免费医学论文发表-体外多发性骨髓瘤模型中代谢网络的数学重建
抽象
越来越明显的是，癌细胞除了重塑其新陈代谢以存活和增殖外，还适应和操纵其他细胞的新陈代谢。这一特性可能是一个明显的迹象，即仅利用体外单一培养模型的临床前肿瘤代谢研究可能被证明是有限的，无法发现能够转化为临床治疗的新代谢靶点。尽管人们越来越认识到这一点，并且解决这一问题的工作正变得司空见惯，但人们对这一问题仍然知之甚少。例如，关于癌细胞操纵非癌细胞代谢的生化机制以及随后对其存活和增殖的影响的知识仍然有限。此外，这些过程在不同癌症类型和进展阶段的变化及其对治疗的影响也在很大程度上尚未探索。本研究采用跨学科方法，利用数学建模的预测能力来丰富实验结果。我们开发了一种功能性多细胞计算机模型，该模型有助于对骨髓间充质干细胞系和骨髓瘤细胞系的体外共培养模型产生的代谢网络进行定性和定量分析。为了获得这个模型，我们设计了一个定制的基于人类基因组约束的重建工作流程，该工作流程结合了传统mCADRE和Metabotools算法，新颖的redHuman算法以及13C代谢通量分析。我们的工作流程将最新的人类代谢网络矩阵（Recon3D）转化为两个细胞特异性模型，以及跨越共享生长培养基的代谢网络。当将我们的计算机模型与体外模型交叉验证时，我们发现计算机模型成功地再现了体外对应物的重要代谢行为;结果包括细胞生长预测、呼吸速率以及对表明细胞之间氧化还原活性代谢物交叉穿梭的观察结果的支持。
作者摘要
众所周知，癌细胞会重塑自身的新陈代谢以求生存和生长，但新出现的证据表明，它们也会操纵其他细胞的新陈代谢。了解这一过程可能是发现癌症治疗新治疗靶点的关键。然而，关于癌细胞如何改变非癌细胞的代谢以及这些变化如何影响它们的存活、生长和对治疗的反应，仍然有很多未知之处。我们的研究旨在通过使用独特的跨学科方法，将数学建模与实验数据相结合来填补这些空白。我们创建了一个骨髓干细胞和骨髓瘤细胞共培养的计算机模型，使用从各种算法方法中提取的定制工作流程。该模型成功地反映了实验室中观察到的关键代谢行为，包括细胞生长和呼吸速率。我们的研究结果也支持了先前对细胞之间代谢相互作用的观察。这项研究代表了了解癌细胞代谢复杂相互作用的重要一步。
数字
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引文： 维拉-西根扎 E、埃斯克里巴诺-冈萨雷斯 C、塞拉诺-贡萨洛 I、埃斯克拉 K-L、Spill F、坦南特 D （2023） 体外多发性骨髓瘤模型中代谢网络的数学重建。公共科学图书馆计算生物学19（9）： e1011374. https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011374
编辑 器： 埃里克·洛夫格伦， 美国华盛顿州立大学
收到： 9月 2022， 19;接受： 七月 2023， 15;发表： 2023月 <>， <>
版权所有： ? 2023 维拉-西根扎等人。这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。
数据可用性： 本研究中进行的模拟是使用 MATLAB 2021a 软件进行的。使用 MATLAB 的基于约束的重建分析 （COBRA） 工具箱结合 IBM 优化 CPLEX 12.7.1.package 和 Gurobi 进行了磁通平衡分析、热力学通量平衡分析和磁通变率分析仿真。在范德堡大学颁发的学术许可下，使用基于MATLAB的图形用户界面同位素网络区室分析（INCA）套件软件进行了13C-MFA仿真和蒙特卡罗参数估计。本文随附的补充材料包括运行旧算法所需的几个生成的脚本，例如使用 CPLEX 和 MATLAB 2021a 的 mCADRE。但是，我们还在 APACHE 2.0 许可证下生成了一个 GitHub 存储库，可以在其中找到我们的模型文件：https://github.com/esig626/Metabolic_Networks。
资金： 由英国癌症研究中心资助给D.A.T.，652 E.V.-S.和C.E.-G.（C42109/A26982 和 C42109/A24747）。https://www.cancerresearchuk.org/资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。
竞争利益： 提交人声明不存在相互竞争的利益。
介绍
细胞的新陈代谢可以通过广泛的相互关联的化学反应网络来定义，这些网络由看似有组织的途径细分[1,2]。 这些途径专门构建细胞功能各个方面（即体内平衡、细胞繁殖和生物质）所必需的独特块[3,4]。 它们的性能取决于许多方面，其中一个关键方面是细胞所在的微环境[4-7]。微环境由现成的化学物质和不同细胞类型的水库组成。由于微环境的细胞群具有不同的代谢需求，因此它们的空间组织，类型和目标将受到微环境本身特性的影响。这在癌症代谢的情况下尤其明显[8]。研究表明，几种类型的恶性肿瘤依赖于其直接的细胞外环境和驻留在其中的细胞来满足其高能量需求，增强增殖，甚至使治疗耐药性[5-7,9-13]。
体外共培养是探测细胞类型之间代谢相互作用的有力工具（图1）[10-13]。这些实验模型是有利的，因为可以在受控的微环境下研究细胞相互作用，允许共培养的细胞建立独特的代谢生态位[14-16]。由此产生的细胞间化学交换使共培养中的细胞能够利用更大的代谢物库，从而激发了旨在优化可用营养素使用的大量代谢劳动分工。因此，细胞存活和增殖可能会增强，特别是在系统扰动（例如缺氧或缺氧）下，否则单培养物会死亡[14-16]。
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图1. 描述体外共培养模型设置的示意图。
(创建与 BioRender.com）A.共文化模型示意图。B.计算机模型原理图。
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由于过去几十年的技术进步，今天共同文化研究成为可能[17]。然而，研究跨微环境的细胞间代谢相互作用仍然极具挑战性[18-20]。因此，一波跨学科研究途径催生了许多生物信息学方法，这些方法解开了细胞代谢。组学富集和广泛的多尺度和多组学分析等技术以前所未有的精度帮助巩固了细胞功能的关键方面[21-23]。然而，充分理解细胞生物化学复杂性所需的粒度，例如代谢通量的定量信息，往往太难获得、分析和解释。
这是多发性骨髓瘤（MM）研究中一个非常熟悉的问题。MM是一种在骨髓（BM）中发现的恶性肿瘤，通过恶性浆细胞的进入和增殖形成[11,24]。 该疾病仍然无法治愈，尽管新疗法改善了患者的生存结局，但对于许多无法耐受当前癌症管理策略的患者，需要更有效的治疗[25,26]。 因此，开发多发性骨髓瘤的下一代治疗方法需要一种技术方法，重点是在保持生活质量的同时提供长期疾病控制[26]。
解决这个问题的一种潜在方法涉及利用那些对MM存活至关重要的代谢特征。已经观察到恶性浆细胞可以改变存在于骨髓壁龛中的基质的表型[7,15,27]。这种恶性肿瘤可以在肿瘤微环境中产生能够促进存活和侵袭增殖的代谢网络[28,29]。 先前的研究表明，MM患者的骨髓代谢发生显着改变，骨髓间充质干细胞（BMMSC）是恶性浆细胞的主要支持细胞类型[28,30]。 因此，我们假设了解这两种细胞类型（BMMSC和MM细胞）之间代谢相互作用的生理学以及它们所在的生态位将有助于发现新的代谢靶标。这样的靶标可能会干扰代谢间促生存轴，该轴被认为对恶性肿瘤的生存至关重要。
有鉴于此，我们的研究概述了一种多学科方法，以产生由恶性浆细胞或骨髓瘤和骨髓间充质干细胞形成的代谢网络的可测试和集成的体外/计算机模型。我们通过两个阶段来实现这一目标，这两个阶段显示了计算和工作台边实验研究之间的协同作用。第一阶段或实验阶段涉及HS-5（BMMSC）和JJN-3（MM）细胞系的单培养。我们进行了基准测量，例如细胞生长和细胞呼吸速率，即氧气（O2）消耗，以探测其碳代谢能力[31,32]。 我们通过体外共培养上述细胞系来遵循这些实验（图1A）。最后，利用稳定同位素探测了共培养系统的代谢表型13C6葡萄糖和13C5谷氨酰胺示踪[33,34]。
本研究的计算阶段借鉴并优化了已建立的技术，以生成我们两种细胞类型BMMSC和MM的两个细胞特异性基因组规模模型（GEM）[35,36]。 使用这些GEMs，我们重建了一个基于计算机共培养约束的模型（CBM）。该模型通过定制的计算工作流程组装而成，该工作流程使用mCADRE算法将公开可用的转录组学数据集（从NCBI基因表达综合数据库-GEO检索）集成到人类基因组分类的最新全球代谢功能知识库的热力学约束版本：人类Recon3D;使用redHuman算法的子程序（图2）[37-40]。我们的计算共培养进一步受限于使用代谢工具MATLAB例程模拟体外生长培养基RPMI[41]。我们根据实验对应物验证了结果模型，我们发现它成功地概括了观察到的体外生长和呼吸速率。此外，通过整合稳定同位素标记数据13C 代谢通量分析（13C-MFA），使用MATLAB INCA例程作为“表型调整”的手段[42,43]。
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图2. 示意图描述了生成计算机共培养模型的工作流程。
(用 BioRender.com 创建）。
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材料和方法
细胞培养
HS-5细胞系（ATCC）和JJN-3细胞系均经过STR分析以确保准确鉴定，并在RPMI（Sigma-Aldrich，R8758）中维持10%FBS（Sigma-Aldrich，F7524）。对于单个细胞生长实验，将HS-5和JJN-3细胞接种在4×104细胞/mL 和 3.7 × 104通过JJN-3的细胞计数和HS-5的磺酰罗丹明B（SRB）测定来评估随时间推移的细胞/ mL和细胞生长。对于共培养实验，HS-5细胞接种在12×104在6×3将JJN-401接种在Transwell（CC8，Appleton Woods）顶部的前一天，将JJN-10的<>孔板的每孔细胞接种4每孔细胞数。
氧消耗
将胰蛋白酶消化的细胞重悬于培养基中，并加载到Oxygraph-2k（Oroboros仪器）室中。关闭腔室并记录常规呼吸后，加入寡霉素（2.5 μM）以抑制ATP合酶。在实验结束时加入鱼藤酮（0.5 μM）和抗霉素A（2.5 μM）抑制呼吸。通过逐步（0.5 μM）滴定解偶联器羰基氰4-（三氟甲氧基）苯腙（FCCP）来测量非磷酸化电子转移系统（ETS）容量。
13碳代谢示踪
将70%汇合度的细胞在助焊剂培养基中孵育：不含葡萄糖、谷氨酰胺、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-缬氨酸和酚红的改良RPMI 1640，补充有2g/L的细胞培养技术13C-[U]-葡萄糖或 2mM13C-[U]-谷氨酰胺（均为CK同位素），另一种以未标记的形式提供。48小时后，取出培养基进行提取，JJN-3细胞旋转下来，然后用冰冷的盐水洗涤细胞（JJN-3）和孔（HS-5）两次，然后用冰冷的MeOH淬灭代谢。将细胞转移到冷管中，其中加入D6-冰冷H中的戊二酸2O（CDN同位素，D-5227）和预冷氯仿。在冰上摇晃15分钟并离心后，将极相转移到另一管中进行干燥。
衍生化和气相色谱-质谱
