免费医学论文发表-使用特征辅助分割器/追踪器FAST高密度跟踪细菌
抽象
大多数细菌附着在密集群落的表面。虽然新的实验和成像技术开始为这些社区中发生的复杂过程提供一个窗口，但解决单个细胞在时间和空间上的行为仍然是一个重大挑战。尽管已经开发了许多不同的软件解决方案来跟踪微生物，但这些解决方案通常需要用户调整大量参数或对大量成像数据进行地面测量以训练深度学习模型 - 这两个手动过程对于新实验来说可能非常耗时。为了克服这些限制，我们开发了FAST，即特征辅助分割器/跟踪器，它使用无监督机器学习来优化跟踪，同时保持易用性。我们的方法植根于信息论，在很大程度上消除了用户手动迭代调整参数并对所得细胞轨迹进行定性评估的需要。相反，FAST测量每个细胞的多个区分“特征”，然后自主量化每个特征提供的独特信息量。然后，我们使用这些测量值来确定应如何组合来自不同特征的数据，以最大程度地减少跟踪误差。将我们的算法与仅使用细胞位置的朴素方法进行比较，发现FAST产生的跟踪误差减少了4到10倍。FAST 的模块化设计将我们新颖的跟踪方法与用于分割、广泛数据可视化、沿袭分配和手动跟踪校正的工具相结合。它还具有高度可扩展性，允许用户从图像中提取自定义信息，并将其无缝集成到下游分析中。因此，FAST 能够以最少的用户输入实现高通量、数据丰富的分析。它已被发布用于 Matlab 或作为编译的独立应用程序，并在 https://bit.ly/3vovDHn 上提供，以及广泛的教程和详细的文档。
作者摘要
我们对细菌行为的了解大部分来自通过空间和时间跟踪孤立细胞。例如，人们可以通过量化单个微生物对营养来源做出反应时的运动来解开驱动趋化性的机制。然而，在感染、工业过程和环境中，细菌通常生活在紧密聚集的社区中，在那里它们表现出在孤立细胞中没有观察到的独特行为，例如激活接触依赖性武器以杀死邻居。在这些密集的集合中跟踪个体在技术上具有挑战性，因为很难仅使用细胞在每一帧中的位置来跟踪细胞。在这里，我们提出了一种名为FAST的新软件工具，它结合了机器学习和信息理论来优化细胞跟踪。我们的方法使用一系列不同的细胞特征，如形状和荧光强度，随着时间的推移更好地区分个体，与传统方法相比，误差减少多达10倍。此外，FAST 还估计跟踪精度如何随时间变化，提醒用户注意潜在问题，例如失焦框架。通过以最少的用户输入跟踪各种条件下的细胞，FAST提供了一个新的定量平台来研究细菌如何适应群体生活。
数字
Fig 5Fig 6图1图2图3Table 1Table 2Fig 4Fig 5Fig 6图1图2图3
引文： Meacock OJ，达勒姆 WM （2023） 使用 FAST（特征辅助分割器/跟踪器）高密度跟踪细菌。公共科学图书馆计算生物学19（10）： e1011524. https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011524
编辑 器： 斯特凡·克伦普，格奥尔格-奥古斯特-哥廷根大学，德国
收到： 10年2023月17日;接受： 2023月 9， 2023;发表： <>月 <>， <>
版权所有： ? 2023 达勒姆米科克。这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。
数据可用性： 所有源代码，包括FAST和基准测试系统，都可以在 https://github.com/Pseudomoaner/FAST 获得。案例研究的数据，包括原始数据文件、轨迹数据和数据处理设置和脚本，可在 https://doi.org/10.6084/m9.figshare.21756212（图4）、https://doi.org/10.6084/m9.figshare.21756269（图5）和 https://doi.org/10.6084/m9.figshare.21756329（图6）获得。
资助：O.J.M.通过生命科学接口博士培训中心（EP / F500394 / 1）获得EPSRC学生奖学金和人类前沿科学计划（LT0020 / 2022-L）提供的长期博士后奖学金，而WMD则获得EPSRC泵启动奖（EP / M027430 / 1），BBSRC新研究者资助（BB / R018383 / 1）， 以及人类前沿科学计划（0080 年 RGY2021 月）。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。HFSP：https://www.hfsp.org/ EPSRC：https://www.ukri.org/councils/epsrc/ BBSRC：https://www.ukri.org/councils/bbsrc/。
竞争利益： 提交人声明不存在相互竞争的利益。
介绍
延时显微镜和自动细胞追踪在我们对微生物如何感知和响应环境的理解方面取得了许多根本性的进步。虽然许多研究都集中在浮游细菌以相对较低的密度移动，但许多行为 - 包括集体运动[1,2]，战斗[3]，共享公共物品[4]和遗传交换[5] - 通常只发生在大多数微生物生活的紧密聚集中[6,7].这些密集群落通常在实验室中使用融合的单层细胞进行研究，这比三维聚集更容易成像。产生这种单层的一种方法是用琼脂糖或聚丙烯酰胺板限制细胞以形成间质菌落[1,8-12]，而更先进的微流体技术[13]也可用于将细胞限制在单个平面上，同时允许更精确地控制其化学环境（图1A).单层也可以在流体薄膜中形成，包括在细菌群运动期间自然产生的薄膜[2]和用于研究鞭毛运动诱导的混合的测定[14]。然而，无论单层的来源如何，研究人员在使用相衬、明场和/或落射荧光显微镜追踪密集堆积的细胞时都面临着同样的技术挑战（图1B）。
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图1. 使用FAST的模块化框架分析高密度数据集。
（A）虽然细菌在某些环境中自然形成单层，但在实验室实验中使用许多不同的测定法将细胞物理限制在平面上。其中包括间质菌落，将细胞捕获在两个固体边界之间的微流体装置，以及将细胞限制在液体薄膜中的实验测定。（B）这些实验通常使用自动显微镜系统成像，该系统能够在指定时间点收集透射光和荧光通道中的图像。（C）FAST在六个单独的模块中分析这些成像数据集，每个模块按顺序使用（见S1文本）。S3 文本的第 1 节提供了每个模块的完整规范。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011524.g001
以低密度跟踪孤立细胞相对简单，仅使用细胞位置的基本跟踪算法通常会产生出色的结果。然而，跟踪密集排列在一起的细胞是出了名的困难，因为相邻细胞之间的间距变得类似于细胞在帧之间移动的距离。这些问题因细胞运动而加剧。虽然某些种类的细菌在高密度下是非运动的，并且仅通过细胞分裂和表面活性剂的分泌缓慢传播[9,13]，但由抽搐[1]、蜂拥[2]和滑行[15]驱动的集体运动的紧急模式通过快速改变细胞位置使跟踪进一步复杂化。因此，密集的运动群落必须以高帧速率成像才能进行跟踪，因此典型的实验需要数百或数千张图像的时间序列。成像数据集的庞大尺寸，加上每张图像中的大量细胞，意味着细胞追踪所需的计算时间通常是研究人员工作流程中的主要瓶颈之一。如果必须多次重复跟踪以优化跟踪参数，则情况可能会更加复杂。
