免费医学论文-视交叉上核动力学的体内记录揭示了精氨酸加压素神经元在昼夜节律起搏中的主导作用

抽象

视交叉上核（SCN）的中央生物钟是由各种类型的神经元和神经胶质细胞组成的网络。单个细胞具有细胞时钟的自主分子机制，但它们的内在周期差异很大。在这里，我们表明精氨酸加压素（AVP）神经元在体内设置SCN网络的集成周期以控制昼夜节律行为节律。通过删除整个SCN中的酪蛋白激酶1δ（CK1δ）来人工延长细胞周期，将行为节律的自由运行期延长到类似于AVP神经元特异性CK1δ缺失的程度。然而，在SCN切片中，这些小鼠的PER2：：LUC报告节律仅部分和短暂地概括了周期延长，显示出SCN壳和核心之间的解离，壳中存在周期不稳定。相反，自由运动小鼠SCN中AVP和血管活性肠肽（VIP）神经元的体内钙节律表现出与AVP神经元特异性CK1δ缺失时的行为节律相似的稳定延长期，而不改变彼此之间的相位关系。此外，AVP神经元的光遗传学激活急性诱导体内VIP神经元的钙增加。这些结果表明，AVP神经元在体内调节其他SCN神经元，例如VIP神经元，因此是SCN集成期的主要决定因素。

数字

Fig 7Fig 1Fig 2Fig 3Fig 4Fig 5Fig 6Fig 7Fig 1Fig 2Fig 3

引文： Tsuno Y， Peng Y， 堀家 S-i， Wang M， Matsui A， Yamagata K， et al. （2023） 视交叉上核动力学的体内记录揭示了精氨酸加压素神经元在昼夜节律起搏中的主导作用。公共科学图书馆生物学21（8）： e3002281. https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002281

学术编辑： Paul J. Shaw， 华盛顿大学， 圣路易斯， MO 63110， 美国

收到： 14月 2022， 28;接受： 七月 2023， 29;发表： 2023月 <>， <>

版权所有： ? 2023 津野等这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。

数据可用性： 所有相关数据都在论文及其支持信息文件中。

资金： 这项工作得到了JSPS KAKENHI授权号JP20K07259，JP23K06345（至Y.T.）的部分支持;JP22K20738（至上午）;JP18H04972、JP18K19421、JP20K21498、JP22H02802（致M.M.）（日本科学振兴会：https://www.jsps.go.jp/english/index.html）;JST SPRING Grant Number JPMJSP2135 （Y.P.， M.W.）（日本科学技术振兴机构：https://www.jst.go.jp/EN/）;武田科学基金会（致M.M.）（https://www.takeda-sci.or.jp/en/）;内藤基金会（致M.M.）（https://www.naito-f.or.jp/en/）;日本应用酶学财团（致M.M.）（https://www.jfae.or.jp/）;和金泽大学CHOZEN项目（致M.M.）（http://www.o-fsi.kanazawa-u.ac.jp/research/chozen/）。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。

竞争利益： 提交人声明不存在相互竞争的利益。

缩写： AVP， 精氨酸加压素;CK1δ， 酪蛋白激酶1δ;CRE， cAMP响应元件;快车道 昼夜节律时间;DRD1a， D1a多巴胺受体;摇头丸 明暗;MEF， 小鼠胚胎成纤维细胞;网管， 神经素S;PFA， 多聚甲醛;投资回报率， 感兴趣的区域;单片机， 视交叉上核;tTA， 四环素反式激活剂;TTFL， 转录-翻译反馈循环;贵宾 血管活性肠肽

介绍

在哺乳动物中，下丘脑的视交叉上核（SCN）作为中央时钟，控制多种昼夜节律的行为和生理功能，如睡眠-觉醒、体温和激素分泌[1]。大约 20，000 个 SCN 神经元中的大多数是 GABA 能的，并且包括以共表达肽为特征的几种神经元类型。例如，腹侧核心区域的血管活性肠肽（VIP）阳性神经元和背壳区域的精氨酸加压素（AVP）阳性神经元是SCN中的2种代表性神经元类型[1]。在单个细胞中，细胞时钟的分子机制由自调节转录-翻译反馈环（TTFL）驱动，其中转录激活剂CLOCK和BMAL1起核心作用[2]。周期（Per1，2和3）和隐色素（Cry1和2）是CLOCK/BMAL2的许多靶基因中的1个。然后PER和CRY蛋白抑制CLOCK/BMAL1活性，完成负反馈循环。酪蛋白激酶 1 δ （CK1δ） 已知是细胞时钟周期长度的关键调节因子。通过磷酸化PER2蛋白，CK1δ调节PER2以及其他时钟蛋白的降解速度和核保留[3-6]。事实上，药理学和遗传学实验表明，消除CK1δ活性可延长SCN和外周细胞的昼夜节律节律和分子振荡[4，7，8]。有趣的是，这些细胞内分子机制并非SCN神经元所独有，而是外周细胞所共有的。相反，SCN细胞之间的细胞间通讯对于SCN产生高度稳健、连贯的昼夜节律作为中心时钟可能至关重要[1]。

因此，SCN在各种类型的神经元和神经胶质细胞中包含了数以万计的细胞时钟。然而，这些细胞自主节律很草率，周期长度差异很大[1，9-13]。这些事实提出了一个基本问题，即如何确定SCN网络水平上昼夜节律的集成幅度，周期和相位。VIP被认为是SCN神经元之间同步的最关键贡献者，并且还参与光夹带以根据光/暗循环调节SCN的集成阶段[14-20]。另一方面，最近利用小鼠TTFL的细胞类型特异性遗传操作的研究表明，表达神经素S （NMS）、AVP-、D1a多巴胺受体（DRD1a）和VIP受体VPAC2表达神经元甚至星形胶质细胞会影响SCN网络的起搏[21-27]。据报道，NMS神经元包括AVP、VIP和其他类型的神经元，并充当起搏器，对于SCN集合节律的产生和周期设置至关重要，通过轮子运行行为（体内）和PER2：：LUC报告基因切片表达（体外）测量[21]。相比之下，Patton及其同事表明，由Vpac2-Cre驱动系标记的神经元主要分布在SCN外壳中，包括大多数AVP神经元和少数VIP神经元[28]。它们调节昼夜节律的周期和连贯性，但也需要VIP神经元的协同作用来在SCN切片中起搏PER2：：LUC节律[25，28]。

AVP神经元特异性破坏细胞时钟，删除Bmal1严重扰乱了运动活动的昼夜节律（家笼活动）[22]。此外，通过删除或过表达CK1δ来操纵AVP神经元的细胞昼夜节律期，相应地延长或缩短了运动活动节律的自由运行期[23]。这些观察结果支持AVP神经元在SCN集成节律的周期设置和连贯性中的重要作用。然而，在SCN切片的细胞PER1：：LUC节律中，CK2δ特异性缺失导致的行为期延长并未完全重现[23]，这暗示了SCN网络在体内和离体之间的不同状态。此外，相对于其他类型的SCN神经元，AVP神经元对SCN起搏的贡献程度尚不清楚。为了解决这些问题，我们比较了整个SCN中CK1δ缺失引起的周期延长效应与行为和切片节律中的AVP神经元特异性缺失。此外，我们通过监测细胞内 Ca 来检查由于 AVP 神经元特异性 CK1δ 缺失引起的行为周期延长是否在体内 SCN 细胞时钟振荡中重现2+（[Ca2+]我）使用纤维光度法在自由行为的动物中使用AVP和VIP神经元的节律。我们的结果表明，AVP神经元在体内SCN网络的昼夜节律起搏中起着主要作用。

结果

整个SCN中CK1δ的缺失延长了昼夜节律的行为周期，与AVP神经元特异性CK1δ缺失相比

我们之前表明，通过特异性缺失CK1δ来延长AVP神经元的细胞昼夜节律周期，延长了昼夜节律行为的自由运行周期，表明AVP神经元参与设置SCN网络的集成周期[23]。剩下的问题是AVP神经元对周期设置有多大贡献。为了阐明这一点，我们旨在比较由AVP神经元特异性CK1δ缺失引起的周期延长与泛SCN CK1δ缺失引起的周期延长。虽然CaMKIIα在SCN中并不丰富[29]，但特定的CaMKIIα-Cre系[30]驱动前脑中的Cre表达，包括整个SCN [31]。事实上，越过这条线到絮状的Bmal1小鼠会导致SCN中BMAL90缺失>1%，昼夜节律行为节律完全丧失[31]。我们还重现了CaMKIIα-Cre的心律失常;Bmal1絮/絮絮小鼠，确认CaMKIIα-Cre小鼠为泛SCN Cre驱动程序（S1A和S1B图）。

