免费医学论文发表-来自西伯利亚永久冻土的新型线虫物种与C具有隐生生存的适应性机制。秀丽隐杆线虫幼虫

抽象

自然界中的一些生物已经发展出在环境条件不利时进入称为隐生的暂停代谢状态的能力。这种状态转变需要执行遗传和生化途径的组合，使生物体能够长时间存活。最近，线虫个体在隐生后从西伯利亚永久冻土中复活。初步分析表明，这些线虫属于Panagrolaimus和Plectus属。在这里，我们提出了精确的放射性碳测年法，表明Panagrolaimus个体自更新世晚期（~46,000年）以来一直处于隐生状态。基于我们的基因组组装和详细形态学分析的系统发育推断表明，它们属于一种未描述的物种，我们将其命名为Panagrolaimus kolymaensis。比较基因组分析表明，P.科雷曼西斯和在C.秀丽隐杆线虫部分是直系同源的。我们表明，这两种物种在实验室条件下在干燥和冷冻中存活的生化机制是相似的。我们的实验证据还表明，C.秀丽隐杆线虫道尔幼虫在假死状态下可以比以前报道的时间更长。总之，我们的研究结果表明，线虫进化出的机制可能使它们在地质时间尺度上暂停生命。

作者摘要

在极端环境中长时间生存是只有少数生物才能做到的挑战。目前尚不清楚这些隐生生物利用了哪些分子和生化途径，以及它们可能暂停生命多长时间。在这里，我们展示了一种土壤线虫Panagrolaimus kolymaensis，在西伯利亚永久冻土中暂停了46,000年的生命。通过对比分析，我们发现P.科雷曼斯和模式生物C。秀丽隐杆线虫利用类似的适应机制在恶劣的环境条件下长时间生存。我们在这里的发现对于理解进化过程很重要，因为世代时间可以从几天延长到几千年，物种个体的长期生存可能导致其他灭绝谱系的重建。

数字

Fig 3Fig 4图1图2Fig 3Fig 4图1图2

引文： Shatilovich A， Gade VR， Pippel M， Hoffmeyer TT， Tchesunov AV， Stevens L， et al. （2023） 来自西伯利亚永久冻土的新型线虫物种与C共享隐生生存的适应性机制。秀丽隐杆线虫幼虫。公共科学图书馆基因19（7）： e1010798. https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010798

编辑 器： Gregory P. Copenhaver，美国北卡罗来纳大学教堂山分校

收到： 17年2023月24日;接受： 2023月 27， 2023;发表： <>月 <>， <>

版权所有： ? 2023 沙蒂洛维奇等人。这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。

数据可用性： 所有数据文件都可以在 https://doi.org/10.5281/zenodo.6590382 中找到。

资金： 这项工作得到了俄罗斯基础研究基金会（19-29-05003-mk）对AS和ER的支持。 VRG和TVK感谢大众汽车基金会（生命研究资助92847）的财政支持。PHS和TTH由DFG ENP赠款支持PHS（DFG项目434028868）。GMH由ucd ad Astra奖学金资助。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。

竞争利益： 提交人声明不存在相互竞争的利益。

介绍

来自不同分类群的生物可以在极端环境条件下生存，例如完全没有水或氧气、高温、冷冻或极端盐度。这些生物的生存策略包括一种称为假死或隐生的状态，在这种状态下，它们将新陈代谢降低到检测不到的水平[1]。长期隐生的壮观例子包括一种芽孢杆菌孢子，该孢子保存在埋在琥珀中的蜜蜂腹部25万至40万年[2]，以及在古代湖泊中发现的1000至1500年前的莲花种子，随后能够发芽[3]。缓步动物、轮虫和线虫等后生动物也以长期隐生而著称[4,5]。据报道，南极物种Plectus murrayi [6]（在-25°C冷冻的苔藓中为5.20年）和Tylenchus polyhypnus [7]（在植物标本馆标本中干燥39年）的线虫隐生记录最长。

过去十年的深入研究表明，永久冻土（常年冻结的沉积物）是独特的生态系统，可以在零下的温度下保存数千年的生命形式[8,9,10,11]。永久冻土遗骸是发现各种在隐生中长期存活的单细胞和多细胞生物的特殊来源[1,12,13]。西伯利亚永久冻土是将生物在零下温度下保存数百万年的独特储存库。过去十年的考察导致西伯利亚永久冻土层中各种分类群中的几种生物复活[14,15,16,17]。利用永久冻土作为复活多细胞动物的来源的可能性早在1936年就被认识到。一种可行的克拉多克拉甲壳类动物Chydorus sphaericus在外贝加尔永久冻土中保存了数千年[18,19]，由P. N. Kapterev发现，他在科学站Skovorodino担任古拉格囚犯。不幸的是，几十年来，这一观察一直没有引起人们的注意。我们最近复活了在西伯利亚永久冻土中保存了数千年的土壤线虫，最初的形态学观察暂时将它们描述为属于Panagrolaimus和Plectus属。先前的研究表明，几种Panagrolaimus可以以无水生物（通过干燥）和冷冻（通过冷冻）的形式进行隐生[20,21,22,23,24]。在各种线虫中，进入无水生化通常伴随着轻度干燥暴露的准备阶段，称为预处理[22,25]。这诱导转录组、蛋白质组和代谢途径的特异性重塑，从而增强生存能力[26,27,28]。一些泛农酰胺具有快速干燥的适应性机制，其中大部分细胞水分丢失，而另一些则通过抑制冰晶的生长和重结晶，在零下温度下具有耐冻性而不会损失水分[22]。

在这里，我们提出了高质量的基因组组装，详细的形态系统发育分析，并定义了一个新的物种Panagrolaimus kolymaensis。精确的放射性碳测年表明P.自更新世晚期以来，kolymaensis在隐生中保持了大约46,000年。利用模式生物C。秀丽隐杆线虫，我们证明C.秀丽隐杆线虫幼虫和Panagrolaimus kolymaensis利用类似的分子机制在极端干燥和冷冻中存活，即海藻糖生物合成和糖异生的上调。

