医学论文发表-力依赖性焦点粘附组装和拆卸：一项计算研究
抽象
细胞通过细胞-ECM粘附与细胞外基质（ECM）相互作用。这些物理相互作用被转导为细胞内的生化信号，从而影响细胞行为。尽管已经广泛研究了细胞-ECM相互作用，但尚未完全了解未成熟（新生）粘附如何发展为成熟（局灶性）粘附以及机械力如何影响这一过程。鉴于新生粘附物的小尺寸、动态性和较短的使用寿命，使用传统的显微镜和实验技术研究它们具有挑战性。计算建模为模拟和探索计算机中的各种“假设”场景以及确定关键分子成分和机制以进一步研究提供了宝贵的资源。在这里，我们提出了一个基于常微分方程的简化机械化学模型，其中三种主要蛋白质参与粘附：整合素，他林和黏着蛋白。此外，我们加入了一个影响粘附（拆卸）速率的假设信号分子。我们发现组装和拆卸速率需要动态变化，以限制新生粘附的成熟。该模型预测肌动蛋白逆行速度和成熟分数随底物刚度的双相变化，成熟分数在18-35%之间，最佳刚度为～1 pN/nm，机械敏感范围为1-100 pN/nm，所有这些都对应于关键的实验发现。灵敏度分析显示结果对参数值的微小变化具有鲁棒性，允许模型调整以反映特定的细胞类型和信号级联。该模型提出，信号相关的拆卸速率变化在成熟分数调节中起着被低估的作用，应进一步研究。我们还预测了在增加/降低的粘着蛋白浓度下牵引力产生的变化，补充了以前在不同细胞类型中的粘着蛋白过表达/敲除实验。总之，这项工作提出了一个模型框架，可以稳健地模拟粘附成熟和维持背后的机械化学过程，从而增强我们对细胞 - ECM相互作用的基础知识。
作者摘要
细胞的直接环境在健康和患病组织中大不相同，并影响许多细胞内过程。细胞外基质（ECM）的机械和化学特性通过各种途径影响细胞过程，使细胞能够“感知”其环境并做出相应的反应。细胞-ECM相互作用通过粘附发生，并由称为整合素的跨膜蛋白介导，根据ECM特性，可以直接或间接募集>200蛋白并将外部信号转导为细胞内化学信号。然而，粘连如何组装、生长和拆卸知之甚少。在这里，使用基于微分方程的机械化学计算模型，我们研究了基材刚度如何影响粘附的形成，成熟和拆卸。我们明确包括塔林和基于黏着蛋白的强化在这些过程中的作用。我们提出的模型是稳健的，可以针对特定的细胞类型和信号机制进行微调。模拟预测了中间“最佳”刚度的基板上的最高成熟量，并且（拆卸）速率需要动态变化，以便细胞建立这种“最佳”。总之，我们的研究结果强调了黏着蛋白可用性在粘附成熟和强化中的重要性，并有助于我们了解细胞粘附形成和机械转导。
数字
Fig 5Fig 6Fig 1Table 1Fig 2Fig 3Table 2Fig 4Fig 5Fig 6Fig 1Table 1Fig 2
引文： 霍纳索格 KS、卡拉格兹 Z、古尔特 BT、沃尔芬森 H、拉普安特 VLS、卡利尔 A （2023） 力依赖性焦点粘附组装和拆卸：一项计算研究。公共科学图书馆计算生物学19（10）： e1011500. https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011500
编辑 器： 马克· 美国克莱姆森大学
收到： 7月 2023， 7;接受： 2023月 6， 2023;发表： <>月 <>， <>
版权所有： ? 2023 霍纳索格等人。这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。
数据可用性： 该代码可通过 GitHub 在 https://github.com/CarlierComputationalLab/force-dependent-adhesion-composition.git 上公开获得。
资金： 这项研究得到了荷兰科学研究组织（024.003.013至AC）资助的引力计划“材料驱动再生”的财政支持。H.W.得到了以色列科学基金会拨款1738/17和拉帕波特家庭基金会的支持 资助者在研究设计，数据收集和分析，发表决定或手稿准备方面没有任何作用。
竞争利益： 没有。
介绍
细胞与细胞外基质（ECM）通过粘附直接接触是多细胞生物的重要组成部分[1]。整合素是跨膜ECM受体蛋白，与α和β亚基组装为非共价键的异二聚体[2]。整合素外结构域结合ECM配体，而细胞质尾间接与细胞的肌动肌肉蛋白细胞骨架相连，形成超分子组装或“离合器”[3-6]。这种间接联系由200多种蛋白质组成的动态网络组成，统称为“整合素粘附体”[7,8]。 整合素功能的核心是细胞外和细胞内力的动态和平衡[9]，它们驱动整合素粘附复合物（IACs）[7]的力依赖性进化，导致其大小和组成发生变化。体外研究表明，粘附组装是一个多步骤过程，其中整合素首先通过与细胞内衔接蛋白分子（如他林）结合来激活[10-12]和/或ECM配体[13]。一旦激活，整合素会聚集在粘附部位，不受力和底物刚度的影响，形成新生粘附[14-16]。然后，NAs通过募集其他衔接蛋白（如黏着蛋白）进行拆卸或力依赖性成熟，以形成粘连（FA）（图1A）[17,18]。 粘合装配的这三个主要步骤在时间上也有重叠，并且不是严格顺序的。了解整合素贴壁体的关键蛋白质与力生成之间的相互作用将为细胞-ECM相互作用提供有价值的见解，并对发育生物学产生影响。更好地了解细胞反应和信号传导可以潜在地突出新的治疗靶点，并改进工程底物以更好地模仿生物组织，从而推进再生医学。
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图1. 本研究中建模的过程概述。