一种基本的最近邻跟踪算法比较后续帧之间的像元质心坐标，并通过连接后续时间点之间最接近的质心来构建轨迹。更先进的算法利用额外的细胞特征或“特征”来区分细胞，包括测量细胞形状、方向、荧光水平和先前运动模式的指标[16-19]。然而，合并这些额外的特征测量会带来一个新问题，即如何有效地组合来自不同特征的信息以优化跟踪性能。在某些软件包中（例如MicrobeJ [17]），这需要用户手动选择大量参数，并对每组参数产生的轨迹进行定性判断。可能参数数量的组合爆炸，单个参数集可能需要数小时进行测试的事实，以及缺乏比较不同参数集跟踪结果的严格方法，意味着这种跟踪算法中的参数优化通常是一个高度迭代、耗时的过程。
一个相关的问题是，集体中细菌的特性是高度动态的，随着时间的推移，在个体水平和种群水平上都会发生变化。例如，荧光团可以在细胞内或漂白剂内积聚，而细胞运动会由于细胞外因子的分泌或基因表达的变化而加速或减慢[20,21]。此外，由于细胞分裂，细胞的整体密度通常会随着时间的推移而增加。这种可变性意味着在实验开始时优化以跟踪细胞的算法在以后的时间点可能会遇到困难。此外，实验问题（例如由热漂移引起的照明、焦点变化或视场偏移）可能导致跟踪精度突然下降。知道跟踪精度何时下降到不可接受的水平通常缺乏严格的基础，并且需要通过肉眼仔细验证跟踪软件的输出，这对于高吞吐量数据集通常是不可行的。
在本文中，我们讨论了一种使用无监督机器学习来提高跟踪保真度的新方法。我们的系统会自动测量每个特征随时间推移的统计属性，然后使用这些数据根据其有助于解决跟踪问题的信息动态更改每个特征的相对权重。它还为用户提供了生成的细胞轨迹的预期准确性的指标，提醒他们注意可能需要在后续分析中省略的数据集部分。该跟踪算法与强大的分割、特征提取、沿袭分析和可视化例程相结合，构成了特征辅助分割器/跟踪器FAST。FAST已作为开源软件发布，可以直接在Matlab中运行，也可以作为独立应用程序运行，并且已经在许多出版物中用于准确分析密集的细菌单层[1,10,22,23]。
在以下部分中，我们将讨论FAST的设计方法和一般结构，然后使用合成数据集说明我们新型细胞追踪方法的实用性。接下来，我们将讨论三个说明FAST多功能性的案例研究，包括：1）E的谱系分析。大肠杆菌微菌落，2）追踪抽搐P。2D单层中的铜绿假单胞菌细胞，以及3）在P共培养物中自动分析6型分泌系统（T6SS）。铜绿假单胞菌和V.霍乱。虽然这些案例研究侧重于密集堆积的细菌，但FAST也可用于分析其他类型的生物样品（e.g. S1文本中的图Ag-i）。
结果
软件概述
最初，我们对现有的细胞追踪软件包进行了审查[17,24-28]，为我们的软件建立了四个关键设计目标：模块化，快速用户反馈，最小化用户定义的参数和可扩展性（有关更多详细信息，请参阅S2文本的第1节）。我们按照这些设计原则构建了FAST流水线，从而产生了一组六个按顺序使用的模块（图1C）。如果需要，可以使用外部工具对延时图像进行预处理，例如，在将图像导入FAST之前对其进行稳定或漂白。成像数据使用生物格式[29]加载到FAST中，确保与各种成像格式兼容。FAST的第一个模块是分割模块，它使用标准的图像处理方法（包括纹理检测，脊检测[30]和分水岭算法[31]）来识别单个细胞的边界。虽然这通常基于明场或相衬图像，但如果细胞用胞质或膜结合的荧光团适当标记，也可以使用荧光图像。接下来，特征提取模块使用先前提取的分割作为基础测量一系列不同的细胞属性，例如位置、大小和荧光强度（可能在多个通道中）。跟踪模块采用我们的机器学习过程来量化与每个特征相关的信息，然后计算每个特征的相对权重，以最大限度地提高跟踪保真度。如果需要，手动验证和校正子模块还允许用户纠正跟踪算法所犯的任何错误。可选的分裂检测模块使用密切相关的机器学习过程，在细胞分裂事件后将子细胞分配给母细胞。最终可以使用两个独立的模块来可视化 FAST 的输出：叠加模块在原始图像的顶部绘制轨迹和/或分析结果，而绘图模块包含一系列不同的选项来可视化提取的数据。S3 文本的第 1 节提供了每个模块的全面描述。
FAST GUI 指导用户完成分析单个数据集的过程。然而，许多应用需要使用一致的设置来分析大量成像数据集。为了自动化这一点，我们实现了一个名为doubleFAST的批处理工具。一旦用户使用 FAST GUI 对单个数据集执行了分析，doubleFAST 就可以读取此初始运行期间使用的设置，并自动将其应用于任意数量的附加数据集。这允许使用最少的其他用户输入处理来自多个实验的数据，并确保使用一致的设置对每个实验进行分析。
最后，我们实现了一个后处理工具箱，其中包含在 FAST 输出上执行多种不同任务的脚本和函数。除其他事项外，这些允许将轨迹数据转换为其他文件格式，自动检测不同的基因型，以及注释诸如运动方向的反转等事件。FAST 的用户可以建议此工具箱中的新增内容，以便更广泛的社区可以使用它们。
法斯特的跟踪算法
FAST的主要创新之一是其跟踪算法，该算法可自动确定如何最好地组合来自各种不同细胞特征的数据，以提高跟踪保真度。尽管以前的跟踪软件包可以选择在其跟踪程序中纳入位置以外的细胞特征[16,19]，但FAST使用基于信息论的概念框架来优化这一过程，从而提高了这种方法的功能和便利性。在本节中，我们将简要概述我们的主要创新以及它们如何影响跟踪过程。有关更详细的推导和解释，请参阅S3文本第4.1节。
我们解决跟踪问题的方法基于对可用于在后续帧中分配对象之间链接的信息量的测量，我们称之为“可跟踪性”。这种可追踪性分数提供了一个综合衡量标准，衡量我们从一帧到另一帧跟踪物体的准确度，并且由于其基于信息论，具有某些理想的属性，例如统计独立特征的贡献的加性[32,33]。因此，随着时间的推移测量可跟踪性为用户提供了一种工具来预测跟踪何时稳定和稳健，以及标记数据集中可能产生虚假轨迹的部分。我们在以下段落中定义了可跟踪性，然后在第一个和第二个案例研究中说明了该指标在实践中的使用方式。
我们首先假设为每个对象测量了N个不同的特征。对象的特征可以表示为具有 N 个元素的向量，其中对象索引表示为 i，时间表示为 t。因此，物体特征随时间的变化（例如对应于平移运动或荧光强度的变化）会在 N 维特征空间中生成轨迹。我们的跟踪算法的目标是从每个图像中对象的分割和测量产生的单个数据点云中重建每个对象的轨迹。如前所述，高密度和高运动系统中的个体可以很容易地比帧之间的典型细胞 - 细胞分离更远，因此很难仅从位置信息重建其轨迹。通过在跟踪框架中包含其他特征，我们将特征空间从这两个空间维度扩展到N个特征维度，创建新的轴，沿着这些轴可以潜在地区分相邻的个体。
可追踪性指标用于估计要素空间中轨迹之间的可区分程度，从而估计追踪的精度。不可预测的对象移动往往会降低可追踪性，而如果要素采样的值范围更广 （i.e. 如果它们具有更大的动态范围）。为了形式化这一点，我们将对象在特征空间中的瞬时位置建模为随机向量 Xt以及后续图像之间该位置的变化作为随机向量 ΔXt.分布 f（x） 是概率密度函数 （PDF），表示在没有附加信息（特别是物体在先前时间点的位置）的情况下在特定位置 x 找到随机选择的物体的机会，而分布 f（Δ x） 表示连续时间点之间物体在特征空间中位置的随机变化。我们通过假设物体通过特征空间的运动可以建模为高斯随机游走来估计 f（Δx）。明确地，我们假设一个对象在第 t+1 帧的特征向量可以用其先前的特征向量写成：
