《免费医学论文-链条内酯在体外和体内显示出对锥虫寄生虫的活性，并导致克氏锥虫的形态和大小缺陷》期刊简介
免费医学论文-链条内酯在体外和体内显示出对锥虫寄生虫的活性，并导致克氏锥虫的形态和大小缺陷
抽象
动质体寄生虫引起的被忽视疾病是热带和亚热带国家的健康负担。需要创造安全有效的药物来改善治疗，这仍然是一个优先事项。微生物天然产物是化学多样性的来源，为识别新的候选药物提供了有价值的方法。我们最近报道了具有抗疟原虫活性的新型大环内酯类药物家族的发现和生物测定引导分离。从植物组织获得的真菌菌株 Strasseria geniculata CF-247251 的培养物中分离出四种强效抗疟大环内酯类药物 A-D 的新型家族。在本研究中，我们分析了这些链质体内酯对动质体原生动物寄生虫的活性，即布氏锥虫、多诺瓦利什曼原虫和克氏锥虫。 化合物对T的活性大多较低。b. brucei，但在临床相关的细胞内T中观察到链内酯C和D的显着生长抑制和选择性。克鲁兹和L.多诺瓦尼·阿姆斯蒂戈特斯与欧共体50值在低微摩尔范围内。化合物C对细胞内和锥体形式的T均起效和活性。克鲁齐。虽然未识别细胞周期缺陷，但通过微分干涉对比显微镜观察了明显的形态变化，并且在暴露于链内酯C时观察到较小和圆形的寄生虫。此外，化合物C降低了恰加斯病急性感染模型中体内寄生虫血症。因此，链内酯C是一种新型天然产物，对不同形式的T具有活性。克鲁兹在体外和体内。该研究提供了一种阻断新细胞感染的途径，这种策略可以额外有助于避免治疗失败。
作者摘要
动质体寄生虫是热带和亚热带国家的健康负担。动质体产生的重要人类疾病包括由原生动物布氏锥虫引起的非洲人类锥虫病、克氏锥虫感染引起的恰加斯病和利什曼原虫属寄生虫感染引起的利什曼病。我们之前报道了由具有抗疟原虫活性的真菌Strasseria geniculara产生的四种大环内酯类新家族的发现和分离。在本研究中，我们分析了这些链内酯对动质体寄生虫的活性。在测试的四种链球菌内酯中，C和D对细胞内T具有活性。克鲁兹和L.多诺瓦尼·阿姆斯蒂戈特斯与欧共体50值在低微摩尔范围内。化合物C对细胞内无鞭毛体和细胞外锥体形式的T均起效。Cruzi通过感染哺乳动物细胞在体外培养，并降低恰加斯病感染急性模型中的寄生虫血症。因此，链内酯C是开发治疗动质体疾病的新治疗策略的有希望的候选者。
数字
Fig 7图1表1图2Table 2Fig 3Table 3Fig 4Fig 5Fig 6Fig 7图1表1图2
引文： 博世-纳瓦雷特 C、佩雷斯-莫雷诺 G、安南 F、迪亚兹-冈萨雷斯 R、加西亚-埃尔南德斯 R、罗查 H 等人 （2023） 链球菌内酯在体外和体内显示出对抗锥虫寄生虫的活性，并导致克氏锥虫的形态和大小缺陷。PLoS Negl Trop Dis 17（9）： e0011592. https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0011592
编辑 器： 以色列希伯来大学哈达萨医学院查尔斯·
收到： 22月 2023， 14;接受： 八月 2023， 15;发表： 2023月 <>， <>
版权所有： ? 2023 博世-纳瓦雷特等人。这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。
数据可用性： 所有相关数据都在手稿及其支持信息文件中。
资金： 这项工作由红海和红银合作调查中心卡洛斯三世健康研究所资助 https://www.isciii.es/Paginas/Inicio.aspx - https://www.ricet.es/proyectos：RD16/0027/0014 （DGP）、RD16/0027/0015 （FV） 和 RD12/0018/0005 （FV）;MCIN/AEI/10.13039/501100011033 https://www.aei.gob.es/ayudas-concedidas/buscador-ayudas-concedidas：PID2019-109623RB-I00 （DGP）;MCIN/AEI/10.13039/501100011033和FEDER Una manera de hacer Europa https://www.aei.gob.es/fondos-europeos/fondos-feder：2016-79957-R （DGP）;安达卢西亚军政府 https://www.juntadeandalucia.es/organismos/universidadinvestigacioneinnovacion/servicios/procedimientos.html：BIO-199（LMRP）。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。
竞争利益： 提交人声明不存在相互竞争的利益。
介绍
利什曼病、锥虫病和恰加斯病是由动质体原生动物寄生虫引起的传染性热带病媒传播疾病。它们对发展中国家弱势群体的破坏性影响以及对研究计划的投资不足，使他们属于被忽视的热带病（NTDs）群体。在防治被忽视的热带病方面取得的进展减轻了人类和经济负担，但全世界仍有1.74亿人需要未来的干预措施。
利什曼病是由利什曼原虫属的20种不同种类的原生动物寄生虫引起的，这些寄生虫通过受感染的静脉白蛉叮咬传播。有三种主要疾病形式：内脏（也称为黑热病），皮肤和皮肤粘膜利什曼病。据估计，利什曼病每年新发病例为700万-000万例[1]。尽管有严重的副作用，但锑剂已被用于治疗这种疾病近1年。需要更短、更实惠、更安全、更容易给药的替代疗法来替代两性霉素 B 和米替福辛。
美洲锥虫病又称恰加斯锥虫病，是由锥蝽节肢动物传播的原生动物克氏锥虫引起的全身性疾病。恰加斯病是拉丁美洲最流行的传染性热带病。它在美洲21个国家流行，影响约6万人，每年导致12,000例死亡[2]。对于恰加斯病，缺乏足够的化疗;硝呋替莫司和苄硝唑剂量最终会导致不良反应，并在长期治疗后降低疗效。很少有化合物进入临床试验，不幸的是，重新定位的抗真菌唑类药物具有局限性。T的静止形式。克鲁兹使完全治愈进一步复杂化[3]。目前，大多数努力都集中在确定较短的治疗方案上，这些方案至少与今天的苄硝唑标准治疗一样有效，但副作用较少。在泊沙康唑临床试验失败后[4]，最新获批的昏睡病药物治疗非昔硝唑正在一项II期概念验证研究中作为恰加斯病的潜在药物进行评估[5]，而几个正在进行的先导性合作项目则寻求发现新的活性分子，排除那些抑制CYP51酶的分子[6-9]。
非洲人类锥虫病（HAT），通常称为昏睡病，是由寄生虫布氏锥虫T属的两个亚种引起的。b. 冈比亚人和 T.B. 罗得西亚，由采采蝇传播。HAT在撒哈拉以南非洲国家流行，年病例数从7000年的2012多例下降到1000年的不到2019例[10]，超过98%的感染归因于T。B. 冈比亚人。几十年来，可用于第二阶段HAT的唯一治疗方法是美拉胂醇和最近的依氟鸟氨酸，尽管需要长时间的治疗和肠胃外给药，但更安全。依氟鸟氨酸可用于单药治疗，但目前，与硝呋替莫（NECT）联合使用可降低灌注频率，并作为该疾病晚期的一线治疗。非昔硝唑于2021年被批准为T的两个阶段的首个口服治疗药物。B. 冈比亚昏睡病。目前，单剂量口服治疗药物acoziborole正在临床试验中进行评估[11]。
天然产物代表了药物发现的多样化、未开发和负担得起的化学起点的丰富来源。许多抗寄生虫药，特别是抗原虫药物是天然产物，如传统的抗疟药奎宁、氯喹和青蒿素。最近，从海洋生物和植物中分离出化合物产生了新的锥虫杀虫和抗利什曼原虫分子，如醌、倍半萜内酯、类黄酮、过氧化物和各种无细胞毒性或低细胞毒性的生物碱。不同类别的源自微生物的天然产物已显示出作为抗锥虫和抗利什曼原虫药物的潜力[12-25]。
