免费医学 论文发表-复制周期时间决定了噬菌体对胞苷脱氨酶毒素/抗毒素细菌防御系统的敏感性

抽象

毒素-抗毒素（TA）系统是无处不在的双基因位点，细菌用它来调节噬菌体防御等细胞过程。在这里，我们展示了新型III型TA系统avcID被激活并赋予噬菌体感染抗性的机制。该系统的毒素（AvcD）是一种脱氧胞苷酸脱氨酶，可将脱氧胞苷（dC）转化为右尿苷（dU），而RNA抗毒素（AvcI）抑制AvcD活性。我们已经表明，AvcD在噬菌体感染时使dC核苷酸脱氨，但激活AvcD的分子机制尚不清楚。在这里，我们表明AvcD的活化源于噬菌体诱导的宿主转录抑制，导致不稳定的AvcI降解。AvcD活化和核苷酸耗竭不仅会减少噬菌体复制，还会增加有缺陷的噬菌体病毒粒子的形成。令人惊讶的是，不受AvcID抑制的噬菌体（例如T7）的感染也会导致AvcI RNA抗毒素降解和AvcD活化，这表明AvcI的消耗不足以提供对某些噬菌体的保护。相反，我们的结果支持复制周期较长的噬菌体（如T5）对AvcID介导的保护敏感，而复制周期较短的噬菌体（如T7）具有抗性。

作者摘要

在过去的几年中，已经发现了许多不同的抗噬菌体防御系统，但是这些系统在噬菌体感染时如何激活的机制以及为什么这些系统可以防止某些噬菌体而不是其他噬菌体的机制知之甚少。AvcID毒素-抗毒素噬菌体防御系统在噬菌体感染时耗尽宿主内dC池的核苷酸。我们表明，噬菌体抑制宿主细胞转录通过消耗AvcI抑制性sRNA来激活该系统，该sRNA抑制噬菌体的产生并导致有缺陷的病毒粒子的形成。此外，我们确定噬菌体复制周期的速度是影响对AvcID敏感性的关键因素，更快的复制噬菌体对其影响表现出抗性。这项研究对理解影响细菌宿主/噬菌体动力学的因素具有重要意义。

数字

Fig 7图1图2图3Fig 4Fig 5Fig 6Fig 7图1图2图3

引文： Hsueh BY， Ferrell MJ， Sanath-Kumar R， Bedore AM， Waters CM （2023） 复制周期时间决定了噬菌体对胞苷脱氨酶毒素/抗毒素细菌防御系统的敏感性。公共科学图书馆病理19（9）： e1011195. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011195

编辑 器： Michael T. Laub，HHMI，麻省理工学院，美国

收到： 9年2023月21日;接受： 七月 2023， 8;发表： 2023月 <>， <>

版权所有： ? 2023 薛等这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。

数据可用性： 所有数据均可在以下网址访问：沃特斯、克里斯托弗;薛，布莱恩 （2023）。复制周期时间决定了噬菌体对胞苷脱氨酶毒素/抗毒素细菌防御系统的敏感性。无花果。数据。https://doi.org/10.6084/m9.figshare.22028480.v1。

资金： 这项工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）对C.M.W GM139537和AI158433拨款的支持。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。

竞争利益： 提交人声明不存在相互竞争的利益。

介绍

细菌必须对大量不同的挑战做出反应和适应才能生存和繁殖。其中一个挑战是掠食性噬菌体（噬菌体）。为了对抗噬菌体感染，细菌已经进化出多种分子噬菌体防御机制，包括限制性/修饰（RM）、CRISPR/Cas、基于环寡核苷酸的抗噬菌体系统（CBASS）、逆转录蛋白和毒素-抗毒素（TA）系统[1-7]。TA系统首先在质粒（e.g.I型）以及后来在细菌和噬菌体染色体上普遍存在[8-10]。这些模块通常构成一个双基因操纵子，编码多种毒素以及中和毒素的肽或RNA抗毒素[11-13]。根据抗毒素的性质及其调节毒素的机制，目前有11类TA系统（I-VIII）[13,13]。毒素通常是蛋白质，但VIII型系统除外，其中毒素为小RNA（sRNA）[14,13]。在I型、III型和VIII型TA系统中，抗毒素是sRNA，而其余类别具有小肽抗毒素[15]。抗毒素比同源毒素更丰富，但更不稳定，当两种基因的表达受到抑制时，抗毒素释放出发挥其生长抑制功能[<>]。

尽管过去的许多研究都使用了非生物应激源（i.e.抗生素、氧化剂），以测试II.型TA系统的诱导，最近的发现表明，噬菌体感染等生物应激也可以激活TA系统[13,16]。I.型TA系统中编码的RM可抑制噬菌体感染并促进质粒维持[2,8]。同样，其他TA系统已被证明可以限制噬菌体感染[17-20]。此外，TA模块不仅聚集并与移动遗传元件（MGEs）紧密相连，而且还通过限制基因还原来介导MGE的稳定[21]。TA模块在自由生活的细菌中也非常丰富，但不是共生的宿主相关物种[22]，支持它们作为噬菌体防御系统的作用。

AvcID是一种新发现的，广泛保守的III型TA系统，编码AvcD毒素和AvcI抗毒素。AvcD是一种脱氧胞苷脱氨酶，可将dCTP和dCMP核苷酸分别脱氨为dUTP和dUMP，导致噬菌体感染后核苷酸代谢中断[23,24]。AvcI是一种非编码RNA，可结合并直接抑制AvcD的活性;然而，噬菌体诱导AvcID系统活性的机制仍然未知。此外，为什么AvcID抑制某些噬菌体的感染而不抑制其他噬菌体的感染尚不清楚。在这里，我们证明在噬菌体感染时，AvcI sRNA抗毒素迅速丢失，允许AvcD对dC池进行脱氨。这种活化导致噬菌体产量减少和有缺陷的噬菌体病毒粒子的产生。与我们的假设相反，对AvcID介导的保护具有抗性的T7噬菌体仍然消耗AvcI并在感染时激活AvcD，这表明噬菌体/宿主相互作用的其他动力学对AvcD的敏感性很重要。我们的结果表明，T7的复制周期，或从噬菌体感染到细胞裂解所需的时间，是介导对AvcID敏感性的关键因素，因为具有快速复制周期的噬菌体对AvcID介导的保护具有抗性。