(1)
其中 ΔXt被建模为多元法线，μt（Δx） 和 Σt（Δ x） 分别是帧-帧特征位移集合 {Δx 的平均向量和协方差矩阵t}.我们同样可以使用原始对象位置的协方差矩阵 Σ 来表征 f（x）t(虽然我们可以估计Σt(x） 直接从静态快照作为特征向量集的协方差 {xt}， 解析 {Δxt} 并随后μt（Δx） 和 Σt（Δx）需要一组假定的细胞轨迹，在我们的算法中，这些轨迹是通过使用简单的最近邻方法的初步跟踪获得的。为了帮助确保准确测量这些汇总统计数据，FAST 仅使用此训练数据集中最有可能正确的最低位移轨迹链接。用户指定用于计算μ的具有最小位移的链节的分数F。t（Δx） 和 Σt（δx）。这允许用户在较大的 F 值（增加训练数据集的大小）和较小的 F 值（可提高训练数据集的质量）之间进行权衡。
从这些测量中，我们通过计算两个分布H（X）和H（ΔX）的熵之间的差异来估计可用于在帧之间分配对象的信息量[33,34]。可追踪性 rt，以位/对象为单位，然后可以写成：
(2)
其中 no，t是时间 t 和 |?|表示内容的行列式。第一项捕获所有特征的动态范围（|Σt（δx）|）以及物体在特征空间中运动的不可预测性（|Σt（Δx）|），而第二项和第三项重新缩放此数量以表示每个对象的跟踪算法可用的信息量。有关更多详细信息，包括我们对基础统计分布形式的假设，请参阅S3文本第4.2.1节。
为了说明可跟踪性指标，我们考虑具有单个特征的单个物体的情况，例如它在空间中沿单个轴的位置x（图2A-2C）。这将等式（2）简化为：
(3)
哪里σt(x） 和σt（Δx） 表示它们各自分布的标准差。正如预期的那样，当特征位移的分布f（Δ x）相对于f（x）的分布更尖锐地达到峰值时，人们观察到更大的可跟踪性得分（图2B和2C）。一.e. 当对象在帧之间移动的典型距离小于 x 的值范围时。直观地说，跟踪的精度将随着（i）特征空间随机波动的大小减小，（ii）帧内对象数量的减少，以及（iii）对象所占的特征空间的总大小（i.e. 它们的动态范围）增加。通过考虑这些多重因素，rt表示对给定对象在后续帧中错误地链接到不同对象的风险的综合度量。
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图2. 用于自动对象跟踪的信息理论框架。
（A）为了便于说明，我们在这里考虑一个理论数据集，其中使用单个特征表征对象，即其沿x轴的位置。物体在三个连续时间点的位置表示为 x1， x2， x3（红色圆圈），而位移表示为 Δx1， Δx2（蓝色箭头）。（B）我们假设特征位移是从正态分布f（Δ x）绘制的，而瞬时物体位置（独立于其他时间点的知识）是从单独的均匀分布f（x）中提取的。然后，特征的信息内容I计算为两个分布H（X）和H（Δ X）的熵之差，并表示我们在给定时间t的位置知识的情况下，对物体在时间t+1的位置的确定性增加。可追踪性量化了为每个对象测量的信息总量，当 f（Δ x） 相对于 f（x） 表现出较少的变异性时，可追踪性会增加。（C）当f（Δx）的分布更宽时（即特征变得更加“嘈杂”），可追踪性降低。这里不同的颜色对应于图B中显示的f（Δx）的不同分布。 （d，e） 两个特征的特征归一化过程图示。在 D 和 E 中，中心图表示一对特征位移的联合分布，而左侧和底部图表示相应的边缘分布。在 D 中，表示两个特征（ΔX 和 ΔY）的非归一化帧帧位移的随机变量相关并从原点移位。使用联合分布的协方差矩阵 Σ（Δ x） 和平均向量 μ（Δ x），对特征空间进行变换，使得特征位移的联合分布为零中心和各向同性 （E），确保每个特征在帧之间表现出等量的随机变化。
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除了计算可跟踪性外，μt（Δx） 和 Σt（Δx）也用于执行我们所说的“特征归一化”。这种变换将原始特征空间x转换为具有各向同性和零中心的相应位移分布的归一化特征空间（图2D和2E），从而确保在每个分量中观察到的随机变化相等，并且特征空间中的任何可预测运动（例如，由于生长导致细胞长度逐渐增加， 或由于光漂白引起的荧光强度降低）被考虑在内。这个转换空间的度量是马氏距离，这是一种无量纲度量，用于在我们的统计框架假设下，我们可以预测下一个时间点物体在特征空间中出现的位置的可靠性。通过提供一种公平的方式来将来自不同特征的数据组合在一起，该指标使我们能够更准确地区分正确和不正确的推定链接。此空间中连续时间点之间的较大距离表示下一帧中对象预测位置和观测位置之间的差异，因此表明输入数据一定是错误的，例如，因为对象在单个帧中被错误分割。与以前必须手动选择或测量特征权重的方法[16]相比，特征归一化允许自动优化多个特征的贡献，而无需任何额外的用户输入。
最后，我们使用这些统计测量值来计算自适应跟踪阈值βt，它会根据每帧中可用的信息量自动调整将对象链接在一起的算法的严格性。虽然当信息相对丰富时，接受较大比例的推定链接，但当信息更有限时，只接受最高确定性的链接。因此，链路阈值的这种动态调整允许FAST在不太具有挑战性的跟踪条件下最大化轨迹数量（e.g. 低密度缓慢移动的单元），同时在更具挑战性的条件下最大限度地减少杂散链路的数量（e.g. 高密度快速移动的细胞）。由于不同的成像数据集可能需要在最大化正确链路数量和最小化虚假链接数量之间取得不同的平衡，因此用户选择一个静态阈值P来平衡这种权衡，然后FAST会自动将其转换为时变阈值βt基于可用信息的瞬时量。
总之，用户必须指定跟踪阈值 P、保留 F 的训练链接比例以及最后一轮跟踪中应包含的特征。为了帮助用户快速优化这些参数，跟踪模块包含内置工具，允许用户在提交处理整个数据集之前客观地评估单帧的跟踪质量。
使用地面真实数据集验证 FAST 的方法
为了演示我们的跟踪算法的功能并说明使用多个特征如何提高准确性，我们使用之前描述的自走杆（SPR）模型[1,35]来生成模拟细菌高密度集体移动的合成数据集（图3A）。在这些模拟中，细胞被建模为由恒定力推动的刚性、相互排斥的杆（参见方法）。该模型已被证明与使用鞭毛或IV.型毛毛推动自身的细菌群体非常接近，其中邻近细胞之间的空间位阻相互作用会产生复杂的紧急集体行为[1,35]。重要的是，这种方法使我们能够独立控制系统的每个不同属性，使我们能够在大量定性不同的数据集上测试FAST，并使用自动生成的地面事实客观地评估其性能。
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图3. 使用来自集体细菌运动模拟的合成数据验证 FAST。