（A）—整合素在预络合步骤中与他林和黏着蛋白结合，然后形成一个小簇，称为“种子”。种子可以变小形成更大的簇，称为“clusts”。肌动蛋白丝拉扯他林和长春花蛋白，导致塔林上隐秘的长春菌素结合位点暴露，促进更多的长春斑蛋白募集。然后，该链可以在整合素-配体捕获滑键或塔林-肌动蛋白滑键（黑匣子）处断裂。有关术语的详细说明，请参阅表 1。（B） - 模型中反应的概述。Int、tal 和 vinc 分别指整合素、talin 和 vinculin 的浓度。黑色矩形包围了强化反应（在图1C中进一步扩展）。灰色箭头代表克吕斯特形成反应。红色箭头代表肌动蛋白结合反应。虚线箭头表示力依赖性反应 - 蓝色虚线：强化，黑色虚线：肌动蛋白解绑。虚线箭头表示粘附拆卸反应，黑色虚线：塔林重新折叠，紫色虚线：簇击穿。黄色闪电表示经过信号相关速率修改 （SDRM） 的速率，深绿色实心沙漏表示经过时间依赖性速率修改 （TDRM） 的速率。经过信号相关修改的速率常数在 ～158 秒后被驱动为零，仅激活模型的下部，封闭在蓝色框中，代表将经历进一步成熟的粘附。（C）—塔林和黏着蛋白被建模为胡克泉（另见S1附录中的图A）。在该模型中，为了捕获加固过程，最多三个粘着蛋白结合事件在沿塔林杆的不同点依次发生（蓝色箭头），从而增加了单个整合素-塔林-黏着蛋白弹簧系统的刚度。聚类建模为整合素-他林-黏着蛋白弹簧系统的数量平行增加（灰色箭头）。这个数字是用 BioRender.com 创建的。
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除了与粘附（散）组装有关的问题外，粘附成熟也是一个复杂的过程，受基材的机械性能[19,20]，力依赖性构象变化[21-25]，不同的捕捉和滑动粘合强度[5,26,27]和细胞内力[20,28,29].这些机械因素的变化如何影响粘附的生化组成，以及哪些因素决定了特定NA的成熟决定仍不清楚。
鉴于实验研究的限制和挑战，计算建模可以成为宝贵的资源。自Chan和Odde（2008）[4]的第一个分子离合器模型以来，已经开发了许多细胞-ECM相互作用的计算模型，该模型解释了顺应基板上的丝状牵引动力学[30-34]。Elosegui-Artola及其同事扩展了Chan和Odde模型，通过增加整合素密度[35]和多种整合素类型[36]来包括粘附强化。基于整合素的Rho信号[34]和肌动蛋白丝网络中的可逆交联[37]也被其他小组纳入以前的研究中。最近，Venturini 和 Saez （2023） [38] 开发了一个广泛的分子离合器驱动粘合力学的多尺度模型。所有这些模型都探索粘附的形成、生长以及基底刚度和肌动蛋白力对牵引力的影响，但它们是模拟相对较少单个颗粒的离散模型。它们也没有考虑到招募黏着蛋白后离合器刚度的增加，也不认为拆卸过程是动态和活跃的。此外，这些模型几乎没有提供关于NAs到FAs成熟过程中细胞粘附的整体生化组成变化的信息。
在这项研究中，我们开发了一个使用常微分方程（ODE）的新模型，根据基质刚度、衔接蛋白刚度、肌动肌肉蛋白产生的力和键特性等机械特性，描述细胞-ECM粘附随时间推移的生化组成。使用我们的模型，我们研究了在不同机械条件下有可能成为成熟FA的NA比例。总体而言，本研究的结果揭示了粘附成熟和拆卸背后的机械转导机制。该模型还为模拟具有200多种已鉴定蛋白质的较大局灶粘附体提供了一个可靠的起点[7]。
方法
微分方程模型
我们开发了一种基于ODE的模型，该模型根据环境和细胞内蛋白质的机械特性捕获细胞-ECM粘附生化成分的变化。下面我们简要描述了粘附成熟过程的特定阶段 - 整合素 - 他林 - 诗歌蛋白预复合物的形成，预复合物簇的形成和生长，肌动蛋白结合和解结合，与黏着蛋白的粘附强化和粘附分解 - 以及如何对它们进行建模（图1B概述了系统中的所有物种及其相互作用）。对于每个子过程（粗体），我们给出一个简短的解释，并在微分方程中标记相应的项（方程1-17）。除非另有说明，否则反应是可逆的，正向速率常数在下标中具有“f”，反向速率常数具有“r”。除非另有说明，否则反应遵循质量作用动力学。当在文本中提到浓度时，它们写在方括号之间（例如，[S3a]），当被称为物种时，它们按原样书写（例如，S3a）。反应和参数的详细说明可以在S1附录的文本A和表A中找到。表 1 概述了整个手稿中使用的术语。
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表 1. 本手稿中使用的术语。
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粘附组装从整合素活化开始。在这项研究中，我们对α5β1整合素并假设它们被激活。我们还假设底物上的配体间距足够接近，可以形成整合素簇。
Pcomp形成和解离。
活化的整合素[Int]与talin，[tal]和vinculin，[vinc]结合，形成预复合物[Pcomp]，这是粘附成熟的必要步骤[18]（S1附录中的文本A）。
种子形成和二聚化。
多达50个IAPC簇，不受基板刚度和张力的影响，形成NA[16]。在这里，为了简化起见，簇的增长到最大大小（50个IAPC）分两个阶段发生 - 首先，形成一个由25个IAPC组成的小簇，称为“种子”（用“Sx”表示（图1C，表1），第二阶段种子一角，形成一个具有50个IAPC的大簇，称为“clust”（用“Cx”表示（图1C， 表 1，S1 附录中的文本 A））。在这里，x ∈ {1,2,3} 表示单个 IAPC 中长春斑蛋白分子的数量。
当离合器为AUB时，拉伸的爪子可能会重新弯曲[24,39]。 我们假设这使得中阶和高阶（S2，S3）的AUB种子不太可能变小。所有目（S1a，S2a，S3a）的AB种子都可以变小形成AB种子（C1a，C2a和C3a）（图1B中的灰色箭头）。
肌动蛋白结合/解除结合。
肌动蛋白未结合（AUB）种子和肌腑可以通过他林和黏着蛋白上的肌动蛋白结合位点与肌动蛋白结合，使AB种子和肌腥（分别用“Sxa”和“Cxa”表示，（S1附录中的文本A））可以拉伸到不同程度（基于x的值），因此传递不同大小的力（图1C）。
虽然基线肌动蛋白结合率k做对于所有肌动蛋白结合反应，信号分子如FAK、Src和ERK在粘附周转中发挥作用，它们的抑制导致更多的成熟[40]。为了实现类似的机制来阻止无限期粘附的形成和成熟，我们在模型中引入了信号依赖性速率修正（SDRM）（详见“信号依赖性速率修正（SDRM）”）。
根据整合素-配体（捕获-滑移）键[41]和塔林-肌动蛋白（滑移）键[5]上的力，细胞和底物之间的力链可以在这些键中的任何一个处断裂。我们通过力依赖性（以及因此底物刚性依赖性）肌动蛋白解结合速率（图1B中的黑色虚线箭头，详见S1附录中的文本A）来捕获这些现象。在离合器达到其最大承载能力之前，这些粘合器也可能由于随机热力学波动而破裂，从而减少离合器施加的总力。为了解释连续框架中的自发离合器解绑，我们引入了时间依赖性速率修正（TDRM）（详见'力依赖性肌动蛋白解绑和时间依赖性速率修正（TDRM）'）。