结果

AvcID在液体培养物中提供噬菌体防御

先前的研究表明，AvcID系统来源于霍乱弧菌V。副溶血性和大肠杆菌ETEC可在噬菌体感染时减少dC核苷酸库，但通过斑块效率（EOP）测定法测量的它们各自的耐药谱不同[23,24]。例如，V。副溶血性AvcID提供针对T3，T5，T6和SECФ18噬菌体的保护，而E。大肠杆菌ETEC AvcID针对T3、SECФ17、SECФ18和SECФ27提供保护[23]。为了更好地了解AvcID系统的激活和噬菌体防御特异性的分子机制，我们研究了源自V的AvcID系统。异源E中的副溶血性。大肠杆菌宿主，因为它对特征明确的 T 型大肠杆菌（如 T5）提供强大的保护。对于本研究的其余部分，“AvcID”指的是V。我们之前描述的副溶血性avcID[23]。

由于迄今为止，AvcID系统赋予的保护是基于比较琼脂平板上的噬菌体滴度[23]，我们想知道AvcID系统是否也可以在液体培养中提供保护，因为这将是一个更易于处理的实验系统来探索这种噬菌体防御的分子机制。为了回答这个问题，我们生成了E。携带编码野生型AvcID（pAvcID）或非活性AvcID基因的大肠杆菌细胞S49K+E376A突变酶（pAvcID*），从其天然启动子在培养基拷贝数质粒上表达。这些 E.大肠杆菌菌株以不同的感染多重性（MOI）感染T5或T7，并通过测量OD跟踪细菌生长600随着时间的推移。外径600在整个实验过程中，在所有测试的MOI中，与携带AvcID *的培养物相比，携带AvcID的T5感染培养物更高，并且在MOIs为0.1–0.001时，AvcID完全保护了培养物免受T5的侵害（图1A）。或者，在任何MOI测试中，AvcID在液体培养中都没有显示出对T7感染的保护（图1B）。这些数据表明，AvcID提供E。大肠杆菌在液体培养中可防御T5，但不能防御T7。

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图1. AvcID系统在液体培养中提供噬菌体防御。

E.在不同感染多重性 （MOI） 感染 T5 （A） 或 T7 （B） 噬菌体后，大肠杆菌具有活性 （pAvcID） 或非活性 （pAvcID*）。数据表示三种生物重复培养物的平均±SEM。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011195.g001

AvcD通过抑制宿主细胞转录而被激活

AvcI和AvcD在体外形成复合物，AvcD被sRNA AvcI抑制，提示AvcD抑制与复合物的组装有关[23]。裂解噬菌体在感染时采用的常见机制是抑制宿主细胞转录[19,25-27]。鉴于抗毒素不稳定，我们假设AvcI在噬菌体抑制宿主细胞转录时降解，无论是通过直接抑制转录机制还是通过宿主基因组降解间接降解，导致AvcD的激活。为了测试这一点，我们评估了来自E的北方印迹的AvcI的稳定性。大肠杆菌细胞在其天然启动子的表达下编码质粒上的avcID位点。同样，为了确定AvcD蛋白水平是否与avcI RNA水平的变化同时变化，我们使用含有C末端6xHis标签特异性抗体的蛋白质印迹对AvcD蛋白进行定量。值得注意的是，avcI转录本的全长略小于300个核糖核苷酸碱基，这比先前确定的~171个碱基的AvcI最小功能长度长（S1图）[23]。在某些情况下，由于未知原因观察到AvcI的双峰。由于电泳是在非变性条件下进行的，这种双联体可能是由于AvcI的交替折叠形式或不同的RNA长度，这是正在研究的。然而，当用转录抑制剂利福平处理细胞时，AvcI的水平迅速下降，表明在没有新转录的情况下，AvcI被降解（图2A）。重要的是，抑制蛋白质合成而不是转录的壮观霉素并没有降低avcI水平（图2B），表明降解是转录关闭特异性的。这些结果与我们之前的研究一致，显示利福平而不是大观霉素激活了V中的AvcD。霍乱[23]。

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图2. 转录关闭导致avcI的降解。

图中显示了在利福平处理 （6 μg/mL） （A）、大观霉素处理 （6 μg/mL） （B）、T250 感染 （C） 和 T200 感染 （D） 期间使用与 avcI 互补的生物素化探针的 avcI RNA 的北方印迹（顶部）和在 MOI 为 5 期间使用抗 7xHis 抗体（底部）的 AvcD-5xHis。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011195.g002

我们还用噬菌体T5和T7感染这些细胞，并在感染后检测AvcI RNA和AvcD蛋白（图2C和2D）。与T7相比，AvcI在T5期间降解得更快，这是一个令人惊讶的结果，因为AvcID提供针对T5噬菌体的保护，而不是T7。同时，我们还发现AvcD蛋白水平在任何测试条件下都没有显着变化（图2A-2D），除了7分钟时间点的T20。这是由于大多数细胞被T7裂解。

为了确定AvcD是否在AvcI丢失时被激活，我们在用T5或T7噬菌体感染含有活性或非活性avcID的细胞之前和之后，使用UPLC-MS / MS测量了dCTP和dCMP的细胞内丰度。令人惊讶的是，T5和T7感染都显着降低了含有活性avcID的细胞中的细胞内dCTP和dCMP，表明两种噬菌体都激活了AvcD（图3A和3B）。我们还注意到，T5降低了含有无活性avcID的细胞中的细胞内dCMP（图3B）。我们假设这一结果是由于T5编码的5'单磷酸酶（dmp）通过去磷酸化5'-dNMP的底物参与宿主DNA降解的最后阶段[28]。总的来说，这些结果表明，转录的抑制加上avcI RNA的不稳定性导致现有的AvcD在T5和T7噬菌体感染的抑制下释放，但AvcD的活化不足以防止T7噬菌体感染。

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图3. AvcD被T5和T7噬菌体激活。

体内 dCTP （A） 和 dCMP （B） 在 E 中的丰度。在感染T5（MOI = 5）或T7噬菌体（MOI = 5）之前和之后携带pAvcID或pAvcID*及其天然启动子的大肠杆菌宿主。使用UPLC-MS/MS测量核苷酸并标准化为总蛋白。数据表示三种生物重复培养物的平均± SEM，Dunnett事后检验的双向方差分析，ns表示不显著。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011195.g003

AvcID推动有缺陷的T5噬菌体的生产

我们发现AvcID对T5提供抗性，但不能对T7产生抗性（图1A和1B），但两种噬菌体都诱导AvcI的降解和AvcD脱氨的活化（图2和3）。为了进一步了解这种差异，我们量化了噬菌体的产生和E的活力。在液体 T5 （MOI 0.1） 和 T7 （MOI 0.01） 噬菌体感染测定过程中的大肠杆菌宿主。携带 AvcID 或非活性 AvcID * 的大肠杆菌。感染了E。通过离心从噬菌体裂解物中分离大肠杆菌细胞以测量菌落形成单位（CFU）和斑块形成单位（PFU）。与携带非活性AvcID的细胞相比，携带感染T5的AvcID的细胞观察到群体崩溃的延迟。（图4A）。此外，含AvcID的群体产生的PFU比含AvcID *的细胞少~100倍（图4B），支持AvcID抑制功能性T5噬菌体积累的观点。与上述液体感染结果一致，当细胞感染T7时，AvcID不会影响CFU和PFU的数量（图4D和4E）。