通过与CK1δ穿过这条CaMKIIα-Cre线絮/絮絮 [8]，我们删除了前脑和整个SCN神经元中的CK1δ（CaMKIIα-CK1δ?/?).CaMKIIα-CK1δ?/?小鼠在光照12小时和黑暗12小时（LD）条件下表现出正常的昼夜运动活动（家笼活动）节律（图1A和1B）。在恒定的黑暗中（DD），CaMKIIα-CK1δ?/?小鼠的自由运行期（24.83±0.08小时）比对照小鼠（23.93±0.03小时，P<0.001，图1C）更长。相比之下，它们的运动活动节律（Qp）幅度是正常的（P = 0.52，图1D）。对照与CaMKIIα-CK1δ自由运行周期的差异?/?小鼠几乎与对照组和Avp-CK1δ之间的差异相似?/?小鼠（23.94±0.03小时±24.72.0小时）[03]，以及对照组和Vgat-Cre之间的小鼠;CK23δ絮/絮絮小鼠（伸长约40分钟），另一系泛SCN神经元CK1δ缺乏[32]。这些数据表明，AVP神经元是昼夜节律行为节律自由运行期的主要决定因素。

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图1. CaMKIIα-CK1δ?/?小鼠在DD中表现出自由运行期的延长。

(A） 控制和CaMKIIα-CK1δ的代表运动活性?/?小鼠（家笼活动）。动物最初饲养在12：12-h LD条件下，然后转移到DD。 灰色阴影表示灯关闭的时间。 （B）LD（左）或DD（右）运动活动的平均每日概况。（C）DD中的自由运行期。 （D）运动活动节律的昼夜节律幅度（从周期图分析中获得的Qp值）。值是 SEM ±平均值;n = 10 表示控制，n = 13 表示 CaMKIIα-CK1δ ?/?小 鼠。基础数据可在 S1 数据中找到。P < 0.001 通过双尾学生 t 检验;ns，不重要。另见 S1 和 S2 图。

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为了检查VIP神经元在SCN集成期设置中的贡献，我们通过将VIP-ires-Cre小鼠[1]与CK33δ杂交，专门删除了VIP神经元中的CK1δ 絮/絮絮 (VIP-CK1δ?/?).然而，我们没有观察到Vip-CK1δ的运动活动节律有任何变化。?/?小鼠（图2A-2D，周期，对照23.93±0.04与Vip-CK1δ?/?23.91 ± 0.03）。这一结果与先前的报告一致，即通过Clock的过表达延长了VIP神经元中固有的TTFL周期。Δ19没有改变行为自由奔跑期[21]。因此，尽管VIP肽是SCN神经元的基本同步器，但VIP神经元本身的TTFL可能对SCN网络的集合周期设置几乎没有贡献。

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图2. VIP-CK1δ?/?小鼠在DD的自由运行期没有变化。

(A） 控制和 Vip-CK1δ 的代表运动活动?/?小鼠（家笼活动）。灰色阴影表示灯熄灭的时间。 （B） LD（左）或 DD（右）运动活动的平均每日概况。（C）DD中的自由运行期。 （D）运动活动节律的昼夜节律幅度（Qp值）。值是 SEM ±平均值;n = 9 表示控制，n = 9 表示 Vip-CK1δ ?/?小 鼠。ns，不重要。基础数据可在 S1 数据中找到。另见S2图。

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AVP神经元中的细胞时钟对于昼夜节律的持续产生是必需的

我们之前报道过通过删除Bmal1（Avp-Bmal1?/?小鼠）导致通过家笼活动测量的昼夜节律行为节律严重减弱[22]。但是，大多数 Avp-Bmal1?/?小鼠仍然保持一定的昼夜节律，不稳定，延长的自由奔跑期和活动时间。相比之下，Lee及其同事报告说，NMS神经元中Bmal1缺失的小鼠（Nms-Bmal1 ?/?小鼠）在车轮奔跑行为中失去了昼夜节律[21]。值得注意的是，最近的一项研究表明，Avp-Bmal1?/?小鼠与Nms-Bmal1中的小鼠非常相似?/?小鼠[34]。因此，轮式运行和笼式活动节律之间的昼夜节律表型可能显着不同。

鉴于SCN AVP神经元在设置自由运行周期中的关键作用，我们重新评估了Avp-Bmal1的昼夜节律行为节律?/?和 Avp-CK1δ?/?小鼠通过测量轮子运行活动。Avp-CK1δ 之间的车轮运行节奏差异?/?对照组小鼠与家笼活动节律一致[23]，即自由奔跑期延长约50分钟（对照组23.73±0.05与Avp-CK1δ?/?24.52 ± 0.07，P < 0.001，S2A 和 S2B 图）。Avp-Bmal1?/?小鼠还表现出类似于先前描述的家笼活动节律的受损轮子运行节律，即DD中自由奔跑期延长的“分裂”行为。然而，与本垒笼活动相反，7 个 Avp-Bmal8 中有 1 个?/?小鼠在DD中约10至20天后逐渐失去昼夜节律（S2C图）。这种车轮运行节奏的逐渐消失类似于Nms-Bmal1?/?小鼠[21]。因此，昼夜节律的损害可能与Avp-Bmal1?/?和 Nms-Bmal1?/?小 鼠。

PER2：：SCN切片中的LUC振荡部分概括了CaMKIIα-CK1δ延长的行为周期?/?和 Avp-CK1δ?/?小 鼠

为了评估SCN中细胞生物钟的状态，我们接下来对对照制备的冠状SCN切片进行了实时生物发光细胞成像，Avp-CK1δ?/?， CaMKIIα-CK1δ?/?和 Vip-CK1δ?/?成年小鼠与保存在LD中的荧光素酶报告基因（Per2：：Luc）[35]杂交。在之前的研究中，我们报道了Avp-CK2δ的SCN切片中的PER1：：LUC振荡?/?小鼠没有表现出延长的连贯昼夜节律，这与它们的运动活动节律相反[23]。

在这里，我们监测和比较了单个像素在壳和核心之间以及基因型之间的PER2：：LUC振荡周期的逐日变化。为此，我们计算了覆盖SCN的单个像素的PER2：：LUC振荡的每日峰值相位和周期（2个相邻峰值的间隔）（图3和S3）。在 avp-CK1δ?/?;Per2：：Luc小鼠，在第一个峰处，壳像素中的峰相位比核心像素中的峰相位晚约5 h（图3A和3E–3G）。此外，在第一个周期中，壳中的周期（25.77±0.21小时）比核心（23.93±0.13小时）长约2小时（图3A和3B）。虽然核心像素以相对稳定的周期振荡，但壳像素的周期在随后的周期中迅速缩短，就好像核心细胞影响了壳细胞的周期（图3B和S3）。Avp-CK1δ 的结果?/?;Per2：：Luc小鼠与我们之前的报告一致[23]。

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图3. PER2：：LUC振荡周期在Avp-CK1δ的SCN切片中迅速变化?/?和CaMKIIα-CK1δ?/?小 鼠。

(A） 由对照制备的冠状SCN切片中具有代表性的第一峰相位（与切片平均值的相对相位）、周期（第一峰和第二峰之间的间隔）和像素水平PER2：：LUC振荡的幅度图，Avp-CK1δ?/?， CaMKIIα-CK1δ?/?和 Vip-CK1δ?/?小 鼠。计算每个周期覆盖SCN的单个像素中PER2：：LUC振荡的峰值相位、周期和幅度。振幅图上的白色方块表示被视为壳或核心的区域（15 × 15 像素），以便进一步分析。（B）壳（左）和核心（右）区域中单个像素PER2：：LUC振荡的平均周期的逐日变化。分析区域的示例如图3A所示。峰值、周期和周期的定义在 S3 图中表示。单个切片的左右SCN中2个区域的平均值被认为是单个小鼠的代表。蓝色，控制;红色，AVP-CK1δ?/?;橙色， CaMKIIα-CK1δ?/?;紫色， VIP-CK1δ?/?.（C）壳（左）和核心（右）区域中单个像素周期的标准偏差（SD）的逐日变化。（D）壳（左）和核心（右）区域中单个像素的PER2：：LUC振荡的平均峰值幅度（相对于第一个峰值幅度）的逐日变化。（东、女）不同小鼠系中壳（E）和核心（F）区域的平均第一峰期（ZT）显示为瑞利图。单个点表示每个鼠标的平均峰相。（G）对照小鼠SCN核心与其他小鼠系的壳或核心之间的峰相位差。圆形，贝壳;三角形，核心。值是 SEM ±平均值;n = 9 表示控制，n = 7 表示 Avp-CK1δ ?/?， n = 7 对于 CaMKIIα-CK1δ?/?， n = 6 表示 Vip-CK1δ?/?.基础数据可在 S1 数据中找到。字母表示基因型因子（g：与对照组相比）、日（d）或区域（r）的显着差异。g：基因型的影响，P < 0.05 通过克鲁斯卡尔-沃利斯秩和检验，然后是曼-惠特尼 U 检验与邦弗朗尼校正 （B， C） 或三向重复测量方差分析与事后瑞安检验 （D）;d：天的影响，P < 0.05 通过弗里德曼秩和检验，然后用邦弗朗尼校正（B，C）进行威尔科克森符号秩检验或三向重复测量方差分析与事后瑞安检验（D）;r：区域效应，P < 0.05 通过威尔科克森符号秩检验（B，C）或三向重复测量方差分析与事后瑞安检验（D）;g × d，基因型与日之间的相互作用（D，核心）;r × d，区域和日之间的相互作用（D，在所有基因型中）。*P < 0.05;**P < 0.01;P < 0.001 通过哈里森-汉字检验，然后是沃森-威廉姆斯检验与邦弗朗尼校正 （E， F） 或克鲁斯卡尔-沃利斯秩和检验，然后是曼-惠特尼 U 检验与邦弗朗尼校正（G，基因型-区域与对照核心的影响）。所有循环数据的瑞利检验P值<0.01。另见 S3 图。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002281.g003