结果

分类学

帕格罗莱莫斯科雷曼斯Shatilovich， Gade， Pippel， Hoffmeyer， Tchesunov， Stevens， Winkler， Hughes， Traikov， Hiller， Rivkina， Schiffer， Myers & Kurzchalia sp. nov.

urn：lsid：zoobank.org：act：57A9E39B-5603-46B6-A035-4B9BDBC1C441

发现地点和放射性碳测年

以前，我们已经证明，来自西伯利亚永久冻土的线虫，其形态与Panagrolaimus和Plectus属一致，可以在冻结数千年后复活。在跨越不同年龄和成因的300多个研究的永久冻土沉积物样本中，有两个发现了几个可行的线虫个体。俄罗斯普希诺土壤冷冻实验室的研究人员在北极东北部沿海地区进行的常年古生态探险中收集了样本[12]。S1文本中提供了研究地点（露头Duvanny Yar，科雷马河，图1A），取样和活化程序的详细描述。与北极东北部的其他晚更新世永久冻土层一样，Duvanny Yar由永久冻结的富含冰的淤泥沉积物组成，这些淤泥沉积物布满了大型多边形冰楔，将它们分成矿物块[29,30]（图1B）。沉积物包括沙质冲积层、泥炭透镜、埋藏的古溶胶和更新世啮齿动物洞穴（图1C）。发现Panagrolaimus线虫的洞穴（P-1320）（图1D）是从冰冻露头壁中取出的，深度在地表以下约40米，河水位以上约11米，在未受干扰和从未融化的更新世晚期永久冻土沉积物中。Citellus属北极地鼠留下的化石洞穴由入口隧道和直径达25厘米的大型筑巢室组成[29]。

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图1. 研究地点。

（A） 俄罗斯西伯利亚东北部科雷马河上杜瓦尼亚尔露头的位置。https://climate.copernicus.eu/sites/default/files/inline-images/C3S_indicator_sea_ice_sidebar_figS2_branded.png）（https://climate.copernicus.eu/data-protection-and-privacy-statement）（B）由冰楔和永久冻土粉质沉积物组成的露头上部视图。（C）矿床的岩石学方案，显示所研究的啮齿动物借用位置（红色圆圈）。（四）化石啮齿动物洞穴，多年冻土沉积物中埋有草本凋落物和种子;m a.r.l. = 河面以上米。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010798.g001

多年冻土取样的不育性和栽培生物群的年龄已在几篇综述中详细讨论[9,31,32]。根据以前的报告，在洞穴中发现的生物的年龄等于冻结时间，对应于同步沉积物中保存的有机物的年龄。这使得使用有机物的放射性碳测年法来确定生物体的年龄成为可能。我们对从研究借用P-1320获得的植物材料进行了加速器质谱（AMS）放射性碳分析，并确定了直接14C 年龄 44,315±405 BP（地理研究所，RAS;样本 IGAN艾姆斯9137）. 校准年龄范围为 45,839–47,769 cal BP（95.4% 概率）（S1 图）。

像其他单性生殖的Panagrolaimus一样，新发现的物种是三倍体

复活的动物在实验室中培养了100多代，最初根据形态学被描述为Panagrolaimus aff. detritophagus [33]。我们对复活的动物进行了详细的形态学分析（图2和S2，以及S1文本和框1中的表A），明确确认该动物属于Panagrolaimus属，与之前对18S核糖体RNA序列的系统发育分析一致[33]。然而，由于Panagrolaimus的形态均匀性，即使对于线虫也不常见，单个核糖体RNA序列的形态学和分子分析不足以描述物种。我们发现该物种是孤雌生殖的，这进一步使大多数物种概念下的描述复杂化。由于这些限制，我们决定参考系统发育物种概念，使用基于多个基因的系统发育树作为标记。

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图2. P的一般形态学。科雷曼斯，雌性。

全息图的扫描电子图片（A，C），光学显微镜照片（E，F）和图形呈现（B，D，G）：A，B）整个身体，C，D）前端，E）前体，F）外阴周围身体区域，G）尾巴。缩写：l.f.-侧野，卵-卵巢，咽前体，咽部结核-末端球，u-子宫与卵，V-外阴，VP-腹孔。比例尺：A、D、E、F、G– 20 μm、B– 100 μm、C– 2 μm。

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方框1.P的描述。科雷曼斯

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为了获得用于系统发育物种测定的全面分子数据，我们使用PacBio HiFi测序生成了长读长（84X覆盖率，平均长度14,425 bp）的基因组组装。我们对重复和基因含量的分析在S1文本的表C中描述。K-mer对读数的分析清楚地表明，这种动物具有三倍体基因组（图3A），就像其他孤雌生殖Panagrolaimus物种一样[34]。尽管三倍体基因组对组装提出了挑战，但我们获得了三个假单倍型的高度连续的重叠群组装，这些假单倍型包含近266 Mb，因此具有与其他孤雌生殖Panagrolaimus物种相似的基因组大小[34]。所有三种假单倍型的重叠群N50值为3.8 Mb。由于这些假单倍型表现出明显的差异程度，我们通过在基因预测中使用明显的同源物来进一步研究它们的关系，以对齐基于微共性的最长连续重叠群（图3B）。重叠群之间的联系清楚地显示了基因组的三倍体状态。

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图3. 基因组组装和系统发育组学揭示了新发现的P.科雷曼斯属物种是三倍体。

