《免费医学论文发表-基于颗粒的模拟揭示了两个正反馈回路，允许在酵母交配期间重新定位和稳定极性位点》期刊简介
免费医学论文发表-基于颗粒的模拟揭示了两个正反馈回路，允许在酵母交配期间重新定位和稳定极性位点
抽象
许多细胞根据外部方向线索调整极化生长或迁移的方向。酿酒酵母在交配过程中将其细胞前额（也称为极性位点）定向到信息素梯度上。然而，初始极性位点通常不面向最终的交配伴侣，并且细胞在发展稳定方向之前以不确定的方式重新定位极性位点。在这个重新定向阶段，极性位点表现出不稳定的组装-拆卸行为，并在细胞皮层周围移动。这种动态行为背后的机制仍然知之甚少。基于粒子的磁芯极性电路仿真表明，分子水平的波动不太可能克服极化所需的强正反馈并产生重新定位的极性位点。令人惊讶的是，包含促进极性位点定向的第二条途径产生了具有与实验中观察到的性质相似的极性位点的重新定位。该途径形成第二个正反馈环路，涉及受体募集到细胞膜并将极性建立与梯度传感耦合。第二个正反馈回路还允许细胞在位点与信息素梯度对齐后稳定其极性位点。
作者摘要
细胞执行许多复杂的任务，包括定向生长、迁移、分裂和分化。为了完成这些任务，相关的分子机制被定位到特定的细胞区域。细胞成分的不对称分布称为细胞极性。极性是通过蛋白质Cdc42的局部激活建立的。 建立调节Cdc42时空活性的机制是细胞生物学的一个基本领域。交配酵母细胞动态地重新定位具有高Cdc42活性的区域，称为极性位点，并在位点正确对齐后相互生长。我们通过对调节Cdc42活性的生化反应进行基于粒子的模拟来研究产生动态极性位点的机制。反应包含两个正反馈回路，可增强Cdc42活性。第一种涉及通过募集激活剂对Cdc42进行自催化活化。虽然极性建立是必需的，但这种反馈回路本身创建了一个稳定的极性站点，不会重新定位。结合第二个反馈回路，将极性机制耦合到细胞外交配信号，产生重新定位极性位点。该反馈回路还提供了一种机制，用于开发极性位点的稳定对齐。我们的研究结果提供了细胞如何调节极性动力学以完成复杂任务的见解。
数字
Fig 7图1表1图2Table 2Fig 3Fig 4Fig 5Table 3Fig 6Fig 7图1表1图2
引文： 关 K， 柯蒂斯 ER， 卢 DJ， 埃尔斯顿 TC （2023） 基于粒子的模拟揭示了两个正反馈回路，允许在酵母交配期间重新定位和稳定极性位点。公共科学图书馆计算生物学19（10）： e1011523. https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011523
编辑 器： 帕德米尼·兰加马尼，加州大学圣地亚哥分校，美国
收到： 4月 2023， 17;接受： 2023月 2， 2023;发表： <>月 <>， <>
版权所有： ? 2023 关等这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。
数据可用性： 用于生成图形和模拟的代码可在 https://github.com/guanhighyun/Indecisive-polarity-behavior 公开获得。
资金： 这项工作得到了NIH / NIGMS赠款的支持，R35GM127145给T.C.E.和R35GM122488给D.J.L.。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。
竞争利益： 提交人声明不存在相互竞争的利益。
介绍
细胞极性是细胞成分沿某个轴的不对称分布。许多细胞根据环境线索动态调整极化方向。迁移细胞在追踪细胞外信号时将细胞重新定位到“前方”[1-3]。花粉管、植物根尖、真菌菌丝、神经元轴突和酵母细胞会根据物理或化学线索改变极化生长的方向[4-8]。极性位点重新定位背后的机制尚不清楚。
控制细胞极性的分子机制以Rho家族GTP酶Cdc42为中心，该酶在真核生物中高度保守[9,10]。Cdc42充当分子开关。当与GDP结合时，Cdc42处于关闭状态，并且大多数通过与GDP解离抑制剂（GDIs）的相互作用保持在细胞质中。非活性的Cdc42可以过渡到膜并从GDI解离。膜相关的Cdc42由鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEF）激活，该因子促进GDP的释放以允许GTP结合。活性GTP-Cdc42结合调节细胞骨架的各种“效应”蛋白。
出芽酵母酿酒酵母的极性回路已被广泛表征。酵母细胞在出芽和交配过程中使其生长两极分化。极性通过自催化正反馈建立和维持[11,12]。含有效应子和GEF的细胞质蛋白复合物与膜处的活性Cdc42结合，并促进邻近Cdc42分子的活化[11,13]。由于与细胞质相比，膜中的扩散速度较慢，因此膜中的Cdc42分子簇分散缓慢，但可以从广泛的集水区募集细胞质极性因子，从而维持极性位点。捕获这些特征的数学模型概括了在营养酵母细胞中观察到的Cdc42定位模式：非极化细胞发育出簇，这些簇迅速粗化形成单个极性位点，然后稳定地维持[12-17]。然而，在交配过程中，酵母细胞重新定位其极性位点，显然是为了寻找交配伴侣[18,19]。这一观察结果提出了如何修改酵母极性回路以允许重新定位的问题。
在交配过程中，每种交配类型的酵母细胞表达G蛋白偶联受体（GPCR），可检测相反交配类型释放的细胞外肽信息素[20]。与受体结合的信息素刺激Gα亚基将GDP交换为GTP，GTP将Gα与膜处的Gβγ解离。Gα和Gβγ传递信号以准备细胞交配，包括激活调节细胞极性的途径。允许细胞极性受外部信息素梯度影响的途径由支架蛋白Far1介导，该支架蛋白与Gβγ和Cdc42 GEF结合[21-23]。这导致存在Gβγ的Cdc42激活，这反映了活性GPCR的位置[22,23]。因此，信息素浓度的外部梯度可以转化为活性Cdc42浓度的内部梯度。携带交配特异性蛋白和脂质的囊泡通过福尔马林有核肌动蛋白电缆递送到Cdc42簇，使细胞能够在极性位点向交配伴侣生长[13]。然而，酵母细胞在拥挤的条件下交配，其中全局信息素梯度可能没有信息[24,25]，并且鉴于分子噪声的扰动效应，浅梯度可能难以解释[26]。事实上，交配酵母细胞中的Cdc42簇通常在不指向伴侣的位置形成[18,27,28]。然后需要重新定位极性位点才能成功配接。在最初的“不确定阶段”，交配酵母中的多个Cdc42簇会自发出现、消失并不稳定地重新定位[18]。这种行为被认为能够寻找交配伴侣，并且在不确定阶段之后，细胞会发展出一个面向所选伴侣的单一稳定极性位点[29]。
