免费医学论文发表-功能和结构分析表明，双域唾液酸酶通过补体因子的去唾液化来保护细菌免受补体杀伤

抽象

补体系统是抵御微生物感染的先天免疫防御的第一道防线。为了在人类中存活并引起感染，细菌病原体已经发展出复杂的机制来破坏补体介导的杀菌活性。有报道称，唾液酸酶，也称为神经氨酸酶，与细菌补体耐药有关;然而，其潜在的分子机制仍然难以捉摸。几种补体蛋白（例如 C1q、C4 和 C5）和调节因子（例如因子 H 和 C4bp）被各种嶾液聚糖（含有末端唾液酸的聚糖）修饰，这对它们的功能至关重要。该报告提供了功能和结构证据，证明细菌唾液酸酶可以通过脱唾液酸化关键的补体蛋白和调节剂来解除补体系统的武装。口腔细菌牙龈卟啉单胞菌是牙周炎的“关键”病原体，产生双域唾液酸酶（PG0352）。生化分析表明，PG0352可以对人血清和补体因子进行脱水，从而保护细菌免受血清杀伤。结构分析表明，PG0352含有N端碳水化合物结合模块（CBM）和C端唾液酸酶结构域，表现出典型的六叶β螺旋桨唾液酸酶折叠，每个叶片由3-4条反平行β链组成。后续功能研究表明，PG0352形成单体，在广泛的pH范围内具有活性。虽然PG0352可以去除N-乙酰神经氨酸（Neu5Ac）和N-乙醇酰神经氨酸（Neu5Gc），但它对Neu5Ac具有更高的亲和力，Neu<>Ac是人类最丰富的唾液酸。结构和功能分析进一步证明CBM与碳水化合物和血清糖蛋白结合。本文的研究结果为理解唾液酸酶在细菌毒力中的作用提供了新的见解，并为研究细菌补体耐药的分子机制开辟了新的途径。

作者摘要

人类补体途径是一种高效的识别和效应系统，致力于破坏感染性微生物和受损宿主材料，因此它被认为是先天免疫防御的第一道防线。细菌病原体已经进化出各种策略来逃避补体系统并引起感染。补体耐药机制可作为防御高度抗生素耐药性致病性细菌感染的新治疗靶点，包括牙周炎，一种由多种微生物感染引发的慢性炎症性疾病。因此，了解补体系统和细菌病原体之间的相互作用对于开发针对包括牙周炎在内的细菌感染的新疗法至关重要。据报道，细菌唾液酸酶与补体耐药有关，但其潜在机制在很大程度上仍然未知。该报告揭示了唾液酸酶通过脱唾液化关键补体蛋白和调节剂赋予细菌补体抗性，这可能成为治疗传染病的新治疗靶点。

数字

Fig 8图1图2图3Table 1Fig 4Fig 5Table 2Fig 6Fig 7Fig 8图1图2图3

引文： Clark ND， Pham C， Kurniyati K， Sze CW， Coleman L， Fu Q， et al. （2023） 功能和结构分析表明，双域唾液酸酶通过补体因子的去唾液化来保护细菌免受补体杀伤。公共科学图书馆病理19（9）： e1011674. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011674

编辑 器： Jon T. Skare，德克萨斯A&M大学学院站：美国德克萨斯A&M大学

收到： 七月 7， 2023;接受： 8月 2023， 25;发表： 2023月 <>， <>

版权： ? 2023 克拉克等人。这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。

数据可用性： 作者确认，研究结果背后的所有数据都是完全可用的，不受限制。所有相关数据都在论文及其支持信息文件中。

资金： 该项目得到了 C.P. 的 F31 奖学金 （DE029999） 的支持;USPHS将GM095459授予NCC;DE030667给C.L.，DE023080给C.L.和M.G.M.。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。

竞争利益： 提交人声明不存在相互竞争的利益。

介绍

人体补体系统是先天免疫的关键防御机制之一[1,2]。它擅长识别和清除外来病原体并防止微生物感染。补体系统可被抗原-抗体复合物（经典途径，CP）、某些碳水化合物（凝集素途径，LP）或各种未受天然抑制剂保护的表面（替代途径，AP）激活[1,3]。当C1复合物的C1q识别蛋白与抗原-抗体复合物结合时，CP就会启动[4]。AP通过C3连续“周转”为C3b而被激活，C3b可以在称为调理作用的过程中与外来病原体结合。LP 由甘露糖结合凝集素 （MBL） 与病原体表面的碳水化合物残基结合触发。所有三种途径都汇聚形成C1转化酶，触发激活级联反应，最终形成细菌细胞表面的膜攻击复合物（MAC）。MAC形成细胞毒性孔，破坏细菌细胞膜并导致细胞溶解和死亡。除先天免疫外，补体系统还与适应性免疫交织在一起，例如补体系统的调理作用可与B细胞上的各种受体（即补体受体2和1）相互作用并调节其反应[5,4]。同样，补体系统也可以与T细胞结合，即补体缺乏会降低CD8和CD6 T细胞的启动[<>]。

补体系统受到严格调节，以防止对健康宿主细胞的意外破坏。补体系统有多种液相调节剂，例如因子H（FH）、因子I（FI）、C4结合蛋白（C4bp）和前蛋白[3,7]。FH是一种可溶性介质，可负调节补体系统。它识别并结合宿主细胞上的结构，以防止附带损害[8]。FH也可作为FI的辅助因子，FI是一种丝氨酸蛋白酶，可切割C3b以使补体系统失活[9]。C4bp通过在C4转化酶内结合C3来抑制补体活化以促进其解离，从而抑制活化级联反应[10]。C4bp也可以以与FH类似的方式作为FI的辅助因子。Properdin具有上调补体活化的功能。它结合并稳定C3转化酶，同时保护转化酶免受FH和FI介导的切割[11]。

为了在人类宿主中建立感染并持续存在，细菌病原体必须成功逃避补体系统，因为它是免疫系统的第一道防线[12]。致病菌已经进化出复杂的机制来破坏补体介导的杀伤（也称为血清杀伤），包括用蛋白酶破坏补体因子，劫持宿主补体调节因子（如FH）以防止补体活化，“隐藏”在宿主细胞内，无论是在液泡中还是在细胞质中，或利用多糖胶囊等物理屏障来防止补体活化和沉积[供审查， 参见 [12–14]]。例如，淋病奈瑟菌可捕获循环血清FH以抑制补体活化[15,16]。伯氏疏螺旋体是莱姆病的病原体，它使用补体调节因子获取表面蛋白（CRASPs）赋予其补体抵抗力，CRASP可募集宿主FH和FH样蛋白来下调补体系统[17]。其表面粘附素分子BBK32通过阻断C1复合物的活化来抑制CP活化[18,19]，外表面蛋白C（OspC）通过与C2竞争C4b结合来阻断CP和LP活化[20]。化脓性链球菌产生外毒素B（一种半胱氨酸蛋白酶），可降解C3，从而抑制补体活化[21]。同样，来自中间普雷沃氏菌的半胱氨酸蛋白酶通过降解C3来抑制补体[22]。肺炎链球菌胶囊通过阻断C3b向iC3b的转化及其随后在细菌细胞表面的调理作用来赋予其补体抗性[23]。也有报道称，细菌唾液酸酶（也称为神经氨酸酶）与补体抵抗有关。例如，S的NanA唾液酸酶。肺炎通过阻断AP激活来赋予其血清耐药性[24]。我们最近的研究还显示，唾液酸酶缺陷突变体密螺旋体和牙龈卟啉单胞菌是人类牙周炎的两种“关键”病原体[25]，对补体杀伤敏感[26,27]。然而，唾液酸酶保护细菌免受补体杀伤的分子机制在很大程度上仍然未知。

补体系统由30多种蛋白质组成，包括血浆蛋白、调节因子、受体和配体，其中大多数被各种O-连接和N-连接聚糖修饰，这对它们的功能、稳定性、蛋白质-蛋白质相互作用和自我识别至关重要[7]。有趣的是，这些聚糖中的大多数含有末端N-乙酰神经氨酸（Neu5Ac），这是人类最常见的唾液酸形式。例如，C1q、C4、C5、FH和FI均在多个位点被各种嘶吼胶修饰[7,28]。唾液酸化被认为通过稳定C1q来最小化C1复合物的非特异性相互作用[7]。从FH中去除唾液酸（去唾液酸化）会改变其功能并导致致病作用[29]。在本报告中，我们使用功能和结构方法证明了PG0352，一种先前在P中鉴定的唾液酸酶。牙龈W83菌株[27]，可以从人血清和几种关键补体因子如C5q、C1、C4、FH和FI中去除Neu5Ac，从而降低血清杀菌活性。此外，我们还介绍了apo PG0352以及配体和抑制剂结合的PG0352的晶体结构。本报告的结果为理解细菌唾液酸酶的作用提供了新的见解，并为研究细菌补体耐药性的分子机制开辟了新的途径。