在CaMKIIα-CK1δ?/?;Per2：：Luc小鼠，所有SCN神经元似乎都有类似的延长的PER2：：LUC节律周期。因此，我们预计这些小鼠的SCN外植体将显示出与对照小鼠相似的相干PER2：：LUC振荡，除了周期延长。事实上，核心像素在延长周期（约 25.5 小时）的情况下稳定振荡 3 个周期（图 3B，右）。然而，我们观察到壳像素中周期的快速时间变化，类似于Avp-CK1δ?/?;Per2：：Luc小鼠，除了大约1小时延长（图3B，左）。也就是说，在第一个峰值处，壳像素中的峰相位比核心像素中的峰相位晚约4 h（图3A和3E–3G）。此外，在第一个周期中，壳中的周期（27.09±0.32小时）比核心（25.87±0.11小时）长约1小时。然而，壳像素的周期在随后的周期中迅速缩短（图3B）。因此，在 CaMKIIα-CK2δ 中 SCN 切片培养物的 PER1：：LUC 表达中，没有保持连贯的昼夜节律。?/?小鼠，这是Avp-CK1δ的常见现象?/?小 鼠。一致地，单个像素周期的变异性在Avp-CK1δ的SCN外壳中增加?/?和CaMKIIα-CK1δ?/?小鼠（图3C）。此外，单个像素的PER2：：LUC振荡的峰值幅度在这2株小鼠的壳中衰减得更快（图3D）。这些观察结果表明，Avp-CK2δ的SCN壳中蜂窝PER1：：LUC振荡的衰减同步?/?和CaMKIIα-CK1δ?/?小鼠离体。相比之下，VIP-CK2δ 的 SCN 切片中的 PER1：：LUC 振荡?/?;Per2：：与对照小鼠相比，Luc小鼠没有显着差异。这一观察结果与他们正常的昼夜节律运动活动节律的自由运行期一致。

Avp-CK1δ的SCN AVP神经元钙节律的昼夜节律期?/?小鼠体内稳定延长

延长AVP神经元的细胞昼夜节律周期可以稳定地延长行为节律的自由运行周期。然而，它不能延长延长SCN培养物中的细胞PER2：：LUC节律。因此，我们假设AVP神经元的作用可能容易受到切片的影响。为了测试这种可能性，我们接下来通过记录细胞内Ca来测量SCN AVP神经元在体内的细胞周期。2+（[Ca2+]我） 在 Avp-CK36δ 中使用纤维光度法 [1] 的节律?/?和控制（Avp-Cre;CK1δ重量/絮）小鼠（图4）。为此，我们表达了荧光Ca。2+指示剂jGCaMP7s [37]专门用于SCN AVP神经元，方法是局部注射Cre依赖性AAV载体（AAV-CAG-DIO-jGCaMP7s），然后在SCN上方植入光纤（图4A和4B）。对检测到的jGCaMP7s信号进行平均、去趋势化和平滑处理，以提取每日[Ca2+]我节奏（见材料和方法）。我们将跨越零值的时间点定义为GCaMP信号的起点和偏移量，并将其中点定义为峰值相位。在控制和 Avp-CK1δ?/?小鼠，每日[Ca2+]我在LD和DD的SCN AVP神经元中观察到节律。如前所述，它们的峰值位于运动活动（家笼活动）的偏移量附近（图4C，4D，5A和S4A），如前所述对照组[36]。GCaMP峰值与运动偏移之间的关系在Avp-CK1δ中保持不变?/?小 鼠。因此，不仅是运动活动节律的周期，还有[Caa2+]我AVP神经元的节律在DD中类似地延长（GCaMP，对照23.77±0.18与Avp-CK1δ?/?24.42 ± 0.13， P < 0.05， 图5D;行为，对照 23.77 ± 0.10 与 Avp-CK1δ?/?24.43 ± 0.09，P < 0.001，图 5F，黑色）。如此加长 [Ca2+]我从DD开始就一致观察到节律期（图5H）。这一结果表明，AVP神经元中的CK1δ缺失导致其细胞在体内的昼夜节律周期稳定延长。

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图4. AVP神经元的体内昼夜节律期[Caa2+]我节律在 Avp-CK1δ 的 SCN 中延长?/?小 鼠。

(A）病毒载体（AAV-CAG-DIO-jGCaMP7s）注射和光纤植入在SCN控制（Avp-Cre;CK1δ重量/絮） 或 Avp-CK1δ?/? (Avp-Cre;CK1δ絮/絮絮）用于纤维光度记录的小鼠。（B）在SCN AVP神经元中表达jGCaMP7s的小鼠的代表性冠状切片。白色虚线方块表示植入光纤的估计位置。绿色，jGCaMP7s;蓝色，DAPI。比例尺，1毫米。 （C）SCN AVP神经元（绿色）的体内jGCaMP7s信号的代表性图，与运动活动（家笼活动）（黑色）在关节图中重叠。控制（左）和 AVP-CK1δ?/?（右）小鼠最初被饲养在LD（LD1至LD5）中，然后饲养在DD（DD1至DD12）中。暗区表示为灰色阴影区域。（D）运动活动开始（黑色），活动偏移（灰色），GCaMP开始（绿色），GCaMP偏移（浅绿色）和GCaMP峰（洋红色）的平均±SEM（左列）和单个小鼠数据（右列）的对照和Avp-CK1δ?/?小 鼠。相同的标记形状表示来自同一动物的数据。n = 5 用于控制（n = 3 无 Vip-tTA;n = 2 与 Vip-tTA）， n = 6 表示 Avp-CK1δ ?/? (n = 4 没有 Vip-tTA;n = 2，带 Vip-tTA）。基础数据可在 S1 数据中找到。另见S4图。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002281.g004

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图5. AVP 神经元、VIP 神经元和行为节律的周期在 Avp-CK1δ 中同样延长?/?小鼠体内。

(A-C）在LD（LD1-5，A）或DD中投影ZT（DD8-10，B）或CT（C）中AVP和VIP GCaMP荧光节律的峰相显示为瑞利图。单个点表示每个鼠标的峰值相位。（D）LD（LD1-5，左）或DD（DD8-10，右）中的AVP-神经元GCaMP荧光节律周期。（E）LD或DD中的VIP-神经元GCaMP荧光节律周期。 （F）LD或DD中运动活动开始的周期。 黑色圆圈，来自AVP-GCaMP实验的数据;白色圆圈，来自VIP-GCaMP实验的数据。结合AVP-GCaMP和VIP-GCaMP实验的数据进行统计分析。（G） LD（LD1-5，左）或DD（DD8-10，右）中运动活动节律的活动时间。蓝色， 控制 （avp-CK1δ+/?，即 Avp-Cre;CK1δ重量/絮);红色，Avp-CK1δ?/?.±对于 AVP-GCaMP： Control， n = 5 对于 AVP-GCaMP： Avp-CK6δ?/?， n = 6 表示 VIP-GCaMP： 控制， n = 4 表示 VIP-GCaMP： Avp-CK1δ?/?.*P < 0.05;**P < 0.01;P < 0.001 通过哈里森-汉字检验，然后是沃森-威廉姆斯检验（A 到 C），或者通过双尾韦尔奇 t 检验（D 到 G）。瑞利检验所有循环数据的P值<0.01。（H， I）LD（3天）和DD（9天）中AVP-（H）或VIP-神经元（I）GCaMP荧光节律期间的逐日变化。±对于 AVP-GCaMP： Control， n = 3 对于 AVP-GCaMP： Avp-CK5δ，n = 1?/?， n = 5 表示 VIP-GCaMP： 控制， n = 3 表示 VIP-GCaMP： Avp-CK1δ?/?.*P < 0.05;P < 0.001 通过双向重复测量方差分析。N.S.，不重要。基础数据可在 S1 数据中找到。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002281.g005