是什么导致Cdc42簇在交配细胞中的优柔寡断行为？一种说法是，不稳定的重新定位是分子水平噪声作用在酵母极性回路上的产物[27,30,31]。分子水平的噪声不能被确定性模型捕获，例如仅基于反应扩散方程（RDE）的模型，这些模型忽略了生化系统的分子性质，因此错过了噪声驱动的现象。与确定性模型相比，随机模型试图捕获由生化反应的随机性引起的随机效应。基于粒子的模型最准确地捕获分子水平噪声[17,32,33]。通过基于粒子的仿真，我们确认了真实酵母极性电路中的极性位点重新定位可能来自随机噪声，但只能在非常窄的参数范围内引起。我们发现，结合信息素响应的Far1通路可以显着扩展模型显示极性位点重新定位的参数空间。同样的途径也可以解释为什么极性最终会稳定地面向伴侣。
结果
噪声驱动的极性站点重新定位
为了系统地研究核心酵母极性电路是否可以产生像在交配细胞中看到的那样不确定的Cdc42聚类，我们使用了先前开发的模型来描述营养酵母细胞中的Cdc42行为[12,17,32,34]（图1A和表1）。模型物种是非活性Cdc42（可以在膜和胞质区室之间交换），活性Cdc42（仅限于膜区室）以及Cdc42的效应器和激活剂的异二聚体（此处称为Bem1-GEF）。这种复合物也在膜和细胞质之间交换，并且可以与活性Cdc42结合。在膜上，复合物促进无活性Cdc42的激活。该模型的主要结构特征是由Cdc42和Bem1-GEF相互激活形成的正反馈回路（图1A，插图）。在这个反馈回路中，活性Cdc42从细胞质中招募Bem1-GEF并增加其GEF活性。反过来，Bem1-GEF激活Cdc42，导致Cdc42从胞质池中进一步募集。这种正反馈环路放大了Cdc42活性的局部波动，最终导致极性位点的形成[12,35]。
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图1. 核心极性电路的行为。
A）酵母核心极性回路的反应方案（图改编自Pablo等人[17]）。极性由通过相互激活（插图）的正反馈驱动。B）Cdc42和Bem1-GEF分子丰度的双参数分岔图（非极化状态 - 绿色，瞬态极性 - 蓝色，偏振 - 红色）。C） 瞬态极性状态的仿真结果。为十次模拟生成了 Ripley K 函数值（Cdc42 聚类的度量）的时间序列（左图）。K 值的分布（右图）。D）Cdc42-GTP分子在指定时间的分布。分布取自 C 中的黑色时间序列，使用时间轴上的刻度指示的时间点。模拟对应于3000个Cdc42和102个Bem1-GEF分子，使用Cdc42和Bem1-GEF的均匀随机分布作为初始条件。E） 聚类数的时间序列。仿真结果取自 C 语言中的黑色时间序列（左图）。实验中的聚类计数示例（右图）。
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表 1. 核心极性电路的参数。
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我们的第一个目标是确定由生化反应和扩散的随机性质引起的分子水平波动是否足以促进极性位点的重新定位。为了测试这种可能性，我们使用仿真平台Smoldyn [33,36]对核心极性电路进行基于粒子的仿真，参数如前所述[17]。我们用不同数量的Cdc42和Bem1-GEF分子进行了模拟。这些初步模拟揭示了三种不同类型的行为：1）非极化，其中没有形成显着的Cdc42簇（S3A图），2）极化，其中保持单个强团簇（S3B图），以及3）瞬态极性，其中簇可以自发形成，消失和重新形成（图1C和1D以及S1电影）).这些结果表明，分子水平噪声能够触发极化稳态和非极化稳态之间的间歇性转变，这与先前关于调节系统的工作一致[37-39]。
为了量化我们的结果，我们使用了Ripley的K函数（K）的归一化版本[40,41]。K测量聚类强度，即观察到的颗粒分布与均匀分布的偏差[17]。K值接近零表示均匀分布，K的值越大，分布越偏振。我们指定了一个阈值1.5，以区分所有1D模拟的非偏振（K < 5.1）和偏振（K ≥ 5.2）状态（S1A图）。在瞬态极性状态下，K值表现出双峰分布，与在极化和非极化状态之间切换的双稳态系统一致（图1C，右图）[16,37-39]。为了研究核心极性电路产生瞬态极性的鲁棒性，我们开发了一种基于K值分布区分三种行为的方法（方法和S2图）。具体来说，我们根据K值的双峰分布定义了瞬态极性状态（S2图）。我们的分析表明，支持瞬态极性的参数制度仅限于小范围的分子丰度（图1B），正如早期工作[32]所发现的那样。因此，需要非常精确的控制细胞才能利用这种参数机制来发展瞬态极性。此外，瞬态极性状态表现出具有单个簇的长寿命非极化状态和极化状态之间的转变，而不是在优柔寡断的酵母细胞中观察到的多个快速波动的簇（图1E）。我们得出结论，交配酵母细胞的优柔寡断极性行为不太可能是分子噪声作用在核心极性电路上的简单结果。
受体-Far1通路
