免费医学论文发表-敲低抗性突变常见且广泛分布于在马达加斯加传播鼠疫的爪蟾跳蚤中
抽象
背景
由鼠疫耶尔森菌引起的鼠疫仍然是马达加斯加的一种重要疾病，东方鼠蚤Xenopsylla cheopis是主要媒介。为了控制跳蚤，合成拟除虫菊酯（SP）已经使用了>20年，导致许多X具有抗性。鲤鱼种群。SP抵抗的最常见机制是电压门控钠通道（VGSC）基因中的靶位点突变。
方法/主要发现
我们获得了 25 个 X 集合。来自马达加斯加22个地点的Cheopis进行了表型测试，以确定对溴氰菊酯，氯菊酯和/或二氯二苯基三氯乙烷（DDT）的抗性。大多数种群对所有这些杀虫剂都有抗药性。我们对VGSC基因的535 bp片段进行了测序，并在氨基酸位置1014处发现了编码不同取代的两个不同突变，这与昆虫对SP的敲低抗性（kdr）有关。Kdr突变L1014F发生在所有25个集合中;在1014个集合中发现了一个罕见的突变L12H。kdr等位基因的频率与暴露于溴氰菊酯存活的个体比例之间存在显着的正相关关系。马达加斯加12个VGSC等位基因的系统发育比较表明，抗性等位基因至少三次来自易感谱系。由于基因型可以合理地预测耐药表型，我们开发了一种TaqMan PCR检测方法，用于快速检测kdr抗性等位基因。
结论/意义
我们的研究为马达加斯加X人群中的VGSC突变提供了新的见解。Cheopis，并且是第一个报告跳蚤中VGSC基因型与SP抗性表型之间存在正相关关系的人。这两种SP抗性突变在X中广泛发生。马达加斯加的Cheopis种群降低了这些杀虫剂控制跳蚤的活力。然而，这里描述的TaqMan测定有助于快速检测kdr突变，以告知何时仍有必要使用这些杀虫剂以减少鼠疫的传播。
作者摘要
在马达加斯加，东方鼠跳蚤Xenopsylla cheopis是引起鼠疫耶尔森菌的主要载体。据报道，这种跳蚤对用于病媒控制的杀虫剂具有抗药性。本研究的目的是检查X中电压门控钠通道（VGSC）基因的靶位点突变。在整个岛上采样的Cheopis种群，并先前测试了合成拟除虫菊酯（SP）的敏感性。鉴定出与SP的敲低抗性（kdr）相关的两个广泛突变，并揭示了kdr等位基因的频率与SP抗性表型之间的显着关系。这些结果引起了人们对SPs通过X控制鼠疫耶尔森菌传播的总体疗效的担忧。马达加斯加的芷薇。
数字
Table 4Fig 4Fig 5Fig 1Table 1Table 2Fig 2Table 3Fig 3Table 4Fig 4Fig 5Fig 1Table 1Table 2
引文： 赫顿 SM， 米亚林加拉 A， 斯通 NE， 拉哈里马拉拉 FN， 拉韦洛森 AO， 拉科托比哈里马纳纳 R， 等. （2023） 敲低抗性突变很常见，广泛分布在马达加斯加传播鼠疫的爪蟾跳蚤中。PLoS Negl Trop Dis 17（8）： e0011401. https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0011401
编辑 器： 让-菲利普·戴维，法国国家科学研究中心：法国国家科学研究中心
收到： 十月 27， 2022;接受： 22月 2023， 22;发表： 2023月 <>， <>
这是一篇开放获取的文章，没有任何版权，任何人都可以出于任何合法目的自由复制、分发、传输、修改、建立或以其他方式使用。该作品在知识共享CC0公有领域奉献下提供。
数据可用性： 所有相关数据都在手稿及其支持信息文件中。
资金： 这项研究得到了马达加斯加巴斯德研究所的资助。这项工作还得到了儿童基金会/开发计划署/世界银行/世卫组织热带病研究和培训特别方案的财政支助：TDR ID号。B80105 到 RG，北亚利桑那大学的胡珀本科生研究补助金授予 S.M.H. 在瑞士驻塔那那利佛大使馆资助的啮齿动物控制运动期间从监狱收集跳蚤（参考编号 771.22.00-1-MAE/RML） 给 M.R.资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。
竞争利益： 提交人声明不存在相互竞争的利益。