AVP神经元控制体内VIP神经元的钙节律

接下来，我们询问了Avp-CK1δ中SCN壳和核心昼夜节律振荡是否在体内?/?小鼠像切片中一样解离或保持同步。由于SCN核心中的VIP神经元对于维持SCN中昼夜节律振荡器的相干性非常重要[14，15，18，38，39]，我们检查了[Ca2+]我SCN VIP神经元的节律在Avp-CK1δ中改变?/?小鼠体内。特异性靶向Avp-CK7δ的VIP神经元中的jGCaMP1s表达?/?小鼠，我们首先穿越了Avp-CK1δ?/?（或对照）与Vip-tTA敲入小鼠[40]。在Vip-tTA小鼠中，VIP神经元特异性表达四环素反式激活剂（tTA）。然后，我们将tTA依赖性AAV载体（AAV-TRE-jGCaMP7s）注入SCN（图6A和6B）。[Ca2+]我在两个对照中，VIP神经元的节律与运动活动节律相反相同步（Avp-Cre;CK1δ重量/絮;Vip-tTA）和Avp-CK1δ?/?;Vip-tTA小鼠（图6C，6D和S4B）。此外，运动开始的时间和GCaMP偏移的时间几乎相同，而运动偏移和VIP GCaMP开始的时间在LD和DD中相关（图6C，6D和S4B）。在 avp-CK1δ?/?小鼠，VIP神经元[Ca2+]我DD 患者的节律延长程度与 AVP 神经元 [Ca2+]我和行为节律（GCaMP，对照 23.87 ± 0.03 与 Avp-CK1δ?/?24.47 ± 0.05，P < 0.001，图 5E）。如此加长 [Ca2+]我从DD开始就一致观察到节律期（图5I）。重要的是，作为对照，我们验证了通过注射AAV-TRE-EGFP表达EGFP的VIP神经元显示出非常小的荧光昼夜节律振荡（S4C图）。这些结果表明，AVP和VIP神经元的细胞昼夜节律在Avp-CK1δ中保持体内同步。?/?小 鼠。

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图6. VIP神经元的体内昼夜节律期[Ca2+]我节律在 Avp-CK1δ 的 SCN 中延长?/?小 鼠。

(A）病毒载体（AAV-TRE-jGCaMP7s）注射和光纤植入在SCN控制（Avp-Cre;CK1δ重量/絮;Vip-tTA） 或 Avp-CK1δ?/? (Avp-Cre;CK1δ絮/絮絮;Vip-tTA）小鼠用于纤维光度记录。（B）在SCN VIP神经元中表达jGCaMP7s的小鼠的代表性冠状切片。白色虚线方块表示植入光纤的估计位置。绿色，jGCaMP7s;蓝色，DAPI。比例尺，1毫米。 （C）SCN VIP神经元（绿色）的体内jGCaMP7s信号的代表性图，与运动活动（家笼活动）（黑色）在谱图中重叠。控制（左）和 AVP-CK1δ?/?（右）小鼠最初被饲养在LD（LD1至LD5）中，然后饲养在DD（DD1至DD10）中。暗区表示为灰色阴影区域。（D）运动活动开始（黑色），活动偏移（灰色），GCaMP开始（绿色），GCaMP偏移（浅绿色）和GCaMP峰（洋红色）的平均±SEM（左列）和单个小鼠数据（右列）的对照和Avp-CK1δ?/?小 鼠。相同的标记形状表示来自同一动物的数据。n = 6 表示控制，n = 4 表示 Avp-CK1δ ?/?.基础数据可在 S1 数据中找到。另见S4图。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002281.g006

AVP神经元，VIP神经元和行为昼夜节律之间的相位关系如何？总体而言，LD中GCaMP信号的峰值相位在对照组和Avp-CK1δ之间相似?/?用于AVP和VIP神经元的小鼠（AVP：对照，ZT 2.74±0.57;Avp-CK1δ?/?， ZT 3.82 ± 0.74， 图 5A， 顶部;真空绝热板：控制，ZT 4.98 ± 0.54;Avp-CK1δ?/?， ZT 5.99 ± 0.17， 图 5A， 底部）。AVP神经元峰值早于VIP神经元（对照，P < 0.05;Avp-CK1δ?/?， P = 0.07） 在 LD 中。由于自由运行周期的延长，AVP神经元[Caa2+]我在预测的ZT在Avp-CK1δ中明显较晚?/?在DD的第8至10天（对照，预计ZT 0.72±0.69;Avp-CK1δ?/?，预计ZT 6.15±0.65，P < 0.001，图5B，顶部），但在CT（昼夜节律时间）上没有差异，由运动活动开始定义为CT12（对照，CT 3.16±0.66;Avp-CK1δ?/?，CT 4.43 ± 0.76，图 5C，顶部）。VIP神经元[Ca-Ca]的情况2+]我在DD中相似（对照，预计ZT 4.48±0.22;Avp-CK1δ?/?，预计ZT 9.47± 0.36，P < 0.001，图5B，底部;对照，CT 5.64 ± 0.17;Avp-CK1δ?/?，CT 6.23 ± 0.44，图 5C，底部）。因此，[Ca2+]我AVP和VIP神经元的节律在Avp-CK1δ中保持不变?/?小 鼠。请注意，TTFL周期仅在AVP中被人为延长，而在VIP神经元中没有。这些结果表明，AVP神经元可以调节VIP神经元在体内的细胞昼夜节律周期。

AVP对于AVP神经元的细胞昼夜节律期的传递不是必需的

为了测试AVP肽是否对于SCN AVP神经元将其细胞周期传递给其他SCN神经元至关重要，我们使用体内基因组编辑选择性地破坏了这些神经元中的Avp基因。首先，我们进一步越过了Avp-CK1δ?/?Rosa26-LSL-Cas9-2A-EGFP小鼠，其SpCas9 Cre依赖性表达[41]。然后，我们将表达靶向Avp（AAV-U6-gAvp-EF1α-DIO-mCherry）或对照AAV（AAV-U6-gControl-EF1α-DIO-mCherry）的gRNA的AAV载体注射到Avp-CK1δ的SCN中。?/?;Rosa26-LSL-Cas9小鼠（S5A图）[41，42]。注射AAV-U6-gAvp-EF1α-DIO-mCherry可有效降低SCN中的AVP免疫反应性（S5B-S5F图）。然而，Avp敲低并没有显着减少这些小鼠自由运行期的延长（S5G-S5I图）。因此，AVP肽可以可有可无地用于将AVP神经元的细胞时钟的周期长度传输到整个SCN网络。

VIP神经元对体内AVP神经元的光遗传学激活做出反应

为了调节VIP神经元的钙节律，SCN AVP神经元应该与VIP神经元有一定的功能连接。因此，我们通过顺行追踪测试了AVP神经元向VIP神经元的投射。为此，我们将表达突触素融合GFP报告基因的AAV载体以Cre依赖性方式（AAV-EF1α-DIO-Synaptophysin：：GFP）[43]注入Avp-Cre小鼠的SCN中。突触素：：SCN AVP神经元的GFP阳性纤维分散在整个SCN（图7A）。我们确认了这些纤维在VIP神经元上的至少一些，但不是很多（图7B）。这一结果与之前的一项研究一致，即AVP纤维与VIP神经元进行稀疏接触，而它们与GRP和钙视黄蛋白神经元进行大量接触;后两者反过来又与VIP神经元进行密集接触[44]。

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图 7. AVP神经元在功能上连接到SCN中的VIP神经元。

(A，B）融合蛋白突触素：：GFP通过将AAV-EF1α-DIO-synaptophysin：：GFP注射到Avp-Cre小鼠的SCN中在AVP神经元的轴突末端表达。从左起，SCN的代表性冠状部分显示了天然突触素：：GFP荧光（绿色），VIP免疫染色（品红色）或合并信号（白色）。（A）中的白色矩形表示（B）放大图像的位置。一些突触素：：GFP标记的AVP神经元轴突末端存在于SCN中的VIP神经元周围。比例尺，200 （A） 或 20 μm （B）。（C）病毒载体（AAV-CAG-Flex-ChrimsonR-mCherry和AAV-TRE-jGCaMP7s）注射和光纤植入在Avp-Cre的SCN示意图;Vip-tTA小鼠用于SCN VIP神经元的纤维光度记录[Ca]2+]我和SCN AVP神经元的光遗传学刺激。（D）在SCN AVP神经元中表达ChrimsonR-mCherry和在SCN VIP神经元中表达jGCaMP7s的小鼠的代表性冠状切片。白色虚线方块表示植入光纤的估计位置。红色，麦切里;绿色， jGCaMP7s;蓝色，DAPI。比例尺，1 mm。 （E） 上图：SCN VIP 神经元在体内 ZT7 对 AVP 神经元进行光遗传学刺激时 jGCaMP22s 信号的代表性痕迹（左，ChrimsonR;右，mCherry 对照）。绿色迹线表示 470 nm 光激发 （F470） 处的荧光 （F） 值，Ca。2+-依赖信号。洋红色迹线表示 415 nm 光激发 （F415） 下的荧光值，Ca。2+-独立的控制信号。红色阴影表示光刺激的时间（635 nm，50 ms脉冲，5 Hz，120 s）。底部：比率 （R） 由 F470/F415 从上部迹线计算得出。基线比率（R0） 是预刺激期的平均 R 值 （?30 s–0 s）。ΔR是刺激期（90 s–120 s）晚期的平均R值与R之差0.a.u.，任意单位。光遗传学刺激SCN AVP神经元增加VIP神经元[Caa2+]我在自由移动的老鼠中。（F） ΔR/R 的比较0%在晚期刺激期。n =4. *P < 0.05 通过曼-惠特尼 U 检验。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002281.g007

最后，我们通过记录[Ca2+]我VIP神经元对体内SCN AVP神经元光遗传学激活的反应。为此，我们通过将AAV-CAG-FLEX-ChrimsonR-mCherry和AAV-TRE-jGCaMP45s分别在AVP和VIP神经元中表达ChrimsonR-mCherry（一种红光门控阳离子通道[46，7]）和jGCaMP7s;Vip-tTA小鼠（图7C和7D）。引人注目的是，ZT22周围SCN AVP神经元的光遗传学激活，当[Ca2+]我在AVP和VIP神经元中相对较低，通过光纤光度法测量的VIP神经元中的jGCaMP7s信号急剧增加（图7E和7F）。这些数据表明，SCN AVP神经元可以在体内激活VIP神经元。