（A）我们使用自走杆（SPR）模型生成具有经过验证的地面真相的噪声数据集。然后，我们仅使用单个特征（连续时间点的杆质心;棕色）或使用一套不同的特征（杆质心，长度，方向和模拟荧光强度;紫色）使用FAST进行细胞跟踪。将FAST（B）重建的轨迹与真实数据（C）进行比较，使我们能够识别跟踪算法（D）所犯的错误。错误分为两类：不正确的对象之间的链接（“误报”，实心洋红色线）和丢失的对象之间的链接（“假负”，洋红色虚线）。我们还计算了每种情况下正确链接的数量（“真阳性”，橙色实线）。根据这些计数，我们通过计算 F 来评估跟踪算法的性能1-分数（正文）。（E） 此 F 的值1-score 取决于用户定义的参数，即跟踪阈值。为了客观地比较在具有不同属性的数据集上运行时跟踪算法的结果，我们计算了生成最大 F 的跟踪阈值1给定数据集的分数，并在后续分析中使用此分数。（F）包括所有特征信息，与仅使用物体位置相比，跟踪性能得到实质性和一致的改进（另见S2图）。图右侧的箭头（标记为“性能提升”）表示中位数 F1-分数，对应于使用所有功能时跟踪误差减少 ~10 倍。此外，我们发现我们的可跟踪性指标是给定特征集跟踪准确性的出色预测指标，这表明即使没有基本事实，它也可以用来估计算法的准确性。在不同的模拟中，我们改变了杆密度、推进力和帧率，以及测量位置、长度和荧光时的噪声量（表 1）。F 中的黑色圆圈对应于 E 中呈现的数据集。
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我们通过初始化长度和荧光强度从实验数据中获得的分布中提取的细胞群来模拟组成型表达荧光蛋白的 2D 单层细胞（S1 图）。初始化后，我们通过对每根杆的运动方程进行数值积分来模拟细胞运动。一旦系统达到稳态，我们就在均匀间隔的时间点提取杆位置、方向、荧光和长度的测量值。为了模拟噪声测量，我们将高斯噪声添加到每个特征中，噪声幅度基于在实际实验数据中观察到的噪声幅度（图3B，方法）。
FAST 的跟踪算法不是专注于具有特定属性的数据集，而是通过特征归一化自动补偿来对各种不同的条件具有鲁棒性。为了测试这种能力，我们通过调整杆密度、自推进力和帧速率来改变仿真参数，并通过调整测量单元位置、长度和荧光强度中的噪声量来改变特征测量的准确性（表 1）。我们对这六个参数中的每一个测试了五个不同的值，总共产生了 30 个数据集。
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表 1. 用于生成合成数据集的 SPR 模型的参数。
在这里，我们显示了我们测试的值范围和更改另一个参数时使用的基线值。请注意，我们的模拟是非量纲的，使用单杆的宽度作为特征长度尺度，并使用具有自推进力 ν = 1 的孤立杆移动单杆宽度所需的时间作为特征时间尺度。
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通过比较跟踪算法的输出与真实值来评估跟踪算法的性能（图3C和3D）。在地面真相中存在但在重建中缺失的链接被评分为假阴性（FN），而那些在地面真相中不存在但在重建中存在的链接被评分为假阳性（FP）。两者中相同的链接被评分为真阳性 （TP）。现在，我们将这些测量结果集成到一个量化跟踪性能的单一指标中，即 F1-score，定义为：
(4)
FAST 的用户指定一个跟踪阈值，用于控制链接过程的严格程度。如果这个阈值太严格，算法会拒绝太多正确的链接，而如果阈值不够严格，就会接受太多不正确的链接。在实践中，用户需要能够选择最适合其需求的跟踪阈值，例如，对检测非常罕见的事件感兴趣的用户与对测量平均细胞行为感兴趣的用户有不同的要求。但是，为了测试我们的自动跟踪算法的优势，我们使用导致最大 F 的阈值从分析中删除了跟踪阈值作为因素。1-每个数据集的分数（图3E）。此最大值 F1-score 是衡量我们的跟踪算法在具有不同特征的数据集中性能的客观度量，还允许我们对跟踪算法进行稳健的基准测试。
使用两种不同的方法跟踪模拟数据集（图3B）。第一种方法仅使用杆的位置 - 实际上是经典的基于位置的跟踪方法（“质心”），而第二种方法使用所有四个特征 - 位置，方向，长度和荧光强度（“所有特征”）。我们发现，包括所有特征导致所有数据集的跟踪精度显着提高，跟踪错误的数量减少了 4 到 10 倍（S2 图）。此外，我们的地面真实数据集允许我们直接将数据集的可跟踪性与结果轨迹的准确性联系起来，这表明它是 F 的出色预测因子。1-score，与数据集中的模拟参数或噪声水平无关（图3F）。
总之，这些分析验证了我们的方法，并说明了FAST如何应对具有挑战性的数据集。首先，他们证明了我们在跟踪过程中整合其他特征信息的方法是可靠和有效的，与单独使用细胞位置的替代方法相比，FAST能够大大减少跟踪误差。其次，这些分析表明，我们的可跟踪性分数可以将数据集的多个方面整合到预测跟踪精度的单一、强大的启发式方法中。
案例研究
跟踪生长中的非运动E中的细胞，分裂和谱系。大肠杆菌菌落。
许多先前的追踪包的主要目的是自动重建细胞谱系[25,28]。然而，识别细胞分裂事件和产生的子细胞是一个特别困难的挑战。近乎完美的个体跟踪对于准确的谱系跟踪至关重要，因为单个错误可能会传播并导致谱系在以后的时间点被错误分配。我们使用八部独立的E延时电影测试了FAST的谱系跟踪功能。大肠杆菌细胞分裂形成微菌落[11]。这些实验使用相衬和荧光显微镜的组合进行成像，并使用带有GFP转录报告基因的菌株来量化大肠杆菌素Ib（cib）表达的水平。该基因的表达在细胞之间变化很大，但在一代内保持稳定。群体水平异质性和个体水平稳定性的结合意味着每个细胞中的GFP表达水平可以为FAST的跟踪算法贡献大量信息，从而显着提高其性能。
我们首先将自动跟踪和划分检测应用于单个数据集。我们使用叠加模块可视化微菌落的谱系结构，以快速验证谱系分配的准确性（图4A和4B，S1电影）。这表明，实验开始时存在的每个单个细胞的后代在菌落内形成了高度细长的结构，类似于先前在实验中观察到的模式，其中集落由多个标记有不同荧光蛋白的创始人细胞启动[8]。接下来，我们使用批处理工具doubleFAST，使用分析第一个微菌落时获得的参数自动分析八个数据集的其余部分。表2显示了按模块和数据集划分的处理时间的完整细分 - 总共处理所有八个数据集需要5.5分钟，或标准笔记本电脑上每个微菌落约40秒（方法）。
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表 2. 世系数据集的处理时间和维度。
“维度”将原始成像数据集的大小表示为 x 大小、y 大小和持续时间。x 和 y 大小以像素为单位记录，而持续时间记录为帧数。“对象”表示手动校正分割中分割对象的总数，而“单元格”表示手动校正的轨迹数据集中单独像元轨迹的总数。“处理时间”部分报告了 FAST 的每个模块在标准笔记本电脑上处理每个数据集所需的时间（以秒为单位）（有关详细信息，请参阅方法）。
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图4. 使用包含八个大肠杆菌微菌落的实验数据集对 FAST 的性能进行基准测试。