A） P的克默光谱。科雷曼斯PacBio HiFi数据。使用水母计算长度为19的公里。B）显示P三倍体结构的马戏团图。科雷曼斯基因组。线表示八个重叠群中 6,715 个同源物的位置，这些重叠群构成组件的 39.9 Mb （15%）。通过使用OrthoFinder将蛋白质编码基因聚类到正系组中并选择包含三个序列的组来鉴定同源物。显示重叠群 ID 和比例。C）所有分类群的推断物种树。显示使用具有自举支持值的串联超矩阵（18S 和 28S 基因）推断的最大似然树。所有属都表示为单系分支。P. kolymaensis以红色突出显示，并且基底到所有其他Panagrolaimus分类群。内部节点，其中所有后续分支表示相同的序列，以黑色星号显示。D） P.科雷曼西斯拥有C。秀丽隐杆线虫基因直系同源物为 TCA 循环、乙醛酸分流、糖酵解、糖异生、海藻糖合成和多胺合成所需的酶。黑色填充圆圈：正交群聚类、系统发育分析和域结构所提示的直系同源物存在。白色填充圆圈：通过当前分析未找到正交同源物。彩色填充圆圈：P的存在。Kolymaensis基因，与几个C有关。秀丽隐杆线虫基因（所有相同颜色的基因）都与该基因（那些基因）同源。标签：秀丽隐杆线虫酶名称和根据我们的正统群聚类包含该基因的正统群。

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应用系统发育概念来定义P。科雷曼斯

为了将该物种归入Panagrolaimus属，我们使用最大似然法进行了更广泛的多基因系统发育分析。我们对60个基因的串联，分区比对的分析，以及使用更广泛的12,295个基因树的基于合并的方法，将复活的动物作为所有其他测序的Panagrolaimus物种的姐妹，但作为Propanagrolaimus的内群[35]（图3C，S3B和S3C）。因此，系统发育位置提供了强有力的证据，证明这种动物代表了一种新的物种。此外，这个新物种与Panagrolaimus sp. PS1159和Panagrolaimus sp. ES5之间存在很大的序列差异，在我们的级联比对中，估计每个位点平均有2.06和2.11个氨基酸取代。这种巨大的差异与先前关于Panagrolaimus线虫年龄的数据一致[34]，更广泛地见于线虫，线虫可能具有高度多样性[36,37]。我们的数据也与Panagrolaimus属中所有孤雌生殖菌株都具有单系起源的假设相矛盾[34]（图3C）。使用在GRAMPA（用于多倍体分析的MUL（Multi labelled）树的基因树调控算法）中实施的基因树协调方法，我们探索了我们在孤雌生殖物种中发现的额外蛋白质集是自体多倍体还是异体多倍体的结果。在包含单性生殖和有性物种的谱系之外发现额外的蛋白质基础分支，表明这些额外基因拷贝的异体多倍体起源（S6图）。

根据出土动物的科雷马河位置，我们提出了以下分类学分类和物种名称：

线虫门，1932年

英格利斯1983级

亚目泰伦奇纳·索恩，1949年

索恩家族，1937年

帕格罗莱莫斯科雷曼斯

秀丽隐杆线虫幼虫和P.Kolymaensis可能利用部分相似的机制进入并保持长时间的隐生状态

在P中缺乏既定的遗传方法的情况下。Kolymaensis，我们参考了模型C。秀丽隐杆线虫作为对照系统，以深入了解长期生存的可能途径[25,27,28,33]。P.kolymaensis允许我们将其用于隐生的分子工具包与C进行比较。秀丽隐杆线虫。我们利用直立聚类和系统发育学来研究P.Kolymaensis含有先前与C隐生有关的基因。秀丽隐杆线虫幼虫。我们的分析表明，与其他Panagrolaimus物种一样[38,39]，P.kolymaensis还将直系同源物编码为C。秀丽隐杆线虫海藻糖磷酸合酶基因（TPS-2）和海藻糖磷酸酶基因（gob-1）（图3D和S1正交分析）。此外，我们还发现了所有C的直系同源物。秀丽隐杆线虫酶需要多胺生物合成、TCA循环、糖酵解、糖异生和乙醛酸分流（图3D和S1正交分析）提示P.kolymaensis可能部分利用与C相似的分子机制。秀丽隐杆线虫促进不利条件下的生存。

我们早期的发现证实，在C的几个发育阶段中。秀丽隐杆线虫，只有道尔幼虫，在不利条件下（如营养物质低和种群密度高）形成，可以在无水生物和暴露于冷冻中存活[25,33]。与C的其他幼虫阶段相比，dauer幼虫处于低代谢状态，具有明显的代谢特性，例如氧气消耗减少和散热。秀丽隐杆线虫。为了在极端干燥的情况下生存，C.秀丽隐杆线虫幼虫（低代谢状态）需要首先在高相对湿度（98%RH）下预处理4日[25]。在预处理期间，dauer幼虫上调海藻糖生物合成，确保其在剧烈干燥下存活[25,28]。我们测试了P.Kolymaensis也通过预处理促进。由于Panagrolaimus生命周期中没有dauer阶段，我们对所有幼虫阶段和成虫的种群进行了实验。虽然P的一小部分。kolymaensis个体在没有预处理的情况下在苛刻的干燥和冷冻中存活下来（图4A），所有幼虫阶段和P的成虫的混合物。Kolymaensis的存活率显着更高（p值<0.0001），与预处理时的剧烈干燥成正比（图4A）。同样，预处理和干燥进一步提高了P的存活率。科雷曼斯冷冻（-80°C）（图4A）。像C.秀丽隐杆线虫幼虫，P.kolymaensis在预处理后将海藻糖水平上调至20倍（图4B）。我们之前报道过，为了在预处理时上调海藻糖水平，C。秀丽隐杆线虫道尔幼虫通过激活乙醛酸分流和糖异生途径来消耗其脂肪储备（三酰基甘油）[28]经过预处理，我们发现P中的甘油三酯（TAG）水平显着降低。kolymaensis（S5A和S5B图）。为了进一步研究源自TAG降解的乙酰辅酶A是否最终导致海藻糖，我们应用了先前开发的代谢标记方法14C-acetate in combination with 2D-TLC [1,33]. The 14由蠕虫代谢的C-乙酸盐被掺入TAG中。在TAG降解后，14释放C-乙酰辅酶A，作为海藻糖生物合成的前体。如图4C所示，预处理导致海藻糖中放射性的大幅增加和某些氨基酸（甘氨酸/丝氨酸，苯丙氨酸;图C和D）的小幅增加。有趣的是，P.kolymaensis显示出一个额外的斑点（图4D，枚举为7），这在C中没有发现。秀丽隐杆线虫。我们使用质谱法根据分子的碎裂模式将这个斑点确定为海藻糖-6-磷酸（S5C-S5H图），海藻糖的前体。因此，为了抵抗苛刻的干燥，如C。秀丽隐杆线虫幼虫，P.Kolymaensis可能利用乙醛酸分流和由此衍生的TAGs的乙酸盐来合成海藻糖。检测直接前体（海藻糖-6-磷酸）表明，P的代谢物通量很强。科雷曼西斯。最后，我们调查了C.秀丽隐杆线虫幼虫也可以在长时间的隐生状态下存活。尽管进行了预处理，但干燥的dauer幼虫在室温下的存活能力下降非常迅速，大多数幼虫在近10天后死亡（图4E）（S4A和S4B图）。在-80°C下直接冷冻，没有任何冷冻保护剂会导致动物立即死亡。为了测试结合这些条件是否可以延长dauer幼虫的生存能力（S4A和S4B图），我们将干燥的幼虫转移到-80°C。 值得注意的是，在这些条件下，即使在480天后，存活率也没有显着下降（图4E）。此外，解冻后，动物恢复生殖生长，并产生与控制条件下的动物一样数量的后代（图4F）。由于我们在任何时间点都没有观察到存活率有任何降低，这表明无水生物和冷冻的结合可以延长dauer幼虫的存活能力。因此，C.秀丽隐杆线虫幼虫，当暴露于隐生状态的组合时，可以存活极长时间。