以前，已经实施了一个强大的HTS平台来鉴定从微生物提取物中分离出的新型活性分子，用于对抗HAT、利什曼病、恰加斯病[26]和疟疾[27]。由于这一努力，我们最近报道了由具有抗疟活性的真菌Strasseria geniculata产生的由28种大环内酯类真菌产生的由29种大环内酯类药物组成的新家族的发现和生物测定引导分离[<>]。这些化合物是恶性疟原虫红细胞内阶段的有效抑制剂，其中两种化合物在该病的小鼠模型中显示出有希望的药代动力学特征和体内疗效[<>]。
在这里，我们报告了这些大环内酯类药物对动质体原生动物寄生虫（即T）的有希望的活性。b. 布鲁塞， L.多诺瓦尼和T.克鲁兹并分析暴露时细胞周期和寄生虫形态中潜在扰动的发生。这项工作还突出了这些新发现的分子与一组对动质体有活性的参考药物之间作用方式的差异。
材料和方法
道德声明
在纽约大学医学院（美国）监测体内疗效。这项研究是根据美国国立卫生研究院（美国）实验动物护理和使用指南中的建议进行的。该协议已获得纽约大学医学院机构动物护理和使用委员会的批准，该委员会已获得国际实验动物护理评估和认证协会的全面认可。
试剂
胎牛血清（FBS）和RPMI 1640培养基，丙酮酸钠，青霉素链霉素和L-谷氨酰胺，从Invitrogen Gibco购买，包括LIT，RPMI 1640改性培养基和HMI-9培养基在寄生虫学和生物医学研究所“López-Neyra”的组织培养设施制备。Surfact-Amps NP40由Thermo Scientific提供，Tween 20由Merck提供。十二烷基硫酸钠（SDS）购自Affymetrix。氯酚红-β-D-吡喃半乳糖苷（CPRG）、刃天青钠盐、两性霉素B、对甲醛、羟乙基磺酸喷他脒盐、苄硝唑、硝呋替莫司、泊沙康唑、ATP二钠盐、碘化丙啶、鬼臼毒素、牛胰腺核糖核酸酶A（RNase A）、佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯（PMA）、3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化物（MTT）和二甲基亚砜（DMSO）。CellTiter-Glo发光细胞活力测定从Promega公司购买，4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）延长从分子探针购买。
菌株和培养基
使用适应体外培养的寄生虫菌株。T. b.布鲁西Lister 427血流形式寄生虫（有关该菌株的身份和谱系的信息可在洛克菲勒大学网站上找到[30]）在补充有9%热灭活胎牛血清（iFBS）的HMI-10培养基中生长。
使用的克氏锥虫图拉胡恩菌株是一种表达大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因lacZ的转基因菌株[31]。它由Marcel Kaiser（瑞士热带和公共卫生研究所）慷慨提供。T.克鲁兹在补充有 4% 灭活 FBS （iFBS）、1640.10 mM L-谷氨酰胺、1 U/mL 青霉素和 7 U/mL 链霉素的 RPMI-100 中培养 Tulahuen C100 菌株，温度为 37°C 和 5% CO2.从ATCC购买L6大鼠骨骼肌细胞（参考CRL-1458），并用作转基因T感染的宿主细胞。克鲁兹锥体鞭毛虫。表鞭毛是在10°C下用28%iFBS在LIT培养基中从锥体鞭毛体形式分化而获得的。
利什曼原虫多诺瓦尼如上所述，获得具有荧光素酶基因整合到寄生虫基因组中的MHOM/ET/67/HU3细胞[32]。寄生虫在28°C下在RPMI 1640修饰的培养基中生长，并补充有20%热灭活胎牛血清（iFBS，Invitrogen）和100mg / ml潮霉素B。
人骨髓单核细胞系THP-1（来自ATCC，参考TIB-202）在37°C和5%CO下生长2在补充有 1640% iFBS、10 mM 谷氨酸、2 U/mL 青霉素和 100 mg/mL 链霉素的 RPMI-100 中。
克氏锥虫锥鞭毛虫活力测定
图拉胡恩·在6°C下6小时后，从收获的感染L3细胞培养物的上清液中回收克氏锥体鞭毛体。 密度为 37 × 90 的 5 μL 寄生虫培养物6将RPMI 1640培养基中的细胞分配到含有96μL每种化合物的10个Nunc平底测定板中。
在24°C的48%CO中孵育72、37和5小时时评估寄生虫活力2向白色 50 孔微孔板中加入 96 μL 细胞滴定-Glo 活性试剂。信号稳定后，读取生物发光。化合物浓度范围为0.1μM至50μM，孔中最终最大DMSO百分比为0.05%。将结果归一化为阴性（50μM硝呋替莫）和阳性对照柱在每个板中。
在荧光测定中，将板孵育24和48小时，然后将10μL刃天青溶液加入每个孔中。将板进一步孵育24小时，并使用Tecan Infinite 550酶标仪在590/200nm处测量荧光。使用400 μM的苄硝唑作为100%的活力损失对照，并在降低浓度下进行分析以确认报告的EC50值 [7,33]。孔中最终最大DMSO百分比为0.1%，化合物浓度范围为0.2至100μM。
克氏锥虫表鞭毛虫生长抑制试验
在含有96 μL测试化合物的10孔微孔板中建立基于刃天青的测定，浓度范围为0.39至200μM，对数期寄生虫接种于2×105每孔细胞，最终体积为100μL。井中DMSO的最大百分比为0.2%。包括正增长和负增长对照。在72°C下孵育28小时并振荡轨道后，向每个孔中加入10μL刃天青溶液，并将板返回培养箱4小时。通过在Tecan Infinite 550酶标仪中分别以590和200nm为中心的激发和发射波段进行荧光测量，刃天青还原与细胞活力相关。使用400μM的苄硝唑作为负生长对照，并在降低浓度下确认报告的EC50值 [33,34]。
ATP细胞内水平的定量
使用CellTiter-Glo测定法测定ATP。建立了T的最佳读出条件和测定的线性。克鲁兹表鞭毛通过测试不同的细胞密度。该测定是线性的，每孔最多100,000个细胞（90μl）。将每孔50,000个细胞（来自对数期培养物）分配到含有96μl链条内酯C的10孔白色平底微孔板中，浓度范围为0.4至6.25μM，并在28°C下通过轨道振荡生长72小时。使用每孔0μlLIT培养基中1.100至90pmol的ATP二钠盐浓度获得ATP标准曲线。样品和标准品一式三份测定。将 70 μL CellTiter-Glo 溶液加入处理过的和对照寄生虫以及标准曲线孔中，并在 Tecan Infinite 15 酶标仪中孵育 200 分钟后记录发光检测。
β-D-半乳糖苷酶转基因T.克鲁兹测定
使用赛默飞世尔科技多滴组合分液器分液 55 μL T。克氏菌感染的L6细胞（2×103每孔细胞）放入384孔康宁检测板中，该检测板已经含有5μL每种化合物，浓度范围为0.0015至50μM和对照。将板在 37°C 下孵育 96 小时，向每个孔中加入 15 μL 裂解缓冲液（0.5 mM CPRG，0.5% NP 40），并在黑暗中进一步孵育 4 小时。在Perkin Elmer Envision酶标仪中测量585nm处的吸光度。使用40μM的苄硝唑作为负生长对照。
杀伤率
对于杀伤率实验，体外对抗细胞内T的活性。Cruzi amastigotes在早期时间点进行了分析：24,48和72小时。标准比色转基因测定以 96 孔形式建立，化合物的连续稀释和每孔的最终最大 DMSO 百分比为 0.05%。在这些实验中，L6宿主细胞作为阴性对照包括在内，并使用Versamax酶标仪（分子装置）在585nm处监测CPRG转化。
基于刃氮杂的T.B. 布鲁塞检测