结果

PG0352去除人血清唾液酸

人血清含有高浓度的唾液酸，可与各种糖蛋白结合，其中一些有助于补体活化及其杀菌活性[30,31]。牙龈卟啉单胞菌 （Pg） 对血清杀伤具有抗性;然而，当W0352菌株中编码PG83的基因被删除时，这种耐药性被消除[27]。我们推断PG0352可以通过去除血清糖蛋白中的唾液酸来保护Pg免受血清杀伤。为了验证这一假设，我们用重组PG0352处理人血清，然后使用黑参（SNA）凝集素检测唾液酸，该凝集素特异性识别α-2,3-和α-2,6-连接的唾液酸。在本实验中，将人血清与图0352中标记的不同量的野生型PG1一起孵育。此外，突变的PG0352构建体，其中残基Tyr-193，Arg-194，Ile-195和Pro-196，这四个残基构成了高度保守的“F / YRIP”基序，对细菌唾液酸酶至关重要[32]，共同突变为丙氨酸，产生无活性酶PG0352AAAA，作为阴性对照包括在内。孵育后，在10、30和60分钟收集样品并进行凝集素印迹分析。SNA在人血清中检测到几个蛋白质条带，这些蛋白质条带通过野生型PG0352处理逐渐消除，但不是PG0352AAAA，以时间和剂量依赖性的方式（图1）。到60分钟时，SNA检测到的所有信号都消失了。相比之下，用PG0352处理的样品AAAA保持不变。为了排除处理可能导致蛋白质降解的可能性，使用刀豆球蛋白A（ConA）凝集素对处理60分钟的样品进行凝集素印迹，该凝集素可检测内部核心甘露糖残留。用野生型PG0352处理对所有样品的ConA信号没有影响，表明该蛋白不影响血清蛋白的稳定性（图1）。综上所述，我们得出结论，PG0352作为一种唾液酸酶，可以脱水人血清糖蛋白。

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图1. PG0352脱唾液酸正常人血清。

正常人血清用0.2~0.6μg野生型PG0352或无活性PG0352（PG0352AAAA），如“方法”部分所述。收集样品，并在用SNA处理后10分钟使用黑桑布库斯（SNA）和刀豆球蛋白A（ConA）凝集素（A）进行SDS-PAGE和凝集素印迹分析;（B） 用SNA治疗后30分钟;（C） 用SNA治疗后60分钟;（D）用ConA治疗后60分钟。

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PG0352去唾液酸酯补体蛋白

几种补体因子被糖基化，其中一些被唾液酸化，例如，C1q被7-N-连接聚糖修饰，其中7个是嶾液聚糖[7]，FH在33个位点被N-连接聚糖修饰，其中至少0352个位点被嶾液聚糖修饰[1,3]。基于上述结果，我们推断PG4可以去解构成血清主要部分的补体蛋白。为了验证这一假设，我们检查了一组糖基化的补体蛋白，包括C5q，C4，C2，C3，IgG，FH，FI和C7bp（图0352）。值得注意的是，C0352是糖基化的，但不是唾液酸化的[<>]，唾液酸化是作为对照包括在内。这些蛋白质与野生型PG<>，PG<>一起孵育AAAA或 C。产气荚膜唾液酸酶（NanI）在37°C下治疗30分钟，但IgG除外，其治疗延长至过夜（图2D）。处理过的补体蛋白进行SDS-PAGE和SNA凝集素印迹（图2）。正如预期的那样，在C3中没有检测到唾液酸信号，因为它是糖基化的，但不是唾液酸化的，突出了SNA的底物特异性（图2A）。在C1q，C4，C5，FH，FI和C4bp中检测到唾液酸信号，野生型PG0352完全消除或显着降低，但PG0352没有AAAA (图2）。IgG对治疗更具弹性，并经过过夜孵育以完全去除唾液酸信号（图2D）。有趣的是，我们发现PG0352比C的NanI唾液酸酶活性更强。产气荚膜从这些补体蛋白中释放唾液酸（图2B-2H）。这种差异可能是由于它们的结构差异或其他未知因素造成的。产气荚膜梭菌产生三种不同的唾液酸酶（即NanH、NanI和NanJ），它们具有不同的活性、底物特异性和功能[34,35]。在这里，我们只测试了NanI [36]。我们正在测试另外两种唾液酸酶对人血清和补体因子的侵害。值得注意的是，SDS-PAGE分析表明，用PG0352处理对这些补体蛋白的稳定性没有影响（S1图）。总的来说，这些结果表明PG0352特异性地去唾液酸化这些测试的补体因子而不影响其稳定性。

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图2. PG0352脱唾液酸化不同的补体因子。

用野生型PG0352，非活性PG0352（PG0352AAAA）或来自C的唾液酸酶。产气荚膜 （Cp） 如方法部分所述。收集样品并使用SNA凝集素进行SDS-PAGE和凝集素印迹分析。（A） C3， （B） C4， （C） C5， （D） IgG， （E） FH （因子 H）， （F） C1q， （G） C4bp （C4 结合蛋白） 和 （H ） FI（因子 I）。 指向条带的箭头被去唾液酸化，并且在与重组PG0352孵育后无法被SNA检测到。

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绘制人FH的糖基化位点和聚糖

上述生化分析表明，PG0352可以去除血清蛋白和几种补体因子中的唾液酸。为了证实这项研究，我们使用FH作为替代物来进一步评估PG0352的去唾液酸化活性，因为这种蛋白质被高度糖基化和唾液酸化[33]。在本实验中，将人FH蛋白与或不与PG0352一起在3°C下孵育37小时。 将所得样品进行SDS-PAGE处理，然后用考马斯蓝染色。如图3A所示，用PG0352处理后，与未处理的FH相比，FH的大小变小，表明发生了去唾液酸化。为了进一步确认这一结果，切除了与未处理（条带A）和处理（条带B）FH有关的蛋白质条带（图3A），并进行了纳米LC-ESI/MS/MS以绘制其糖基化位点和聚糖。在未经处理的FH样品中，在FH中可靠地检测到4个糖基化位点（N217，N882，N911和N1029）和13个sialoglycan（表1）。在用PG0352处理的FH中检测到相同的糖基化位点，但这些相关聚糖均不含末端Neu5Ac（表1）。图0352显示了有或没有处理PG3的FH糖肽的代表性LC-ESI-MS/MS谱图。我们使用C1q重复这个实验，并观察到类似的模式（S2和S3图，以及S2和S3表）。总的来说，这些结果表明PG0352作为一种唾液酸酶，可以从唾液酸化的补体蛋白中去除末端唾液酸。

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图3. PG0352去唾液酸化人因子H（FH）。

（A） 未经处理的FH的SDS-PAGE（A条）和用重组PG0352或PG0352处理的（B条带）AAAA在 3°C 下放置 37 小时。 切除条带A和B以检测纳米LC-ESI/MS/MS以检查N-连接聚糖。（B）和（C）未处理（B）和用PG0352处理（C）处理的FH糖肽的代表性LC-ESI-MS / MS谱图。

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表 1. PG0352处理前后人因子H（FH）的纳米LC/MS/MS的MS/MS谱图。

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PG0352 解除血清对易感细菌的杀伤效果

我们先前的研究表明，PG0352的缺失突变体ΔPG0352易于补体杀灭，而其亲本野生型菌株具有抗性[27]。由于PG0352可以脱水解关键的补体因子，如C1q、C4和C5，我们推测这种活性可能直接保护Pg免受补体杀伤。为了测试这种推测，我们首先通过在用血清挑战之前向ΔPG0352中添加重组PG0352来进行“细胞外”互补测定。然而，我们发现重组蛋白很可能被牙龈蛋白酶（PG产生的一组蛋白酶）迅速降解[37-39]。我们还尝试使用上面构建的非活性形式的PG0352来补充突变体，但没有成功。为了克服这些技术问题，我们使用E进行了保护测定。大肠杆菌NEB5α，一种非致病菌株，对血清杀伤敏感[40]，作为替代物。在本实验中，稀释至2%和5%的人血清样品用野生型PG0352或PG0352预处理AAAA所得样品用于血清杀灭试验。孵育60分钟后，E的平均存活率。用PG2处理的0352%人血清中的大肠杆菌为~93%，在用PG47处理的样品中降至0352%AAAA (图4A）。在用5%人血清处理的样品中观察到类似的模式，其中E的存活率。大肠杆菌从78.67%下降到42%（图4B）。为了证实这些发现，我们评估了补体在E上的沉积。大肠杆菌细胞，以确定PG0352是否通过抑制补体活化和随后在细菌细胞表面形成MAC（C5b-9）来赋予保护作用。正如预期的那样，在E中检测到补体因子，例如C3，C5-9和C9。用5%正常人血清处理的大肠杆菌样本。相比之下，在用PG3处理的样品中仅检测到痕量的C5，C9-9和C0352信号（图4C）。这些结果表明，用PG0352预处理人血清，但不是其非活性形式，可以保护E等细菌。血清杀伤引起的大肠杆菌，最有可能通过关键补体因子（如 C1q、C4 和 C5）的脱唾液化。