加固。
AB离合器在底物和肌动蛋白细胞骨架之间形成机械连接，从而实现力传递和蛋白质展开。当talin被拉伸和展开时，多达42个隐秘的粘着蛋白结合位点（VBS）被覆盖[43,24]，导致通过粘着蛋白募集进行强化。 塔林展开和加固的速率取决于AB离合器所承受的力，并随着力的增加而增加，类似于贝尔模型[44,45,1]（有关更多详细信息，请参阅“粘附加固率”一节）。 在这个简化的模型中，考虑了两个黏着蛋白强化事件，一个从低阶到中阶离合器（S2a到S1a和C2a到C2a），然后是一个从中阶到高阶离合器（S3a到S2a和C3a到C1a）（有关详细说明，请参阅S1附录中的文本A）。因此，在该模型中，他林杆可以结合至少 3 个和最多 1 个黏着蛋白分子。在这个框架下，我们认为低阶离合器（S1，S1a，C1，C1a（图2C））代表NA，中阶和高阶离合器（S2，S2a，C2，C3a，S3，S3a，C3，C1a，（图25C））表示更成熟的粘附阶段，指示成熟为FA的NA的比例（参见“NA形成与刚性和力无关”部分进行推理）。强化被建模为一步反应，其中分别同时募集50个（用于种子）和1个（用于clusts）的黏着蛋白分子（由图2B中的蓝色虚线箭头表示）。然而，这些反应相对于黏着蛋白的顺序被选择为3（方程8,9,10和<>），以解释反应中可能的中间阶段的影响。
重新折叠和分解。
在没有足够的力的情况下，粘连会因机械和化学信号而分解[46]。在这里，我们模拟了两个平行的拆卸过程，即1）talin重新折叠（图1B中的黑色虚线箭头）导致离合器中的粘着蛋白损失和减弱，以及2）AUB簇分解成种子和Pcomp（图1B中的紫色虚线箭头）导致粘附的承载力降低（S1附录中的文本A）。这些是不可逆的反应。
为了考虑粘附组装的机械方面，底物-整合素-衔接蛋白系统被配制成胡克弹簧系统。当离合器与肌动蛋白丝结合时，它们对肌动蛋白丝的运动提供阻力，直到键断裂，这是随机引起的，或者因为达到捕捉/滑动键合力阈值。我们假设肌球蛋白II马达施加在肌动蛋白丝上的力被由于细胞质粘度而产生的阻力所平衡。因此，在肌动蛋白丝上没有整合素介导的力的情况下，它们以恒定的逆行速度移动（参见S1附录中的文本A）。当使用连续常微分方程框架时，我们认为所有离合器具有相同的肌动蛋白逆行速度。离合器上的力取决于其刚度和伸展（根据胡克定律）。离合器的刚度取决于组成IAPC的数量和每个IAPC中长春斑蛋白分子的数量（计算等效弹簧常数，请参阅S1附录中的文本A）。因此，施加在肌动蛋白丝网络上的总力取决于每种类型的AB离合器的数量及其刚度。由于我们使用连续介质方法来解释每种物种的丰度，因此我们通过假设体积为 1 μm 来离散 AB 离合器的浓度3以计算总力（请参阅S1附录中的文本A）。
上述过程共同产生以下一组微分方程：
(1)
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基线参数值和速率常数可在 S1 附录的表 A 中找到。我们请读者参阅S1附录中的文本A，以详细说明模型中的所有反应和基本推理。下面，我们重点介绍新的方法（信号和时间依赖速率修改（SDRM和TDRM）），并简要解释该模型中使用的一些数学公式和假设。
信号相关速率修改 （SDRM）
新生粘连（NAs）大量形成，大多数在几分钟内被拆卸[17,47]。 随着细胞突出，细胞膜和NA之间的距离增加，肌动蛋白解聚率高于细胞膜[48]。因此，许多NA可能在细胞膜附近得到支撑，但在没有这种支架的情况下，许多NA会拆卸。各种信号级联也调节粘附拆解。致密性粘附激酶（FAK）、Src和ERK激酶等信号分子在粘附周转中起作用，它们的抑制导致更多的成熟[40]。然而，大多数研究已经研究了信号分子对FA而不是NA周转的影响[49,50]，并且NA拆卸的确切机械或化学触发因素仍然难以捉摸[51]。由于上述机制，电池前端的NA组装，成熟和远离前缘的拆卸不断发生。本研究聚焦于NA形成的一个周期，研究了不同基底刚度上NA成熟的差异。为了实现一种阻止无限期粘附形成和成熟的机制，假设存在一种信号分子，其最低浓度，信号打，是新的NA形成和低阶AUB离合器（S1，C1）结合肌动蛋白进行成熟的需要。该分子的浓度[信号]最初很高，并且按照Michaelis-Menten动力学以任意速率降低，由下式给出：
(17)
对最大速度和米氏常数值的初始估计基于文献中报道的在ATP存在下FAK Tyr-397磷酸化[52]的估计值，但经过调整，使[信号]的浓度达到信号打在58秒内，这是实验中测量的NA组装阶段的近似持续时间[4]。当[信号]低于信号打，它类似于被激活的信号通路，以及特定的反应速率常数（k1层， k1r， k2层， k2r， k3层， k3r， k4层， k9层， k18层， k20层， k21层， k22层，由图 1B 中的黄色闪电表示）按照 S1 附录中的文本 A 中的详细说明进行了修改。因此，[信号]的衰减速率决定了在NA拆卸开始之前可能发生粘附成熟的可用时间。请注意，如果我们假设相反的情况，即[信号]随着时间的推移而增加，并且其浓度有一个上限，超过这个上限就不会发生肌动蛋白结合，则模型行为不会改变（S1附录中的图C.B）。
力依赖性肌动蛋白解绑和时间依赖性速率修饰 （TDRM）
如果整合素-配体（捕获-滑动）键[41]或他林-肌动蛋白（滑移）键[5]由于达到各自的力阈值或由于随机热力学波动而断裂，则细胞-ECM力链断裂。S1附录中的文本A对此进行了详细说明。为了捕捉锁滑键和滑键的组合动力学，以及随机键断裂的影响，肌动蛋白解绑速率（图1B中的深绿色沙漏）定义如下：
(18)
哪里F离合 器是离合器中单个IAPC上的力（请参阅S1附录中的文本A，其中F离合 器进行了详细描述）。第一项和第二项，其中A和C是比例因子，b和d控制力依赖性，描述整合素-配体捕捉-滑移键，第三项描述塔林-肌动蛋白滑键，其中是给定离合器类型的键断裂阈值（i ∈{1， 2， 3}，参见S1附录中的表A），是卸载解离速率。k目录是定性解释自发离合器解绑事件引起的总力减小所需的时间相关速率修正 （TDRM） 因子。k目录由以下人员给出：