使用多滴分配器（45μL，500血流T。B. Brucei 寄生虫每孔）到已经含有 384 μL 每种化合物和对照的 5 孔康宁测定板中，并在 72°C 下孵育 37 小时。 每孔加入 10 μL 刃天青，并将板在 6°C 下进一步孵育 37 小时。 最终荧光在550-590nm处测定。40 nM和0.0067%DMSO的喷他脒分别用作负和正生长对照。
多诺瓦尼乳杆菌细胞内无鞭毛体测定
THP-1 细胞在 20 孔板中以 96 × 3 分化为具有 10 ng/mL PMA 的巨噬细胞4每孔细胞48小时，然后在新鲜培养基中培养24小时。然后用转基因固定L感染细胞。多诺瓦尼MHOM/ET/67/HU3 原鞭毛体在感染多重性 （MOI） 为 10 时表达荧光素酶基因。向每个孔中加入100μL含有测试化合物的培养基，并将板在37°C下孵育72小时。使用Promega试剂盒荧光素酶测定系统测量发光。
细胞毒性评估
将1640微升含有化合物和对照的补充RPMI 6培养基加入先前接种在4孔微孔板中的L000大鼠肌母细胞（每孔96,72个细胞）中。在37°C下20小时后，通过刃天青还原确定活细胞数。将 0 μL 11.1 mg/mL 的刃天青加入 PBS 2X 中，并在 37°C 下在黑暗中孵育 570 小时。 通过在Tecan Infinite F590酶标仪中测量200-<>nm处的最终荧光来估计细胞活力。
如前所述，使用基于比色MTT的测定法测定人巨噬细胞宿主TPH-1细胞系中化合物的细胞毒性[35]。
THP-1细胞接种于3 × 104在96孔板中将细胞/孔分化为巨噬细胞，用20ng / ml PMA处理48小时，然后在新鲜培养基中孵育24小时。以增加浓度加入Stasseriolides至50μM，并将细胞进一步在37°C下孵育72小时.向每个孔中加入10μLMTT（PBS溶液为5mg / mL），并将板在8°C下再孵育37小时。 通过加入 50 μL 20% SDS 溶解甲臜晶体，并使用酶标仪在 595 nm 处读取吸光度。
荧光激活细胞分选 （FACS） 分析
FACS分析用于研究细胞周期进程和细胞参数，如大小和复杂性。5 × 106 在存在和不存在测试化合物的1孔板中孵育000小时后，通过在4,72×g和6°C下离心收获克氏锥虫表鞭毛虫。用5mL PBS洗涤细胞沉淀，并在-70°C下固定在20%冰冷乙醇/ PBS溶液中过夜。然后通过离心收集细胞，用PBS洗涤，并在含有40μg/ mLRNase A的PBS中用10μg/ mL碘化丙啶染色37分钟。使用BD CellQuest Pro版30.4.0软件使用Becton Dickinson FACSCalibur监测荧光，每个样品总共采集2,10个事件。不同的细胞群以及平均细胞参数由FlowJo软件确定。
显微镜分析
用于形态表型分析和通过FACS进一步确认细胞周期分析，T。在存在和不存在药物的情况下，将Cruzi表鞭毛在72孔板中生长6小时。简而言之，1 × 106收获每种条件的寄生虫并在4°C下固定在4%对甲醛中20分钟，用冷PBS洗涤两次，并放置在聚-L-赖氨酸包被的载玻片上。随后在甲醇中脱水，对寄生虫样品进行染色并用DAPI延长安装。使用徕卡DMi8显微镜在305 LED激发模式下以平铺扫描模式采集数字图像，以量化寄生虫种群的DAPI染色细胞核和动质体。透射光显微镜用于获取微分干涉对比（DIC）图像（在两个独立实验中>80个单个细胞）。
经过测试的化合物
如前所述，从真菌菌株Strasseria geniculata CF-95的培养物中获得1种新大环内酯类药物的样品（>247251%，参见S28图中的HPLC迹线）[100]。这种真菌菌株是从新西兰Mimiha收集的一种未命名植物根部活组织的内部碎片中分离出的轴烯培养物，属于MEDINA基金会的收藏。在DMSO中以40 mM制备链内酯的储备溶液，然后根据需要在培养基中进一步稀释。硝呋莫司，泊沙康唑和苄硝唑的溶液分别在DMSO中以50,192和<>mM制备，然后在培养基中稀释至最终工作浓度。
数据分析
根据以下等式使用板内阴性和阳性对照对化合物活性进行归一化：其中Abs
井是特定孔的吸光度值，AbsPOS和腹肌负分别是阳性和阴性对照测量的平均吸光度。
结果以 EC 表示50值，表示与未处理的对照细胞相比，使细胞生长减少50%的化合物浓度。
对于 384 孔检测，EC50每种化合物从16点剂量反应曲线计算，而对于96孔测定，使用SigmaPlot软件分析10点剂量反应曲线。所有欧共体50值代表至少三个生物学重复的平均值。
使用SigmaPplot软件从4参数logistic函数回归中获得山坡，该回归拟合实验剂量反应数据，而EC则90值是用GraphPad软件计算的。
统计分析
数据绘制为每个组的平均值 ±S.D.。IBM SSPS Statistics 版本 26 用于使用 Student's t 检验比较数据集。当Levene的正态性检验或Kolmogorov-Smirnov检验失败时，应用Welch的双样本t检验。p 值 ≤0.05 被认为具有统计显著性。
体内药理实验
体内实验在纽约大学医学院的抗感染筛选核心服务设施中进行。使用表达萤火虫荧光素酶的转基因巴西克氏锥虫菌株[36,37]。每组2只雌性BALB / c小鼠感染10×<>6 T. cruzi 锥鞭毛虫。在治疗组中，斯特拉西里酯C治疗在感染后72小时开始，在载体中腹膜内（ip）剂量为50mg / Kg（0.5%羟甲基纤维素+ 0.5%吐温-80），并连续重复持续150天。定量基于在PBS中腹膜注射0mg / Kg D-荧光素钾盐后寄生虫的荧光素酶活性。在第五天使用IVIS Lumina II成像仪测量发光。仅用载体（5.0%羟甲基纤维素+ 5.80%吐温-30）或<>mg / kg苄硝唑腹膜内剂量治疗<>天的组分别用作阴性和阳性对照。
结果和讨论
抗寄生虫活性
锥虫具有复杂的生命周期，在昆虫媒介和脊椎动物宿主之间有不同的阶段。针对哺乳动物阶段的体外测定 T.克鲁齐，L.多诺瓦尼和T.B. brucei寄生虫以384孔形式开发，使用T的细胞内无鞭毛体形式。克鲁兹和L.多诺瓦尼和T的血流形式。b.布鲁西。这些生物测定获得的Z评分分别为0.83、0.70和0.74[26]。
原生动物寄生虫T中新发现的1种大环内酯类药物（图1）的生物学评价。b. 布鲁塞， L.多诺瓦尼和T.cruzi显示斯特拉西内酯A的活性低，而高活性的链条内酯B对细胞内L的效力比C或D高两个数量级以上。多诺瓦尼和T.克鲁兹如表29所示。然而，B以混杂化合物的形式出现，据报道在体内有毒[<>]。
缩略图 下载：
.PPT幻灯片
.PNG大图
.TIFF原始图像
图1. 链球菌内酯A-D的结构
https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0011592.g001
缩略图 下载：
.PPT幻灯片
.PNG大图
.TIFF原始图像
表 1. 电子商务50原生动物寄生虫中链球菌A-D的值。
https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0011592.t001
我们之前已经表明，从真菌Strasseria geniculata CF-247251中分离出的四种大环内酯类，即Stasseriolides A-D，表现出EC50针对恶性疟原虫菌株0D013全寄生虫的数值在9.810-3.7μM之间[28]。在本研究中，化合物对T的活性大多较低。b. brucei，但在临床相关的细胞内T中观察到链内酯C和D的显着生长抑制。克鲁兹（图2）和L.多诺瓦尼·阿姆斯蒂戈特斯与欧共体50T 的值。如表1所示，克氏菌处于低微摩尔范围，因此效力与苄硝唑相似[7]。两种HTS检测均利用转基因寄生虫，可对组织培养细胞中的增殖进行比色和发光定量[31,38]。
缩略图 下载：
.PPT幻灯片
.PNG大图
.TIFF原始图像
图2.