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图4. PG0352抑制血清的杀菌活性。

对E进行血清杀灭试验。大肠杆菌NEB5α使用用野生型PG0352或其非活性形式PG0352预处理的正常人血清AAAA，如材料和方法部分所述。使用热灭活血清作为对照。（A） 2%血清;（B） 5%血清。使用单因素方差分析，然后在P < 0处进行Tukey的多重比较确定统计分析。05.（C）补体沉积测定。共 10 条7E的细胞。将大肠杆菌细胞与5%正常人血清（-）或PG0352处理（+）血清在20°C下共同孵育37分钟。 收获所得血清处理的细胞，洗涤并重悬于50μlPBS中。对大约10μl样品进行SDS-PAGE，然后用标记的四种不同抗体进行免疫印迹分析：αC3（抗C3的多克隆抗体），αC9（抗C9的单克隆抗体），αC5-9（抗C5-9复合物的单克隆抗体）和αGroEL（抗E的多克隆抗体。大肠杆菌格罗埃尔）。这些抗体购自 Abcam。

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未配体PG0352的晶体结构

为了阐明PG0352的催化机理，我们首先在单斜空间组中使用同步辐射至1.84?确定了其未配体晶体结构。利用分子替换结合使用AlphaFold2生成的蛋白质模型获得初始阶段。PG0352的整体结构由两个主要结构域组成，包含493个残基（31-523）（图5和表2）。小的N端结构域（残基31至176）是假定的碳水化合物结合模块（CBM），而C端结构域（残基177-523）表现出典型的六叶β螺旋桨唾液酸酶折叠，每个叶片由3-4个反平行β链组成。未配体PG0352的整体结构与最近的报告非常相似（41）。

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图5. PG0352的整体架构。

PG0352整体结构的卡通表示，突出了N端CBM结构域和C端唾液酸酶结构域。螺旋和β片二级结构分别被涂成红色和黄色。N-乙酰神经氨酸（Neu5Ac）在唾液酸酶结构域的中心内结合，碳，氮和氧原子分别呈绿色，蓝色和红色。N端和C端被相应地标记。标记为“YRIP”的区域对应于突变为Ala-Ala-Ala-Ala的保守“F / YRIP”序列，以产生催化无活性的PG0352（PG0352AAAA).

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表 2. 六个PG0352晶体结构的数据收集和细化统计。

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煤层气由两张平行的β片组成，β股在一面上为三股，另一面为五股β股（图5）。β片形成凹面，形成面向唾液酸酶结构域活性位点的开放裂缝。利用CBM结构的DALI搜索[42]确定了肠道细菌中发现的唾液酸酶26（PDB条目6MRV）[43]作为最接近的结构同源物，对于16个等效的Cα原子，序列同一性为9.12%，Z评分为2.2，均方根偏差（RMSD）为18.127?。最近表征的来自连翘坦纳菌的NanH唾液酸酶（TfNanH;PDB条目7QYJ）[44]还包含一个N端结构域，尽管表现出16.6%的序列同一性，但该结构域与CBM显示出很强的结构同源性。由于唾液酸酶26和TfNanH的CBM都属于CBM93家族，如碳水化合物活性酶（CAZy）数据库[45]所定义，因此PG0352的CBM很可能也是成员。据推测，CBM裂缝用于结合埾液酸聚糖，以便随后将末端唾液酸定位在唾液酸酶结构域的活性位点内[32,44,46]。尽管与唾液酸酶26和TfNanH的CBMs的序列同一性较低，但裂隙内仍有一些残基保守，可能参与底物的配位，包括Trp-36、His-40、Lys-53、Arg-95和Ser-169[46-48]。

对PG0352唾液酸酶结构域的检查揭示了与CAZy糖苷水解酶家族33（GH33）的其他细菌，人类和真菌成员的显着结构同源性。DALI搜索确定来自非致病性土壤细菌微单孢子虫（PDB条目1EUT）[49]的唾液酸酶是与PG0352最接近的结构同系物，32个等效Cα原子的序列同一性为42%，Z评分为7.2，RMSD为1.333?。TfNanH还表现出与PG0352的结构同源性，尽管在该域中仅共享1%的序列同一性，但对于54个等效的Cα原子的RMSD为318.21?。参与催化的残基和有助于塑造GH33酶唾液酸酶结构域结构的序列基序在PG0352中是完全保守的。活性位点的相对面有四个Asp盒基序，用于维持酶的β螺旋桨折叠结构[50]。活性部位裂隙位于β螺旋桨的中心，表面可触及（图5）。如前所述，酶两面的静电电位存在差异，催化面的正电位更大，相反面的负电位更大[41]。该电荷差被认为对于将酶的催化面定向到底物至关重要[51-53]。Tyr-488和Glu-382侧链的位置表明它们分别作为亲核试剂和一般碱催化剂，因为它们在其他结构表征的细菌唾液酸酶中占据拓扑等效位置（图6）[34,41,44,49,54].类似地，Asp-219被定位为酸/碱催化剂，以激活水分子以释放游离唾液酸[48,49,55,56]。

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图6. PG0352配体相互作用。

与（A）Neu5Ac，（B）DANA，（C）3'SL和（D）6'SL结合的唾液酸酶活性位点的卡通表示。 FO-FC省略电子密度图，在3s处轮廓，在每个面板中显示为绿色网格。与配体相互作用的残基被标记并显示为棒状，碳原子、氮原子和氧原子分别着色为黄色、蓝色和红色。有序的水分子被描绘成红色球体。D219A突变在图C和D中标记为红色.唾液酸羧酸头的协调由Tri-arg基序（Arg-194，Arg-398，Arg-460）介导。甘油部分通过与Asp-381的相互作用稳定，而N-乙酰基部分通过与Asp-256的极性相互作用稳定，并插入由Leu-220，Val-272，Leu-277，Trp-278和Phe-327形成的疏水口袋中。每个配体的化学结构如图6所示。

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我们在Tyr-488侧链附近的活性位点口袋内观察到额外的电子密度，随后我们将其建模为来自结晶混合物的部分占据的柠檬酸盐分子（S4，S5E和S6图）。同样，最近的一份报告也在同一位置发现了酒石酸盐分子[41]。柠檬酸羧乙基之一与Arg-194、Arg-398和Arg-460相互作用，Arg-48是与稳定唾液酸羧酸基团有关的保守精氨酸残基三元组[49,57,194]。Arg-504是保守RIP基序的一部分，并被Glu-50进一步稳定[213]。另一个羧乙基与Arg-4的侧链相互作用，模仿该侧链与唾液酸O34之间的相互作用[49,58,219]。这种相互作用扰乱了Asp-<>的侧链，其在未配体结构中表现出交替的旋转体构象。第三羧乙基不与酶相互作用，因为它的方向远离活性位点口袋。

PG0352与产物和抑制剂的相互作用

我们还确定了PG0352与产物Neu5Ac（PG0352：Neu5Ac）和唾液酸酶抑制剂2-脱氧-2,3-脱氢-N-乙酰神经氨酸（PG0352：DANA）结合的晶体结构，分辨率分别为1.93?和2.14?（图6和表2）。利用分子替换和未配体的PG0352结构作为搜索模型求解了这些结构。每个结构在由CBM和唾液酸酶结构域组成的不对称单元中含有一种PG0352单体。计算出的PG0352：Neu5Ac和PG0352：DANA结构与未配体PG0352结构之间的RMSDs分别为0.227?和0.517?，表明结构之间没有显著的全局差异。

在PG5：Neu0352Ac晶体结构的活性位点内以α异常形式结合的Neu5Ac可见清晰的电子密度（图6A和S5A）。Neu5Ac取向于其羧基与Arg-194，Arg-398和Arg-460的胍基相互作用。C-2羟基与Asp-219形成氢键，而C-4羟基与Asp-256，Arg-213和Asp-219形成氢键相互作用。N-乙酰基部分位于由Leu-220、Val-272、Leu-277、Trp-278和Phe-327形成的疏水口袋内，N-乙酰酰胺与Asp-256的羧酸盐相互作用。甘油部分主要通过O-8和O-9原子与Asp-381之间的相互作用稳定。总的来说，相互作用使Neu6Ac的O2和C5原子分别位于Tyr-2羟基的89.3?和26.488?。Neu5Ac的结合也导致Asp-219的侧链采用单一构象。

