免费医学论文发表-酵母中的衰老与XII号染色体的扩增线性片段有关，而不是核糖体DNA环积累

抽象

酵母母细胞中染色体外核糖体DNA环（ERCs）的大量积累长期以来一直被认为是复制衰老的主要驱动因素。ERCs通过核糖体DNA（rDNA）重组产生，大量的遗传数据将rDNA不稳定事件联系起来，导致ERCs寿命缩短和其他衰老病理。然而，我们对ERC积累的分子效应知之甚少。在这里，我们研究了存在和不存在ERCs的衰老，出乎意料地没有发现基因表达差异的证据，这些差异可能表明ERCs引起的压力反应或代谢反馈。我们也没有观察到伴随酵母老化的基因表达的广泛破坏的任何全球变化，这表明ERCs在很大程度上是惰性的。伴随酵母老化的大部分差异基因表达实际上与衰老入口点（SEP）的标志物有关，这表明衰老而不是衰老是这些变化的基础。无论ERCs如何，细胞都通过SEP，但我们发现SEP与rDNA和端粒（ChrXIIr）之间的XII染色体区域的拷贝数扩增有关，形成最大约1.8Mb大小的线性片段，由于rDNA不稳定，这些片段在老化细胞中产生，但通过与ERC不同的机制。因此，尽管由于ERC积累，rDNA拷贝数随着年龄的增长而急剧增加，但我们的发现表明ChrXIIr而不是ERCs是出芽酵母老化期间衰老的主要驱动因素。

数字

Fig 7Fig 8Fig 1Fig 2Fig 3Fig 4Fig 5Fig 6Fig 7Fig 8Fig 1Fig 2Fig 3

引文： Zylstra A， Hadj-Moussa H， Horkai D， Whale AJ， Piguet B， Houseley J （2023） 酵母中的衰老与XII染色体扩增的线性片段有关，而不是核糖体DNA环积累。公共科学图书馆生物学21（8）： e3002250. https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002250

学术编辑： Sarah E. Zanders，美国斯托尔斯医学研究所

收到： 15月 2022， 12;接受： 七月 2023， 29;发表： 2023月 <>， <>

版权所有： ? 2023 Zylstra 等人。这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。

数据可用性： 所有RNA-seq数据均已存放在GEO中，入藏号为GSE207429。所有其他相关数据均在论文及其支持信息文件中。详细和更新的协议可在 https://www.babraham.ac.uk/our-research/epigenetics/jon-houseley/protocols 获得。

资金： JH和AZ由Wellcome Trust[110216]资助，AZ和DH由BBSRC DTP博士奖[1645489，1947502]资助，JH，AW和HHM由BBSRC资助[BI Epigenetics ISP：BBS/E/B/000C0423]，BP由巴黎萨克雷高等师范学院资助，巴黎萨克雷大学。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。

竞争利益： 提交人声明不存在相互竞争的利益。

缩写： 欧哈 本贾米尼-霍奇伯格;ERC， 染色体外核糖体DNA圈;红沉降率， 环境胁迫反应;罗斯福 错误发现率;环保部， 母亲充实计划;PCA， 主成分分析;rDNA， 核糖体脱氧核糖核酸;RFB， 复制分叉屏障;九月 衰老入口点;WGA， 小麦胚芽凝集素

介绍

萌芽酵母酿酒酵母的复制性衰老是一种广泛使用的分裂细胞衰老模型[1-3]。在这种范式下，年龄是母细胞经历的出芽事件的数量，寿命是永久丧失复制能力之前的分裂总数[4]。长期影像学检查显示，细胞周期持续时间在复制寿命的大部分时间保持不变，但在最后几次分裂中显著延长[5-7]。这表明在失去复制活力之前有一个病理性衰老时期，尽管这种向病理性衰老状态过渡的原因仍然存在争议。

老化细胞显示出一系列分子表型，包括基因表达的显着变化。这归因于组蛋白耗竭导致的转录抑制丧失[8，9]、诱导广泛但明确的环境应激反应（ESR）[10-13]以及翻译与mRNA丰度的解耦[14]。无论原因是什么，老化酵母都会经历编码和非编码位点的广泛诱导，这些位点通常在营养生长过程中被抑制为RNA聚合酶II转录，并增加应激和环境响应因子的表达，同时编码翻译和核糖体生物发生成分的mRNA丰度降低[8，11，12，15，16].类似地，也许也因此，蛋白质组变得失调，容易聚集，并且越来越与转录组脱节;基因表达变得无反应;代谢组向生长和底物摄取减少的方向转移[14，17–19]。有趣的是，单细胞技术显示，衰老的开始是在衰老入口点（SEP）突然开始的离散过程[5，20]。SEP后，细胞表现出延长的G1期，其特征是标记的线粒体膜蛋白Tom70-GFP的强烈病灶和低水平的细胞周期蛋白Cln1。然而，细胞生长不会暂停，导致细胞大小快速扩张，病理性细胞质稀释与核和核仁生长同时发生[5，6，17，20，21]。这些表型中的一种或多种可能导致定义酵母复制寿命的复制潜力的永久性丧失，从SEP到复制活力丧失的可重复时间表明衰老在一定程度上限制了寿命[5]，但我们和其他人观察到衰老轨迹导致复制潜力丧失而没有明显的衰老[22，23]，因此其他非SEP机制也必须限制寿命，并且SEP与丧失活力之间的因果关系仍未得到证实。

最突出的酵母老化理论侧重于ERCs的积累，ERCs在高度重复的核糖体DNA（rDNA）位点内的同源重组过程中产生[24-26]。ERC在每个细胞周期中复制，并在有丝分裂时被SAGA和TREX-2复合物不对称地保留在母细胞中，使得ERC拷贝数在衰老过程中呈指数级上升，以至于有效基因组大小在30小时内增加40%至24%[15，20，24，27，28]。由于这种行为，ERC是非常合理的“衰老因素”，在衰老早期出现，后来导致核仁碎裂[24，29，30]。该理论的重要组成部分是Sir2，高度保守的sirtuin蛋白脱乙酰酶家族的同名成员，以及定位于rDNA复制叉屏障（RFB）位点的Fob1。Fob1在RFB处阻滞复制叉，避免与RNA聚合酶I正面碰撞，但停滞叉的分辨率可以通过修复事件重组，导致ERC形成[26，31，32]。为了支持ERC理论，SIR2缺失会破坏rDNA的稳定性，促进ERC积累和rDNA拷贝数变异，并缩短酵母寿命，而FOB1缺失或SIR2过表达会延长寿命[26，33]。ERC编码的非编码RNA由RNA聚合酶II大量表达，并伴随H3K4me3等激活表观遗传标记的积累，而额外的核糖体DNA基因则由RNA聚合酶I转录[15，16，20]。因此，不难想象，数千个ERC对核因子和核仁因子的滴定可能会使蛋白质编码转录组和/或核糖体合成失衡。

具有跨物种疗效的抗衰老干预措施，如热量限制和mTOR抑制，也可通过Sir2减少rDNA的不稳定性和重组[34-37]。值得注意的是，有迹象表明rDNA的不稳定性和拷贝数变异可能与动物衰老和病理学有关，因为在果蝇和小鼠衰老[38，39]、人类神经退行性疾病[40]和癌症[41-44]期间报道了rDNA拷贝数变异。在果蝇和人类细胞中也观察到含有rDNA序列的环状DNA[45，46]。然而，尽管四分之一个世纪前首次报道了老化酵母中ERCs的积累，但仍然明显缺乏任何其他模式生物的类似数据[24]。尽管如此，最近的出版物显示ERC积累与酵母中衰老表型之间存在紧密联系，强烈表明ERC是与年龄相关的细胞周期破坏和衰老的近端原因。Neurohr及其同事观察到，SEP后的母细胞通过罕见的事件恢复活力，其中整个ERC补体被传递到子细胞;ünal及其同事观察到，在衰老细胞减数分裂期间，ERCs被区室化和降解[47，48];而Morlot及其同事报道，细胞周期破坏和SEP与指数ERC积累和伴随的过量rDNA转录相吻合[19，20]。此外，Meinema及其同事最近报道，ERCs与核孔复合物的扩展关联可以促进酵母老化过程中发生的核孔的逐渐衰减[49，50]。

这些研究强烈表明ERC积累是病理性的，但几乎没有机制证据证明ERC依赖性病理学是如何介导的。为了研究这一点，我们使用ERC形成和保留中的突变体来定义ERC对mRNA丰度和SEP的影响，但意外地发现与ERCs没有联系。相反，我们显示了XII号染色体（ChrXIIr）的大线性片段的扩增与SEP之间的强烈相关性，这表明这可能是酵母衰老的意外原因。

结果

研究ERC积累在S复制老化中的作用。酿酒会，我们检查了衰老过程中未能积累ERC的衰老突变细胞。同源重组缺陷的rad52Δ细胞不能形成ERC，而spt3 Δ和sac3Δ细胞缺乏SAGA和TREX-2的成分，因此不能在母细胞中保留ERC（图1A）[25，28]。通过研究年龄相关ERC积累所需的不同途径的突变体，我们旨在将ERCs引起的效应与单个突变的不相关效应区分开来。

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图1. ERCs不会导致全基因组基因表达失调。

(A）复制老化过程中ERC积累的示意图，表明rad52Δ，spt3 Δ和sac3Δ突变体受损的过程。（B）用于分离老年人口的MEP培养系统示意图进行分析。显示了生物素标记和收获的时间。（C） 使用 MEP 对野生型和指示型 ERC 突变体的年轻和老年 poly（A）+ RNA-seq 文库的 PCA 摘要。箭头显示文化中随时间推移的进展;背景颜色刻度表示采样时间点。每台 PC 的主要 GO 类别根据 PC 在任一方向上的基础 300 个最高旋转基因指示，S7 文件中的完整 GO 项富集分析。（D） MA图比较对数2来自野生型和指示突变体的对数期和 48 小时龄样品之间的 mRNA 丰度分布。x 轴为日志2平均标准化读取计数;y 轴在日志中发生变化2从年轻人到老年人的标准化读取计数。斜率通过线性回归计算。每个基因型和年龄的数据计算为对数2 mean normalised read counts per gene of 3 biological replicates for wild-type, spt3Δ, and sac3Δ or 2 biological replicates for rad52Δ. The numerical data underlying this Figure can be found in S8 File. ERC, extrachromosomal ribosomal DNA circle; GO, gene ontology; MEP, mother enrichment programme; PC, principal component; PCA, principal component analysis.

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为了纯化衰老细胞，我们采用了Lindstrom和Gottschling设计的母富集计划（MEP）[51]。MEP细胞正常增殖，直到将β-雌二醇添加到培养物中，之后所有新生子细胞都变得无法存活。这使得母细胞在批量培养中达到晚期复制年龄，而不会使年轻细胞增殖耗尽培养基成分。母细胞壁在年轻时用反应性生物素标记，这允许在固定后的老化时间点恢复磁性链霉亲和素珠上的相同细胞（图1B）。与酵母中的大多数老化系统不同，MEP使用二倍体细胞，二倍体细胞对可能绕过MEP的随机突变和毒性双链断裂更具弹性，这些突变随着年龄的增长而增加，并导致（二倍体）杂合性丧失[51，52]。

并非所有改变年轻细胞中ERC丰度的突变在衰老细胞中都具有相同的效果。例如，年轻的fob1Δ突变细胞含有较少的ERC，但老化的二倍体fob1Δ MEP细胞中的ERC丰度与野生型几乎没有差异（S1A图）[52]。因此，我们通过南方印迹证实了所有3个突变体的ERC丰度。令人欣慰的是，MEP背景中RAD52的缺失消除了ERC积累（减少30×）[25，26]，而SPT3或SAC3的缺失相对于野生型显著降低了老化过程中ERC积累（分别为减少10×和5×）（S1B图）[28]。

rad52Δ、spt3 Δ 和 sac3Δ 共同形成一组 3 个突变体，与野生型相比，它们在衰老过程中积累的 ERC 非常少。在衰老过程中，每个突变体和野生型之间出现的一致差异形成了可归因于ERCs的候选效应，而仅在单个突变体中观察到的差异或在ERC积累之前已经存在于年轻细胞中的差异必须归因于基因型效应而不是ERC。我们注意到rad52Δ和sac3Δ的寿命很短，而spt3Δ的寿命几乎与野生型相同，因此提供了一系列寿命，以便将末端表型与ERC的影响分开[25，53，54]。

年龄相关性转录组失调与ERC无关

RNA聚合酶II转录组应提供ERCs对衰老过程影响的灵敏读数，报告mRNA丰度总体分布的变化以及单个基因的表达。预计个体基因表达差异特别有用，表明应激反应途径和/或代谢反馈回路由于ERC积累的病理影响而被激活。

Poly（A）+ RNA-seq文库来源于MEP野生型、spt3Δ和sac3Δ细胞一式三份，rad52Δ细胞一式两份。在对数期和老化24小时和48小时后收获细胞，分别约100%和约30%-40%的野生型细胞保持活力（图1B）[15，51]。与对数期相比，野生型富含碳水化合物代谢、呼吸和细胞壁组织的 1，186 个基因在 48 小时时表达显着增加，而富含核糖体合成和翻译的 870 个基因显着下降，所有这些都与以前的衰老基因表达研究高度一致，并支持我们数据集的可靠性（DESeq2， Benjamini-Hochberg （BH） < 0.05 更正错误发现率 （FDR），日志2-倍数变化阈值±0.5）（S1C图）[8，12，15]。