T的剂量反应曲线。用链球菌A-D处理96小时后的克氏细胞内无鞭毛虫。生长抑制已通过 β-D-半乳糖苷酶转基因 T 后读出的 CPRG 比色法进行定量。克鲁兹测定。条形表示从至少三个生物重复计算的 16 个浓度点中每个浓度点的平均值 （± SD）。
https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0011592.g002
发现化合物C和D的选择性指数以抑制浓度与L6细胞的比率计算，T的选择性指数超过15倍。克鲁齐在L.多诺瓦尼寄生虫与TPH-1宿主细胞相比，链球菌内酯C和D的值分别为68和37。这些数据与先前报道的HepG2细胞系细胞毒性评估[28]一起强调了这些分子的总体选择性抗原虫作用，如表2所示。
thumbnail 下载：
.PPT幻灯片
.PNG大图
.TIFF原始图像
表 2. 四种分离的大环内酯类药物的细胞毒性。
https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0011592.t002
进一步关注T的细胞外形式。在建立线性、溶剂效应和孵育时间的最佳条件后，将Cruzi寄生虫和锥体鞭毛体和表鞭毛体测定以96孔形式建立（参见S2和S3图以及材料和方法中的详细信息）[39]。
因此，B的全局高活性在T的细胞外形式中得到证实。克鲁兹与欧共体50表鞭毛体的值低于 0.4 μM，非复制性感染性锥体鞭毛体的值低于 0.2 μM，而 T 的最大有效活力损失减半。具有链条内酯A的克氏锥体鞭毛细胞不能在25μM下实现。化合物A对寄生虫表鞭毛体形式的体外评估也表明中等功效（在50μM浓度下暴露72小时后细胞生长减少小于50%）（表1）。
考虑到该生命阶段对不同化合物的耐药性以及在体内评估后期缺乏疗效的潜在关系，抗色鞭毛体测定很重要[7]。进一步的分析表明，在3°C孵育4小时后，3.8μM的链条内酯D和50.72μM的链条内酯C导致感染性锥体鞭毛虫的活力丧失37%。 因此，这两种化合物除了作用于细胞内T.Cruzi amastigotes可以在受感染的人类细胞崩溃后杀死新出现的锥体鞭毛虫寄生虫，从而可能限制健康宿主细胞的再感染。
链内酯C和D对T的效果略差。Cruzi表鞭毛在基于刃天青的测定中显示出中等活性，通过使用Neubauer室和发光二次测定的目视计数得到证实。值得一提的是，可测量的针对细胞外表鞭毛的体外活性已被假定为区分CYP51作用方式分子的独特特征[40]。
链球菌内酯是速效T。克氏抑制剂
如图3所示，通过监测加入活性试剂后的生物发光，即使在孵育短至24小时的情况下，化合物C也证实了上述报道的针对非复制性色鞭毛体的低微摩尔锥虫杀活性。泊沙康唑、硝呋替莫司和苄硝唑也作为对照以剂量依赖性方式进行比较。
thumbnail 下载：
.PPT幻灯片
.PNG大图
.TIFF原始图像
图3. 对T的作用率。克鲁兹锥体鞭毛虫。
（A）不同浓度的链西瑞内酯C、苄硝唑和硝呋替莫司对T的影响。克鲁兹锥体鞭毛体生存能力。通过发光法测量24,48和72小时药物治疗后活力损失，其1/2系列浓度范围为50μM的Stasseriolide和苄硝唑以及硝呋替莫的10μM。结果对应于 3 次重复的平均值，误差线表示标准偏差。（B）对细胞外形式的T的最大活性百分比。Cruzi在用24μM苄内酯C（蓝色条），48μM苄硝唑（绿色条），50μM硝呋替莫（红色条）或50μM泊沙康唑（紫色条）处理10和2小时后达到锥鞭毛体形式的寄生虫的杀伤率实验。
https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0011592.g003
剂量-反应曲线的陡度由希尔斜率量化。与对T有活性的参考药物硝呋替莫司和苄硝唑（图3A）不同，斯特拉西里酯C表现出急剧的活力损失。根据丘陵斜率计算，化合物C在4和1小时时分别为6.3和48.72，而对于苄硝唑和硝呋替莫，斜率因子在两个时间点都低于2.1（表3）。链条内酯C的更快行为转化为较低的EC90/电子商务50比率：1 小时和 7 小时分别为 1.4 和 48.72，而每个时间点的苄硝唑比率分别为 3.8 和 3.0。硝呋替莫 EC90/电子商务50比率也更高（3小时和6小时分别为3.3和48.72）。相比之下，CYP51抑制剂泊沙康唑对这些细胞外形式的寄生虫没有影响（图3B），这与先前报道的数据一致[7]。考虑到泊沙康唑等唑类药物在临床试验中的失败，降低作用于寄生虫14-α-去甲基化酶（TcCYP51）的慢效药物（TcCYP41）的优先级很重要[51]。虽然TcCYP42抑制剂最初被确定为有前途的抗恰加斯类药物，但现在已知它们对非复制性锥体鞭毛虫和缓慢分裂的寄生虫菌株缺乏活性是导致这种失败的原因之一[<>]。
thumbnail 下载：
.PPT幻灯片
.PNG大图
.TIFF原始图像
表 3. 斯特拉西瑞内酯C，苄硝唑，硝呋替莫司和泊沙康唑对T的药物疗效。Cruzi amastigotes和Trypomastigotes。
https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0011592.t003
表3总结了链内酯C和参考EC的50增加暴露时间时色鞭毛体的值与基于刃天青的测定中获得的值一致。山坡和EC山坡90/电子商务50每种药物的比率也标明。
还使用增加剂量的化合物C和参考药物监测杀灭速率实验中的无鞭毛体生长抑制（图4A和表3）。为细胞内形式的T获得的生长抑制百分比。用24μM苄内酯C，48μM苄硝唑，72μM硝呋替莫司或50nM泊沙康唑处理50,20和100小时后的cruzi如图4B所示。
thumbnail 下载：
.PPT幻灯片
.PNG大图
.TIFF原始图像
图4. 对T的作用率。克鲁兹·阿马斯蒂戈特斯。
（A）复方剂量与T之间的时间依赖性相关性。暴露 24、48 和 72 小时的 Cruzi amastigote 生长抑制绘制为 10 点剂量反应曲线。指示在较高浓度下暴露24,48和72小时后获得的泊沙康唑的剂量反应数据。（B）对细胞内形式的T的最大活性百分比。用24μM链内酯C（蓝条），48μM苄硝唑（绿条），72μM硝呋替莫（红条）或50nM泊沙康唑（紫色条）处理50,20和100小时后获得的cruzi在与无鞭毛体形式的寄生虫的杀灭率实验中。
https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0011592.g004
因此，链内酯C表现为速效化合物，其方式与苄硝唑和硝呋替莫司相似。对于泊沙康唑，欧共体5024小时时的值显著增强，从而证明其作用较慢[40,43]。链条内酯C的高速作用及其对锥体鞭毛期T的显着活性。克氏寄生虫是将该化合物与CYP51抑制剂区分开来的理想特性，从而最大限度地减少复发的可能性，并增加体内疗效模型中的成功概率[42,44,45]。
细胞周期不受链条内酯处理的干扰
考虑到链内酯A具有中等活性，并且先前的体内结果表明，链条内酯B在小鼠模型中是有毒的[29]，我们将注意力集中在使用T进行形态学和细胞周期研究的链条内酯C和D上。克鲁兹表鞭毛。此外，这两种新型抗原虫分子已被证明是安全的，并且在中等（链内酯C）和低（链西瑞内酯D）肝微粒体清除率下具有理想的药代动力学特征[29]。中清除率的Strasseriolide C可能具有足够的代谢稳定性，具有潜在的体内疗效，但可能的毒性风险较低[29]。
对于细胞周期分析，克氏锥虫的表鞭毛复制形式暴露于两种不同的抑制浓度的链球菌内酯C和D，EC30和欧共体70，以分析轻度和高暴露的条件。这些值是根据用四参数逻辑函数回归拟合获得的剂量反应曲线计算得出的，化合物D分别为36μM和68μM，化合物C分别为28μM和47μM。不同的表鞭毛T.通过DAPI染色观察到的克氏菌群根据细胞核（N）和动质体（K）的数量通过显微镜进行分类。分析正常细胞期（如1N1K，1N * 1K*，1N * 2K和2N2K）以及异常群体（例如2N1K或0N1K）。未经治疗的表鞭毛醭毛的种群分布与先前观察到的一致[46]。
使用处理和未处理的寄生虫培养物进行实验，并针对每种条件分析至少80个细胞。然而，在72小时后比较处理和对照寄生虫群后，细胞周期没有显着差异（图5A）。
使用用链内酯C和D处理的表鞭毛体流式细胞术进行细胞周期评估得出了类似的结果（图5B和5C）。
thumbnail 下载：
.PPT幻灯片
.PNG大图
.TIFF原始图像
图5. T的细胞周期进程。药物暴露 72 小时后出现十字鞭毛。
（A）带有DAPI染色的荧光显微镜。条形表示从两个独立实验计算的平均值 （± SD），分别占每个条件至少 80 个细胞。（B） 用碘化丙啶染色进行 FACS 分析。条形表示从两个独立实验计算并使用 Flow Jo 软件分析的平均值 （± SD）。（C）获得的荧光直方图的叠加，用于对照和处理用碘化丙啶染色的固定寄生虫。
https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0011592.g005
形态学研究
表鞭毛T的大小和复杂性。通过侧向（SSC）和正向散射（FCS）流式细胞术评估治疗72小时后的克氏体型。苄硝唑在欧共体30电子商务70和欧共体90（分别为7.5、22.5和96μM）浓度作为对照。