(19)
哪里t离合 器是离合器保持肌动蛋白结合的模拟时间步长的数量，dt 是时间步长和k感是确定影响大小的参数。简而言之，该定义捕捉了AB离合器长时间保持AB的可能性降低。研究表明，整合素-配体键经过循环机械增强（CMR），从而延长使用寿命[53]。这意味着在力加载率较低的软基底上，与刚性基底相比，整合素-配体键在给定时间段内经历的力循环更少，因此更有可能在软基底上断裂。以前的研究模拟CMR在低力下键解离率增加[35,38]。 在这里，TDRM可以捕捉到这些现象的影响。TDRM影响较软的基板，其中离合器需要更长的时间才能达到其力阈值，而不是刚性基板。
当AB离合器承受等于其力阈值的力时，它会从肌动蛋白中解脱并成为AUB离合器。因此，AB离合器的浓度设置为0，并且其AUB对应物的浓度增加相同量。
附着力增强率
塔林杆展开的速率随着施加的力而增加，并且在以前的研究中已经通过贝尔模型进行了描述[24,44,45]。 在这里，对贝尔公式进行了调整，使得速率随力呈指数增长，直到粘着蛋白结合力阈值F.vb达到，超过它就保持不变。费率由以下机构给出：
(20)
卸载的塔林展开的速度在哪里，k用友是控制力依赖性的参数，F离合 器是单个IAPC在离合器中承受的力，是黏着蛋白结合力阈值，i∈{1,2}对应于第一和第二黏着蛋白结合步骤。在这里，和[24,42]。 假设一旦VBS被揭开，粘着蛋白结合就会立即发生[45,54]，因此根据在使用磁镊的单分子实验中观察到的talin的力依赖性展开动力学来确定增强速率[42]。曲线拟合方法的详细说明可在 S1 附录的文本 A 中找到。
基材刚度范围
ECM的硬度通常以杨氏模量测量，在大脑中为1-3kPa，肌肉组织中为23-42kPa，血管中为1000kPa-860MPa，骨骼中为15-40GPa[55]。然而，在这项研究中，我们考虑了弹簧常数，可以根据[34,36]中详述的一些假设将其转换为杨氏模量，并在S1附录的文本A中进行了总结。 因此，我们将主要研究和预测的范围限制在相当于0.1-130 kPa的刚度范围内，并且仅定性讨论高达1000 kPa的结果。这与以前的计算和实验研究一致，这些研究也主要研究类似基材刚度范围内的粘附力学生物学[4,36]。
局部敏感性分析
由于该模型包含许多参数，其值要么是估计值，要么是经过调整以拟合实验数据，因此进行了局部敏感性分析。每个参数测试的值范围是基线值（S1附录中的表A）±10%和±20%。为了量化影响，使用两个不同的指标作为结果，即1）成熟分数：平衡（最后一个时间点）中高阶AB和AUB离合器（[S2]+[S2a]+[S3]+[S3a]+[C2]+[C2]+[C3]+[C3a]）中的整合素浓度，以及2）最佳刚度：具有最低平均肌动蛋白逆行速度的底物刚度。结果 1 表示系统中整合素的总分数，使其超越粘附形成的初始力无关阶段，指示成熟为 FA 的 NA 的比例。结果 2 表示对系统的总体影响，因为它量化了在一系列基体刚度的仿真长度期间施加的平均力。此外，已知细胞能够调整其机械敏感范围以适应其环境，这是结果2可以揭示的一个方面。由于不同的参数可能根据基体刚度产生不同程度的影响，因此评估了结果1对每个参数的四个基体刚度的灵敏度（k子= 0.1， 1， 10， 100 pN/nm）。
对21个参数（S1附录中的文本B、图I和图J）进行了参数灵敏度分析，正文中列出了影响最大或关键重要性的参数。结果 i 的参数 p 的参数灵敏度计算如下：
(21)
其中结果我( p + Δp） 表示参数值已更改的结果指标的值，结果我（p）是结果指标的值与基线参数值，Δ p和p分别是参数和基线参数值的变化。
初始条件
假设整合素、他林和黏着蛋白的初始浓度相等，为简单起见设置为1 μM，所有其他物种的初始浓度设置为0。假设黏着蛋白在细胞质中大量可用，因此在整个模拟过程中以 1 μM 的恒定浓度建模。
模拟步骤
所有模拟运行600秒。欧拉前向积分方法用于求解常微分方程，时间步长dt为5 ms，如以前的计算研究[4,35]。有关质量保存步骤，请参阅 S1 附录中的文本 A。模型不同方面的集成步骤和更新顺序（图2）如下：
计算与力相关的速率常数。特别是，以下比率是在当前力下评估的：
首次强化率：（k7层， k12层） 使用等式 20。
二次强化率：（k8层， k13层） 使用等式 20。
信号相关速率修改：（k1层， k1r， k2层， k2r， k3层， k3r， k4层， k9层， k18层， k20层， k21层， k22层） 已更新，详见 S1 附录中的文本 A。
具有时间相关速率修正的锁滑粘结速率：（k4r， k5r， k6r， k9r， k10r， k11r） 使用等式 18 和 19。
通过求解上面列出的微分方程，根据电流速率常数更新浓度。
检查每种离合器类型的滑动粘合阈值
如果达到滑扣阈值，离合器上的力将重置为0。
离合器的肌动蛋白结合形式的浓度转换为肌动蛋白未结合形式。
肌动蛋白结合的离合器施加的总力是使用方程S53基于离散浓度计算的。
逆行速度，v复古，使用等式 S49 根据系统中的当前总力进行更新。
所有基板离合器弹簧系统都延长了 v复古? 分。
每个离合器上的力使用等式 S51 更新。
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图2. 示意图显示了用于模拟和力量化的流程图。
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结果
为了探索基材刚度、衔接蛋白刚度、肌动肌肉蛋白产生的力和键特性等机械性能对粘附成熟的影响，我们开发了一个计算模型，该模型捕捉了粘附形成和成熟时IAC成分的整体变化。该模型基于常微分方程，由一个隔室组成，该隔室代表形成粘附的细胞斑块，并考虑三个核心成分：整合素，他林和黏着蛋白，从中制造了14种其他物种。动态NA / FA成熟由总共22个反应（在方法和文本A中解释，S1附录中的表A和B解释）建模，这些反应主要代表三个不同的过程（图1）：（i）粘附形成，（ii）强化和生长，以及（iii）粘附分解。