在交配过程中，还有一种额外的机制可以将GEF分子带到膜上。具体而言，在暴露于信息素后，与Far1（Far1-GEF）复合的GEF分子通过Far1与活性受体释放的Gβγ相互作用被募集到膜中。Far1与Gβγ的相互作用将极性回路与细胞外信息素浓度耦合。此外，受体-Far1回路形成第二个正反馈回路，因为活性Cdc42导致新受体向膜运输（图2A）。为了深入了解受体-Far1回路的行为，我们考虑了一个由Cdc42，受体和Far1-GEF组成的模型，忽略了Bem1-GEF。为了简化模型，介导受体和Far1-GEF之间相互作用的G蛋白没有明确建模。也就是说，我们假设活性受体从细胞质中招募Far1-GEF。一旦到达膜上Far1-GEF促进Cdc42活化，其功效与Bem1-GEF在与活性Cdc42的复合物中相同（图2A和表2）。我们还假设所有信息素受体都是活跃的（这类似于细胞暴露于饱和信息素浓度的情况）。信息素受体通过Cdc42定向的肌动蛋白电缆传递到细胞表面。该模型没有明确考虑肌动蛋白电缆或囊泡递送。相反，我们假设受体递送的速率由活性Cdc42的局部浓度决定（详见方法）。表面受体通过内吞作用以明确的速率内化[42,43]。我们进一步假设受体在膜上扩散非常缓慢，这与实验结果一致[18]。如上所述，由于Cdc42簇增强受体的局部积累，受体募集Far1-GEF来激活Cdc42，因此该途径形成相互激活的正反馈回路（图2A，插图）。因此，我们预计受体-Far1回路与Bem1-GEF回路（图1A）一样，将具有自发极化的能力。
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图2. 受体-Far1电路的行为。
A）受体-Far1回路的反应方案。该电路通过相互激活（插图）形成第二个正反馈回路。B）活性Cdc42（顶行）和受体（底行）的分布显示0分钟和0.3分钟。较长的受体寿命可防止极性部位的维持。使用3000个Cdc42,280个Far1-GEF和2500个受体分子进行模拟。初始条件包括3000个Cdc42-GTP的极化簇和均匀分布的受体和Far1-GEF分子。C）最终K值作为受体膜停留时间的函数。在t = 4000秒处取的K值。数据点表示 30 次模拟的 K 平均值，阴影区域表示标准偏差。快照适用于 t = 42 秒的活动 Cdc4000。
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表 2. 均匀激活的受体-Far1通路的参数。
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当我们使用真实的受体运输速率和从均匀分布中提取的初始颗粒分布来模拟该电路时，该模型并没有在生物学相关的时间尺度上自发地形成Cdc42的极化簇。即使初始条件包括强烈的活性Cdc42簇但分布的受体，初始簇也会迅速丢失（图2B）。为了理解为什么Cdc42的极化分布不能维持，请考虑受体运输的速度比Cdc42和Far1-GEF结合和解离的速率慢得多：受体的平均膜停留时间约为8分钟[42,43]，而Cdc42[46,47]和Far1-GEF [44].因此，任何Cdc42簇在被受体交通增强之前都会消散。与该解释一致，当受体停留时间因增加受体运输速率而减少时，受体-Far1回路确实自发地建立了极性（图2C）。
我们的模拟表明，尽管有正反馈回路（图2A），但由于Cdc1（短）和受体（长）的停留时间不匹配，受体-Far42电路本身无法建立极性位点。然而，如果Bem1-Cdc1电路也存在，则不清楚Far42通路如何影响极性行为，就像在不确定阶段一样。为了了解这些途径如何相互作用，我们模拟了一个将极性回路（Bem1-GEF和Cdc42）与受体-Far1通路（受体和Far1-GEF）相结合的系统。
受体-Far1电路促进极性位点重新定位并产生优柔寡断的行为
组合极性电路（图3A）包括两个互连的正反馈回路，一个来自核心极性电路，另一个来自受体Far1电路（图3A，插图）。重要的是，这些反馈环在不同的时间尺度上工作，较快的极性电路支持极化，而较慢的受体-Far1电路无法产生稳定的极性位点。因此，组合系统的行为方式尚不清楚。为了研究组合极性电路的行为，我们从两个不同的初始条件开始进行了仿真：路径分量的均匀随机分布和预极化Cdc42簇。与单独的极性电路类似（图1B），根据组分的分子丰度，组合体系表现出以下三种行为之一（图3B和S4）：具有少量Cdc42簇的非极化状态（S5A图），具有稳定和静态簇的极化状态（S5B图），以及簇可以形成或消失的中间状态（图3C).然而，非极化制度得到了扩展，向极化制度的过渡需要更多量的Bem1-GEF复合物（比较图3B和1B）。在这两者之间，有一个更大的瞬态极性状态。有趣的是，在这种状态下，系统的行为似乎与只有核心极性电路的模型有质的不同。Far1-GEF的加入似乎促进了多个瞬时Cdc1簇的出现和分散（图42D），而不是单个形成良好的极性位点出现和分散（图3D），这些簇以让人联想到酵母细胞中不确定极性聚类的方式动态重新定位（图2C和S48电影）。为了量化这一观察结果，我们采用了基于Voronoi镶嵌的聚类检测算法[6]，并跟踪了随时间推移检测到的聚类数量（S0A图）。根据这些时间序列，我们计算了每个模型在具有 1、2 和 6+ 聚类的状态中花费的时间比例以及状态之间的转移概率（S2021B 图）。然后，我们将模拟结果直接与Clark-Cotton等人19年[42]中提供的数据的类似分析进行了比较（有关详细信息，请参阅方法）。我们的分析表明，组合模型中共存的Cdc6簇更频繁，并且表现出与优柔寡断酵母细胞的极性位点相似的行为（S0图）。我们还计算了两个模型在 1 或 6 个聚类的状态下停留时间的分布（S2C 图）。这些分布表明，在组合模型中，集群状态之间的转换比在核心极性电路中更频繁地发生。（我们无法从实验数据中计算出类似的分布，因为在实验中，数据每<>分钟采集一次，这不足以解决所有转换。请注意，优柔寡断的行为也不同于非极化状态，因为它表现出更高的K值，波动较大，并且有多个共存的簇，这在非极化状态下不存在。
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图3. 组合电路允许重新定位和稳定极性站点。