将干燥的提取物用2%甲氧胺在吡啶中（20μ升，在60°C下衍生1小时），然后用30%叔丁基二甲基硅烷（1μ升，在60°C下8890小时）。将样品转移到玻璃样品瓶中，使用 Agilent 5977 GC 和 1B MSD 系统进行 GC-MS 分析。以1.0 mL/min的速率用氦载气以不分流模式注入100μL样品。初始气相色谱炉温度保持在 160°C 一分钟，然后以 10°C/min 的速率升温至 200°C，然后以 5°C/min 的速率升温至 320°C，最后以 10°C/min 的速率升温至 <>°C，保持五分钟。化合物检测在扫描模式下进行。将每种代谢物的总离子计数标准化为内标D6-戊二酸。
归一化和量化
数据归一化通过使用从科瓦国际购买的计数室快速读取102对细胞进行计数来实现。使用安捷伦质量分析软件对 GCMS 数据进行分析，以进行实时数据质量分析和内部 MATLAB 脚本。
型
生成计算机模拟大型代谢模型的一种经常抢手的解决方案是使用基因组规模模型（GEM）绘制组织特异性功能[44,45]。 GEMs是旨在重建特定生物体新陈代谢的综合模型[36,38,44,45]。它们通常包括大多数（如果不是全部）已知的化学反应和化学计量基质形式的代谢物，以及基因规则基质形式的相应基因。后者是GEM的一个吸引人的特征，因为模型中每个酶介导的反应都与有关基因如何影响蛋白质的信息相关联，而蛋白质又会影响反应。在 GEM 中，这被称为基因-蛋白质-反应 （GPR） 规则。GPR对于GEM至关重要，因为它们对编码酶的基因之间关系的描述能够介导给定模型中的给定反应或一组反应[44,46]。 此外，GEMs很有吸引力，因为它们有望促进我们对各种组织中各种生理和病理过程背后的潜在代谢的理解[44,46,47]。 与许多建模框架不同，GEM可以对细胞行为产生深刻的见解，需要关于需要难以测量的动力学参数的生物物理方程的最少信息。诸如人类基因组分类的代谢功能的全球知识库（称为Human Recon3D）等努力，加上丰富的高通量数据，使细胞特异性代谢模型的重建成为可能[39,48]。
以下是自上而下的重建策略的详细工作流程，旨在生成两个基于细胞特定的约束模型;一个骨髓间充质干细胞（BMMSC）和一个骨髓瘤（恶性血浆-MM）细胞（图2）。我们的首要目标是评估代谢适应和所需表型调节的后果——在我们的例子中，是多发性骨髓瘤体外共培养;通过网络通量分析。为此，第一步使用人类新陈代谢的通用模型：Recon3D，这是最新的，可以说是最全面的共识人类GEM。Recon3D由10,600个反应组成，5938个反应与2248个基因相关，2797个独特代谢物跨越七个区室：细胞质、线粒体、过氧化物酶体、高尔基体、内质网、细胞核和溶酶体[39,48]。 代谢网络的GEM与CBM相结合，产生了一个强大的工具，最终通过给定的网络图表示产生有关稳态代谢通量分布的定性和定量信息。此功能可以预测实验可测量的变量，例如细胞生长速率或目标代谢物的生产率[49]。在这种范式中，稳态方法之所以有效，是因为在我们的实验时间尺度内，代谢物浓度的变化缓慢发生[49-51]。在恒定的指数细胞生长（即癌症）下也是如此。稳态假设允许CBM在不知道酶动力学和翻译后调控机制的情况下模拟大型网络[50]。当感兴趣的生理学细胞活动尚未得到充分了解时，最后一个特征是有利的[50,52]。
热力学数据集成（步骤 1）
我们按照redHuman工作流程中概述的方案引入了所有代谢物化合物和反应的热力学信息[40]。简而言之，该协议涉及从MetaNetX档案中获取代谢物Gibb的自由能数据[53]。这些来自Recon3D的代谢物以及来自SEED、KEGG、CHEBI和HMDB的标识符被手动注释，然后使用ChemAxon的Marvin（如果用于学术目的，则免费提供），将化合物结构在pH值为7时转化为其初级质子化状态并生成MDL Molfiles [53-59]。然后使用这些MDL摩尔文件和组贡献法来估计Recon3D中代谢物形成的标准Gibb自由能，如[60,61]。 结果，每种代谢物都与其吉布的自由能（ΔG）相关。然后根据其反应物和产物的热力学性质估计给定反应的ΔG。在合并这些数据之后，使用redHuman的prepModelforTFA.m例程为热力学通量平衡分析（tFBA）和热力学通量变异性分析（tFVA）准备了模型[40]。现成的注释矩阵和 MATLAB 脚本在 matTFA 包中可用 [62]。但是，由于 MetaNetX 存档中的更新（最新更新发生在 2022 年 3 月），我们重复了该协议。通过运行redHuman的matTFA子程序并将其结果与redHuman算法包生成的热力学注释Recon40D版本进行比较，验证了模型的一致性[62,<>]。
执行此步骤可以确定并确保Recon3D矩阵中包含的那些化学反应的可行热力学方向性，我们没有约束数据。从数值上讲，这也确保了优化例程的采用，例如MATLAB COBRA例程中的优化CB模型，不会产生热力学上不可行的通量回路，从而避免生理上不准确的行为[63]。
数据库挖掘和细胞特异性（步骤2）
为了确定必须从现在受热力学约束的Recon3D矩阵中删除哪些反应才能生成我们的细胞特异性模型，我们使用了来自基因表达综合数据库（GEO）的转录组数据集[37,39]。 在这项研究中，我们严格遵守基于Affymetrix人类基因组U133 Plus 2.0阵列平台的骨髓间充质干细胞和恶性浆细胞模型的数据集[64]。这一选择是由Affymetrix通过.cdf文件（描述Affymetrix GeneChip阵列布局的文件）的可用性及其通过生物信息学工具箱与最新MATLAB版本兼容的全力支持所驱动的[64]。这些用于生成骨髓间充质干细胞模型重建的集合是从健康的人类早期骨髓通道样本和在MSCGM（间充质干细胞生长培养基）中培养的间充质干细胞中获得的基因表达数据。这些是按照早期模型选择的，该模型使用Recon3D的遗留版本，即Recon1，以生成基因组规模的重建 - iMSC1255 [65,66]。 他们的入库编号：GSM184636、GSM184637、GSM184638、GSM194076、GSM194077、GSM194078、GSM194079、GSM764199、GSM797497、GSM797498、GSM920586、GSM920587和GSE80608[67]。特别是，GSE80608数据集包括从骨髓抽吸物中生长出来的骨髓间充质干细胞的基因表达中收集的较新的数据集，用于多次患者传代[30]。对于骨髓瘤细胞模型，我们使用了来自一系列治疗前骨髓抽吸物的数据集，这些数据集来自被诊断患有多发性骨髓瘤的患者。选择这些样品中使用的骨髓瘤细胞表达CD138，CD1是多发性骨髓瘤的特征标志物。数据集还包含个体的表达，这些个体表现出一种称为未知意义的单克隆丙种球蛋白病（MGUS）的病症。虽然已经发现这种情况是多发性骨髓瘤的前兆，但重要的是要注意这些患者群体之间的显着临床差异。因此，在本研究中，我们没有使用MGUS患者的数据，承认从MGUS到多发性骨髓瘤的概率转换率较低（每年30%）[50986]。数据接入ID：GSM50987、GSM50988、GSM50989、GSM50990、GSM50991、GSM50992、GSM50993、GSM50994、GSM50995、GSM50996、GSM50997和GSM68[<>]。重要的是要注意，上面的表达数据提供了有关细胞环境的丰富信息来源。然而，仅用这些数据调整的模型可能无法完全复制体内或体外微环境。因此，与实验结果相比，包含该基因表达数据可能会导致改变。换句话说，如果模型仅由早期人类骨髓样本提供信息，则可能会由于这些样本的特定特征而产生差异，这些特征可能因生长培养基中的条件而异。包含不同的数据类型对于我们的研究是必要的（参见下面的“表型规范”部分）。+
使用热力学约束的Recon3D（步骤1）和上面的微阵列数据集，我们执行了mCADRE例程[38]。简而言之，作为第一步，mCADRE根据Recon3D矩阵中包含的基因在转录组数据集中的存在对其进行评分。然后根据初始模型的注释基因-蛋白质-反应（GPR）关系将这些分数归因于反应。接下来，考虑代谢网络的拓扑结构来更新这些分数。一旦程序完成，去除评分低于一定阈值的反应，以完成细胞特异性代谢网络的重建。我们请读者参阅 [38] 以获取 mCADRE 算法的详细说明。
我们设计了mCADRE的更新版本，与Recon3D（https://github.com/esig626/Metabolic_Networks）兼容。此版本使用 Matlab 包装器运行，以便直接在其本机 C 版本中使用 IBM 的 CPLEXstudio 线性规划 （LP） 和 MLP 求解器。这是必要的，因为IBM在最新的版本中停止了对MATLAB软件的支持[38,69]。 此外，尽管不是开源的，但IBM的CPLEXstudio可以在学术和学生许可下用于研究目的。鉴于 mCADRE 算法依赖于 CPLEX 的快速通量变异性分析（也称为 fastFVA）优化例程 [70]，因此这种可访问性至关重要。鉴于这些考虑，我们整合了 fastFVA 的优化开源版本，恰如其分地命名为超快速通量变异性分析 （VFFVA）。VFFVA利用CPU并行化，从而通过优化的系统生物学建模促进生物学见解的生成。在开源许可证下，它可以在C，MATLAB和Python中使用[71]。
模型缩减（步骤 3）
在前面的步骤中，我们已经概述了我们的GEM，BMMSC和骨髓瘤是如何重建的，以研究人类细胞中发生的生物化学。从本质上讲，这些模型可用于探测其各自代谢的生物化学。然而，这种方法结果的验证是有限的，因为大多数实验程序都集中在细胞代谢的一小部分上。因此，该模型及其解决方案在其分析中利用了不必要的复杂性，阻碍了一致和简洁的生理表示。在我们的研究中，我们对癌细胞的代谢感兴趣，我们可以产生的数据以中央碳代谢为中心;这意味着我们必须保留那些为细胞生长和维持提供能量、氧化还原电位和生物量前体的途径。我们还包括那些据报道在癌细胞中被改变的途径。因此，我们指定模型的核心子系统是糖酵解、戊糖分流、三羧酸循环、氧化磷酸化、谷氨酸/谷氨酰胺代谢、丝氨酸代谢、尿素循环和活性氧解毒。我们执行了redHuman算法，该算法执行了一系列约简[40]。简而言之，上述定义的核心代谢途径已在常规中指定。然后我们使用mCADRE GEM作为输入，redHuman使用其子程序redGEM-lumpGEM围绕我们指定的核心重建一个简化的模型[38,40,72,73]。
共培养组装、目标功能、培养基和表型规范（步骤 4）
共文化组装和目标功能。
为了模拟实验细胞培养条件，我们必须根据体外对应物中使用的计算机培养基定义计算机培养基。模型中培养基的正确定义是充分表示细胞内代谢的基础。使用redGEMX（redHuman的一部分）和metabotools MATLAB包例程setMediumConstraint的组合，我们可以保证简化的模型具有消耗和产生培养基细胞外环境成分的所有可行途径[40,41,72]。 redGEMX子程序从将细胞外代谢物连接到上面定义的核心网络所需的模型中找到这些途径。我们还通过使用与RPMI培养基组成相关的数据，对两个细胞中细胞外培养基的交换通量进行了限制。结合使用这些方法的优势在于，我们能够专门满足简化模型的需求，同时提供生理上合理的体外培养基模型，该模型定义了培养基成分以及细胞可以吸收但未被测量数据捕获的成分，例如CO2， H， H+2O、、和NH4.