PG0352：Neu5Ac和PG0352：DANA结合晶体结构域之间的RMSD为0.19?，表明DANA的结合不会导致明显的结构偏差。正如预期的那样，DANA在唾液酸酶活性位点内以与Neu5Ac观察到的构象相似的构象结合，所有活性位点残基表现出几乎相同的旋转体构象（图6B和S5B）。上述涉及Neu5Ac的羧酸盐，N-乙酰基和甘油部分的相互作用与观察到的与PG0352结合的DANA相互作用是保守的。与Neu5Ac相比，DANA表现出更平面的环结构，这导致O6原子与Glu-382和Arg-398的相互作用丧失。此外，Tyr-488的羟基从O6原子移开0.35?。这些扰动使Tyr-488的羟基更接近DANA的C2原子。糖环的平面性也会扰乱甘油部分的位置，使O8和O9原子与Glu-382和Arg-398侧链之间的距离分别增加0.5?和0.3?。结果，这些原子现在与Arg-398的侧链相互作用。观察到PG0352：Neu5Ac晶体结构中不存在的两种有序水，这进一步提供了活性位点内DANA的稳定相互作用。其中一种水与Arg-194和Asp-219形成氢键，可能模仿了Asp-219激活的水分子，以促进糖苷键的水解[34,48,49]。

为了探究PG0352如何与天然聚糖相互作用，我们在PG219中设计了一个D0352A突变，以抑制酶水解糖苷键的能力[44,59]。随后，我们将D219A PG0352与3'-唾液酸乳糖（3'-SL）和6'-唾液酸乳糖（6'-SL）共结晶，并利用分子置换方法分别解析为1.42?和1.41?的结构（图6和表2）。CBM和唾液酸酶结构域的整体结构在结构中是完全保守的。在每种结构中，唾液酸部分的糖环采用扭曲的舟状构象，与DANA相比，O2，O6和C7羟基的位置发生了~0.5?的变化，这是由于D219A取代。否则，PG0352：3'-SL和PG0352：6'-SL结构中末端唾液酸部分结合所涉及的残基和相互作用与PG5：Neu0352Ac结构中Neu5Ac结合观察到的残基和相互作用基本相同（图6C，6D，S5C和S5D）。在活性位点中观察到另外三个有序的水分子。一个有序的水占据了Asp-219侧链腾出的空间，将O2原子协调到Ala-219的主链酰胺和Arg-194的侧链上。另外两个有序的水是将唾液酸的羧酸盐连接到Trp-278，Arg-398和Gln-400侧链的相互作用网络的一部分。 没有观察到清晰的电子密度来促进3'-SL或6'-SL的半乳糖或葡萄糖部分的建模。

PG0352的功能表征

大多数细菌唾液酸酶是单体，尽管其分子量（MW）和结构域结构存在差异[48,60,61]。相反，病毒唾液酸酶通常形成四聚体[60]。我们使用体积排阻色谱（SEC）来确定PG0352是形成单体还是低聚物。SEC色谱图显示，PG0352在单个大峰上洗脱，估计分子量为52 kDa，表明PG0352在溶液中形成单体（S7图）。接下来，我们检查了PG0352的动力学特性，并确定了其对Neu5Ac和Neu5Gc的亲和力，这是两种最丰富和研究最好的唾液酸[30,31]。在这些实验中，分别代表Neu4Ac和Neu4Gc的4-甲基伞形酰基-α-D-N-乙酰神经氨酸（4-MUNANA）和5-甲基伞形酰基-α-D-乙醇酰神经氨酸（5-MUNAGc）作为底物。我们首先利用0352-MUNANA评估了pH值对PG4唾液酸酶活性的影响。虽然唾液酸酶活性在3.0–8.0的pH范围内可检测到，但在pH 5.0下观察到最大活性（图7A）。然后，我们将PG0352与不同量的4-MUNANA或4-MUNAGc孵育，并确定从每种底物释放的4-甲基伞形酮（4-MU）的初始速率。野生型PG0352有一个V.max的 62.33 ± 6.236 mmol 最小值-1毫克-1和 Km当使用81-MUNAGc作为底物时，值为65.20±56.4μM。当使用4-MUNANA作为底物时，V.max的 66.91 ± 3.350 mmol 最小值-1毫克-1和 Km观察到的值为 39.31 ± 6.540 μM。虽然PG0352表现出类似的V.max朝向两个基底，Km4-MUNAGc的值是2-MUNANA的4倍，表明PG0352与Neu5Ac具有更高的结合亲和力。正如预期的那样，我们没有检测到PG0352的任何可测量的唾液酸酶活性AAAA突变体构造。

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Fig 7. Functional Evaluation of PG0352.

（A）PG0352在不同的pH条件下用荧光底物4-甲基伞形酰基-α-D-N-乙酰神经氨酸（4-MUNANA）处理，以评估其唾液酸酶活性的最佳pH值，如方法部分所述。PG0352具有较宽的活性范围（pH 3–8），在pH 5时具有最大活性。上图：基于4-MU释放的每个pH条件下获得的荧光水平的代表性图像。（B）使用0352-MUNANA和4-甲基伞形-α-D-乙醇神经氨酸（4-MUNAGc）作为底物，如方法部分所述评估PG4唾液酸酶活性。非活性 PG0352 （PG0352AAAA）用作阴性对照。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011674.g007

CBM的缺失改变了PG0352的溶解度，但截短的蛋白质保留了唾液酸酶活性

我们试图确定PG0352的唾液酸酶活性是否需要CBM。在此过程中，我们去除了CBM（1-180 aa）并表达仅包含C端唾液酸酶结构域的截短蛋白（PG0352CT）。CBM的缺失显著降低了E中PG0352CT的表达水平。大肠杆菌，以及影响PG0352CT的溶解度，例如，大多数纯化的蛋白质是不溶的（图8A）。经过多次试验，我们能够利用pET0352载体结合大体积E表达和纯化少量可溶性PG200CT。大肠杆菌培养物（~4L）（图8A）。尽管截短的蛋白质未纯化至均一，但滤纸斑点测定显示PG0352CT仍具有时间和剂量依赖性的唾液酸酶活性（图8B）。总的来说，这些结果表明CBM需要维持PG0352的溶解度，而不是其唾液酸酶活性。

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图8. 独立CBM（碳水化合物结合模块）和唾液酸酶结构域构建体的功能评估。

（A） SDS-PAGE 凝胶显示 C 端唾液酸酶结构域构建体的纯化 （PG0352CT）。与PG0352CT有关的波段由红色箭头表示。FT：流通，内衬：不溶性部分。（B）来自重组PG0352CT唾液酸酶过滤斑点测定的代表性图像。（C） SDS-PAGE凝胶显示纯化的重组CBM。（D）使用rCBM和人血清的免疫共沉淀（Co-IP）。重组PG1589作为阴性对照被纳入。红色数字是在CBM下拉样品中发现的三个蛋白质条带，在对照样品中不存在。（E）使用未经处理的rCBM和C1q和用PG0352处理的Co-IP。对于处理过的样品，在Co-IP之前，将C1q与PG0352在2°C下孵育37小时。 （F）与PG0352的CBM结构域结合的果糖的卡通表示。FO-FC省略电子密度，轮廓为3σ，显示为绿色网格。与果糖相互作用的残基被标记并显示为棒状，碳、氮和氧原子分别呈黄色、蓝色和红色。有序的水分子被描绘成红色球体。果糖的化学结构如图6所示。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011674.g008

CBM与糖基化血清蛋白结合

为了进一步研究CBM的作用，我们表达并纯化了仅含有CBM（残基30-180）的N端截断结构。这种结构在E中得到了高度表达。大肠杆菌。正如预期的那样，纯化的重组CBM蛋白（rCBM）没有表现出唾液酸酶活性。像PG0352一样，V的唾液酸酶。霍乱具有N末端凝集素样结构域[48]和M的唾液酸酶。Viridifaciens具有半乳糖结合结构域[46]。由于这些非催化结构域与结合碳水化合物有关，我们推测同样的情况可能适用于CBM。为了验证这一假设，我们纯化了rCBM（图8C）并使用人血清进行了下拉实验，因为它含有充足的糖蛋白和各种聚糖模块，包括唾液酸聚糖。下拉测定与纳米LC-/MS/MS分析相结合，鉴定出四种蛋白质：C1q（25.8 kDa），免疫球蛋白λ样多肽5（23 kDa），转甲状腺素蛋白（15.9 kDa）和dermcidin（12.4 kDa）（图8D）。有趣的是，这四种蛋白质都是糖基化的[7,62,63]。为了确认这一结果，我们使用C1q和PG0352处理的C1q重复下拉测定。 与上述下拉结果一致，rCBM树脂沉淀了C1q，但不是PG0352处理的C1q（图8E），这表明C1q和CBM之间的结合是特异性的，很可能取决于唾液酸化。这些结果进一步表明，CBM具有碳水化合物结合结构域的功能。