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图4. AvcID降低T5的功能，但不降低T7噬菌体的功能。

E.编码指示的AvcID系统的大肠杆菌，由CFU在感染T5（MOI 0.1）（A）或T7（MOI 0.01）（D）后测量。在含有 T5 （B） 或 T7 （E） 感染的细胞的 pAvcID 或 pAvcID* 培养物中随时间推移的 PFU 定量。相对 T5 （C） 或 T7 （F） 基因组丰度比较 E.随时间推移表达 pAvcID 或非活性 AvcID* 的大肠杆菌。用 T5 或 T7 噬菌体 （G） 感染含有 AvcID 的细胞后的噬菌体存活百分比。数据表示三种生物重复培养物的平均±SEM。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011195.g004

由于斑块测定只能量化活噬菌体，我们推测，如果其中一些病毒粒子不可存活，则产生的病毒颗粒总量可能会被低估。为了确定产生的病毒粒子总量，我们使用qPCR定量了噬菌体颗粒样品中T5和T7的特定噬菌体基因的丰度。重要的是，这些样品已经用DNase处理，确保只有受噬菌体病毒粒子保护的基因组才能通过该测定进行定量。我们的结果表明，与含AvcID*的细胞相比，在含AvcID的细胞感染培养物中，T5噬菌体基因组的总数随着时间的推移而减少。然而，这种下降幅度小于两个样品之间PFU差异的观测幅度（图4B和4C）。例如，在两小时的时间点，PFU的差异为~100倍，但用qPCR测量的病毒粒子仅存在20倍的差异。我们观察到，当感染T7时，编码培养物的AvcID和AvcID*之间的基因组丰度没有显着差异（图4F）。

与噬菌体基因组相比，PFU的T5的幅度差异更大，这表明由含有AvcID的细胞产生的大多数病毒粒子含有感染新细胞并形成斑块的缺陷基因组。我们通过量化PFU与AvcID或AvcID*感染培养物的基因组丰度之间的比率来计算活噬菌体的百分比。使用该分析，我们估计到30分钟时，仅30%来自含有AvcID的细胞的T5噬菌体具有功能，并且功能性噬菌体的比例通常随着时间的推移而降低，这表明AvcID驱动有缺陷的T5噬菌体病毒粒子的形成（图4G）。相比之下，对T7的类似分析表明，几乎所有的T7噬菌体都是可行的，即使它们来自编码avcID的细胞（图4G）。这表明AvcID通过减少噬菌体复制和增加T5的缺陷噬菌体产量来提供保护，而T7可以通过未知机制克服AvcID的这些负面影响。

与我们的观察一致，即有缺陷的T5噬菌体是由avcID编码的细胞产生的，负染色样品的透射电子显微镜（TEM）图像显示，由含有活性AvcID的细胞产生的颗粒具有更多有缺陷的噬菌体衣壳-i。e.破碎的颗粒，或具有异常形态的衣壳，不含基因组，没有附着的尾巴（图5A），与含有AvcID*的细胞的T5噬菌体相比（图5B和S2）。从avcID编码细胞中分离的T7负染色颗粒的图像显示没有这种缺陷，病毒粒子看起来正常（图5C）。总之，TEM结果证实了我们之前的实验，证实AvcID系统抑制功能性T5噬菌体颗粒的产生。

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图5. AvcID诱导的噬菌体防御的TEM。

来自E的T5（A，B）或T7（C）的透射电子显微镜（TEM）。携带pAvcID （A， C）或pAvcID* （B）的大肠杆菌宿主。样品用1%（w / v）乙酸铀酰进行阴性染色。比例尺 100 nm。所有样品在三个生物学重复中进行分析，结果相似。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011195.g005

Ung 和 Dut 对 AvcID 抗噬菌体防御没有贡献

我们之前已经证明AvcD可以将dCTP分解为dUTP。细胞中dUTP浓度的增加可能导致dUMP在复制过程中被DNA聚合酶掺入噬菌体基因组DNA中的频率增加，而不是dTMP。在基因组DNA中掺入的dUMP可以被DNA修复酶尿嘧啶-N-糖磺酸酯（Ung）靶向，导致形成可能阻止DNA复制的非碱性位点。此外，无嘌呤酸或无嘧啶核酸内切酶可切割非碱性位点处的DNA，导致DNA链切口[29,30]。我们假设在AvcID表达细胞中产生的噬菌体的活力降低可能是由于尿嘧啶掺入T5的基因组DNA中，而T7对这种活性具有抗性。基因组DNA中的尿嘧啶在感染未感染的细菌宿主时可能受到Ung的过度修复。

为了确定AvcID和Ung是否共同发挥作用以减少噬菌体感染，我们感染了E。大肠杆菌MG1655 或 Δung E.大肠杆菌NR8052用T5噬菌体编码avcID或avcID*，测量相对噬菌体滴度，并通过OD进一步跟踪细菌生长600随着时间的推移。我们假设Δung突变体不会像WT E那样表现出对T5的强健保护。大肠杆菌。与我们的假设相反，OD600两种携带活性AvcID的菌株背景表现出相似的保护，这表明Ung不是AvcID保护E所必需的。来自T5噬菌体的大肠杆菌（图6A）。当比较相对噬菌体滴度时，我们观察到在存在或不存在ung的情况下，AvcID介导的T5保护没有差异（图6B）。最后，我们感染了E。大肠杆菌MG1655含有AvcID或AvcID*和T5噬菌体，同时过表达dUTP酶（dut）以减少dUTP的积累，从而防止尿嘧啶潜在掺入噬菌体基因组。Dut的过表达对AvcID赋予的噬菌体防御没有影响（图6C）。总之，这些数据表明，dUTP的积累或尿嘧啶掺入噬菌体基因组中无助于AvcID介导的保护。

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Fig 6. Ung and AvcID do not function together to provide phage protection.

