免费医学论文发表-植物甾醇逆转抗逆转录病毒诱导的听力损失，对耳蜗老化有潜在影响
抽象
胆固醇有助于神经元膜的完整性，支持膜蛋白聚集和功能，并促进适当的信号转导。大量证据表明，中枢神经系统中的胆固醇失衡发生在衰老和神经退行性疾病的发展中。在这项工作中，我们将年轻和老年小鼠内耳中的胆固醇稳态描述为预防和治疗听力损失的一种新的未开发可能性。我们的研究结果表明，在衰老过程中，内耳中的胆固醇水平会降低，这种效应与胆固醇24-羟化酶（CYP46A1）的表达增加有关，胆固醇46-羟化酶是负责大脑中胆固醇更新的主要酶。此外，我们表明，使用抗逆转录病毒药物依法韦伦对CYP1A<>的药理学激活降低了外毛细胞（OHC）中的胆固醇含量，导致prestin免疫标记的减少，并导致失真产物耳声发射（DPOAEs）阈值的增加。此外，膳食补充植物甾醇，植物甾醇具有与胆固醇相似的结构和功能，能够挽救依非韦伦给药对听觉功能的影响。总之，我们的研究结果指出了内耳胆固醇稳态作为预防和/或延缓听力损失的创新治疗策略的重要性。
数字
Fig 4图1Fig 2Fig 3Fig 4图1Fig 2Fig 3
引文： Sodero AO， Castagna VC， Elorza SD， Gonzalez-Rodulfo SM， Paulazo MA， Ballestero JA， et al. （2023） 植物甾醇逆转抗逆转录病毒诱导的听力损失，对耳蜗老化有潜在影响。公共科学图书馆生物学21（8）： e3002257. https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002257
学术编辑： 曼努埃尔·马尔米耶卡，萨拉曼卡大学，西班牙
收到： 8月 2022， 18;接受： 七月 2023， 24;发表： 2023月 <>， <>
版权所有： ? 2023 索德罗等人。这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。
数据可用性： 支持本研究结果的数据可从开放科学框架（https://osf.io/xpemk/）公开获得。
资金： 这项研究得到了阿根廷国家促进科学和技术的PICT-2018-00539赠款和PICT-2018-00648赠款的支持。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。
竞争利益： 提交人声明不存在相互竞争的利益。
缩写： ABR， 听觉脑干反应;阿尔尔， 与年龄相关的听力损失;中枢神经系统， 中枢神经系统;直流网， 背侧耳蜗核;DPOAE， 失真产物耳声发射;IHC， 内毛细胞;OHC， 外毛细胞;公共广播公司， 磷酸盐缓冲盐水;PFA， 多聚甲醛;聚氯乙烯， 后腹侧耳蜗核;RNS， 活性氮种类;投资回报率， 感兴趣的区域;ROS， 活性氧;SC， 支持细胞;scRNA-seq， 单细胞核糖核酸序列;声压级， 声压级
介绍
老年人经常观察到神经系统功能恶化，认知能力逐渐下降[1]。年龄相关性听力损失（ARHL—老年性耳聋）是导致听力感知下降的重要问题，1岁以上的成年人中，近三分之一会出现一定程度的听力损失[3，65]。流行病学研究表明，ARHL与老年人认知能力下降加速和痴呆风险密切相关[2-3]。尽管使用助听器和/或人工耳蜗已被证明可以改善许多这些相关疾病，但ARHL的治疗仍然相当不足[4]。现代社会的高水平噪声暴露使老年性聋成为后天听觉应激、创伤和耳科疾病的混合体，叠加在内在衰老过程中[6]。ARHL通常始于内毛细胞与听觉神经纤维之间的突触连接缺失，以及耳蜗高频（基底端）区域的OHC缺失[7，8-3]。尽管如此，这些与年龄相关的损失背后的细胞和分子机制仍然大多未知。
胆固醇是神经细胞膜的重要组成部分，对细胞及其膜相关蛋白的正常功能至关重要。最近的研究表明，胆固醇在突触膜中含量丰富，并通过直接结合和/或调节构象、动力学和生物物理特性来调节许多蛋白质复合物[14]。在中枢神经系统（CNS）中，胆固醇在突触形成、细胞间相互作用和细胞内信号传导中起关键作用[15]。重要的是，由于外周胆固醇不能穿过血脑屏障，CNS内的所有胆固醇都是原位合成的[16]。因此，大脑中的胆固醇水平需要严格调节，胆固醇稳态的破坏与认知功能障碍和神经退行性疾病的发展有关[16-20]。一些研究表明，在衰老过程中，海马体中的胆固醇水平会降低[21，22]，从而对质膜结构和细胞功能产生深远的影响[15，19，23-26]。人类大脑样本中也有老年大脑和神经退行性疾病中胆固醇含量降低的报道[21，27-34]。在年龄相关性胆固醇丢失的原因中，有人提出海马体中胆固醇羟基化酶CYP46A1水平升高[24]，与氧化应激积累有关[22，35]。CYP46A1是一种大脑特异性酶，迄今为止在皮质和海马体的锥体细胞和中间神经元以及小脑的浦肯野细胞中都有报道[36-38]。研究表明，小鼠海马体衰老过程中突触胆固醇含量的降低（主要是由于CYP46A1上调）会干扰突触受体迁移和内吞作用，并导致记忆障碍[18]。有趣的是，恢复大脑胆固醇水平可以挽救老年小鼠的生化、突触和认知缺陷[19，39]和亨廷顿舞蹈症小鼠模型[40]。
OHC是与哺乳动物声音的机械放大和频率选择性有关的感觉细胞[41]。OHCs随长度变化响应膜电压的变化，这种现象称为电动性，由运动蛋白prestin引起，这是一种存在于OHC侧壁的多位位积分膜蛋白[42，43]。OHC侧壁的组织在毛细胞和其他哺乳动物细胞类型中是独一无二的，因为它含有严格调节的胆固醇水平[44-46]。据推测，OHC侧壁胆固醇含量的改变可能会调节质膜内prestin的功能和/或分布[45，47]。
所有这些证据使我们假设胆固醇缺乏可能在衰老过程中发生的相关耳蜗病变中发挥作用。然而，胆固醇稳态在内耳生理病理学中的作用尚未得到研究[48]。本研究的目的是通过分析年轻和老年小鼠内耳中的CYP46A1水平和胆固醇含量来验证这一假设。此外，我们测试了用依法韦伦激活CYP46A1（FDA批准的抗HIV药物）激活对听觉功能的影响。在用依非韦伦治疗的小鼠的内耳中也测试了膳食补充植物甾醇的效果。我们的研究结果首次显示了内耳胆固醇稳态作为预防和/或延缓听力损失的药物治疗策略的重要性。
结果
衰老过程中内耳胆固醇稳态
胆固醇通过CYP24A46羟基化成1（S）-羟基胆固醇，并通过血脑屏障消除这种氧甾醇，是从大脑中去除胆固醇的主要机制[51]。因此，为了测试胆固醇变化参与ARHL的可能性，我们分析了年轻和老年C46BL / 1J小鼠Corti器官中分解代谢酶CYP57A6的水平。C57BL / 6J是最广泛用于衰老研究的小鼠品系，因为它的寿命长达27至29个月。该菌株的先前研究表明，衰老会增加46个月龄小鼠海马体CYP1A24水平，导致胆固醇损失和认知能力下降[19]。然而，这些缺陷在小鼠达到19个月大之前并不明显。因此，我们决定在C46BL / 1J小鼠的内耳中探索高龄的CYP57A6水平。从2月龄和24个月大的C57BL / 6J小鼠中收获耳蜗并固定用于组织学分析。用抗CYP46A1和钙视黄蛋白的抗体对Corti整个支架的器官进行免疫染色，以标记耳蜗毛细胞（图1A）。从代表性共聚焦图片中可以看出，在年轻和老年小鼠的感觉细胞和支持细胞（SC）中都观察到CYP46A1标记（图1A）。不同耳蜗位置（顶端、内侧和基底）的全膜免疫染色（图1A）和定量分析（图1B）显示老年小鼠感觉上皮的CYP46A1荧光强度显着增加。在IHCs中，耳蜗46个区域的CYP1A3表达增加（t检验，顶端/内侧p < 0.0001，基底端p < 0.01）。在24个月大的小鼠中存活的OHC中，我们还发现整个耳蜗的CYP46A1荧光强度增加（t测试，顶端p < 0.001，内侧/基底区域p < 0.0001）。在SCs区域，我们通过计数IHC和OHC周围的所有阳性标记细胞来量化CYP46A1荧光强度。我们发现46个月龄小鼠SC的CYP1A24表达显着增加，但仅在耳蜗的内侧和基底区域具有统计学意义（t检验，基底
先前已经表明，胆固醇含量在OHCs侧质膜内Prestin的适当分布中起着重要作用，因此胆固醇含量是调节小鼠听力的关键因素[45，47]。为了分析观察到的老年小鼠CYP46A1水平的增加是否导致感觉上皮中胆固醇含量的降低，我们使用荧光抗生素菲律宾蛋白来标记胆固醇并检查耳蜗组织中这种甾醇的水平。根据已发表的研究结果[45]，年轻成年小鼠OHC中的胆固醇分布显示出强烈的细胞内菲律宾染色，周围环绕着对应于细胞侧壁膜的较低染色区域，如图1C放大插图中单个OHC中的粉红色虚线所示。如代表性共聚焦图片（图1C）和像素强度图（图1D，底图）所示，与年轻小鼠相比，2岁时OHCs的菲律宾染色显着减少（t检验，p <0.0001）。尽管老化的耳蜗显示出明显的OHC缺失，但沿存活OHC的直径定量菲律宾染色，以明确确定每个细胞的胆固醇含量，如图1C底部插图中放大的粉红色虚线所示。IHC中的菲律宾标记也显示老年耳蜗中的像素强度显着降低（图1D，上图，t检验，p <0.0001）。