我们基于其他不同突变体（spt3Δ，sac3Δ和rad52Δ）的相似基因表达变化来定义ERCs在衰老过程中的影响的策略依赖于这些突变对年轻细胞中的基因表达具有不同的影响。为了支持这一点，对对数期样品进行的主成分分析（PCA）显示任何一对突变体之间都没有关联（S1D图）。更详细地说，对数期的成对差异表达分析发现，与野生型相比，每个突变体中>1，000个显着差异表达的基因（DESeq2，BH校正FDR<0.01，log2-倍数变化阈值±0.5），在至少2个突变体中显着差异表达的606，1个基因中，在所有197个突变体中只有7个（5.3%）在相同方向上变化（93个向上，104个向下）。2，606个基因的分层聚类也显示不同突变体的影响之间几乎没有重叠（S1E图）。值得注意的是，spt3Δ和sac3 Δ，鉴于Spt3和Sac3在物理上相关并将启动子连接到核孔，它们可能具有相似的转录组学效应，实际上对基因表达具有几乎截然相反的影响。

然后，我们对完整的RNA-seq数据集进行了PCA，发现样品在PC1上按时间分离（方差的47%），在PC2上按基因型（变异的12%）分离。所有基因型的PC1评分随着年龄的增长而增加，野生型和spt3Δ之间的进展惊人地相似（图1C，比较灰色和紫色）。rad24Δ细胞的48小时和52小时转录组聚集在一起，与这些寿命非常短的细胞在24小时前达到其复制寿命的终点一致[25]，尽管细胞的产量没有从24小时降低到48小时，并且非分裂rad52Δ细胞的实际年龄增加显然不会影响转录组（图1C， 绿色）。相比之下，sac3Δ转录组在PC1上从对数到24小时和从24小时到48小时都进展，但不如野生型，与较慢但持续的分裂一致（图1C，橙色）。

据报道，酵母细胞在衰老过程中会发生全基因组转录去抑制，尤其是低表达基因[8]。这在MA图中清晰可见，MA图显示了每个基因的表达随年龄的变化，作为该基因平均表达的函数（图1D）。在野生型中，平均表达低的基因随着年龄的增长而强烈诱导，中等表达的基因相对于平均值变化不大，丰度的mRNA相对于平均值减少，赋予特征从水平偏斜到分布（图1D，虚线）。spt3Δ的MA图与野生型基本相同（图1D，比较灰色和紫色），并且在rad52Δ和sac3Δ中观察到类似的效果（图1D，将灰色与绿色和橙色进行比较）。

因此，我们得出结论，伴随酵母复制老化的mRNA丰度的显着重塑完全独立于ERC积累引起的大量基因组和表观基因组变化。

ERC积累对单个基因的影响最小

大量转录组特性可以掩盖大量基因行为的差异。然而，对于在野生型中对数期和48小时之间显着差异表达的基因集（S1C图），衰老过程中mRNA丰度变化的方向和幅度在野生型和突变体之间密切相关（图2A）。这与其他显示野生型和各种突变基因型之间存在共同年龄相关转录模式的研究高度一致[12，15]。该分析进一步表明，无论ERC积累如何，都会发生与年龄相关的广泛基因表达变化。

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图2. 单个基因的表达变化与ERC积累无关。

(A） 日志更改图2与野生型相比，每个突变体的对数期和48小时龄细胞之间的mRNA丰度。只有1，186个基因在野生型中随年龄显着差异表达（野生型2小时龄与.log期的DESeq48成对比较，BH校正FDR<0.05，对数2-包括倍数变化阈值 ±0.5）。通过线性回归计算的斜率。每个基因型和年龄的数据计算为对数2野生型、spt3Δ 和 sac3Δ 的每个基因平均标准化读取计数为 3 个生物学重复，rad2Δ 为 52 个生物学重复。日志2变化计算为日志之间的差值2表示基因型内48小时和对数期样品。（B） 日志的分层聚类2在存在基于线性模型 158 的 ERC 的情况下，1 个基因的标准化 mRNA 丰度显着差异上调（DESeq2 线性模型因子“高”与“低”ERC 丰度 BH 校正 （FDR） < 0.05，对数2-倍数变化阈值 ±0.5）。色标指示对数2相对于每个基因中位数的倍数变化。显示单个生物学重复（野生型为6个;spt3Δ和sac3Δ为3个;rad2Δ为52个）。除了标准的MEP野生型外，还包括具有TRP1基因修复的野生型细胞，并且几乎相同。模型的完整输出在 S1 文件中提供。（C）对数差异的小提琴图2（B）所示的簇48基因在对数期和老化2小时后野生型和给定突变体之间的平均归一化mRNA丰度。小提琴内的实线表示中值，而下四分位数和上四分位数用虚线表示。（D） 日志的分层聚类2Ellahi及其同事定义的40个Sir2调控基因集的标准化mRNA丰度[62]。显示单个生物学重复（野生型为3，spt3Δ和sac3Δ，rad2Δ为52）。聚类过程和规模如（B）所示。此图下面的数字数据可以在 S8 文件中找到。BH，本贾米尼-霍奇伯格;ERC，染色体外核糖体DNA圈;罗斯福，错误发现率;欧洲议会议员，母亲充实计划。

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接下来，我们寻找可能依赖于ERC的更具体流程或途径的变化。我们在48小时龄的样品中对野生型和每个突变体进行了标准的成对差异表达分析，并在所有缺乏ERC的突变体中寻找始终过度表达或表达不足的基因（DESeq2，BH校正FDR <0.05，log2-倍数变化阈值 ± 0.5）。然而，这种非常保守的方法只鉴定了10个基因，令人担忧的是，其中一个是TRP1，用于删除SPT3，SAC3和RAD52的标记。因此，我们转向更强大的线性建模方法，为了控制TRP1营养不良，为修复TRP3位点的MEP野生型菌株增加了1个重复老化时间程。

差异表达分析的线性建模方法[55]将许多数据集考虑在一起，并试图基于多个自变量解释数据集之间每个基因的表达差异。例如，在样本之间年龄和基因型不同的数据集中，线性建模将估计年龄和基因型对每个基因表达变化的单独贡献（模型系数）;有些基因可能受年龄影响更大，年龄系数较高，有些基因受基因型影响，基因型系数较高。还计算了每个变量对每个基因差异表达的贡献的重要性，从而可以提取受每个实验变量显着影响的基因集。这意味着线性建模可以识别复杂实验中受一个（或多个）变量特别影响的基因，这些变量超出了简单的成对比较。

我们在模型中使用了4个分类自变量：基因型（野生型，spt3Δ，rad52Δ，sac3Δ），TRP1（存在，不存在），年龄（对数期，24小时，48小时），ERC丰度（高，低）。老化的野生型样品被归类为“高”ERC丰度，所有其他样品被归类为“低”，因为老化的spt3Δ，rad52Δ和sac3Δ细胞在对数期以上几乎没有ERC积累（S1B图）。在 161 个基因中，“高”和“低”ERC 丰度显著差异表达（DESeq2，BH 校正 FDR < 0.05，对数2-倍数变化阈值±0.5），只有3个基因（CSS1，PHO11和PHO12）显着下调，而158个基因在高ERC丰度样品中显着上调，因此被归类为“ERC诱导”。六个基因根据TRP1差异表达，但这些基因与受ERC丰度影响的基因不重叠（线性模型1，S1文件）。

在分层聚类之后，我们将158个候选ERC诱导的基因分成2个大簇，在rad52Δ数据集中差异最明显（图2B）。簇1基因大多在rad52Δ中高表达，在spt3Δ和sac3Δ中表达低（图2B，顶部）。该簇包括覆盖染色体rDNA和ERC区域的注释，这些区域通常被Sir2沉默[56-59]。在所有3种低ERC突变体中，rDNA重复序列中RNA聚合酶II转录的非编码RNA的年龄相关诱导率都非常低，但在野生型中，随着年龄的增长而急剧增加，与ERCs上这些区域的高转录活性一致（图2B和S2A）[16]。事实上，从E-pro启动子表达的IGS1-F非编码RNA成为老化野生型细胞中丰度最高的poly（A）+ RNA（S2B图）。这些转录本的发现验证了线性模型方法，该方法基本上将基因识别为基于ERC丰度的差异表达，如果突变体中基因随年龄的变化小于野生型。其余簇1基因以可逆转录转座元件（23/46基因）为主，已知其表达在rad52Δ增加，在spt3Δ降低[60，61]。这些遵循从对数期开始的预期基因型特异性行为，这使得可逆转录转座元件不太可能是真正的ERC诱导的转录本。

相比之下，簇2主要由单拷贝蛋白编码基因组成，功能富集用于ATP酶活性的负调节，水解酶活性的负调节和细胞壁组织。然而，以下推理使我们得出结论，这些基因和本体与ERC积累无关。首先，野生型和突变体之间这些基因的表达差异在对数期最高，并随着年龄的增长而减小（图2C）;这意味着表达差异在ERC积累之前最显着，因此必须归因于突变基因型的重叠效应而不是ERC积累。事实上，这些基因中有27%[30]在上述93个mRNA中，在对数期的所有3个突变体中都明显更丰度。其次，ERC丰度对簇2基因影响的中位数模型系数与年龄和基因型的模型系数相似（S2C图），表明ERC最多是这些基因差异表达的中等贡献者。

Sir2沉默的异色区域遵循ERC调控转录本的行为（rDNA和交配型位点在簇1中），因此我们询问ERCs滴定Sir2是否可以解释所报道的Sir2调控蛋白编码基因的年龄相关诱导[33]。在SIR复合物抑制的40个基因中[62]，其中Sir2是活性脱乙酰酶，大多数基因随年龄而诱导，与ERC无关，因为诱导类似于rad52Δ或sac3Δ中的野生型（图2D）。这些基因的“高”ERC丰度和48小时年龄的模型系数，可解释为对数2ERC积累和年龄引起的表达变化分别为0.7±1.3和1.8±1.7（四分位距±中位数）（S2D图）。相比之下，簇2基因的这些值为1.7±1.4（对于“高”ERC丰度）和1.5±1.5（对于48小时年龄）。因此，我们的数据表明，ERC积累可能有助于一些Sir2调节基因的去抑制，但程度低于由于年龄增长而发生的相同基因的去抑制。

总体而言，尽管ERCs在衰老过程中大量积累，并由此产生大量聚腺苷酸化非编码RNA，但我们无法确定蛋白质编码基因，其中衰老过程中mRNA丰度的变化主要由ERC积累驱动。

ERC 积累不是获得 SEP 的唯一途径

ERC积累紧接在SEP之前，其标志是G70中线粒体外膜蛋白Tom1-GFP形成非常明亮的病灶[5，20]。酵母细胞在进入SEP后也会经历体积增长，以至于细胞质稀释可能导致功能障碍[21]，但尚不清楚ERCs是否有助于这种生长。细胞大小和Tom70强度都可以通过成像进行量化，因此我们使用Amnis ImageStream流式细胞术系统建立了高通量测定，以对来自纯化的老年MEP群体的数百个单独的MEP细胞进行成像[22]。

捕获Tom70-GFP的荧光图像以评估SEP的开始，核糖体成分Rpl13a-mCherry作为对照，在野生型衰老过程中不会大量积累或形成病灶[7]。还为每个细胞采集了明场和小麦胚芽凝集素（WGA）染色图像;细胞面积从明场计算，而WGA强度形成复制年龄的定量标志物，与野生型和spt3Δ的手动芽疤痕计数相关，在rad52Δ中略有低估（参见S3A图中与手动芽疤痕计数的比较）[14，63，64]。正如预期的那样，在野生型细胞中，Tom70-GFP和WGA强度从对数期显着增加到24小时，从24小时增加到48小时（图3A和3B）。细胞大小在衰老的前24小时内尤其增加（图3C），而Rpl13a-mCherry仅略有增加（<1.5倍，S3B图）。

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图3. 缺乏ERC的突变体仍然显示SEP的特征。

(A）Tom70-GFP强度的成像流式细胞术分析，SEP后G1细胞的强度大幅增加[5]。对细胞进行门控以进行链霉亲和素染色（仅限老化样品），过滤掉年轻细胞，然后进行循环，其选择G1细胞并去除团块。左图显示了代表性群体中的单个细胞，中位数有一个条形。右图比较了生物学重复的中位数。p值从2因素方差分析计算，使用基因型和年龄作为自变量进行事后Tukey检验，n = 4。红色 p 值表示 p < 0.05 时的显著性。（B）WGA染色分析以显示相对年龄。样品和分析如（A）。（C）分析从明场图像中提取的像素中的细胞大小。样品和分析如（A）。（D）来自指定基因型的对数期培养物的细胞的代表性明场图像。将样品固定在乙醇中并超声处理以分散细胞团块。定量显示包含 3 个或更多细胞的细胞颗粒的比例（颗粒是 1 个或多个细胞的单位，未通过超声分散），通过事后 Tukey 检验的 1 路方差分析分析，n = 3。此图下面的数字数据可以在 S8 文件中找到。ERC，染色体外核糖体DNA圈;SEP，衰老入口点;WGA，小麦胚芽凝集素。

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在spt3Δ中，Tom70-GFP强度随着年龄的增长而显着增加，尽管不是很大程度上低于野生型，但在24小时时，尽管细胞达到与野生型相当的年龄，但从24小时增加到48小时没有增加（图3A和3B）。spt3Δ细胞在所有年龄都略小，但随着年龄的增长仍然显着增长，而Rpl13a-mCherry强度随着年龄的增长而降低，尽管变化仍然很小（图3B和S3C）。缺乏Sac3的细胞比野生型细胞衰老得更慢，在48小时内达到平均年龄，仅略高于野生型细胞在24小时内，但考虑到这一点，其行为方式与spt3Δ突变体非常相似（S3C图）。相比之下，rad52Δ细胞在70小时时表现出明显高于野生型的Tom24-GFP荧光，即使rad52Δ细胞更年轻，并且略大，尽管没有显着，（图3A和3B）。这些参数都没有从24小时变为48小时，与rad52Δ细胞在24小时之前达到复制寿命结束一致，因此到48小时，野生型细胞已经赶上了Tom70-GFP和细胞大小。综上所述，我们观察到SEP发病或细胞大小与这组突变体中ERC的存在与否之间基本上没有相关性，rad52Δ是一个特定的异常值。