使用我们的机械化学计算模型，我们发现可能受生化信号事件调节的组装和拆卸的动态速率对于确定成熟的NA子集至关重要。发现该模型满足质量守恒（文本B，S1附录中的图B）。
NA形成与刚性和力无关
当只有预复合的初始晶种和晶圆形成反应（Rx1，Rx2和Rx3）活跃时（见S1附录中的文本B，表B），所有测试底物刚度的晶种和晶粒浓度相等，与先前的实验证据表明NA形成与底物刚性无关[16]（图3A）。这是刚性和力无关的速率常数（k1层， k1r， k2层， k2r， k3层， k3r） 用于反应 Rx1、Rx2 和 Rx3。因此，形成的种子和晶圆的浓度仅取决于[int]，[tal]和[vinc]的初始浓度，它们都设置为1 μM，[vinc]在整个模拟过程中保持不变（见方法）。
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图3. 虽然NA的形成与基体刚度无关，但成熟度受刚度的影响很大。
（A） - 模型中表示 NA（S1 和 C1）的物种随时间推移的浓度。所有测试基板刚度的曲线重叠，因此显示为一条（蓝色）线。垂直虚线标记超过信号阈值的时间点，因此新的NA形成减少。（B）—所有肌动蛋白结合物种随时间推移的浓度。代表NA的物质（S1a，C1a）最初增加，然后在信号浓度降至阈值以下后驱动至0。最高水平的成熟发生在中等刚度（ksub = 1 pN/nm).
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011500.g003
设置基线信号衰减参数（S1附录中的表A）以匹配NAs组装阶段的实验测量时间段[17]，导致信号通过信号打在t西格= 58.04 s（图 3A、图 C 和 S1 附录中的文本 B）。此外，当成熟（肌动蛋白结合）反应被禁用时，种子和中整合素的预测浓度≥0.1 μM（图3A），持续约158秒，这一持续时间表明新生粘附的寿命，并且与实验测量的NA平均寿命135-180 s一致[16,17,47].此外，[S1]和[C1]的浓度也与实验观察到的早期NA丰度趋势相匹配[17]（图3A)
然而，当允许肌动蛋白结合反应时，[S1a]和[C1a]的浓度在58秒时达到峰值（图3B），随后急剧下降至0。这种减少是因为肌动蛋白结合速率的信号依赖性降低减少了这些物种的形成，但速率常数（k7层和 k12层）的强化反应Rx7和Rx12分别将S1a和C1a转化为S2a和C2a，保持不变。因此，S1a和C1a在大约158秒后几乎完全消耗。[S1a] 和 [S3a] 的预测浓度最高k子= 100 pN/nm 和k子= 分别为 1 pN/nm 衬底（图 3B），而 [C1a] 和 [C3a] 在k子= 1 pN/nm。这些差异源于刚度相关的强化率，以及这里考虑的可逆质量作用动力学。S1附录的文本B对此进行了更详细的解释。因此，该模型考虑了一个NA组装周期，然后是成熟或拆卸。当使能成熟时，[S2a]，[C2a]，[S3a]和[C3a]的浓度在600秒后达到稳定状态，因为它们在0和几乎恒定的峰值浓度之间振荡（图3B）。总之，可逆质量作用动力学、刚度依赖性增强速率和信号浓度衰减之间的平衡导致代表NA的低阶物种（S1，C1，S1a，C1a）的形成和随后的拆卸，而中高阶物种（S2，C2，S2a，C2a，S3，C3，S3a，C3a）代表稳定的粘附，可能进一步成熟成为FA。
在中等基材刚度下粘附成熟度最高
根据实验结果[3,2,3,1]，[S3a]，[C4a]和[C34a]的浓度在中等基底刚度（56pN / nm）上最高，在较硬或较软的基底上较低（图57B）。 这是由于离合器上的力达到键断裂阈值所需的时间大致等于由于热力学波动而自发地与肌动蛋白（或基底）解离的空载AB离合器的寿命[4,58]。因此，完整的ECM-整合素-衔接蛋白肌动蛋白链的寿命最大化，导致更多的成熟。此外，在模拟的早期阶段（0至70 s，S1附录中的图D），浓度[C3a]，[C2a]和[S3a]在k子=1 pN/nm。虽然这些结果适用于具有恒定黏着蛋白浓度的模拟，但在有限的长春苦蛋白条件下也获得了类似的结果（参见S1附录中的文本B和图E）。
尽管图3B中的浓度图由于反复的键断裂事件将AB离合器转换为AUB离合器而振荡，将AB离合器的浓度推高至0并导致AUB离合器的浓度峰值，但峰值接近稳定状态。我们观察到AB离合器在较硬基板上的振荡周期通常较短（表2），Venturini和Saez（2023）也报告了这一点[38]。我们模拟中预测的周期与以前的研究（表2）非常一致[4,38,58,59]。 请注意，C2a 和 C3a 的周期为k子= 0.1 pN/nm，与数值孔径的寿命（～60 s）或更高。因此，这些结果表明，C2a和C3a可以代表（部分）成熟的粘合而不是NAs，并且在非常柔软的基材上发生足够的增强之前，粘附可能会拆卸。
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表 2. 不同基质刚度的不同肌动蛋白结合离合器的平均周期（s）。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011500.t002
从本质上讲，在初始NA形成阶段之后，成熟粘附物的数量增长最快，在中等基材刚度k子= 1 pN/nm，并接近稳态。虽然由于达到力阈值或随机键断裂事件，主动结合到肌动蛋白网络的粘附数量不断波动，但平均而言，数量接近稳定的稳定状态。
牵引力在中等刚度的基材上最高
最佳基材刚度是在粘附处产生最大牵引力的刚度[60]。如上一节所述，这是由于空载AB离合器的使用寿命与离合器达到力阈值所需的时间之间的平衡而产生的。在我们的模拟中，最高牵引力在k子= 1 pN/nm，这也对应于记录最低逆行速度的点（图4A）。对于较硬的基板，振荡频率更高（表2），因为离合器上的力在刚性基板上增加得更快，因此更早达到力阈值，导致键断裂，随后AUB离合器与肌动蛋白重新结合。而在较软的底物上，由于底物更顺应，力的积聚要慢得多（因此振荡频率较低），由于热力学波动引起的肌动蛋白解合占主导地位，因为键在达到力阈值之前自发断裂，从而产生更高的肌动蛋白解结合率（S1附录中的图F）。这些结果表明，k子= 1 pN/nm产生“负载和失效”状态，其中离合器以中等速率加载，达到其力阈值并随后断裂，“摩擦打滑”发生在较硬的基板上，其中快速加载导致离合器脱开太快，导致平均AB离合器浓度降低[4,60]。总之，这些观察表明，在我们的模型中，NA成熟的最佳刚度是k子= 1 pN/nm。
