免费医学论文发表-来自犬弓蛔虫的cox1的单倍体分析表明五个不同的分支在地理上没有定义

抽象

背景

犬弓蛔虫是一种世界性的狗寄生虫，通过胎盘传播给幼犬，导致卵在环境中广泛脱落。然而，目前尚不清楚是否存在更常见、致病或可能具有人畜共患优势的显性寄生虫基因型。

方法/原理发现

来自成虫的线粒体cox1基因序列用于比较来自美国的寄生虫与来自不同国家的狗分离的寄生虫的提交序列。我们的分析揭示了至少55种单倍型。虽然我们预计北美蠕虫会形成一个独特的集群，但我们发现了T的单倍型。犬科动物在该种群中存在其他部位。有趣的是，将我们研究中的序列数据与可用的GenBank数据相结合，对cox1序列的分析产生了五个不同的分支，这些分支在地理上没有定义。

结论

T的五个分支。本研究中发现的犬科动物可能具有独特的生活史、特征或宿主偏好。需要进一步的研究来确定这些不同的分支是否代表具有临床有用属性或具有分类价值的基因型的神秘物种。对常见线粒体基因的评估可能揭示不同的人畜共患 T 群体。犬。

作者摘要

犬弓蛔虫是一种世界性的蛔虫线虫。在人类中，摄入卵后，这种寄生虫的幼虫会导致内脏幼虫迁徙和眼部弓蛔虫病。犬弓蛔虫在美国继续存在，在人群中观察到高水平的血清阳性。然而，可用于描述1）从狗传播给人类的寄生虫遗传分离株或2）地理上孤立的T簇的数据相对较少。可能形成具有独特性质的分类群的犬科动物。在这项研究中，我们收集了成年T。来自四种不同状态的狗的犬科动物，并应用系统发育和单体分析将寄生虫COX1序列与全球报道的序列进行比较。我们的假设是，我们将发现美国独有的新单倍型。然而，我们的数据显示分离株的地理聚类很少。相反，最大似然树和中位数连接网络支持的结论，即迄今为止全球报告的几乎所有单倍型都属于5个不同的分支。对其他基因和寄生虫性状的分析可以揭示T的不同分支。具有特定临床意义的犬科动物，例如易引起人类疾病的犬科动物。

数字

Fig 4Table 1图1图2图3Fig 4Table 1图1图2图3

引文： Martin KA， Jesudoss Chelladurai JRJ， Bsrat A， Pulaski C， Lee ACY， Starkey LA， et al. （2023） 来自犬弓蛔虫的cox1的Haplotypic分析表明了五个不同的分支，这些分支没有地理定义。公共科学图书馆 Negl Trop Dis 17（10）： e0011665. https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0011665

编辑 器： Bruce A. Rosa，华盛顿大学圣路易斯医学院，美国

收到： 4月 12， 2023;接受： 9月 15， 2023;发表： 10月 25， 2023

版权： ? 2023 马丁等人。这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。

数据可用性： 序列可在GenBank核苷酸数据库中找到（入藏号OP131517 – OP131578）。GenBank中提供的其他序列（入藏号：MT359256 – MT359318）。所有其他相关数据均在稿件及其支持信息文件中。

资金： 这项工作得到了授予MTB和KAM的USDA-VSGP 2017-04619资金，向JJC和KAM提供的国家兽医寄生虫学住院医师中心，堪萨斯州立大学向JJC提供的启动资金以及MTB举办的Ramsey兽医学捐赠主席的支持。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。

竞争利益： 提交人声明不存在相互竞争的利益。

介绍

犬弓蛔虫是全世界犬科动物常见的线虫寄生虫。成虫生活在狗的小肠中，产卵通过粪便排出。在易感犬摄入幼虫卵后，幼虫孵化并经历血-肝-肺迁移，然后成为成年线虫。然而，一部分幼虫迁移到体细胞组织中，在那里它们被逮捕为低生素幼虫。这些组织栖息的幼虫在妊娠晚期被重新激活，穿过胎盘感染幼犬。这种普遍感染的机制导致狗对驱虫药治疗的广泛需求。弓蛔虫病被CDC根据感染数量、疾病严重程度以及预防和/或治疗感染的能力，指定为5种被忽视的寄生虫感染之一[1]。在人类中，迁移幼虫会导致内脏和眼部幼虫迁徙[2]。2018年的一项研究估计，5%的美国人群弓蛔虫抗体血清学阳性[3]。