有趣的是，用30%抑制浓度的链条内酯C和D处理的寄生虫的细胞大小显着减小.在这两种情况下，未处理的寄生虫的大小减小估计百分比均为16%。暴露于较高浓度（EC70）进一步增强了寄生虫大小的扰动，在用C和D处理22小时后分别降低了24%和72%（图6A和6B），而苄硝唑（Bnz）使表鞶体大小减小了17.2%，但致死剂量仅为96μM，与之前描述的相似[34]。然而，由于在较低浓度的苄硝唑下没有显着减少，观察结果表明这些大环内酯类药物对细胞大小的特定影响，与它们对细胞增殖的影响无关。
事实上，通过微分干涉对比显微镜观察了突出的形态变化。图6C显示了在EC暴露后较小和圆形的寄生虫70浓度。
thumbnail 下载：
.PPT幻灯片
.PNG大图
.TIFF原始图像
图6. 克氏锥虫表鞭毛虫在药物暴露 72 小时后尺寸减小。
（A）使用流式细胞术收集和分析细胞参数。星号表示学生 t 检验计算的相对于对照寄生虫的前向散射 （FSC） 强度几何平均值的显著差异：* p< 0.05，** p< 0.01。条形表示从两个独立实验计算并使用 Flow Jo 软件分析的平均值 （± SD）。（B）直方图显示用单剂量（EC30蓝色或欧共体70黄色）的链内酯D和C，上图和下图，分别相对于对照寄生虫。（C）EC用链内酯C处理72小时后固定细胞的荧光和微分干涉对比（DIC）显微镜70剂量与各自的对照细胞。细胞核（N）和动质体（K）用DAPI染色。使用徕卡DMi8倒置光学显微镜采集数字图像。棒材，10 μm。
https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0011592.g006
T形态缺陷的原因。在暴露于这些新化合物时观察到的Cruzi寄生虫仍有待确定，但这些观察结果可能表明膜功能改变或代谢失衡。
为了确定ATP的产生是否受到这些化合物的影响，我们测量了T的细胞内水平。克鲁兹表鞭毛。用斯特拉西里酯C以72.0至4.6μM的剂量处理25小时后，用多通道移液器加入70μl细胞滴度Glo试剂。将板在28°C下孵育10分钟，然后记录发光。在ATP校准曲线中插值发光相对光单位（RLU）值（S4A图），并量化每孔ATP的pmol。考虑到由于链条内酯C活性引起的增殖抑制，通过使用相差显微镜在Neubauer室中计数来确定的寄生虫数量的值进行归一化。斯特拉西里酯C处理导致细胞ATP池的离散减少（S4B图）。
体内研究
以前，链条内酯A-D在体外没有细胞毒性，没有心脏毒性，也没有药物相互作用。此外，在伯氏疟原虫小鼠模型中，有报道称链内酯C和D在体内表现出抗原虫活性[29]。考虑到后者化合物对T的突出活性。Cruzi，这些化合物之一，C在初步体内药效实验中进一步研究。对照载体和苄硝唑分别作为感染和有效治疗的对照纳入研究。
与对照载体相比，观察到体内寄生虫血症降低，如发光任意单位的测量所示（图7），从而说明该结构类别的化合物在该疾病的动物模型中也具有有希望的活性。
thumbnail 下载：
.PPT幻灯片
.PNG大图
.TIFF原始图像
图 7. 表示斯特拉西里酯C治疗5天后小鼠体内疗效。
小鼠感染转基因T。Cruzi线并在感染后72小时用50mg / kg的链条内酯C（5次重复）连续30天处理。使用载体和<>mg / kg苄硝唑作为对照。
https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0011592.g007
目前，治疗恰加斯病的管道很差，迫切需要具有新作用模式的化合物。在基于天然产物的恰加斯病新疗法中，已经评估了数百种植物的潜在抗寄生虫活性，而对微生物天然产物的探索较少[26]。Strasseriolides A–D呈现出一种独特的结构支架，包括一个18元的大环内酯类核心环结构，其羧酸盐基团位于C1处，六个甲基连接到C2、C6、C8、C10、C14和C18（图1）[28]。四种化合物之间观察到的结构差异包括在C11和C13（R1和 R3= OH），在链西里内酯D的情况下，因此是最具极性的，其次是C11羟基和C13酮（R1= OH 和 R3/R4= O）在链西瑞内酯C的情况下，仅在C11（R1= OH），在链条内酯B的情况下，最后在C11处有一个酮官能团（R1/R2= O）在链条内酯A的情况下，它是家族中极性较低的分子。四种化合物之间看似微小的结构差异转化为其生物效应的显着差异。比较四种化合物的结构，C-11中羟基与酮基团的存在似乎对于分子的抗寄生虫活性至关重要，因为在该位置具有酮的链内酯A在体外没有显示出显着的抗原虫活性。C-11 处的羟基与 C-13 处缺乏第二次含氧功能化相结合，似乎赋予链内酯 B 具有有效的抗寄生虫活性，尽管与体内高毒性有关。最后，在C-11和C-13上均具有含氧功能的链条内酯C和D显示出选择性的体外抗原虫活性（针对T。克鲁齐，L.多诺瓦尼和此前对阵P.恶性），理想的临床前特性和感染小鼠的体内寄生虫清除。因此，从四种化合物之间的结构差异可以推断，该化合物类别的C11-羟基化是生物活性的关键，但是当与C13处没有羟基化/氧合相结合时，它会导致生物活性增加许多倍，这最终使平衡倾向于毒性，如在Stasseriolide B中观察到的那样。
从天然来源发现新药会带来局限性，例如足够数量的分离和纯化合物的表征。然而，自动化、新型组学和改进培养技术的进步正在带来重大进展。通过扩大生产微生物菌株的发酵来获得微生物产品的可能性是一个额外的优势。此外，最近报道了链条内酯A和B的全合成[47]，这为设计和合成具有优化药理学性质和活性的新型链条内酯提供了途径。
总之，用这些最近发现的强效大环内酯类进行的研究，证明化合物C和D对细胞内无鞭毛体和锥体鞭毛体形式的T都有活性。克鲁兹体外。有趣的是，化合物C起效快，在急性恰加斯病小鼠模型中表现出疗效。这些观察结果为设计和开发链条内酯作为有前途的抗寄生虫剂铺平了道路，这些抗寄生虫剂可能被证明对治疗恰加斯病有用。
支持信息
Excel电子表格在单独的工作表中包含图1,2A，2B，3A，3B，4A，4B，5A，6，S2B，S3A，S3B，S4A和S4B的所有数值。
显示 1/5： pntd.0011592.s001.xlsx
跳到无花果共享导航
一个 B C D E F G H 我 J
1 96小时治疗后克氏锥虫的剂量反应曲线
2 生长抑制（%）
3 浓度（微米） 1 2 3 4 5 6 平均 标清
4 斯特拉西里酯A 50 88.52318 87.22392 80.90083 89.5626 87.31054 84.79862 86.704214 3.3836370679462666
5 25 38.45821 47.20659 32.48161 47.89953 30.83587 31.87527 39.376362 7.9887025718648434
6 12.5 5.456915 8.921615 16.80382 13.94544 11.86662 14.29191 11.398881999999999 4.397752689903962
7 6.25 5.283682 7.535741 2.598535 2.771768 4.937206 0.7795637 4.6253864 2.0337635204323283
8 3.125 3.291457 0.4330978 3.984399 0.6063204 8.055429 3.897798 3.27414064 3.1046044203494727
9 1.5625 3.551332 1.126019 2.771768 5.023828 5.283682 3.291457 3.5513258 1.707274448528179
10 0.78125 0.2598649 7.882207 2.85839 3.98442 0.6929524 1.73234 3.13556686 3.0644737903356054
11 0.390625 9.268091 2.511914 9.268091 0.1732433 0.8661854 2.252049 4.41750494 4.508693669609414
12 0.1953125 11.17367 16.89043 4.417507 13.2525 16.97705 7.362498 12.542231399999999 5.171146764635945
13 0.09765625 7.102654 3.031623 0.7795637 2.425303 1.212641 0.00001032562 2.9103569400000002 2.5123622681582902
14 0.04882812 3.98442 2.252069 10.82721 8.835004 8.57515 8.57515 6.894770599999999 3.6082225184519605
15 0.02441406 9.441324 4.677361 0.7795637 0.8661854 0.5196988 2.945001 3.25682658 3.860368877729718
16 0.01220703 4.071031 4.244274 14.11868 0.3464659 6.582944 0.6929524 5.87267898 5.121954667135552
17 0.006103516 10.91382 4.937206 8.228673 9.961033 0.6929524 0.6929524 6.9467368800000004 4.171783925245861