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图4. 基线模型的平均肌动蛋白逆行速度和成熟分数的模型预测。
（A）显示了与以前的研究相比预测的速度与基材刚度的关系，（B）显示了该模型中所有粘附（红色）施加的预测速度（蓝色）和平均力，以及（C）显示NA成熟分数与基板刚度的关系。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011500.g004
图4A显示了我们的模拟与其他计算[36,38]和实验[4]研究中的平均逆行速度之间的一致性。最近的一项计算研究也报道了类似的双相行为，最佳刚度约为10 pN/nm[38]。然而，只有当模型中力链中最薄弱的环节被模拟为捕获键时，才会观察到这种情况。此外，我们的模型预测平均速度在 10 之间线性增加0pN/nm 和 102pN/nm（图4B），这是细胞对机械敏感的刚度范围——刚度的变化线性转化为肌动蛋白逆行速度的变化。这与以前的研究非常吻合，这些研究报告的范围为100–101到 100–102pN/nm [4， 57， 61]。刚度的预测逆行速度降低> 101在Elosegui-Artola等人的计算研究中，pN / nm[36]（图4A）是由于增强而引起的，他们将其建模为整合素密度的增加超过离合器上的某个阈值力。虽然报告的速度范围各不相同，但在我们的模型中，最低速度取决于肌球蛋白马达的浓度康克肌，这是一个自由参数，经过调整后，最低速度在Chan和Odde （10）报告的2008%以内[4]。
同样重要的是要注意，只有当应用肌动蛋白解结合速率的TDRM时，才能达到1 pN/nm的最佳刚度（参见方法中的“力依赖性肌动蛋白解结合和时间依赖性速率修饰（TDRM）”小节和S1附录中的文本A）。对于高基体刚度，由于达到力阈值所需的时间很短，因此成熟度受到限制。然而，对于软刚度，情况并非如此。因此，在没有TDRM的情况下，我们用来解释与力无关的自发键断裂的方法，中阶和高阶AB离合器（[S2a]，[S3a]，[C2a]，[C3a]）的平衡浓度最高k子= 0.1 pN/nm，随着基板刚度的增加而单调降低（S1附录中的图G）。重要的是，由TDRM引起的中阶和高阶AB离合器平衡浓度的下降幅度最大k子= 0.1 pN/nm 且最小开启k子= 100 pN/nm（S1附录中的图G.A和G.B）。因此，拆卸速率的TDRM对于通过机械传感获得最佳刚度至关重要。由于粘合组装和拆卸是严格监管的过程，这些结果表明，影响粘附拆装的改变因素允许在机械传感和粘附成熟过程中具有更高的鲁棒性和弹性。
预测的NA成熟分数对他林硬度和粘着蛋白的可用性最敏感
在识别模型中代表NA（S1，C1，S1a，C1a）和成熟到FA的粘附（S2，C2，S2a，C2a，S3，C3，S3，S3a，C4a，C18a）的物种后，我们利用我们的模型来预测在一系列基质刚度上可能成熟为FA的NA的比例。值得注意的是，我们的模型还预测了成熟分数（MF）的双相趋势（图10C）。更具体地说，在非常柔软的基板上，MF的范围约为<>%（<>-2pN/nm）至34.3%左右，最佳基板刚度为100pN/nm，位于不同条件下实验确定的MFs范围内[18,62]。
为了确保最佳刚度和MF预测不会受到参数值选择的严重影响，我们对21个参数（文本B，S1附录中的图I和J）进行了局部灵敏度分析，并在此处解决了最重要和最具代表性的参数。
最佳基板刚度，即观察到最低平均逆行速度的刚度（图5B），对k塔尔，塔林的刚度。增加k塔尔将最佳刚度转移到较软的基材上并降低MF（图5B）。Talin是模型中最丰富的机械敏感部件，主要有助于确定离合器的刚度，从而有效地确定最佳基体刚度。增加talin的刚度会导致更硬的离合器更快地达到粘合力阈值，从而减少成熟反应的时间，从而降低MF。
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图5. 灵敏度分析结果。
（A） - 成熟分数与刚度的关系（结果 1）和 （B） - 不同参数参数值局部变化的平均逆行速度与刚度的关系。（B） 中的黑色箭头指向增加参数值的方向并跟踪最佳刚度（结果 2）。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011500.g005
初始黏着蛋白浓度增加初文克导致MF大幅增加（图5A），最佳刚度小幅增加（图5B）。较高的黏着蛋白浓度会增加成熟的可能性，从而增加承载力，从而将最佳刚度转移到更硬的状态。相反，较低的粘着蛋白可用性导致成熟分数和牵引力降低以及较高的平均逆行速度（图5和6）。
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图6. 黏着蛋白浓度会影响成熟分数。
（A）和（B）是分别低和较高的细胞类型或生物学背景。在A中，长春斑蛋白与他林上暴露的长春花蛋白结合位点结合的可能性很低，导致成熟分数低。然而，在B中，由于相对较高的长春菌素可用性，整合素-肌动蛋白链接极有可能被黏着菌素加强，从而增加成熟分数。这个数字是用 BioRender.com 创建的。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011500.g006
塔林复性率变化，塔尔射频，对平均逆行速度的影响大于最佳刚度（图5）。更高的塔尔射频导致较低的成熟分数，但对最佳刚度的影响可以忽略不计。这是因为较高的塔林再折叠率导致AUB离合器更容易从粘着蛋白中脱落，从而降低更成熟，更高承载能力的离合器在所有基质刚度上的浓度。然而，这不会导致不同离合器在基体刚度上的浓度的相对比例发生任何变化，因此不会显着改变最佳刚度。类似的推理适用于较低的塔尔射频.