虽然T.犬科动物是全世界家犬的常见寄生虫，关于这种生物的种群遗传结构的数据相对较少。了解病原体的系统发育关系对于临床目的可能很重要，因为它可能提供有关耐药性、毒力或其他相关参数的信息[4,5]。在蛔虫等类似线虫中，分子流行病学研究利用核和线粒体序列来研究种群结构和单体变异[6-9]。例如，A的研究。SUUM揭示了序列关系和潜在人畜共患传播事件的地理聚类[6]。然而，很少或没有研究来描述T的这种群体性状。美国的犬科动物。

最近的一项研究使用细胞色素c氧化酶亚基1线粒体基因（cox1）来检查T之间的关系。卡尼斯，T.卡蒂，T.马来西亚和来自8个国家的狮子毒蛔虫：巴西，中国，丹麦。德国、日本、马来西亚、葡萄牙和俄罗斯[10]。Fava等人发现序列根据宿主物种（犬科动物和猫科动物）进行分组，但没有表现出任何地理关系。作者认为，由于动物的全球移动，种群之间的基因流动是缺乏标本地理聚类的原因[10]。

在本研究中，我们旨在了解T的遗传和单体多样性。使用部分线粒体条形码COX1基因从美国狗中分离出的犬科动物成虫，并将其与全球报道的犬科动物进行比较。我们假设北美的地理隔离将驱动T的单体分化和结构。美国的犬科动物种群和全球其他地区报告的犬科动物种群。

材料和方法

道德声明

该研究得到了爱荷华州立大学机构生物安全委员会#21289的批准。

寄生虫

2017年至2019年，有执照的兽医从阿拉巴马州（28个样本）、佛罗里达州（14个样本）、爱荷华州（8个样本）和路易斯安那州（19个样本）的狗身上收集了犬弓蛔虫成年标本。寄生虫的物种特征是使用执业兽医寄生虫学家（作者）鉴定的形态特征建立的，并提交给爱荷华州立大学兽医学院。样本是机会主义收集的;任何来自狗的形态上真正的弓蛔虫都有资格纳入该研究。在可能的情况下，努力只收集每个犬宿主1个蠕虫，以寻找更大的遗传多样性。使用传统密钥[11]鉴定寄生虫，并储存在70%乙醇中，直到DNA提取时间。所有协议均由爱荷华州立大学机构生物安全委员会批准15-I-0027-A/H。

使用无菌手术刀片从每个蠕虫的前端去除5毫米的组织部分。根据制造商的说明，使用Qiagen DNeasy血液和组织试剂盒（加利福尼亚州瓦伦西亚）提取DNA。将基因组DNA在100 μL水中洗脱并储存在-20°C。

cox1的扩增

使用引物ToxCoIF（5′-GATTTTACCTGCTTTTTTTTTATTATTAG-3′）和ToxCoIR（5′-CCAAAGACAGCACCCAAACT-3′）扩增线粒体细胞色素氧化酶1（cox1）基因的约425 bp片段[10]。PCR在20 μL体积中与2 μl DNA模板，1x PCR缓冲液，2 mM MgCl进行2，每个dNTP的0.5μM，每个引物的0.3μmol和1U的Taq聚合酶（GoTaq Flexi，Promega，Madison WI）。PCR条件包括在95°C下初始变性3分钟，然后进行35个循环：30秒变性（95°C），40秒退火（60°C），1分钟伸长（72°）和5分钟最终伸长（72°C）。进行琼脂糖凝胶电泳以确认扩增，并在应用生物系统公司3730xl DNA分析仪上对PCR产物进行测序。DNA序列使用CAP3组装[12]（可在：http://doua.prabi.fr/software/cap3 获得）。序列可在GenBank核苷酸数据库中找到（入藏号OP131517 –OP131578）。

系统发育和单体分析

本研究共有63个新序列可用于系统发育和单体分析。此外，还包括来自Fava等人（2020）[10]和GenBank上可用的其他序列。使用原始搜索、从弓蛔虫转录组中搜索 FASTA 文件以及多序列比对来识别潜在序列。GenBank上可用的由327个成对核苷酸组成的所有序列都包含在分析中。最终数据集由 135 个序列组成，其中 63 个来自美国，1 个来自澳大利亚，12 个来自巴西，6 个来自中国，11 个来自丹麦，5 个来自德国，24 个来自伊朗，1 个来自日本、荷兰、波兰、葡萄牙和 9 个来自俄罗斯。将序列修剪为327个碱基对，并在MegaX上使用ClustalW进行比对[13]。