A） 组合极性电路的反应方案。组合模型由双正反馈架构（插图）组成。B）Cdc42和Bem1-GEF分子丰度的双参数分岔图（非极化状态 - 绿色，瞬态极性 - 蓝色，偏振 - 红色）。C）–E）：瞬态极性状态的仿真结果。K 的图由 10 个实现组成。活动 Cdc42 的分布来自黑色时间序列，使用时间轴上的刻度线指示的时间点。所有模拟均使用3000个Cdc42,170个Bem1-GEF，30个Far1-GEF和2500个受体分子进行，具有不同的初始条件。C）使用均匀随机分布作为初始条件形成多个瞬态极性位点。在模拟的一个子集中，最终形成单个极性位点。D）在加入随机分布的受体和Far1-GEF分子后，已建立的极性位点迅速消散。E）快速建立并稳定维持极性位点，以便从一组活性受体和均匀分布的Cdc42分子开始模拟。
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当我们使用预极化的Cdc42簇但受体均匀时，簇立即消散（图3D和S3电影）。因此，即使受体-Far1电路具有正反馈结构，受体运输的缓慢时间尺度也允许分布式受体克服Bem1-GEF维持的极性。请注意，在许多模拟中，极性站点最终进行了改革（图3D）。在这些情况下，受体分布也变得极化。
我们建议使用以下机制来解释优柔寡断的行为是如何在组合模型中产生的。由活性受体募集到膜上的Far1-GEF分子可以播种多个小的Cdc42簇，然后由Bem1-GEF介导的正反馈扩增。如果没有Far1-GEF，集群将竞争产生一个获胜的极性位点[16,17]。然而，随着这一竞争过程的开始，Far1-GEF对新的集群进行成核，阻碍了有效的竞争：尽管一些Cdc42集群可能暂时占据主导地位，但新种子集群继续竞争，以至于无法发展稳定的集群。要使此机制运行，系统必须满足几个要求。
首先，活性受体的分布性质是持续播种新簇的关键：如果受体被聚集在一起，那么组合的Bem1-GEF和Far1-GEF正反馈将协同作用以维持Cdc42簇。事实确实如此。当使用初始聚焦的受体分布进行模拟时，所有模拟都产生了极化良好的Cdc42分布（图3E和S4电影）。随着初始受体分布的变化，更分散的受体分布降低了系统保持极化的可能性（图4A）。
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图4. Far1通路通过延迟或防止极性位点的粗糙化来促进优柔寡断的行为。
A）极化的时间分数作为初始受体分布中分散程度的函数。时间分数测量为1至5秒内K值≥2000.4000与K值总数的比率，以避免任何初始瞬变。每个点代表总共 30 个模拟中的一个模拟结果。初始受体分布由二维高斯分布产生。离散度表示分布的标准差。B）最终K值（t = 2秒）作为受体膜停留时间的函数。4000 ≤ n ≤每个数据点进行 5 次模拟。标准差带有阴影。C） 最终 K 值作为 Far30-GEF 分子数的函数。1 ≤ n ≤每个数据点进行 5 次模拟。D）极性位点（K≥30）的稳定时间作为膜中固定Far3-GEF分子数量的函数。Far1-GEF分子的分布沿x轴显示。E） 1 个固定 Far15-GEF 分子情况下 K 值的时间序列（左图）。右图显示了黑色时间序列中活性Cdc1分子的分布，时间轴上用刻度指示。F） 基于 42D 粒子的模拟结果。Cdc3T分子在细胞表面显示为蓝点。从二维情况转换的速率常数，如方法中所述，如表 42 和 2 中列出。所有模拟均使用1 Cdc2,3000 Bem42-GEF，170受体进行，除非另有说明，否则使用1个Far2500-GEF分子。
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其次，信息素受体的缓慢运输是促进优柔寡断行为的关键：如果要增加贩运率，那么受体内化将剥夺Far1播种竞争簇的潜力，而将受体递送到当前占主导地位的簇将稳定它们。事实上，我们发现加速受体交通（减少受体停留时间）改变了组合模型的行为，从不确定的重新定位到稳定的极性（图4B）。
第三，增加Far1-GEF的丰度将增加新种子Cdc42簇的数量，推动系统朝着更均匀的Cdc42分布方向发展。这也被观察到了（图4C）。改变受体运输速率或Far1-GEF丰度揭示了产生非极化状态，极化状态或在两者之间切换的参数机制（图4B和4C）。
为了直接可视化Far1-GEF成核的团簇之间的假设竞争，我们将不动的Far1-GEF分子分布在模拟域中的特定位置，以便每个固定的Far1-GEF分子可以启动Cdc42簇。随着Far1-GEF分子数量的增加，种子Cdc42簇之间的竞争时间也增加了，延迟了单个“获胜者”极性位点的建立（图4D）。Cdc42簇以不确定的方式在不同的Far1-GEF“种子”之间重新定位，即使一个簇成为主导，较小的簇继续共存（图4E和S5电影）。
为了确认我们的结果在三维空间中成立，我们对组合极性电路进行了3D模拟。2D和3D模拟的大多数参数保持不变（表1和表2），因此两种模拟类型的稳态物种数量相似（S7图）。3D模拟中的极性位点在细胞皮层周围不规则地重新定位，如酵母细胞中不确定的极性聚类所示（图4F和S6电影）。总之，这些模拟表明，将核心Bem1-GEF电路与受体-Far1电路相结合的系统可以表现出不确定的极性行为，Cdc42簇迅速重新定位。
信息素梯度作用于稳定极性位点
我们的模拟表明，在信息素浓度均匀的情况下，Far1途径可以破坏极性以促进重新定位。相比之下，实验研究发现，该途径是极性位点朝向交配伴侣的方向和稳定所必需的[27,49-51]。调和这些发现的一种方法是，Far1途径的影响取决于细胞经历的信息素浓度谱。
酵母细胞每秒发射~1400个信息素分子[52]。有了这个数字，伴侣细胞暴露的最大信息素浓度可能低于10nM[19]。令人惊讶的是，分泌信息素（峰值浓度约为20-1nM）的酵母细胞仍然能够稳定其交配伴侣的极性位点[2]。这远低于稳定极性位点所需的均匀信息素浓度[53,51]。这些发现表明，稳定极性位点位置的可能是信息素梯度，而不是绝对信息素浓度[54]。为了验证这一假设的合理性，我们在组合极性电路模拟中加入了信息素分子（图53A和表5）。在这种情况下，受体在信息素结合时被激活，使我们能够测试信息素梯度是否可以改变极性位点行为。
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图5. 模拟信息素梯度。