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图4. 秀丽隐杆线虫幼虫和P.Kolymaensis可能利用类似的机制在隐生中存活。

A） P的存活率。线虫干燥和冷冻（-80°C）。误差条表示两个独立实验的平均值标准误差，其中两个技术重复在两个不同的日期进行。使用非配对t检验和韦尔奇校正进行统计比较。N.S. P > 0.05， ****p < 0.0001。对于干燥（非预条件）n = 289，冷冻（非预条件）n = 675，干燥（预处理在98%RH）n = 953和冷冻（预条件为98%RH）n = 1295。B） P.Kolymaensis 线虫和 daf-2（e1370） dauer 幼虫在 98%RH 预处理后上调海藻糖水平。误差条表示两个独立实验的平均值标准误差，在两个不同的日期进行三次重复。使用双向方差分析与Holm-Sidak多重比较检验进行统计比较，****p < 0.0001。C-D）二维薄层色谱14C-乙酸盐标记的代谢物来自P。非预处理和预处理为 98%RH 的 kolymaensis。列举的斑点表示海藻糖（1），葡萄糖（2），谷氨酸（3），谷氨酰胺（4），丝氨酸/甘氨酸（5）和苯丙氨酸（6）。来自在两个不同日期进行的至少两个独立实验的代表性图像。E） 干燥的 daf-2 （e1370） dauer 幼虫在冷冻 （-80°C） 下存活极长时间。误差条表示两个独立实验的平均值标准误差，其中两个技术重复在两个不同的日期进行。F）暴露于冷冻的干燥dauer幼虫的育雏大小与未干燥的dauer幼虫相同。平均育雏大小是每种情况下七个dauer幼虫的平均值。使用非参数柯尔莫哥罗夫-斯米尔诺夫检验n.s p>0.05进行统计比较。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010798.g004

讨论

来自永久冻土的新线虫物种现在可以归入Panagrolaimus属[40]，该属包含几种描述的孤雌生殖和淋病物种[34,41]。许多Panagrolaimus表现出对恶劣环境中生存的适应[22]，该属包括南极物种P。戴维迪[23]。Panagrolaimus属的形态均匀性非常出色，即使在难以根据一般形态进行分类的线虫物种中也是如此。因此，通过显微镜（包括SEM）分析指定物种是不可靠的，由于孤雌生殖物种中没有雄性，这进一步复杂化。雄性具有重要的诊断特征，如针状体和泄殖腔周围，雌性主要通过形态计量学从一个物种到另一个物种的差异，其中种间差异（绝对测量和比率）可能很微妙。我们的标本基于双性恋物种Panagrolaimus detritophagus的绝对大小和与雌性的比例相似[42]。唯一不重叠的形态测量特征是索引“b”（体长：咽长）：5.6-6.8英寸。Kolymaensis与P的4.4-5.1。三叉戟。

因此，我们转向系统发育物种概念下的系统发育方法，将物种放在树上。这表明该物种是其他已知Panagrolaimus物种的外群，与先前的发现相比，增加了该属孤雌生殖第二次独立进化的可能性[34,35,41]。或者，单性生殖Panagrolaimus的杂交起源可能会影响菌株的系统发育定位，从而增加了新物种是其他孤雌生殖菌株的真正姐妹的可能性。为了进一步完全解决系统发育定位问题，需要对Panagrolaimus物种进行广泛的采样和基因组测序。我们找到了P。Kolymaensis是三倍体，因此可能是杂交起源，如其他孤雌生殖Pangrolaimus所示[34]。

P的高度连续基因组。Kolymaensis将允许与目前正在基因组测序的其他Panagrolaimus物种相比分析这一特征。我们的研究结果为C之间分子和生化机制的同源性提供了更深入的见解。秀丽隐杆线虫和P.Kolymaensis，不仅在分类学上而且在生态上都是独特的。秀丽隐杆线虫主要存在于温带地区腐烂的水果和植物中[43,44]，而Panagrolaimus物种分布全球，普遍存在于落叶和土壤中[41]，包括在恶劣的环境中[22]。