（A）显示典型微菌落内单个细胞在扩张时的运动轨迹，其中颜色表示瞬时细胞长度。（B）在三个不同时间点自动跟踪微菌落。在第1代（“Gen 1”）中共享同一母体的细胞被标记为相同的颜色，说明不同谱系的空间分布如何随着时间的推移而发展。最终时间点（“Gen 6-7”）中偶尔出现的黑色细胞表示未分配给正确谱系的细胞。（C）用FAST处理来自八个不同微菌落的图像，以自动获得轨迹和分裂事件。然后将这些与手动策划的地面实况进行比较，以计算F1-scores，量化分割模块（三角形）、跟踪模块（实心圆圈）和除法检测模块（空圆圈）的性能。这些分析在两个平行流中进行：在“校正”流中，跟踪和分区检测模块的输入已手动校正，而在“自动”流中，这些输入直接从前一个模块获得，并且未校正。（D）当对包含超过32个单元格的所有时间点进行平均时，我们发现可跟踪性指标是全自动条件下跟踪和分裂检测模块准确性的可靠预测指标。此外，该分析表明，将细胞长度、宽度、荧光强度和位置作为跟踪模块中的特征（“所有特征”，紫色）将跟踪和分裂检测模块中的误差中位数减少了约 5 倍，与仅使用细胞位置获得的结果（“仅质心”，棕色）。（E-H）接下来，我们通过比较与特征值波动相关的指标来研究哪些因素会影响可追踪性——平均细胞速度 （E）、相对伸长率（每分钟细胞长度的分数变化）（F）、GFP 强度的变异系数 （COV） （G） 和细胞宽度的 COV（H）。相关性的统计显著性使用以下符号表示：* = p < 0.05，** = p < 0.005，n.s. = 不显著。这些分析是使用对数变换的F进行的1-分数在 D 中，并且基于线性回归 t 检验。C-H 中的橙色点表示 A 和 B 中显示的示例微菌落.A 和 B 中显示的可视化是使用 FAST 的叠加模块生成的。
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尽管这些自动分析产生了高度准确的结果，但观察到一些跟踪和除法分配误差（图4B）。为了客观地评估 FAST 算法的准确性，我们通过构建手动验证的分割、跟踪和除法检测模块输出的地面真实版本来对结果进行基准测试。在跟踪模块的情况下，我们的跟踪校正 GUI 极大地促进了这项任务。然后，我们的分析通过两个单独的流进行：在第一个“校正”流中，我们使用分割模块的手动校正输出作为跟踪模块的输入，并使用跟踪模块的手动校正输出作为分区检测模块的输入，使我们能够独立评估每个模块的质量。在第二个“自动化”流中，我们使用每个模块的未校正输出作为下一个模块的输入。这使我们能够评估跟踪和除法检测算法在大规模分析的典型条件下的性能，其中早期分析的错误未经校正就传播到后续步骤中（图4C）。
我们发现我们的分割模块的结果非常准确，中位数错误分割率为0.52%。跟踪模块同样准确，使用未校正的分割作为输入时，中位数错误率为 1.02%。这与DeLTA 2.0报告的错误率非常相似[36]，后者也以van Vliet等人的微菌落数据集为基准[11]。然而，我们注意到，DeLTA 2.0报告的平均错误率是一个聚合度量，其中还包括来自其他E的数据集。van Vliet 等人 [11] 中的大肠杆菌基因型在这里不考虑。手动纠正FAST罕见的错误分割对跟踪模块的性能影响相对较小，将中位数错误率降低到0.71%，这表明跟踪算法用于桥接错误分割的自动化系统按预期执行。相比之下，当手动校正输入轨迹时，分频检测模块的性能得到了显着提高，中位数错误率从4.77%下降到0.63%。因此，如果需要高度准确的世系分配，我们建议使用我们的轨迹校正 GUI。
我们还分析了可跟踪性作为跟踪算法性能预测指标的效用，相当于我们使用SPR模型的自动基准测试（图4D）。和以前一样，我们发现具有相对较多细胞数量（>32）的所有时间点的平均可追踪性是不同微菌落跟踪性能的可靠预测指标。对于单个时间点也是如此，可跟踪性是跟踪保真度的更好预测指标，而不是更基本的指标，例如微菌落内的当前细胞数量（S3图）。我们还发现，可追踪性是检测分区准确性的有力预测指标（图4D）。最后，我们测量了使用大量特征（细胞长度、宽度、荧光和位置;表示“所有特征”）时跟踪和分裂检测算法的性能，与仅使用细胞位置（表示“仅质心”）时相比。与之前在合成数据集中观察到的情况类似，添加额外的特征大大提高了我们算法的性能，将跟踪和除法分配错误的数量减少了大约 5 倍。
鉴于我们分析的八个微菌落使用相同的细菌菌株并在相同的实验条件下生长，我们对我们在八个微菌落中观察到的跟踪性能的变化感到惊讶。这种变化的一个潜在原因是，针对一个数据集优化的用户定义的跟踪参数对于其他微菌落不是最佳的。然而，当我们使用不同的用户定义的跟踪参数系统地重复基准时，我们发现产生最准确结果的跟踪参数集在八个微菌落中高度保守（S4图），这表明这不是主要原因。接下来，我们询问样品之间的生物学差异是否可能是观察到的性能变化的原因。为了测试这一点，我们使用手动校正的轨迹测量了每个微菌落的平均细胞速度、相对伸长率（每分钟细胞长度的平均分数增加）、GFP 荧光的变异系数 （COV） 和细胞宽度的 COV，并研究了这些指标与微菌落的可追踪性的关系（图 4E–4H).我们发现细胞在微菌落内移动和生长的平均速率与微菌落的可追踪性显着相关。相比之下，在细胞荧光和细胞宽度中观察到的变异量对微菌落的可追踪性没有明显影响。综上所述，这些结果表明，我们观察到的可追踪性指标的变化是由不同微菌落的真实生物变异驱动的。在这种情况下，每个微菌落中细胞平均生长速率的差异可能会推动这些非运动菌落扩张速度的变化，从而影响跟踪和分裂检测的保真度。
总之，这些分析表明，分割误差不会对FAST的跟踪性能产生实质性影响，但跟踪误差会对细胞分裂事件的检测产生不利影响。此外，这些对实验数据的分析验证了我们之前从合成数据集中发现的，首先证明通过包含细胞位置以外的细胞特征可以显着提高跟踪性能，其次证明可跟踪性是跟踪保真度的可靠预测指标。最后，本案例研究表明，用户定义的跟踪参数F和P不需要过度微调即可获得可靠的跟踪结果（S4图，注意对数间隔的轴）。
量化密集堆积的P中细胞运动的快速爆发。单层铜绿假单胞菌。
许多不同种类的细菌在密集的群落中产生集体运动，使用鞭毛、IV.型绒毛或通过滑行[2,15,35,37]。运动性使种群能够迅速扩展到新的领域，使其比非运动基因型具有竞争优势[1,38]。在这里，我们展示了如何使用FAST来量化P的行为。琼脂和玻璃之间形成的间质菌落中的铜绿假单胞菌[37]。我们专注于直接在菌落前缘后面形成的单层内的细胞，其动力学在间质菌落和更经典的“表层”菌落中基因型之间的竞争中起着至关重要的作用[1]。
与非运动细胞相比，跟踪经历集体运动的细胞需要更大的采集帧速率。虽然昂贵的定时板可用于以高精度“触发”相机，以保持帧间时间几乎恒定，但许多高端研究显微镜缺乏这种能力。相反，“相机流”更广泛地可用，它直接将相机的输出流式传输到计算机，从而尽可能快地保存帧。这样可以最大限度地提高帧速率，但通过相机流获取的图像在后续帧之间经过的时间可能会略有变化。
为了说明如何使用FAST来处理通过相机流收集的图像序列，我们收集了一个大型数据集，其中以平均每秒3帧的速度记录了505,127帧。此数据集的大小约为 8 Gb，每帧包含大约 1,700 个紧密排列的 P。铜绿假单胞菌细胞。尽管该数据集很大，但使用FAST处理可以在标准笔记本电脑上完成（方法），只需200分钟即可分割，355分钟即可提取~6万个单独对象中每个对象的特征。
跟踪包括两个独立的阶段：模型训练阶段和链接分配阶段。模型训练阶段完成后，FAST自动生成并绘制数据集在每个时间点的可跟踪性（图5A）。对于我们的数据集，该图显示可跟踪性在某些时间点急剧下降。我们假设这些下降是由于成像帧速率的降低。为了测试这一点，我们将可跟踪性得分与?t（根据时间戳计算的帧之间经过的时间）绘制成图表（图5A，插图）。这揭示了很强的负相关（皮尔逊相关系数 = -0.705），表明帧之间的时间越长，可跟踪性越低，跟踪结果越不准确。为了避免这些时间点以及它们可能产生的虚假跟踪结果，我们使用跟踪模块的内置时间窗口选择工具来指定要跟踪的帧子集（图5A，绿色区域，750帧）。为这个缩减的数据集训练跟踪模型需要 18 分钟，而跟踪和跟踪处理需要额外的 88 分钟。