PG0352 CBM与碳水化合物的相互作用

为了进一步表征碳水化合物和CBM之间的相互作用模式，我们将PG0352与果糖共结晶，并将复合物（PG0352：果糖）的结构确定为2.29?分辨率。PG0352：果糖与未配体PG0352结构的叠加显示总RMSD为0.56?（493当量C?原子），大部分差异局限于CBM结构域RMSD 0.527?（145等效C?原子），与唾液酸酶结构域RMSD相比为0.248?（348当量C?原子）。在CBM之间观察到的差异是由于远离果糖结合位点的区域的变化。这些变化不太可能与果糖结合有关，因为它们也存在于PG0352：DANA结构中，该结构不包含在CBM内结合的配体。果糖配体主要通过其氧原子与His-40、Arg-95、Arg-461、Ser-485和Asp-507的亲水侧链之间的直接和水介导的氢键相互作用在CBM内稳定，表现出交替的旋转体构象（图8F和S5F）。

讨论

在本报告中，我们提供了生化和结构证据，证明PG0352通过对关键补体因子（如C1q，C4和C5）的去唾液化提供对补体杀伤的保护。我们认为，这种保护主要发生在牙龈缝隙处，因为Pg作为一种关键的牙周病原病原体，主要存在于牙龈缝隙中，牙龈缝隙中含有高浓度的血浆，并受到补体系统的持续监测[64-66]。除牙周病外，Pg还与心血管疾病、阿尔茨海默病和类风湿关节炎等多种全身性疾病有关[67-69]。可以想象，PG0352介导的补体耐药性可以帮助促进Pg引起全身感染的能力。基础和临床研究表明，唾液酸酶在Pg的致病性和牙周炎的发病机制中起关键作用。首先，我们之前的动物研究表明，所有受到Pg W83野生型菌株攻击的小鼠都发生了全身感染（例如，继发性皮肤病变和肺，肝脏和其他器官中明显的扩散感染），并且感染的小鼠在皮下注射后6天内死亡。相比之下，PG0352的缺失突变体未能诱导全身感染，感染小鼠均存活[27]。其次，Moncla等人检查了25株Pg临床分离株，发现它们都具有唾液酸酶活性[70]。BLAST搜索进一步显示，所有基因组测序的Pg分离株都含有至少一个PG0352同源物拷贝。最后，临床研究发现，牙周炎患者牙龈沟液（GCF）中的唾液酸酶水平明显高于健康个体;因此，唾液酸酶已被提议作为评估牙周炎严重程度和牙周治疗结局的预测生物标志物[71,72]。除Pg外，其他牙周病原体，如T。登蒂科拉和T.连翘也产生唾液酸酶，这是重要的毒力因子;然而，其致病作用的机制仍然难以捉摸[26,73]。因此，本报告中的研究为研究唾液酸酶在其他牙周病原体中的作用和潜在机制开辟了新的途径。

口腔是一个动态的环境。它的pH值会受到许多因素的影响，包括我们的饮食摄入量。例如，高糖饮食有利于变形链球菌和乳酸杆菌的定植，后者可以代谢糖（即蔗糖）并产生使牙齿脱矿的酸，导致龋齿[74]。这种酸的产生可以降低牙菌斑的pH值。Vroom等人证明，口腔生物膜可以在体外形成pH梯度[75]。他们制备了由核梭杆菌，Pg，S组成的多种微生物生物膜。 穆坦斯，S.奥拉利斯，S.血红菌和Veillonella在化学恒温器系统中存在差异，表明添加蔗糖会导致生物膜中出现明显的pH梯度[75]。如果这反映在体内，我们可以假设PG0352的宽pH活性范围是有利的，因为尽管口腔内的pH值波动，它仍然可以发挥作用。因此，鉴于PG0352对其致病性至关重要，Pg的定植和存活将得到增强[27,76-80]。

4-MUNANA是表征唾液酸酶活性的常用底物[70]。该底物由与Neu4Ac连接的荧光5-MU组成。除定性分析外，4-MUNANA还可用于唾液酸酶活性的定量分析[57]。因此，我们使用4-MUNANA动力学表征PG0352的唾液酸酶活性。我们还想知道PG0352是否对Neu5Ac或Neu5Gc（两种最常见的唾液酸形式）具有更高的亲和力。Zaramela等报道，肠道细菌的唾液酸酶对Neu5Gc表现出更高的特异性，以响应饮食变化（即红肉增加）[43]。由于Pg存在于口腔中，它可以从我们的饮食（如红肉）中直接进入Neu5Gc。为了测试这一点，我们还包括了4-MUNAGc，以确定PG0352与Neu5Ac和Neu5Gc的亲和力。动力学研究表明，PG0352对两种底物均具有活性。然而，Km4-MUNAGc比2-MUNANA高4倍。对Neu5Ac的较高亲和力是合理的，因为它是人体的主要形式，因为人类只能产生Neu5Ac[81]。Neu5Gc可以通过饮食方式获得。对Neu5Ac和Neu5Gc都有活性，使Pg能够从我们吃的食物中清除唾液酸。这可能有助于通过从许多不同的来源释放唾液酸来促进社区水平的口腔微生物群。例如，F.核子可以使用唾液酸进行生长，但它不产生唾液酸酶。相反，F.核产生唾液酸转运蛋白，记为SiaT，使其能够从其他细菌（例如Pg）获得唾液酸酶释放的唾液酸[82]。PG0352具有广泛的活性和底物，可以在不同条件下从不同的底物中起作用并去除唾液酸，这些条件可以被Pg和/或其他细菌利用。

我们之前的报告发现PG0352保护Pg免受补体杀伤，但其潜在机制尚不完全清楚[27]。在本文中，我们提供了几条证据线，证明这种保护很可能是由于它对几个关键补体因子（例如，IgG，C1q和C4）的去唾液酸化活性。然而，由于上述技术限制，我们无法证明去唾液酸化直接赋予Pg补体抗性，即使我们证明这种活性保护了替代物E。血清杀灭中的大肠杆菌菌株。补体系统中有30多种蛋白质，包括血浆蛋白、调节因子、受体和配体，其中一些被sialoglycans修饰[7]。这些嘶吼合糖有助于蛋白质功能、稳定性、蛋白质-蛋白质相互作用和自我识别[7,28]。例如，唾液酸被认为可以通过稳定C1q来最小化C1复合物的非特异性相互作用[7]。FH的唾液酸脱化可改变其功能并导致致病作用[29]。我们证明PG0352可以有效地去解析人血清和单个补体因子，包括C1q，C4，C5，FH，FI，C4bp和IgG，突出了其在补体逃避中的重要性及其与改变宿主免疫稳态的潜在联系，这两者都在牙周炎的发病机制及其与全身性疾病的关联中起关键作用[2，64,69,83]。除了解除关键补体因子外，PG0352还可能通过其他机制损害补体系统，例如，用唾液酸修饰Pg表面分子，如多糖胶囊和脂多糖（LPS），这反过来又赋予其血清抗性。例如，N。淋病将唾液酸掺入其脂多糖（LOS）中，以捕获循环FH以逃避补体[84,85]。Pg中可能存在类似的情况，因为其LPS含有高水平的唾液酸[86]。此外，牙龈蛋白酶是一组Arg-X和Lys-X蛋白酶，通过降解补体因子（如C3和C5）来保护Pg免受血清杀伤[66,87,88]。Aruni等报道，PG0352的缺失降低了牙龈蛋白酶活性[76]。因此，PG0352也有可能通过控制牙龈蛋白酶的活性来促进血清抵抗。

PG0352是一种双结构域蛋白，由CBM和典型唾液酸酶结构域组成。BLASTP分析表明，CBM在从人类和动物中分离的不同卟啉单胞菌产生的唾液酸酶中高度保守[89]。最初，我们打算确定唾液酸酶活性是否需要CBM结构域。为了解决这个问题，我们设计了一个仅由C端唾液酸酶结构域（PG0352CT）组成的截断结构。令我们惊讶的是，这种截短的蛋白质在很大程度上是不溶的。经过多次尝试，表达微量的可溶性蛋白。随后，我们能够纯化少量具有可检测唾液酸酶活性的PG0352CT，这表明PG0352的唾液酸酶活性不需要CBM。

建立信任措施的确切功能尚不完全清楚。我们的晶体结构数据表明，它是一种假定的碳水化合物结合模块，属于CBM93家族。像PG0352一样，V的唾液酸酶。霍乱具有双凝集素样结构域，其中一个结构域可结合唾液酸以协调其活性[48,90]。T的NanH唾液酸酶。连翘也含有假定的CBM[32]。综上所述，我们推断CBM可能与sialoglycans结合以调节PG0352底物特异性。为了验证这一假设，我们使用纯化的CBM和人血清进行了下拉测定。我们的数据虽然是初步的，但显示CBM沉淀了几种糖蛋白，包括C1q，一种高度糖基化的补体因子[7]。此外，我们的晶体结构数据也支持CBM结合碳水化合物的功能。为了证实这些结果并确定CBM结合的碳水化合物类型，我们在两个独立的实体（ZBiotech和国家功能糖组学中心;NCFG）。来自显思科技的聚糖阵列包含100种不同的聚糖，表明CBM与几种候选聚糖结合;然而，约束力太弱，无法得出明确的结论。含有562个聚糖的NCFG聚糖阵列表明，CBM与几种大的聚乳糖胺的结合度较低。