在考虑计算机共培养模型的组装时，我们手动策划了每个细胞特异性随机测量基质，以反映每个细胞的区室是唯一的（即骨髓瘤细胞质的代谢物[cm]和BMMSC细胞质的代谢物[bm]），排除细胞外通量，鉴于两个细胞共享该空间（在模型中以符号[e]指定），则细胞外通量保持不变。随后的模型跨越了一个大的代谢基质，其中重复的细胞外汇和来源被移除。此外，最终模型要求两个细胞都配备生物质产生反应。我们遵守Recon3D GEM [39]规定的那些。使用此函数作为模型的优化目标有几个原因，包括实验功能。一项研究提出了这样的论点，该研究分析和比较了几种CBM生物量功能用于癌症代谢建模[4,74]。在这里，发现来自Recon家族模型（Recon 2和Recon3D）的配方在他们测试的所有癌细胞系（包括白血病研究）中的基本基因和生长速率预测方面获得了最准确的结果。
多目标优化。
我们驻留在微环境（即细胞外介质）中的两个细胞具有不同的功能，每个细胞都需要在模拟中具有不同的目标。在多目标范式中，我们假设即使在受控环境中，两个细胞也解决各种生物任务（即目标）以维持生命。为了获得最优解，我们使用“帕累托最优”的概念。简而言之，帕累托最优解决方案是指一项任务的性能会降低实现一项或多项其他任务的能力的解决方案。为了简单起见，我们假设无论两种细胞类型的生物学功能如何，在我们的模拟中，生物量函数都携带了关于生物系统的足够知识[75-77]。我们的仿真使用 MOFA 例程对 MATLAB 中的 COBRA 包实施了多目标优化 [78]。简而言之，MOFA通过计算大量帕累托解来绘制帕累托前沿的n-1维表面，其中n是目标的数量。也就是说，在两个或多个相互冲突的目标之间存在权衡的情况下，例程映射了多个标准决策的区域[78,79]（S1文本）。
在管理共培养模型后，我们进行了通量变异性分析（FVA），并使用了目标函数最小化和最大化的极端之间的平均值。通量平衡分析 （FBA） 的扩展。简而言之，FVA探索了给定特定目标函数的代谢网络中每个反应的可能通量值范围。在此过程中，我们不仅确保了稳健的通量分布，而且还促进了卓越的预测，同时保留了生物质合成不可或缺的途径的基本功能[71,80,81]。 然而，必须注意的是，这种方法的有效性和准确性取决于几个因素，包括代谢模型的质量和完整性、目标函数的选择以及输入数据的准确性。该方法还提供了探索细胞代谢网络的详尽窗口。它使我们能够减轻过度约束解决方案可能产生的潜在瓶颈，例如目标函数的过度最大化或最小化。同时，它能够识别感兴趣的潜在代谢通量。在我们的模型中，尽管通量变化和固有的不确定性，代谢反应的固有复杂性仍然保持一致，但由于各种约束和权衡，代谢反应的内在复杂性通常表现不佳。这在哺乳动物细胞等复杂的生物系统中尤其明显，这些系统需要在生长速率最大化，能量守恒和氧化还原平衡维持之间取得良好的平衡[71,81]。
通过更细致地表示不同代谢途径及其相互作用之间的复杂相互作用，以这种方式筛选代谢网络可以全面了解支撑共培养系统的过程。（S3 表）。
表型规格。
由于代谢具有高度的细胞类型和状态特异性，因此为诊断和治疗癌症提供了宝贵的机会[82]。基于质谱（MS）或核磁共振（NMR）的方法（如代谢组学）测量细胞代谢物的相对丰度，这可以帮助检测代谢状态的差异，但这种丰度数据并不能告知其自身的代谢活动[42,83,84]。 为了详细评估细胞内的细胞内代谢活性，需要稳定同位素标记的营养素[83-85]。这是因为代谢反应速率或通量有助于代谢表型和细胞调节机制[42,83,85]。 然而，在大多数情况下，由于代谢途径中原子重排的高度复杂性，同位素标记数据无法直观地解释;相反，需要一种正式的基于模型的分析方法来从标记数据中提取通量信息。定量和表征细胞中的代谢表型13C 代谢通量分析（13C-MFA）是将同位素标记数据转换为相应代谢通量图的金标准[42,43]。 在高层次上13C-MFA被表述为最小二乘参数估计问题，其中通量是未知参数，必须通过最小化测量的标记数据和模型模拟的标记模式之间的差异来估计，受细胞内代谢物和代谢物标记状态的质量平衡引起的化学计量约束;所谓的质量同位素[42,43]。
我们的主要目标是通过在注释的代谢网络模型中为反应分配通量值和每个估计通量的置信区间来生成细胞代谢的定量图谱。置信区间充当从步骤1到步骤4生成的建立信任措施的下限和上限。其结果是纳入了实验数据和进一步的建模约束。因此，我们允许模型中的每个细胞从体外共培养装置中获得显示或推断的表型。虽然许多例程可以执行13C-MFA，我们选择了用于同位素网络区室分析（INCA）的MATLAB软件包[43]。简而言之，INCA使用基本代谢物单位（EMU）框架来模拟任意生化模型中的同位素标记。该例程配备了蒙特卡洛参数估计例程，我们用它来获取每个预测通量的置信区间[42,43,86]。
本研究中同位素示踪剂的选择是13C6-葡萄糖和13C5-谷氨酰胺。13C6-葡萄糖最适合确定碳代谢上部的通量，即糖酵解及其产物掺入TCA循环[42]。13C5-另一方面，谷氨酰胺专门用于测定下部，即TCA循环和还原羧化。所有进行的示踪实验都是并行进行的，这意味着培养物和初始条件是相同的，只是示踪是在不同的批次中进行的。从这些实验中获得的数据也可以并行合并，因为这些同位素是互补的[42,43]（S2文本和S2至S8表）。
Results
Models in mono-culture: Results and experimental validation
我们进行了基准测试，以验证BMMS单元和MM单元两种模型的预测行为。在单一培养中进行以下模拟。每个细胞特异性模型都单独测试，其中细胞外培养基设置为RPMI。然后，我们进行了计算机实验，以解决细胞培养物的一致性[87,88]（S1表）。
细胞生长。
通过执行以生物量最大化为优化目标的通量平衡分析程序获得细胞生长预测速率的模拟[48]。据报道，BMMSC的生长速度在很大程度上取决于细胞培养条件，包括培养基组成及其随时间的变化。我们在RPMI培养基中培养的HS-5细胞系的实验生长速率数据计算为0.024±0.0097 /小时。一些文献报道体外BMMSc种群增长率为0.027 /小时。我们的骨髓间充质干细胞模型预测生长速度为0.02367 /小时。这是通过注意到每克干细胞重量（grDW）假设相当于一毫摩尔生物质而发现的。这意味着最佳计算机比生长速率等于 [65]：
(1)
我们的结果在我们的实验和文献报道的测量误差范围内（图3A）[65,89-91]。我们重复该过程以计算骨髓瘤细胞的生长速率（方程1）。该模型预测计算机中骨髓瘤细胞的生长速率为0.0265 /小时，这与我们的实验结果一致，表明生长速度为0.02843 /小时（图3A）和文献报道[92-94]。
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图3. 单一培养和共培养中模型与实验结果的增长率比较。
A.描述体外和计算机模型增长率的比较分析。该图说明了BMMC体外培养物（描述为黑点）的实验生长，标准化进行比较。该增长曲线与指数增长模型确定的预测增长形成对比，该指数增长模型使用BMMSC约束基于模型（CBM）预测的增长率;利用通量平衡分析（FBA）程序解决，以最大生物质生产率为优化目标。这由黑色间歇线表示。同时，该图显示了MM细胞系体外培养的测量，标准化生长，用红点表示。这是根据预测的增长曲线设定的，最大生物质生产率是主要优化目标;用间歇性红线表示。B.模型与共培养实验结果之间的增长率比较图示。该图显示了BMMSC细胞系的测量，标准化体外共培养生长;（黑点）。这与指数增长模型解决方案给出的生长曲线形成对比，该曲线拟合了计算机共培养模型预测的增长率，由间歇黑线表示。同时，该图显示了MM细胞系的测量，标准化体外共培养生长，用红点表示。这是根据指数增长模型解决方案产生的生长曲线设置的，该曲线根据计算机共培养模型预测的增长率进行调整，由间歇性红线表示。请注意，在单培养和共培养这两种情况下，BMMSC和MM的建模和测量生长速率之间的可忽略不计的差异限制了细胞类型的区分。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011374.g003
奥罗波罗斯呼吸研究。