18 0.003051758 10.82721 15.50456 8.661771 7.795586 5.630148 4.937206 9.683855 3.7493540548445123
19 0.001525879 13.51235 19.31573 7.795586 7.622353 10.39412 3.031613 11.728027800000001 4.869728033523552
20
21 斯特拉西里内酯B 50 117.1471 117.4453 116.2525 117.5447 116.6501 117.3459 117.00793999999999 0.5471516316342333
22 25 114.5626 114.3638 115.4573 115.5567 113.9662 114.662 114.78131999999998 0.6972705909473048
23 12.5 113.0716 112.1769 112.1769 113.8668 112.2763 113.171 112.71370000000002 0.7458819041912709
24 6.25 113.2704 112.5745 111.8787 112.7734 113.171 113.5686 112.7336 0.556152825219833
25 3.125 112.3757 112.8728 113.4692 113.7674 112.674 106.0139 113.03182 0.5736277468881705
26 1.5625 112.8728 114.165 113.5686 112.2763 112.8728 112.5745 113.1511 0.7284360438638398
27 0.78125 112.9722 111.6799 112.8728 113.4692 109.2942 112.1769 112.05766000000001 1.6787417603669703
28 0.390625 104.2247 93.29026 100.9443 94.08549 101.1431 91.89861 98.73756999999999 4.797912620952991
29 0.1953125 50.64613 60.9841 44.68192 63.17098 44.1849 59.09543 52.73360600000001 8.93416203439802
30 0.09765625 13.36978 22.1173 3.628228 3.230607 11.67993 19.4334 10.805169 7.813277413463062
31 0.04882812 10.18886 5.815102 10.58647 3.131211 4.224642 4.721671 6.789257000000001 3.4235820322194694
32 0.02441406 7.306154 14.56262 6.510924 8.69781 6.411528 0.745532 8.6978072 3.4037574281563003
33 0.01220703 6.113315 13.86679 15.15904 17.84294 4.125246 25.69582 11.4214662 5.97067187446959
34 0.006103516 5.715694 7.504959 12.37574 3.628228 2.03778 6.610332 6.2524802 4.000048453842178
35 0.003051758 1.341958 1.143153 6.510924 2.137176 12.97216 5.11928 4.8210742 5.052980692126106
36 0.001525879 7.007942 0.2485146 5.218677 0.7455202 9.393632 11.28229 4.522857159999999 3.966186401422716
37
38 斯特拉塞里内酯C 50 114.8608 113.2704 113.668 115.4573 115.8549 114.62228 1.1193449097574892
39 25 112.5745 111.1829 111.5805 111.8787 111.2823 111.69977999999999 0.5596493652279054
40 12.5 109.5924 111.0835 109.3936 109.7913 109.1948 109.81112 0.7452106125116571
41 6.25 96.47117 98.16103 100.0497 96.66998 88.41948 95.95427200000002 4.449573668922678
42 3.125 54.82108 62.37575 79.47316 64.16501 48.26044 61.819088 11.729114761454479
43 1.5625 19.53281 26.59046 3.727636 16.05369 10.48709 15.2783372 8.704030402001663
44 0.78125 5.218688 3.131211 3.827033 8.101384 0.9443247 4.24452814 2.6518599392304263
45 0.390625 1.441342 0.3479228 11.08349 5.91451 5.91451 4.94035496 4.271111946614161
46 0.1953125 3.827044 6.212735 3.131222 10.38768 5.61631 5.834998199999999 2.8398814675937105
47 0.09765625 0.1491064 5.318085 2.73359 1.143129 1.838975 2.23657708 1.9655764333399333
48 0.04882812 3.230607 4.025837 8.498994 4.125246 9.89065 5.9542668 3.018825537612219
49 0.02441406 3.131222 6.510924 0.5467274 8.399597 6.013919 4.92047788 3.0887105748230237
50 0.01220703 3.628228 6.610332 17.94234 6.013907 12.07752 9.254465399999999 5.7575170386606604
图1图2A图2B图3A图3B图4A图4B图5A图6图 S2A图 S2B图 S3A图 S3B图 S4A图 S4B
1 / 5
下载
无花果分享
S1 数据。 Excel电子表格在单独的工作表中包含图1,2A，2B，3A，3B，4A，4B，5A，6，S2B，S3A，S3B，S4A和S4B的所有数值。
https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0011592.s001
（三十）
S1 图
HPLC-UV（210 nm）痕量的纯链条内酯A-D。
https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0011592.s002
（提夫）
S2 图 克氏锥虫表鞭毛蚴活力测定及DMSO作用。
（A）添加刃天青时荧光与培养密度的线性相关性。每个点代表两个生物学重复的平均值，标准偏差的误差线。（b） DMSO的影响。寄生虫以每孔200,000个细胞接种并生长72小时。每个条形代表九种不带DMSO（白色，对照）的独立培养物的平均值，其中0.1%DMSO（灰色）或0.2%DMSO（黑色）。阅读时间为添加刃天青后的两四个小时。λexc = 550 和 λem = 590 nm 处的荧光读数。
https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0011592.s003
（提夫）
S3 图 时间依赖性刃天青通过T还原。不同细胞密度的克鲁兹锥体鞭毛体。
如方法部分所示获得色鞭毛，在刃天青测定之前，在24°C下孵育48（图A）和37小时（图B）。 在与刃天青孵育2小时（圆圈）和24小时（三角形）后测量荧光。
https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0011592.s004
（提夫）
S4 图 细胞内ATP水平的定量。
（A） 用于插值 RLU 读数的 ATP 标准曲线。（B）用链条内酯C以增加浓度处理克氏鞭毛虫72小时，使用细胞滴度Glo发光活力测定ATP含量，并通过每孔细胞数归一化。结果对应于每个条件的三个重复的平均值。
https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0011592.s005
（提夫）
引用
1.世界卫生组织（世卫组织）。利什曼病实况报道 [互联网];2020 [更新于 2023 年 12 月 <> 日]。可用从： https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/leishmaniasis.