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图1. CYP46A1老年小鼠耳蜗的表达和胆固醇含量。
(A）来自内侧区域的Corti整个安装器官xy投影中的代表性共聚焦图像，免疫标记来自年轻（顶部）和老年（底部）C46BL / 1J小鼠的CYP57A6（绿色）和钙视黄蛋白（红色）（比例尺= 30μm）。填充箭头表示 SC 的区域。箭头指向老年小鼠中存活的OHC。还标明了IHC和OHC的面积。（B）从年轻（n = 5）和老年（n = 6）小鼠获得的定量数据。在耳蜗的46个区域（顶端，内侧和基端）测量1个月和2岁时的IHC（左），OHC（中）和SC（右）的荧光强度（a.u.，任意单位）（年轻：顶端n = 2个IHC，3个OHC和43个SC;内侧78个IHC，144个OHC和25个SC;和29个IHC，CYP51A12 基底区有31个OHCs和24个SCs。旧：n = 顶端 22 个 IHC、28 个 OHC 和 55 个 SC;24个IHC，17个OHC和79个SC在中间;以及基底区28个IHC、13个OHC和69个SC）。绘制了对应于每种细胞类型（IHC，OHC和SC）的ROI示例。在老年小鼠中，与年轻耳朵相比，IHC，OHC和SC在所有耳蜗区域（SC的顶端除外）的CYP46A1免疫标记显着增加。n.s. = 不重要。星号表示统计显著性（t 检验，** = p < 0.01，*** = p < 0.001 **** = p < 0.0001）。 （C）来自耳蜗内侧区域的Corti整个安装器官的代表性共聚焦图像，染色为菲律宾人以标记胆固醇（绿色）和鬼笔环肽，以可视化来自年轻（顶部）和老年（底部）C57BL / J小鼠的立体纤毛（蓝色）肌动蛋白（比例尺= 30μm）。矩形使用63×物镜（比例尺= 8 μm）表示右侧显示的放大区域的区域。粉红色虚线代表单个IHC和OHC的直径。（D）用像素强度图（a.u，任意单位）沿一条线（在图C中显示为粉红色虚线）定量的菲律宾染色，在年轻（n = 3）和老年（n = 6）小鼠中穿过单个OHC或IHC在耳蜗的所有区域。在老年小鼠中，与年轻耳朵相比，IHC（上图）和存活OHC（下图）中的胆固醇含量显着降低（年轻：n = 104个IHC和200个OHC;旧：n = 52 个 IHC 和 22 个 OHC）。星号表示统计显著性（t 检验，**** = p < 0.0001）。这一数字背后的数据可以在 https://osf.io/xpemk/ 中找到。IHC，内毛细胞;OHC，外毛细胞;投资回报率，感兴趣的区域;SC，支持细胞。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002257.g001
CYP46A1的药理激活损害OHCs在体内的功能
上述结果表明，在衰老过程中，内耳中的胆固醇含量降低，并且这种胆固醇降低与胆固醇羟基化酶CYP46A1染色增强有关。因此，我们假设CYP46A1激活可能会降低年轻小鼠的胆固醇含量，导致听力缺陷。为了验证这一假设，我们使用了抗HIV药物依非韦伦，因为已知它可以增强CYP46A1活性[49，50]，然后评估听觉功能。已经证明，依非韦伦能够穿过血脑屏障，刺激小鼠的CYP46A1活性，剂量比用于HIV患者的剂量低300倍[49]。我们在0个月大的C09BL / 4J小鼠的饮用水中以57.6mg / kg /天的剂量给予依非韦伦2周。据报道，2月龄C57BL/6J小鼠具有良好的听力敏感性，该菌株的听觉阈值升高始于8-10月龄[56]。使用两种补充测试来评估耳蜗功能，从而可以鉴别诊断整个耳蜗的OHC与IHC/听觉神经功能障碍，从低频心尖转向高频基底端。第一个测试是听觉脑干反应（ABR），这是由头皮电极测量的上升听觉通路中的神经元回路产生的声音诱发电位。ABR 波形包括声音刺激发作后最初约 7 ms 内的一系列峰值（峰值 1 至 5）。第一个峰代表IHC和传入神经纤维之间第一个突触处的声音诱发峰值活动[57]。耳蜗输出的第二个补充测量是通过从外耳道记录的失真产物耳声发射（DPOAE）来评估OHC的功能[58]。在由 2 个接近的纯音频率同时刺激的正常耳蜗中，OHC 转导中的非线性会产生失真。这些畸变产物被OHCs电动性放大，在失真频率处引起运动，该失真频率传播到中耳，并可通过外耳道中的麦克风检测到[58，59]。与对照组未治疗小鼠相比，依非韦伦治疗在8周或12周（治疗开始和结束的年龄）的ABR阈值略有增加，尽管没有统计学意义（图2A和2B）（Kruskal-Wallis试验：df = 2，在所有频率下p >0.05）。在8周和12周时，对照组之间的ABR阈值没有差异（图2B）（曼-惠特尼u检验：df = 1，在所有频率下p > 0.05）。给予依非韦伦后，超阈值ABR峰1振幅未改变，表明耳蜗神经功能没有药物相关变化（图2C）（Kruskal-Wallis检验：df = 2，在所有频率下p > 0.05）。然而，与对照组相比，我们观察到用依非韦伦治疗的小鼠中频耳蜗区域的DPOAE阈值升高了20至30 dB（图2D）（Kruskal-Wallis检验：df = 2，p = 0.02，邓恩后试验，p < 0.05在11.33，16和22.65kHz），表明依非韦伦治疗后OHC功能退化。依非韦伦处理后，16 kHz下DPOAE的发射幅度与电平函数的平均数据减少（图2E）。图2F显示了基线时DPOAE在频域中的快速傅里叶变换示例，在对照和治疗小鼠的1 dB SPL下，f2和f13分别为34.16和80 kHz。与对照组相比，用依非韦伦治疗的小鼠的立方DPOAE（2f1-f2）减少（图2F）。
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图2. 控制，依法韦伦和依非韦伦加上植物甾醇处理的小鼠的听觉功能。
（A） 来自对照（黑色）、依法韦伦处理（红色）和依法韦伦处理的 Phy（蓝色）小鼠的代表性 ABR 波形，在增加的声压级 （dB SPL） 下以 16 kHz 音突发记录。阈值由虚线表示，并由峰值1的存在确定。比例尺适用于 3 个录音。ABR阈值显示，用依非韦伦治疗的小鼠在补充Phy时部分恢复。对照（n = 1）在1dB SPL（C）下的平均ABR阈值（B）和ABR峰值80（P6）幅度，用依非韦伦（n = 6）处理，并用依非韦伦与Phy（n = 6）小鼠以不同的测试频率处理。我们纳入了12周时的对照组;治疗后的年龄（黑色;n = 6）并在开始治疗前8周控制（灰色;n = 6）。（D）DPOAE控制阈值（12周;黑色;n = 6 和 8 周;灰色;n = 6），用依非韦伦（n = 6）处理，并用依非韦伦与Phy（n = 6）小鼠以不同的测试频率处理。DPOAE阈值显示，用依非韦伦治疗的小鼠在补充Phy时部分恢复的小鼠显着增加。（E）2组小鼠中f16 = 3kHz的平均DPOAE振幅与水平函数的关系。组表示显示± SEM （B-E）。（F） 快速傅里叶变换迹线示例，显示立方DPOAE振幅（2f1-f2），在f1 = 13.34 kHz时;f2 = 16 kHz，f2 输入电平为 80 dB SPL。50 dB SPL 的比例尺适用于 3 个录音。星号表示统计显著性（Kruskal-Wallis 检验，后跟邓恩后检验 * = p < 0.05）。这个数字背后的数据可以在 https://osf.io/xpemk/ 找到。ABR，听觉脑干反应;植，植物甾醇;声压级，声压级。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002257.g002
生理测试后，收获并固定耳蜗，以使用菲律宾素和鬼笔环肽标记毛细胞的立体纤毛来确定OHC中的胆固醇水平。菲律宾染色显示，与未处理的对照组相比，用依非韦伦治疗的组OHC的胆固醇水平降低（图3A，上图和中央图）。OHCs中的菲律宾染色模式在像素强度图中肯定很明显，该图绘制了耳蜗基底区域2行中每一行沿3个连续OHC（图3A中的虚线表示）宽度的像素强度作为代表性示例（图3B）。依非韦伦处理后，从基底到顶端沿耳蜗3个区域的OHCs胆固醇含量显着降低，如图3C中的相对强度图所示（单因素方差分析，df = 2，Tukey检验，所有区域的所有比较的p < 0.0001）。IHC和SC中菲律宾染色的定量分析也显示耳蜗3个区域的这些细胞中的胆固醇含量降低（单向方差分析，df = 2，Tukey试验，所有区域的IHC的p < 0.0001，内侧和顶端/基底区域的SC的p <0.001和p < 0.0001， 分别）（S2A–S2C 图）。正如预期的那样，依非韦伦在OHC，IHC和SCs中激活CYP46A1（图1A和1B）导致整个耳蜗中这3个细胞群的胆固醇水平降低（图3和S2）。在治疗结束时，我们使用分别标记感觉毛细胞立体纤毛（图3A）和钙视黄素/普雷斯汀（图4A）的鬼笔环肽抗体对Corti的整个坐骑器官进行组织学检查，没有观察到任何毛细胞丢失。我们的结果清楚地表明，依非韦伦治疗能够刺激感觉上皮的CYP46A1活性，导致OHC和DPOAE阈值升高的胆固醇损失，表明OHCs功能受损。