Mega-X [13] 用于推断进化历史，并使用具有伽马分布 [14] 和 1000 次自举复制的一般时间可逆模型生成最大似然树。弓蛔虫（入藏号：MT942618.1）被用作外群。树的构建有和没有先前研究[10]和其他T的序列。Canis Cox1序列可在GenBank上找到。

使用DNASp v6软件进行单倍型分析[15]。在网状树种群分析（PopArt 1.7）[17]中构建了一个中位连接单倍型网络[16]（可在：http://popart.otago.ac.nz）。此外，在MegaX中构建了单倍型共识最大似然树。

结果

T的鉴定。犬科动物和序列分析

所有PCR反应都产生了预期大小的扩增子，除了4个（1个佛罗里达州，3个爱荷华州）被排除在分析之外。NCBI爆炸分析用于确认序列与T一致。犬。一个标本（爱荷华州）被炸为Baylisascaris，并从分析的其余部分中删除。此外，由于序列质量差，一个标本（阿拉巴马州）从分析中删除。

cox1序列的系统发育分析

图1和图2分别显示了使用本研究中收集的序列构建的最大似然树以及使用GenBank中可用的其他序列构建的树，包括来自Fava等人[10]（GenBank入藏号：MT359256 –MT359318）的序列。当单独分析时，我们研究中的序列似乎形成了松散的簇，主要由来自阿拉巴马州，佛罗里达州和路易斯安那州的样本组成，而来自爱荷华州的样本具有来自其他几个州的共同特征（图1）。另一方面，出乎意料的是，当对GenBank中的所有序列进行全局分析时，来自不同大陆的样本聚集在一起（图2）。使用氨基酸序列的最大似然分析产生了类似的结果（S1和S2图）。

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图1. 使用 T 的最大可能性。本研究中从美国收集的犬科动物样本。

引导程序支持大于 50% 的分支用相应的引导程序值表示。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0011665.g001

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图2. 使用本研究中的序列和Genbank上可用的全局序列的最大可能性。

引导程序支持大于 50% 的分支用相应的引导程序值表示。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0011665.g002

cox1序列的单倍型分析

对135个序列的单倍型分析显示55个单倍型，单倍体多样性为0.932，核苷酸多样性为0.01227，分离变异位点为54个（图3和4）。我们将主要单倍型指定为单倍型1。表1提供了单倍型的描述，包括单倍型频率，每个单倍型中包含的序列以及每个序列的起源国。单倍型表现出地理分组，大多数（55个中的50个）单倍型由来自一个位置的序列组成。单倍型 1 包含来自美国（阿拉巴马州、佛罗里达州、路易斯安那州）、丹麦、俄罗斯、伊朗、波兰和荷兰的序列。单倍型3和5是美国和欧洲之间唯一的其他共享单倍型。单倍型 4、6-25 是美国独有的新奇单倍型 4 完全由来自阿拉巴马州的序列组成;完全来自佛罗里达州的序列的单倍型9和来自路易斯安那州的序列的单倍型19（表1和图4）。使用氨基酸序列的最大似然分析产生了类似的结果（S3）。

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图3. 来自所有可用T的单倍型共识最大似然树。GenBank中的犬科x1序列;单倍型在括号中给出。

对单面体簇进行着色以匹配图 4 中的中值连接网络。引导程序支持大于 50% 的分支用相应的引导程序值表示。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0011665.g003

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图4. T的中位数连接网络。犬科动物单倍型在世界各地发现。

对半速簇进行着色以匹配图 3 中的最大似然树。彩色圆圈代表单个单倍型。哈希标记表示不同单倍型之间的核苷酸差异数量。

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表 1. T的cox1的全局单倍型分析。犬。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0011665.t001

美国序列和非美国序列之间的遗传分化全局序列较低，Fst为0.08309。美国序列与欧洲、亚洲和南美序列之间的Fst分别为0.0569、0.12218和0.12728。由于缺乏来自澳大利亚的数据（1个序列），无法计算美国序列和澳大利亚序列之间的距离。