(A） E的生长曲线。大肠杆菌MG1655或Δung突变体在不同感染多重性（MOI）下感染T5噬菌体后具有pAvcID或pAvcID *。数据表示三种生物重复培养物的平均±SEM。（B）在WT E上测量噬菌体滴度。大肠杆菌MG1655 或 Δung E.大肠杆菌编码感染T5噬菌体的活性或非活性AvcID系统。数据表示三种生物重复培养物的平均±SEM。（C）在WT E上测量噬菌体滴度。大肠杆菌MG1655共表达Dut和被T5噬菌体感染的活性或非活性AvcID系统。数据表示三种生物重复培养物的平均±SEM。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011195.g006

复制周期较慢的 T7 突变体易受 AvcID 的影响

我们的结果表明，T5和T7都激活AvcID，但该系统只能防止T5感染。在考虑这种差异时，我们注意到T7的复制周期比T5快得多（~22.5分钟对60分钟），这表明T7可以在AvcID被激活之前复制足够的基因组以减轻其保护作用。与该模型一致，使用Q-PCR对T7基因组积累进行定量表明，大多数基因组复制发生在10分钟内，并且在AvcID存在的情况下，噬菌体基因组的复制数量没有显着差异（S3图）。另外，我们之前已经使用相同的方法证明AvcID显着减少了T5基因组复制[23]。

为了测试复制周期的速度是否是AvcID敏感性的关键因素，我们用烷化剂甲磺酸甲酯（MMS）在体外处理T7噬菌体。先前的研究表明，这种治疗通过在DNA中产生病变来增加噬菌体感染的第一个复制周期的长度，这些病变必须先由宿主DNA修复机制修复，然后才能开始复制[31]。因此，MMS处理的噬菌体在第一个感染周期中会有一个延迟的复制周期，因为DNA被修复，但随后的周期将类似于未经处理的T7。如果我们的模型是正确的，我们希望观察到针对MMS处理的T7的初始AvcID介导的保护，随着噬菌体DNA随着时间的推移而修复，这些保护会丢失。

当以0.1的MOI感染细胞时，AvcID对未经处理的T7和MMS处理的T7显示出最小的保护（S3A和S3B图）。然而，在MOI为0.0001时，AvcID延迟了MMS处理的T7噬菌体对群体的完全裂解（S3C和S3D图）。然而，最终，在所有条件下，人口下降的速度都是相同的。我们将这一结果解释为AvcID能够在第一轮复制期间保护很大一部分细胞免受MMS处理的T7的侵害，但最终随着噬菌体基因组的修复，未受损T7的后续复制克服了AvcID编码细菌种群。这种群体动态与MMS处理的T7的延迟复制周期一致，使得噬菌体对AvcID敏感。

为了进一步探索复制周期时间对AvcID介导的保护的影响，我们感染了E。携带 AvcID 或 AvcID* 的大肠杆菌与 T7 突变噬菌体 T7412（Ian Molineux的礼物）具有40分钟的延迟复制周期。T7412用 T0 RNA 聚合酶基因 5 编码基因 0.7–7.1 的缺失，该基因整合在基因 12 附近。与WT T7不同，T7的斑块形成412突变噬菌体被avcID完全抑制（图7A和7B）。接下来，我们用 t7 的 qPCR 量化了宿主的活力、功能性噬菌体的产生和噬菌体基因组的总丰度412在 AvcID 和 AvcID* 编码单元格中。含有感染T7的AvcID的细胞412与携带AvcID*的细胞相比，具有更多的活CFU（图7C），并且含有AvcID的细胞的T5减少了~7个数量级412PFU比含AvcID *的细胞（图7D）。此外，T7的总数412与非活性变异相比，使用qPCR定量的基因组在含AvcID的细胞感染培养物中随着时间的推移而减少（图7E）。利用这些结果，我们估计了功能性T7的比例412到30分钟时仅占总噬菌体病毒粒子的约2%（图7F）。这些数据表明 AvcID 可针对 T7 提供保护412通过增加有缺陷的噬菌体产量并产生无功能噬菌体，类似于我们对T5的结果。

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图 7. AvcID 降低了 T7 的功能412突变噬菌体。

T7 十倍连续稀释斑块测定的代表性图像文晔（一）、T7412（B） 或 T7C74（C）噬菌体在E上点缀。大肠杆菌MG1655表示活动（顶部）或非活动（底部）avcID系统。图像代表三个重复。（D） CFU量化E。大肠杆菌MG1655随时间推移在培养物中表明感染突变型T7后的AvcID系统412.（E） 在含有感染 T7 的指定 AvcID 系统的培养物中随时间推移的 PFU 定量412.（F） 相对 T7412基因组丰度比较E.随时间推移表达 pAvcID 或非活性 AvcID* 的大肠杆菌。（G）用T7感染含有AvcID的细胞后的噬菌体存活百分比412.数据表示三种生物重复培养物的平均±SEM。（H） T7 十倍连续稀释斑块测定的代表性图像文晔（顶部）或 T7412（底部）在E上发现的噬菌体。大肠杆菌BL21或BL21（D3E）表示活性或非活性avcID系统。图像代表三个重复。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011195.g007

确定噬菌体T0中基因是否丢失5.0-7.7412对AvcID介导的敏感性有所贡献，我们进行了另外两个实验。T7C74是一种突变的 T7 噬菌体，其基因 0.5-0.7 被删除，但基因 1 在其天然位置编码。T7C74无论AvcID如何，都形成等效的斑块，类似于WT T7，尽管我们注意到在表达AvcID的细胞上形成的斑块比在含有AvcID*的细胞上形成的斑块更浑浊（图7C）。液体生长测定表明，T7C74在所有测试的 MOI 中均耐 AvcID，而 T7412对 MOI 0.1–0.0001 处的 AvcID 敏感（S5 图）。重要的是，T7 的复制周期时间C74类似于T7 WT（S5图）。此外，T7感染412在Bl21（DE3）宿主中对AvcID介导的防御完全耐药，恢复了T7 RNA聚合酶的早期生产（图7H）。这些结果表明，仅是RNA聚合酶产生的缺陷，而不是噬菌体中的任何其他突变赋予T7的敏感性。412 to AvcID.