讨论

在本研究中，我们发现CK1δ泛SCN缺失引起的行为节律周期延长与AVP神经元特异性缺失引起的行为节律延长相当。相比之下，我们没有观察到VIP神经元特异性CK1δ缺乏症小鼠的行为期有任何变化。在切片中，PER2：：LUC节律不能完全再现Avp-CK1δ中SCN网络融合周期的假定延长。?/?小 鼠。相比之下，在体内，[Ca2+]我SCN AVP和VIP神经元的节律在Avp-CK1δ中相干振荡?/?随着行为节律延长的小鼠。此外，AVP神经元的光遗传学刺激急剧增加[Caa2+]我在VIP神经元中。总的来说，这些数据表明AVP神经元在体内昼夜节律起搏中起着主要作用，以确定SCN网络的集成期。这一观察结果强调了SCN网络动力学体内分析的重要性。

AVP神经元是SCN体内融合期的主要决定因素

先前利用神经元类型特异性遗传操作的研究表明，NMS神经元、AVP神经元、Drd1a神经元和VPAC2神经元在设置SCN的系综周期方面具有重要意义[21，23，24，25，47]。相比之下，尽管VIP是SCN神经元的关键同步器，但VIP神经元本身的TTFL可能对整个SCN网络的起搏贡献不大。

最近，Hamnett及其同事证明，延长VPAC2神经元中的细胞周期（由特定的Cre驱动系标记）也会延长昼夜节律轮运行节律的自由运行期[25]。然而，SCN切片的PER2：：LUC节律并不能反映这些小鼠的行为周期。体内和离体期之间的这种不一致类似于我们目前和以前对AVP神经元特异性延长细胞周期的观察。此外，这些纵的VPAC2神经元大多局限于SCN壳，包括约85%的AVP神经元[28]。因此，他们和我们的发现表明，VPAC2 / AVP神经元在体内设置SCN集成周期的能力在切片中丢失。有趣的是，他们报告说，VPAC2神经元还需要VIP神经元的贡献来决定SCN切片周期[28]。这一观点还解释了NMS神经元（包括AVP和VIP神经元）的细胞周期延长成功地延长了SCN切片和行为的周期[21]。另一方面，我们目前研究的一个本质意义是证明体内AVP神经元单独可以控制其他SCN神经元（如VIP神经元）的昼夜节律，并确定SCN集成周期来控制行为节律。

事实上，最近有报道称，SCN AVP神经元的光遗传学刺激促进了昼夜节律[48]。在这项研究中，我们还证明，这些神经元的光遗传学刺激立即增加了VIP神经元[Ca2+]我体内。然而，这种效应是否由AVP神经元与VIP神经元的直接或间接连接介导仍然难以捉摸。SCN连接组分析仅报道了AVP神经元直接投射到VIP神经元上的稀疏投影[44]。相反，大多数GRP和钙视黄蛋白神经元接收AVP纤维并将投影发送到SCN中的VIP神经元。综上所述，AVP神经元可以通过GRP或钙视黄蛋白神经元间接连接到VIP神经元。

SCN昼夜节律期的稳定性在离体和体内之间有所不同

那么，是什么导致了体内和体外之间的周期差异呢？AVP神经元可能需要与在切片中丢失的SCN外区域直接或间接连接，以对整个SCN产生影响。另一种可能性，似乎对我们更有吸引力，是切片破坏了SCN内部的通常连接和体液环境，因此AVP神经元无法将周期信息传递给其他SCN神经元。形式上也有可能是由于更一般的因素，例如通过培养重置PER2：：LUC节律和切片中CK1δ缺陷细胞的存活率较低。本研究的另一个技术限制可能是体外（PER2：：LUC）和体内（[Ca2+]我） 测量。虽然2+已在新生儿器官型SCN培养物中成功进行了影像学检查[49，50]，我们不知道有任何Ca。2+成人SCN培养的影像学研究。类似地，测量Avp-CK2δ中VIP神经元PER1：：LUC节律的技术?/?体内小鼠目前不可用。尽管如此，[Ca2+]我PER2：：LUC在大多数时候可能在同一周期但不同阶段振荡[49，50]。

我们之前已经证明，来自AVP神经元的GABA对于将其细胞期传递到行为期是不必要的[36]。在这里，我们表明 AVP 对于 Avp-CK1δ 中的昼夜节律起搏设置也是可有可无的?/?小 鼠。这一发现与先前的报道一致，即AVP信号传导的遗传和药理学阻断可能会减弱SCN中的神经元间通讯，但行为期或SCN切片PER2：：LUC节律几乎没有变化[51-55]，但一项研究报告高剂量V1a或V1b受体拮抗剂延长了PER2：SCN切片中的LUC周期[56]。然而，AVP和GABA仍有可能充当冗余发射器来介导AVP蜂窝周期。或者，SCN AVP神经元中表达的其他肽，如NMS、胆囊收缩素和促动力素2[21，57-59]，可能负责集合周期的设置。一般来说，肽通常参与体积传递而不是突触传递[60]。因此，AVP神经元的肽能传递在切片培养物中可能更具扩散性和衰减性。此外，由于AVP神经元分布在核心周围，因此在包含壳和核心的冠状切片中，AVP神经元与核心细胞的比例小于体内。这种情况可能是AVP神经元的细胞周期没有在整个SCN切片中反映的另一个原因。

在这种情况下，令人惊讶的是，在CaMKIIα-CK2δ的SCN切片中，PER1：：LUC节律在壳和核心之间解离。?/?小 鼠。因为，与 Avp-CK1δ 相反?/?小鼠，所有SCN神经元都被认为缺乏CK1δ。对这一观察结果的简单解释是，CK1δ对壳细胞和核心细胞之间的细胞周期设置的贡献不同。它的缺乏可能会延长壳中的细胞周期而不是核心中的细胞周期，导致SCN内细胞周期的嵌合，如Avp-CK1δ?/?小 鼠。精确测量每种类型的CK1δ的内在细胞周期在技术上具有挑战性?/?SCN神经元（例如AVP神经元和VIP神经元）在完全排除细胞外输入的情况下[10，11，61]。培养物中PER2：：LUC节律的初始期可能反映但与内在细胞期不同。这是因为应该有一些细胞间通讯可能会影响细胞周期。

在Avp-CK0δ中，行为周期延长约8.0至9.1小时?/?和CaMKIIα-CK1δ?/?小鼠似乎小于在CK1δ中观察到的约5.2至1小时的延长?/?外周细胞，如原代小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）和肝外植体[8]。然而，行为节律的这种周期延长的明显减少可能归因于体内SCN网络的性质。事实上，一系列CRY1突变引起的昼夜节律期改变在行为节律上比在MEF的细胞振荡中小得多，在行为上收敛接近24小时[62]。

无论如何，这项研究证明了测量SCN网络在体内动力学的重要性。虽然切片制备有利于检查SCN中细胞时钟的时空组织，但SCN切片与行为节律之间存在较大差距。事实上，也有报道称行为自由运行期与切片Per1-Luc、Per1-Gfp或PER2：：LUC振荡周期之间存在不一致[22，63-67]。SCN动力学的体内记录将在填补这一空白方面发挥关键作用。通过使用Cre / loxP和Tet系统结合转基因小鼠和AAV载体[40]，我们成功地分别测量了AVP神经元特异性基因敲除小鼠中AVP和VIP神经元的体内细胞振荡。这种双靶向策略对于研究SCN内2种不同类型的细胞之间的相互作用是有效的，SCN是一个由多种类型的神经元和神经胶质细胞组成的小而复杂的网络。

SCN中AVP和VIP神经元之间的钙节律形状不同

AVP神经元体内钙活性接近正弦曲线（图4C）。相比之下，VIP神经元的钙信号接近于开和关方脉冲（图6C），这几乎描绘了（主观）一天。这种日常模式[Ca2+]我与之前的报道一致[18，36，68]。在培养的单个SCN神经元中，时钟基因表达节律是准正弦的，而神经元活动节律通常是准矩形的。[加2+]我节律可能是中间的和可变的，这似乎由细胞间神经元网络和连接TTFL到[Ca] 的细胞内调节剂调节2+]我 [11，12，61，69–71]。

以此类推，AVP-神经元 [Ca2+]我节律可能主要由细胞内 TTFL 机制调节，而神经元放电可能对 VIP 神经元 [Ca2+]我.如前所述[28]，除了神经元活动和Ca之外的一些机制2+流入，例如cAMP响应元件（CRE）依赖性转录[72]，对于调节VPAC2/AVP神经元中的TTFL可能至关重要。越矩形 [Ca2+]我VIP神经元的节奏就像一个开关。这种形状可能适合根据运动活动、睡眠觉醒和其他身体功能的 LD 周期设置时间框架。