A）信息素受体结合的反应方案。B）模拟发射器和接收器细胞之间的3D信息素梯度，如Clark-Cotton等人所述[19]。C 和 D） 两种不同发射速率（C—650 分子/秒，均匀背景信息素浓度为 1.5 nM 和 D—150 分子/秒）的时间平均信息素浓度。在x轴下方显示的“环”中测量浓度。误差线表示±标准。
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表 3. 信息素诱导的受体-Far1通路的参数。
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尽管交配酵母细胞经历的实际信息素梯度尚未通过实验可视化，但以前的工作模拟了具有相邻伴侣从其极性位点分泌信息素的细胞所感知的信息素梯度[19]（图5B），假设实验测量的信息素发射率[52].为了模拟最初寻找伴侣的细胞，我们用1.5nM的均匀信息素浓度初始化了模拟，这导致了Cdc42簇的重新定位（S8图）。然后，为了模拟细胞将极性（以及信息素分泌）定向到伙伴细胞的情况，我们施加了在1.5-5.8nM之间变化的信息素梯度（图5C）。在许多但不是全部的模拟中，这种梯度导致极性位点在50分钟内停止重新定位，并发展出面向信息素源的稳定的Cdc42簇（图6A和S7电影）。接下来，我们使用0-1.2 nM的梯度进行模拟（图5D）。值得注意的是，在这种情况下，所有模拟在30分钟内都产生了位于高信息素区域的稳定极性位点（图6B和S8电影）。这些结果与实验结果一致，其中仅分泌20%的信息素量的细胞作为野生型细胞能够稳定交配伴侣的极性位点[53]。极性稳定在0–1.2 nM中比在1.5–5.8 nM梯度中发生得更快（图6C），这与极性稳定的主要障碍是由信息素背景水平播种的不同极性簇的竞争提供的观点一致。综上所述，我们对组合极性回路的仿真表明，虽然信息素浓度均匀会破坏极性并促进重定位，但局部信息素梯度可以稳定极性。
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图6. 信息素梯度稳定极性位点。
使用图5所示的两个梯度的仿真结果。对于这两种情况，细胞在前1分钟内暴露于5.5nM均匀信息素。信息素梯度从5分钟开始应用。 A）图5C所示梯度的结果。10 次模拟的 K 时间序列（顶部）。活动 Cdc42 的分布对应于黑色（底部）显示的时间序列。B） 使用图5D所示的梯度与A相同。C） 两个梯度的 K 到 50 的时间。
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讨论
酵母极性回路模型
酵母极性回路的第一个现实模型是由Goryachev和Pokhilko提出的，他们考虑了一个由一组反应扩散方程组成的确定性模型[12]。他们使用他们的模型证明Bem1-GEF介导的正反馈加上膜和细胞质之间变化的扩散速率足以通过图灵机制产生稳定的极性位点[12]。还研究了几个更抽象的简约模型，其中包含少至两种具有非线性正反馈的化学物质，以更深入地了解细胞如何使用Rho家族GTP酶产生空间模式。由于其数学上的可追踪性，这些模型对GTP酶簇的建立、竞争和共存机制产生了重要的见解[14,15,30,57-61]。虽然理论工作已经开始建立支持极性建立和粗糙的条件，但对确定产生极性位点移动或重新定位的机制的关注较少。
动态极性位点重新定位在酵母交配的不确定阶段至关重要，此时极性簇经历了不稳定的组装、拆卸和看似随机的运动。这种行为的各个方面已被随机模型概括，该模型结合了由生化反应中的随机性引起的随机效应。使用非常简单的双物种模型的基于粒子的模拟来研究具有线性正反馈的系统的行为[30,31]。在线性正反馈下，Cdc42的聚类仅发生在具有小分子数的状态下，使得聚类的程度和位置容易受到分子波动的影响。Hegemann等人利用该模型中极性簇的噪声驱动重定位来探索信息素梯度如何通过Far1途径将极性引导到正确的位点[27]。然而，实验结果表明，酵母极化对增加分子丰度具有鲁棒性[16,62,63]，表明非线性正反馈更强劲。具有非线性正反馈的基于粒子的模型也可以显示极性簇的噪声驱动重新定位，但是（与线性反馈模型一样）这种行为需要微调，并且只发生在参数空间的一小部分区域[32]。因此，目前尚不清楚简单地将分子噪声纳入极性电路是否足以解释交配酵母中观察到的优柔寡断的极性行为，或者是否需要额外的调节元件。
先前的建模研究通过在极性电路中包含负反馈来产生动态极性站点。Ghose等人表明，肌动蛋白介导的通过随机囊泡递送的负反馈可促进单个稳定极性位点的持续运动[50,64]。Khalili等人使用裂变酵母交配的反应-扩散方程模型来证明作用在Ras1上的耦合正负反馈调节如何产生在不同位置连续组装和拆卸的单个极性位点[65]。然而，这两项研究都没有重现在出芽酵母交配的不确定阶段观察到的多个瞬时GTP酶活性簇。Shi等人实施局部激发、全局抑制偏置兴奋网络（LEGI-BEN）模型来描述经历趋化性的细胞[66]。在他们的模型中，LEGI模块将外部化学梯度转换为信号活动的内部梯度，该梯度偏置可兴奋网络处于活动状态的位置。反过来，可激发网络与涉及细胞骨架的极化模块相连，允许沿梯度方向发生迁移。该模型与我们的模型不同，因为我们的模型不需要可兴奋的网络来生成多个Cdc42活性簇。相反，活性受体种子形成新簇，确保不会形成单个极性位点。
互补的正反馈回路确保成功配接
成功的交配需要酵母细胞将其生长引导到潜在的交配伴侣，这需要正确定位极性位点。为了完成这项任务，极性系统必须满足几个经常相互竞争的要求：1）检测信息素梯度，2）建立单极性位点，3）与梯度未对齐时极性位点的重新定向，以及4）朝向交配伙伴时极性位点的稳定。我们的建模结果表明，这些要求是通过作用于不同时间尺度的一系列三个耦合正反馈回路来满足的（图7）。
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Fig 7. Summary of system architecture.