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图3. 来自对照组、依非韦伦和依非韦伦的OHC中的胆固醇含量以及植物甾醇处理的小鼠。
(A）来自OHCs基底区域的Corti整个安装器官的代表性共聚焦图像，用鬼笔环肽（蓝色;在立体纤毛中可视化肌动蛋白）和菲律宾蛋白（绿色;标记胆固醇）染色，用依非韦伦处理，并用依非韦伦加Phy小鼠处理。粉色线表示大约 16 μm，即 2 个连续 OHC 的宽度（比例尺 = 8 μm）。（B）从耳蜗基底区域每行的14个连续OHC的宽度获得的像素强度图（对照：n = 6个来自12 只动物的细胞;依非韦伦：n = 6个细胞来自28只动物，依非韦伦与植物甾醇：n = 6个细胞来自2只动物）显示，在依非韦伦治疗后， 当补充Phy时，胆固醇降低，菲律宾染色略有增加。x轴下方的粉色线表示3个连续OHC的宽度（C）相对强度条形图，显示耳蜗2个区域（顶端，内侧和基底）的3组小鼠的菲律宾染色变化。依法韦伦治疗后胆固醇水平显着降低。用依非韦伦联合Phy处理显示，与单独用依非韦伦治疗的小鼠相比，3个区域的菲律宾染色增加。然而，与对照组相比，耳蜗3个区域的菲律宾染色显著减少（对照：3只小鼠的顶端n = 80 OHC;内侧140 OHC;基底区域70 OHC;依非韦伦：顶端n = 6 OHC;内侧200 OHC;70只小鼠和依非韦伦与植物甾醇一起在基底区域有65个OHC： 顶端 n = 6 OHC;内侧92个OHC;和115只小鼠基底区域的77个OHC）。组表示显示± SEM。星号表示统计显著性（单因子方差分析，其次是Tukey检验，**** = p < 6.0）。这一数字背后的数据可以在 https://osf.io/xpemk/ 中找到。OHC，外毛细胞;植物甾醇。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002257.g003
依非韦伦处理的小鼠的OHC功能受损可以通过植物甾醇拯救
植物甾醇是植物天然存在的化合物，在结构和功能上与哺乳动物的胆固醇相似[60]。与循环胆固醇相反，膳食植物甾醇酯可以穿过血脑屏障并积聚在CNS细胞膜中[61]。最近研究表明，富含植物甾醇的饮食可以预防衰老加速SAMP8小鼠胆固醇丢失引起的记忆障碍[62]。我们认为，富含植物甾醇的饮食可以挽救依法韦伦给药引发的胆固醇损失依赖性内耳缺陷。为了验证这一假设，除了依法韦伦治疗外，实验组还在小鼠的食物中补充植物甾醇3周（随意）。
如图2A-2C所示，与对照或依非韦伦处理的动物相比，用依非韦伦加植物甾醇处理的小鼠的ABR阈值和超阈值ABR峰1振幅没有变化（Kruskal-Wallis试验：df = 2，在所有频率下p >0.05）。然而，与单独用依非韦伦治疗的小鼠相比，用依非韦伦和植物甾醇治疗的小鼠的DPOAE阈值有所降低，尽管没有统计学意义（图2D-2F）。重要的是，与对照组相比，用依非韦伦加植物甾醇治疗的小鼠的DPOAE阈值没有统计学差异（Kruskal-Wallis试验，df = 2，在所有频率下p > 0.05）。
为了评估植物甾醇是否可以恢复OHC膜中的甾醇含量，解剖耳蜗并用菲律宾染色。先前的报告表明，菲律宾人能够识别真核膜中的植物甾醇[63]。用菲律宾和鬼笔环肽染色以标记毛细胞立体纤毛的Corti器官整个支架的代表性共聚焦显微镜图像如图3A所示。沿基底区域2个连续OHC宽度的像素强度图显示，与单独用依非韦伦治疗的小鼠相比，用植物甾醇处理的组的菲律宾强度增加（图3B）。在耳蜗的顶端、内侧和基底区域观察到相同的增加（单向方差分析，df = 2，Tukey试验，所有区域的p < 0.0001）（图3C）。尽管甾醇水平未达到对照中测量的水平（单因子方差分析，df = 2，Tukey试验，所有区域的p < 0.0001），但依非韦伦加植物甾醇处理组菲律宾染色的增加表明植物甾醇可以部分恢复OHCs膜中的甾醇含量（图3C）。OHC中鬼笔环肽荧光强度的定量分析显示，3组小鼠之间没有差异。控制：顶点1，023±13.13;中位数 1，364 ± 8.98;和基础 1，289 ± 11.79。依非韦伦：顶点1，027±7.21;中位数 1，355 ± 8.70;和基础 1，297 ± 11.83。依非韦伦+Phy：顶端1，020±6.04;中位数 1，369 ± 17.77;和基础 1，265 ± 8.43。（任意单位表示± SEM，单向方差分析，df = 2，p > 0.05）。总之，这些结果表明，饮食中补充植物甾醇部分拯救了依法韦伦治疗的小鼠的OHC功能。
依非韦伦引发的OHCs膜中prestin分布的改变可以通过植物甾醇挽救
考虑到prestin是OHCs侧膜的关键组成部分，并且对其电动性至关重要，我们想知道通过降低胆固醇含量导致DPOAE阈值升高是否可以通过质膜内prestin分布的改变来解释。使用抗普雷斯汀和钙视黄素的抗体通过免疫组织化学评估来自对照，依法韦伦处理和依法韦伦加植物甾醇处理的小鼠OHC中的Prestin水平，以可视化毛细胞。如从内侧区域Corti器官的整个支架的代表性共聚焦图像中可以看出（图4A），与对照组相比，用依非韦伦治疗的耳朵中的prestin免疫标记减少。在旋转z-stack图像以查看每行3个OHC的投影作为通过耳蜗上皮的横截面后，用依非韦伦处理的小鼠（即yz平面;图 4A，底板）。如图4A-4C所示，在对照小鼠中，prestin集中在OHCs膜的侧区域。依非韦伦处理后，侧壁中的prestin标记减少并沿细胞体分布。值得注意的是，与依法韦伦处理的小鼠相比，饮食中补充植物甾醇增加了OHCs膜中的prestin水平（图4A-4C），导致正常prestin分布的部分恢复。下图上的图4B显示了耳蜗内侧区域沿每行一个OHC宽度的Prestin强度的代表性图，这些切片来自3组小鼠的共聚焦显微镜成像的所有切片。图4B的顶部面板显示了图4A上的白色矩形指示的选定区域的单个OHC的放大图像，作为我们如何沿OHC绘制线以执行预强度分析作为细胞距离的函数的示例。粉红色和橙色的线代表8μm，即单个OHC的平均直径（图4B）。对应于0至2μm和6至8μm的区域之间的像素强度值表示单个OHC的侧壁的近似宽度（由线的粉红色表示），线的橙色部分表示OHC的细胞质（图4B）。与侧壁相对应的区域（用粉红色表示）的Prestin强度图显示，与对照组相比，依非韦伦治疗组的像素强度降低，补充植物甾醇后Prestin信号略有但显着增加。为了量化耳蜗内侧区域每个OHC内普雷斯汀分布的变化，我们计算了膜区域（距离0至2和6至8μm，由图4B中的粉红线表示）和细胞质（距离2至6μm，图4B中的橙色线）的平均荧光，并计算膜和细胞质荧光之间的比率。如图4C所示，在对照条件下，该比率的值为1.20±0.09，表明与细胞质相比，细胞膜中prestin的存在更高。在依法韦伦处理的动物中，该比率显着下降至0.74±0.04（单因子方差分析，df = 2，Tukey检验，所有区域的p <0.0001）显示hi与膜相比，细胞质中存在普雷斯汀。这种效应在用植物甾醇处理的动物中恢复，其中比率为1.09±0.03。与对照小鼠相比，该比率没有显着差异（单因子方差分析，df = 2，p > 0.05）。最后，我们通过在3个连续OHC的中间画一条线，计算了3组小鼠耳蜗所有区域（顶端，内侧和基底）的平均Prestin荧光强度（图4D）。与对照小鼠相比，在耳蜗的所有区域，依非韦伦普雷斯汀染色的减少是明显的（单因素方差分析，df = 2，Tukey试验，所有区域的p < 0.0001）。重要的是，与单独用依非韦伦治疗的小鼠相比，在饮食中添加植物甾醇可显着增加3个区域的像素强度（单因子方差分析，df = 2，Tukey测试，所有区域的p <0.0001）。尽管加入植物甾醇后Prestin免疫染色的增加未达到耳蜗内侧和基底区域的对照水平，但与单独用依非韦伦治疗的小鼠相比，有显着增加。总之，这些数据表明OHC中的胆固醇含量随着依法韦伦CYP46A1的激活而降低，导致质膜中运动蛋白prestin的减少，从而导致DPOAE阈值升高。值得注意的是，我们可以通过补充植物甾醇来部分恢复OHCs的功能。
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Fig 4. Prestin expression in OHCs from control, efavirenz, and efavirenz plus phytosterols-treated mice.