PG0352：3'-SL或PG0352：6'-SL晶体结构内没有明确的电子密度，便于半乳糖或葡萄糖部分的建模。这些部分没有电子密度表明，除了末端唾液酸外，PG0352与活性位点的聚糖底物之间没有特定的相互作用。虽然3'-SL和6'-SL可能在共结晶过程中发生了水解，但正如6'-SL的稳定性研究表明的那样，该分子在35°C的中性pH溶液中保持稳定长达91个月的可能性不大[92]。最近的研究强调了CH-π堆积相互作用对酶中碳水化合物结合的重要性，特别是唾液酸酶等聚糖修饰酶[94-50]。这些研究强调了PDB沉积的含聚糖结构中芳香族残基（即Trp、Tyr、Phe和His）与非共价连接的碳水化合物之间的相互作用，赋予碳水化合物显著的非特异性结合亲和力（分别为~90%和93%的结合能和亲和力）[41]。此外，活性位点上方的环，特别是羧酸结合区上方的环与唾液酸酶的底物选择性有关[44,47,49,52,57,95,1]。以前有人建议这些环通过芳香族残基介导的空间位阻来赋予底物选择性。然而，克氏锥虫唾液酸酶（PDB ID 0MS96）与共结晶乳糖分子呈CH-π堆积相互作用[0352]。有趣的是，PG77不显示连锁偏好[34]，也不在该区域内具有芳香族残基，而许多其他具有连锁偏好的唾液酸酶[44,96,0352]。因此，PG<>的广泛底物偏好可能是由活性位点上方环内缺乏特定芳族残基介导的，更广泛地说，唾液酸酶内的连锁偏好可以通过芳香族残基介导的CH-π堆积介导。

During the preparation of this manuscript, the structure of PG0352 bound to tartrate was published (41). The structure was determined to 2.10? in space group P3121，在不对称单元中有 3 个分子。此处报告的结构与该结构的叠加表明，整体结构或N端和C端域内没有显着差异。有趣的是，在其结构的唾液酸酶活性位点中观察到的酒石酸盐分子与此处报道的未配体PG0352结构中观察到的柠檬酸盐结合的构象几乎相同，这表明这些分子可以作为有用的稳定配体以促进唾液酸酶的结晶。

材料和方法

PG0352重组蛋白的制备

编码PG0352的核苷酸序列经过密码子优化（GenScript）合成，然后插入到pUC57克隆载体中。密码子优化的扩增子由BamHI和HindIII释放并亚克隆到pQE80L表达载体中（Qiagen，Germantown，MD）。然后将所得表达载体转化为BL21-Star（DE3）进行蛋白表达和纯化。为了制备PG0352CT蛋白，将编码C端唾液酸酶结构域（残基180-526）的序列进行PCR扩增，克隆到pET200中，通过DNA测序验证，然后转化为BL21-Star（DE3）。为了制备重组CBM，将编码PG0352的N端CBM（残基30-180）的核苷酸序列进行PCR扩增，克隆成pET101，通过DNA测序验证，随后转化为BL21-Star（DE3）进行表达。用于克隆的PCR引物可在S1表中找到。

用21 mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）在3°C下诱导WT PG1和30°C诱导PG0352CT和CBM重组蛋白在BL16-Star（DE0352）中的表达。如前所述，重组蛋白在天然条件下纯化[26]。简而言之，E.将大肠杆菌细胞沉淀重悬于裂解缓冲液（300 mM NaCl，50 mM NaH2采购订单4和 10 mM 咪唑，pH 8.0），补充有溶菌酶 （10 mg/mL） 和苯并酶 （0.5 μg/mL），并使用 Emulsiflex-C3（Avestin;加拿大安大略省）。在15°C下以000,20 RPM离心4分钟后，收集上清液并使用NGC FPLC系统（Bio-Rad，Hercules，CA）应用于HisTrap HP Ni-NTA色谱柱（Cytiva，马尔堡，马萨诸塞州）。进行体积排阻色谱（SEC）以测量PG0352的大小并提高其纯度。将Ni-NTA纯化的PG0352蛋白在透析缓冲液（50 mM Tris，150 mM NaCl，pH 7.0）中合并并透析过夜。将透析蛋白应用于填充有Superdex 16树脂（Cytiva，马尔堡，MA）或Superdex 100 Raise 200/200 GL（Cytiva）的XK 10/300色谱柱上。

定点诱变产生催化无活性的PG0352

定点诱变用于产生催化无活性的PG0352蛋白。Tyr-193，Arg-194，Ile-195和Pro-196共同突变为丙氨酸的结构（PG0352AAAA）使用Q5定点诱变试剂盒（新英格兰生物实验室，马萨诸塞州伊普斯威奇）进行工程设计，如先前报道的那样[32]。正向引物设计为包含点突变，反向引物设计有正向引物的适配器（突出）。将pQE0352中克隆的野生型密码子优化PG80基因用作使用PCR扩增进行定点诱变的模板。随后的PCR产物用激酶，连接酶和DpnI酶的专有混合物（新英格兰生物实验室）处理，然后转化为NEB5α进行质粒纯化。纯化的质粒通过DNA测序进行验证，随后转化为BL21-Star（DE3）进行蛋白表达和纯化。利用SuperFi II DNA聚合酶结合基于全质粒PCR的方法和含有N端His的pQE219L质粒产生用于晶体结构测定的D80A突变6PG31的亲和标签和残基526-0352作为模板。PCR产物在1°C下用37x DpnI（新英格兰生物实验室）处理1小时，然后转化为E。大肠杆菌NEB5?细胞。使用全质粒测序验证突变。定点诱变的引物可以在S1表中找到。

唾液酸酶活性测定

我们通过在不同pH条件下进行测定来测量PG0352的唾液酸酶活性。该测定是在设计用于测量荧光的黑色96孔聚苯乙烯板上进行的（康宁公司，康宁，纽约）。使用5 nM PG0352在0 °C下处理1.4 mM 4-甲基伞形酰基-α-D-N-乙酰神经氨酸（1-MUNANA）37分钟：20 mM柠檬酸钠（pH 3–5）、20 mM磷酸钠（pH 6–8）和20 mM碳酸氢钠（pH 8–10.5）[26,32]。孵育后，用碳酸氢钠（pH 10.5）以1：1.5的体积比（反应：缓冲液）淬灭反应。通过测量4-甲基伞形酮（4-MU;西格玛-奥尔德里奇，密苏里州圣路易斯）荧光（λ前任= 350 nm 和 λem= 450 nm），在 Varioskan LUX 多模酶标仪（赛默飞世尔，匹兹堡，宾夕法尼亚州）上。为了进行动力学表征，将5 nM的PG0352与0–250 μM 4-MUNANA在含有10 mM柠檬酸钠（pH 5.0）的反应缓冲液中孵育。反应在1°C下进行37分钟，并立即用10mM碳酸氢钠淬灭，pH 10.5，体积比为1：1.5。使用一组浓度（4–0 nM）的250-MU生成标准曲线。对照标准曲线施加PG0352活性以测量4-MU的释放量（μmolmin-1毫克-1).使用GraphPad Prism 5（Graph-Pad Software，加利福尼亚州圣地亚哥）将数据拟合到Michaelis-Menten动力学中，以计算V.max和 Km.为了评估PG0352的底物特异性，使用4-甲基伞形-α-D-乙醇酰神经氨酸（4-MUNAGc;苏塞克斯研究，加拿大渥太华）。产气荚膜梭菌的唾液酸酶作为所有条件的对照。

PG0352血清杀伤保护试验

对于该测定，正常人血清（NHS）用野生型PG0352或PG0352预处理AAAA确定PG0352是否能抑制血清对E的杀菌活性。大肠杆菌，如前所述，经过一些修改[26,27]。简而言之，E.大肠杆菌NEB5α在LB培养基中培养直至达到指数生长期（OD6000.5–0.7).选择该菌株是因为其对血清杀伤的敏感性[40]。将细胞旋转并用明胶巴比妥酸盐维罗纳缓冲液（GVB）洗涤两次[40]。在此期间，将NHS解冻并用10mM柠檬酸钠在GVB中稀释，pH 5.0至终浓度为2%（v / v）或5%（v / v）。血清用100 nM野生型PG0352或PG0352处理++++AAAA在 30°C 下放置 37 分钟。 将处理过的血清样品与NEB5α细胞在37°C下共同孵育30或60分钟。孵育后，将样品连续稀释并铺板到LB琼脂平板上进行菌落计数。将板在37°C孵育过夜。第二天早上，计数平板上的菌落以计算存活率。存活率计算如下：处理血清的菌落数相对于热灭活人血清的菌落数。