A）核心极性电路，B）细胞内受体-Far1电路，C）组合电路和D）跨细胞受体-Far1电路的正反馈回路示意图。u表示膜相关的缓慢扩散“活性”形式，而v表示相关蛋白质的胞质，快速扩散的“非活性”形式 - Cdc42由下标C表示，Bem1-GEF由下标G表示，受体-Far1-GEF由下标R表示。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011523.g007
第一个正反馈回路形成核心极性电路（图7A）。在该电路中，发生正反馈是因为活性Cdc42分子通过将活性GEF分子募集到其位置来提高相邻Cdc42分子的活化率。由于与膜中的扩散相比，细胞质中的扩散速度更快，因此这种正反馈环为形成活性Cdc42簇提供了有效的机制。 细胞质中的快速扩散还允许共存的簇之间竞争细胞质中的极性因子。较大的集群产生更强的正反馈，因此能够胜过较小的集群，从而形成建立单极性站点的“赢家通吃”机制。
虽然强正反馈可有效生成独特的极性位点，但它也表现出梯度跟踪的不良特征。首先，极性簇的启动极性簇极易受到相关分子局部浓度波动的影响，因此极性位点很容易在与信息素梯度错位的位点形成。其次，极性位点一旦建立就很难重新定位：除了在非常狭窄的参数空间中，这使得极性位点能够抵抗分子波动（图7A）。极性回路与酵母中的信息素传感耦合的Far1途径似乎克服了这两个缺点（图7B）。活性信息素受体募集与多功能蛋白Far1复合的GEF分子，从而激活活性受体附近的Cdc42。因此，活性受体不断培育新的Cdc42簇，同时削弱共存簇之间的竞争。这种减少的竞争产生Cdc42的动态簇，在整个细胞表面形成和分解，为寻找局部信息素来源提供了一种搜索机制。组合极性/Far1电路表现出更大的参数空间区域，其中分子波动可以驱动极性位点的重新定位（图7C）。
有趣的是，受体介导的Cdc42激活形成了第二个正反馈回路，因为活性Cdc42分子招募肌动蛋白电缆，含有新受体的囊泡沿着这些电缆被贩运（图7B）。由于膜上的受体寿命较长[67,68]，该反馈环不支持在信息素浓度恒定的条件下建立极性。然而，在存在信息素梯度的情况下，受体-Far1回路的正反馈在信息素浓度高的区域作用更强，因为受体活化更高，导致该区域的Cdc42更活跃。反过来，较高的Cdc42活性导致受体局部浓度的增加，增强Cdc42活性并促进稳定极性位点的形成。有趣的是，这种梯度跟踪机制能够有效响应低峰浓度（1.2nM）的信息素梯度，这与观察到的信息素产生减少80%的细胞仍然能够成功地向交配伴侣发出其位置信号一致[53]。这种梯度跟踪机制的潜在局限性是，当梯度叠加在恒定信息素的背景上时（例如，梯度范围为1.5-5.8 nM的情况），细胞可能会被混淆。由于酵母在野外经历的信息素浓度可能变化很大，我们推测酵母已经进化出额外的机制来克服这一限制。
最后，第三个正反馈回路作用于相反交配类型的细胞之间（图7D）。所有单倍体酵母细胞都发出交配型特异性信息素，其与相反交配型细胞表面的受体结合。通过这些受体的信号传导既增加了接收细胞内信息素的产生速率，又通过局部激活Cdc42，增加了信息素向相反交配类型方向释放的可能性。我们的模拟证实了实验结果，即这种信息素的局部释放对于建立陡峭到足以被相邻交配伙伴检测到的梯度非常重要[19]。这种正反馈回路可能在两个细胞的极性位点都是动态的交配的不确定阶段发挥作用。考虑到这种双单元方案将是未来调查的主题。
生物学影响和未来方向
我们的结论可能适用于其他系统中的极性调节。类似于 S。酿酒，远亲裂变酵母S中的极性位点。Pombe在交配过程中也表现出不稳定的组装-拆卸行为，当它们碰巧与伴侣对齐时会稳定下来[69,70]。有趣的是，裂变酵母缺乏Far1途径，但具有具有相同结构的途径，其中信息素受体结合导致Cdc42 GEF的局部募集[71]。因此，我们的发现可能广泛适用于真菌交配系统[25]。
我们的工作表明，分子噪声足以促进结合极性回路和受体-Far1通路的细胞中极性簇的重新定位。Far1是细胞周期停滞所需的多功能蛋白质。因此，删除这种蛋白质不会提供对我们模型的测试。然而，可以构建专门针对Far1各种功能的点突变体。这些突变体将为测试我们的模型提供一种机制。其他现象也可能促进极性团的移动性。特别是，极化囊泡运输可引起极性因子的稀释和横向移位[55,64,72,73]。在未来，研究结合囊泡交通和受体-Far1途径的模型是否可以准确地再现交配酵母中的极性位点行为可能是有用的。
我们提出的极性位点重新定位机制对交配酵母细胞以外的一系列细胞功能具有影响。例如，迁移细胞在化学梯度中移动时经常表现出极性位点的重新定位[1,74,75]。在轴突发育中，最初形成多个极性位点（神经突），其中一个在化学梯度向上移动时分化为轴突[76]。其中许多功能需要受体内吞作用[77-79]。研究动态极性是否可能由极性因子扩散和受体运输的时间尺度差异引起将是有趣的。将交配酵母的极性原理与其他真核细胞中的极性原理进行比较，有望深入了解许多细胞功能。
方法
基于二维粒子的模型
所有基于粒子的模拟均使用Smoldyn（v2.67）在基于Linux的计算系统（UNC教堂山的长叶集群，2.50 GHz和2.30 GHz英特尔处理器）上进行连续空间和离散时间间隔[33,36]。假设在两个空间方向上都存在周期性边界条件。分子被认为是没有体积的点粒子。用欧拉-丸山方法模拟了分子的布朗运动，如下所示。设 x（t） 和 y（t） 表示给定分子在时间 t 处的坐标，则分子在 t + Δ t 处的位置计算如下： 其中 Z
x和 Zy是从标准正态分布中抽取的独立随机数，D 是扩散系数。从10秒的模拟中，所有物种的坐标每4000秒存储一次。
二阶反应由两个参数决定：反应半径ρ和反应速率λ。当两个反应伙伴在距离ρ内时，它们在时间步长Δ t内反应的概率为P = 1-exp（-λΔt）。当 Δ t 足够小时，P ≈ λΔt。当结合的分子解离时，它们被放置在结合半径ρ之外0.00001μm的距离处，以避免立即重新结合。一阶反应的概率P = 1-exp（-k Δt），其中k是反应的速率常数。模拟中使用的参数值列于表 1 和表 2 中。
基于二维粒子的模型
酵母细胞近似为一个球体。膜结合物质扩散在球体表面。胞质物种在球体内扩散。3D模型的反应速率列于表1-3中。通过使用Ramirez等人[3]的方法转换2D模拟中的速率常数，获得了32D模拟中速率常数的初始选择。但是，一些速率常数需要额外调整，以确保2D和3D仿真的稳态浓度相似。膜结合物质之间反应的速率常数在2D和3D模拟之间没有变化。与膜相关的胞质物种的一阶反应的速率常数如下：