(A）来自内侧区域的Corti整个支架器官的代表性共聚焦图像免疫标记的钙视黄蛋白（红色）和普雷斯汀（绿色）对照，用依非韦伦处理，并用依非韦伦加Phy小鼠（顶部）（比例尺= 16μm）。耳蜗整体安装yz从每行（底部）投影3个OHC（比例尺= 8μm）。（B）在耳蜗内侧区域的3行中，沿一个单个OHC的宽度绘制的平均像素强度图，作为3组小鼠距离的函数（下图）。来自选定区域的一个OHC的高放大倍率图像，由A（顶部图）共聚焦图像上的白色矩形指示。粉红色和橙色线代表约8μm，一个OHC的宽度（粉红色末端表示对应于侧壁的区域，橙色表示细胞的细胞质）。（C）侧壁和细胞质中平均荧光强度之间的比率，以可视化耳蜗内侧区域每个OHC内Prestin分布的变化（对照：来自24只小鼠的n = 6个细胞;依非韦伦：n = 25来自6只小鼠和依非韦伦与 植物甾醇：n = 38来自6只小鼠的细胞）。（D）条形图显示3个耳蜗区域（顶端，内侧和基底）的Prestin荧光强度平均值。通过追踪通过3个连续OHC的线来测量强度。（对照：顶端n = 110 OHC，内侧60 OHC，基底区76 OHC;依非韦伦：顶端n = 75 OHC，内侧90 OHC，基底区60 OHCs和依非韦伦与植物甾醇一起：顶端n = 110 OHC，内侧105 OHC，基底区80 OHC）。依非韦伦处理后，OHC侧壁上的prestin标记减少。与单独使用依非韦伦治疗的小鼠相比，补充Phy增加了OHCs膜中prestin的存在。组表示显示± SEM。星号表示统计显著性（单因子方差分析，后跟图基检验，**** = p < 0.0001）。这一数字背后的数据可以在 https://osf.io/xpemk/ 中找到。OHC，外毛细胞;植物甾醇。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002257.g004
讨论
哺乳动物的听觉功能取决于OHCs的主动运动来放大基底膜运动[42，62]。OHC是高度极化的细胞，分为3个结构域：其顶端极与角质板和立体纤毛，其基底极包含细胞核和听觉突触，以及侧壁。OHC侧壁在核能级以上具有独特的三层组织，并且已经证明OHC电动性存在于其侧壁中[64-67]。因此，侧壁膜的脂质组成对耳蜗力学至关重要[68]。根据这一观点，[68]描述了膜胆固醇如何调节耳蜗电力学，并且[45]显示了膜胆固醇水平与OHC中prestin相关电荷运动的电压依赖性之间的动态和可逆关系，从而调整了这些细胞的功能。
以前的研究表明，衰老与中枢神经系统胆固醇代谢的改变有关，主要是在大脑中，这取决于所研究的区域。在海马体中，由于胆固醇24-羟化酶或CYP46A1（催化胆固醇转化为24S-羟基胆固醇的酶）的活性增强，衰老会引发神经元轻度但持续的胆固醇流失[24]。老年海马神经元中的胆固醇损失会影响突触后AMPA受体的横向活动，损害受体内吞作用，并影响神经元刺激激活的信号通路。所有这些事件都会导致老年人的认知能力恶化。有趣的是，这些认知缺陷可以通过老年小鼠侧脑室胆固醇灌注[19]或通过体内药理学CYP46A1抑制来挽救[39]。这一证据促使我们研究内耳胆固醇代谢改变是否是与ARHL相关的潜在事件[48]。
我们通过免疫荧光首次发现，在年轻C46BL / 1J小鼠的3种不同细胞群（IHC，SC和OHC）中，CYP57A6在内耳中表达。有趣的是，在这46个群体中，1个月大的小鼠CYP24A3水平显着升高。在CYP46A1增加的同时，我们发现感觉细胞中的胆固醇水平显着降低，这是通过对24个月大的小鼠的整个支架器官进行菲律宾染色所鉴定的。为了测试CYP46A1活性，胆固醇损失和听觉功能之间是否存在直接的因果关系，我们用依非韦伦治疗2个月大的小鼠，这是一种能够特异性激活CYP46A1的抗HIV药物。我们选择在2月龄时开始治疗，以避免C57BL/6J菌株（从8-10月龄开始）随年龄增长而出现的听觉阈值升高[56]。为了支持我们的假设，我们发现依非韦伦治疗导致OHC胆固醇水平降低，伴随着OHC功能的改变。事实上，耳声发射是通过OHCs的机电特性测量的主动耳蜗扩增的客观指标[69，70]。我们观察到用依非韦伦治疗的小鼠在中基底频率耳蜗区域的DPOAE阈值升高20至30 dB，与对照组相比，表明当这些细胞中的胆固醇水平降低时OHC功能降低。依非韦伦治疗后观察到轻度但无统计学意义的ABR阈值升高，这种改变可以通过胆固醇损失引起的OHC功能缺陷来解释。值得注意的是，超阈值ABR峰1振幅在所有测试频率下均未显示变化，表明耳蜗神经功能未因治疗而改变。
然后，我们测试了由于胆固醇损失引起的OHC功能改变的可能性，可以通过向依法韦伦治疗的小鼠补充植物甾醇来挽救。我们根据先前的证据分析了植物甾醇的作用，该证据表明，在衰老小鼠模型中，膳食植物甾醇补充剂可以挽救由海马神经元胆固醇损失引起的认知障碍[62]。我们发现，在饮食中补充植物甾醇3周后，Corti全山器官OHC的菲律宾染色增加，表明它们可能到达OHCs膜。因此，我们发现用依非韦伦加植物甾醇治疗的小鼠的DPOAE阈值降低，这与未治疗的对照组在统计学上无法区分，这表明饮食中补充植物甾醇部分恢复了OHC的功能。
为了寻找依非韦伦处理细胞中胆固醇降低导致OHC功能障碍的可能原因，我们通过免疫染色评估了对照组依非韦伦组和依非韦伦组加上植物甾醇组小鼠OHC中的prestin水平。先前的研究表明，胆固醇在调节基于膜的运动以在OHC受体电位范围内以最大增益发挥作用方面起着关键作用[45]。Prestin在对照细胞中沿OHC侧质膜均匀分布，并且在低胆固醇依非韦伦处理小鼠的OHC中观察到Prestin水平降低以及该蛋白质沿细胞的错误分布。引人注目的是，补充植物甾醇增加了OHC中的prestin水平，侧壁中正常的prestin分布明显恢复。普雷斯汀改变可能不是OHC中胆固醇降低导致的唯一缺陷。已经描述，膜脂质的组成会显著影响质膜的生物物理和机械性能，例如流动性和刚度[46]，这可以调节电压门控通道的门控[71]。事实上，据报道，胆固醇会影响雏鸡成熟神经支配毛细胞中的电压门控钙和BK型钾通道[72]。此外，胆固醇可能通过直接与其他膜蛋白结合来发挥其作用，影响其构象和动力学[73，74]。因此，胆固醇对通道生物物理学的可能影响，以及蛋白质在膜中的定位，表明胆固醇是听觉生理学的关键因素。无论如何，我们的结果清楚地表明，由于CYP46A1激活而导致OHC中胆固醇含量的降低导致运动蛋白prestin的水平和错误分布的降低，这与DPOAE阈值的升高平行。我们认为，这种现象可能发生在衰老的早期阶段，在OHC变性之前，并且至少是触发ARHL/老年性聋的多种原因之一。
ARHL是一种由不同因素引起的多因素进展性疾病[8]。外周感觉和神经元件的损伤以及沿中枢听觉通路发生的变化会导致与年龄相关的视力下降[75-77]。外周变性涉及血管纹、感觉毛细胞、螺旋神经节神经元和纤维细胞的变性。活性氧和活性氮（分别为ROS和RNS）的积累以及细胞内钙稳态被认为是促成因素，使OHC，尤其是耳蜗高频区域的OHCs最容易衰老[78，79]。事实上，通过免疫组织化学，我们观察到耳蜗存活的OHC在衰老过程中钙视黄蛋白表达的增加。同样，最近对老年小鼠耳蜗毛细胞的细胞类型特异性转录组学分析的研究表明，在2月龄时，钙视黄蛋白（Calb26基因）在OHC中的特异性表达增加[80]。据报道，钙结合蛋白钙视黄蛋白在所有耳蜗核的细胞应激期间缓冲细胞内钙[81]和脑衰老[82，83]中起着关键作用。在PVCN（PVCN）和耳蜗背侧核（DCN）等几个大脑区域，与幼年动物相比，老年小鼠的钙视黄蛋白表达增加[84]，钙结合蛋白的增加与OHC缺失相关[85，86]。我们发现，由于活性增加，老年OHC的胆固醇含量降低CYP46A1可能是ARHL的另一个促成因素。事实上，体外老化海马神经元显示，ROS积累触发了CYP46A1基因表达增加[22，35]。有趣的是，由于我们观察到植物甾醇治疗部分恢复了OHC的功能，我们的结果为探索预防或延缓ARHL-老年性聋的创新治疗策略提供了可能性。考虑到已知C57BL / 6小鼠在生命早期会失去听力能力，因此有必要在替代小鼠品系中进行额外的工作，例如CBA / CaJ，其听力一直保持到老年，以进一步探索胆固醇水平下降的进展和听力随着年龄的增长，以证明这种影响是由于年龄，并且不受OHCs整体损伤的影响。总之，这些结果是第一个原理验证研究，表明CYP46A1激活可导致听力缺陷，因为胆固醇从OHC中去除，从而导致运动蛋白prestin分布的改变。此外，我们表明，OHCs中胆固醇损失的影响可以通过在饮食中补充植物甾醇来挽救。
As stated above, efavirenz treatment leads to a reduction in the cholesterol levels in OHCs that was reflected by an elevation in DPOAEs thresholds. Several studies have reported an increased incidence of auditory dysfunction among HIV/AIDS patients treated with highly active antiretroviral therapy as a side effect [87,88]. Nowadays, the cocktails frequently used in clinical therapies include efavirenz, suggesting that prolonged treatment may cause hearing deficits. However, the mechanisms underlying hearing loss among HIV/AIDS patients treated with antiretroviral therapy are not well understood. Studies in mice indicated a synergistic relationship between anti-HIV drugs and noise, with an increase in DPOAE thresholds consistent with drug-induced damage to OHCs [89]. Efavirenz was also found to decrease the viability of immortalized auditory HEI-OC1 cells in culture in a dose-dependent manner [87]. The present study reveals for the first time a possible mechanism by which efavirenz treatment can lead to hearing impairment. Moreover, it sheds light into the use of phytosterols as a potential therapeutic and preventive strategy for treating and/or delaying hearing loss in HIV/AIDS patients treated with antiretroviral therapies.