由于碳代谢是癌症研究的核心，如方法论部分所述，我们通过模拟计算机Oroboros研究来测试每个模型（即单培养）的呼吸[32]。然后，我们比较了在体外培养（也包括单一培养）中进行的那些。简而言之，Oroboros呼吸研究包括通过药理抑制剂进行一系列电子传递链扰动，以测量细胞的呼吸能力[32]。该过程在记录基础测量后开始。这是通过测量氧气（O2） 执行 FBA 优化例程时的通量，其中目标函数（生物量）设置为通过网络找到最小通量分布（图 4A 和 4B 分别为α、紫色和绿色;图4A和4B α，红色和黄色;分别）。呼吸研究的第二步涉及将细胞暴露于寡霉素，寡霉素是ATP合酶（或电子传递链的复合物V）的抑制剂。通过抑制通过该酶的质子（H）通量，寡霉素的作用导致线粒体内膜上的质子梯度增加，阻止电子通过复合物I-IV的传递（图4A和4B分别β紫色和绿色;分别是图4A和4B β红色和黄色;）。耗氧量成比例下降。线粒体呼吸的剩余速率代表质子泄漏;也就是说，在电子传输过程中泵送的质子导致氧气消耗，但不产生ATP（图4A和4B。δ，紫色和绿色;分别，图4A和4B δ红色和黄色;分别）。ATP相关呼吸的增加，衡量细胞满足其能量需求的能力，将表明ATP需求的增加。相反，降低表明ATP需求低，底物可用性不足，包括对氧化磷酸化途径的严重破坏，这将阻碍电子的流动并导致较低的耗氧率（图4A和4B分别为ε紫色和绿色;图4A和4B ε，红色和黄色;分别）。在这两个模型中，我们通过将ATP合酶通量限制为零并约束电子传递链复合物以防止逆转来实现这一点。然后，我们执行了第二个FBA优化程序，其目标函数是最大限度地提高生物质生产率。+
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图4. 线粒体呼吸实验和计算机模拟使用Oroboros呼吸计测量线粒体呼吸能力。
小组A.将骨髓间充质干细胞（BMMSCs）进行的Oroboros呼吸研究的结果与我们的计算机模型的预测进行了对比。叠加图提供了清晰的比较，展示了模型预测（红色）和实验观察数据（紫色）之间的一致性程度。小组B.将骨髓瘤细胞系的Oroboros呼吸研究的结果与我们的计算机模型的预测进行设置。叠加结果允许显式比较，显示模型的预测结果（黄色）与实验观察数据（绿色）之间的相关性。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011374.g004
以下实验涉及FCCP，这是一种有效的解偶联剂，可破坏质子梯度并破坏线粒体膜电位。该药剂在细胞暴露于寡霉素后添加。结果，通过电子传递链的电子流动不受抑制，复合物IV的耗氧量达到最大值。与基础速率相比，FCCP刺激的高耗氧率表明线粒体使用的电子传输速率低于细胞底物供应支持的最大电子传输速率。我们通过放宽电子传递链相关通量的约束来执行此模拟。然后，我们执行了第三个FBA优化程序，目标是通过模型电子传递链的复合物IV最大化通量（分别为图4A和4B γ紫色和蓝色;分别图4A和4B γ红色和黄色）。然后，我们使用FCCP刺激的耗氧率来计算细胞的备用呼吸能力。该速率定义为最大呼吸和基础呼吸之间的差异。备用呼吸能力测量细胞对增加的能量需求或压力的反应能力。
最后一个实验涉及将细胞暴露于复合物I抑制剂鱼藤酮的混合物中，然后加入抗霉素A，一种电子传递链复合物III抑制剂。这种组合关闭了线粒体呼吸，并能够计算由线粒体外过程驱动的非线粒体呼吸。我们通过限制通量通过电子传递链的配合物1和3来进行这种计算机实验。我们执行了FBA优化程序，其中生物质被用作最大化的目标函数（分别为图4A和4B ζ紫色和绿色;图4A和4B分别为红色和黄色，图<>A和<>B ζ红色和黄色）。
共培养模型：结果和实验验证
共培养细胞生长。
在对单一培养模型进行实验验证后，验证了共培养计算机模型生长速率预测。我们发现BMMC和MM细胞的值均为0.0335 /小时（图3B）。有趣的是，尽管它看起来非常接近体外对应物的测量值，但我们无法准确验证共培养中JJN-3细胞系的生长速率。这是因为我们的实验数据只针对一个生物学重复进行，使其统计意义为零。由于实验数据似乎尚无定论，我们假设该模型的预测足以根据单一培养和文献中发现的预测作为合理的近似增长[65,89-94]。
13C-MFA。
模拟骨髓瘤细胞和骨髓干细胞、HS-5 和 JJN-3 细胞系的质量和同位素平衡。通过测量分析时间点的质量同位素分布（MID）平衡来验证同位素稳态。当同位素富集随时间的变化落在测量不确定度范围内时，达到同位素稳态。我们实施了13C6葡萄糖和13C5谷氨酰胺数据集在并行数据集中同时回归，为每种培养基配方生成一个完整的代谢通量图。计算葡萄糖摄取通量为0.45 μmol/106细胞/小时，测得的谷氨酰胺为0.63 μmol/106细胞/小时—这些值是根据[42]中概述的方案计算的。在MATLAB的INCA例程中模拟所有通量，使用至少100次随机初始值的唯一重启，以确保找到全局最小值[43]。对通量结果进行卡方统计检验以评估拟合优度，并为每个估计的通量值计算95%置信区间[43]。图5总结了我们的代谢通量分析结果。图5的图A和C说明了观测和模拟的质量同位素分布（MID）;也称为“标签模式”。当葡萄糖代谢时，同位素的掺入导致质量变化（m + n，其中n的范围为图1中的5至5）。这些MID代表每种同位素的相对丰度，归一化为所有可能的同位素的总和。因此，含有n个碳原子的代谢物可能具有0到n个标记的原子13C，导致同位素异构体表现出特定代谢物的质量从m + 0增加到m + n。有关 中使用的概念的深入解释13C-MFA 我们将读者推荐给Antoniewicz et.AL， （2018） [42].下一节（S2 文本和 S2 到 S7 表）将彻底讨论这些结果。
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图5. 13C-MFA 模拟。
A. & B.来自 [U- 的质量同位素分布13C]葡萄糖和[U-13C]谷氨酰胺示踪。质量同位素分布表示每种同位素的相对丰度，归一化为所有可能的同位素的总和。葡萄糖衍生代谢物丰度。数据表明两个细胞的糖酵解活性都很高。在JJN-3细胞中，丙酮酸衍生的丙氨酸远高于HS-5细胞。JJN-3细胞中丙酮酸的丰度也比HS-5更显著。可以看到，尽管丙酮酸衍生的柠檬酸盐遵循预期的TCA循环，但由于JJN-3细胞中的a-酮戊二酸含量低，因此它不会继续下游。这表明TCA周期中断。C. & D.来自 [U- 的质量同位素分布13C]葡萄糖和[U-13C]谷氨酰胺示踪。谷氨酰胺衍生的代谢物丰度。数据表明，两个细胞中的TCA循环都是通过anaplerosis支持的，其中外源性谷氨酰胺相互转化为a-酮戊二酸，然后掺入TCA循环。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011374.g005
共文化模型预测。
我们的计算机模拟结果表明，两种细胞在从单培养到共培养时都会降低其糖酵解活性。原则上，这是一个违反直觉的结果，因为高糖酵解活性是癌症代谢的标志。因此，我们希望看到这种行为在以更生理相关的方式组装时得到增强。然而，这一结果屈服于在单一培养中观察到的细胞类型之间的异质性，而不是其在共培养中的结果。例如，我们模型的单一培养解决方案优先考虑与糖酵解途径相关的通量，以产生生物质合成所需的大部分ATP。相比之下，我们在体外共培养细胞系中看到的较小程度。与我们的期望相反，我们的单一培养模型支持这一实验证据，其中体外共培养细胞系比单一培养细胞系消耗更少的葡萄糖。然而，在我们的共培养模型中进行的葡萄糖摄取模拟并没有重新概括这种行为，也许可以解释图3B中观察到的细胞生长速度稍快的结果。体外共培养表现出的葡萄糖使用表型一旦13纳入了C-同位素标记数据。有人怀疑合成大量的生物高能代谢物需要恶性细胞建立协作的细胞间代谢网络。我们的模型预测，这种机制的一个关键组成部分是由丙酮酸和乳酸从骨髓间充质干细胞单向输出到骨髓瘤细胞驱动的。我们的模型预测，这种现在的外源性丙酮酸可能被骨髓瘤细胞吸收以支持其呼吸和生物质需求。在图6中，描述了在共培养中，BMMSC相对于其功能使用的丙酮酸产生相对大量的丙酮酸。事实上，该分支点代谢物的一小部分用于细胞呼吸和生物量（即TCA循环，丙氨酸合成），而其余的则输出到共培养基中。在丙酮酸被纳入骨髓瘤细胞的代谢网络后不久，它注定要支持大分子合成，我们怀疑大分子合成主要用于脂肪酸。
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图6.