补体沉积测定

该实验如先前报道的那样进行，并进行了一些修改[26]。简而言之，E.大肠杆菌NEB5α细胞生长至中对数（OD600：0.5–0.7），通过离心收获，洗涤并用GVB重悬。为了测量补体沉积，10++7NEB5α细胞与5%正常人血清或PG0352处理的血清（与100nM重组PG0352在30°C下共孵育37分钟）在20°C下共孵育37分钟。 孵育后，结果E.将大肠杆菌细胞在冰上孵育1分钟，以灭活通过离心获得的补体活化。用冰冷的PBS-EDTA洗涤获得的细胞沉淀，然后进行SDS-PAGE，然后使用抗体C3（cat#，ab48611），C5b-9（cat#，ab66768）和C9（cat#，ab17931）或E进行免疫印迹分析。大肠杆菌GroEL （cat#， ab82592， 加载控制）。这些抗体购自 Abcam。

用PG0352治疗人血清和补体因子

如前所述[26]，终浓度为0.15%（v/v）的人血清用0.2–0.6μg野生型PG0352或PG0352处理。AAAA在10mM柠檬酸钠中，pH 5.0。将样品在37°C下孵育，并在不同的时间点（例如，15、30和60分钟）采集样品。对样品进行SDS-PAGE，然后使用黑桑布库斯（SNA;矢量实验室，加利福尼亚州纽瓦克）和刀豆球蛋白A（ConA;载体实验室）凝集素。使用人补体因子进行了类似的实验，包括C1q，C3，C4，C5，因子H（FH），因子I（FI）和C4结合蛋白（C4bp）。根据制造商（Complement Technologies，Tyler TX）网站，这些因素是从健康供体的混合血清中纯化的。人免疫球蛋白IgG购自Sigma-Aldrich。补体蛋白用100 nM野生型PG0352、PG0352处理AAAA或 C。产气荚膜唾液酸酶（对照）。处理后，在30和60分钟收集样品，进行SDS-PAGE，并使用凝集素印迹分析进行分析。

凝集素印迹分析

凝集素印迹检测如前所述[26,27]。简而言之，将血清样品或补体蛋白进行SDS-PAGE，然后转移到PVDF膜上。将所得膜在补充有1.0%吐温-05的20x无碳水化合物封闭缓冲液（载体实验室）中封闭过夜。然后将膜与0.2μg/mL SNA或0.5 μg/mL ConA在含有0.2%吐温-0的05.20x无碳水化合物封闭缓冲液中在室温下孵育1小时。孵育后，用过滤的PBS，0.05%吐温-20（PBS-T）洗涤膜四次，然后与链霉亲和素 - 辣根过氧化物酶偶联物（赛默飞世尔）孵育1小时。随后用过滤的PBS-T洗涤印迹四次，使用ECL鲁米诺测定（Bio-Rad）开发，并使用ChemiDoc成像系统（Bio-Rad）成像。

凝胶内胰蛋白酶消化

将蛋白质凝胶样品切成~1 mm立方体，用胰蛋白酶消化，然后提取胰蛋白酶肽。将切除的凝胶片在200 μL蒸馏/去离子水、200 μL 50 mM碳酸氢铵、50%乙腈中连续洗涤，最后在200 μL 100%乙腈中洗涤。将脱水凝胶片用30 μL 10 mM二硫苏糖醇在100 mM碳酸氢铵中在1°C下还原56小时，并在室温下用30 μL 55 mM碘乙酰胺在100 mM碳酸氢铵中在黑暗中烷基化45分钟。如上所述重复洗涤步骤。然后将凝胶干燥并用胰蛋白酶在1mM碳酸氢铵，10%乙腈中以估计的比例50：10（w / w）再水合，并在37°C下孵育18小时。用200 μL 50%乙腈、5%甲酸提取消化肽两次，用100 μL 75%乙腈、5%甲酸提取一次。将每个样品的提取物汇集在一起，用Costar Spin-X 0.22 μm离心过滤器（康宁公司，康宁，纽约）过滤，并在高速真空中干燥。在LC-MS/MS分析之前，将每个样品复溶为0.5%甲酸。

纳米LC-ESI-MS/MS分析

纯化的FH用野生型PG0352处理3小时，并用考马斯蓝染色进行SDS-PAGE。从处理和未处理的FH样品中提取两个目标分子量条带，并提交给康奈尔生物技术研究所的蛋白质组学和代谢组学设施，使用纳米级液相色谱与串联质谱（纳米LC-ESI/MS/MS）耦合进行N-link糖基化分析。在进行纳米LC-ESI-MS / MS分析之前，用胰蛋白酶处理样品并在0.5%甲酸中复溶，该分析使用配备纳米喷雾Flex离子源的Orbitrap Fusion Tribrid质谱仪进行，并结合Dionex UltiMate 3000 RSLCnano系统（Thermo，Sunnyvale，CA）。以 5 μL/min 的流速将 18 μL 肽样品注入 PepMap C-5 RP 纳米捕获柱（100 μm、20 μm i.d x 20 mm）上，以便快速上样，然后在 18°C 下在 PepMap C-2 RP 纳米柱（75 μm、25 μm x 35 cm）上分离。 胰蛋白酶肽使用60分钟梯度的5%至35%乙腈在0.1%甲酸中以300 nL/min的速度洗脱，然后8分钟升至90%乙腈，并在8%乙腈下保持90分钟。在下一次运行之前，将色谱柱用0.1%甲酸重新平衡25分钟。Orbitrap Fusion在正离子模式下运行，喷雾电压设置为1.5 kV，源温度设置为275°C。 对傅里叶变换（FT）、离子阱（IT）和四极杆质量分析仪进行了外部校准。在数据依赖性采集（DDA）分析中，使用FT质量分析仪在MS扫描中操作仪器以选择母离子，然后使用第二个“最高速度”数据相关高能C阱解离（HCD）和电子转移/高能碰撞解离（EThcD）切换方法。在 3 m/z 四极杆分离的 orbitrap MS/MS 扫描中，HCD 适用于具有 2-3 个带电离子高于阈值离子计数 10,000 的前体肽和 30% MS 调查扫描的归一化碰撞能量，分辨率为 120,000（FWHM at m/z 200），质量范围为 m/z 350–1600。动态排阻参数设置为35 s的排阻持续时间，排阻质量宽度为±10 ppm。同时，对电荷为3–4的离子采用归一化自动增益控制为118e3、最大进样时间为7 ms的离子阱中的EThcD。所有数据均在Xcalibur 4.4操作软件（赛默飞世尔科技）下获取。

纳米LC-ESI-MS/MS数据分析

使用Byonics v. 3.6.8（蛋白质指标，加利福尼亚州圣卡洛斯）使用智人Uniprot蛋白质数据库搜索每个样品的MS和MS / MS原始光谱。肽搜索参数如下：使用半胱氨酸的固定氨基甲甲基修饰进行完全胰蛋白酶消化的两次遗漏裂解，蛋氨酸氧化和天冬酰胺/谷氨酰胺残基上的脱酰胺的可变修饰。HCD和EThcD谱图的肽质量耐受性为10 ppm，片段质量耐受性值分别为0.05Da和0.6Da。常见和罕见修改的最大数量设置为两个。针对309种哺乳动物N-连接聚糖的列表进行了聚糖搜索。过滤鉴定出的肽，以获得最大1%的错误发现率。

下拉检测

使用HisTrap HP Ni-NTA柱纯化重组CBM蛋白（rCBM），然后针对300 mM NaCl，50 mM NaH透析过夜2采购订单4和 10 mM 咪唑，pH 8.0 以去除多余的咪唑。将透析蛋白反弹至在同一缓冲液中平衡的新鲜Ni-NTA琼脂糖，以产生rCBM结合的Ni-NTA树脂（rCBM树脂）。用无菌PBS将人血清稀释至50%（v / v），然后与rCBM树脂在4°C下倒置孵育过夜。将rCBM树脂装入重力流柱中，并用300 mM NaCl，50 mM NaH洗涤2采购订单4，10 mM咪唑，pH 8.0。洗涤后，将rCBM树脂重悬于洗涤缓冲液中并煮沸以进行SDS-PAGE分析。同时，纯化的PG1589（一种二氢蝶酸合酶）以相同的方式处理以作为阴性对照。我们还单独使用缓冲液平衡的Ni-NTA树脂作为附加对照。这些对照用于排除血清蛋白与树脂的非特异性结合。如上所述，被rCBM特异性拉下的蛋白质被切除并提交给康奈尔生物技术研究所的蛋白质组学和代谢组学设施，用于使用纳米LC-MS / MS进行蛋白质鉴定。