我们通过正交学分析表明，C使用的分子途径得到了充分研究。秀丽隐杆线虫幼虫进入道尔状态，如胰岛素[45,46]（DAF-11，DAF-2和DAF-16），TGF-β[47]（DAF-7），类固醇[48]（DAF-9，DAF-12）都存在于P的基因组中。科雷曼斯（S4C图）。两个物种中同源基因的存在并不一定证明它们在两个物种中的功能。因此，需要进一步的功能分析来详细研究分子途径。海藻糖积累（图4B）和三酰基甘油的消耗（S5A和S5B图）确保了海藻糖生物合成途径的功能和P干燥过程中乙醛酸分流的利用。科雷曼西斯。没有酶TPS-2和乙醛酸分流的活性，在线虫中合成海藻糖是不可行的。我们不排除其他可能有助于P干燥生存能力的生化特征的可能性。Kolymaensis，但关于海藻糖生物合成和乙醛酸分流，我们的数据表明分子工具包是部分直系同源的。在我们未来的研究中，我们打算进行基于RNAi的实验来推断具体的机制。我们的研究结果暗示了组织dauer形成和隐生的分子机制的收敛或平行性。

如上所述，预处理可增强P的存活率。Kolymaensis通过使它们具有干燥耐受性。我们之前报道过预处理可促进C中的海藻糖生物合成。秀丽隐杆线虫幼虫和升高的海藻糖通过保护细胞膜来提供干燥耐受性[25]。毫不奇怪，P.Kolymaensis上调海藻糖，但海藻糖升高的程度高于C。秀丽隐杆线虫幼虫。这表明海藻糖上调的中枢调节因子（DAF-16，DAF-12）可能差异调节P中的tps-2。科雷曼斯[38,49,50]。虽然P.Kolymaensis利用乙醛酸分流和糖异生来上调海藻糖水平，有趣的是观察到它们积累了大量高水平的海藻糖-6-磷酸。使用RNAi或基于抑制剂的实验对这一观察结果的进一步研究将为P代谢调节的分子机制提供见解。预处理后的科雷曼斯。我们的研究结果首次证明了C.秀丽隐杆线虫幼虫具有在经历无水生物的情况下长时间冷冻生存的固有能力。人们很容易推测，经历无水生物可能是C的生存策略。秀丽隐杆线虫在自然界的季节性变化中生存。

总之，我们的研究结果表明，通过在永久冻土等环境中适应隐生状态的短时间生存，一些线虫物种获得了单个蠕虫在地质时间范围内保持状态的潜力。这就提出了一个问题，即个体可以保持隐生状态的时间长度是否有上限。长时间跨度可能仅受到环境剧烈变化的限制，例如环境温度的强烈波动、天然放射性或其他非生物因素。这些发现对我们理解进化过程具有重要意义，因为世代时间可能从几天延长到数千年，物种个体的长期生存可能导致其他灭绝谱系的重建。这在孤雌生殖物种的情况下尤其有趣，因为每个个体都可以找到一个新的种群，而不需要寻找配偶，即逃避性行为的成本。最后，了解长期隐生的精确机制和导致成功复活的线索可以为长期储存细胞和组织提供新方法。

方法

命名法

本条的电子版符合经修订的《国际动物命名规则》的要求，因此，本文所载新名称可从该守则的电子版中获得。该已发表的作品及其包含的命名行为已在ICZN的在线注册系统ZooBank中注册。通过将LSID附加到前缀“http://zoobank.org/”，可以通过任何标准Web浏览器解析ZooBank LSID（生命科学标识符）并查看相关信息。本出版物的LSID是：urn：lsid：zoobank.org：pub：150A5436-941D-4244-8884-89E39070BFE5。这项工作的电子版发表在ISSN的期刊上，并已存档，可从以下数字存储库获得：LOCKSS。

材料和C.秀丽隐杆线虫菌株

[1-14C]-乙酸盐（钠盐）购自哈特曼分析公司（德国布伦瑞克）。所有其他化学品均从Sigma-Aldrich（德国陶夫基兴）购买。由NIH研究基础设施计划办公室（P40 OD010440）资助的Caenorhabditis遗传中心（CGC）提供了daf-2（e1370）和E。大肠杆菌NA22菌株。

从P中分离基因组DNA。科雷曼斯线虫

分离后（S1文本），以确保我们的应变P。kolymaensis（Pn2-1）可以适应不同的实验室，我们培养了好几代。该菌株在基因组DNA分离期间培养了几代，并在进行基因组DNA分离后被冷冻。P. kolymaensis 线虫（异雌菌株 Pn2-1）生长在接种有 E 的 NGM 琼脂的几个平板上。22°C的大肠杆菌NA20细菌。 从平板中收集蠕虫，用水以1000g离心至少三至五次，以除去任何残留的细菌和任何碎屑。将蠕虫沉淀溶解在5体积的蠕虫裂解缓冲液（0.1M Tris-HCl pH = 8.5,0.1M NaCl，50mM EDTA pH = 8.0）中，并分布在1.5ml微量离心管中。将这些管在-80°C下孵育20分钟。向每个试管中加入100μl蛋白酶“K”（20mg / ml），并在60°C下孵育过夜。将625μl冷GTC缓冲液（4M硫辛酸胍，25mM柠檬酸钠，0.5%（v \v）N-月桂酰肌氨酸，7%（v / v）β巯基乙醇）加入试管中，在冰上孵育30分钟，每10分钟倒置一次混合。 将1体积的苯酚-氯仿-异戊醇（pH = 8）加入裂解物中，并通过倒置管混合10-15次。将试管在5°C下以10,000g离心4分钟以分离相。将上层水相小心地收集到新管中。加入一体积的新鲜氯仿，将试管倒置10-15次混合，并在5°C下以10,000g离心4分钟以分离相。加入一体积冷的5M NaCl，通过倒置试管混合并在冰上孵育15分钟。孵育后，将这些管在15°C下以12,000–16,000g离心4分钟。 将含有核酸的上清液缓慢转移到新管中。将一体积的异丙醇加入试管中，倒置几次，并在冰上孵育30分钟。孵育后，将管在3000°C下以30g离心45-25分钟，并在不干扰沉淀的情况下弃去上清液。将沉淀用1ml 70%乙醇洗涤两次，将试管以3000g离心5分钟，弃去上清液并在37°C下孵育10-15分钟以干燥沉淀。将沉淀小心地重悬于TE缓冲液中。用脉冲场凝胶电泳分析基因组DNA的质量。