Discussion

噬菌体捕食是一种持续的进化压力，它塑造了细菌的多样性和适应性，推动了多种反噬菌体防御系统的进化。某些抗噬菌体防御（如RM）利用DNA修饰来区分宿主和外来DNA的潜在机制已得到充分表征[2,32,33]。相反，基于环核苷酸的系统（i.例如，CBASS）对噬菌体感染的反应通常不为人所知[3,34]尽管最近的两项研究表明，细胞内叶酸的耗竭会激活CBASS（[35,36]。此外，尽管最近发现了许多新型噬菌体防御系统，但通常尚不清楚为什么它们能对某些噬菌体提供保护，而不能对其他噬菌体提供保护[7,24,37,38]。在这里，我们揭示了AvcID TA系统如何响应噬菌体感染的激活机制及其对噬菌体形态发生途径的影响。我们还确定，噬菌体复制周期的速度是驱动AvcID专门防止像T5这样的更长复制噬菌体而对T7等更快复制的噬菌体无效的重要因素。

转录停止，无论是通过抑制转录机制还是通过宿主基因组降解非特异性，都是许多噬菌体感染的标志[17,27,28,39]。1型TA Hok/Sok是最早研究的TA系统之一，由于复制周期较快，它也不能防止T7[17]。我们的结果表明，转录关闭导致AvcI降解，释放AvcD使dC核苷酸脱氨。这种激活方式与其他TA系统一致，例如ToxIN系统[19,40]，以及既往研究表明抑制转录会激活AvcD，但这种激活的机制尚不清楚[23,24]。这项工作首次表明这种激活是由于AvcI sRNA抗毒素的降解。与AvcD转录本相比，AvcI抗毒素的RNA转录本的产生丰度很高[23]。北方印迹中的两条AvcI转录本条带已与其他RNA抗毒素一起显示[40]，并且在非变性凝胶上进行电泳时，它们可以代表AvcI的交替折叠结构。在其他TA系统中，通常有一个Rho非依赖性终止子，位于毒素和抗毒素基因之间[41,42]。这可能部分解释了AvcI RNA转录本的多个条带，因为较长的转录本是较小的加工转录本的前体。然而，序列分析没有预测avcI和avcD之间的这种终止子，因此AvcI sRNA是如何形成和产生的，其水平远高于AvcD，并且抑制AvcD所需的AvcI sRNA的活性形式需要进一步研究。

虽然AvcID不能提供针对T7的保护，但avcI转录本在T7感染后迅速降解，这意味着当细胞通过直接抑制转录或间接抑制（如宿主基因组的降解）被噬菌体感染时，avcI水平会降低。然而，与T7相比，AvcD的激活对T4的生存能力没有任何不利影响（图5），也没有T7基因组的复制（S3图），这意味着T7已经进化到无视AvcID或类似噬菌体防御系统造成的任何有害影响。鉴于我们观察到功能性AvcID与含有AvcID*的细胞的活噬菌体没有差异（图4），我们建议即使在存在AvcID和耗尽的dCTP的情况下，T7也能复制足够的基因组（S3图）以完全包装所有产生的衣壳头。噬菌体可以合成比衣壳头更多的基因组，这与这一解释一致[43,44]。应该注意的是，检查来自E的AvcD直系同源物。大肠杆菌在异源E中表达。使用斑块试验确实显示出对T7的保护作用[24]。这一结果突出了每种防御系统噬菌体保护的高度特异性。这些研究之间存在这种差异的原因尚不清楚，但我们推测这可能是由于正在研究的两个AvcD系统的特定分子特征或测试的T7噬菌体的差异。

我们对T5感染培养物的种群动态分析表明，AvcID不仅影响T5基因组的整体合成，而且还导致非活噬菌体衣壳的形成。这一结论得到了TEM图像的支持，该图像显示当AvcD活跃时，大多数T5噬菌体都有缺陷。dCTP和dCMP的消耗可能对DNA包装的时间或噬菌体病毒粒子的稳定性产生下游影响，从而解释功能性噬菌体数量的减少。AvcID产生非活噬菌体衣壳的机制正在研究中。

当几种众所周知的噬菌体的DNA含有dUMP并且Ung存在于宿主细胞中时，它们的生长受到抑制。例如，为了抵消这种负面影响，T5编码其自身的dUTP酶以降低dUTP水平，从而使dUMP在其基因组中受到限制[45]。然而，即使没有Ung，AvcID系统的存在也能防止这种T5感染，这表明dUMP掺入噬菌体基因组可能不是噬菌体活力缺陷的原因。此外，T5蛋白T5.015与Ung相互作用，这被认为是克服Ung介导的限制的机制[45]。这种蛋白质中的T5缺陷可能对AvcID介导的保护表现出更高的敏感性。相反，我们的证据表明，dC池的消耗是导致T5噬菌体颗粒功能降低的原因。值得注意的是，尽管T7的G/C含量约为52%，但dC池中的耗竭对T46存活率没有影响[7]。T47噬菌体降解宿主基因组并将其整合到自己的基因组中[<>]，这可能部分抵消减少的dCTP核苷酸库。

我们获得了两条证据线，将噬菌体复制周期与AvcID敏感性联系起来。首先，用MMS治疗噬菌体病毒粒子，已知这会延迟复制周期时间[31]，增强了对AvcID的敏感性，但这种防御只是短暂的（S4图）。随着T7噬菌体的修复和复制，无论AvcID如何，细菌培养物最终都会死于噬菌体感染。其次，T7对AvcID的抗性可以通过改变其复制周期来完全抑制，因为T7412复制周期较慢，并且完全易感染AvcID，即使该噬菌体完全能够感染和根除表达AvcID的群体[48]。该噬菌体的基因缺失为0.5-1，基因1，即T7 RNA聚合酶，插入基因12的下游。这些突变的最终结果是噬菌体蛋白合成和基因组复制的延迟，增加了复制周期的持续时间。T7的灵敏度412提示T7的快速复制周期文晔使其能够超越 AvcID 系统，在 AvcID 完全耗尽 dC 池之前产生新的病毒粒子。支持复制周期速度在抵抗AvcID方面的重要性的第三条证据线在最近的一项V研究中得到了说明。霍乱ICP3噬菌体，命名为M1Φ，部分受到天然avcID基因座的限制[49]。在这项研究中，分离出一种AvcID耐药突变体M2Φ，令人惊讶的是，该突变体的复制周期（20分钟）是原始噬菌体（40分钟）的两倍[49]。重要的是，这种噬菌体在整个基因组中只有噬菌体DNA聚合酶的一个突变，仅这种变化就足以抵消AvcID。在天然基因组环境和宿主中研究avcID的结果与我们的结论一致，即复制周期时间是AvcID敏感性和抗性的重要驱动因素[49]。

先前对III.型TA系统的研究表明，它们与流产感染（Abi）有关，Abi被定义为宿主为防止噬菌体复制而进行利他自杀[40]。然而，AvcD的过表达不会导致细胞死亡，但会损害基因组复制，这种效应可以通过抑制毒素的表达或在反式中过表达avcI来挽救[23]。鉴于avcI被降解，随后在噬菌体感染时释放现有的AvcD以脱氨dC池，我们建议AvcD赋予的保护不是通过流产感染。我们的观察结果支持了这一结论，即感染含有高MOI的AvcID细胞不会增强对宿主细胞的杀伤（图1），AvcD的过表达不会导致细胞死亡[23]。