使用蛋白质组发现器（PD）2.4软件（赛默飞世尔科技）和Sequest HT算法对带有MS和MS / MS的DDA原始文件进行数据库搜索。PD 2.4处理工作流程包含Minora特征检测器的附加节点，用于母离子定量，用于蛋白质鉴定和鉴定肽及其修饰形式的相对定量。数据库搜索是针对智人NCBI数据库进行的。肽前体耐受性设置为10 ppm，碎片离子耐受性设置为0.6 Da.M的氧化以及N和Q的脱酰胺被指定为氨基酸残基的动态修饰;蛋白N端乙酰化、M-损失和M-损失加乙酰化为变量修饰;氨基甲甲基C被指定为静态改性。只有由渗滤器定义的具有1%FDR的Sequest HT定义的高置信度肽才被考虑用于可靠的肽鉴定。

结晶学

野生型和D219A PG0352被转化为E。大肠杆菌BL21 星 （DE3）。为了大规模表达，在1°C下将含有LB培养基的25 L摇瓶接种37 mL起始培养物并生长至OD6000.4–0.6.通过添加IPTG至终浓度为1mM诱导细胞，并将温度降低至18°C。 通过离心在诱导后16小时收获细胞，并在-80°C下冷冻直至进一步使用。将对应于1L细胞生长培养基的细胞沉淀重悬于缓冲液A（50mM磷酸钠，pH 8.0,300mM NaCl，10mM咪唑，0.1%吐温-20（v / v），0.5mg / mL溶菌酶和60U / mL苯并酶）中并使用超声仪裂解。通过在40°C下以000,20g离心4分钟来澄清细胞裂解物。 将所得上清液与 5 mL 钴-NTA 树脂（赛默飞世尔，罗克福德，伊利诺伊州）一起在 30°C 下在缓冲液 A 中预平衡孵育 4 分钟，并轻轻混合。将树脂倒入柱支架中，并用10柱体积（CV）的缓冲液B（50 mM磷酸钠，pH 8.0,300 mM NaCl和20 mM咪唑）洗涤。使用5 CV缓冲液C（缓冲液B + 300 mM咪唑）从色谱柱中洗脱蛋白质。将洗脱级分合并并使用截止值为2 kDa的超离心过滤器浓缩至30 mL（密理博，马萨诸塞州贝德福德）。将浓缩样品施用在16 mM Tris、pH 600.200和20 mM NaCl中平衡的HiLoad 8/0 Superdex 150 PG体积排阻柱（Cytiva，马尔堡，马萨诸塞州）。将对应于PG0352的峰合并并使用截止值为25kDa的超离心过滤器浓缩至30 mg/mL。

使用商业筛选试剂盒和坐滴蒸汽扩散方法进行了初始结晶筛选，并从Morpheus筛选的条件H5（分子尺寸，俄亥俄州Maumee）中鉴定出铅。这些晶体以海胆的形式出现，无法优化。我们随后收获了晶体并产生了种子储备，这些种子与额外的筛选实验结合使用。将 0352 mg/mL 的 23 μL 蛋白质溶液与 3 μL 7.2–1.6 M 柠檬酸铵三碱基（pH 1.9 和 7μL 0：1 稀释的种子原液）混合，并在 1 mL 1000.1000 M 柠檬酸铵三碱的储液槽溶液上平衡，在 1°C 的静滴中生长适用于衍射实验的未配体 PG8 晶体， 酸碱度 7.0。利用上述条件通过共结晶生成PG0352与3'-唾液酸乳糖（3'-SL），6'-唾液酸乳糖（6'-SL）和果糖的复合物，在最终浓度为3mM的液滴中加入6'-SL，5'-SL和果糖。为了生成N-乙酰神经氨酸（Neu5Ac）和2-脱氧-2,3-脱氢-N-乙酰神经氨酸（DANA）复合物，将未配体的PG0352晶体分别浸泡在1.8 M柠檬酸铵三碱，pH 7.0和0.1M HEPES，pH 7.5中，含有27 mM Neu5Ac或10 mM DANA，分别浸泡60分钟和20分钟。随后收获所有晶体并在液氮中冷冻以进行衍射分析。

X射线衍射数据分别在先进光子源（阿贡国家实验室）使用Dectris Eiger-100M和Pilatus23 0352M探测器在光束线0352-ID-B（未配体PG0352，PG23：DANA和PG0352：果糖）和5-ID-D（PG0352：Neu3Ac，PG0352：6'-SL和PG16：3'-SL）上收集X射线衍射数据。数据在CCP6（v2.97）程序套件[98]中使用Xia4 / DIALS [8,0]进行处理。未配体PG99的结构是使用PHASER [0352]通过分子替换（MR）确定的，从PG100（UniProt ID：Q0352MX7）的预测结构衍生的搜索模型是由从AlphaFold DB [62]下载的AlphaFold2 [101]生成的。从原始AlphaFold模型生成了两个搜索模型，一个包含N末端结构域，另一个包含唾液酸酶结构域。在搜索过程中定位每个单独的结构域，不对称单元包含一个完整的PG102蛋白。该结构最初是使用模拟退火方案在凤凰中改进的。细化[0352]。在COOT [103]中连续几轮手动构建模型，并使用改进来构建缺失的蛋白质片段。使用MR和未配体的PG104结构作为搜索模型，确定了与Neu5Ac，DANA，3'-SL，6'-SL和果糖结合的后续结构，然后采用上述迭代轮模型构建和改进。在最后一轮精炼中，添加了水和配体，并应用了平移-解放-螺杆（TLS）精炼[0352]。表105总结了所有六个结构的数据收集和细化统计数据。使用MolProbity进行了结构验证[2]。坐标和结构因子已存入蛋白质数据库：PG106，条目0352FEB;PG8：Neu0352AC，条目 5T8Z;PG1：DANA，条目 0352T8Y;PG1：0352'-SL，条目 3T8;PG26：0352'-SL，条目 6T8;和 PG27：果糖，条目 0352T8。LIGPLOTS是使用LIGPLOT+（v.24.2.2）生成的[8]。

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本研究中使用的引物。

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S1 表。 本研究中使用的引物。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011674.s001

（英文）

S2 表。 PG1处理前后用于人类C0352q的纳米LC / MS / MS的MS / MS谱图。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011674.s002

（英文）

S3 表。 PG1处理前后用于人类C0352q的纳米LC / MS / MS的MS / MS谱图。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011674.s003

（英文）

S1 图 用PG0352处理的补体因子（cFactors）的SDS-PAGE分析。

对于本实验，用野生型PG0352或非活性PG0352（PG0352AAAA）60分钟，然后进行10%SDS-PAGE，然后进行考马斯蓝染色。FH：因子H;FI：因子 I。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011674.s004

（蒂夫）

S2 图 PG0352脱唾液酸C1q。

未处理（顶部）和用PG1处理（下）处理（下）的C0352q糖肽的代表性LC-ESI-MS/MS谱图。带下划线（红色）的是检测到末端Neu5Ac的聚糖。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011674.s005

（蒂夫）

S3 图 PG0352脱唾液酸C1q。

未处理（顶部）和用PG1处理（下）处理（下）的C0352q糖肽的代表性LC-ESI-MS/MS谱图。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011674.s006

（蒂夫）

S4 图 PG0352与柠檬酸盐的相互作用。

与柠檬酸盐结合的唾液酸酶活性位点的卡通表示。属于活性位点的残基被标记并显示为棒状，碳、氮和氧原子分别呈鲑鱼、蓝色和红色。有序的水分子被描绘成红色球体。注意 Gln-400、Asp-219 和 Asp-256 显示交替的旋转体构象。观察到一个羧乙基头与三-Arg（Arg-194，Arg-398，Arg-460）基序之间的相互作用，提出模拟唾液酸羧酸头的相互作用。在第二个羧乙基和Arg-213之间观察到额外的稳定相互作用，模仿该侧链与唾液酸的O-4之间的相互作用。第三羧乙基远离活性位点，不直接与酶相互作用。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011674.s007

（蒂夫）

S5 图 LIGPLOTs对应于PG0352配体。

描绘的是LIGPLOTs，突出了PG0352和（A）Neu5Ac，（B）dana，（C）3'SL，（D）6'SL，（E）柠檬酸盐，（F ）果糖之间的相互作用。 注（C）和（D）用PG0352 D219A突变体结晶。注意水分子被排除在LIGPLOT分析之外。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011674.s008

（蒂夫）

S6 图 本研究中使用的配体的化学结构。

注意PG0352：3'SL和PG0352：6'SL仅观察到对应于唾液酸（Neu5Ac）部分的密度（即，没有观察到半乳糖或葡萄糖部分的密度）。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011674.s009

（蒂夫）

S7 图 PG0352是单体的。

PG0352的低聚状态使用体积排阻色谱（SEC）测定。如方法中所述，从标准曲线确定每个峰下蛋白质的估计分子量。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011674.s010

（蒂夫）

确认

我们感谢康奈尔大学的蛋白质组学和代谢组学设施提供质谱数据，并感谢NIH SIG为Orbitrap Fusion质谱仪授予1S10 OD017992-01支持。

引用

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