Limitations of the study and future directions
Our results provide valuable insights into the relationship between cholesterol homeostasis and the physiopathology of the inner ear. However, there are 2 major limitations in this study that should be addressed in future research. The first limitation is the strain used in the study. C57BL/6J mice are widely used for aging studies due to its low aggressivity, which makes them suitable for long-term studies. However, this strain is known to exhibit early-onset hearing loss. Therefore, it is crucial to replicate the same experiments in a different mouse strain without this predisposition. These experiments are fundamental to determine whether the observed effects are specific to C57BL/6J mice or can be generalized to other mouse strains or even humans. Thus, our future research direction will be to explore the effect of aging and efavirenz administration in cholesterol levels in the cochlea using other strains of mice, like CBA/CaJ or BALB/cJ, and to test if phytosterols supplementation can ameliorate aged- and/or antiretroviral-related hearing loss. Second, although our results show that in aged cochlear tissue there is a reduction in cholesterol content in sensory cells of the inner ear—assessed by filipin labeling—and that this reduction is correlated with an increase in the immunofluorescence of CYP46A1, it will be important to test alternative methods for CYP46A1 quantification in specific cell populations. Future studies incorporating techniques such as RNAscope or scRNA-seq are necessary to validate our findings. In conclusion, while our study sheds light on the extent to which alterations in cholesterol homeostasis contributes to the pathophysiology of the inner ear, it is important to consider the aforementioned methodological limitations. Nonetheless, the initial outcomes of our present research offer great promise as they establish the first evidence in favor of phytosterols supplementation as a potential therapeutic strategy in the prevention or treatment of hearing loss.
Materials and methods
Ethics statement
All animal care and experimental protocols were performed in accordance with the American Veterinary Medical Association (AVMA) Guidelines for the Euthanasia of Animals (June 2013) as well as Facultad de Medicina, Universidad de Buenos Aires (UBA) Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) guidelines, and best practice procedures. The animal experiments were approved by the Institutional Animal Care and Use Committee of Facultad de Medicina, Universidad de Buenos Aires (UBA) (Approval Number: RESCD-2022-1402-E-UBA-DCT#FMED) and the Institutional Animal Care and Use Committee of Instituto de Investigaciones Biomédicas, Pontificia Universidad Católica Argentina (BIOMED) (Approval Number: 011–2021 and 005–2022).
Animals
Young (2 months) and old (2 years) C57BL/6J male mice were used in this study. All experimental mice were maintained under specific pathogen-free conditions with a 12-hour light/dark cycle and open access to food and water. The temperature and humidity were set at 22 ± 1°C and 55% ± 5%, respectively.
Efavirenz and phytosterols treatment in vivo
The treatment started at 8 weeks of age (2 months), with efavirenz administered in the drinking water at a dose of 0.09 mg/kg/day as described [50]. Efavirenz solutions were replaced every 3 days during the 4 weeks of treatment. Control groups drank water. Efavirenz treatment did not significantly alter the daily consumption of water (Controls: 6.2 ± 0.3 ml, Efavirenz: 6.1 ± 0.2 ml, and Efavirenz plus Phytosterols: 6.3 ± 0.2 ml; one-way ANOVA, df = 2, p = 0.67). Phytosterols (Vitatech) were added to standard food pellets (Cooperación, Argentina) at a concentration of 2% (w/w) and administered ad libitum. The phytosterols treatment was performed for 3 weeks (i.e. initiated 1 week after the efavirenz treatment started). At the end of the treatments, mice exhibited similar body weights (Controls: 28.8 ± 0.4 g, Efavirenz: 27.0 ± 0.9 g, and Efavirenz plus Phytosterols: 27.9 ± 0.2 g; one-way ANOVA, d = 2, p = 0.15).
Cochlear function tests
Inner ear physiology, including ABRs and DPOAEs, was performed in mice anesthetized with xylazine (10 mg/kg, IP) and ketamine (100 mg/kg, IP) and placed in a soundproof chamber maintained at 30°C. Sound stimuli were delivered through a custom acoustic system with 2 dynamic earphones used as sound sources (CDMG15008–03A; CUI) and an electret condenser microphone (FG-23329-PO7; Knowles) coupled to a probe tube to measure sound pressure near the eardrum (for details, see https://www.masseyeandear.org/research/otolaryngology/investigators/laboratories/eaton-peabody-laboratories/epl-engineering-resources/epl-acoustic-system). Digital stimulus generation and response processing were handled by digital I-O boards from National Instruments driven by custom software written in LabVIEW (generously given by Dr. M. Charles Liberman, Eaton-Peabody Laboratories, Massachusetts Eye & Ear Infirmary, Boston, MA). For ABRs, needle electrodes were placed into the skin at the dorsal midline close to the neural crest and pinna with a ground electrode near the tail. ABR potentials were evoked with 5 ms tone pips (0.5 ms rise-fall, with a cos2 envelope, at 40/s) delivered to the eardrum at log-spaced frequencies from 5.6 to 45.25 kHz. The response was amplified 10,000× with a 0.3- to 3-kHz passband. Sound level was raised in 5 dB steps from 20 to 80 dB sound pressure level (SPL). At each level, 1,024 responses were averaged with stimulus polarity alternated. Threshold for ABR was visually defined as the mean between the lowest stimulus level at which a repeatable peak 1 could be identified in the response waveform and the sound intensity before that. The ABR peak 1 amplitude was computed by offline analysis of the peak to baseline amplitude of stored waveforms. The DPOAEs in response to 2 primary tones of frequency f1 and f2 were recorded at 2f1-f2, with f2/f1 = 1.2, and the f2 level 10 dB lower than the f1 level. Ear canal sound pressure was amplified and digitally sampled at 4 μs intervals. DPOAE threshold was defined as the lowest f2 level in which the signal to noise floor ratio is >1. Offline analysis of ABR thresholds and P1 amplitudes together with DPOAEs thresholds were done by 2 experimenters “blind” to each animal’s treatment condition.