A.葡萄糖碳掺入丙酮酸也通过共培养而改变;虽然与共培养条件相比，HS-5细胞在单一培养物中的丙酮酸掺入量较低，但JJN-3掺入几乎没有变化。B.与13C6在骨髓瘤细胞系（JJN-3）或BMMSCs（HS-5）中，葡萄糖，标记富集到TCA循环代谢物苹果酸中表明氧化葡萄糖代谢（m+2同位聚体）以及无毒剂使用（m+3同位聚体）显着增加。C.BMMSC和MM细胞系HS-5和JJN-3的共培养分别导致与单一培养中的任何一种细胞类型（校正为细胞数）相比，葡萄糖使用减少，这表明当两个细胞一起培养时更有效地使用葡萄糖碳。（图中参考：****; p<0.001， ****;p<0.0001。来自Anova和Dunn的多重比较）。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011374.g006
事实上，我们可以证明体外共培养的BMMC和骨髓瘤细胞比单培养时消耗更少的葡萄糖（图7）。这些观察表明，这两种细胞类型作为一个代谢群落起作用，促进骨髓内更有效的营养利用（图7）。实验还表明，共培养的HS-5细胞显示出葡萄糖衍生的丙酮酸增加，而在骨髓瘤细胞中观察到的变化很小（图7）。这可能表明丙酮酸可能在细胞类型之间运输，可能导致葡萄糖代谢效率的提高，这表明模型预测的可能验证。
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图 7. 模型预测。
在共培养中，BMMSC产生相对大量的丙酮酸，其中一部分用于细胞呼吸，其余的出口到共培养基。不久之后，这种丙酮酸被骨髓瘤细胞吸收并结合到其碳代谢轴中，注定要支持生物质合成。然而，两种细胞都显示出分馏的TCA循环，其中L-柠檬酸盐被输出，主要用于脂肪酸合成，并且该循环通过谷氨分解被拯救。该模型表现出天冬酰胺的显着乙酰化，在骨髓瘤细胞中形成N-乙酰基-l-天冬酰胺。代谢物被骨髓间充质干细胞输出和吸收，其中反向乙酰化产生天冬酰胺和乙酸盐。骨髓间充质干细胞将其用于外源性丝氨酸交换，部分用于生产丙酮酸、脂质、抗氧化剂和生物质。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011374.g007
该模型的通量分布表明，HS-5细胞中丙酮酸与乳酸的比例与丙酮酸不对称，与我们的共培养实验一致。然而，目前尚不清楚乳酸的命运是什么。这是因为这种代谢物的进出口与其合成到丙酮酸和返回是平衡的，大概是为了维持NAD / NADH的胞质氧化还原平衡。+
该模型预测，一旦丙酮酸进入线粒体内部，它可能主要通过丙酮酸脱氢酶（PDH）分解代谢，在较小程度上通过丙酮酸羧化酶（PC），在那里它可以遵循TCA循环终止为L-柠檬酸盐，由柠檬酸合酶（CS）催化。在这一点上，该模型表明代谢物通过柠檬酸盐转运蛋白从线粒体中挤出，以换取α-酮戊二酸，我们怀疑它注定要合成脂肪酸。由于该通量相对较大，该模型绕过了乌头酸水合酶将柠檬酸盐转化为异柠檬酸盐的过程，导致线粒体葡萄糖衍生的a-酮戊二酸的比例相对较低。这些观察结果与我们的实验数据一致，其中我们看到m+2同位素体从柠檬酸盐减少到a-酮戊二酸（图5B），表明BMMSC细胞中的线粒体a-酮戊二酸，在其大多数中，不是葡萄糖衍生的。该模型预测，这种挤压有助于平衡线粒体柠檬酸盐交换的α-酮戊二酸通量在稳态下 - 先前关于高水平ROS抑制乌头酸水合酶的研究也看到了类似的结果[95]。根据我们的模拟，BMMSC的TCA循环，超过L-柠檬酸盐步骤，通过高谷氨酸分解活性引起的无奈反应被拯救，这是癌症的标志（图5D）。最后，在我们的计算机模型中，我们还观察到葡萄糖衍生丙酮酸的L-乳酸脱氢酶（LDH）具有相当大的通量，表明BMMSC也具有高度糖酵解性;正如预期的那样（瓦尔堡效应）。然后将这种葡萄糖衍生的L-乳酸挤出。然而，我们不能排除细胞一旦挤出就会重新导入这种乳酸。该结果可能支持先前的研究，其中这些细胞观察到副分泌样行为，其中L-乳酸被重吸收[28]。
在预测丙酮酸被骨髓瘤细胞掺入线粒体之后，我们的计算机模型表明L-柠檬酸盐的产生率很高，我们的实验结果证实了这种可能性（图5）。与BMMSC一样，丙酮酸衍生的L-柠檬酸盐主要出口到细胞质区室以交换a-酮戊二酸（特别是通过线粒体载体CTP-Slc25a1）。一旦进入细胞质，L-柠檬酸盐主要转化为脂肪酸;该模型的通量分布选择长链脂肪酸（即棕榈酸酯）。这些脂肪酸主要用于生物质生产，而相对较小的部分通过β氧化回收到线粒体中，并重新纳入TCA循环（图6）。我们的模型预测，由于大多数葡萄糖衍生的L-柠檬酸盐可能会被输出，因此该细胞可能表现出骨髓瘤模型的TCA周期中存在的低异柠檬酸盐通量。值得注意的是，这些甚至低于在BMMSC细胞模型中观察到的。在骨髓瘤细胞GEM内，大部分可用的丙酮酸被运往线粒体，并由线粒体膜丙酮酸载体（MPC）被动运输。然而，该模型通量分布的一个有趣结果描述了很大一部分在细胞质中转介成L-丙氨酸，然后通过未指定的线粒体转运蛋白转运到线粒体中。一旦进入线粒体，L-丙氨酸被脱氨回丙酮酸。结果很有趣，因为L-丙氨酸也是一种生物质前体。与BMMSC类似，恢复TCA循环所需的大多数α-酮戊二酸是通过L-谷氨酸脱氢酶将线粒体谷氨酸转化为α-酮戊二酸提供的。最后，与BMMSC结果不同，骨髓瘤细胞的通量分布预测，除了从L-柠檬酸转运和谷氨分解中获得α-酮戊二酸外，该细胞还通过增加通过线粒体α-酮戊二酸/苹果酸转运蛋白（由Slc25a10/11基因表达）的通量来平衡其线粒体α-酮戊二酸的需求。这具有双重目的，进一步有助于维持合成代谢和维持细胞高糖酵解需求所需的氧化还原平衡。
最后，我们研究了多细胞模型中其他可能的细胞间代谢交换节点。我们的模型表明天冬酰胺在骨髓瘤细胞中显着乙酰化形成N-乙酰基-l-天冬酰胺的可能性（图6）。代谢物被BMMSC模型输出和吸收，其中反向乙酰化产生天冬酰胺和乙酸盐。在我们的模型中，这用于将其交换为细胞外丝氨酸，丝氨酸部分注定要产生丙酮酸，脂质，抗氧化剂和生物质。由于骨髓瘤细胞显示出生物质合成和能量需求中谷氨酰胺产生水平升高，因此如果没有外源性天冬酰胺，它们可能无法增殖。这表明需求超过了通过GS / ASNS途径可以产生的需求。因此，天冬酰胺是N-乙酰化的，使用乙酰辅酶A作为乙酰供体形成N-乙酰基-l-天冬酰胺。通过这种方式，细胞使用N-乙酰基-l-天冬酰胺衍生的天冬酰胺作为调节生物质合成和细胞增殖的因子。在我们的模型中，这种行为的存在是显着的，因为天冬酰胺已被理论化为增殖癌细胞的关键代谢物。
讨论
肿瘤代谢仍然是识别新药物靶点的令人兴奋的空间。然而，由于肿瘤内（包括邻近细胞）的代谢网络更全面，仅对癌细胞代谢的研究就存在识别癌细胞中冗余代谢酶的巨大风险[96]。了解这些代谢特征的生理学有望创建一种靶向方法，其中细胞间代谢串扰也代表了治疗操作的令人兴奋的空间，限制了肿瘤代谢网络并降低了癌细胞的弹性。
尽管由于无数的实验局限性，重新编程的代谢网络尚未完全理解，但我们可以通过计算机模型提供细胞代谢状态的见解[97-99]。数据整合的能力，以及这些模型中的细胞特异性，可以提供更广泛的图景，证明是实验学家的宝贵工具。此外，我们提出的管道（图2）也与在肿瘤微环境中模拟细胞代谢（构成复杂的适应性生态系统）的研究中相关，并且由于实验探测多种细胞类型之间的相互作用的困难仍然具有挑战性[99]。这种方法（图2）为已知算法提供了一种替代方案，这些算法牺牲了数据集成来换取还原技术。
我们提出的管道提供了解决多发性骨髓瘤领域已知差距的预测。我们重建了一个最先进的共培养计算机模型，以在基因组尺度上探测肿瘤代谢，同时提供必要的粒度来支持癌症和基质之间的细胞间代谢串扰在基于约束的建模框架的背景下。在我们的模拟中，我们预测单培养和共培养的最大计算机生长速率与实验对应物一致（图3A和3B）以及文献中报道的结果[65]。然而，有一个细微差别值得关注：HS-5模型的增长率与MM实验数据密切相关，有趣的是，MM模型的增长率反映了HS-5实验数据的增长率。乍一看，这似乎不一致，但重要的是要记住，两个模型的增长率都在实验误差范围内。这一细节非常重要，因为实验数据不能仅根据其生长速率对这些细胞类型进行分类区分，这表明生长速率可能无法作为细胞类型特定建模的稳健、独立的验证标准。此外，许多因素的潜在影响，包括体内条件和培养基的复杂性，都会影响这些速率。假设最大增长率可能是还原论，因为细胞群的目标可能会随着环境而变化[14]。因此，虽然我们不将增长率视为模型的唯一验证指标，但它是与我们的观察结果一致的不可或缺的组成部分。因此，我们也认识到扩展实验数据以包括各种不同介质的重要性，以更准确地评估我们模型的预测，因为我们的模型目前缺乏监管约束[14,100]。 因此，在未来的研究中，我们计划结合蛋白质组学和代谢学数据来帮助验证我们模型的预测，这已经显示出增强对实验观察到现象的支持的巨大潜力，特别是在模拟扰动对细胞代谢的影响时[100]。
考虑到模型的预测，我们进行了所谓的“表型调整”。这包括集成13C标记葡萄糖和谷氨酰胺数据以约束模型并产生生理相关的约束。我们的模型预测，骨髓瘤细胞可能表现出恶性肿瘤对糖酵解的潜在依赖，导致大量乳酸产生的影响，这与之前对多种癌细胞类型的许多研究一致[101,102]。 例如，有人假设乳酸不仅是恶性肿瘤高度糖酵解代谢的副产物，而且可以被其他细胞类型挽救，用于线粒体氧化能量的产生[28,103,104]。同样，以前也有人提出，乳酸可以由附近的基质细胞提供，原因相同 - 方向性取决于每个细胞的相对氧化还原状态[28,104]。此外，我们的模型预测，当共培养时，BMMSC和骨髓瘤细胞（分别为HS-5和JJN-3）形成跨越肿瘤微环境的代谢群落，而不是乳酸，如以前认为的那样，丙酮酸从基质被贩运到骨髓瘤，而不是在另一个方向（图6和7）。这种细胞间相互作用可以由对丙酮酸比乳酸具有更高亲和力的转运蛋白明确地仲裁，从而确定这些机制主要依赖于丙酮酸而不是先前假设的乳酸[28,103]。有趣的是，我们的计算模型预测骨髓瘤细胞导入的丙酮酸可能会支持细胞的合成代谢和能量产生。如果我们的计算机模型预测在实验测试中成立，结果表明另一种作用模式可能正在发挥作用，其目的是在有限的资源条件下支持细胞活力，从而优化代谢群落。此外，通过丙酮酸转运靶向，乳酸动力学可能是扰乱和增加骨髓瘤细胞对常规药物治疗的脆弱性的有力方式。这样的靶点来得及时，因为从历史上看，在靶向多发性骨髓瘤代谢时找到合适的治疗窗口一直具有挑战性，因为大多数药物都集中在其他正常组织共有的表型上。从多年来不成功的糖酵解抑制剂试验以及目前抗代谢物疗法（如5-氟尿嘧啶）观察到的副作用中可以明显看出这一点[105,106]。 这些药物缺乏肿瘤特异性，通常会导致明显的副作用[105,106]。
在过去的二十年中，癌症代谢研究的复兴得益于我们检测和量化数千种不同代谢物的能力的显着提高，以及测序技术的革命，导致代谢酶中肿瘤驱动突变的鉴定[107,108]。 我们的研究是开发靶向肿瘤代谢的新型药物的新动力的一部分。在这项研究中，我们提出了一种替代的计算机重建管道，并用它来生成由恶性浆细胞和BMMSC形成的代谢网络的第一个可测试的、集成的体外/计算机模型。据我们所知，基于体外数据开发的大多数数学模型都是在实验控制的条件下产生的，其中MM中恶性浆细胞的代谢表征了孤立生长的细胞系。尽管如此，如果实验系统更好地重新概括BM的环境，我们更有可能为新疗法开发确定有效的癌症特异性靶点。我们的集成多学科工作流程迭代利用工作台边研究和数学建模，可用于确定和测试未来药物干预的最合适靶点。将代谢组学、通量组学和生长相关数据以及其他相关组学数据引入 GEM 的重建和验证过程有助于提高使用我们的管道生成的任何模型的准确性和预测能力 [109]。如前所述，我们的工作流程可用于生成有用的计算机模型，以支持难以看到的行为，并在体外实验的同时预测其结果。
支持信息
补充资料 1.