与AvcID系统类似，细菌dGTP酶通过将dGTP去磷酸化为dG来抑制噬菌体DNA复制，并且该系统在噬菌体诱导的转录关闭时也被激活[24]。然而，目前尚不清楚dGTPase系统是否是TA系统。虽然其他类型的TA系统已被证明具有抗噬菌体特性，但它们是否以与III型系统类似的机制被激活尚不清楚。最近，DarTG II 型 TA 系统被证明可以通过 ADP 核糖基化噬菌体 DNA 来破坏 DNA 复制来提供噬菌体防御[38]。ParST是另一种II型TA系统，通过修饰参与核苷酸生物合成的细胞靶标Prs发挥其作用，尽管ParST系统尚未被证明参与噬菌体防御。AvcID的机制与DarTG和ParST相似，但在毒素功能和激活机制方面与两者不同。这表明操纵核苷酸池是许多TA系统和反噬菌体防御机制的保守功能。

材料和方法

细菌菌株、质粒和生长条件

本研究中使用的菌株、质粒和引物列在 S1–S3 表中。除非另有说明，否则培养物在 37°C 的 Luria-Bertani （LB） 中生长，并在需要时补充氨苄西林 （100 μg/mL）、卡那霉素 （100 μg/mL） 和异丙基-β-D-硫代半乳糖苷 （IPTG） （100 μg/mL）。大肠杆菌BW29427是一种二氨基庚二酸（DAP）营养素，另外补充了300μg/mL DAP。将质粒引入E中。大肠杆菌MG1655 或 E.大肠杆菌NR8052通过使用E的双亲偶联。大肠杆菌BW29427捐赠者。P战术由Gibson Assembly构建诱导表达载体，插入片段通过PCR扩增，pEVS143 [50]分别通过EcoRI和BamHI线性化。E的转变。使用DH10b电穿孔进行异位表达实验的大肠杆菌，以表达pEVS143衍生质粒。

噬菌体繁殖

在E上繁殖了大肠杆菌。大肠杆菌MG1655在LB中生长，其滴度采用小滴斑测定法测定，如前所述[3,51]。简而言之，将 1 mL 过夜培养物与 50 mL MMB 琼脂（LB + 0.1 mM MnCl 2 + 5 mM MgCl 2 + 5 mM CaCl + 2.0% 琼脂）混合，点样 MMB 中噬菌体的 5 倍系列稀释液 （5 μL） 并在室温下孵育过夜。病毒滴度以斑块形成单位/mL （pfu/mL） 表示。

液体培养中的噬菌体感染

E.携带指示的AvcID质粒的大肠杆菌传代培养并生长至OD6000.3，然后在指定的MOI下与噬菌体混合。将 150 μL 等分试样的混合物放入 96 孔板中，并以 2.5 分钟的间隔测量生长，并在读板器（BioTek H1（仅限 T5）或 SpectraMax M6（其余噬菌体））上在 37°C 下振荡 8 小时。数据表示 SEM ±平均值，n = 3。

斑块检测和成像

将具有指定质粒的大肠杆菌MG1655细胞在LB中与100μg/ mL氨苄青霉素在37°C下生长过夜。 过夜培养物在熔化的MMB琼脂中以1：500传代培养，并在室温下固化。E.大肠杆菌将具有诱导质粒（pEV或pDut）的MG1655用1μM IPTG在LB中以1000：100传代培养并生长至OD600的 1.0。然后将培养物在补充有1μM IPTG的熔融MMG琼脂中以500：100传代培养，并在室温下固化。

用pBYH21或pBYH21转化的大肠杆菌BL3和BL67（DE83）在MMB+ 100μg/mL氨苄西林中生长过夜。将菌株以1：100传代培养到含有100μg/ mL氨苄青霉素和100μM IPTG的预热MMB肉汤中。将培养物在37°C下生长4小时，并以1：100稀释到补充有100μg/ mL氨苄青霉素和100μM IPTG的回火熔融MMB琼脂中，倒入平板中并使其凝固。

点样MMB培养基中大肠杆菌素的5倍系列稀释液（37 μL）并在室温下孵育过夜。我们注意到，在该测定中，AvcID的保护是温度依赖性的，并且在<>°C时丢失。 目前正在调查这种温度依赖性。斑块的图像是使用ProteinSimple AlphaImager HP系统拍摄的。

噬菌体感染后北方印迹的RNA提取

如前所述进行了RNA分离和qRT-PCR分析[52]。简而言之，将E的过夜培养物一式三份。携带pAvcI-AvcD-6x希氏的大肠杆菌在LB中以1：100传代培养并生长至OD600的 0.3。通过乙醇-干冰浆液法对每个重复品的 1 mL 进行沉淀和快速冷冻。按照制造商的说明使用TRIzol试剂提取RNA（赛默飞世尔科技）。RNA的质量和数量使用NanoDrop分光光度计（赛默飞世尔科技）测定。

RNA探针合成和纯化

RNA探针生产的方法是从先前描述的方案修改而来的[23]。使用Q5高保真DNA聚合酶（NEB）从pAvcI对用于体外转录的AvcI DNA模板进行PCR扩增。为了将T7启动子掺入最终的AvcI DNA模板中，前向引物在AvcI的同源序列之前包括T7启动子序列。此外，反向引物的前两个残基经过2'-OMe修饰，以减少转录本的3'末端异质性[53]。使用1%琼脂糖凝胶分析PCR反应，并使用Promega凝胶提取和PCR纯化试剂盒切除与AvcI DNA模板对应的条带并进行凝胶纯化。AvcI RNA是使用T7-AvcI逆转补体DNA模板和HiScribe T7高产量RNA合成试剂盒（NEB）通过体外转录合成的。在转录反应过程中包括Bio-11-UTP，用于北方印迹检测目的。将转录反应在37°C下孵育4小时。转录后，将DNase I（NEB）加入至每次反应1X的终浓度，并在37°C下再孵育15分钟。然后使用君主RNA净化试剂盒（NEB）纯化AvcI。使用1.0%TBE琼脂糖凝胶评估产品的纯度。使用液氮快速冷冻AvcI的单个等分试样，并在-80°C下长期储存。