在我们的模型中，塔林复性因子控制着长春花蛋白解离的速率，因此控制着高阶物种的相对额外稳定性（参见S1附录中的文本A），在我们的模拟中，其基线值设置为0.5（高阶物种中的塔林比中阶物种重整的可能性低一半）。增加会导致较低的MF，并且由于高阶物种的“额外”稳定性降低，将最佳刚度转移到较软的基材上。类似的推理可以用来解释减少的影响。由于已知长春斑蛋白将塔林“锁定”在展开的构象中[39]，我们进一步将值降低到0.2，以研究具有高度稳定的高阶物种的影响。这导致不同刚度的成熟趋势相同，但成熟分数略高（S1附录中的图H）。
增加vu，卸载的肌动蛋白逆行速度，将最佳底物刚度推向较软的底物，符合先前的计算研究[57,60]，并导致较低的MF（图5）。 较高的逆行速度会导致更快的力积聚，从而导致较软基板上的摩擦滑动。似k塔尔，这也会导致较低的 MF。相反，增加k做将最佳底物刚度推向更硬的基质并增加MF（图5），这是由于离合器的“加强”，因为它们更有可能结合肌动蛋白，拉伸并募集黏着蛋白，并且平均而言，有更多的AB离合器导致较软的基板上的力更大[57,60]。
在所有参数中，塔林的刚度k塔尔，初始黏着蛋白浓度初文克，塔林复性率塔尔射频和肌动蛋白结合率k做对MF的影响最大，参数值的增加和减少相似（S1附录中的图I）。重要的是，TDRM因素k感和团簇形成 （k14层， k15层， k16层） 和拆卸 （k21层， k22层）速率对测试值范围（±1%）的MF和最佳刚度（S20附录中的图I和J）的影响可以忽略不计。
讨论
尽管对细胞-ECM粘附进行了广泛的研究，但ECM和细胞内蛋白的机械性能对粘附组装，成熟和牵引力产生的早期过程的影响尚不清楚。在这里，我们提出了一个计算模型，该模型创新地桥接了粘附形成的离散机械和连续生化方面。我们的模型捕获了NAs的成熟分数（MF），肌动蛋白逆行速度和键形成 - 断裂周期的关键趋势，所有这些都与实验证据一致[4,18,59,62]。 预测的最佳基体刚度[4]和刚度灵敏度范围[57,61]也在实验确定的范围内。
虽然在测试的刚度范围内预测的平均肌动蛋白逆行速度与使用胚胎小鸡前脑神经元的实验研究一致[4]，但与Elosegui-Artola及其同事（2014）[36]的研究一致仅限于也可以看到双相趋势的较软状态（比较图4A中的黄线和蓝线）).这种差异源于粘合强化的建模方式。特别是，该研究中的强化被建模为如果离合器受到≥87 pN的力，则会发生整合素密度的增加，从而导致整合素-ECM结合事件的增加和更多的绑定离合器。在最近的一项计算研究中，钢筋的建模也类似，观察到双相行为与我们的模型一样，但最佳刚度约为10 pN/nm[38]。在我们的模型中，虽然离合器的簇尺寸增加和额外的黏着蛋白募集导致更大的承载能力，但可用整合素的数量或粘附形成率没有变化。
在这项研究中，我们假设信号分子的动力学相对较快，以使NA组装和拆卸阶段与实验数据保持一致[17]。重要的是要注意，基于所使用的细胞类型，实验结果可能存在相当大的差异，从而导致不同的时间尺度。但是，由于该模型对以下变化相对不敏感信号打（S1附录中的图I和J），以及因此的变化t西格，当这些参数被调整为代表特定的细胞类型或例如信号分子动力学时，模型的整体行为不太可能发生巨大变化。因此，模型中的通用信号分子可以潜在地表示未磷酸化的FAK或类似分子的水平，其（磷酸化）状态的变化可以引发信号级联，导致粘附分解。未来的工作应旨在确定诱导和影响粘附拆解的潜在因素，以便可以用更准确的配方和相互作用代替通用信号分子。特别是，确定这些具体因素有助于确定信号打.