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\documentclass{article}
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\begin{document}
\title{Supplementary Material 2}
\maketitle
\section*{Multi-Objective Pareto Optimisation {\&} Muti-Objective Flux Analysis}
\label{Supplementary:VFFVA}
In scenarios with multiple competing goals, the multi-objective Pareto approach proves particularly useful. This technique becomes critical in human metabolic network modelling, where several resource-competing enzymes or even cells are at play. By identifying optimal trade-offs, it is possible to maintain a balance between different cellular objectives. \bigbreak
In the context of our work, we propose that each cell type strives to optimise its own metabolic processes - from growth rate to energy production, and nutrient uptake. Yet, these objectives might not always align, necessitating a compromise. It achieves this by generating a set of non-dominated solutions, a collection where no single solution dominates the others in every objective, known as the Pareto-front. This front symbolises an optimal equilibrium between the competing objectives of different cells. Several techniques utilise the multi-objective Pareto optimisation principle. For our study, we chose the Multi-Objective Flux Analysis (MOFA) routine .\bigbreak
In general, MOFA aims to chart any $n$-dimensional surface of the Pareto front by calculating a large set of so-called Pareto solutions. This is especially useful for evaluating trade-offs between multiple biological objectives. This routine employs the Normalised Normal Constraint (NNC) method for Multi-Objective analyses, which ensures a comprehensive set of evenly distributed Pareto-optimal points, regardless of the differences in the magnitudes of the objectives under consideration. \bigbreak
To understand how, we begin by describing the steps of MOFA. Let us define a multi-objective optimisation problem as:
\begin{align}
\max_x \{ F_1(x) F_2(x) \cdot\cdot\cdot F_n(x)\}, n \geq 2;
\end{align}
subject to costrains:
\begin{align}
& g_j(x) \leq 0, \ \ \ 1 \leq j \leq r, \\
& h_k(x) = 0, \ \ \ 1 \leq k \leq s, \\
& x_{li} \leq x_i \leq s_{ui}, \ \ \ 1 \leq i \leq n_x.
\end{align}
Here the vector $x$ denotes the set of constraints and $F_i$, denotes the $i^{th}$ objective.
MOFA then finds the points that contain a set of maximum and minimum values of all objectives, through Fast Variability Analysis. It calls them Utopia Point:
\begin{align}
F^U = [F_1(x^{1*}) F_2(x^{2*}) \cdots F_n(x^{n*})],
\end{align}
and Nadir point:
\begin{align}
F^N= [F_1^N, F_2^N \cdots F_n^N],
\end{align}
where
\begin{align}
F_i^N = \max [F_i(x^{1*}) F_i(x^{2*}) \cdots F_i(x^{n*})], i \in \{1,2,..., n\}.
\end{align}
MOFA uses these points as a reference in the objective space as there isn't a way to simultaneously optimise all objectives. The normalised normal constraint (NNC) method uses the utopia point to normalise the space in each dimension (Flux Variablity Analysis). The difference between utopia and nadir yields the range for each dimension in objective space, a vector:
\begin{align}
\bar{F} = \left[ \begin{array}{c}
v_{1} \\
v_{2} \\
\vdots \\
v_{n} \\
\end{array} \right] = F^N - F^U,
\end{align}
which leads to:
\begin{align}
\bar{F}_i = \frac{F_i- F_i(x^{i*})}{v_i}, i \in \{1,2,...,n \}.
\end{align}
The routine then calculates reference vertices in objective space, known as anchor points. These points help define a utopia line vector and compute a normalised increment ($\delta$). The anchor points are calculated by individually minimising each objective $F_j$ subject top the problem constraints to obtain the $j^{th}$ anchor point: $F^{j*} (j = 1,2,...,n)$. \bigbreak
This whole process generates an objective function subject to a set of constraints, some original and some newly defined as part of the Multi-Objective problem formulation. The commonly accepted solution of such a problem is known as a Pareto optimal solution. In essence, it's a solution where improving one objective is only possible if at least one other objective deteriorates. The Pareto solution is obtained by solving a specific linear problem at each anchor point individually:
\begin{align}
& \min \bar{F}_n \\
& g_j(x) \leq 0, 1 \leq j \leq r, \\
& h_k(x) = 0, 1 \leq k \leq s, \\
& x_{li} \leq x_i \leq s_{ui}, 1 \leq i \leq n_x.
\end{align}
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S1 文本。 补充资料 1.
多目标帕累托优化和多目标通量分析。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011374.s001
（德克萨斯州）
S2 文本。13C-MFA 模型。
代谢通量分析。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011374.s002
（德克萨斯州）
S1 表。 补充信息 2.
计算机培养基。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011374.s003
（德克萨斯州）
S2 表。 补充信息 3.
13C-MFA 模型。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011374.s004
（德克萨斯州）
S3 表。 参数。
的通量13C-MFA 模型 T1。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011374.s005
（德克萨斯州）
S4 表。 参数。
的通量13C-MFA 模型 T2。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011374.s006
（德克萨斯州）
S5 表。 参数。
的通量13C-MFA 模型 T3。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011374.s007
（德克萨斯州）
S6 表。 参数。
的通量13C-MFA 模型 T4。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011374.s008
（德克萨斯州）
S7 表。 参数。
的通量13C-MFA 模型 T5。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011374.s009
（德克萨斯州）
S8 表。 变量。
的变量13C-MFA 模型。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011374.s010
（德克萨斯州）
引用
1.蒙塔内斯 R， 麦地那 马， 索尔 RV， 罗德里格斯-卡索 C.当代谢遇到拓扑时：调和代谢物和反应网络。传记。2010;32(3):246–256.密码：20127701
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
2.萨尔韦·新陈代谢一目了然。约翰·威利父子;2016.
3.新陈代谢与癌症之间的联系.基因开发 2012;26（9）：877–890.密码：22549953
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
4.García M. M， Pacheco M， Bintener T， Presta L， Sauter T. 生物质制剂对癌症代谢建模和药物预测的重要性。科学。2021;24(10):103110.
查看文章谷歌学术搜索
5.Lyssiotis CA，Kimmelman AC.肿瘤微环境中的代谢相互作用。趋势细胞生物学. 2017;27（11）：863–875.密码：28734735
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
6.Gouirand V，Guillaumond F，Vasseur S.肿瘤微环境对癌细胞代谢重编程的影响。前昂科尔。2018;8:117.pmid：29725585
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
7.张国荣， 范妮丝·骨髓基质微环境影响骨髓瘤体外治疗反应。白血病。2001;15(2):264–271.密码：11236942
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
8.科斯塔 A， 肖勒-达希尔尔 A， 梅希塔-格里戈里乌 F.活性氧和代谢对癌细胞及其微环境的作用。Semin Cancer Biol. 2014;25：23–32.密码：24406211
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
9.彼得洛娃五世，安尼基亚里科-彼得鲁泽利M，梅利诺G，阿梅里奥一世。缺氧肿瘤微环境。发生。2018;7(1):1–13.密码：29362402
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
10.苏巴尔斯基P，希尔RP。缺氧肿瘤微环境及转移进展。临床经验转移。2003;20(3):237–250.pmid：12741682
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
11.Mitsiades CS，Mitsiades N，Munshi NC，Anderson KC.专注于多发性骨髓瘤。癌细胞。2004;6(5):439–444.密码：15542427
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
12.Koh B， Jeon H， Kim D， Kang D， Kim KR. 成纤维细胞共培养对结肠癌细胞增殖、活力和药物反应的影响。肿瘤学杂志 2019;17（2）：2409–2417.密码：30675306
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
13.代谢物和肿瘤微环境：从细胞机制到全身代谢。纳特·梅塔布。2021;3(1):21–32.密码：33398194
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
14.维斯·A， Ito K， Hofmann S. 培养基对体外共培养系统中细胞相互作用的影响。前生物科技。2020;8:911.密码：32850750
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
15.Schüler J，Ewerth D，Waldschmidt J，W?sch R，Engelhardt M.多发性骨髓瘤的临床前模型：批判性评估。专家观点 生物学2013;13（sup1）：S111–S123.pmid：23742200
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
16.三木Y，小野K，畑S，铃木T，熊本H，笹野H共培养在模拟体内环境方面优于单细胞培养的优势。类固醇生化分子生物学杂志. 2012;131（3-5）：68–75.pmid：22265957
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
17.Firdous S，Srivastava SK，Saha S.系统生物学时代的癌症生物标志物。在：癌症研究中的系统生物医学方法。斯普林格;2022:51–70.