Vc是球体的体积，Am是膜的面积。
涉及胞质物质和膜结合物质的二阶反应的速率常数比例如下：
V二 维和是二维反应区，V二 维和是 3D 模拟的反应体积。原因五二 维和是球体体积的一半是因为其中一个反应物是膜结合的。
模拟受体循环
由Cdc42引导的肌动蛋白电缆将信息素受体带到极性位点。我们在模拟中没有明确考虑肌动蛋白电缆。肌动蛋白依赖性受体递送被隐含地建模为双分子反应。每个单独的Cdc42-GTP能够以指定的速率（λ9在表 2 中，λ12表3）在每个时间步长中。膜受体通过内吞作用内化，内吞作用被建模为具有指定速率常数（k10在表 2 中，以及 k14- J15在表 3 中）。
模拟信息素分子
根据前面描述的方法模拟3D信息素梯度[19]。将一对交配细胞建模为两个直径为5μm的球体。一个细胞发出信息素。我们假设释放的信息素分子的数量遵循泊松过程，并且所有分子都是从单点源发射的。囊泡释放事件在Smoldyn中使用命令点源模拟。在距离原点7μm的球形吸收边界处去除信息素。细胞膜被视为反射边界。
量化极性
极性使用Ripley的K函数的归一化版本测量[17,32,40,41,80]。函数 K（r） 根据成对分子距离 P（r） 的累积分布来测量当前粒子分布与均匀分布的偏差：
对于 2D 平面上的粒子分布：
对于 3D 球体上的粒子分布：其中 m
我(r）Δ r 是距分子 i d 处的分子数，使得 r ≤ d ≤ r+Δ r，N 是域中分子的总数，A 是域的面积。K（r） = 0 如果粒子均匀分布。对于非均匀分布，K 函数通常经过有限值 r 的最大值。为了量化极性，我们使用了K的最大值。对于 2D 模拟，我们将 K < 1.5 的分子分布定义为非极化态;K ≥ 1.5 为极化态;K≥3为稳定极性（S1A图）。对于 3D 模拟，我们将 K < 30 定义为非极化态的分布;K ≥ 30 为极化态;K≥50为稳定极性（S1B图）。
识别极性制度
为了确定三种极性状态（非极化、瞬态极性和极化），我们在每次仿真的最后 10 秒每 2000 秒记录一次 K 值。使用两种初始条件进行仿真：随机和极化。对于随机初始条件，从均匀分布中选择Cdc42分子的位置，而对于偏振情况，Cdc42分子的位置是根据域中心的高斯选择的，标准偏差为0.2。对于给定数量的Cdc42和Bem1-GEF分子，我们对每种类型的初始条件进行了十次模拟。对于每个模拟，我们计算了极化态数 F（K ≥ 1.5） 和非极化态数 F（K < 1.5） 之间的差值 Δ：
如果系统一半时间处于极化状态，一半时间处于非极化状态，则 Δ 等于 0。较大的正值 Δ 表示极化状态，较大的负值表示非极化状态。设 N 等于仿真期间记录的 K 值总数。为了确定瞬态极性状态，我们使用了条件： α = 0.85。如果Δ/N> α，则该状态被归类为极化和Δ/N<-μ非极化。对于给定数量的Cdc42分子，假设Δ与Bem1-GEF分子数量x之间的关系遵循逻辑函数：
然后将该函数拟合到模拟结果中，以确定系统在极性状态之间转换的Bem1-GEF分子的值（S2和S4图）。
通过Voronoi镶嵌进行聚类检测
我们利用先前基于Voronoi镶嵌的方法检测集群[48,81]。聚类被定义为一组相邻的Voronoi多边形，其大小低于预定阈值。面大小的阈值确定如下。作为阴性对照，我们从均匀分布中生成了50个粒子分布实现。这些分布用于生成 Voronoi 多边形大小的概率密度。我们还获得了模拟生成的Cdc42-GTP分子的多边形尺寸分布的概率密度。负对照的概率密度与我们的模拟的交集定义了聚类形成的多边形大小阈值。如果多边形的大小高于阈值，则会从 Voronoi 逻辑示意图中删除该多边形，这意味着多边形中的分子密度太低，无法被视为簇的一部分。Voronoi图上的其余多边形将被视为潜在聚类的组成部分。然后，我们将相邻多边形分组到聚类中，并对聚类面积和数量密度应用过滤器。团簇的阈值区域设置为0.785 μm2由于酵母极性位点的直径估计为1μm。我们根据先前的测量设置了集群中Cdc42的阈值数[62]。通过过滤器的多边形组被记录为真聚类。
手动群集检测
交配酵母细胞中极性簇行为的分析是使用Clark-Cotton等人报告的视频进行的[19]。这些包括相反交配型S的混合物的延时双色共聚焦成像。含有绿色（DLY9069：MATa BEM1-GFP）和红色（DLY12944：MATα BEM1-tdTomato）极性探针的酿酒菌株。Clark-Cotton等人详细描述了酵母生长和成像条件[19]。
当相反交配类型的细胞混合在一起以允许交配时，它们最初通过出芽在营养上生长。随着出芽周期的结束，Bem1探针定位于母芽颈以进行细胞分裂，之后极性簇在一段时间内表现出优柔寡断的行为。然后，一部分细胞将它们的极性位点彼此对齐，进入承诺阶段，最终以细胞 - 细胞融合告终。对于此分析，我们仅考虑已完成细胞分裂（Bem1探针不再在芽颈处）但尚未对齐极性的细胞。因此，所有细胞都被认为是“优柔寡断的”。
将来自Z-stack的荧光信号投射到单个平面上以观察极性簇（红色或绿色通道中的强烈像素组）。对每隔2分钟拍摄的图像进行视觉评分，以计算极性簇的数量。极性簇被定义为强度明显高于背景的 >10 像素的分组。由背景强度的清晰区域分隔的强像素组被计为单独的聚类。
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S1 图 里普利 K 函数的示例。
对应于列出的 K 值的聚类分布。A） 长度为 2.8 μm 的正方形域的 8623D 示例。B） 半径为 3.2 μm 的球体的 5D 示例。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011523.s001
（英文）
S2 图 核心极性电路的极性状态。
A）极化态和非极化态数量与Bem1-GEF丰度的差异。数据点（o）表示图标题中指示的Cdc42分子总数的模拟结果。曲线表示使用逻辑函数（非极化状态 - 绿色、偏振状态 - 红色和瞬态状态 - 蓝色）对数据的拟合。B和C）使用总Cdc42丰度为3000的瞬态状态下K的分布。星星表示用于产生分布的Bem1-GEF丰度（100个下面板和106个上面板）。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011523.s002