基因组测序和组装

长插入文库是按照Pacific Biosciences的建议根据“程序和清单-使用SMRTbellExpress模板制备试剂盒2.0制备gDNA文库”协议制备的。总之，RNAse处理的HMW gDNA在MegaRuptordevice（Diagenode）上剪切成20 kb片段，并使用10 μg剪切的gDNA进行文库制备。PacBio SMRTbell 文库的大小选择为两个馏分（9-13kb，> 13kb），使用暗盒定义为0.75%DF MarkerS1 3-10 kb的暗盒器件 提高回收率。所选大小库的第二部分在Sequel SMRT单元（95M）上的板上加载了8 pM。续集聚合酶 2.0 与 v2 PacBio 测序引物和续集测序试剂盒 2.0EA 结合使用，运行时间为 30 小时。我们使用PacBio的ccs命令行工具（版本4.2.0）从subreads.bam文件中创建了PacBio CCS读取，输出8.5Gb的高质量CCS读取（HiFi读取N50为14.4 kb）。HiCanu（版本2.2）[51]用于创建重叠群程序集。Blobtools [52]（版本1.1.1）用于识别和去除细菌重叠群。最终的三倍体重叠群组件由856个重叠群组成，N50为3.82 Mb，大小为266Mb。线粒体基因组是使用mitoHifi管道（版本2，https://github.com/marcelauliano/MitoHiFi 基于组装的重叠群和密切相关的Panagrellus redivivus的参考线粒体基因组（菌株：PS2298 / MT8872，ENAaccession：AP017464）创建的。mitoHifi管道确定了49个线粒体重叠群，范围从13-32Kb。最终注释的环状线粒体基因组的长度为17467 bp。

鉴定P中的假单倍型。Kolymaensis基因组组装，我们在组装和C中选择了每个预测蛋白质编码基因的最长亚型。秀丽隐杆线虫基因组（从WormBase Parasite下载，发布WBPS15）使用AGAT（版本0.4.0），并使用OrthoFinder（版本2.5.2）将它们聚类到直系同源组（OG）中。我们鉴定了包含三个Panagrolaimus序列的OG（即在所有三个假单倍型中以单拷贝形式存在的组），并使用这些来鉴定来自三个假单倍型的多兆碱基大小重叠群的三个。使用Circos可视化三个伪单倍型之间的同源性，以绘制每个同源物的位置（版本0.69-8）。

基因组注释

RepeatModeler 1.0.8（http://www.repeatmasker.org/）与参数'-engine ncbi'一起使用，以创建一个重复家族库，该库与RepeatMasker 4.0.9一起使用，以软掩蔽Panagrolaimus基因组。为了注释基因，我们从现有的Panagrolaimus交叉映射蛋白质模型，作为基于Augustus的管道中的外部证据。我们的预测的完整性是在gVolante Web界面上使用BSCO进行评估的。

正交分析

我们使用来自P的基因组数据进行了基因正统学分析。kolymaensis，来自永久冻土的Plectid线虫物种，以及来自WormBase寄生虫的基因组数据（https://parasite.wormbase.org;访问17/12/2020）：秀丽隐杆线虫，双倍体角虫，双倍体，墨菲斯嗜血虫，帕纳格雷鲁斯，帕纳格雷鲁斯，帕纳格莱莫斯大卫，帕纳格罗莱莫斯属ES5，帕纳格罗莱姆斯属PS1159，帕纳格罗莱莫斯 超级巴士，Plectus sambesii和Propanagrolaimus sp. JU765。对于蝴蝶来说，基因组资源是稀缺的。因此，我们添加了Plectus murrayi，Anaplectus granulosus，Neocamacolaimus parasiticus和Stephanolaimus elegans的转录组数据，后三个转录组由Oleksandr Holovachov博士（瑞典自然历史博物馆）友好提供。 细粒蚴和新蝴蝶的转录组已经发表，现成[53,54]。所有三个转录组都是与三位一体一起重新组装的[55]。确切的程序在相应的出版物中描述[53,54]。Stephanolaimus elegans转录组使用与Neocamacolaimus parasiticus相同的方法组装。

Plectus murrayi转录组由存放在NCBI（https://sra-downloadb.be-md.ncbi.nlm.nih.gov/sos2/sra-pub-run-13/SRR6827978/SRR6827978.1;22年12月2020日访问）的原始读数构建而成，并使用Galaxy Trinity版本2.9.1组装[55,56]。使用了所有默认选项，包括在组装前对读取进行计算机归一化。Transdecoder（conda版本5.5.0）[57]用于翻译成氨基酸序列。使用cd-hit版本4.8.1删除了相同的读取[58,59]，使用Trinity get_longest_isoform_seq_per_trinity_gene.pl命令[57]（Trinity conda版本2.8.5;蟒蛇软件发行版，康达，版本 4.9.2，蟒蛇，2020 年 10 月）。使用AGAT（Dainat，https://www.doi.org/5281.3552717/zenodo.3）分别使用“agat_convert_sp_gxf2gxf.pl”，“agat_sp_keep_longest_isoform.pl”和“agat_sp_extract_sequences.pl”脚本从基因组组装FASTA文件和基因组注释GFF2文件中提取最长亚型的氨基酸翻译。所有FASTA标头都经过修改，以便在后续分析中对每个序列进行简单的物种分配。使用默认设置使用 OrthoFinder v. 5.1.60 [61,7] 进行正交分析。对于感兴趣的基因，我们使用局部对和maxiterate（475）函数构建了与MAFFT v. 62.1000 [1]的比对。使用Trimal v. 4.22.rev63 [1]去除了未对齐良好的虚假序列和区域（每个系统发育下方的S2正交分析中所述的程序）。然后，我们使用Iqtree2 v. 0.6.64 [1000]进行系统发育分析，使用-bb 1选项，测试每次分析的模型（最终使用的模型在S5正交分析中说明）。使用Interproscan v. 50.84–0.65探索PFAM结构域[3]。使用树状镜7.6.66[<>]可视化系统发育，并使用Inkscape（https://inkscape.org）创建图形。我们的大部分分析都是在科隆大学区域计算中心（RRZK）的HPC RRZK CHEOPS上进行的。