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图5. 追踪通过基于毛的运动传播的间质铜绿假单胞菌菌落中的单个细胞。
（A）我们使用FAST跟踪单层铜绿假单胞菌内的细胞，这些细胞使用位置，长度和宽度作为特征进行集体运动。使用平均帧速率为127 fps的高速“相机流”收集图像，但后续帧之间经过的时间变化（?t）导致可跟踪性的瞬时降低。（A，插图）对与每帧相关的时间戳的分析表明，可跟踪性得分与?t呈负相关（r表示皮尔逊相关系数;较暖的颜色表示数据点密度较高）。因此，我们使用FAST的内置工具将后续分析限制在可追踪性得分相对恒定的数据子集（绿色区域）。（B）我们使用叠加模块根据单元格的瞬时速度对单元格进行颜色编码。虽然细胞通常移动相对较慢，但偶尔观察到细胞经历非常快速的运动爆发（见奶油色细胞）。（C）这些快速跳跃也可以在单个细胞的速度痕迹中观察到。在这里，我们绘制了三个不同单元格随时间变化的瞬时速度，每个单元格的颜色都不同。上面的蒙太奇说明了其中三个瞬态事件，使用与B所示相同的颜色编码。 为了在群体水平上研究这些运动，我们计算了所有细胞在x和y方向上的瞬时细胞速度，并绘制了它们的组合分布。在其他有源系统中，这种分布近似于高斯分布。然而，在我们的系统中，高度瞬态的速度爆发会导致重尾，导致它们偏离具有相同方差的高斯分布（黑色虚线）。
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在此示例中，相对较大的时间步长 ?t 允许单元格在帧之间进一步移动，这会降低可预测性，从而降低可跟踪性分数。然而，更一般地说，可跟踪性取决于实验和成像条件的组合，从而为解释数据集提供了可靠的指标。例如，可追踪性分数可用于快速识别实验过程中可能出现的各种问题，包括焦点波动、照明强度或样品的意外移动。一旦确定了有问题的时间点，用户可以决定通过使用图像的子集来避免它们（如本例所示），或者拒绝整个数据集。
跟踪我们指定的较小图像子集会产生 1,600 多个单独的轨迹，每个轨迹至少有 200 个时间点长。为了可视化这个大型数据集，我们使用叠加模块根据瞬时速度为相衬图像中的单个细胞着色（图5B，S2电影）。这表明，虽然大多数细胞以相对较慢的速度移动，但少数细胞经历快速，零星的运动爆发比平均水平快约25倍。这些快速运动在测量单个细胞随时间变化的速度时也清晰可见（图5C）。我们的结果类似于先前在孤立P中观察到的“弹弓”。铜绿假单胞在玻璃/液体界面处移动，显然是由毛发脱离事件驱动的[39]。但是，我们记录的峰值速度（高达60μm s-1） 在 P 的集体中。铜绿假单胞菌比以前观察到的大约20倍。虽然我们不知道这种差异的具体原因，但高细胞密度、玻璃/琼脂间质集落环境和我们较高的帧率（~13 倍 [39]）促进的与邻近细胞的相互作用可能都起作用。
为了说明如何挖掘这个大型跟踪数据集以阐明罕见事件的统计数据，我们从我们的轨迹（i.e. 瞬时速度矢量的 x 和 y 分量）（图 5D）。虽然先前的研究发现，精子和游泳的细菌细胞经历集体运动会产生大约高斯的边际速度分布[35,40]，但我们观察到细菌通过基于毛皮的运动集体移动表现出更重的尾巴，对应于它们偶尔的快速运动。尽管这些事件很少见，但只有不到0.05%的测量值大于20μm s-1—尽管如此，我们获得的细胞轨迹数量却非常多，这使我们能够精细地解析它们的统计分布。这些分析证明了如何使用FAST在密集堆积的条件下快速表征大量细胞的运动性，而用户输入和计算工作量相对较少。
自动分析T6SS战斗。
为了说明FAST超越标准细胞追踪的能力，我们使用FAST分析了6型分泌系统（T6SS）的活性。T6SS是一种高动态细胞器，由分子“矛”组成，上面有一种称为效应器的毒素[41]。拥有T6SS的细菌可以将这种效应子注射到邻近细胞中，从而杀死它们[42]。可以通过可视化形成T6SS针收缩鞘的蛋白质的定位来监测放电事件，TssB在P中。霍乱弧菌中的铜绿假单胞菌和VipA[12,43]。在这里，我们重点介绍了如何使用FAST来量化T6SS在V的共培养物中的调节方式。霍乱和P.铜绿假单胞菌。
由于其距离短，T6SS仅在高细胞密度下有效，这在历史上使得使用自动分析进行研究变得困难。我们使用FAST来分析显示V的成像数据集。霍乱和P.分别表达VipA-mCherry和TssB-mNeongreen的铜绿假单胞菌细胞在密集堆积的单层中混合在一起时通过各自的T6SS相互作用[12]（图6A，左）。我们使用FAST的后处理工具箱将这两个物种区分开来（图6A，右），该工具箱比较mCherry和mNeonGreen通道中每个细胞的强度，以自动将它们分配给两个不同的群体（图6B）。该实用程序允许人们快速比较同一样品中不同基因型的行为。
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图6. 鉴定不同的细菌种类，量化细胞形态，并在密集的集体中研究T6SS动力学。
（A）由表达TssB-mNeongreen的铜绿假单胞菌细胞和表达VipA-mCherry的霍乱弧菌细胞混合物组成的单层（左）。测量两个不同荧光通道中每个细胞的平均强度使我们能够自动区分两种物种（B），这种方法称为图像细胞术。通过对每个细胞（铜绿假单胞菌、青色、霍乱弧菌、红色）进行颜色编码，我们能够直观地确认分配过程的准确性（A，右）。（C）然后，我们使用FAST的自定义特征提取框架来计算分割骨架（插图）的曲率，量化了一个新的特征，即细胞曲率。将这些测量结果分成先前分配的两个群体，显示逗号形霍乱弧菌细胞比杆状铜绿假单胞菌细胞弯曲得多。（D-F）然后，我们使用FAST的绘图选项来说明T6SS的动力学。铜绿假单胞菌细胞发射其T6SS机制（观察为TssB的明亮点），可以使用kymograph（D）和“cartouche”（F）绘图选项进行可视化，这也导致mNeongreen通道（E）的标准偏差增加。（G）我们使用后一种测量来检测T6SS何时在细胞中处于活动状态，使我们能够测量群体中每个细胞在放电状态下花费的时间比例。我们的分析证实，当与具有无活性T6SS（Δhcp1 Δhcp2）的霍乱弧菌菌株共培养时，与WT V. cholerae共培养时相比，WT P. aeruginosa细胞的T6SS活性显着降低。在这里，圆圈显示来自不同电影的平均值，水平线显示给定基因型组合的所有样本的平均值。
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FAST的架构允许用户轻松定义和量化FAST中尚未包含的新特征。为此，用户可以编写一个简短的特征测量脚本，该脚本可以利用每帧中每个对象的分割，以及每个成像通道中的相应区域 - 在这种情况下，mNeongreen，mCherry和相衬信号。然后，特征提取模块以与内置特征相同的方式自动存储这些自定义特征，从而允许将它们集成到下游分析中。为了说明这种能力，我们提取细胞曲率作为自定义特征，看看我们是否可以检测到V形态的差异。霍乱细胞（逗号形）来自P。铜绿假单胞菌（呈杆状）。使用基于骨架化的方法，我们从其分割中提取每个细胞的形态主干，并通过找到这组点的最佳拟合圆来测量其曲率。与预期一致，我们的自动分析发现细胞被识别为V。霍乱比那些被确定为P的霍乱弯曲得多。铜绿假单胞菌（图6C）。