这意味着缺乏ERC的衰老细胞仍然应该变得衰老，由细胞周期时间的显着增加来定义。由于早期活力丧失和生长缓慢，这很难对 rad52Δ 和 sac3Δ 突变体进行测定，但可在 spt3Δ 细胞中进行测试，这些细胞遵循与野生型相似的衰老动力学（S3A 图）。通过显微操作放置在YPD琼脂上的年轻细胞迅速分裂并形成集落，但SEP后细胞循环极其缓慢，这应该会延迟能够形成集落的子细胞的产生。我们测量了单个年轻细胞和24小时龄细胞在48小时内产生的集落大小，仅包括在72小时内产生集落的活细胞，并观察到与年轻细胞相比，老年野生型和衰老spt3Δ细胞的集落大小等效大幅减小（S3D图）。这表明，尽管积累的ERC减少了10倍，但spt3Δ细胞随着年龄的增长而衰老，正如非常缓慢的细胞分裂所证明的那样，与Tom70-GFP强度数据一致。相比之下，在半乳糖上老化的野生型细胞积累了高水平的ERC，但集落形成没有延迟，这与它们的Tom70-GFP信号一致[22]，进一步将ERC积累与衰老分开。

为了确认衰老表型与ERC积累无关，我们检查了前面描述的其他标志物。首先，核仁的大小（可视化为RNA聚合酶I标记Rpa190-GFP所占据的区域）已被证明会随着细胞年龄的增长而扩大[20]。这被认为是由于ERC扩增占用更多空间并招募更多核糖体生物发生因子而产生的rDNA拷贝增加;然而，我们观察到核仁大小随年龄的增长发生在野生型和rad52Δ和spt3Δ突变体中，这些突变体积累的ERC减少了≥10倍（S3E图）。其次，液泡随着年龄的增长和pH值的增加而膨胀，导致Vph1-mCherry报告基因发出更高的信号[65]。同样，我们在野生型和突变型细胞中观察到相同的表型，除了在rad24Δ突变体中增加在52小时停止，因为这些细胞已经完成了其复制寿命（S3F图）。我们对Tom70-GFP，Vph1-mCherry和Rpa190-GFP的成像数据，以及对生长速率和基因表达失调的直接测量都得出了相同的结论：与年龄相关的变化和以SEP为标志的衰老开始与ERCs无关。

我们使用上位测定扩展了这些令人惊讶的观察结果，其中rad52Δ与spt3 Δ或sac3Δ相结合。我们预计 rad70Δ 突变体的高 Tom52-GFP 和低 WGA 表型将在这些双突变体中占主导地位，因为无论 SAGA 或 TREX-52 破坏如何，似乎无论 SAGA 或 TREX-2 破坏如何，任何持续的 DNA 损伤都会驱动 rad5Δ 细胞中的 SEP。然而，我们实际上观察到了强烈的加性效应。复制老化酵母的一种末端表型，特别是在二倍体MEP细胞中，是一种细胞分裂缺陷，导致<3%的细胞形成大的多细胞聚集体（S52G图）。然而，在rad3Δ spt52Δ和rad3 Δ sac24Δ双突变体中，每个母细胞在3小时内形成这样的聚集体，使得纯化变得不可能。即使在对数期群体中，这种表型也很突出（图1D），并且量化单个颗粒（一个颗粒是3个或多个无法通过超声分离的细胞）表明，大多数双突变细胞颗粒是10个或更多细胞的簇，通常包含3+细胞（图52D）。这一观察结果表明，尽管rad52Δ突变体缺乏ERC，但rad2Δ母细胞可能含有另一种毒性物质，通常由SAGA/TREX-<>保留在母细胞中。

总体而言，对 spt3Δ 和 sac3Δ 突变体的表型分析表明，ERC 积累对 SEP 的贡献很小，并且尽管完全没有 ERC，但 rad52Δ 在年轻时发展出非常强的 SEP 表型。因此，ERC的存在与否并不能定义SEP。此外，上位测定的意外结果提出了另一种DNA物种存在于rad52Δ突变细胞中的假设，这种DNA通常被SAGA和TREX-2保留在母细胞中（就像ERC一样），如果与子细胞沟通，则会导致细胞分裂缺陷。

标准必要专利的转录签名

SEP标记与ERC积累的解耦促使我们重新分析我们的基因表达数据，寻找与SEP而不是ERC相关的变化。为此，我们使用了与图2中ERC相同的数据集和线性建模方法，但更改了参数来测试SEP而不是ERC对差异表达的贡献。我们像以前一样使用年龄、基因型和 TRP1 的分类自变量重建线性模型，但将 ERC 丰度变量替换为基于 Tom70-GFP 的表示 SEP 状态的连续变量（图 70A 和 S3C 中的 Tom3-GFP 强度中值从 0 到 1 线性缩放）（线性模型 2，S2 文件）。

该模型发现了187个基于SEP变量（DESeq2，BH校正FDR<0.05，log）显着差异表达的基因2-倍数变化阈值 ± 0.5）（图 4A）。重要的是，SEP的模型系数远高于这些基因的其他模型系数，表明SEP在很大程度上解释了这些基因在整个实验中的基因表达变化，而年龄或基因型的贡献很小（图4B）。这应该与ERC丰度对潜在ERC诱导基因的弱影响形成对比（S2C图）。基于SEP差异表达的基因集的GO项富集分析揭示了孢子形成的富集，特别是用于前孢子形成，孢子壁组装和隔膜素以及铁转运的基因。

我们还发现290个基因根据年龄显着差异表达（DESeq2 48小时与对数期年龄，BH校正FDR<0.05，log2-倍数变化阈值±0.5），其中年龄是迄今为止导致差异表达的最强变量，SEP或基因型的贡献很小（S4A和S4B图）。鉴于以前的报道，这些基因在能量利用类别、翻译和核糖体合成方面被富集，这可能是对衰老的预期。然而，48小时与对数期的比较也比较了大部分终末停滞的细胞与未被终末停滞的细胞，因此，这些差异中的一些部分可能归因于终末停滞而不是衰老本身。

与SEP显着相关的一组基因的一个意想不到的特征是，22%位于rDNA和端粒之间的XII染色体的右臂上，该区域仅包含5%的注释基因。该区域（以下简称ChrXIIr）先前已被注意到在酵母老化过程中被放大，影响未知[8，16]。因此，我们询问该区域的基因表达是否在衰老细胞中普遍被破坏，并观察到ChrXIIr基因的平均mRNA丰度随着野生型年龄的增长而显着增加（S4C图，左，S4D图）。 尽管许多基因是随着年龄的增长而诱导的，但由于采用了DESeq2归一化方法，2个数据集之间任何大型随机基因集的平均mRNA丰度变化应接近于零。事实上，对不在XII染色体上的所有基因的等效分析显示没有平均变化，尽管mRNA丰度的扩散确实如预期的那样随着年龄的增长而增加（S4C图，右图，S4D图），因此对ChrXIIr的影响是异常的。 为了确保ChrXIIr的这种积累不是用于MEP的二倍体菌株中老化的独特特征，我们还通过Tom70-GFP和RNA-seq分析了单倍体MEP，并观察到ChrXIIr的类似积累与增加的Tom70-GFP信号一致（S4E和S4F图）。

在突变体中，尽管mRNA丰度的扩散有类似的增加，但ChrXIIr基因的mRNA丰度增加在spt3Δ中不太明显，在sac3Δ中几乎检测不到（图4C和4D，将灰色与紫色和橙色进行比较）。相比之下，ChrXIIr基因的平均mRNA丰度在rad52 Δ在24小时内显着增加，明显高于野生型（图4C和4D，比较灰色和绿色）。ChrXIIr基因的表达紧密遵循SEP标记Tom70-GFP的模式，在我们的数据集中显示了ChrXIIr积累与SEP的关联（图3A）。

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图4. SEP 的基因表达特征。

(A） 日志的分层聚类2DESeq187线性模型2称为2个基因的mRNA丰度在基于SEP的数据集之间显着差异（来自图70A和S3C的Tom3-GFP中位数）（DESeq2连续线性模型因子：Tom70-GFP中位数缩放至[0，1]之间，BH校正FDR<0.05，对数2-倍数变化阈值 ±0.5）。显示单个生物学重复（3 个为野生型，spt3Δ 和 sac3Δ，2 个表示 rad52Δ。 （B） DESeq2 线性模型 2 系数表示每个参数对 （A） 所示基因集的 mRNA 丰度差异的贡献。DESeq2 用于将表达建模为依赖于 3 个分类自变量和 1 个连续变量（具有额外的截距因子）：基因型（野生型，spt3Δ，rad52Δ，sac3Δ），TRP1 营养不良（存在，不存在），年龄（对数期，24 小时，48 小时）和 SEP（Tom70-GFP 连续，值取自图 3A 和 S3C 所示的中位数最小-最大值缩放到范围 [0，1]，百搭类型值也用于 TRP1 修复的样本）。系数值可以解释为对数2归一化mRNA丰度变化是由相对于野生型对数期TRP1营养素存在的特定模型因子引起的。小提琴内的实线表示中值，而下四分位数和上四分位数用虚线表示。模型的完整输出在 S2 文件中提供。（C） 日志2ChrXIIr上所有基因（左）或XII以外的染色体上所有基因（右）从对数期到给定时间点的mRNA丰度变化。数据是野生型 spt3Δ 和 sac3Δ 的 3 个生物学重复的平均值，或 rad2Δ 的 52 个生物重复的平均值，如图 （C） 所示。（四）对数中值变化分析2ChrXIIr上所有基因从对数期到给定时间点的mRNA丰度。仅通过事后Tukey检验的2-BY-方差分析分析，因为对数值是参考点n = 6个生物重复（野生型，结合野生型和TRP1数据集），n = 3表示spt3Δ和sac3Δ，n = 2表示rad52Δ。红色 p 值表示 p < 0.05 处的显著性。（E）可归因于年龄（对数与48小时），SEP（Tom70-GFP）和TRP1的观察到的差异表达的百分比。DESeq2 线性模型 3 具有基因型、年龄、TRP1 和碳源的分类自变量，以及代表 SEP 的 1 个代表 SEP 的 Tom70-GFP 连续变量应用于具有 9 个葡萄糖老化野生型细胞的重复时间过程（包括 3 个 trp1Δ）和 5 个半乳糖老化野生型细胞的重复时间过程以及 spt3Δ 数据集的数据集， sac3Δ 和 rad52Δ。在对数阶段排除标准化读取计数<4的基因后，百分比计算为给定因子的贡献/观察到的变化×100。0%–100% 范围之外的值分别表示预测错误方向或幅度太大的基因表达的模型系数。模型的完整输出在 S3 文件中提供。（F）野生型衰老对数中的基因表达变化分配给48小时至SEP和年龄贡献由线性模型3计算，显示为MA图。左-右：在对数期和6小时平均1个TRP48阳性野生型样品的老化过程中观察到野生型的基因表达变化;添加了 SEP 贡献的对数阶段表达式;添加了年龄贡献的对数阶段表达式;添加残差贡献的对数阶段表达，其中观察到残差基因表达随年龄的变化，模型未归因于 SEP 或年龄。红点表示来自rDNA的IGS区域的RNA，这些区域形成突出的异常值。此图下面的数字数据可以在 S8 文件中找到。BH，本贾米尼-霍奇伯格;罗斯福，错误发现率;SEP，衰老入口点。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002250.g004

ChrXIIr上的基因不是187个SEP相关基因中富集的GO项的主要贡献者;当排除ChrXIIr上的基因时，丰富的GO项和模型系数基本相同（S4G图）。因此，这187个基因可以分为两类 - 位于ChrXIIr上的基因和功能富集的孢子形成和铁代谢的基因。然而，该基因集必须仅包含最强的SEP相关基因，因为基因表达的年龄相关失调和SEP或多或少地发生在数据集中的所有突变体中，因此线性模型将难以分离SEP和年龄产生的效应。我们怀疑衰老可能是大多数报告的与年龄相关的基因表达变化的原因，但需要没有可检测到的SEP表型的细胞数据来证实这一点。因此，我们在数据集中添加了 2 个在半乳糖上老化的 YDH5 酵母（携带 18 个荧光标记物，但其他方面是野生型 MEP 菌株）的重复时间疗程以及匹配的葡萄糖对照;在半乳糖上，野生型MEP细胞达到等效年龄，但衰老率非常低[2]。然后，我们用SEP，年龄，基因型和TRP22的变量以及碳源（葡萄糖或半乳糖）的附加变量重新计算了线性模型。这发现了一组更大的1，1个基因，这些基因基于SEP显着差异表达（DESeq236，BH校正FDR<2.0，log2-倍数变化阈值±0.5），而基于年龄的237个基因，而与葡萄糖相比，657个基因在半乳糖上的表达显着差异（线性模型3，S3文件）。

在模型的这种变体中，只有SEP，年龄（对数与48小时）和TRP1成分在葡萄糖野生型衰老期间促进差异基因表达。将48小时龄的样品与对数期进行比较，该模型将观察到的81%的基因表达变化归因于SEP，而年龄解释了24%，TRP1解释了1%（图4E）。将SEP对对数期野生型基因表达的贡献添加到对数期野生型基因表达中，导致与在衰老细胞中观察到的基因表达模式非常相似，包括抑制基因的特征诱导和高表达基因的表达降低，特别是翻译和核糖体合成因子（图4F，比较左侧2图）。相比之下，年龄的贡献几乎没有改变基因表达谱的整体形状;受年龄显着影响的基因特别富含细胞壁组织基因，这可能是由于所有测试突变体以及半乳糖老化的野生型细胞中发生的细胞生长引起的，因此独立于SEP（图4F，年龄）。这组最大的变化是从ERC转录的IGS ncRNA，正如预期的那样，鉴于先前的数据显示ERC积累与SEP之间没有关联（图4F，红点）。一旦去除年龄和SEP，在衰老过程中，从对数到48小时，只有一小部分基因表达变化仍然无法解释（图4F，残差）。重要的是，SEP和年龄本身影响的这种生物信息学分离与年轻，高度衰老和老年，最小衰老人群的物理分离结果相似，这也表明SEP比年龄本身具有更大的影响（图4和S4在[22]）。