系统发育组学

来自Propanagrolaimus，Panagrolaimus，Panagrellus和Halicephalobus属的18个分类群的28S和44S基因序列（均在S1文本中列出）对齐（MAFFT L-INS-I v7.475）[62]，连接[67]并用于使用最大似然通过（IQTREE）[68]推断物种树，并通过两者序列进化的最佳拟合模型进行划分[69].使用1000个自举假重复确定节点支持。来自60个分类群的另外101个基因（全部列在S1文本中）使用上述超矩阵连接方法确认分类位置。鉴于差异基因采样的局限性，我们扩展了系统发育分析，包括使用12,295 ML基因树推断出含有目标动物的直系群的聚结方法。将每组每个物种的多个基因实例作为副同源物/直系同源物进行处理，并使用ASTRAL-Pro进行分析[70]。考虑到每个直系群的基因拷贝数，我们探索了使用GRAMPA中实施的基因树协调方法（用于多倍体分析的基因树与MUL（Multi labelled）树的基因树调控算法）中观察到的额外基因的来源[71]。所有根植于中点的基因树和最终的ASTRAL-pro物种树都被用作输入，并进一步分析了最简洁的结果。

干燥生存测定

秀丽隐杆线虫幼虫干燥测定如[25]所述进行。与[25]中所述，线虫的混合种群（所有幼虫阶段和成虫的混合物）进行了类似的干燥测定。

线虫暴露在极端环境中

秀丽隐杆线虫幼虫或混合种群（所有幼虫阶段和成虫的混合物）的P。如[28]所述对Kolymaensis线虫进行预处理和干燥，然后转移到34°C的高温，冷冻（-80°C）和缺氧。通过将氮气冲洗到干燥室中，在60%RH的干燥室中产生缺氧环境。监测腔室内的氧气浓度。在每个时间点之后，用500μl水再水化2-3小时。将再水化的蠕虫转移到带有E的NGM琼脂平板上。大肠杆菌NA22作为食物。在15°C孵育过夜后计数幸存者。 每个实验在两个不同的日子进行，至少有两个技术重复。

线虫裂解物中的海藻糖定量

海藻糖测量如先前报告所述[27]。

放射性标记、代谢物提取和 2D-TLC

上述操作是根据先前的报告进行的[27,28]。

从TLC板中鉴定海藻糖-6-磷酸

采用高效薄层色谱（HPTLC）分离来自非预处理和预处理样品的归一化水级分，首先以1-丙醇-甲醇-氨（32%）-水（28：8：7：7 v/v/v/v）为第一，干燥15 min和1-丁醇-丙酮-冰醋酸-水（35：35：7：23 v/v/v/v）第二维。使用海藻糖作为TLC两个维度的标准，感兴趣的区域从TLC中剔除。刮出的二氧化硅用10ml 50%甲醇萃取两次。将馏分合并，真空干燥并溶解在含有100：4：2（异丙醇：甲醇：氯仿）和1.7mM甲酸铵的5μlMS混合溶液中。质谱分析是在配备机器人纳流离子源TriVersa NanoMate（Advion BioSciences，伊萨卡，美国）的Q Exactive仪器（Thermo Fischer Scientific，不来梅，DE）上进行的，使用直径为4.1μm的纳米电喷雾芯片。离子源由Chipsost 8.3.1 sostware（Advion BioSciences）控制。负模式下电离电压为+ 0.96 kV;背压设定为 1.25 psi。离子转移毛细管的温度为200°C;S镜头射频电平设置为50%。在R m/z 50 = 750的质量分辨率下，在m / z 200–140000范围内获得FT MS谱图;自动增益控制 （AGC） 3×106最大进样时间为3000 ms，在R m/z 50 = 750的质量分辨率下，在m / z 200–140000范围内获得ft MS / MS谱图;自动增益控制 （AGC） 3×104最大注射时间为30秒。

从P.裂解物

将非预处理和预处理沉淀在200μl异丙醇中与0.5mm锆珠裂解两次15分钟。将裂解物以1300g离心5分钟。仔细收集上清液，无任何碎片，使用20μl裂解物进行蛋白质估计。根据可溶性蛋白质水平进行归一化，在干燥器中干燥对应于50-100μg蛋白质的上清液体积。将700μlIS（（10：3（甲基叔丁基醚：乙醇））混合物（加热至室温）加入干燥样品中，并在摇床上放置1小时。将样品在1400rpm和4°C下离心，加入140μl水并在摇床上放置15分钟。将这些样品以13400rpm离心15分钟。收集上部有机级分并转移到1.5ml玻璃小瓶中，并在干燥器中干燥。将干燥的样品复溶在300μl的4：2：1（异丙醇：甲醇：氯仿）的体积中。注射用相当于1μg的体积。

LC-MS/MS分析在与Xevo G1200-S QTof（沃特世）偶联的高效液相色谱系统（Agilent 2 HPLC）上进行。样品在反相C18色谱柱（来自沃特世的Cortecs C18 2.7um）上分离，溶液用量为50：50：0.1：1%（水：甲醇：甲酸：1MAmm甲酸酯）和25：85：0.1：1%（乙腈：异丙醇：甲酸：1M甲酸铵）作为流动相。使用以下梯度程序：洗脱液B在0分钟内从100%到12%;100%从12分钟到17分钟;0%从17分钟到25分钟。流速设定为0.3毫升/分钟。根据总蛋白质浓度和蠕虫数对样品进行归一化。TAG 50：00：00 用作内标。Skyline软件（https://skyline.ms/project/home/software/Skyline/begin.view）用于分析原始数据。TAGs是从脂质图谱（https://www.lipidmaps.org/）数据库中提取的。