我们的软件还能够生成复杂的可视化和分析单个细胞的行为。例如，FAST允许使用绘图模块的kymograph选项（图6D）以及“cartouche”选项（提取和对齐指定细胞的裁剪图像）轻松可视化单个细胞中T6SS放电的动力学（图6F）。我们还可以使用与给定单元相关的特征数据来量化T6SS的动力学：mNeongreen通道的标准偏差在发射过程中显着增加（图6E），因为TssB在组装到鞘中时变得不均匀地分布在单元中。
人们普遍认为，P.铜绿假单胞菌仅在邻近细胞的T6SS放电触发时才触发其T6SS[9,12]。尽管这方面的定性证据很有力，但据我们所知，这种影响从未被直接量化，可能是因为追踪密集堆积的细胞涉及困难，并且因为T6SS放电事件本身相对罕见。因此，我们决定使用FAST同时跟踪大量密集堆积的细胞，并自动检测每个细胞何时发射T6SS。我们使用doubleFAST自动分析来自WT P的实验的多个数据集。铜绿假单胞菌细胞与WT V共培养。霍乱或与突变型V共培养。无法发射T6SS（Δhcp1 Δ hcp2）的霍乱菌株。使用mNeongreen通道的标准差来区分P时。铜绿假单胞菌正在积极发射其T6SS，我们计算了P的时间比例。铜绿假单胞菌细胞燃烧T6SS（图6G，S3电影）。正如预期的那样，当与失活的Δhcp1 Δ hcp2 V共培养时。霍乱菌株，P.与WT V共培养相比，铜绿假单胞菌大大减少了其发射T6SS所花费的时间比例。霍乱。这些分析产生了1,246个单独的轨迹，其中大约一半（601个）跨越了实验的全部151个时间点。总之，本案例研究展示了FAST如何自动区分不同的物种，用户如何指定细胞曲率等新特征，以及如何使用特征数据量化复杂的细菌行为。
讨论
实验技术和自动化显微镜的进步已经将活细胞成像从主要依赖于定性观察的技术转变为利用大量数据的高度定量学科。这种复兴不可或缺的是计算工具，可以自动解析和注释这些实验产生的大型成像数据集。为此已经开发了许多工具[17,24-28,44-47]，每个工具都针对特定的研究问题进行了优化。正如我们在本手稿中强调的那样，我们自己的贡献特别适合分析细胞紧密堆积在一起的实验。
我们设计了FAST，通过最大限度地减少跟踪模块中用户定义参数的数量和处理包含许多细胞的成像数据集所需的计算时间，允许用户快速获得高质量的结果。我们的跟踪算法会自动确定如何组合来自不同单元格特征的数据，从而防止用户不得不通过按顺序调整大量参数来迭代改进跟踪结果——这通常是一个非常缓慢和费力的过程。在图4的微菌落分析中，使用FAST的内置工具选择用户定义的跟踪参数F和P的适当值只需几分钟。随后的基准测试表明，对于所有八个数据集，为第一个微菌落选择的特定F和P参数集几乎是最佳的（S4图）。这种鲁棒性允许用户使用 doubleFAST 对许多数据集的自主分析进行排队。我们的方法还为用户提供了一个易于解释的指标，使他们能够快速识别和避免预测会产生低保真轨迹的数据集部分。虽然基本的FAST软件包已经输出了研究人员广泛使用的大多数细胞特征，但对系统的简单修改允许用户将新功能集成到现有的分析框架中。
我们还注意到我们的方法存在一些局限性。首先，视场的大规模偏移，例如由热漂移或电动载物台的不精确移动引起的，会对FAST的跟踪精度产生不利影响。虽然这些变化发生的时间点可以通过相关的可跟踪性急剧降低来确定（并且可能被排除在后续分析之外，类似于图5A中显示的过程），但通常最好使用TurboReg [48]等工具稳定麻烦的数据集，然后再使用FAST处理它们。我们还注意到，我们的方法依赖于汇总统计数据，例如Σt（δx）（特征位移的协方差矩阵）意味着当视野中的像元数量非常低 （?10） 时，它可能会出现稳定性问题，因为没有足够的训练数据来准确估计这些统计数据。但是，如果这会带来问题（例如在微菌落数据集开始时只有少量细胞），则涉及的相对少量数据通常使得使用手动轨迹校正GUI纠正这些错误变得可行。
跟踪系统通常以两种方式之一分解 - 无法区分单个对象，或者跟踪算法无法在帧之间准确链接个人。机器学习越来越多地用于解决这两个挑战中的第一个，许多使用深度学习方法高密度分割微生物的软件包现在被广泛使用[36,46,47,49,50]。然而，这种技术在追踪问题中的应用直到最近几年才获得关注[36,51-53]。这里描述的方法基于一个统计框架，该框架优化了轨道质量，同时提供了一个预测轨迹可靠性的指标。我们的软件已经证明了它能够阐明单个细菌在密集条件下表现出的丰富而复杂的行为[1,10,22,23]。这些实验和分析方法相结合的未来工作最终可能会为密集细菌群落的功能提供新的线索，并帮助我们开发操纵它们的新策略。
在线方法
计算资源
本手稿中介绍的所有分析均使用Microsoft的Surface Book 2,8核Intel i7-8650U CPU和8 Gb内存进行。FAST 直接在 Matlab 2018b 版本中运行。
SPR 模型
本手稿中使用的2D SPR模型已在别处详细描述[1,35]。简而言之，我们将细胞建模为由均匀间隔的汤川段组成的硬棒，相互排斥的点电位。我们通过用 N 填充一个正方形域来初始化系统r杆，均匀分布在格子上。每根杆 i 与纵横比 a 相关联我和荧光强度 I我，从拟合到 P 的分布中随机抽取。来自可视化T6SS [9]的实验的铜绿假单胞菌数据，如S1图所示。系统的堆积分数ρ计算为，其中A是模拟域的面积，具有双重周期性边界条件。
取杆的瞬时位置 i 作为 r我，其方向为 φ我，表示此方向的单位向量为 和 i 和所有其他杆之间的电位之和为 U我，我们将每根杆的运动方程定义为：
（5A）
（5B）
其中 fT是平移摩擦张量，fθ是旋转摩擦常数，ν是每根杆沿其轴线施加的自推进力的大小。我们使用 [35] 中给出的公式来计算 fT和 fφ，而连杆长宽比和斯托克斯摩擦系数 f 的函数又是0.我们通过使用中点方法对方程 5A 和 5B 进行数值积分来模拟系统的动力学。
在初始瞬态之后，系统达到统计稳态。此时，我们开始以采样“帧率”ΔT测量每根杆的位置、方向、长度和强度。我们将模拟测量噪声添加到每个测量值中，该噪声是从平均值为零的高斯分布中提取的。每个特征的测量噪声标准偏差由参数控制σr（位置噪声），σφ（定向噪声），σ一个（长度噪声）和σ我（荧光噪声）。为了限制这些噪声参数的基线估计值，我们测量了T6SS射击数据集中每个相应特征如何围绕平均值波动[9]。该数据集中的细胞是非运动的，帧率足够高，生长可以忽略不计，这意味着位置、方向、长度或荧光的任何明显变化都完全归因于测量噪声。
我们通过调整参数 N、v、ΔT σ 的值来改变模拟的属性。r、σ一个和σ我在不同的模拟运行中。这些参数的值以及固定的系统参数如表1所示。
样品制备
P的单层。图5中所示的铜绿假单胞菌是使用野生型PAO1菌株制备的[54]。将细胞从冷冻储液中划出到LB琼脂平板上（Lennox，20g / l，Fisher Scientific，用1.5%（w / v）琼脂固化，Difco品牌，BD），并在37°C下孵育过夜。 从所得培养板中挑选单个菌落，并在连续振荡下在液体培养物中孵育过夜，从而得到固定相培养物。然后将其稀释30倍，并返回振荡培养箱再放置两个小时，产生指数阶段的培养物。通过调节600nm（OD600）的指数相培养物到0.05使用新鲜LB，对应于大约12,500个细胞μl的浓度-1.