SEP导致生长速度大幅减慢，预计可诱导ESR样基因表达改变[5，13，66，67]。为了证实这一点，我们将衰老过程中基因表达的年龄和SEP系数与[900]中报告的代表性应激（20分钟热休克）期间约13个ESR基因的表达变化进行了比较。正如预测的那样，观察到与SEP呈正相关（R2= 0.68），但与年龄没有相关性（R2= 0.19），表明SEP中的基因表达变化与热休克引起的相似（S5A图）。我们对响应生长放缓而发生的基因表达变化进行了等效比较[66]，并且还观察到与SEP的相关性（S5B图）;相关性较为温和（R2= 0.52），但应该注意的是，用于控制生长速率的培养条件与我们的老化实验中使用的条件非常不同。为了推广这些关联，我们将年龄和SEP系数与[13]中测试的所有应力条件进行了比较，并观察到在所有应力下，SEP的相关性远高于年龄，在原始研究中，在“热冲击”和“进入固定相”条件下观察到与SEP的相关性最好，这些条件给出了最强的ESR响应。 这些发现表明，SEP的基因表达影响类似于缓慢生长和ESR，因此应主要归因于生长缓慢。然而，SEP并不完全等同于ESR，因为线性模型187发现的2个SEP相关基因的表达在热休克期间与衰老期间的变化方式不同（S4D图），同样，5个SEP相关基因在衰老和生长速率变化期间的表达变化之间没有相关性（S187E图）。

总体而言，我们发现SEP是迄今为止与年龄相关的基因表达变化的最大贡献者。这些变化大部分是由于生长放缓造成的，但我们也发现了特定基因表达程序和染色体异常的特征。

ChrXIIr 而不是 ERC 积累与 SEP 相关

使用SEP的ChrXIIr上基因表达的增加强烈表明该区域的染色体片段的积累;事实上，通过rDNA切割产生的离散染色体片段包含部分rDNA以及rDNA远端的染色体区域着丝粒，先前已在老化的野生型MEP细胞中报道过，并通过脉冲场凝胶电泳验证[8，16]。因此，我们对从对数、24 小时和 48 小时龄野生型、spt3Δ、rad52Δ 和 sac3Δ 细胞中分离的 DNA 进行了基因组重测序。最显着的变化是rDNA拷贝数，由于ERC积累，野生型的rDNA拷贝数随着年龄的增长增加了14×但在突变体中没有（图5A）;然而，在rad52Δ细胞中，随着年龄的增长，主要变化是ChrXIIr信号增加了1.5倍，相当于这些二倍体细胞中该区域增加了1个拷贝（图5B和5C，左）。随着年龄的增长，ChrXIIr也在野生型细胞中积累，但在spt3Δ中较少，并且在sac3Δ中几乎检测不到，这与我们在SEP标记中观察到的模式（图4C）密切相关，而其他染色体平均没有变化（图5C，中），并且我们观察到XII染色体的其余部分（从左侧端粒到rDNA;图 5C，右）。

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图5. ChrXIIr扩增与SEP有关。

(A） 给定时间点的基因组重测序读取计数与跨 rDNA 中 5 kb 窗口中的对数阶段的比率。（B）整个基因组中48 kb窗口中rad52Δ中对数期和25小时之间读取计数比率的热图。（C）在给定时间点的基因组重测序读取计数与ChrXIIr（左）和非染色体XII区域（右）的25 kb窗口中的对数阶段的比率。此图下面的数字数据可以在 S8 文件中找到。rDNA，核糖体DNA;SEP，衰老入口点。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002250.g005

虽然ChrXIIr是扩增程度最高的区域，但其他单个染色体也随着年龄的增长而变化，尽管程度远低于ChrXIIr。我们观察到通过基因组重测序和RNA-seq对I号染色体和VI号染色体的扩增;尽管与ChrXIIr相比，这些影响很小，但我们相信这些事件是真实的，因为通过不同的方法在不同样本中检测到（S6图），而其他染色体没有显示出一致的变化（S4文件）。这些扩增事件在野生型和突变体中以相似的程度发生，因此不太可能与SEP相关，并且可能是Neurohr及其同事先前使用I号染色体标记观察到的染色体错失分离事件的结果[19];对特定染色体（基因组中最短的染色体）的偏向很有趣，但并非完全出乎意料，因为酵母中的小染色体更容易出现非整倍性[68]。

这些实验表明，来自ChrXIIr的基因表达增加是由于该染色体区域的扩增，该区域似乎特别容易受到非整倍性的影响，超出了在衰老细胞中观察到的已知染色体错偏表型。此外，ChrXIIr 的扩增与野生型、spt3Δ、rad52Δ 和 sac3Δ 突变体的衰老程度密切相关。

ChrXIIr与不同突变体和环境的SEP相关

然后，我们测试了ChrXIIr与其他突变体中SEP之间关联的稳健性。rad52Δ 是我们数据集中的一个异常值，显示高 SEP、高 ChrXIIr 且没有 ERC，而 spt3 Δ 和 sac3Δ 遵循具有低 ERC 和低 SEP 的模式，因此确保衰老与其他突变体的 ERC 水平无关非常重要。一个问题是rad52Δ细胞在非常年轻的复制年龄停滞，通常在G2（在我们的样品中>80%在24小时出芽;S7A图左）[25，69]，而野生型酵母细胞通常在G1中终末停滞。尽管Tom70-GFP和其他标记物的定量成像数据被过滤以仅包括G1细胞，因此突变体之间应该具有可比性，但测序方法适用于整个群体，因此异常高的芽化部分可能会扭曲结果。因此，我们寻找进一步的突变体和条件，将ERC积累与SEP分开。

首先，与rad52Δ一样，组蛋白去乙酰化酶双突变体hst3 Δ hst4Δ是短暂的，并在24小时达到终末停滞[70]（S7B Fig，WGA）。然而，一小部分细胞在G2 / S中停滞，使得大块样品的细胞周期分布在24小时时更接近野生型（hst60Δ hst3Δ为4%，而rad80Δ为52%，野生型为40%;S7A图右），ERC水平虽然降低，但更接近野生型（S7C图）。尽管如此，Tom70-GFP在24小时时明显高于野生型，显示出强烈的早期衰老表型（S7B图，Tom70-GFP），并且与野生型相比，24小时的RNA-seq显示出基因表达的显着失调，甚至比rad52Δ更严重（S7D图）。与SEP相关的187个基因的诱导在hst3Δ hst4Δ和rad52Δ之间是等效的（S7E图），ChrXIIr基因的表达增加也是如此，表明等效的ChrXIIr扩增（S7F图）。因此，hst3Δ hst4Δ 和 rad52 Δ 之间的 SEP 发病、ChrXIIr 积累和 SEP 相关基因表达变化非常相似，而 G2 停滞和 ERC 积累是不同的，这意味着短寿命突变体中快速、强的 SEP 与 ChrXIIr 积累密切相关，不能归因于终末停滞时偏向 G2 的细胞周期分布或 rad52Δ 突变体的特殊性。

其次，缺乏核酸内切酶Mus81的细胞积累的ERC减少了10倍（图6A和[71]）。然而，mus81Δ细胞不会在年轻时终末停滞，在24小时达到与野生型相当的年龄，并在24至48小时进一步分裂，即使48小时的年龄小于野生型（图6B，WGA）。此外，与 rad81Δ 细胞相比，mus2 Δ 细胞在 G52/S 中的停滞频率较低（mus60Δ 为 81%，而 rad80Δ 为 52%;图6C）。然而，尽管缺乏ERC，mus81Δ细胞积累的Tom70-GFP水平与野生型相似（图6B，Tom70-GFP），并经历等效的基因表达失调（S7G图）。ChrXIIr基因表达与野生型相似，与Tom70-GFP强度一致（图6D），SEP相关基因的诱导也等同于野生型（图6E）。总之，这表明尽管ERC积累大幅减少，但mus81Δ细胞仍显示出正常的SEP谱，而在短寿命的rad52Δ和hst3 Δ hst4Δ突变体中没有观察到的SEP的强烈和早期诱导，并且SEP再次与ChrXIIr扩增紧密相关。

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图6. ChrXIIr 扩增与 SEP 的稳健关联。

(A） 对数期ERC丰度和48小时龄野生型和mus81Δ MEP细胞的南方印迹分析;定量显示ERC条带与染色体rDNA的比率。（B）Tom70-GFP强度的成像流式细胞术分析，在SEP后G1细胞中显着增加[5]，以及报告复制年龄的WGA。对细胞进行门控以进行链霉亲和素染色（仅限老化样品），过滤掉年轻细胞，然后进行循环，其选择G1细胞并去除团块。图显示了生物重复种群的中位数，p值从2元方差分析计算得出，事后Tukey检验使用基因型和年龄作为自变量，n = 3。红色 p 值表示 p < 0.05 处的显著性。（C）比较芽状细胞和未芽状细胞百分比的细胞周期阶段图。使用门控对链霉亲和素（仅老化样品）进行成像流式细胞术，然后根据圆度调用出芽和未出芽细胞，并通过检查代表性图像进行验证。误差线 ±1 SD. （D） 日志2ChrXIIr上所有基因（左）或XII以外的染色体上所有基因（右）从对数期到给定时间点的mRNA丰度变化。数据是 3 次生物学重复的平均值。（E） 日志的分层聚类2DESeq187线性模型2称为2个基因的mRNA丰度在基于SEP的数据集之间显着不同。显示单个生物学重复（每种情况2次）。（F） 基于 Tom70-GFP 与 ChrXIIr 扩增（根据 RNA-seq 估计）的衰老图，用于来自 [22] 的所有单个野生型样品，其中有匹配的 Tom70-GFP 和基因表达数据可用（GSE207503葡萄糖、半乳糖、果糖、蔗糖、棉子糖-半乳糖、葡萄糖<>半乳糖位移）。R2通过线性回归计算;虚线显示 95% 置信区间。（G） 基于Tom70-GFP与ERC积累的衰老图（根据给定时间点的IGS2信号估计 - RNA-seq中的日志），对于来自[22]的所有单个野生型样品，其中匹配的Tom70-GFP和基因表达数据可用（GSE207503葡萄糖，半乳糖，果糖，蔗糖，棉子糖 - 半乳糖，葡萄糖<>半乳糖转移）。R2通过线性回归计算;虚线显示 95% 置信区间。红色和蓝色框勾勒出 2 个可观察的点聚类。此图下面的数字数据可以在 S8 文件中找到。ERC，染色体外核糖体DNA圈;环保部，母亲充实计划;rDNA，核糖体DNA;SEP，衰老入口点;WGA，小麦胚芽凝集素。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002250.g006

第三，为了避免DNA修复突变体的特殊性，我们使用匹配的RNA-seq和Tom70-GFP数据的大型数据集，询问ChrXIIr和/或ERC积累是否预测在不同条件下衰老的野生型细胞中的SEP标记Tom70-GFP[22]。ChrXIIr与Tom70-GFP在所有数据集中的累积图显示了非常好的相关性（R2= 0.84）（图6F），表明ChrXIIr与SEP密切相关。同一数据集也可用于检查ERC，因为IGS2区域中ncRNA的反向链信号的变化有效地报告了ERC积累（将S2A与S1B图进行比较;也比较了[5]中的图5A和22B），为RNA-seq数据中的ERC积累提供了代理。正如预期的那样，鉴于我们的RNA-seq分析，我们观察到ERC积累与Tom70-GFP之间的相关性较小（R2= 0.47），仔细检查发现数据被细分为两组 - 具有宽频谱ERC水平的低Tom2-GFP集，以及具有宽频谱Tom-70 GFP信号的高IGS表达集（图70G，分别为红色和蓝色） - 其中每组ERC和Tom6-GFP之间基本上没有相关性。

最后，rad52Δ突变体特别强的SEP表型，以及其严重的DNA修复缺陷，可能导致rad52Δ数据集在我们的线性模型中产生不当影响，其中我们发现SEP和ChrXIIr染色体异常之间存在关联。为了解决这个问题，我们重新拟合了线性模型 2 和 3，包括野生型、spt3Δ 和 sac3Δ 的数据，但没有 rad52Δ 数据集（S5 和 S6 文件）。令人放心的是，当排除rad52Δ数据时，原始模型中基于SEP变量显着差异表达的大多数基因仍然显着差异表达（模型78中2%的基因和模型90中3%的基因）。此外，当从分析中排除rad52Δ时，基于SEP显着差异表达的基因在ChrXIIr上仍然强烈过度代表，但在其他染色体上则没有，这表明ChrXIIr与SEP的关联得以维持（S8A图）。从数量上讲，没有rad3Δ数据集的模型52的单个系数与原始模型非常相似（年龄系数0.02±0.03 SD，SEP系数0.04±0.09 SD的中位数差异），并且不出所料，这些分量的图几乎与使用完整数据集拟合的模型的图相同（比较S8B图与图4F）。尽管缺乏 rad52Δ 数据集的模型归因于 SEP 的 IGS 转录成分高于原始模型，但与与 Age 相关的成分相比，这仍然很小;这意味着ERC扩增仍然主要与年龄而不是SEP发病有关（S8B图，红点）。这些测试清楚地表明，我们的发现不依赖于来自rad52Δ突变体的数据集。