根据我们的结果，影响NA拆解动力学的因素比影响装配动力学的因素起着更重要的作用。我们应用了TDRM，这是一种在常微分方程框架中解释NA形成过程中自发键断裂事件的创新方法。TDRM对于建立最佳刚度是必要的，因为如果没有TDRM，软基材上的成熟度最高，因为离合器上的力会缓慢增加，从而产生较长的成熟反应。TDRM通过增加离合器-肌动蛋白键断裂的速率来抵消这一点，从而防止成熟。使用TDRM因子的基线值k感，由于离合器寿命短，TDRM对粘结断裂率的影响在软基板上最高，而在较硬的基板上可以忽略不计。Walcott等人（2011）[63]预测并实验验证了软基板的拆卸过程开始得更早，这是由力和应变依赖的键形成和破裂概率引起的。此外，整合素-配体键的循环机械增强（CMR）增强了它们，增加了寿命，这意味着在力加载相对较慢且力在较长时间内保持较低的软基底上，这些键的增强程度较低，并且更有可能断裂[53]。在以前的研究中，CMR被建模为低力下键解离率的增加[35,38]。 TDRM可以被视为粗略说明这些过程的方法。然而，虽然TDRM的结果与[35,38]中模拟的CMR的效果相似，但这两种方法之间的差异需要进一步研究。令人惊讶的是，最佳刚度对控制TDRM幅度的参数变化不敏感（ksens, (Fig 5B). This was unexpected since TDRM was essential for establishing an optimal stiffness implying a major role of this parameter in determining model behaviour (Figs F and G in S1 Appendix). It is likely that the explored sensitivity range (±20%) was too narrow to considerably change the behaviour of the model, which should be investigated more in-depth in the future. Note as well that in this study we performed a local sensitivity analysis focusing on those parameters that can directly be traced to a biological phenomenon (for instance kact, Initialvinc), those that we introduced as part of SDRM and TDRM (for instance ksens, signalthresh), or assumed (for instance, ). Considering the non-linear nature of the model, it would be interesting in future studies, to conduct a more rigorous, global sensitivity analysis (i.e. using Bayesian Optimization) to further identify the most significant parameters of the model.
Another benefit of our model is that it allows the prediction of the maturation fraction of adhesions for a range of substrate stiffnesses. While there are no studies to the best of our knowledge that explicitly investigate the MFs for different substrate stiffnesses, the predicted range of MFs for the stiffness range tested in this study was within the range of experimentally determined fractions [18, 62].
我们的灵敏度分析结果表明，MF受可用整合素和长春菌素浓度、肌动蛋白结合速率和他林复折叠速率的影响很大（图5A）。这些因素可以通过在蛋白质中引入突变来通过实验控制，从而可以测试预测。此外，发现MF和最佳刚度对TDRM因子的变化不敏感。k感以及簇的形成和拆卸速率，表明该模型对这些因素具有局部鲁棒性，并且可以调整参数以特定于实验条件或细胞系。这表明该模型可用于通过改变分子刚度、塔林、整合素和黏着蛋白的初始浓度、不同的聚类、成熟和拆卸速率以及许多其他参数来预测各种条件下的MF。这可以潜在地揭示细胞施加的牵引力如何受到细胞内生化改变的影响。
例如，黏着蛋白在细胞-ECM粘附和通过钙粘蛋白的细胞-细胞粘附中起重要作用。大量研究表明，这两种过程的相互依赖性和合作性是通过信号级联或蛋白质介导的，这些信号级联或蛋白质在两种类型的粘附中都不同程度地存在于不同的细胞类型中[64-69]。虽然长春菌素敲除研究表明，牵引力的产生受损，一些研究报告说，在没有长春花蛋白的情况下，牵引力会降低近50%，但过表达的长春蛋白会导致极强的粘附，从而抑制细胞运动[70-75]。然而，这留下了悬而未决的问题，即整合素和钙粘蛋白粘附复合物之间的串扰引起的黏着蛋白可用性的相对较小的变化如何影响牵引力的产生和粘附成熟。我们的模型预测，在最佳底物刚度下，黏着蛋白浓度降低20%会导致肌动蛋白逆行速度增加约9%（或相当于由于MFs降低而施加的牵引力减少9%）（图5）。因此，我们的模型对于预测和生成关于（局部）粘附蛋白浓度如何影响粘附组装、成熟和牵引力产生的早期过程的假设特别有价值。
总体而言，我们的模型在几个方面改进了以前的研究。首先，通过考虑多个长春斑蛋白募集事件来更准确地捕捉成熟过程，这些事件在连续常微分方程框架中逐渐增加离合器刚度。以前的研究要么没有考虑到这一点，要么最多考虑了招募一种黏着蛋白[4,30-35]。其次，该模型将粘合成熟离散力学因素（如离合器刚度）的变化与粘附成熟背后的生化反应的连续框架耦合。这一点尤其重要，因为连续生化模型没有明确考虑离合器上的力，并且粘附形成的离散机械模型不能捕获由此产生的实验可测量的生化变化。
虽然从我们的结果中可以清楚地看出，粘附组装和拆卸速率必须是动态的，并且依赖于信号才能实现最初形成的一小部分NA的成熟，但我们承认这项研究有几个局限性。首先，我们没有模拟参与成熟过程或粘附面积持续增加的许多蛋白质[76]。其次，我们简化了粘连蛋白募集和簇大小的生长，分两个离散的步骤发生，并且没有考虑空间效应（例如与肌动蛋白纤维的接近程度，与细胞膜的粘附距离）。第三，我们假设整合素、他林和黏着蛋白在粘附附近以大致相等的比例获得（初始浓度相同），这可能不一定是真的。尽管存在这些限制，我们的模型还是通过实验重现了在不同种子和阴囊浓度下观察到的力、基质刚度和振荡时间段的趋势[4,59,60]。此外，我们的结果相当接近前面提到的离散随机计算研究，即使我们的模型桥接了离散和连续方面。因此，该模型为进一步调查提供了可靠的基础。
也许通过建立我们的模型，还有待探索的是调节NA成熟的各种信号级联之间的相互作用。无处不在的信号分子FAK也被强制激活，增加了另一层相互作用和复杂性[77,78]。 此外，已知KANK家族蛋白会损害talin的肌动蛋白结合能力，从而削弱整合素-肌动蛋白连接，并影响捕获和滑键动力学[79]。它们还发挥作用，将微管靶向粘附，这有助于通过多个信号级联进行拆卸[80]。通过扩展当前的模型框架以包括这些相互作用，它有可能稳健地模拟机械转导背后的机械化学过程，并为细胞信号传导、通信和组织提供有价值的见解，从而有助于发育生物学和再生医学的进步。
实现
模型和仿真是使用 MATLAB R2020a [81] 实现的。本研究中使用的所有代码和脚本均可通过 GitHub https://github.com/CarlierComputationalLab/force-dependent-adhesion-composition.git 公开获取。
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方法（文本A）、附加结果（文本B）、图表（图A—图N）和表格（表A和表B）的详细说明。[83–104] 在本文件中被引用。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011500.s001
（邮编）
确认
我们感谢José Manuel Garcia-Aznar博士提供关键意见和想法，感谢Hang Nguyen在科学写作方面提供指导。对于S1附录中图I和J中的颜色，使用了公开的用户创建的MATLAB包[82]。
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