噬菌体感染后的北方印迹分析和半衰期定量和分析

将1.5–2μg总RNA在1x样品缓冲液（Invitrogen）中以1：2稀释，与生物素化的sRNA分子量标准（Kerafast）一起加载到7.5%TBE-尿素PAGE凝胶上，并运行30分钟或直到前染料在1 V下到达凝胶底部上方~200cm.然后将RNA转移到BrightStar-Plus带正电荷的尼龙膜（Invitrogen）中，并在1mA下运行250小时。然后使用UVP HybriLinker HL-2000（费希尔科学）的CX-2000交联剂隔室将RNA交联到膜上。将膜的每一侧在1200μJ下交联两次，并在50°C下干燥至少30分钟以提高灵敏度。将膜在ULTRAhyb超灵敏杂交缓冲液（Invitrogen）中在60°C下预杂交至少60分钟，并轻轻摇动。接下来，除去预杂交缓冲液，并加入含有1nM纯化探针的杂交缓冲液。将膜在12°C下轻轻摇动杂交16-60小时。接下来，每五分钟用2x盐水 - 柠檬酸钠（SSC）缓冲液冲洗膜两次，0°C下1.60%SDS，然后在15°C下用0.1X SSC每0分钟冲洗两次。 生物素标记的探针在室温下使用化学发光核酸检测模块（赛默飞世尔科技）进行检测。然后使用阿默舍姆成像仪1对膜进行成像。为了确定avcI的半衰期，使用斐济软件分析了条带强度，并将其归一化为相应的60 min条带强度[600]。显示的所有北方印迹都是两个独立生物学重复的代表。

AvcD 的蛋白质印迹分析

以与RNA提取相同的方法收集细胞。然后将颗粒重新悬浮在OD600= 15 （~20 μL） 在补充有 2% β-巯基乙醇 v/v 的 10x Laemmi 上样染料中，在 10°C 下变性 95 分钟，并以 15k x g 离心 10 分钟。然后使用4–20%SDS-PAGE凝胶（Mini-PROTEAN TGX预制蛋白凝胶，Bio-Rad）和尺寸标准品（Precision Protein Plus，Bio-Rad或PageRuler Plus预染色蛋白质分子量标准品，Thermo Scientific）分析样品。凝胶在室温下在60 V下在120x Tris/甘氨酸/SDS电泳缓冲液中电泳1分钟。蛋白质被转移到硝酸纤维素膜（Optitran）上。使用5%脱脂牛奶封闭膜，并与1：5000 HIS Tag抗体，mAb，小鼠（GenScript）一起孵育，然后用1：4000山羊抗小鼠IgG抗体（H&L）[HRP]，pAb（GenScript）孵育，用Pierce ECL蛋白质印迹底物处理，并使用Amersham Imager 600成像。所示的蛋白质印迹是两个独立生物学重复的代表。

噬菌体感染前后的 CFU/PFU 测量

传代培养过夜并分成两个 10 mL 等分试样并生长至 OD600的 ~0.3。将一个等分试样与噬菌体混合（T5，MOI = 0.1;T7， MOI = 0.01;T7412，MOI = 0.01）和另一个具有等体积的LB（未感染对照）。两者都在210°C的振荡培养箱（37rpm）中生长。 在每个指定的时间点，旋转1.5 mL培养物。将每个管中的上清液用0.22μM过滤器灭菌并转移到新管中，并用等体积的LB洗涤细菌细胞沉淀两次以除去未吸附的噬菌体。对于PFU测量，将上清液在MMB培养基（LB + 0.1 mM MnCl 2 + 5 mM MgCl + 2 mM CaCl 5）中连续稀释，并将每种稀释液的2 μL点样在MMB琼脂平板（MMB + 5.0%琼脂）中接种的细菌草坪上。然后将PFU板在室温下生长过夜，并在第二天定量斑块。对于CFU测量，然后将重悬的细胞沉淀在5°C下孵育37-5分钟，然后在PBS中连续稀释10倍，并在LB板上点样每种稀释液10μL。然后将CFU板在5°C下生长过夜，并在第二天定量菌落。

UPLC-MS/MS dNTPS定量

如前所述[23]通过微小修改确定脱氧核苷酸浓度。简而言之，为了测量噬菌体感染后的核苷酸，将细胞在37°C的LB中生长过夜。 在LB中以1：100传代培养过夜培养物并生长至OD600的 ~0.3。收集 3 mL 培养物的时间为零读数：1.5 mL 用于 dNTP 定量，1.5 mL 用于总蛋白定量。然后用噬菌体（T7，MOI为5）感染培养物，并在随后的每个指示时间点再取出3mL。通过以15k x g 离心1分钟收集培养物等分试样。将沉淀重悬于200 μL冷冻提取缓冲液[乙腈、甲醇、超纯水、甲酸（2：2：1：0.02，v/v/v/v）]中。为了使体内核苷酸样品标准化，将另一个 1.5 mL 等分试样沉淀以 15,000 x g 离心 1 分钟，重悬于 200 μL 裂解缓冲液 （20 mM Tris·盐酸，1%SDS，pH 6.8），并在10°C下变性95分钟。 将变性裂解物以15,000×g离心1分钟以沉淀细胞碎片，并使用上清液通过DC蛋白测定（Bio-Rad）和BSA标准曲线量化样品中的总蛋白质浓度[55]。然后将UPLC-MS/MS检测到的脱氧核苷酸浓度归一化为每个样品中的总蛋白。

收集后立即将所有重悬于提取缓冲液中的样品在-20°C下孵育30分钟，并以15,000×g离心1分钟。将上清液转移到新管中，在高速真空中干燥过夜，最后重悬于100μL超纯水中。采用UPLC-MS/MS分析实验样品和脱氧核苷酸标准品[1.9、3.9、7.8、15.6、31.3、62.5和125 nM的dCTP（Invitrogen）、dCMP（Sigma）、dUTP（Sigma）和dUMP（Sigma）]，使用Acquity Ultra Performance LC系统（沃特世）与Xevo TQ-S质谱仪（沃特世）和ESI源在负离子模式下进行分析。

使用 qPCR 进行基因组提取和定量

如前所述提取噬菌体基因组[56]。简而言之，噬菌体裂解物用RNase A（罗氏;1μg/ mL），DNase I（NEB;18U）和溶菌酶（Sigma-Aldrich;1mg / mL）处理。将样品在37°C下孵育90分钟，然后在75°C下孵育10分钟使DNA酶失活。然后用0.1mg / mL蛋白酶K（Invitrogen）和0.5%SDS进一步处理样品，并在55°C下孵育1小时。然后用苯酚-氯仿：异戊醇（25：24：1）提取一次样品，用氯仿第二次提取样品。通过乙醇沉淀分离DNA，并加入0.3 M乙酸钠。DNA质量和数量使用NanoDrop分光光度计（赛默飞世尔科技）测定。