AVP神经元作为SCN网络的主要振荡部分

如上所述，AVP神经元可能是SCN网络时钟的主要标兵。此外，重新评估具有AVP神经元特异性Bmal1缺失（Avp-Bmal1?/?小鼠）显示，它们的轮子运行节律受到的破坏与NMS或VPAC2神经元特异性Bmal1缺失的小鼠相似[21，25]。

总之，我们提出了以下模型，以整合先前报告和本研究中的发现。AVP神经元作为SCN网络的主要振荡部分，决定周期并负责振荡本身。然而，AVP神经元的细胞时钟可能是草率的，不一定是自我维持的。因此，AVP神经元细胞时钟的持续振荡可能需要由其他SCN神经元驱动。VIP神经元可能扮演这个角色，耦合AVP神经元群，并传递有关外部光的信息以调节AVP细胞节律的阶段。通过这种方式，VIP对于昼夜节律起搏至关重要。另一方面，AVP神经元的TTFL调节节律性VIP释放的周期。因此，SCN网络中细胞类型之间的功能分化和相互相互作用发挥了中心时钟功能。

材料和方法

道德声明

所有实验程序均获得金泽大学动物实验委员会（批准号：AP-173836，AP-224337），金泽大学基因重组实验安全委员会（批准号：Kindai 6-2124，6-2598），明治大学机构动物护理和使用委员会（批准号：IACUC20-126）和明治大学重组DNA实验安全委员会（批准号： D-19-4）。该研究是根据《文部科学省管辖的学术研究机构正确进行动物实验和相关活动的基本准则》（71年第2006号公告）和《实验动物护理、饲养和减轻疼痛标准》（环境省88年第2006号通知）进行的。

动物

既往报道过Avp-Cre和Vip-tTA小鼠[22，40]。该Avp-Cre系是携带修饰BAC转基因的转基因小鼠，其将密码子改良的Cre重组酶基因立即插入BAC中外源性Avp基因的翻译起始密码子5′，但没有操纵小鼠的内源性Avp位点。因此，该菌株不同于广泛使用的Avp-ires2-Cre（JAX #023530），后者显示AVP的亚态表达[73]，以及另一个Avp-ires-Cre系[74]。CK1δ絮絮（JAX #010487）[8]， Bmal1絮絮小鼠 （JAX #007668） [75]， Vip-ires-Cre （Viptm1（cre）Zjh/J，JAX #010908）[33]和Rosa26-LSL-Cas9-2A-EGFP小鼠（JAX #026175）[41]从杰克逊实验室获得。CaMKIIα-Cre （Camk2a：：iCreBAC） [30] 取自欧洲小鼠突变档案馆 （EMMA #01153）。Per2：：Luc报告小鼠由Joseph Takahashi博士提供[35]。所有品系在C57BL / 6上都是同源的：在C57BL / 6J上产生Avp-Cre和Vip-tTA小鼠;CK1δ絮絮（N>12）， Bmal1絮絮（N>9）、Vip-ires-Cre （N>7）、Per2：：Luc （N>10） 和 Rosa26-LSL-Cas9-2A-EGFP （N>7） 在使用前被回交到 C57BL/6J;CaMKIIα-Cre回交至C57BL/6N（N>10），然后杂交至CK1δ絮絮和 Per2：：Luc。我们将条件敲除与遗传背景可比的对照组进行了比较。Avp-Cre，CaMKIIα-Cre，Vip-ires-Cre，Per2：：Luc，Vip-tTA和Rosa26-LSL-Cas9-2A-EGFP小鼠用于半合子或杂合子条件。我们在实验中使用了雄性和雌性小鼠（S1数据）。无论我们合并了两性的数据还是单独分析了它们，我们得出的结论都是一样的。在温度和湿度控制的房间里将小鼠保持在严格的12小时光照/ 12小时黑暗循环下，并随意喂食。

行为分析

公头和母头 CaMKIIα-CK1δ?/? (CaMKIIα-Cre;CK1δ絮/絮絮) (图1）， VIP-CK1δ?/? (VIP-ires-Cre;CK1δ絮/絮絮) (图 2），和 Avp-CK1δ?/?;Rosa26-LSL-Cas9-2A-EGFP （avp-cre;CK1δ絮/絮絮;Rosa26-LSL-Cas9-2A-EGFP）（S5图）小鼠，年龄为8至20周，将单独饲养在放置在光密室（光强度约为100勒克斯）中的笼子中。如前所述，在1分钟箱中通过红外运动传感器（O'Hara）监测自发运动活动（家笼活动）[22]。CK1δ絮/絮絮和CaMKIIα-Cre;CK1δ重量/絮同窝虫作为CaMKIIα-CK1δ的对照?/?小 鼠。CK1δ絮/絮絮和 Vip-ires-Cre;CK1δ重量/絮同窝伴侣用作Vip-CK1δ的对照?/?小 鼠。因为 2 条控制线 （CK1δ絮/絮絮和克雷;CK1δ重量/絮） 对于每个条件敲除的行为相似，我们将它们一起视为对照。活动图、活动概况和 χ2周期图分析通过ClockLab（Actimetrics）进行。通过周期图测量第 10 至 24 天（图 1 和 2）或 DD 中最后 10 天的自由运行期（S5 图）。根据相同15天的每日活动概况（平均活动模式）计算活动时间，使用平均活动水平作为检测活动时间开始和偏移的阈值[22]。测量Avp-CK1δ的车轮运行活动?/? (Avp-Cre;CK1δ絮/絮絮）， Avp-Bmal1?/? (Avp-Cre;Bmal1絮/絮絮），并如前所述对照小鼠[76]。简而言之，每只老鼠都被安置在一个单独的笼子里，笼子里装有一个跑轮（直径12厘米;日本大阪三光）。笼子放在通风的盒子里;笼子底部的光强度为200至300勒克斯。车轮转数以 1 分钟箱计算。时间生物学工具包（斯坦福软件系统）和时钟实验室软件（Actimetrics）用于数据收集和分析。在DD中，通过周期图测量过去7天的自由运行期（S2图）。

生物发光成像

Avp-CK1δ?/?， CaMKIIα-CK1δ?/?和 Vip-CK1δ?/?小鼠进一步与Per2：：Luc报告小鼠[35]交配（Avp-Cre;CK1δ絮/絮絮;Per2：：Luc， CaMKIIα-Cre;CK1δ絮/絮絮;Per2：：Luc， Vip-Cre;CK1δ絮/絮絮;Per2：：Luc）并与对照小鼠（CK1δ絮/絮絮;Per2：：Luc）。在采样前将8至17周的雄性和雌性小鼠饲养在LD中。在ZT150–8上用线性切片机（NLS-MT;土坂）。培养前颈中区的SCN组织，每9分钟成像一次PER2：：LUC生物发光，使用EMCCD相机（Andor，iXon30）曝光时间为25分钟，如前所述[3]。

使用ImageJ和MATLAB（MathWorks）分析图像。将图像的分辨率调整为4.6μm/像素以进行进一步分析。通过减去24 h移动平均值来去除单个像素的生物发光值，然后用15点移动平均法进行平滑处理。向上和向下穿过值0的时间点的中间定义为峰值相位，而这两个时间点之间的最大值定义为幅度。2个相邻峰相之间的间隔计算为周期[2]。SCN侧侧区域的值被视为背景。因此，消除了值低于背景的像素以进行进一步分析。计算每个周期的单个像素振荡周期。然后，在左右SCN的外壳和核心中定义方形感兴趣区域（ROI，22×15像素）。消除周期短于15 h或长于4 h的像素，以计算平均周期、幅度和峰值相位。首先分别处理左右ROI中的像素。然后，将这两者的平均值视为个体小鼠的代表。

病毒载体和手术

含有质粒pGP-AAV-CAG-FLEX-jGCaMP2s-WPRE（Addgene质粒#7，来自Douglas Kim博士和GENIE项目的礼物）[104495]和pAAV-TRE-EGFP（Addgene质粒#37，来自Hyungbae Kwon博士的礼物）[89875]的AAV-77 ITR是从Addgene获得的。pAAV-TRE-jGCaMP7s和pAAV-U6-gAvp-EF1α-DIO-mCherry已在前文中描述[40，42]。pAAV-U6-gControl-EF1α-DIO-mCherry包含来自pX333（Addgene质粒#64073，Andrea Ventura博士的礼物）的间隔序列，而不是Avp的gRNA序列。pAAV-EF1α-DIO-synaptophysin：：GFP [43]由华盛顿大学的Richard D. Palmiter博士提供。pAAV-CAG-FLEX-ChrimsonR-mCherry是通过将含有pAAV-CAG-FLEX-EGFP EGFP的EGFP的NheI-AscI片段替换为含有ChrimsonR-mCherry PCR扩增的NheI-AscI片段而生成的，该片段是从Addgene获得的（#36，Alice Ting博士的礼物）[92207]。作为光遗传学研究的阴性对照，我们注射了AAV-EF46α-DIO-hM1Dq-mCherry，该样品由北卡罗来纳大学Bryan Roth博士提供的质粒pAAV-EF3α-DIO-hM1Dq-mCherry产生[3]。使用三重转染、无辅助方法制备重组AAV载体（AAV78-rh2），并如前所述进行纯化[10]。通过定量PCR测定重组AAV载体的滴度：AAV-CAG-DIO-jGCaMP22s，7.3×413;AAV-TRE-jGCaMP7s， 6.3 × 1011;AAV-TRE-EGFP， 5.7 × 1011;AAV-U6-gAvp-EF1α-DIO-mCherry， 6.4 × 1012;AAV-U6-gControl-EF1α-DIO-mCherry， 2.6 × 1012;AAV-EF1α-DIO-突触素：：GFP， 1.2 × 1013;AAV-CAG-FLEX-ChrimsonR-mCherry， 1.5 × 1013;和AAV-EF1α-DIO-hM3Dq-mCherry，4.5 × 1012基因组拷贝/毫升。如前所述，AAV载体的立体定位注射[22]。手术两周后，我们开始监测小鼠的运动活动。