（英文）
S3 图 核心极性电路非极化和极化状态的仿真结果。
A） K在非极化状态下进行10次模拟的时间序列（左图）。活动 Cdc42 的分布采用黑色时间序列，使用时间轴上的刻度指示的时间点（右图）。使用分子的均匀随机分布作为初始条件进行模拟，其中包含3000个Cdc42和70个Bem1-GEF分子。B）与A相同，但有3000个Cdc42和120个Bem1-GEF分子。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011523.s003
（英文）
S4 图 组合极性电路的极性等级。
A）极化态和非极化态数量与Bem1-GEF丰度的差异。数据点（o）表示图标题中指示的Cdc42分子总数的模拟结果。曲线表示使用逻辑函数（非极化状态 - 绿色、偏振状态 - 红色和瞬态状态 - 蓝色）对数据的拟合。B和C）使用总Cdc42丰度为3500的瞬态状态下K的分布。星星表示Bem1-GEF丰度（135个下面板和165个上面板）。所有模拟均使用30个Far1-GEF和2500个受体分子进行。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011523.s004
（英文）
S5 图 组合极性电路的非极化和极化状态的仿真结果.
A） K在非极化状态下进行10次模拟的时间序列（左图）。活动 Cdc42 的分布采用黑色时间序列，使用时间轴上的刻度指示的时间点（右图）。使用分子的均匀随机分布作为初始条件进行模拟，其中包含3000个Cdc42,80个Bem1-GEF，30个Far1-GEF和2500个受体分子。B） 与A相同，但280 Bem1-GEF除外。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011523.s005
（英文）
S6 图 聚类数作为时间的函数。
A）簇数的时间序列的五个示例，B）簇计数的分布，到后续簇计数的转移概率，以及C）簇的停留时间，用于模拟具有3000个Cdc42和102个Bem1-GEF分子的核心极性电路以及模拟具有3000个Cdc42和170个Bem1-GEF分子的组合极性电路。请注意，这些图像是在实验中以120秒的间隔拍摄的，因此我们无法比较模拟和实验之间集群的停留时间。A） 中的总持续时间为 4000 秒，间隔为 120 秒。红线表示单元格提交的时间。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011523.s006
（英文）
S7 图 2D 和 3D 模型的比较。
使用3000个Cdc42,170个Bem1-GEF，30个Far1-GEF和2500个受体分子进行模拟。模拟从均匀分布的分子开始。线条表示分子数平均值，阴影区域表示 30 次模拟（3D – 蓝色，2D – 红色）的 ± std。所有模拟运行66分钟。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011523.s007
（英文）
S8 图 具有均匀信息素浓度的优柔寡断极性行为。
使用3000 Cdc42,170 Bem1-GEF，2500受体，30 Far1-GEF和1.5 nM均匀浓度的信息素分子进行模拟。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011523.s008
（英文）
S1 电影。 Cdc42-GTP在核心极性电路模型仿真的瞬态极性状态下的时空分布。
蓝点代表活性Cdc42的单个分子。 对应于图1D。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011523.s009
（MP4）
S2 电影。 组合极性电路模型仿真的瞬态极性状态下Cdc42-GTP的时空分布。
对应于图3C。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011523.s010
（MP4）
S3 电影。 Cdc42-GTP簇在引入Far1通路后消散。
受体和Far1-GEF分子在400秒内引入。对应于图3D。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011523.s011
（MP4）
S4 电影。 如果受体最初极化，则建立并维持Cdc42-GTP簇。
对应于图3E。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011523.s012
（MP4）
S5电影。 Cdc42-GTP簇在固定的Far1-GEF分子之间重新定位。
15个固定的Far1-GEF分子直接激活Cdc42，没有受体。对应于图4E。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011523.s013
（MP4）
S6电影。 三维组合极性电路模型仿真的Cdc42-GTP时空分布。
对应于图4F。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011523.s014
（MP4）
S7电影。 1.5–5.8 nM信息素梯度可以促进Cdc42-GTP簇的稳定形成。
前1分钟施用5.5nM均匀信息素。从5分钟开始，施加梯度。对应于图6A。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011523.s015
（MP4）
S8电影。 0–1.2 nM信息素梯度可以有效地稳定Cdc42-GTP簇。
前1分钟施用5.5nM均匀信息素。从5分钟开始，施加梯度。对应于图 6B。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011523.s016
（MP4）
确认
我们感谢Steven S. Andrews开发和更新用于项目中模拟的计算机程序Smoldyn。我们还要感谢Elston实验室的所有成员对该项目的有益讨论。
引用
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