18.Altamirano á，Saa PA，Garrido D.推断人类肠道微生物组在时间和空间中的组成和功能：基因组规模代谢建模工具的综述。计算结构生物技术杂志2020;18：3897–3904。密码：33335687
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
19.凯莱赫·用同位素示踪剂探测代谢途径：来自哺乳动物代谢生理学的见解。Metab Eng. 2004;6（1）：1–5.密码：14734250
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
20.新泽西州克鲁格，拉特克利夫GR.代谢组织：代谢工程师的挑战。高级生物化学分子生物学. 2008;1：1–27.
查看文章谷歌学术搜索
21.Marco-Ramell A， Palau-Rodriguez M， Alay A， Tulipani S， Urpi-Sarda M， Sanchez-Pla A， Andres-Lacueva C. 用于代谢组学数据富集分析的生物信息学工具的评估和比较。BMC生物信息学。2018;19(1):1–11.密码：29291722
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
22.布斯SC，韦尔杰AM，特纳RJ。用于代谢组学实验二次分析的计算工具。计算机结构生物技术学报 2013;4（5）：e201301003.密码：24688685
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
23.Eichner J， Rosenbaum L， Wrzodek C， H?r-ing H-U， Zell A， Lehmann R. 通过使用InCroMAP软件对代谢组学，蛋白质组学，转录组学和基因组学数据进行集成富集分析和以途径为中心的可视化。J Chromatogr B. 2014;966：77–82.密码：24811976
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
24.Rajkumar SV，Kumar S.多发性骨髓瘤：诊断和治疗。梅奥临床研究 2016;91（1）：101–119.密码：26763514
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
25.勒布朗先生，勒布朗TW，布莱恩特AL，波拉克KI贝利德，小贝利德，史密斯SK。对我的多发性骨髓瘤生活经历的定性研究。在：肿瘤学护理论坛。2021.第151页。
26.吉尔纽斯 S，北卡罗来纳州孟希。多发性骨髓瘤诊断和治疗的挑战。白血病补充剂。2013;2（1）：S3–S9.密码：27175259
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
27.贝伦斯坦 R， 布劳 O， 诺盖 A， 瓦希特 M， 施密特-希伯 M， 佩祖托 A， 多尔肯 B， 布劳 IW.与多发性骨髓瘤细胞的乳酸交换上调骨髓基质细胞中的NF-κB活性。
28.藤原 S、和田 N、川野 Y、奥野 Y、菊川 Y、远藤 S、西村 N、上野 N、光也 H、畑 H. 乳酸是骨髓瘤细胞的假定存活因子，通过单羧酸转运蛋白被骨髓瘤细胞掺入 1.Exp Hematol Oncol.2015;4:1–8.密码：25909034
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
29.库内尔 A， 布劳 O， 诺盖 KA， 布劳 IW.多发性骨髓瘤中的Warburg效应及其微环境。医学研究拱门 2017;5（9）.
查看文章谷歌学术搜索
30.McNee G， Eales KL， Wei W， Williams DS， Barkhuizen A， Bartlett DB， Essex S， Anandram S， Filer A， Moss PAH， et al.组蛋白 H3 的瓜氨酸化驱动 MGUS 和多发性骨髓瘤中骨髓间充质干细胞产生 IL-6。白血病。2017;31(2):373–381.密码：27400413
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
31.Gnaiger E，Fasching M，Gradl L，Gradl P. Oxygraph-2k：开始高分辨率呼吸测量。线粒体生理学网络。2012;12(6):1–18.
查看文章谷歌学术搜索
32.Gnaiger E. 高分辨率呼吸测量法的进展：OROBOROS Oxygraph-2k。
33.费尔南德斯-加西亚 J， 阿尔特亚-曼萨诺 P， 普兰齐尼 E， 芬特 SM. 用于追踪体内哺乳动物细胞代谢的稳定同位素。趋势生物化学科学 2020;45（3）：185–201.密码：31955965
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
34.Higashi RM， Fan TW-M， Lorkiewicz PK， Moseley HN， Lane AN. 稳定同位素标记的示踪剂，用于通过 GC-MS 和 FT-MS 阐明代谢途径。代谢组学中的质谱。2014:147–167.密码：25270929
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
35.金泰， 宋SB， 金YB， 金伟杰， 李西.基因组规模代谢模型重建与应用研究进展.Curr Opin Biotechnol.2012;23(4):617–623.密码：22054827
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
36.奥普达姆 S， 里歇尔 A， 凯尔曼 B， 李 S， 齐林斯基 DC， 刘易斯 NE.对定制基因组规模代谢模型的方法的系统评估。细胞系统. 2017;4（3）：318–329.pmid：28215528
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
37.克拉夫、巴雷特·基因表达综合数据库。在：统计基因组学。斯普林格;2016:93–110.
38.王毅， 艾迪贾， 普莱斯ND.使用mCADRE重建126个人体组织的基因组规模代谢模型。BMC 系统生物学. 2012;6（1）：1–16.密码：23234303
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
39.布伦克 E， 萨胡 S， 齐林斯基 DC， 阿尔通卡亚 A， 德尔格 A， 米赫 N， 加托 F， 尼尔森 A， 普雷西亚特冈萨雷斯 GA， 奥里希 MK， 等.Recon3D可以三维查看人体新陈代谢中的基因变异。纳特生物技术公司。2018;36(3):272–281.pmid：29457794
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
40.Masid M，Ataman M，Hatzimanikatis V.通过使用redHUMAN降低基因组规模模型的复杂性来分析人类代谢。纳特公社。2020;11(1):1–12.
查看文章谷歌学术搜索
41.Aurich MK，Fleming RMT，Thiele I. MetaboTools：用于分析基因组规模代谢模型的综合工具箱。前生理学. 2016;327.密码：27536246
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
42.安东尼维奇先生癌症生物学家的 13C 代谢通量分析指南。实验分子医学 2018;50（4）：1–13.密码：29657327
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
43.年轻的京东。INCA：用于同位素非平稳代谢通量分析的计算平台。生物信息学。2014;30(9):1333–1335.pmid：24413674
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
44.顾春， 金国， 金伟杰， 金胡， 李茜.基因组规模代谢模型的现状和应用。基因组生物学. 2019;20（1）：1–18.
查看文章谷歌学术搜索
45.耿 J， 尼尔森 J.人类新陈代谢的计算机分析：基因组规模模型的重建，情境化和应用。Curr Opin Syst Biol. 2017;2：29–38.
查看文章谷歌学术搜索
46.Di Filippo M，Damiani C，Pescini D. GPRuler：代谢基因 - 蛋白质 - 反应规则自动重建。公共科学图书馆计算生物学. 2021;17（11）：e1009550.密码：34748537
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
47.汉密尔顿JJ，里德JL。促进重建基因组规模代谢网络的软件平台。环境微生物。2014;16(1):49–59.密码：24148076
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
48.奥尔特，蒂勒一世，帕尔森·什么是磁通平衡分析？纳特生物技术公司。2010;28(3):245–248.密码：20212490
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
49.利用基因组规模的代谢模型进行人类健康应用。Curr Opin Biotechnol.2020;66:267–276.密码：33120253
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
50.Tepper N， Noor E， Amador-Noguez D， Haraldsdóttir HS， Milo R， Rabinowitz J， Liebermeister W， Shlomi T. 稳态代谢物浓度反映了最大化酶效率和最小化总代谢物负荷之间的平衡。公共图书馆一号。2013;8(9）：e75370。密码：24086517
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
51.雷默斯A-M，雷默斯AC。振荡和增长系统中的稳态假设。J Theor Biol. 2016;406：176–186.密码：27363728
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
52.范比克 JHGM， 柯克伍德 TBL， 巴辛特怀特 JB.了解老年人的生理学：新陈代谢和耐力变化的计算建模。界面焦点。2016;6(2):20150079.密码：27051508
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
53.Ganter M，Bernard T，Moretti S，Stelling J，Pagni M. MetaNetX.org：用于访问，分析和操纵代谢网络的网站和存储库。生物信息学。2013;29(6):815–816.pmid：23357920
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
54.Aziz RK， Devoid S， Disz T， Edwards RA， Henry CS， Olsen GJ， Olson R， Overbeek R， Parrello B， Pusch GD， et al. SEED 服务器：高性能访问 SEED 基因组、注释和代谢模型。公共图书馆一号。2012;7（10）：e48053.密码：23110173
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
55.金久·凯格数据库。诺华发现Symp. 2002;247：91–100.密码：12539951
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
56.Hastings J，Owen G，Dekker A，Ennis M，Kale N，Muthukrishnan V，Turner S，Swainston N，Mendes P，Steinbeck C. ChEBI在2016年：改善服务和扩大代谢物收集。核酸研究 2016;44（D1）:D 1214–D1219.密码：26467479
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
57.Wishart DS， Tzur D， Knox C， Eisner R， Guo AC， Young N， Cheng D， Jewell K， Arndt D， Sawhney S， et al. HMDB：人类代谢组数据库。核酸研究 2007;35（1）:D 521–D526.pmid：17202168
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
58.斯温·Chemicalize.org：马文。ACS出版物;2012.
59.达马吉 M， 沃伊特科维亚克 JW， 吉利斯 RJ.癌症中的pH传感和调节。前生理学. 2013;4：370.密码：24381558
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
60.Fleming RMT，Thiele I. von Bertalanffy 1.0：COBRA工具箱扩展，用于热力学约束代谢模型。生物信息学。2011;27(1):142–143.密码：21115436
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
61.Jankowski MD，Henry CS，Broadbelt LJ，Hatzimanikatis V.复杂代谢网络热力学分析的组贡献方法。生物物理学杂志 2008;95（3）：1487–1499.密码：18645197
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
62.Weilandt DR，Masid M，Hatzimanikatis V.代谢途径的热力学。在：代谢工程：概念和应用。威利在线图书馆;2021:213–235.
63.Hyduke D， Schellenberger J， Que R， Fleming R， Thiele I， Orth J， Feist A， Zielinski D， Bordbar A， Lewis N， et al. COBRA Toolbox 2.0.2011.