体内纤维光度法

我们使用了 6 Avp-CK1δ?/?× Vip-tTA （Avp-Cre;CK1δ絮/絮絮;Vip-tTA）小鼠，4 Avp-CK1δ?/? (Avp-Cre;CK1δ絮/絮絮）小鼠和11只对照小鼠（8只Avp-Cre;CK1δ重量/絮;VIP-tTA 和 3 avp-cre;CK1δ重量/絮).我们合并了Avp-Cre的数据;CK1δ絮/絮絮;Vip-tTA和Avp-Cre;CK1δ絮/絮絮对于AVP神经元记录，考虑到缺乏组间差异。另外4只小鼠（Vip-tTA）用于对照实验，以测量VIP神经元中的EGFP信号。通过施用美托咪定（0.3mg / kg），咪达唑仑（4mg / kg）和布托酚（5mg / kg）的混合物麻醉小鼠，并将其固定在立体定位装置（Muromachi Kikai）上。利多卡因（8%）在手术切口前用于局部麻醉。我们使用牙钻在颅骨的暴露区域钻了小孔。我们用0G汉密尔顿注射器（5RN神经注射器，汉密尔顿）在右侧SCN（后部：1.0毫米，侧面：7.7毫米，深度：距前部0.1毫米）注射0.5至0.25μL病毒（AAV-CAG-DIO-jGCaMP5s或AAV-TRE-jGCaMP7s）（流速= 33.1701μL/min）以标记AVP神经元。随后，我们将植入式光纤（400μm芯，N.A. 0.39，6 mm，套圈2.5 mm，FT400EMT-套管，Thorlabs）放置在SCN上方（后部：0.2毫米，横向：0.2毫米，深度：距前部5.2至5.4毫米）和牙科水泥（Super-bond C&B，Sun Medical）。牙科水泥被漆成黑色。术后给予阿替美唑（0.3mg / kg）以缩短麻醉期。小鼠在病毒注射和光纤植入后2至7周用于实验。他们的年龄为3至10个月大，包括男性和女性。

使用光纤光度测量系统（COME2-FTR，Lucir）记录自由运动小鼠SCN神经元的钙信号[36，79]。光纤耦合LED（M470F3，Thorlabs）与LED驱动器（LEDD1B，Thorlabs）被用作激发蓝光光源。光被二向色镜（495 nm）反射，通过激发带通滤光片（472/30 nm），然后通过定制的跳线（400 um芯，N.A. 0.39，套圈2.5 mm，长度50 cm，COME2-FTR / MF-F400，Lucir）和植入的光纤到达动物。我们通过光电倍增管通过相同的光纤和发射带通滤光片（7/520 nm）检测jGCaMP36s荧光信号;此外，我们使用Power Lab（AD Instruments）和Lab Chart 8软件（AD Instruments）记录信号。动物侧跳线尖端的激发蓝光强度为2.5至100μW。我们在 30 周内每 10 分钟记录相同的 2 秒，以减少光漂白。在记录过程中，将鼠标置于12小时明暗循环中超过5天（LD条件），然后在由声音衰减室包围的定制丙烯酸笼中移动到连续黑暗约10天（DD条件）。在记录过程中停止了跳线的旋转接头，以防止人为的基线波动。使用红外传感器（Supermex PAT。P和CompACT AMS Ver. 3，Muromachi Kikai）。

检测到的jGCaMP7s信号在30-s会话内取平均值[36]。为了在记录日中消除信号逐渐减少的趋势，计算了从时间（12点）开始的±145小时平均值作为基线（F）。数据随后通过减去F（ΔF）来消除趋势。然后，计算ΔF/F值。为了确定jGCaMP7s钙信号的峰相，用21点移动平均线对ΔF/F进行平滑处理，然后将上下交叉值0的时间点中间定义为峰相。此外，峰值期之间的间隔定义为周期[22]。通过减去ΔF的最小值将所有ΔF转换为正值，设计了jGCaMP7s或EGFP信号的双图谱。随后，将这些值乘以 100 或 1，000 并四舍五入。这些图是通过ClockLab（Actimetrics）制作的，每行都有归一化。还制备了运动活动的双图谱，并覆盖在jGCaMP7s信号上。

使用运动活动的轨迹图确定运动活动的开始和偏移。最初，我们试图自动检测发病和偏移;然而，随后是手动目视检查，以及实验者的修改。为了计算GCaMP信号峰值相位的CT，我们将运动活动开始的回归线定义为CT12。

我们通过使用低温恒温器（徕卡）将大脑切成7μm的冠状切片来确认jGCaMP100s的表达和光纤的位置。切片安装在带有安装介质的载玻片上（VECTASHIELD HardSet with DAPI、H-1500、Vector Laboratories），并通过落射荧光显微镜（基恩士，BZ-9000E）观察。

用纤维光度法进行体内光遗传学刺激

我们使用了 8 个 Avp-Cre;Vip-tTA小鼠（ChrimsonR的n = 4，对照的n = 4，雄性和雌性）。我们在右侧SCN（后部：1.0毫米，横向：7.1毫米，深度：距前方3.7毫米）注射0.5μL病毒混合物（AAV-TRE-jGCaMP0s与AAV-CAG-Flex-ChrimsonR-mCherry或AAV-EF25α-DIO-hM5Dq-mCherry和AAV-TRE-jGCaMP7s）（后部：400.0毫米，深度：距前方39.6毫米），然后在SCN上方（后部： 0.2毫米，侧面：0.2毫米，深度：距前膛5.3毫米）用牙科水泥。小鼠在手术后2周以上用于实验。

使用光纤光度测量系统（FP3002，神经光度测量）记录自由运动小鼠中具有光遗传学刺激的SCN神经元的钙信号[80，81]。激发光源是用于检测钙依赖性jGCaMP470s荧光信号的7 nm LED（F470）和用于钙非依赖性等硫磷荧光信号的415 nm LED（F415）。激发灯的持续时间为50 ms，LED激发时序的开始是交错的。光通过激发带通滤光片、二向色镜，然后通过光纤跳线（BBP（4）_400/440/900-0.37_1m_FCM-4xFCM_LAF、MFP_400/440/LWMJ-0.37_1m_FCM-ZF2.5_LAF、多立克透镜）和植入的光纤到达动物。随后，使用CMOS相机通过光纤、二向色镜和发射带通滤光片检测这两个信号。记录的信号是使用盆景软件采集的，每种颜色的采样率为 10 Hz。动物侧跳线尖端的 470 nm 和 415 nm LED 的激发强度分别为 130 μW 和 90 μW。此外，635 nm 红色激光（在光纤光度测量系统 FP3002 内部）通过相同的光纤传输，强度为 2 mW。在ZT720的22-s记录期间，在记录的中间施加光刺激（635 nm，50 ms脉冲，5 Hz，120 s，600脉冲计数）。在整个实验过程中，将小鼠安置在由声音衰减室包围的定制丙烯酸笼中，并保持在12小时明暗（LD）循环中。

记录的数据交错消除红色激光刺激造成的伪影，其中一半被丢弃。因此，jGCaMP7s荧光信号在470 nm光激发（F470）和415 nm激发（F415）下的最终采样率为5 Hz。 比率（R）定义为F470和F415（F470/F415）之间的比率，用于校准和减少运动伪影。基线比率（R0）计算为激光刺激前期间的平均R值（从激光刺激开始的-30 s至0 s，150点）。R1计算为激光刺激后期的平均R值（从激光刺激开始90 s至120 s，150点）。响应 ΔR/R0% 计算为 R 之间的差值1和 R0（ΔR） 除以 R0（ΔR / R0).所有数据分析都是使用 MATLAB 完成的。记录完成后，我们组织学地证实了jGCaMP7s和ChrimsonR-mCherry的表达以及光纤的位置。