使用MegaX构建了单倍型共识树，如图3所示。该分析还支持了单倍聚类不是地理驱动的结论，并导致鉴定出~5个单倍体分支（图3）。使用氨基酸序列的最大似然分析产生类似的结果（S3图）。有趣的是，在评估中位数连接网络时，我们还观察到了5个主要集群（图4）。我们发现，大多数单倍型（51/55）在中位数连接网络中与在最大似然树中分析时处于相同的聚类中，但这些关系没有地理定义。三个单倍型：11、40和53落在中位连接网络中的5个簇之外，因为它们被4个或更多的核苷酸变化分开（图4）。

讨论

犬弓蛔虫是一种重要的寄生虫，因为它对动物和人类健康都有影响。在这项研究中，我们研究了T的单倍型。美国的犬科动物，并将它们与全世界可用于这种寄生虫的单胞菌序列进行了比较。寄生虫的进化/遗传关系可以作为了解驱虫药耐药性、毒力、宿主偏好和人畜共患潜力趋势的框架。例如，系统发育和单胞分析用于推断人畜共患寄生虫粪类圆线虫的人畜共患潜力。包括Cox1在内的基因揭示了S的两个谱系。粪便，其中谱系A是人畜共患的，但谱系B被认为是不适应人类的祖先基因型[18]。同样，用于疟原虫的系统发育方法为宿主物种之间临床疾病的显著差异提供了见解[19]。这些例子为研究寄生虫的系统发育关系的重要性提供了支持。我们的研究是来自美国的第一个沉积cox1序列和单倍型。

本研究提供了对T的基本理解。美国的犬科动物单倍型，但通过更广泛的采样可以揭示很多东西。许多兽医寄生虫的遗传研究是在机会主义获得标本时进行的;由于各种原因，收集成虫在后勤上具有挑战性。此外，正如Fava[10]所假设的那样，动物及其寄生虫的运动可能会影响DNA测序数据测量的系统地理学结果。虽然记录了动物在采集标本时的大致位置并用于本分析，但没有收集有关动物以前旅行的信息。同样，我们的州级数据也不适合进行精确分析。尽管如此，这项研究表明，即使是机会主义抽样也揭示了在美国和全球发现的单倍型的有趣特征。

由于突变率、种内变异性和母体遗传性相对较高，cox1基因已被描述为系统地理学分析的更理想靶标[20]。在这项研究中，我们希望找到新的cox1单倍型，因为北美可用的数据很少。然而，事实并非如此：我们的结果表明，国外报道的单倍型也存在于美国。此外，中位连接网络的分析和共识单倍型的最大似然分析都将寄生虫分为五个主要分支。有趣的是，在两次分析中，51/55个单倍型落在相同的预测分支中。因此，我们的结果表明，T.具有特定特征的犬科动物可能在全球范围内是可区分的。这些种群是否代表神秘的物种目前是一个猜测的问题，我们避免用任何重要的命名法来命名它们。虽然我们发现了T的特定分支。犬科动物很诱人，进一步的临床或生命周期性状可以与我们基于序列的分支相关联。事实上，只有当这些标签对科学家和临床医生有用时，才应该追求这些标签[21]。

虽然我们发现了T的特定分支。犬科动物很诱人，该研究的一个局限性是最大似然树中的自举支持较低，这表明该基因与所研究人群的变异量减少。不同的线粒体基因（如nad4）或对多个基因的分析可以提供更详细的信息，以阐明可能存在的系统地理关系[22]。事实上，来自多个基因的数据串联可以用来阐明线虫系统发育的图景[23]

在本研究中，我们调查了T的种群。来自美国的犬科动物。cox1序列的测序使我们能够从美国的标本中存放新的GenBank序列，并与全球可用的序列进行比较。使用系统发育分析，我们发现cox1序列适度支持聚类，其中5个分支存在于世界各地。然而，这种聚类不能仅仅用地理来解释。需要更多的研究来确定各种单倍型是否具有值得临床医生关注的独特生活史或临床特征。总之，这项研究有助于更广泛地了解T。犬单倍型，并为未来对寄生虫的遗传研究提供了基础，这些研究可以识别在人类感染中发现的人畜共患单倍型。

支持信息

使用T的氨基酸序列构建的最大似然树。本研究中收集的犬科动物。

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S1 图 使用T的氨基酸序列构建的最大似然树。本研究中收集的犬科动物。

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S2 图 使用T的氨基酸序列构建的最大似然树。本研究中收集的犬科动物和Genbank上可用的全球序列。

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S3 图 使用共识单倍型的氨基酸序列构建的最大莱克利胡德树。

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引用

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