Cochlear processing and immunohistochemistry
从幼鼠（对照并用依非韦伦和依非韦伦加植物甾醇治疗）以及2岁小鼠收集颞骨。将耳蜗在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中用4%多聚甲醛（PFA）迷宫内灌注，用4%PFA后固定过夜，并在0.12M EDTA中脱钙。然后将耳蜗组织显微解剖并封闭在 5% 正常山羊血清和 1% Triton X-100 的 PBS 中 1 小时，然后在 4°C 下在一抗（在封闭缓冲液中稀释）中孵育 16 小时。本研究中使用的一抗如下：（1）兔抗CYP46A1抗体（Proteintech #12486-1-AP，1：400）;（2）小鼠抗钙视黄素抗体（密理博，比勒里卡，马萨诸塞州;MAB1568，1：1，000）;（3）山羊抗普雷斯汀抗体（圣克鲁斯生物技术公司sc22692;1：700）。然后将组织与适当的Alexa Fluor偶联荧光二抗（Invitrogen，Carlsbad，CA;封闭缓冲液中的1：1，000）在室温下孵育2小时。最后，将组织安装在FluorSave封片介质（Millipore，Billerica，MA）中的显微镜载玻片上。使用配备0×（3.63×数码变焦）油浸镜头的徕卡TCS SPE显微镜拍摄每个耳蜗的顶端，内侧和基底区域的共聚焦z堆栈（1.5μm步长）。将图像堆栈导入斐济软件[82]进行分析。使用逐个像素的强度总和进行最大预测，并绘制与每种细胞类型（IHC，OHC和SC）相对应的感兴趣区域（ROI）。计算每个ROI的平均CYP46A1强度。沿着一条线测量OHCs中prestin的像素强度，该线穿过对照组和治疗小鼠的所有耳蜗部分的1或3个连续细胞的中间。对于作为距离函数的prestin强度图（图4B），分析来自不同切片的耳蜗内侧区域的单个OHC，并沿细胞宽度绘制像素强度。OHC的平均直径为8μm。我们认为0至2μm区域和6至8μm区域之间的强度值（由图4B中线的粉红色表示）对应于单个OHC的侧壁，图4B中线的橙色部分表示细胞的细胞质。然后，我们计算了膜区域（距离0至2和6至8μm）和细胞质（距离2至6μm）中的平均荧光，并计算了膜和细胞质荧光之间的比率（图4C）。对于耳蜗所有区域的prestin强度分析（图4D），以3个连续细胞为一组分析OHC，并将平均像素强度绘制为顶端，内侧和基底端的函数。根据对所有切片中所有存在和不存在的毛细胞的评估，结合钙视网膜蛋白阳性信号与使用Nomarski光学器件的光学显微镜，沿整个耳蜗切片计数OHC。
Filipin labeling of whole mounts organ of Corti
The sensory epithelium was isolated and washed twice with PBS, fixed with 4% PFA for 30 minutes, and stained with the fluorescent molecule filipin (SIGMA, 125 μg/ml) and AlexaFluor 647 phalloidin (Invitrogen, Carlsbad, CA; 1:20) for 60 minutes in the darkness. The samples were then washed twice with PBS and mounted on microscope slides in FluorSave mounting media. Confocal z-stacks (0.3 μm step size) of the apical, medial, and basal regions from each cochlea were taken using the Leica TCS SPE microscope equipped with 63× (1.5× digital zoom) oil-immersion lens. Image stacks were examined using Fiji software [90]. Filipin pixel intensity was measured by drawing a line through the middle of 1 or 2 consecutive cells and plotted as either pixel intensities or relative intensity. All the OHCs were analyzed from each confocal z-stack [45].
Statistical analysis
Data are presented as group means ± standard error (SEM) and were analyzed with R Statistical Software [91]. Kruskal–Wallis nonparametric ANOVA followed by Dunn’s post-tests and Mann–Whitney tests were used to determine statistical significance in cases where data were nonnormally distributed (peak 1 amplitude between groups, ABR and DPOAE thresholds). For 3-group comparisons of data normally distributed, one-way ANOVA followed by Tukey’s post-tests were used to determine statistical significance (filipin and prestin intensities). For 2-group comparisons, a t test was performed (CYP46A1 intensity, %OHCs and filipin intensity). A p < 0.05 was considered statistically significant at a 95% confidence level.
Supporting information
年轻和老年小鼠耳蜗中的钙视黄蛋白免疫染色。
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S1 Fig. Calretinin immunostaining in young and aged mouse cochlea.
(A) Representative 10× low-magnification confocal images in the xy projection of whole mounts organ of Corti from the apical/medial region immunolabeled for calretinin from young (left; n = 5) and old (right; n = 6) C57BL/6J mice (scale bar = 200 μm). Insets: 40× magnification images of the selected area indicated by a white rectangle (scale bar = 50 μm). Arrows point to OHCs and arrowheads point to lost IHCs in aged ear tissue. (B) Bar graph showing the percentage of OHCs survival in aged mice compared to young animals. At 2 years of age, there was a 70% of OHCs death along the whole length of the cochlea. Asterisks represent the statistical significance (t test, **** = p < 0.0001). The data underlying this figure can be found at https://osf.io/xpemk/.
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002257.s001
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S2 Fig. Cholesterol content in IHCs and SCs from control, efavirenz, and efavirenz plus phytosterols-treated mice.
(A) Representative confocal images of whole mounts organ of Corti from the medial region stained with filipin in control, treated with efavirenz, and treated with efavirenz plus Phy mice. (Scale bar = 30 μm). Pink lines indicate the diameter of IHCs and SCs as an example on how we select cells to measure the pixel intensity. (B) Relative intensity bar graph showing the changes in filipin staining in IHCs in the 3 groups of mice at the 3 regions of the cochlea (apical, medial, and basal) (Control: n = 48 IHCs at the apical, 128 IHCs at the medial, and 66 IHCs at the basal region from 6 mice; efavirenz: n = 81 IHCs at the apical, 75 IHCs at the medial, and 35 IHCs at the basal region from 6 mice and efavirenz together with phytosterols: n = 93 IHCs at the apical, 114 IHCs at the medial, and 60 IHCs at the basal region from 6 mice). (C) Relative intensity bar graph showing the changes in filipin staining in SCs in the 3 groups of mice at the 3 regions of the cochlea (Control: n = 10 SCs at the apical, 21 SCs at the medial, and 10 SCs at the basal region; efavirenz: n = 22 SCs at the apical, 12 SCs at the medial, and 11 SCs at the basal region and efavirenz together with phytosterols: n = 14 SCs at the apical, 11 SCs at the medial, and 10 SCs at the basal region). There was a significant reduction in cholesterol levels after efavirenz treatment in both IHCs and SCs. Treatment with efavirenz together with Phy showed an increase in filipin staining at the 3 regions compared with mice treated with efavirenz alone, except in IHCs at the apical region. However, when compared to controls, there was a significant reduction in filipin staining at the 3 regions of the cochlea in both IHCs and SCs. Group means ± SEM are shown. Asterisks represent the statistical significance (one-way ANOVA, followed by Tukey’s test, = *** p < 0.001, **** = p < 0.0001). The data underlying this figure can be found at https://osf.io/xpemk/.
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002257.s002
(TIF)
Acknowledgments
We thank Dr. Ana Belén Elgoyhen for her insightful discussions and continuous support, and Dr. Carina Porporatto for providing reagents.