免疫组化

我们使用了 15 Avp-CK1δ?/?;Rosa26-LSL-Cas9-2A-EGFP小鼠用于Avp敲低研究（S5图，gAvp或gControl为9或6）和2只Avp-Cre小鼠用于突触素：：GFP示踪研究（图7A和7B）。免疫染色如前所述[22，40，42]。通过PBS经心灌注，然后在PBS中注射8%多聚甲醛（PFA），大约在ZT4处杀死小鼠。然后，将小鼠大脑后固定在4°C的4%PFA中过夜，然后在30°C下浸入4%蔗糖溶液中2天。用低温恒温器（CM30，徕卡）制作连续冠状脑切片（1860毫米厚），并收集成4个系列，其中一个系列进一步免疫染色。对于免疫荧光染色，用含有0.3%Triton X-100（PBST）的PBS洗涤切片，并用PBST加3%BSA（封闭溶液）封闭。然后，将切片与封闭溶液中的指定一抗在4°C下孵育过夜。 使用的抗体是兔抗AVP抗体（1：4，000;AB1565，默克密理博）和兔抗VIP抗体（1：1，000;#20077，Immunostar）。然后，用PBST洗涤切片，然后在封闭溶液中与指定的二抗孵育4小时。本研究中使用的二抗是Alexa Fluor 488偶联驴抗兔IgG抗体（1：2，000，A-21206;赛默飞世尔科技）和Alexa Fluor 594偶联驴抗兔IgG抗体（1：2，000，A-21207;赛默飞世尔科技）。与二抗孵育后，用PBS洗涤切片，安装在载玻片上，风干，并使用封片剂（H-1500，载体实验室;达科荧光封片剂，安捷伦科技公司）。使用落射荧光显微镜（BZ-9000，基恩士）或共聚焦显微镜（Fluoview Fv10i，奥林巴斯）拍摄图像。AVP表达水平通过Photoshop（Adobe）量化如下[40]。首先，将图像转换为灰度。然后，计算SCN内像素的平均强度。最后，将SCN侧侧区域的值视为背景值，并从SCN的值中减去。当切片来自 Avp-CK1δ?/?;对Rosa26-LSL-Cas9-2A-EGFP小鼠进行绿色AVP免疫染色，AVP免疫染色和EGFP均发出绿色荧光。因此，为了评估AVP表达水平，在阴性对照切片中量化EGFP荧光，即模拟处理的切片，而不与抗AVP抗体孵育，并与用抗AVP抗体孵育的切片的荧光强度进行比较。

统计分析

所有结果均表示为平均± SEM。对于2组的比较，进行了双尾学生或韦尔奇t检验或曼-惠特尼U检验。对于巴特利特检验对多组没有方差差异的比较，进行三向或双向重复测量方差分析或单因素方差分析，然后进行事后瑞安检验。为了通过Bartlett检验比较具有方差差异的多个组，非参数检验，Kruskal-Wallis检验与事后Mann-Whitney U检验与Bonferroni校正，弗里德曼秩和检验，然后使用Wilcoxon符号秩测试与Bonferroni校正，以及使用EZR（R的图形用户界面）进行Wilcoxon签名秩检验[82] 或方差分析4。对于循环数据，瑞利检验、沃森-威廉姆斯检验和哈里森-汉字检验是使用循环统计的Circstat MATLAB工具箱进行的[83]。所有小于 0.05 的 P 值均被视为具有统计学意义。文字和数字中只标明了统计分析的相关信息。

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CaMKIIα-Bmal1?/?小鼠在DD中心律失常，与图1有关。

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S1 图 CaMKIIα-Bmal1?/?小鼠在DD中心律失常，与图1有关。

(A）控制和CaMKIIα-Bmal1的代表运动活动?/?小鼠（家笼活动）。灰色阴影表示灯熄灭的时间。 （B）控制（左）和CaMKIIα-Bmal1的运动活动节律的代表性周期图?/?DD中的小鼠（右）。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002281.s001

（提夫）

S2 图 重新评估Avp-CK1δ中的昼夜节律行为节律?/?和 Avp-Bmal1?/?小鼠通过轮子运行活动，与图1和图2有关。

(A） 控制和Avp-CK1δ的代表性轮运行活动?/?小 鼠。灰色阴影表示灯光熄灭的时间。 （B） DD 中车轮运行活动的自由运行周期。 值是 SEM ±平均值; n = 4 表示控制，n = 5 表示 Avp-CK1δ?/?小 鼠。P < 0.001 通过双尾学生 t 检验。（C） 左：3 个控制和 8 个 Avp-Bmal1 的车轮运行活动的动图<>?/?小鼠（M，雄性;F，女）。灰色阴影表示灯光熄灭的时间。右：过去 7 天内各个轮子跑步活动节律的周期图（DD（垂直黑线）。大多数 avp-bmal1?/?小鼠在DD记录的最后部分心律失常。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002281.s002

（提夫）

S3 图 CK2δ条件敲除小鼠SCN切片中Per1：：LUC振荡的单像素轨迹，与图3相关。

显示了每个区域和鼠标行在ROI（15×15像素）内沿中外侧轴连续15个像素的代表性生物发光数据。所有数据均在切片当天以ZT12为起点进行去趋势化、平滑和对齐。标记为第 1 天的黑色垂直线表示投影的 ZT0。这些数据用于图3中的统计分析。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002281.s003

（提夫）

S4 图 体内SCN神经元中GCaMP和EGFP荧光的个体轨迹，与图4，5和6有关。

(A，B）连续记录来自SCN AVP神经元（A）或VIP神经元（B）的GCaMP荧光15天（LD为5天，DD为10天）。红色，AVP-CK1δ?/? (n = 6， 4）;蓝色，控制（Avp-CK1δ+/?，即 Avp-Cre;CK1δ重量/絮， n = 5， 6）。（C）连续记录来自SCN VIP神经元的EGFP荧光5天（LD为2天，DD为3天）。灰色，单个痕迹;黑色，平均。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002281.s004

（提夫）

S5 图 SCN中的AVP对于延长Avp-CK1δ的行为自由运行期是可有可无的?/?小鼠，与图7相关。

(A） 病毒载体（AAV-U6-gAVP-EF1α-DIO-mCherry或AAV-U6-gControl-EF1α-DIO-mCherry）注射示意图在Avp-CK1δ中的SCN?/? (Avp-Cre;CK1δ 絮/絮絮;Rosa26-LSL-Cas9-2A-EGFP）小鼠。（B）在用抗AVP抗体（绿色）染色的SCN中具有（gAvp）或不具有（gControl）Avp敲低的代表性冠状切片，显示AVP免疫反应性降低。 底部切片（无抗体）是无抗AVP抗体模拟染色的冠状切片，以评估源自Rosa26-LSL-Cas9-2A-EGFP等位基因的EGFP表达（绿色）。白色矩形表示 （D-F） 的放大图像的位置。比例尺，1毫米。 （C）免疫染色（gAvp或gControl）或模拟染色（无抗体）的AVP的SCN切片的绿色荧光强度。请注意，免疫染色切片的绿色荧光是来自AVP免疫反应性和EGFP的荧光之和。AVP 表达式通过 Avp 敲低降低到切片中的背景级别。g Avp 为 n = 9，gControl 为 n = 6，无抗体为 n = 6。 P < 0.001 通过单因素方差分析与事后瑞安检验。（D-F）在gAvp （D），gControl（E）和无抗体（F）条件下下丘脑的SCN，视上核（SON）和下丘脑室旁核（PVH）的放大图像。比例尺，200 μm。（G） Avp-CK1δ 的代表性运动活动曲线图?/?在SCN（家笼活动）中具有（gAvp）或没有（gControl）Avp敲低的小鼠。 在AAV注射之前，将小鼠饲养在LD中1w（preLD）和DD中约3w（preDD）。随后，将小鼠转回LD状态并接受gAvp或gControl AAV注射手术（箭头），然后将小鼠饲养在LD中2w（后LD）和DD中约3w（DD后）。灰色阴影表示灯熄灭的时间。 （H） 在 Avp-CK10δ 中使用 （gAvp） 或不具有 （gControl） Avp 敲低的 preDD（过去 10 天）和 DD 后（过去 1 天）的运动活动周期?/?小 鼠。每种颜色表示不同的小鼠。n = 9 表示 gAvp，n = 6 表示 gControl。通过双向重复测量方差分析无显著差异。（I）gAvp（n = 9）和g对照（n = 6）动物的绿色荧光强度与DD后期之间没有明确的关系。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002281.s005

（提夫）

S1 数据。 数值数据。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002281.s006

（三十）

确认

我们感谢 D. R. Weaver 的 CK1δ絮絮鼠;G. Schütz for the CaMKIIα-Cre （Camk2a：：iCreBAC） mouse;黄志杰为贵宾鼠;J. Takahashi for the Per2：：Luc mouse;C. J. Weitz for the Bmal1絮絮鼠;F. Zhang用于Rosa26-LSL-Cas9-2A-EGFP小鼠;H. Okamoto 为生成 Avp-Cre 鼠标提供技术支持;用于 pAAV2-rh10 的宾夕法尼亚矢量核心;D. Kim and GENIE Project for pGP-AAV-CAG-FLEX-jGCaMP7s-WPRE;H. Kwon 代表 pAAV-TRE-EGFP;pAAV-EF1α-DIO-突触素：：GFP for R. D. Palmiter;pAAV-TRE-ChrimsonR-mCherry for A. Ting;pAAV-EF1α-DIO-hM3Dq-mCherry for B. Roth;和 pX333 为 A. 文图拉。我们感谢所有实验室成员，包括M. Fukushi，M. Kawabata，M. T. Islam和Y. Nishiwaki。

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