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放射性碳（14C） 日期。

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S1 图 放射性碳（14C） 日期。

从埋地借用P-44收集的植物材料的放射性碳年代（315,405±45 BP）和校准年龄（839,47-769,1320 cal BP）。使用IntCal4校准曲线，使用OxCal V.4.20程序将放射性碳年龄转换为日历年龄当量。粉红色阴影区域 - 具有标准偏差的放射性碳日期;灰色阴影区域—校准曲线上的放射性碳日期投影，概率为 95.4%。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010798.s001

（英文）

S2 图 P.科雷曼斯雌性。

全模（A，B）和SEM图片（C-I）的图形呈现：a）前体，B）女性生殖分支，C-E）三个不同女性标本的前端，F）侧脊的前部，G）外阴，H）腹侧排泄/分泌孔，I）后体与肛门和侧脊。比例尺：a，b—50 μm、c，i—3 μm、d—2 μm、e –1 μm、f，h—5 μm、g—10 μm。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010798.s002

（英文）

S3 图 使用串联和合并方法推断基因集的系统发育。

A） 使用污迹图v0.2.1分析倍性水平73.KMC 版本 3.1.074用于计算PacBio CCS读数中的21-mers。然后我们运行了污迹图。py 以确定覆盖率下限和上限截止值。这些被确定为14和380。用kmc_tools过滤覆盖率在21至14之间的380-mers。然后，我们通过运行污迹图从过滤后的 21 个默斯计算 k-mer 对。派·赫特克默斯。最后，生成的污迹图显示估计倍性为3。B）使用合并法推断出12,295棵基因树的物种树。显示了使用正统基因树合并方法实现的物种树。本研究中的新物种以红色显示。所有节点的后验概率均为 1。C）推断为102个分类群的物种树。显示使用 60 个基因的串联超矩阵推断的最大似然树。引导值仅针对支持率低于 100% 的节点显示。鸭嘴虫Macrostum lignano是生根的外群。祖先Panagrolaimus是Panagrolaimus属中所有其他物种的姐妹，以红色突出显示。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010798.s003

（英文）

S4 图 隐生状态的组合可提高C的存活率。秀丽隐杆线虫幼虫。

A）干燥的dauer幼虫表现出对热应激（34°C）的存活率提高。误差线表示两个具有两个技术重复的独立实验的标准偏差。B）干燥的道尔幼虫显示可提高缺氧的存活率。误差线表示两个具有两个技术重复的独立实验的标准偏差。采用配对双尾t检验进行统计比较。*p<0.05.C） P.kolymaensis具有与C中dauer形成和代谢有关的大多数基因的基因直系同源物。秀丽隐杆线虫。黑色填充圆圈：正交群聚类、系统发育分析和域结构所提示的直系同源物存在。白色填充圆圈：通过当前分析未发现正交同源物（在所有情况下，这些 C.秀丽隐杆线虫基因在直系群聚类中没有与任何Panagrolaimus基因聚集）。标签：秀丽隐杆线虫酶名称和根据我们的正统群聚类包含该基因的正统群。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010798.s004

（英文）

S5 图 P. kolymaensis降低三酰基甘油（TAGs）水平，并在6%RH预处理后积累海藻糖-98-磷酸。

A） 非预处理 （1） 和预处理 （1） P 的乙酸盐标记有机馏分的一维薄层色谱。科雷曼西斯。B） 非预处理 （2） 和预处理 （1） P 的 TAG 水平的质谱定量。科雷曼西斯。误差线表示两个生物学重复与两个技术重复的标准偏差。使用韦尔奇校正**p<2.0的非配对t检验进行统计分析。C-D）空区域的非预处理和预条件质谱，e-f）斑点001（海藻糖），G-H）斑点1（海藻糖-7-磷酸）从6D-TLC中刮出并提取。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010798.s005

（英文）

S6 图 探索额外蛋白质的可能同种异体多倍体起源。

基因树调控用于确定跨正系群的额外蛋白质集是否起源于自多倍体或异体多倍体。蛋白质的不同拷贝（由“+”和“*”表示）表明异体多倍体起源。孤雌生殖物种以粗体突出显示。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010798.s006

（英文）

S1 文本。 补充信息和方法。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010798.s007

（英文）

S1 数据。 干燥的dauer幼虫表现出对热应激（34°C）的存活率提高。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010798.s008

（三十）

S2 数据。 干燥的dauer幼虫显示可提高缺氧的存活率。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010798.s009

（三十）

S3 数据。 非预处理 （1） 和预处理 （2） P 的 TAG 水平的质谱定量。科雷曼西斯。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010798.s010

（三十）

S4 数据。 P.线虫干燥和冷冻（-80°C）。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010798.s011

（三十）

S5 数据。 线虫和daf-2（e1370）道尔幼虫在预处理98%RH时上调海藻糖水平。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010798.s012

（三十）

S6 数据。 干燥的daf-2（e1370）dauer幼虫在冷冻（-80°C）下存活极长时间。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010798.s013

（三十）

S7 数据。 暴露于冷冻的干燥道尔幼虫的育雏大小与未干燥的道尔幼虫相同。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010798.s014

（三十）

S1 正交分析。 补充文件正交分析。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010798.s015

（英文）

确认

VG感谢大众汽车赠款和Kurzchalia实验室成员Andrej Shevchenko的有益讨论以及MPI-CBG核心设施的帮助。我们感谢S. Gubin博士的实地研究和采样，感谢我们在土壤冷冻实验室，普希诺和萨哈共和国切尔斯基（雅库特）东北科学站的同事的帮助与合作。作者感谢德累斯顿概念基因组中心，DFG NGS能力中心，分子和细胞生物工程中心（CMCB），德累斯顿工业大学和MPI-CBG的Long Read团队。我们感谢 https://www.copernicus.eu/en 图1A中的底图。作者感谢理查德·罗伊和延斯·巴斯特批判性地阅读手稿。我们感谢Iain Pattern对撰写手稿的建议。

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