因此，ChrXIIr扩增在许多突变体和环境中与SEP密切相关，而ERC则不是，这表明ChrXIIr积累是衰老的主要特征。

ChrXIIr上蛋白质编码基因的扩增不会导致衰老

ChrXIIr可以想象成两部分 - 一束rDNA重复序列的大小从2到0.1Mb不等，具体取决于rDNA内形成ChrXIIr的切割发生的位置，连接到包含8个注释基因的0.6Mb区域（图334A，示意图）。我们考虑了这种非着丝粒染色体片段的积累可能有助于SEP的7种潜在机制。由基因拷贝数失衡引起的2个基因表达失调可能导致蛋白质补体的广泛缺陷[334]，或者，无论基因含量如何，大的非着丝粒染色体片段的存在本身都可能损害细胞周期。当然，在与年龄相关的病理学范围内，这些解释可能并不相互排斥。

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图 7. ChrXII上rDNA近端粒基因拷贝数的增加不负责SEP。

(A）显示ChrXIIr的不同可能大小以及XII号染色体其他区域的相对贡献的示意图。（B）将ChrXIIr的含基因部分融合到V号染色体的易位策略示意图。 （C） 日志2ChrXIIr上所有基因（左）或XII以外的染色体上所有基因（右）从对数期到给定时间点的标准化mRNA丰度变化。（D） Tom70-GFP 和 WGA 强度图，细胞大小设门，如图 3 所示，用于野生型和染色体 XIIr <> V 易位菌株。此图下面的数字数据可以在 S8 文件中找到。rDNA，核糖体DNA;SEP，衰老入口点;WGA，小麦胚芽凝集素。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002250.g007

为了确定ChrXIIr上334个基因的失调是否与SEP相关，我们设计了一种易位，将ChrXIIr的0.6 Mb基因部分重新定位到V号染色体，并终止了XII染色体，端粒与rDNA相邻，形成XIIr<>V菌株（图7B和S9A）。这应该会阻止334个基因的扩增，但不会妨碍可变长度的含rDNA片段的扩增，使得ChrXIIr样物种仍然可以形成，但仅包含rDNA束而没有蛋白质编码基因。由于尚不清楚的原因，我们无法在α单倍体中产生这种易位，因此产生了野生型对照菌株和携带XIIr <> V易位的菌株的a：a二倍体。在XIIr <> V菌株中，随着年龄的增长，野生型中ChrXIIr基因mRNA的增加显着减少，这是预期的，因为这些基因不再存在于rDNA切割后积累的ChrXIIr片段上（图7C）。尽管如此，Tom70-GFP信号随着年龄的增长和细胞大小的增长而增加，就像野生型一样（图7D），而图4A中定义的SEP相关基因的全局基因表达失调和表达的变化就像在对照菌株中一样发生（S9B和S9C图）。该实验清楚地表明，尽管SEP与ChrXIIr的扩增有关，但SEP不需要扩增ChrXIIr上的特定基因。换句话说，着丝粒远端基因扩增到rDNA不会导致衰老;相反，这可能与ChrXIIr片段的大线性rDNA组分的形成有关。

总体而言，我们的结果与预测rDNA稳定性缺陷是衰老和年龄相关表型的有效驱动因素的模型完全一致。然而，我们没有发现ERCs对衰老细胞生理学有任何影响的证据表明;相反，包含rDNA和XII染色体右侧端粒之间区域的非着丝粒片段的形成与SEP有关，并且是介导酵母老化破坏性影响的有力候选者。

讨论

ERCs在20多年前首次被提出作为酵母老化的原因，基于短寿命突变体的大量积累和人工ERCs引起的寿命缩短[24]。然而，ERC毒性的机制仍然未知，尽管最近的研究将核糖体合成和核孔结构的缺陷与ERC积累联系起来，但尚不清楚这些缺陷是否或如何影响衰老细胞生理学[19，20，49，50]。在这里，我们检查了一组低ERC突变体中的衰老表型，发现与年龄相关的转录组学失调和SEP独立于ERCs发生。此外，我们没有发现ERCs在基因表达水平上对通路特异性影响的任何有力迹象。因此，ERC对于酵母中的年龄相关表型不是必需的，在随附的手稿中，我们表明ERCs也是不够的，因为在半乳糖上老化48小时的细胞具有丰富的ERC，但与年龄相关的表型很少[22]。这些发现与ERC是S年龄相关变化的主要驱动因素的假设不符。酿酒。相反，我们表明另一种rDNA衍生的染色体外物种与SEP紧密相关，并且可能是正常酵母细胞中年龄相关表型的主要贡献者。

ChrXIIr 作为酵母中衰老表型的候选介质

在了解ERC积累可能导致衰老的机制方面投入了大量精力。鉴于ChrXIIr水平与SEP的相关性比ERC水平更紧密，我们询问是否可以调整这些机制来解释每个细胞约1个分子的ChrXIIr如何诱导与年龄相关的表型。最近的研究发现，核孔的超微结构变化和核孔复合体损伤是酵母老化表型的原因，这是由于ERCs与核孔的结合引起的[49，50]。我们提出大的线性无中心粒DNA片段也通过与ERCs相同的SAGA/TREX-2介导机制结合核孔复合物，但由于它们的大小会连接在一起并缠绕许多核孔复合物，从而损害核膜结构（图8）。有趣的是，这概括了HGPS加速衰老的致病机制，它涉及核膜结构的破坏，将酵母和人类的衰老机制联系起来[73]。

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图8. ChrXIIr病理活性的假设机制。

ChrXIIr的单个拷贝通过SAGA和TREX-2与许多核孔复合物结合。当ChrXIIr经历构象变化和随机运动时，这将施加力使核膜变形，导致观察到的核膜结构缺陷[50]。这也将限制核膜内核孔复合物的任何必要的重新分布和松弛，并且ChrXIIr结合预计将诱导ERCs引起的核孔结构和功能的逐渐损害[49]。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002250.g008

这种机制应该在很大程度上独立于DNA片段的序列组成，只是由大片段大小驱动。这就解释了为什么从XII号染色体易位600 kb着丝粒远端区域不会阻止SEP，因为rDNA切割事件仍然会形成高达1.8 Mb的线性无中心粒DNA片段（图7C），并且每个分子引起的缺陷不会有太大差异。其他人已经表明，合成ERCs可导致寿命和核孔缺陷，尽管rDNA序列本身是可有可无的[24，49，74];单个ERC大小的小环状DNA可能会缠绕几个核孔，如果以足够的水平存在，则会导致致病表型，但我们提出的模型预测，这些DNA的破坏性远小于数量少得多的非常大的线性分子，如ChrXIIr。目前尚不清楚为什么ERCs与核孔复合物结合，而染色体rDNA重复似乎不会，但一种可能性是这种相互作用发生在所有rDNA拷贝上，但被染色体凝聚破坏，这需要着丝粒[75]。由于ERCs和ChrXIIr缺乏着丝粒，这两个物种仍将与核孔复合物结合成有丝分裂，而全长XII染色体则不会;为了支持这一观点，凝聚蛋白突变体在母细胞中显示出XII染色体与ERCs的特异性保留[76]。

核孔复合物和核膜结构的缺陷预计将导致mRNA输出和基因表达的非特异性变化，而不是影响特定的基因集，并且这种变化对于批量RNA-seq方法是不可见的。基因表达的失调会损害促进快速生长的精确生化控制，减慢细胞周期，这反过来会导致全局表达谱的变化，因为细胞会适当地改变基因表达以降低生长速率。这解释了我们的发现，即许多先前归因于复制衰老的基因表达变化更具体地说是SEP的结果，SEP后的细胞显示出高度失调的基因表达模式，类似于缓慢生长的影响。

似乎有理由认为，长时间在SEP中具有高水平的核孔复合物和核膜破坏最终将使细胞无法存活，要么是由于基因表达模式被破坏到超出可容忍的参数，要么是由于核膜结构缺陷对DNA复制的已知影响（图8）。这两种效应都可以解释rad52Δ和hst3 Δ hst4Δ细胞的早期终末停滞。然而，总的来说，我们的数据并不支持SEP是正常酵母老化中的主要生命限制过程：非衰老半乳糖衰老细胞与葡萄糖老化的细胞具有相似的寿命;非衰老的 sac3Δ 细胞寿命短;Li及其同事通过微流体描述了无SEP的衰老轨迹[23]。因此，ChrXIIr与衰老密切相关，与寿命密切相关，这使得ChrXIIr成为年龄相关表型的候选介质，但不是寿命限制者，除非在极端情况下。

酵母老化的ERC模型在预测和解释寿命改变的酵母突变体方面非常有效。然而，这些结果很难转化为更高的真核生物，因为缺乏衰老中ERC积累的证据。我们的研究结果表明，其他拷贝数较低的染色体外DNA物种可能是衰老表型的有效介质，推动衰老健康的差异几乎与寿命无关。当然，目前尚未证明 ChrXIIr 的出现总是触发 SEP 发作，因此我们不能排除 ChrXIIr 形成是 SEP 的结果而不是原因的可能性。然而，非着丝粒片段具有介导衰老的长期表型效应的潜力，并且可能通过高等真核生物中的年龄连锁rDNA切割产生，从而提高了从酵母保存到哺乳动物的衰老病理学rDNA稳定机制的前景。

ChrXIIr积累可以替代许多老化模型中的ERC

Hu及其同事首次报道的ChrXIIr的积累可能受到绝大多数用于调节ERC水平的突变体的影响，尽管ChrXIIr和ERC的机制依赖性并不相同。Ganley及其同事此前曾质疑ERCs与衰老之间的关系，他们证明降低rDNA复制起源的效率不仅会降低ERC丰度，还会降低寿命和rDNA稳定性[77];我们注意到，无论对ERC的影响如何，降低起源效率都会增加rDNA复制不能及时完成的机会，并加速ChrXIIr的形成，从而推动早期非常强大的SEP。同样，ChrXIIr模型可以解决长期存在的问题，即为什么同源重组突变体尽管没有ERCs，但寿命很短，因为当同源重组无法修复停滞的复制叉时，应该加速ChrXIIr的形成，这可能导致异常强烈的SEP导致早期终末停滞[25]。

最近的三项研究表明，ERC会导致SEP，如果ChrXIIr模型正确，则必须解决这个问题：Morlot及其同事表明，ERC积累的时间在SEP发病之前立即高于背景[20]。然而，这只是平均观察到的，许多单个细胞在SEP之前或之后很久就显示出ERC积累。已知rDNA复制问题的风险会随着年龄的增长而增加，我们怀疑这些缺陷是ChrXIIr和累积ERC的来源[52]。在此模型下，由ChrXIIr引起的ERC积累和SEP发病平均是重合的，因为它们通过相同的潜在机制产生。Neurohr及其同事表明，在偶尔的灾难性失隔离事件中，衰老表型可以与所有ERC一起转移到子细胞[19]。然而，鉴于ChrXIIr的母细胞保留机制可能与ERCs相同，ChrXIIr可能会被转移到带有ERCs的女儿身上。事实上，本研究中使用的Cfi1标记无法将ChrXIIr与ERC区分开来。最后，Li及其同事报告了核仁扩增和碎裂，这被认为是ERC积累的结果[23]。然而，我们现在表明核仁扩增独立于ERCs（S3E图），因此不能被视为ERCs对衰老的贡献的证据。因此，ChrXIIr类似的生物发生和分离行为意味着ChrXIIr可能是以前归因于ERC的许多影响的基础。

ChrXIIr形成的机制

将ERCs与衰老联系起来的许多证据来自增加或降低年轻细胞ERC水平的突变。然而，这些突变体并不是绝对特异性的，那些影响rDNA重组的突变体也会影响其他非染色体DNA物种的形成，包括ChrXIIr。许多研究将rDNA的不稳定性和ERC形成归因于Fob1介导的RFB的复制叉停滞，大约70%的单倍体fob1Δ细胞不会发生SEP发作[20，26，31–33，78，79]。如果 ChrXIIr 导致 SEP，则必须通过 Fob1 促进形成。然而，还必须存在另一种独立于Fob1的途径，因为大约30%的fob1Δ细胞也经历SEP，并伴有强烈的ERC积累[20]。鉴于我们检测到老化野生型和fob1Δ之间的ERC丰度没有差异，这种Fob1独立途径很可能在二倍体MEP细胞中占主导地位，因此任何ChrXIIr形成的机制都必须以Fob1为特征，但作为贡献者而不是不可或缺的成分。Fob1也可促进ChrXIIr杂合子事件的丧失，但不是必需的，这些杂合子事件随年龄的增长而增加，在二倍体MEP中[52]。

从机制上讲，Fob1阻断复制叉的通过，否则复制叉会正面遇到35S RNA聚合酶I转录单元（S10Aii图），然后通过与RNA聚合酶I同向行进的复制叉进行解析。但是，如果同向分叉变得不可恢复地停止，则复制不会完成，并且将保留稳定的未复制结构（S10Aiii图）。酵母中的DNA复制可以持续到后期，此时该结构将在2个有丝分裂纺锤体之间拉伸以形成桥接染色体（S10Aiv图）;事实上，已经直接观察到单链rDNA中间体在陈年酵母中持续存在[19]。酵母中的DNA复制可以持续到后期，此时该结构将在2个有丝分裂纺锤体之间拉伸以形成桥接染色体[80-82]（S10Aiv图）。然后必须切割复制叉结构以完成有丝分裂，正如在哺乳动物系统中观察到的那样[80，83-85]，形成ChrXIIr片段以及截短的XII染色体（S10Av图）。在该模型下，ChrXIIr通过切割在后期仍未分离的复制中间体形成，而不是通过特定的重组事件。