我们使用与[37]中描述的类似的方案从这些培养物中制备单层。将1μl接种培养物点样到小（2cm x 2cm）LB琼脂垫的中心。为了为观察抽搐运动提供最佳条件，这些垫中琼脂的浓度为0.8%。然后将该垫倒置并放入盖玻片底部培养皿（175μm盖玻片厚度，MatTek）的底部，然后将其关闭并在室温下孵育16小时。关闭培养皿盖的能力使我们能够避免在孵育过程中样品干燥。到潜伏期结束时，形成了一个在其周边具有致密单层的大型间质菌落[1]。
显微术
用于快速运动分析的高帧率短片（图5）是使用蔡司Axio Observer.Z1显微镜采集的，该显微镜配备了设置为“相机流”模式的Axiocam 702相机和Plan Apochromat 63x油浸物镜。
其他数据集
除以E的数据集。大肠杆菌细胞（图4）从与参考文献[11]、https://zenodo.org/record/268921 相关的原始数据存储库下载。然后使用定制版本的TurboReg插件[48]来稳定它们。T6SS发射数据集（图6）是根据知识共享署名许可从参考文献[12]的补充信息部分下载的。斐济的[55]内置AVI阅读器用于提取这部电影的各个帧。
支持信息
用于指定 SPR 模型初始条件的分布。
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S1 图 用于指定 SPR 模型初始条件的分布。
非运动P数据集的轨迹平均纵横比（A）和GFP强度（B）的分布。铜绿假单胞菌细胞[9]。伽马分布（形状参数 = 15.3，尺度参数 = 0.248）和正态分布（平均值 = 63.1，标准差 = 8.83）分别拟合到这两个数据集（黑色虚线）。要初始化 SPR 模型，杆长宽比，a我和模拟荧光强度，I我，是从这两个拟合分布中随机抽取的，使我们能够确保在模拟中对这两个特征进行真实建模。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011524.s001
（蒂夫）
S2 图 包括其他要素信息可提高可追踪性并提高追踪保真度。
我们测量了可追踪性（A，B）和最大F1-使用一系列不同参数组合生成的合成高密度运动数据的分数（C，D）。“仿真参数”（改变我们用于生成合成数据集的SPR模型属性的参数A，C）和“测量参数”（改变每个不同特征的测量噪声量的参数B，D）都是不同的。有关更多详细信息，请参阅表 1。在这里，我们将跟踪算法只能使用位置信息（“质心”，棕色）与所有特征信息可用（“所有特征”，紫色）时的可跟踪性和跟踪保真度进行比较。箭头显示了当使用合成数据集中的所有特征时，这两个指标的持续增加，说明了我们方法的稳健性。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011524.s002
（蒂夫）
S3 图 与微菌落内的细胞数量相比，可追踪性指标是跟踪性能的更可靠的预测指标。
我们使用手动校正的地面真实数据集来计算FAST跟踪算法在图4所示微菌落数据集的每个时间点的性能，使用全套特征（紫色）或仅使用细胞位置（棕色）。对于包含 32 个或更多单元格的所有时间点，我们随后比较了得到的 F1-得分为（A）瞬时可追踪性和（B）微菌落中的细胞数量。对于所有四个回归，预测变量与 F 之间的相关性1-score是显著的（p < 0.05，线性回归t检验），但是可追踪性的相关性强度远高于细胞数，如相应的皮尔逊相关系数（r）所示。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011524.s003
（蒂夫）
S4 图 细胞跟踪对两个用户定义参数的变化具有鲁棒性，并在实验数据集中产生一致的结果。
我们追踪了八个E中每个E中的细胞。大肠杆菌微菌落四十九次不同的时间，每次用一组不同的两个用户定义的参数——F，训练数据集中包含的链接比例和P，跟踪阈值。这两个参数允许用户分别在初始训练阶段和主要跟踪阶段平衡轨迹质量和轨迹数量之间的权衡。然后，我们将这些自动分析的结果与手动策划的地面实况进行比较，以计算F1–分数，衡量整体跟踪保真度。这些分析使用全套特征（长度，荧光强度，宽度和位置，上图）和仅细胞位置（下图）重复。在这两种情况下，我们都发现了一个广泛的[F，P]参数值，这些参数值产生了相似水平的跟踪性能。此外，产生最佳结果的[F，P]值的组合在不同的微菌落之间是相似的，这表明针对一组实验图像优化的一组[F，P]可以应用于后续数据集，而不会对跟踪性能产生不利影响（注意对数轴）。 图4分析中使用的F和P值用黑色方块表示。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011524.s004
（蒂夫）
S1 电影。 跟踪生长中的E中的细胞，分裂和谱系。大肠杆菌微菌落。
E.使用相衬和荧光显微镜对微菌落中的大肠杆菌细胞进行成像[11]（左）。左侧面板显示了原始相衬和荧光图像的组合，中间面板显示了单个细胞轨迹（其中颜色表示瞬时细胞长度），右侧面板显示了“谱系树”。在谱系树中，细线表示单个细胞的轨迹，粗线表示分裂事件 - 两者都用颜色编码以表示从原始创始人细胞经过的世代数。该视频显示了图4 A和B中所示的相同“自动化”分析，其中没有手动校正任何内容。所有图形均由FAST的内置叠加模块生成。图像数据集是从先前的研究中获得的[11]。此处显示的是Dataset_ID 140408_01_cib（见表 2）。运行时间：7 小时 5 分钟。
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（阿维）
S2 电影。 量化单个P的快速弹弓状运动。铜绿假单胞菌在密集的单层中。
细胞分割按其瞬时速度进行彩色编码（使用叠加模块），范围从静止（黑色）到最大检测到的细胞速度（浅橙色）。圆圈显示当像元暂时被错误分割时由跟踪算法插值的时间点。在这里，我们只显示长度超过200帧的轨迹，这些轨迹包含在我们的最终分析中。虽然FAST输出许多较短的轨迹，但由于多个连续的细胞分割错误，这些轨迹通常会终止。因此，为了保守起见，我们只使用很长的轨迹来量化罕见的弹弓事件（图5D）。此影片显示了整个 230 帧长数据集的 750 帧子集。运行时间：1.809 秒。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011524.s006
（阿维）
S3 电影。 自动检测 P。铜绿假单胞菌T6SS 触发事件。
我们使用FAST工具箱中的功能自动检测6型分泌系统（T6SS）的放电事件，该功能自主识别细胞分割中GFP像素强度标准偏差的短暂增加（图6E），这是由于T6SS针周围的荧光标记鞘的组装和收缩引起的。触发事件由红色圆圈（使用叠加模块）标记，这些圆圈以细胞质心为中心，并按细胞长度缩放，在显示GFP强度的灰度图像上。这些影像数据集是从先前的一项研究中获得的[12]。运行时间：3 分钟。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011524.s007
（阿维）
S1 文本。 设计目标和模块规格。
包括 S5 图到 S9 图。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011524.s008
（英文）
确认
我们要感谢在FAST开发过程中对其进行测试并提供反馈的众多人员，包括N.A. Costin，S.C. Booth，J.H. Wheeler，E.T. Granato，R.K. Kumar，W.P.J. Smith，CJ Walther和H. Todorov。我们还要感谢 S. van Vliet 关于 E 的建议。大肠杆菌微菌落图像数据集。
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