为了测量噬菌体基因组丰度，25 μL 反应包括 5 μL 每个 0.625 μM 引物 1 和 2、12.5 μL 2X SYBR 预混液和 2.5 μL 2.5 ng/μL 噬菌体基因组 DNA。对生物一式三份样品进行技术重复的qPCR反应。通过比较Ct噬菌体感染E的值。在每个时间点，大肠杆菌与 AvcID 到非活动 AvcID*。

为了测量噬菌体DNA复制，在1°C的LB中以100：35传代培养过夜培养物，并生长至~600.0的OD 3。然后将培养物在最终MOI为5时感染T1噬菌体。然后，在感染后1,5,10和20分钟收集30.40ml培养物。将培养物等分试样以15,000g离心1分钟，并将沉淀在干冰 - 乙醇浆液中快速冷冻。使用Wizard基因组DNA纯化试剂盒（Promega）提取DNA，使用革兰氏阴性细菌方案，并将每个样品中纯化的DNA均匀重悬于50μlDNA脱水溶液中。使用NanoDrop分光光度计测定DNA质量和数量。如上所述，使用靶向T7 p52基因的引物通过qPCR定量每个样品中T7噬菌体基因组的丰度。使用每种菌株的7分钟和每个后续时间点（5（?ΔCt）之间的Ct差异计算T2基因组的相对丰度。

T7噬菌体的烷基化

如前所述，T7噬菌体的烷基化反应略有修改[31]。将噬菌体裂解物在2°C下用37.0M甲基甲磺酸酯（MMS）（圣克鲁斯生物技术）或等体积的噬菌体缓冲液（01mM Tris，pH 10.7,6mM MgCl）处理10小时2).然后将处理过的噬菌体在冰上冷却10分钟，然后在4°C下用10 kDA透析管（赛默飞世尔科技）在噬菌体缓冲液下透析过夜。使用小滴斑块测定烷基化和透析后的噬菌体滴度。

透射电子显微镜

使用15 mL软琼脂覆盖和150 μL E制备高滴度噬菌体储备液。大肠杆菌DH10B 和 150 μL 的 2.26x1010PFU/mL（T5 或 T7）。然后使用30 mL LB和100 μL加0 mL过夜培养物生长液体培养物，培养含有具有活性或非活性avcID系统（AmpR）的质粒和一个噬菌斑（T5或T5）。培养物在室温下生长，同时以7RPM振荡200小时或直至澄清。加入6mL氯仿，将培养物再孵育3分钟，然后在5°C下以8,000×g（在F7-000x14cy转子中~14,50rpm）离心10分钟。 然后将上清液在4°C下以26,000×g（在F12-500x14cy转子中~14,50rpm）旋转90分钟以沉淀噬菌体。将沉淀重悬于4.1 mL噬菌体缓冲液中，在5°C下章动过夜。

将大约 ~5 μL 噬菌体样品施用于新鲜放电的发光（PELCO easiGlow，15 mA，45 s）连续碳支持膜网格（Ted Pella，Cat。编号：1754-F）60秒，然后用蒸馏水洗涤，然后用1%乙酸铀酰水溶液染色（电子显微镜溶液，Cat。编号：22400–4）。网格用Whatman滤纸吸干。噬菌体样品在密歇根州立大学的RTSF Cryo-EM核心设施中使用200 keV操作的Talos Arctica进行成像。在Ceta相机上以45,000（2.2 ?/像素）和57,000（1.8 ?/像素）的标称放大倍率收集显微照片，曝光时间为1秒，物镜散焦设置为5μM焦距不足。

统计分析

如图例所示，所有统计分析均在GraphPad Prism软件中进行分析。统计显著性表示如下：单个星号 （*） 表示 p < 0.05;双星号 （**） 表示 P < 0.01;三重星号 （***） 表示 p < 0.001;四重星号 （****） 表示 p < 0.0001。在每个图例中报告± SEM 和特定 n 值的平均值。所有数据均可在以下网址访问：沃特斯、克里斯托弗;薛，布莱恩 （2023）。复制周期时间决定了噬菌体对胞苷脱氨酶毒素/抗毒素细菌防御系统的敏感性。数据。https://doi.org/10.6084/m9.figshare.22028480.v1。

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图1的北方印迹和西方印迹的原始图像。

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S1 图 图1的北方印迹和西方印迹的原始图像。

图中显示了利福平治疗、壮观霉素治疗、T6 感染和 T5 感染期间 avcI RNA 的北方印迹和 AvcD-7xHis 蛋白质印迹的原始图像。灰色三角形对应于avcI转录本（~280 nt），黑色三角形对应于AvcD-6xHis（60 kDa）。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011195.s001

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S2 图 透射电镜图像的复制品。

感染E的大肠杆菌噬菌体T7（a行）和T5（b行和c行）的透射电子显微镜（TEM）。携带活动 avcID（行 a 和 c）或非活动 avcID（行 b）的大肠杆菌宿主。样品用1%（w / v）乙酸铀酰进行阴性染色。比例尺 100 nm。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011195.s002

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S3 图 AvcID显示对T7噬菌体感染的保护作用较差。

感染E的T7的相对基因组丰度。大肠杆菌MG1655 pAvcID 或非活动 pAvcID*。数据表示三种生物重复培养物的平均±SEM，双向方差分析与双侧?ídák多重比较检验。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011195.s003

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S4 图 AvcID系统在E中提供适度的保护。大肠杆菌对抗MMS处理的T7噬菌体。

E.感染未经治疗的 T7 （A， C） 或 MMS 处理的 T7 噬菌体 （B， D） 后，感染多重感染 （MOI） 为 0.1 或 0.0001 的大肠杆菌具有活性 （pAvcID） 或非活性 （pAvcID*） AvcID 系统。数据表示三种生物重复培养物的平均±SEM。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011195.s004

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S5 图 E.大肠杆菌感染T7突变噬菌体。

E.感染 T7 突变体后具有活性 （pAvcID） 或非活性 （pAvcID*） AvcID 系统的大肠杆菌，T7C74（A） 或 T7412（B） 在各内务部。数据表示三种生物重复培养物的平均±SEM。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011195.s005

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S1 表。 本研究中使用的细菌菌株和噬菌体。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011195.s006

（文档）

S2 表。 质粒描述。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011195.s007

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S3 表。 本研究中使用的寡核苷酸。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011195.s008

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确认

我们感谢Ry Young和Ian Molineux的宝贵建议，感谢Ian Molineux为我们提供T7突变噬菌体。我们感谢Sundharraman Subramanian和Kristin Parent的TEM想象以及MSU RTSF Cryo-EM设施。我们感谢余京飞为我们提供NR8052 E。大肠杆菌菌株。我们还要感谢MSU RTSF质谱设施核心的技术支持。

引用

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