在fob1Δ中不会发生RFB处的复制叉停滞，但与RNA聚合酶I的正面碰撞也可能导致不可恢复的叉停滞，并且以相同的结果以相当的频率出现。相反，我们预测rDNA中复制叉不可恢复的停滞频率在rad52Δ突变体中会增加，因为同源重组通常会挽救停滞的复制叉[86，87]，因此在同源重组缺陷突变体的衰老过程中，ChrXIIr的形成会更频繁和更早地发生。这可以解释为什么尽管完全缺乏ERC，但同源重组突变体中的SEP表型比野生型更强。

ChrXIIr形成机制也会导致二倍体细胞杂合性丧失（S10B图）。如果完整的XII号染色体在切割后分离到子体，则2条裂解的XII染色体片段将保留在母细胞中，以便在下一个细胞周期中通过单链退火进行修复（S10B图，左结局）[88]。然而，如果裂解的XII染色体的着丝粒片段分离到子核，它就会与ChrXIIr片段物理分离，ChrXIIr片段不受张力，将被募集到母核中的核孔中[89]（图8）。这导致子细胞的杂合性丧失和母细胞中的ChrXIIr积累。因此，杂合子事件的丧失在机制上可能与ChrXIIr的形成和SEP有关。

总之，尽管ERC积累并不能解释进入SEP，但另一种rDNA衍生物种ChrXIIr的形成与SEP密切相关，并为酵母老化期间衰老的开始提供了潜在的机制。此外，与[22]一起，我们发现大多数与酵母老化相关的基因表达变化实际上是衰老的结果，而不是复制年龄本身。

材料和方法

详细和更新的协议可在 https://www.babraham.ac.uk/our-research/epigenetics/jon-houseley/protocols 获得。

酵母培养和标签

酵母菌株通过标准方法构建，列在S1表中，寡核苷酸序列在S2表中给出，质粒在S3表中给出。对于染色体V<>XII易位，Tom70-GFP首先使用pFA6a-GFP-KanMX6的变体在MEP a中用GFP标记，其中I-SceI位点已被使用寡核苷酸oJH1819-20的位点定向诱变去除，然后通过用BY2的ADE2片段转化形成YJH4741来恢复ade1581Δ。诱导型I-SceI质粒pGSKU [90]（Sac I-Bmg BI片段）中的Kan抗性基因被pFA1a-TRP6 [1]（Sac I-SmaI片段）的TRP91标记物替换以形成pGSTU。然后，将中间具有I-SceI位点的2 kb染色体V片段插入pGSTU，使用含有寡核苷酸oJH1798-9（Sac I-Bam HI）和oJH1800-1（Sac II-BamHI）的PCR，Sac I SacII消化pGSTU形成pGST-V-U。将该质粒上的PCR产物oJH1808-9转化为YJH1581，得到yJH1585，并转化为MEP单倍体以形成YJH1559。将YJH1585和YJH1559的菌落在YPGalactose平板上重新放置两次，然后通过PCR筛选菌落以进行相互转化，并通过PFGE（0.5× TBE，1%凝胶，60至120秒切换，6 V / cm，14°C，24小时）确认，形成YJH1594和YJH1560。YJH6和YJH1584中的NatMX1594标记被His3MX6取代，形成YJH1703和YJH1704。YJH1703与YJH1559交配，而YJH1704与YJH1560交配，在YPD Kan Nat板上选择a：a二倍体YJH1725和YJH1726。

所有细胞均在YPD培养基（2%蛋白胨，1%酵母提取物，2%葡萄糖）中于30°C以200rpm振荡生长。培养基组件从Formedium购买，培养基通过过滤进行灭菌。MEP实验如修改所述进行[15]：将细胞接种在4ml YPD中并生长6至8小时，然后在25ml YPD中稀释并生长16至18小时至0.2至0.6×107细胞/毫升在50毫升锥形瓶中。0.125 × 107通过离心（15，13g下000秒）收获每个老化培养物的细胞，用125μlPBS洗涤两次，并重悬于含有约125mg / ml生物素-NHS的3μlPBS中（Pierce 10538723）。将细胞在室温下在轮上孵育30分钟，用125μlPBS洗涤一次，并重悬于125μlYPD中，然后在125×1下接种在10ml YPD中4细胞/毫升在用石蜡膜密封的250毫升锥形瓶（费雪品牌FB33132）中。1小时后加入1μM β-雌二醇（来自2758mM Sigma E2乙醇溶液），用于野生型和spt3Δ，3小时用于sac3Δ和mus81Δ，4小时用于rad52Δ和hst3 Δ hst4Δ。额外 0.125 × 107从对数期培养物中收获细胞，同时在室温下孵育生物素标记反应。通过离心1分钟，4，600rpm收获细胞，立即通过重悬在70%乙醇中固定，并储存在-80°C。 为了最大限度地减少Tom70-GFP实验期间的荧光团漂白，培养箱的窗口被铝箔覆盖，在标记过程中不使用层流罩上的灯，并且在生物素孵育期间用铝箔覆盖试管。

细胞纯化

通过在1ml管中涡旋2μlPercoll（Sigma P900）与1644μl100×PBS并在10，2g，15°C下离心15分钟，形成Percoll梯度（每个样品000至4个，取决于收获密度）。 将乙醇固定细胞解冻并用1体积的冷PBSE（PBS + 2mM EDTA）洗涤，然后每梯度重悬于约100μl冷PBSE中，并在预先形成的梯度上分层。将梯度在4，2g，000°C下离心4分钟，然后除去细胞碎片的上层和棕色层并丢弃。加入 1 ml PBSE，通过倒置混合，并在 1，2g、000°C 下离心 4 分钟以沉淀细胞，然后每个时间点将其重悬于 1 ml PBSE 中（重新团聚分成 2 个梯度的样品）。加入25μl链霉亲和素微珠（Miltenyi Biotech 1010007），并将细胞在室温下在轮子上孵育5分钟。同时，将每个样品1根LS色谱柱（Miltenyi Biotech 1050236）加载到QuadroMACS磁体上，并在4°C的房间中用冷PBSE平衡。将细胞加载到柱子上并在重力作用过，用1ml冷PBSE洗涤，并使用柱塞用1ml PBSE洗脱。用约500μlPBSE重新平衡后，将细胞重新加载到相同的色谱柱上，洗涤并重新洗脱，并且该过程重复总共连续3次纯化。将Triton X-100加入至0.01%以帮助沉淀后，将细胞在2.1ml管中分成5个部分，在30，20g，000°C下沉淀4秒，在N 2上冷冻，并储存在-70°C。

对于活纯化，将细胞沉淀，用合成的完全2%葡萄糖培养基洗涤两次，然后重悬于相同培养基的2ml最终体积中，并在带有5μlMyOne链霉亲和素磁珠（Thermo）的旋转轮上孵育10分钟，使用磁铁分离并用5ml相同培养基洗涤1次。对于集落形成测定，将细胞划线在YPD板上，并使用Singer MSM400显微操作器将单个细胞移动到特定位置。24小时后，用4×物镜在显微操纵器成像的屏幕上测量菌落大小。

DNA提取和南方印迹分析

将细胞沉淀重悬于50.0M山梨糖醇，34mM EDTA和4025mM DTT中的1μl 2.50U / ml裂解酶（Sigma L10）中，并在37°C下孵育45分钟。以 1，000g 离心 5 分钟后，将细胞轻轻重悬于 80 μl 0.3% SDS、50 mM EDTA 和 250 μg/ml 蛋白酶 K（罗氏 3115801）中，并在 65°C 下孵育 30 分钟。冷却至室温后加入32μl5M KOAc;通过轻弹混合样品，然后在冰上冷却30分钟。以10，20g离心000分钟后，使用切割尖端将上清液提取到新管中;加入125μl苯酚：氯仿（pH 8），样品在轮上混合30分钟。将样品以5，20g离心000分钟;使用切割尖端提取上相并用250μl乙醇沉淀。用70%乙醇洗涤沉淀，风干，并在4°C下放置过夜以溶解在20μlTE中。轻轻混合后，将10μl每个样品用20U XhoI（NEB）在3μl6×CutSmart缓冲液（NEB）中消化20至1小时，使用PicoGreen DNA（Life Technologies）定量0.2μl，并在25cm 1%1×TBE凝胶上以90V分离等量的DNA过夜。 将凝胶在0.25N HCl中洗涤15分钟， 0.5 N NaOH45分钟，在1.5M NaCl，0.5M Tris（pH 7.5）中两次20分钟，然后转移到20×SSC中的20×6cm HyBond N +膜中。在10°C下使用随机引发探针在42ml UltraHyb（Life Technologies）中探测rDNA基因间隔区，并在0°C下用1.0×SSC 1.42%SDS洗涤，或在65°C的Church Hyb中探测，并在0°C下用5.0×SSC 1.65%SDS洗涤。 图像通过暴露于磷化成像屏幕（GE）获得，使用FLA 7000磷酸成像仪（GE）开发，并使用ImageQuant v7.0（GE）进行定量。图6A用生物素标记的RNA探针在10°C下在42ml UltraHyb（Life Technologies）中探测rDNA基因间间隔区，并在0°C下用1.0×SSC 1.42%SDS洗涤，然后与IRDye 680LT链霉亲和素（LI-COR）杂交并在奥德赛DLx（LI-COR）上扫描。S9 Fig中的脉冲场凝胶在CHEF DRIII机器（Bio-Rad）上运行，使用条件：0.5× TBE，1%琼脂糖，60至120秒开关时间，6 V / cm，14°C，24小时运行时间，然后使用针对BNA5基因的随机引发探针如上所述印迹和探测。完整印迹图像以 S1 原始图像形式呈现。

RNA提取和RNA-seq文库制备

将细胞重悬于50μl裂解/结合缓冲液（来自mirVANA试剂盒，Life Technologies AM1560）中，并加入50μl0.5μm锆珠（Thistle Scientific 11079105Z）。裂解细胞，5个周期，每次30秒6，500毫秒?1/在MP Fastprep珠打浆机中冰敷30秒或在冷藏室的子弹搅拌机（赛默飞世尔）中以3的功率冰12分钟，然后加入250μl裂解/结合缓冲液，然后加入15μlmiRNA匀浆添加剂，细胞在冰上孵育10分钟之前短暂涡旋。加入300μl酸性苯酚：加入氯仿，涡旋，在室温下以5，13g离心000分钟，然后提取上相。加入400μl室温乙醇和2μl糖原（Sigma G1767），混合物在-1°C下孵育30小时，然后在15，20g，000°C下离心4分钟。 用冷的70%乙醇洗涤沉淀并重悬于10μl水中。在BPTE小型凝胶上对1μlRNA进行乙醛聚光并进行分析，并使用PicoGreen RNA试剂盒（Life Technologies R11490）或Qubit RNA HS检测试剂盒对RNA进行定量。

使用带有poly（A）+纯化模块（NEB E150，E7760）的NEBNext Ultra II定向mRNAseq试剂盒制备文库，使用7490 ng RNA制备文库，如修改所述：从聚（T）珠中洗脱、逆转录、第二链合成、拖尾和衔接连接试剂体积减少了50%;文库扩增13个循环，每个引物每2μl反应50μl，然后在2.0×的AMPure磁珠纯化9轮，并在11μl0.1×TE中洗脱，然后使用生物分析仪HS DNA ChIP（安捷伦）进行质量控制，并使用KAPA文库定量试剂盒（罗氏）进行定量。

用于基因组重测序的 DNA 提取和文库制备

将细胞重悬于60μlPFGE洗涤缓冲液（10mM Tris HCl（pH 7.5），50mM EDTA）和1μl裂解酶（17U / μl在10mM KPO中）4（pH 7），50% 甘油，默克>2，000 U/mg L2524），加热至 50°C 2 分钟，然后加入 40 μl 熔融 CleanCut 琼脂糖 （Bio-Rad 1703594），剧烈涡旋 5 秒，然后移入塞模 （Bio-Rad 1703713），并在 15°C 下固化 30 至 4 分钟。 将每个塞子转移到含有2μlPFGE洗涤缓冲液的500ml管中，其中含有10μl17U / μl裂解酶，并在3°C下孵育37小时。 用500μlPK缓冲液（100mM EDTA（pH 8），0.2%脱氧胆酸钠，1%N-月桂酰肌氨酸钠，1mg / ml蛋白酶K）替换溶液，并在50°C下孵育过夜。 将塞子在室温下用4ml TE洗涤1次，摇动1至2小时;将 10 mM PMSF 添加到 100 mM 储备液的第二次和第三次洗涤中（默克 93482）。15分钟，将1/10个塞子与1ml琼脂酶缓冲液（6mM Bis-Tris-HCl，5mM EDTA（pH 50.20））平衡，然后除去上清液并加入65μl琼脂酶缓冲液。将塞子在5°C下熔化42分钟，转移到预热至1°C的加热块中0392分钟，加入42μl β-琼脂酶（NEB M1S）并通过轻弹混合，不允许样品冷却，并在25°C下继续孵育10小时。用<>μl<>M NH乙醇沉淀DNA4OAc，1μl糖蓝和330μl乙醇，并重悬于130μl0.1×TE中。DNA在AFA微管（Covaris 520045）中以Covaris E220占空比10，PIP 175，循环200，温度11°C片段化，然后乙醇沉淀。使用NEBNext Ultra II DNA试剂盒（NEB E10S）使用7645 ng DNA制备文库，如修改所述：拖尾和衔接连接试剂体积减少了75%;文库扩增9个循环，每个引物每2μl反应50μl，然后以2.0×的AMPure磁珠纯化9轮，并在11μl0.1×TE中洗脱，然后使用生物分析仪HS DNA ChIP（安捷伦）进行质量控制，并使用KAPA文库定量试剂盒（罗氏）进行定量。

测 序

DNA和RNA-seq文库由Babraham研究所测序设施使用NextSeq 500仪器在75 bp单端模式下测序。所有RNA-seq数据均已存放在GEO中，入藏号为GSE207429号和GSE207503号。