2.泛美卫生组织（泛美卫生组织/卫生组织）。恰加斯病[互联网];2020. 可从： https://www.paho.org/en/topics/chagas-disease.
3.德瑞克M，巴拉加纳B，杜斯SL，吉尔伯特IH。热带病药物发现的挑战和最新进展。自然界。2018;559(7715):498–506.密码：30046073
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
4.莫利纳一世， 戈麦斯一普拉特 J， 萨尔瓦多 F， 特雷维诺 B， 苏莱罗 E， 塞尔 N， 等.泊沙康唑和苄硝唑治疗慢性恰加斯病的随机试验。新英格兰医学杂志。2014;370(20):1899–908.密码：24827034
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
5.被忽视疾病药物倡议（DNDi）。非昔硝唑用于恰加斯[互联网];2022 [更新于 2023 年 15 月 <> 日]。可用： https://dndi.org/research-development/portfolio/fexinidazole-chagas.
6.被忽视疾病药物倡议（DNDi）。NTD药物发现助推器命中铅[互联网];2021 [更新于 2023 年 16 月 <> 日]。可用： https://dndi.org/research-development/portfolio/drug-discovery-booster/.
7.MacLean LM，Thomas J，Lewis MD，Cotillo I，Gray DW，De Rycker M.克氏锥虫体外测定的开发，以确定适合恰加斯病药物发现进展的化合物。公共科学图书馆忽视了热带疾病。2018;12（7）：e0006612.pmid：30001347
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
8.Chatelain E. Chagas病药物发现：迈向新时代。生物分子筛选杂志。2015;20(1):22–35.密码：25245987
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
9.佩纳一世， 皮拉尔·曼萨诺 M， 坎蒂扎尼 J， 凯斯勒 A， 阿隆索-帕迪拉 J， 巴尔德拉 AI， 等.从针对三种动质体寄生虫的高通量表型筛选中鉴定出新的化合物集：一种开放资源。科学报告。2015;5:8771.密码：25740547
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
10.世界卫生组织（世卫组织）。结束忽视以实现可持续发展目标：2021-2030年被忽视的热带病路线图[互联网];2021 28 月 9789240010352.可用： https://www.who.int/publications/i/item/<>.
查看文章谷歌学术搜索
11.被忽视疾病药物倡议（DNDi）。非昔硝唑治疗冈比亚锥虫 [互联网];2022 [更新于 2023 年 16 月 0 日]。可用： https://dndi.org/research-development/portfolio/fexinidazole/<>
12.费尔南德斯-帕斯托尔一世， 冈萨雷斯-梅嫩德斯五世， 安南 F， 托罗 C， 麦肯齐 TA， 博世-纳瓦雷特 C， 等.Pipecolisporin，一种来自小麦内生黑孢子虫的具有抗疟和抗锥虫活性的新型环肽。制药（巴塞尔）。2021;14(3).密码：33809512
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
13.Diyaolu OA， Preet G， Fagbemi AA， Annang F， Perez-Moreno G， Bosch-Navarrete C， et al. 从尼日利亚中北部发现的烟曲霉菌株中分离的化合物的抗寄生虫活性。抗生素（巴塞尔）。2023;12(1).密码：36671310
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
14.Annang F， Perez-Victoria I， Perez-Moreno G， Domingo E， Gonzalez I， Tormo JR， et al. MDN-0185， 一种从微单孢子虫属 CA-256353 中分离的抗疟原虫多环氧杂蒽酮。天然产物杂志。2018;81(7):1687–91.pmid：29924612
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
15.Oluwabusola ET， Tabudravu JN， Al Maqbali KS， Annang F， Perez-Moreno G， Reyes F， et al. 从斐济海洋海绵Aplysinella rhax中分离的溴酪氨酸生物碱和新类似物的抗寄生虫活性。化学与生物多样性。2020;17（10）：e2000335.密码：32697400
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
16.Koagne RR， Annang F， Cautain B， Martin J， Perez-Moreno G， Bitchagno GTM， et al.来自Albizia zygia（DC.）的酚类衍生物的细胞氧基性和抗疟原虫活性 J.F. Macbr.（含羞草科）。BMC补充医学和疗法。2020;20(1):8.密码：32020891
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
17.方琪， 马格兰吉特， 吴 L， 埃贝尔 R， 凯雷梅， 安徒生 JH， 等.来自链霉菌属RK44的信号传导和生物活性代谢物。分子。2020;25(3).密码：31979050
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
18.桑托斯， 维托里诺一世， 德拉克鲁兹 M， 迪亚兹 C， 考坦 B， 安南 F， 等.从海洋海绵中分离的放线菌的生物活性和提取物去复制。微生物学前沿。2019;10:727.pmid：31024503
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
19.安南 F， 佩雷斯-维多利亚一世， 阿皮亚 T， 佩雷斯-莫雷诺 G， 多明戈 E， 马丁 J， 等.从两种加纳蘑菇中分离出的抗原生动物酯萜和三萜。菲托特拉皮亚。2018;127:341–8.pmid：29625145
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
20.贾伟泽， 范姆宝吉， 李永明， 杨玲， 黄思， 奇戈尔， 等.海洋天然产物对疟疾、利什曼病和锥虫病寄生虫的潜力：对最近文章的回顾。贫困传染病。2021;10(1):9.pmid：33482912
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
21.Hameed H， King EFB， Doleckova K， Bartholomew B， Hollinshead J， Mbye H， et al. 温带植物天然产物-一种防治热带寄生虫病的新资源。制药（巴塞尔）。2021;14(3).pmid：33800005
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
22.佐勒菲卡尔 B， 琼斯 AJ， 赛克斯 ML， 谢尔弗 TB， 戴维斯 RA， 艾弗里 VM.筛选基于天然产物的文库以对抗动质体寄生虫。分子。2017;22(10).密码：29023425
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
23.桑托斯， 维托里诺一世， 德拉克鲁兹 M， 迪亚兹 C， 考坦 B， 安南 F， 等.来自海洋海绵细菌共生体的二酮哌嗪和其他生物活性化合物。安东尼·范·列文虎克。2020;113(7):875–87.密码：32130598
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
24.Ungogo MA， Ebiloma GU， Ichoron N， Igoli JO， de Koning HP， BalogunEO.从尼日利亚植物群中分离的天然化合物的抗疟、抗锥虫和抗利什曼原虫活性的综述。化学前沿。2020;8:617448.密码：33425860
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