64.Hgu133plus Carlson M. Affymetrix 人类基因组 U133 Plus 2.0 阵列注释数据（芯片 Hgu133plus2）。
65.Fouladiha H， Marashi S-A， Shokrgozar MA.骨髓来源间充质干细胞基于约束的代谢网络模型的重建和验证。细胞多产。2015;48(4):475–485.密码：26132591
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
66.罗尔夫森 O， 帕尔森 B?， 蒂勒 I.人类代谢重建侦察1指导了新型人类代谢功能的假设。BMC 系统生物学. 2011;5（1）：1–16.pmid：21962087
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
67.Tanabe S，Sato Y，Suzuki T，Suzuki K，Nagao T，Yamaguchi T.人间充质干细胞的基因表达谱用于鉴定早期和晚期细胞培养中的新标记。J 生化。2008;144(3):399–408.密码：18550633
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
68.Shaughnessy JD Jr， Zhan F， Burington BE， Huang Y， Colla S， Hanamura I， Stewart JP， Kordsmeier B， Randolph C， Williams DR， et al.高危多发性骨髓瘤的经过验证的基因表达模型是通过定位于1号染色体的基因表达失调来定义的。血。2007;109(6):2276–2284.密码：17105813
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
69.Nickel S， Steinhardt C， Schlenker H， Burkart W， Reuter-Oppermann M. IBM ilog cplex optimization studio.在： Angewandte Optimierung mit IBM ILOG CPLEX Optimization Studio.斯普林格;2021:9–23.
70.Gudmundsson S，Thiele I.计算高效的通量变异性分析。BMC生物信息学。2010;11(1):1–3.密码：20920235
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
71.格比拉·VFFVA：动态负载平衡可实现大规模磁通变异性分析。BMC生物信息学。2020;21:1–13.密码：32993482
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
72.Ataman M，Hernandez Gardiol DF，Fengos G，Hatzimanikatis V. redGEM：基因组规模代谢重建的系统还原和分析，以开发一致的核心代谢模型。公共科学图书馆计算生物学. 2017;13（7）：e1005444.密码：28727725
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
73.Ataman M，Hatzimanikatis V. lumpGEM：系统地生成子网和元素平衡的集总反应，用于目标代谢物的生物合成。公共科学图书馆计算生物学. 2017;13（7）：e1005513.密码：28727789
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
74.科尔特斯 J-C， 洛佩斯-纳瓦罗 E， 莫斯卡多-加西亚 A， 维拉纽瓦 米科 RJ.Calibración probabilística de un modelo de crecimiento del cáncer de vejiga teniendo en cuenta la incertidumbre de los datos.西班牙人工知识协会会议第十九章 20/21.2021:555-559.
75.吴淑贤， 王 L， 乔杜里 A， 马拉纳斯 CD.自然界中糖酵解替代品的帕累托最优性解释。科学代表 2019;9（1）：1–15.pmid：30796263
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
76.布坎南JM。帕累托最优性的相关性。J Confl Resolveut.1962;6(4):341–354.
查看文章谷歌学术搜索
77.吕克.帕累托最优性。在：帕累托最优性，博弈论和均衡。2008.第481–515页。
78.Griesemer M，Navid A. MOFA：COBRA工具箱的多目标通量分析。生物Rxiv。2021.
查看文章谷歌学术搜索
79.Deb K. 多目标优化。在：检索方法。斯普林格;2014:403–449.
80.Schellenberger J， Que R， Fleming RMT， Thiele I， Orth JD， Feist AM， Zielinski DC， Bordbar A， Lewis NE， Rahmanian S， et al.使用基于约束的模型定量预测细胞代谢：COBRA 工具箱 v2.0。纳特·普罗托克。2011;6(9):1290–1307.密码：21886097
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
81.马哈德万·替代最优解在基于约束的基因组规模代谢模型中的影响。Metab Eng. 2003;5（4）：264–276.密码：14642354
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
82.Gebert N，Rahman S，Lewis使用转录组和蛋白质组1008分析鉴定1009种细胞类型特异性代谢特征。当前协议。2021;1（9）：e245.密码：34516047
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
83.张春， 陈丽， 拉比诺维茨.代谢组学和同位素示踪。细胞。2018;173(4):822–837.密码：29727671
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
84.Grankvist N，Watrous JD，Lagerborg KA，Lyutvinskiy Y，Jain M，Nilsson R.通过深度13C标记分析人类细胞的代谢。细胞化学生物学. 2018;25（11）：1419–1427.密码：30270114
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
85.乔卡图卡拉姆A，金D-H，巴雷特议员，百年灵R，克里克DJ。代谢组学中的稳定同位素标记研究：代谢网络结构和动力学的新见解。生物分析。2014;6(4):511–524.密码：24568354
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
86.Antoniewicz MR，Kelleher JK，Stephanopoulos G.基本代谢物单位（EMU）：用于模拟同位素分布的新框架。Metab Eng. 2007;9（1）：68–86.pmid：17088092
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
87.斯凯汉 P， 斯托伦 R， 斯库迪耶罗 D， 蒙克斯 A， 麦克马洪 J， 维斯蒂卡 D， 沃伦 JT， 博克施 H， 肯尼 S， 博伊德 MR.用于抗癌药物筛选的新型比色细胞毒性测定。JNCI：国家癌症研究所杂志。1990;82(13):1107–1112.密码：2359136
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
88.奥雷利亚纳EA，卡辛斯基AL.细胞培养中的磺酰罗丹明B（SRB）测定以研究细胞增殖。生物协议。2016;6（21）：e1984.密码：28573164
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
89.Roecklein BA，Torok-Storb B.功能不同的人骨髓基质细胞系通过人瘤病毒E6 / E7基因的转导永生化。1995.
90.黄 J， 伍兹 P， 诺莫尔 D， 戈夫 JP， 贝诺斯 PV， 斯蒂勒 CJ， 斯坦曼 RA.下调雌激素受体和调节由旁分泌基质细胞信号介导的乳腺癌细胞系的生长。乳腺癌治疗。2017;161(2):229–243.pmid：27853906
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
91.德拉普恩特 P， 全 N， 胡 RS， 穆兹 B， 吉尔森 RC， 卢德勒 M， 金 J， 阿奇勒夫 S， 萨拉马 NN， 维杰 R， 等.新建立的骨髓瘤来源的基质细胞系MSP-1支持多发性骨髓瘤的增殖、迁移和粘附，并且比正常来源的基质更能诱导耐药性。血液学。2016;101（7）：e307.密码：27081175
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
92.希普曼CM，罗杰斯MJ，阿佩利JF，罗素RGG，裘槎PI。双膦酸盐诱导人骨髓瘤细胞系的凋亡：一种新的抗肿瘤活性。Br J 血马醇。1997;98(3):665–672.pmid：9332325
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
93.卡拉达格 A， 奥亚乔比 BO， 阿佩利 JF， 拉塞尔 RG， 裘槎 PI.人骨髓瘤细胞促进原代人成骨细胞产生白细胞介素6。Br J 血马醇。2000;108(2):383–390.密码：10691869
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
94.R? TB， Holien T， Fagerli U-M， Hov H， Misund K， Waage A， Sundan A， Holt RU， B?rset M. HGF和IGF-1与SDF-1α协同作用，通过合作激活p21活化激酶促进骨髓瘤细胞的迁移。实验血红醇。2013;41(7):646–655.密码：23499762
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
95.Ciccarone F， Di Leo L， Lazzarino G， Maulucci G， Di Giacinto F， Tavazzi B， Ciriolo MR. 乌头酸酶 2 抑制 MCF-7 细胞的增殖，促进线粒体氧化代谢和 ROS/FoxO1 介导的自噬反应。Br J 癌症。2020;122(2):182–193.密码：31819175
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
96.布瓦森D，叶古特金GG。腺苷代谢：癌症治疗的新兴概念。癌细胞。2019;36(6):582–596.密码：31821783
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
97.Perez-Ramirez CA，Christofk HR.研究干细胞代谢的挑战。细胞干细胞。2021;28(3):409–423.密码：33667361
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
98.新陈代谢与癌症：未来就是现在。Br J 癌症。2020;122(2):133–135.pmid：31819199
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
99.Giersch C. 代谢的数学模型。植物生物学. 2000;3（3）：249–253.密码：10837266
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
100.蒙特扎诺 D， 米克 L， 古普塔 R， 贝穆德斯 LE， 贝穆德斯 JC.使用蛋白质组学数据定义的客观函数进行通量平衡分析——暴露于甲氟喹的结核分枝杆菌的代谢。公共图书馆一号。2015;10（7）：e0134014.pmid：26218987
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
101.德拉克鲁斯-洛佩斯 KG， 卡斯特罗-穆尼奥斯 LJ， 雷耶斯-埃尔南德斯 DO， 加西亚-卡兰卡 A， 曼佐-梅里诺 J. 乳酸在肿瘤微环境的调节和治疗方法中。前昂科尔。2019;9:1143.密码：31737570
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
102.Acevedo-Acevedo S，Millar DC，Simmons AD，Favreau P，Cobra PF，Skala M，Palecek SP.代谢组学揭示了乳腺癌对共培养中淋巴内皮细胞代谢，代谢串扰和淋巴管生成信号的影响。科学代表 2020;10（1）：1–15.密码：33277521
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
103.本亚希亚 Z， 布莱克曼 MC， 哈梅林 L， 赞皮耶里 LX， 卡佩洛亚 T， 贝丁 ML， 瓦泽耶 T， 沙克曼 O， 松沃 P.MCT1抑制剂的体外和体内表征AZD3965证实了与乳腺癌治疗兼容的临床前安全性。癌症。2021;13(3):569.密码：33540599
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
104.Forte D， 加西亚-费尔南德斯 M， 桑切斯-阿奎莱拉 A， 斯塔夫罗普卢 V， 菲尔丁 C， 马丁-佩雷斯 D， 洛佩斯 JA， 科斯塔阿什， 特龙奇 L， 尼基托普卢 E， 等.骨髓间充质干细胞支持急性髓系白血病生物能量学，增强抗氧化防御和逃避化疗。细胞代谢表。2020;32(5):829–843.密码：32966766
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
105.Galluzzi L，Kepp O，Vander Heiden MG，Kroemer G.癌症治疗的代谢靶点。纳特雷夫药物迪斯科夫。2013;12(11):829–846.密码：24113830
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
106.Iwazaki A，Yoshioka M. 2'-脱氧胞苷降低5-氟尿嘧啶对小鼠骨髓瘤细胞的抗肿瘤作用。生物制药公牛。2010;33(6):1024–1027.pmid：20522971
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
107.贝利、德维利·2012年的瓦尔堡效应。Curr Opin Oncol.2012;24(1):62–67.pmid：22123234
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
108.Koppenol WH，Bounds PL，Dang CV. Otto Warburg对当前癌症代谢概念的贡献。纳特雷夫癌症。2011;11(5):325–337.pmid：21508971
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
109.Ghaffari P，Mardinoglu A，Nielsen J.癌症代谢：建模视角。前生理学. 2015;6：382.密码：26733270
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索