RNA-seq 质量控制、作图、定量和分析

Babraham研究所测序机构提供的FASTQ格式文件使用Nextflow（v20.01.0）管道处理为每个基因的整数读取计数，该管道略微修改自nf核心（v1.4.2）提供的RNA-seq管道[92，93]。读取是适配器和质量修剪使用修剪丰富！（v0.6.5） （www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore） 围绕 Cutadapt 的包装器 （v2.10） [94]。然后使用FastQC（v0.11.9）（https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/）评估图书馆的整体质量。读取映射到R64-1-1 S。使用HISAT2（v2.2.0）进行酿酒酵母基因组组装[95，96]。映射的读段在外显子上量化，并使用featureCounts（v2.0.0）在gene_id水平进行分组[97]。对于定位和定量，我们使用ENSEMBL释放99注释，在规范RNA聚合酶I转录rRNA基因之间增加了4个额外的位点。以下用“rDNA_intergenic”基因生物型注释：IGS2-1S在XII：485433-459675，-链;IGS2-1AS在XII：458433-459675，+链;IGS1-2S 在 XII： 459797–460711，—链;IGS1-2AS在XII：459797-460711，+链。对于下游分析，我们纳入了所有带有注释gene_biotype的基因：“protein_coding”、“transposable_element”或“rDNA_intergenic”。我们排除了所有线粒体编码的基因和rDNA位点周围的基因（即，起始或结束位置在XII：450000-491000以内），除了具有“rDNA_intergenic”生物型的基因。我们在R（v4.2.1）编程环境中执行了大多数RNA-seq数据操作，这些操作都是在featureCounts下游进行的[98]。我们大量使用了Tidyverse（v1.3.1）系列软件包[99]，特别是stringr（v1.4.0），dplyr（v1.0.9），purrr（v0.3.4），tidyr（v1.2.0），readr（2.1.2）和tibble（v3.1.7）。DESeq2 （v1.36.0） [55] 包是使用 BiocManager （v3.15） [100] 从 Bioconductor 存储库获得的。

RNA-seq 归一化、差异表达检测和图形输出

通常，我们使用内置的DESeq2大小因子归一化过程来使值在测序库之间具有可比性，以进行可视化和差异表达测试。我们对所有鉴别表达测试应用了BH校正FDR临界值0.05。我们用对数对基因进行分类2倍数变化>0.5显著上调，基因与对数2倍数变化<-0.5，显著下调。为了显示，我们记录2使用添加的伪计数 1 转换规范化读取计数，以处理检测到的计数为 0 的任何实例。

S1C和S2A无花果的显著差异表达基因列表来自拟合的DESeq2模型，其中年龄（分类，水平：对数期，48小时）作为单一设计因子。这包括对数期和野生型背景一式三份的48小时龄样品。使用拟合的DESeq2模型进行“ERC积累对单个基因的影响最小”一节中提到的成对比较，比较48小时龄的野生型（一式三份）与spt3Δ（一式三份），rad52Δ（重复）或sac3Δ（一式三份）的样品，使用基因型（分类，水平：野生型，突变体）作为单一设计因子。

图2C的显示数据以及热图2B中显示的基因列表来自拟合的DESeq2模型，具有年龄（分类，水平：对数期，24小时，48小时），基因型（分类，水平：野生型，spt3Δ，rad52Δ和sac3Δ），ERC丰度（分类，水平：低，高）和TRP1（分类，级别：不存在，存在）。这包括对数期、24 小时和 48 小时老化样品，野生型、TRP1 修复野生型、spt3Δ 和 sac3Δ 一式三份，以及 rad52Δ 一式两份。对于ERC丰度因子，大多数样品被归类为“低”，而野生型（包括TRP1修复的野生型）24小时和48小时老化样品为“高”。对于TRP1因子，野生型细胞的标记“不存在”，而所有其他细胞（包括TRP1修复的野生型）的标记“存在”。全套线性模型日志2-倍数变化系数和 DESeq2 结果在 S1 文件中。

对于SIR复合物调控基因的分析，如果Ellahi及其同事确定这些基因在sir2Δ，sir3Δ和sir4Δ背景中差异表达（根据原始作者的定义），我们认为这些基因受SIR复合物的调节（该出版物表7中的粗体条目）。我们过滤的RNA-seq数据集中存在40个基因中的42个。

图4B、4C、4D、S4A、S4B、S4C和S4D的显示数据以及图4A、S4A、S6E和S8C中显示的基因列表来自具有年龄（分类，水平：对数期，2小时，24小时）的拟合DESeq48模型，基因型（分类，水平：野生型，spt3Δ，rad52Δ和sac3Δ）， TRP1（分类，级别：存在，不存在）和 SEP 状态（连续，最小-最大值缩放到范围 [0，1]）。包含的数据与以前的线性模型相同。TRP1 分类如上。SEP状态值取自图70A和S3C所示的TOM3-GFP中位数，野生类型值也用于TRP1修复样品。全套线性模型日志2-倍数变化系数和 DESeq2 结果在 S2 文件中，而装有 rad52Δ 数据集的修改版本的等效信息在 S5 文件中。

图4E和4F的显示数据来自拟合的DESeq2模型，该模型具有年龄（分类，水平：对数期，24小时，48小时），基因型（分类，水平：野生型，spt3Δ，rad52Δ和sac3Δ），TRP1（分类，水平：存在，不存在），SEP状态（连续，最小-最大值缩放到范围[0，1]）和碳源（分类，水平：葡萄糖，半乳糖）。所有以前使用的数据都如上所述包括在内，并带有“葡萄糖”碳源。此外，我们纳入了5组对数期，24小时和48小时样品，用于葡萄糖生长的YDH18细胞和6组在半乳糖上生长的YDH22细胞（数据最初来自[1]）。由于基因型和表型差异可以忽略不计，这些被认为是用于建模的野生型基因型。他们还有TRP18标记“存在”。上述模型中用于野生类型的SEP值用于葡萄糖生长的DH18样品。半乳糖生长的DH1样品的SEP值取自[22]中的图<>B。全套线性模型日志2-倍数变化系数和 DESeq2 结果在 S3 文件中，而装有 rad52Δ 数据集的修改版本的等效信息在 S6 文件中。

图1C，2B，2D，4A，S4A和S5E的显示RNA-seq数据使用Trim Galore（v0.6.6）进行适配器和质量修剪，并由Babraham研究所生物信息学设施使用HISAT64 v1.1.2 [2]映射到酵母基因组R1-0-96。映射的数据被导入到SeqMonk v1.47.0（https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/seqmonk/）中，并量化了日志2映射到带注释的开放阅读框（相对链特异性文库）的反义链的总读段，探针包含在rDNA基因间隔区的每一条链上。通过整套量化探针的大小因子归一化调整读取计数。

在SeqMonk中计算分层聚类图和PCA。在GraphPad Prism（v9.2.0）中生成MA图，比较2个条件之间每个基因的平均值和差异。在对照条件下归一化后少于2个读数的探针被过滤，因为在这种情况下无法准确量化数据集之间的变化。

基因本体术语富集分析

使用GOrilla（http://cbl-gorilla.cs.technion.ac.il/）对单个集群进行的GO分析[101]。GO 分析的引用 p 值根据 Benjamini 和 Hochberg 方法（来自 GOrilla 输出的 q 值）进行 FDR 校正。为简洁起见，仅给出数量级而不是完整的q值[102]。完整的GO分析在S7文件中提供。

基因组重测序图谱和分析

在使用Trim Galore（v0.6.6）进行适配器和质量修剪后，由Babraham研究所生物信息学设施使用Bowtie 64[1]将DNA-seq数据映射到酵母基因组R1-2-103。在每 25 kb 间隔的 5 kb 窗口中量化读取。排除了Ty元素和LTR重叠的窗口、线粒体DNA、ENA位点和CUP1位点，然后应用大小因子归一化[104]。对于rDNA分析，在1 kb窗口，200 bp间距和大小因子标准化中定量读取。

流式细胞术

将细胞沉淀重悬于240μlPBS和9μl10%Triton X-100中，含有0.3μl与Alexa Fluor 1（生命技术）偶联的647mg / ml链霉亲和素和0.6μl与CF1S（生物）偶联的405mg / ml WGA。将细胞在室温下在旋转混合器上染色10分钟，同时用铝箔覆盖，用含有300.0%Triton X-01的100μlPBS洗涤一次，重悬于30μlPBS，并立即进行流式细胞术分析。使用Amnis ImageStream X Mk II进行流式细胞术分析，激光功率设置如下：405 = 25 mW;488 = 180 mW;561 = 185 mW;642 = 5 mW;SSC = 0.3 mW。

根据面积和纵横比（>0.8）值对单个细胞进行门控，并根据梯度RMS值（>50）对焦点内细胞进行门控。还进一步应用了链霉亲和素阳性（AF647）细胞的门控，所有这些都以分层方式进行，并获得了1，000个事件。对于出芽细胞分析，采集了10，000个事件，并根据聚焦图像以及面积和纵横比将细胞门控为2组：将单个细胞门控并计数为G1期细胞，将出芽细胞（3个细胞的双联体或聚集体）门控并计数为G2 / S期细胞。在数据分析之前，根据单色对照和自动计算的补偿矩阵进行补偿。使用IDEAS软件的强度特征提取不同参数的总荧光强度值，并具有自适应侵蚀修改的掩模覆盖率。在分析中，仅包括荧光的阳性值（即，细胞对标记物真正呈阳性），并使用Graphpad Prism（v9.2.0）确定群体的中值。

统计分析

除使用 R DESeq2 包执行的统计分析外，所有统计分析均在 GraphPad Prism （v9.2.0） 中执行。

支持信息

ERC的补充剂不会导致全基因组基因表达失调。

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S1 图 ERC的补充剂不会导致全基因组基因表达失调。

(A） 对数期 ERC 丰度的南方印迹分析以及 48 小时老化的野生型和 fob1Δ MEP 细胞。定量显示了 3 个生物学重复的 ERC 条带和 XII 染色体带之和之间的比率，p 值由 1 路方差分析计算。图像显示同一印迹膜的 2 个切片，未应用差异图像处理。（B）对数期ERC丰度的南方印迹分析，并指示野生型，rad52Δ，spt3Δ和sac3Δ突变MEP细胞的老化时间点，以及TRP1基因已恢复的野生型。（C） 原木散点图2mRNA丰度与48小时野生型的对数期比较。由DEseq2（BH校正FDR<0.05，log2-倍数变化阈值 ±0.5） 以彩色突出显示。为每个类别提供了GO项，重要性由FDR校正的q值指示，S7文件中的完整GO项富集分析。（C） 来自野生型和 rad52Δ、spt3 Δ 和 sac3Δ 突变体的对数期 poly（A）+ RNA-seq 文库的 PCA 摘要。（E）通过DEseq2对至少606个突变体和野生型之间在对数期显著差异表达的1，2个基因进行分层聚类分析（BH校正FDR<0.01，log2-倍数变化阈值 ±0.5）。显示了单个生物学重复;请注意，规模与其他分层聚类分析不同，因为对数阶段样本之间的差异小于与年龄相关的变化。此图下面的数字数据可以在 S8 文件中找到。BH，本贾米尼-霍奇伯格;ERC，染色体外核糖体DNA圈;罗斯福，错误发现率;去，基因本体;环保部，母亲充实计划;PCA，主成分分析。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002250.s001

（提夫）

S2 图 单个基因表达变化的补充与ERC积累无关。

(A）rDNA基因间隔区域中已知RNA聚合酶II转录本的示意图，以及非编码转录本的定量，将RNA聚合酶I转录35S基因的义和反义定向。单个生物学重复显示为点（3表示野生型，spt3Δ和sac3Δ，2表示rad52Δ），条形显示给定年龄和基因型的平均值。（B） 原木的分发2野生型细胞中所有基因的平均标准化mRNA丰度，包括rDNA基因间间隔区的探针。红色箭头突出显示了检测面板 A 中定义的 IGS1-F 非编码 RNA 的探针。 （C） 表示每个单独的 DESeq2 线性模型因子对平均对数的贡献的系数2在所有数据集中标准化簇2基因的mRNA丰度（来自图2B）。DESeq2 用于模拟表达依赖于 4 个类别自变量（具有额外的截距因子）：基因型（野生型，spt3Δ，rad52Δ，sac3Δ），TRP1 营养不良（存在，不存在），年龄（对数期，24 小时，48 小时），ERC 积累（低，高）。系数值可以解释为对数2归一化mRNA丰度变化是由相对于具有低ERC水平的野生型对数期TRP1营养素存在的特定模型因子引起的。小提琴内的实线表示中值，而下四分位数和上四分位数用虚线表示。模型的完整输出在 S1 文件中提供。（D）至于C，显示了所有数据集中40个SIR复合物调节基因（来自Ellahi及其同事）的值。此图下面的数字数据可以在 S8 文件中找到。ERC，染色体外核糖体DNA圈;rDNA，核糖体DNA。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002250.s002