25.秋香 PM， 马约卡 G， 穆泰 P， 奇巴莱 K.天然产物在针对被忽视的热带病的药物发现和开发中的作用。分子。2016;22(1).密码：28042865
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
26.安南 F， 佩雷斯-莫雷诺 G， 加西亚-埃尔南德斯 R， 科登-奥布拉斯 C， 马丁 J， 托尔莫， 等.高通量筛选平台，用于基于天然产物的药物发现，针对 3 种被忽视的热带疾病：非洲人类锥虫病、利什曼病和恰加斯病。生物分子筛选杂志。2015;20(1):82–91.pmid：25332350
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
27.佩雷斯-莫雷诺 G， 坎蒂扎尼 J， 桑切斯-卡拉斯科 P， 鲁伊斯-佩雷斯 LM， 马丁 J， 埃尔奥阿德 N， 等.通过微生物天然产物的高通量筛选发现对恶性疟原虫有活性的新化合物。普洛斯一。2016;11（1）：e0145812.密码：26735308
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
28.Annang F， Perez-Moreno G， Gonzalez-Menendez V， Lacret R， Perez-Victoria I， Martin J， et al. Strasseriolides A-D，一种从真菌 CF-247251 中分离出的抗疟原虫大环内酯类。有机字母。2020;22(17):6709–13.密码：32808790
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
29.安南 F， 佩雷斯-莫雷诺 G， 迪亚兹 C， 冈萨雷斯-梅嫩德斯 V， 德佩德罗蒙特霍 N， 德尔帕拉西奥 JP， 等.从黄蕊草CF-247,251中分离出的强效抗疟原虫大环内酯类药物A-D的临床前评估。疟疾杂志。2021;20(1):457.pmid：34865639
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
30.洛克菲勒大学。分子寄生虫学实验室。Lineage Lister427 [互联网上的数据库]。可用： http://tryps.rockefeller.edu/DocumentsGlobal/lineage_Lister427.pdf.
31.巴克纳 FS， Verlinde CL， La Flamme AC， Van Voorhis WC.使用表达β-半乳糖苷酶的寄生虫筛选克氏锥虫活性药物的有效技术。抗菌剂和化疗。1996;40(11):2592–7.密码：8913471
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
32.加西亚-埃尔南德斯 R， 戈麦斯-佩雷斯 V， 卡斯塔尼斯 S， 加马罗 F. 对药物组合耐药的利什曼原虫寄生虫的适应性。公共科学图书馆忽视了热带疾病。2015;9（4）：e0003704.pmid：25849149
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
33.维拉 A， 珊瑚-阿尔梅达 M， 塞雷诺 D， 科斯塔莱斯 JA， 巴纳贝 C， 布雷尼尔 SF.克氏锥虫离散分型单元 （DTU） 对苄硝唑的体外易感性：系统评价和荟萃分析。公共科学图书馆忽视了热带疾病。2021;15（3）：e0009269.pmid：33750958
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
34.贝塞拉 MC， 吉纳祖 N， 赫尔格特 LY， 佩莱格里尼 A， 马齐耶里 MR， 吉亚 S， 等.N-苯磺酰基苯并三唑对克氏锥虫表鞶毛和锥体鞭毛体形式的体外活性。实验寄生虫学。2012;131(1):57–62.密码：22425748
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
35.戈麦斯-佩雷斯五世、曼萨诺·吉、加西亚-埃尔南德斯·R、卡斯塔尼斯·S、坎波斯·罗莎、加马罗· 4-氨基双吡啶衍生物作为新型抗利什曼原虫药物。抗菌剂和化疗。2014;58(7):4103–12.密码：24798287
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
36.Andriani G，Chessler AD，Courtemanche G，Burleigh BA，Rodriguez A.从高通量筛选中选择的抗克氏锥虫化合物的体内活性。公共科学图书馆忽视了热带疾病。2011;5（8）：e1298.密码：21912715
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
37.PLOS被忽视的热带病工作人员纠正：从高通量筛选中选择的抗克氏锥虫化合物的体内活性。公共科学图书馆忽视了热带疾病。2014;8(10）：e3293。
查看文章谷歌学术搜索
38.Ravinder Bhaskar，Gangwar S，Goyal N.表达利什曼原虫的荧光素酶的开发作为抗利什曼原虫化合物体外筛选的主要模型。当前的微生物学。2012;65(6):696–700.密码：22945482
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
39.Rolon M，Vega C，Escario JA，Gomez-Barrio A.开发用于克氏锥虫表鞭毛虫药物敏感性测试的刃天青微量滴定测定。寄生虫学研究。2006;99(2):103–7.密码：16506080
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
40.Sykes ML， Avery VM.3-吡啶基抑制剂具有抗克氏锥虫的新活性，体外分析有助于预测推定的细胞色素P450抑制作用。科学报告。2018;8(1):4901.密码：29559688
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
41.莫里略， 瓦斯金 H， 索萨-埃斯塔尼 S， 德尔卡门邦格 M， 库内奥 C， 迈尔西 R， 等.苄硝唑和泊沙康唑消除无症状克氏锥虫携带者的寄生虫：STOP-CHAGAS试验。美国心脏病学会杂志。2017;69(8):939–47.
查看文章谷歌学术搜索
42.德瑞克 M， 托马斯 J， 莱利 J， 布拉夫 SJ， 迈尔斯 TJ， 格雷 DW.使用新的克氏锥虫命中发现筛选级联鉴定已知临床化合物的杀锥虫活性。公共科学图书馆忽视了热带疾病。2016;10（4）：e0004584.密码：27082760
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
43.Cantizani J， Gamallo P， Cotillo I， Alvarez-Velilla R， Martin J. 用于恰加斯病药物发现的大型化合物集分类的杀伤率 （RoK） 测定：应用于 GSK 恰加斯盒。公共科学图书馆忽视了热带疾病。2021;15（7）：e0009602.密码：34270544
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
44.Kratz JM， Goncalves KR， Romera LM， Moraes CB， Bittencourt-Cunha P， Schenkman S， et al.恰加斯病药物开发中的转化挑战。奥斯瓦尔多·克鲁兹研究所的纪念馆。2022;117：e200501.密码：35613156
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
45.Cal M， Ioset JR， Fugi MA， Maser P， Kaiser M. 评估反T.克鲁兹候选者在体外进行无菌杀灭。国际寄生虫学杂志药物和耐药性。2016;6(3):165–70.
查看文章谷歌学术搜索
46.Elias MC， da Cunha JP， de Faria FP， Mortara RA， Freymuller E， Schenkman S. 克氏锥虫细胞周期期间的形态学事件。原生生物。2007;158(2):147–57.密码：17185034
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
47.Salituro LJ， Pazienza JE， Rychnovsky SD. Strasseriolide A 和 B 的全合成，抗疟药大环内酯天然产物。有机字母。2022;24(5):1190–4.密码：35094508
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索