References
1.Yankner BA, Lu T, Loerch P. The Aging Brain | Enhanced Reader. Annu Rev Pathol. 2008;3:41–66. pmid:18039130
View ArticlePubMed/NCBIGoogle Scholar
2.傅斌， 勒普雷尔， 西蒙斯， 雷 D， 施拉德， 陈AB， 等.内侧少耳蜗传出神经支配的年龄相关性突触丧失。摩尔神经退行性变者。2010;5:1–9.pmid：21110869
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
3.盖茨，米尔斯·老年性聋。柳叶 刀。2005;366:1111–1120.密码：16182900
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
4.Deal JA， Goman AM， Albert MS， Arnold ML， Burgard S， Chisolm T， et al.听力治疗减少认知能力下降：老年人衰老和认知健康评估的设计和方法随机对照试验。阿尔茨海默氏症 Dement Transl Res Clin Interv.2018;4:499–507.密码：30364572
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
5.Loughrey DG，Kelly ME，Kelley GA，Brennan S，Lawlor BA。年龄相关性听力损失与认知功能、认知障碍和痴呆的关联：系统评价和荟萃分析。JAMA 耳鼻喉颈部外科 2018;144：115–126.密码：29222544
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
6.利文斯顿 G， 索默拉德 A， 奥尔吉塔 V， 科斯塔弗雷达 SG， 亨特利 J， 艾姆斯 D， 等.痴呆症预防、干预和护理。柳叶 刀。2017;390:2673–2734.密码：28735855
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
7.涂北，弗里德曼RA。与年龄相关的听力损失：解开碎片。喉镜调查耳鼻喉镜。2018;3:68–72.pmid：29721536
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
8.Ren HM， Ren J， Liu W. 年龄相关性听力损失进展的识别和控制.复兴研究 2013;16：475–486.pmid：23915327
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
9.利伯曼CM，利伯曼LD，Maison SF.传出反馈减缓耳蜗老化。J 神经科学。2014;34:4599–4607.密码：24672005
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
10.噪音引起的和与年龄相关的听力损失：新视角和潜在疗法。F1000Res.2017;6:1–11.密码：28690836
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
11.Stamataki S，Francis HW，Lehar M，May BJ，Ryugo DK.在衰老的C57BL / 6J小鼠中，内毛细胞的突触改变先于螺旋神经节细胞丢失。请听第2006号决议;221：104–118。pmid：17005343
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
12.费尔南德斯 KA， 杰弗斯 XPWC， 拉尔 K， 利伯曼 MC， 库亚瓦 SG. 噪声暴露后的衰老：“恢复”耳朵中耳蜗突触病的加速。J 神经科学。2015;35:7509–7520.pmid：25972177
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
13.Boero LE， Castagna VC， Terreros G， Moglie MJ， Silva S， Maass J， et al.预防小鼠老年性耳聋，增强内侧少耳蜗反馈。美国国家科学院院刊，2020;117：11811–11819。密码：32393641
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
14.迪奇·中枢神经系统：胆固醇更新，大脑发育和神经变性。生物化学 2009;390：287–293.pmid：19166320
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
15.Egawa J，Pearn ML，Lemkuil BP，Patel PM，Head BP.膜脂筏和神经生物学：膜脂质的年龄相关变化和神经元功能的丧失。生理学杂志. 2016;594：4565.密码：26332795
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
16.Bj?rkhem I.跨越屏障：氧甾醇作为大脑中的胆固醇转运蛋白和代谢调节剂。J 实习医学 2006;260：493–508.邮编：17116000
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
17.Pfrieger FW，Ungerer N.神经元和星形胶质细胞中的胆固醇代谢。Prog Lipid Res. 2011;50：357–371.密码：21741992
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
18.马丁，普弗里格，多蒂。脑部疾病中的胆固醇：有时是决定性的，经常与脑部疾病有关。EMBO Rep. 2014;15：1036–1052.密码：25223281
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
19.马丁·MG， 艾哈迈德 T， 科罗瓦伊丘克 A， 韦内罗 C， 门琼 SA， 萨拉斯一世， 等.组成型海马胆固醇丢失是老年啮齿动物认知不良的基础。EMBO Mol Med. 2014;6：902–917.密码：24878762
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
20.脑胆固醇代谢及其缺陷：与神经退行性疾病和突触功能障碍的联系。自然学报.2016;8(1):58–73.pmid：27099785
View ArticlePubMed/NCBIGoogle Scholar
21.S?derberg M，Edlund C，Kristensson K，Dallner G.衰老过程中人脑不同区域的脂质组成。J 神经化学。1990;54:415–423.密码：2299344
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
22.索德罗，魏斯曼C，莱德斯马医学博士，多蒂CG。来自兴奋性神经传递的细胞应激导致体外衰老的海马神经元胆固醇损失。神经生物学衰老。2011;32:1043–1053.密码：20663588
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
23.莱德斯马医学博士，马丁MG，多蒂CG。老年大脑中的脂质变化：对突触功能和神经元存活的影响。Prog Lipid Res. 2012;51：23–35.密码：22142854
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
24.马丁 MG， 佩尔加 S， 特罗沃 L， 拉索拉 A， 霍尔姆 P， 兰塔马基 T， 等.胆固醇损失增强了体外衰老海马神经元中的TrkB信号传导。分子生物细胞。2008;19:2101–2112.密码：18287532
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
25.索德罗AO，特罗沃L，伊安尼利F，范维尔霍芬P，多蒂CG，马丁MG。 成熟海马神经元中Cyp46 /胆固醇损失途径调节酪氨酸激酶B活性：与压力和衰老下的神经元存活相关。J 神经化学。2011;116:747–755.密码：21214568
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
26.法贝洛 N， 马丁五世， 马林 R， 桑佩雷 G， 阿苏 E， 费雷尔一世， 等.APP/PS1双转基因小鼠脂筏过早衰老的证据，这是家族性阿尔茨海默病的模型。神经病理学实验神经学杂志. 2012;71：868–881.密码：22975585
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
27.莫兰德-梅林 M， 布伦诺 K， 博格丹诺维奇 N， 戴尔赫登 B， 曼森 JE， 弗雷德曼 P. 发现阿尔茨海默氏症大脑的结构膜改变与区域疾病发展有关;神经节苷脂GM1和GM2的密度增加，抗洗涤剂膜结构域中胆固醇的损失增加。J 神经化学。2005;92:171–182.密码：15606906
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
28.Mulder M， Ravid R， De Kloet JER， Haasdijk ED， Julk J， Van Der Boom J， et al.阿尔茨海默病患者脑脊液中胆固醇、磷脂和脂肪酸水平降低与载脂蛋白E4无关。阿尔茨海默病协会不合时宜。1998;12:198–203.密码：9772023
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
29.Svennerholm L，Bostr?m K，Jungbjer B，Olsson L.成人脑的膜脂质：20至100岁受试者额叶和颞叶的脂质组成。J 神经化学。1994;63:1802–1811.密码：7931336
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
30.Svennerholm L，Bostr?m K，Helander CG，Jungbjer B.老化人脑中的膜脂质。J 神经化学。1991;56:2051–2059.密码：2027013
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
31.Svennerholm L，Bostr?m K，Jungbjer B.瑞典成年人类生命期间人脑主要膜成分的重量和组成的变化。神经病理学学报。1997;94:345–352.密码：9341935
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
32.Thelen KM，Falkai P，Bayer TA，Lütjohann D.人类海马体中的胆固醇合成率随着年龄的增长而下降。神经科学杂志 2006;403：15–19.密码：16701946
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
33.梅森RP，鞋匠WJ，Shajenko L，钱伯斯TE，赫贝特LG。 胆固醇介导的阿尔茨海默病脑皮质膜结构变化的证据。神经生物学衰老。1992;13:413–419.pmid：1625771
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
34.Roher AE， Weiss N， Kokjohn TA， Kuo Y-M， Kalback W， Anthony J， et al. 增加A肽并降低胆固醇和髓磷脂蛋白表征阿尔茨海默病的白质变性。2002;41(37):11080–11090.pmid：12220172
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
35.Ohyama Y， Meaney S， Heverin M， Ekstr?m L， Brafman A， Shafir M， et al.胆固醇24-羟化酶（CYP46A1）转录调控的研究：对不同的调控轴明显不敏感。生物学杂志 2006;281：3810–3820.pmid：16321981
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
36.隆德EG，吉莱亚多JM，罗素DW。胆固醇24-羟化酶的cDNA克隆，胆固醇1999-羟化酶是大脑中胆固醇稳态的介质。美国国家科学院院刊，96;7238：7243–10377398.密码：<>
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
37.Moutinho M，Nunes MJ，Rodrigues E.胆固醇24-羟化酶：脑胆固醇代谢等。生物化学生物物理学报.2016;1861:1911–1920.密码：27663182
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
38.拉米雷斯DMO，安德森S，拉塞尔DW。小鼠大脑中胆固醇24-羟化酶的神经元表达和亚细胞定位。Comp Neurol. 2008;507：1676–1693.密码：18241055
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
39.Palomer E， Martín-Segura A， Baliyan S， Ahmed T， Balschun D， Venero C， et al. 衰老触发海马神经元中 Bdnf 启动子的抑制性染色质状态。细胞代表 2016;16：2889–2900.pmid：27626660
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
40.瓦伦扎 M， 陈 JY， 迪保罗 E， 若兹 B， 贝莱蒂 D， 法拉利巴迪尔 C， 等.负载胆固醇的纳米颗粒改善亨廷顿舞蹈症小鼠的突触和认知功能。EMBO Mol Med. 2015;7：1547–1564.密码：26589247
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
41.阿什莫尔 J. 耳蜗外毛细胞运动。生理学修订版 2008;88：173–210.pmid：18195086
View ArticlePubMed/NCBIGoogle Scholar
42.Brownell WE， Bader CR， Bertrand D Y de R， de Ribaupierre Y. 孤立的耳蜗外毛细胞的机械反应。科学（80-）。1985;227: 194–196.密码：3966153
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
43.Dallos P. 耳蜗扩增，外毛细胞和前置。Curr Opin Neurobiol.2008;18:370–376.密码：18809494
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
44.Forge A.哺乳动物耳蜗外毛细胞侧壁的结构特征。细胞组织研究 1991;265：473–483.密码：1786594
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
45.拉贾戈帕兰 L， 格雷森 JN， 夏 A， 刘 H， 斯特姆 A， 拉斐尔 RM， 等.通过膜胆固醇调节外毛细胞运动。生物学杂志 2007;282：36659–36670.密码：17933870
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
46.阮卫视、布劳内尔·膜胆固醇对外毛细胞侧壁硬度的贡献。耳鼻喉头颈外科 1998;119：14–20.pmid：9674509
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
47.斯方杜里斯 J， 拉贾戈帕兰 L， 佩雷拉 FA， 布朗内尔 WE.膜组合物调节与前置相关的电荷运动。生物学杂志 2008;283：22473–22481.pmid：18567583
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
48.Malgrange B， Varela-nieto I， de Medina P， Paillasse MR， Neuroscience A， Malgrange B， et al.针对胆固醇稳态以对抗听力损失：一个新的视角。前衰老神经科学。2015;7:1–7.密码：25688206
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
49.桅杆N，李Y，林格M，克拉克M，怀斯曼J，皮库列娃IA。细胞色素P450 46A1的药理学刺激和小鼠脑胆固醇周转。生物学杂志 2014;289：3529–3538.密码：24352658
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
50.Mitroi DN， Pereyra-Gómez G， Soto-Huelin B， Senovilla F， Kobayashi T， Esteban JA， et al. NPC1在长期增强过程中能够动员胆固醇，这种增强可以通过CYP46A1激活在尼曼-匹克病C型中恢复。EMBO 代表 2019;20（11）：e48143.密码：31535451
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
51.隆德EG，谢C，科蒂T，特利SD，迪奇JM，拉塞尔DW。敲除小鼠胆固醇24-羟化酶基因揭示了胆固醇周转的大脑特异性机制。生物学杂志 2003;278：22980–22988.pmid：12686551
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
52.C57 / b16小鼠听力的发展和退化：圆窗和耳蜗核的电生理反应与耳蜗解剖结构和行为反应的关系。喉镜。1979;89:1–15.pmid：423642
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
53.亨利·实验室小鼠年龄相关听力损失的行为，生理和解剖学表达的基因型差异：原始论文Travaux originaux。听觉学。1980;19:369–383.密码：7436856
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
54.Spongr 副总裁，洪水总局，弗里西纳路，萨尔维 RJ。CBA和C57BL / 6小鼠整个生命周期中毛细胞损失的定量测量。J Acoust Soc Am. 1997;101：3546–3553.pmid：9193043
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
55.刘华， 陈林， 吉芬KP， 斯特林汉姆， 李彦， 贾奇PD， 等. 细胞特异性转录组分析表明，成体支柱细胞和Deiters细胞表达编码耳蜗毛细胞特化的机制的基因。前摩尔神经科学。2018;11:1–17.密码：30327589
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
56.染谷 S， 徐 J， 近藤 K， 丁 D， 萨尔维 RJ， 山荞麦 T， 等.C57BL / 6J小鼠的年龄相关性听力损失由Bak依赖性线粒体凋亡介导。美国国家科学院院刊，2009;106：19432–19437。pmid：19901338
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
57.远场声学响应：猫的起源。科学（80-）。1975;189: 382–384.pmid：1145206
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
58.Shera CA， Guinan JJ Jr. 诱发耳声发射由两种根本不同的机制产生：哺乳动物OAE的分类法。J Acoust Soc Am. 1999;105：782–798.pmid：9972564
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
59.罗伯斯 L， 鲁格罗马.哺乳动物耳蜗的力学。生理学修订版 2001;81：1305–1352.密码：11427697
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
60.Trautwein EA，Demonty I.植物甾醇：具有既定和新兴健康益处的天然化合物。华侨城.2007;14:259–266.