（提夫）

S3 图 缺乏ERC的突变体的补充仍然显示SEP的特征。

(A） 在 3 小时和 52 小时时间点，野生型、spt24Δ 和 rad48Δ 的手动芽疤痕计数与中位 WGA 强度的比较。n = 15个芽疤痕细胞;n = WGA生物重复种群的中位数4个;误差线 ±1 SD. （B） 分析 Rpl13a-mCherry 以显示核糖体蛋白丰度。样品和分析如图3A所示。（C）Tom70-GFP，Rpl13a-mCherry，WGA的图以及指定年龄的野生型和sac3Δ细胞的细胞大小，如图3A所示获得。（D）集落大小测定，测量野生型和spt3Δ细胞在葡萄糖中老化的适应性。通过显微操作将日志期细胞和在培养基中活纯化的48小时细胞置于YPD板上。24小时后在显微操纵器屏幕上测量菌落直径。分析中仅包括3天后形成可见菌落的细胞。对数期细胞直接从相同条件下测量的培养物和菌落生长中取出。通过Kruskal-Wallis检验计算的p值，对数野生型n = 18，对数spt25 Δ为3，老化野生型为40，年龄spt22Δ为3。 （E）Rpa190-GFP流式细胞术图像在对数期细胞或母细胞群中24和48小时的信号区域分布。在对圆形（所有）和生物素（仅衰老细胞，基于链霉亲和素-Alexa1）进行门控后，每个群体总共对000，647个细胞进行成像;对图像进行后过滤以聚焦Rpa190-GFP。（F）Vph1-mCherry流式细胞术图像在对数期细胞或母细胞群中24和48小时的信号强度分布。在对圆形（所有）和生物素（仅衰老细胞，基于链霉亲和素-Alexa1）进行门控后，每个群体总共对000，647个细胞进行成像;对图像进行后过滤以聚焦Vph1-GFP。 （G）来自单个年龄母细胞（链霉亲和素染色，红色）的未分离细胞簇（明场）的示例图像。此图下面的数字数据可以在 S8 文件中找到。ERC，染色体外核糖体DNA圈;SEP，衰老入口点;WGA，小麦胚芽凝集素。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002250.s003

（提夫）

S4 图 SEP基因表达特征的补充。

(A） 日志的分层聚类2DESeq290线性模型2称为2个基因的mRNA丰度，在基于年龄的数据集之间存在显着差异。DESeq2建模如4B所述，聚类过程如2B所述。显示单个生物学重复（野生型为3，spt3Δ和sac3Δ，rad2Δ为52）。（B） 代表每个单独参数对使用 DEseq70 线性模型 2 计算的所有数据集中用 Tom2-GFP 水平显着差异表达的一组基因的 mRNA 丰度差异的贡献的系数，如 4B 所述。 （C） 日志2ChrXIIr上所有基因（左）或XII以外的染色体上所有基因（右）从对数期到给定时间点的mRNA丰度变化。显示了单个生物学重复;框显示中位数和四分位数范围;晶须显示上十分位数和下十分位数。（D）ChrXIIr和其他染色体的mRNA丰度变化数据集的中位数（图4C）。将野生型和 TRP1 数据集合并，每个条件给出 n = 6，p 值由 1 步方差分析与事后 Tukey 检验计算。红色 p 值表示 p < 0.05 时的显著性。（E） Tom70-GFP 和 WGA-Alexa405 流式细胞术图像在 YPD 中老化 24 和 48 小时的单倍体 MATα 对数期细胞或母细胞群中的信号强度分布。在对圆度（全部）和生物素（仅老化细胞，基于链霉亲和素-Alexa1）进行门控后，每个群体总共对000，647个细胞进行成像。对图像进行后过滤以聚焦Tom70-GFP，每个群体留下约600个细胞。（F） 日志2单倍体MATα MEP细胞的mRNA丰度从对数期到给定时间点的变化，ChrXIIr上的所有基因（左）或XII以外的染色体上的所有基因（右）。（G） 如图4B所示，不包括ChrXIIr上的基因。此图下面的数字数据可以在 S8 文件中找到。环保部，母亲充实计划;SEP，衰老入口点。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002250.s004

（提夫）

S5 图 将SEP相关基因表达变化与压力和生长联系起来。

(A）SEP系数和年龄系数之间的相关性，代表这些变量对线性模型3计算的衰老过程中基因表达变化的贡献，以及20分钟热休克（GSE18）期间的基因表达变化。仅包括参与ESR的基因[13]。R2通过线性回归计算的值。（B）SEP系数之间的相关性，代表该变量对衰老过程中基因表达变化的贡献，由线性模型3计算，与特定生长速率μ = 0.1和μ = 0.33之间的基因表达差异[66]。仅包括参与ESR的基因[13]。R2通过线性回归计算的值;n是分析的基因数量，因为并非所有ESR基因都是由Regenberg及其同事测量的。（C）SEP系数与年龄系数之间的相关性总结，表示这些变量对线性模型3计算的衰老过程中基因表达变化的贡献，以及不同胁迫期间的基因表达变化（GSE18）。R2计算值以比较Gasch及其同事报告的每个单独的应力数据集和SEP /年龄系数。R2然后将值分为 8 种不同的应力类型，p 值表示与 SEP 的相关性之间的差异和由 1 分方差分析计算的年龄系数。（D）线性模型48与SEP显着相关的18个基因集在衰老（野生型对数期至187小时）和热休克（GSE2）中的基因表达变化之间的相关性。R2通过线性回归计算的值;n是分析的基因数量，因为并非所有187个SEP基因都是由Gash及其同事测量的。（E）衰老过程中基因表达变化（野生型对数期至48小时）与特定生长速率之间的相关性 μ = 0.1 和 μ = 0.33 [66] 对于与线性模型 187 显着相关的 2 个基因集。R2通过线性回归计算的值;n是分析的基因数量，因为并非所有187个SEP基因都是由Regenberg及其同事测量的。此图下面的数字数据可以在 S8 文件中找到。ESR，环境胁迫反应;SEP，衰老入口点。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002250.s005

（提夫）

S6 图 非整倍体在衰老过程中出现。

基因组重测序数据和RNA-seq数据分别如图5C和4C所示，显示衰老过程中染色体I和VI的轻度积累。此图下面的数字数据可以在 S8 文件中找到。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002250.s006

（提夫）

S7 图 hst3Δ hst4Δ的老化相当于rad52Δ。

(A）细胞周期阶段图比较出芽和未出芽细胞的百分比。使用门控对链霉亲和素（仅老化样品）进行成像流式细胞术，然后根据圆度调用出芽和未出芽细胞，并通过检查代表性图像进行验证。（B）Tom70-GFP强度的成像流式细胞术分析，在SEP后G1细胞中显着增加[5]，WGA，报告复制年龄，野生型和hst3 Δ hst4Δ的细胞大小。对细胞进行门控以进行链霉亲和素染色（仅限老化样品），过滤掉年轻细胞，然后进行循环，其选择G1细胞并去除团块。图显示了生物复制种群的中位数;p值从2因素方差分析计算，事后Tukey检验使用基因型和年龄作为自变量，n = 2。红色 p 值表示 p < 0.05 处的显著性。（C）对数期ERC丰度和24小时老化野生型和hst3Δ hst4Δ MEP细胞的南方印迹分析;定量显示ERC条带与染色体rDNA的比率。从相同的印迹图像拼接各个泳道;未应用差分图像处理。（D） MA图比较对数2来自野生型和指示突变体的对数期和 48 小时龄样品之间的 mRNA 丰度分布。x 轴为日志2平均标准化读取计数;y 轴在日志中发生变化2从年轻人到老年人的标准化读取计数。斜率通过线性回归计算。为每个突变体提供不同的匹配野生型对照数据;rad52Δ 数据作为 hst3 Δ hst4Δ 的比较提供。每个基因型和年龄的数据计算为对数2突变体每个基因的平均标准化读取计数为 2 个生物重复，野生型为 3 个生物重复。（E） 日志的分层聚类2DESeq187线性模型2称为2个基因的mRNA丰度在基于SEP的数据集之间显着差异，如图4A所示，野生型，rad52Δ和hst3 Δ hst4Δ在对数和24小时，突变体每个时间点2个生物学重复，野生型3个生物重复。（F） 日志2ChrXIIr上所有基因（左）或XII以外的染色体上所有基因（右）从对数期到给定时间点的mRNA丰度变化。数据是 2 次生物学重复的平均值。（G） MA 图比较对数2野生型和mus48Δ的对数期和81小时老化样品之间的mRNA丰度分布。 x 轴是对数2平均标准化读取计数;y 轴在日志中发生变化2从年轻人到老年人的标准化读取计数。斜率通过线性回归计算。提供匹配的野生型对照数据，计算每种基因型和年龄的数据作为对数2每个基因 2 个生物学重复的平均标准化读取计数。此图下面的数字数据可以在 S8 文件中找到。ERC，染色体外核糖体DNA圈;环保部，母亲充实计划;SEP，衰老入口点;WGA，小麦胚芽凝集素。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002250.s007

（提夫）

S8 图 线性模型结果受排除rad52Δ数据集的影响最小。

(A） 线性模型 2 和 3 发现的基于 SEP 变量显著差异表达的基因比例，使用野生型的完整数据集 spt3 Δ、sac3 Δ 和 rad52Δ 或仅野生型 spt3 Δ 和 sac3Δ 的简化数据集。 值是观察到的每条染色体的基因数除以预期的基因数（从染色体上显着差异表达的基因×基因的总数/基因组中的基因计算）。染色体XII值分为XII左边 - 从左端粒到rDNA的区域，和XIIr-从rDNA到右端粒（ChrXIIr）。模型的完整输出在 S4 文件和 S5 文件中提供。（B）野生型衰老对数中的基因表达变化分配给48小时SEP和年龄贡献，由线性模型3计算，没有rad52Δ数据集，显示为MA图。分析如图4F所示;左图显示了野生型老化数据以供比较，与图4F中的左侧图相同。此图下面的数字数据可以在 S8 文件中找到。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002250.s008

（提夫）

S9 图 补充增加的基因拷贝数 端粒 靠近 ChrXII 的 rDNA 不负责 SEP。

(A） 脉冲场凝胶电泳分析显示 ChrXIIr 成功转移到染色体 V 上。 （B） MA 图比较对数2来自a：a二倍体野生型和Chr XII <>V易位菌株的对数期和48小时龄样品之间的mRNA丰度分布。x 轴为日志2平均标准化读取计数;y 轴在日志中发生变化2从年轻人到老年人的标准化读取计数。斜率通过线性回归计算。（C） 日志的分层聚类2由DESeq187线性模型2称为的2个基因的mRNA丰度在基于SEP的数据集之间显着差异，如图4A所示，不包括ChrXIIr上的基因 ，对于a：二倍体野生型和Chr XII <>V易位菌株。此图下面的数字数据可以在 S8 文件中找到。rDNA，核糖体DNA;SEP，衰老入口点。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002250.s009

（提夫）

S10 图 ChrXIIr的形成机理模型.

(A）复制分叉动态导致后期复制不完整。（i）rDNA中潜在的复制叉阻滞元件包括RFB，DNA损伤和RNA聚合酶I，II和III高度表达的区域。（ii）第一个复制叉在RFB处或与RNA聚合酶I碰撞时停滞。 （iii）由于DNA损伤，与转录单元碰撞，拓扑应变等原因导致收敛复制叉停滞。 （iv）着丝粒在有丝分裂纺锤体上被拉开，但无法完成分离。（v）通过结构特异性核酸内切酶切割复制叉结构允许分离完成，但形成ChrXIIr。（B）杂合标记物背景下的ChrXIIr形成。不完全复制导致一条染色体形成桥接染色体，其分辨率要么将两个染色体片段留在一个细胞核中（左），在这种情况下，断裂可以修复，要么分离片段（右），在这种情况下，母亲中的ChrXIIr形成伴随着女儿杂合性的丧失。母亲中ChrXIIr和全长XII染色体之间的进一步重组事件也可能导致母亲杂合性丧失。rDNA，核糖体DNA;RFB，复制分叉屏障。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002250.s010

（提夫）

S1 表。 这项工作中使用的菌株。

所有菌株都在 MEP 背景中;如前所述，大多数是二倍体。野生型等位基因表示为+;荧光团标记的构建体是杂合的，以避免生长缺陷。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002250.s011

（文档）

S2 表。 这项工作中使用的寡核苷酸。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002250.s012

（文档）

S3 表。 这项工作中使用的质粒。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002250.s013

（文档）

S1 文件。 线性模型 1 的详细信息和输出数据。

对所用变量的描述，计算模型系数和每个比较的显著性表。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002250.s014

（三十）

S2 文件。 线性模型 2 的详细信息和输出数据。

对所用变量的描述，计算模型系数和每个比较的显著性表。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002250.s015

（三十）

S3 文件。 线性模型 3 的详细信息和输出数据。

对所用变量的描述，计算模型系数和每个比较的显著性表。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002250.s016

（三十）

S4 文件。 单个染色体的基因组重测序数据。

每个突变体中单个染色体的年龄变化，数据处理如图5C所示。刻度与图5C相同，以便于比较。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002250.s017

（英文）

S5 文件。 不带 rad2Δ 的线性模型 52 的详细信息和输出数据。

对所用变量的描述，计算模型系数和每个比较的显著性表。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002250.s018

（三十）

S6 文件。 不带 rad3Δ 的线性模型 52 的详细信息和输出数据。

对所用变量的描述，计算模型系数和每个比较的显著性表。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002250.s019

（三十）

S7 文件。 差异表达基因集的GO分析。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002250.s020

（三十）

S8 文件。 数字数据的基础。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002250.s021

（邮编）

S1 原始映像。 图面板下方的完整未经修改的凝胶图像。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002250.s022

（英文）

确认

我们要感谢巴布拉汉姆研究所流动设施的Rachael Walker和Attila Bebes在成像流式细胞术方面的帮助;Babraham研究所下一代测序设施的Paula Kokko-Gonzales和Nicole Forrester，用于测序样品和QC协助;以及巴布拉汉姆研究所生物信息学设施的Felix Krueger，Laura Biggins和Anne Segonds-Pichon，以帮助进行样品处理和统计分析。我们感谢米歇尔·金的南方印迹分析;帕特里克·林德斯特罗姆和丹·戈特施林负责MEP系统;吉尔斯·查文和泰奥·阿斯珀特进行了有益的讨论;Luca Love和Prasanna Channathodiyil用于RNA-seq数据;以及张念舒和Nazif Alic关于DESeq2线性建模的有用建议。

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