查看文章谷歌学术搜索
61.Vanmierlo T， Weing?rtner O， Van Der Pol S， Husche C， Kerksiek A， Friedrichs S， et al.膳食摄入植物甾醇可稳定地增加鼠脑中的植物甾醇水平。J 脂质研究 2012;53：726–735.pmid：22279184
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
62.佩雷斯-卡纳马斯 A， 萨罗卡 S， 梅莱罗-赫雷斯 C， 波奎特 D， 珊莎 J， 克纳福 S， 等.富含植物甾醇的饮食可防止衰老加速小鼠胆固醇损失引起的记忆障碍。神经生物学衰老。2016;48:1–12.密码：27622776
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
63.Boutté Y， Men S， Grebe M. 拟南芥根中甾醇的荧光原位可视化。纳特·普罗托克。2011;6:446–456.密码：21412273
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
64.Dallos P，Evans BN，Hallworth R.耳蜗外毛细胞电动形状变化中运动元件的性质。自然界。1991;350:155–157.密码：2005965
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
65.卡利内克 F， 霍利 MC， 岩沙 KH， 林 DJ， 卡查尔 B.听觉感觉细胞中基于膜的力产生机制。美国国家科学院院刊，1992;89：8671–8675.pmid：1528879
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
66.霍尔沃斯 R， 埃文斯 BN， 达洛斯 P.豚鼠外毛细胞中电动的位置和机制。J 神经生理学。1993;70:549–558.密码：8410156
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
67.盖尔·人工耳蜗放大器的固有频率限制。自然界。1997;389:63–66.密码：9288966
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
68.Brownell WE， Jacob S， Hakizimana P， Ulfendahl M， Fridberger A. 膜胆固醇调节耳蜗机电。Pflugers Arch Eur J Physiol. 2011;461：677–686.密码：21373862
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
69.Avan P，Büki B，Petit C.听觉失真：起源和功能。生理学修订版 2013;93：1563–1619.密码：24137017
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
70.布劳内尔·外毛细胞电动和耳声发射。耳听。1990;11:82.密码：2187727
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
71.Oliver D， Lien CC， Soom M， Baukrowitz T， Jonas P， Fakler B. 膜脂质在A型和延迟整流器K +通道之间的功能转换。科学（80-）。2004;304: 265–270.密码：15031437
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
72.珀塞尔 EK， 刘 L， 托马斯 PV， 邓肯 RK.胆固醇影响听觉毛细胞中的电压门控钙通道和BK型钾通道。公共图书馆一号。2011;6（10）：e26289.密码：22046269
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
73.琼斯OT，尤班克斯JH，欧内斯特JP，麦克纳米MG。需要最少数量的脂质来支持烟碱乙酰胆碱受体的功能特性。生物化学。1988;27:3733–3742.pmid：3408723
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
74.拉达克里希南 A， 太阳 LP， 权 HJ， 布朗 MS， 戈德斯坦 JL.胆固醇与SCAP纯化的膜区域的直接结合：甾醇传感结构域的机制。摩尔细胞。2004;15:259–268.pmid：15260976
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
75.Hughes L，Turner J，Parrish J，Caspary D.年轻和老年大鼠跨A1层的宽带刺激处理。请听第2010号决议;264：79–85。pmid：19772906
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
76.老年耳蜗中的突触病：表征听觉颞包膜处理中的早期神经缺陷。J 神经科学。2018;38:7108–7119.密码：29976623
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
77.卡斯帕里 DM， 凌 L， 特纳 JG， 休斯 LF.哺乳动物中枢听觉系统中的抑制性神经传递，可塑性和衰老。实验生物学杂志. 2008;211：1781–1791.pmid：18490394
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
78.Cruickshanks KJ， Wiley TL， Tweed TS， Klein BEK， Klein R， Mares-Perlman JA， et al.威斯康星州海狸坝老年人听力损失的患病率。听力损失的流行病学研究。Am J Epidemiol。1998;148:879–886.pmid：9801018
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
79.费蒂普拉斯 R， 南建.钙稳态中的肌腱和耳蜗毛细胞的脆弱性。请听第2019号决议;376：11–21。密码：30473131
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
80.刘海， 吉芬， 陈玲， 亨德森， 曹塔， 科泽尼， 等.小鼠耳蜗内外毛细胞生物衰老的分子和细胞学分析。细胞代表 2022;39（2）：110665.pmid：35417713
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
81.Lohmann C，Friauf E.钙结合蛋白小白蛋白和钙视黄蛋白在成年和发育中的大鼠听觉脑干中的分布。神经学杂志， 1996;367：90–109.密码：8867285
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
82.Vishnyakova PA，Moiseev KY，Spirichev AA，Emanuilov AI，Nozdrachev AD，Masliukov PM。 衰老过程中钙结合素和钙视黄蛋白在背侧和腹内侧下丘脑核中的表达。Anat Rec. 2021;304：1094–1104.pmid：33040447
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
83.安建华， 洪淑， 朴建华， 金世， 赵振华， 李东昌， 等.正常衰老过程中啮齿动物体感皮层中钙结合素-D28k、钙视黄素和细小白蛋白的免疫反应性。Mol Med Rep. 2017;16：7191–7198.密码：28944879
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
84.Elliott KL，Fritzsch B，Yamoah EN，Zine A.年龄相关性听力损失：感觉和神经病因及其相互依赖性。前衰老神经科学。2022;14:1–16.密码：35250542
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
85.Idrizbegovic E，Bogdanovic N，Viberg A，Canlon B.听觉外周对C57BL / 6J小鼠衰老过程中耳蜗核中钙结合蛋白免疫反应性的影响。请听Res. 2003;179：33–42。密码：12742236
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
86.卡斯帕里 DM，拉诺 DA。皮层下听觉系统的衰老过程。牛津汉德布审计脑干。2018:639–679.
查看文章谷歌学术搜索
87.吴廷 P， 卡利内克 总经理， 帕克 C， 卡利内克 F.抗逆转录病毒药物的体外评估显示可能存在耳毒性。2014;310:27–35.密码：24487230
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
88.Khoza-Shangase K.高效抗逆转录病毒疗法：听起来有毒吗？医药生物联盟学报 2011;3（1）：142–153.密码：21430965
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
89.Bektas D，Martin GK，Stagner BB，Lonsbury-Martin BL.用抗逆转录病毒药物治疗的小鼠的噪音诱导听力损失。请听Res. 2008;239：69–78。密码：18384985
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
90.辛德林 J， 阿甘达-卡雷拉斯一世， 弗里斯 E， 凯尼格五世， 朗格尔 M， 皮耶奇 T， 等.斐济：生物图像分析的开源平台。纳特方法。2012;9:676–682.密码：22743772
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
91.R 核心团队。R：统计计算的语言和环境。奥地利维也纳：R统计计算基金会;2020. 可用： https://www.r-project.org/