介绍
鼠疫是一种由鼠疫耶尔森菌引起的人畜共患疾病，是人类历史上最重要的疾病之一，估计在三次大流行期间已造成数亿人死亡[1]。尽管鼠疫对人类很重要，但它主要是一种啮齿动物疾病，通过跳蚤媒介在啮齿动物种群内自然循环[2]。大多数人类病例是腺鼠疫，是通过受感染的跳蚤叮咬获得的。如果不进行治疗，腺鼠疫可进展为更致命的败血性和/或肺鼠疫[3]。肺鼠疫尤其危险，因为如果不及早治疗，其致死率很高，并且可通过呼吸道飞沫在人与人之间传播[4，5]。第三次鼠疫大流行始于1800年代中期，导致全球范围内新的鼠疫疫源地的建立，特别是在亚洲、美洲和非洲，包括马达加斯加[6]。目前，马达加斯加每年报告的全球人类鼠疫病例占大多数[7]。
鼠疫在1800年代后期被引入马达加斯加的图阿马西纳港，可能是通过来自印度的汽船[8，9];随后在海港城市定期引入和爆发。1921年，鼠疫在高地建立，随后从海岸消失，除了港口城市马哈赞加[10]和最近的图阿马西纳[11]定期爆发。地方性跳蚤媒介Synopsyllus fonquerniei被认为在维持环境中的鼠疫方面起着重要作用，因为它和人类鼠疫病例主要局限于海拔800米或更高的地区。虽然S.fonquerniei被发现在环境中的啮齿动物X上。Cheopis在人类住宅内感染黑鼠（Rattus rattus），因此是马达加斯加将细菌传播给人类的主要鼠疫媒介[12]。由于目前没有有效和安全的鼠疫疫苗，杀虫剂以及病例的抗微生物治疗和接触者的化学预防，是应对和预防人类鼠疫疫情的最重要工具。
马达加斯加第一种用于鼠疫控制的杀虫剂是二氯二苯三氯乙烷（DDT），从1947年开始作为粉末在家庭中使用[13，14]。从1960年代开始，在许多鼠疫流行地区开始出现耐滴滴涕跳蚤的描述[15]。尽管如此，滴滴涕一直使用到1980年代末，当时用于鼠疫控制的官方杀虫剂改用溴氰菊酯，这是一种在世界范围内用于昆虫控制的合成拟除虫菊酯（SP）[16]。与滴滴涕类似，几十年来连续使用溴氰菊酯导致X对这种杀虫剂的抗药性水平不断提高。切皮斯。最近的研究表明，一些X.在马达加斯加，Cheopis种群对多种杀虫剂（包括DDT、溴氰菊酯和其他SPs）具有耐药性，这表明杀虫剂耐药性对马达加斯加跳蚤媒介化学控制的长期疗效构成威胁[17，18]。
对SP的耐药性通常是由节肢动物中电压门控钠通道（VGSC）基因的基因突变引起的。该基因编码VGSC蛋白，该蛋白负责传播动作电位并沿神经轴突传递神经冲动。当拟除虫菊酯化合物与该通道结合时，会导致长时间的开放并破坏神经功能，导致瘫痪和死亡[19]。然而，VGSC基因中的点突变可以改变蛋白质中的氨基酸并降低杀虫剂的结合效率。这种类型的抗性被称为敲低抗性（kdr），其特征是不同程度地对所有类型的拟除虫菊酯不敏感[19，20]。由于VGSC基因突变威胁到SP用于害虫和病媒控制，因此在许多节肢动物物种中都有报道[21]。一些最常报告的耐药突变位点出现在结构域II片段4-6段，该片段包含拟除虫菊酯的重要结合位点[22，23]。
尽管VGSC基因的突变在许多昆虫物种中已经得到了很好的表征，但对这些突变与跳蚤对SP的抗性之间的关系知之甚少。了解可能导致X染色体SP耐药性的遗传机制。Cheopis对于评估这种杀虫剂在马达加斯加病媒控制的有效性非常重要。以前的研究已经报道在X的VGSC基因中发现了kdr突变。乌干达[24]和中国[25]均出现Cheopis，提示SP耐药的可能机制。我们的研究首次描述了马达加斯加的VGSC突变，并研究了X的基因型-表型关系。切皮斯。
方法
道德声明
这项研究是根据欧洲议会（https://eur-lex.europa.eu/Lex%2010UriServ/LexUriServ.do?uri=OJ%63AL%20A3%3A2010%3A276%3A0033%3AEN%0079APDF）关于保护用于科学目的的动物的指令3/3 / EU进行的。此外，马达加斯加巴斯德研究所动物伦理委员会批准了涉及现场和实验动物处理的协议（第 425/2021/IPM/DS/CEA 号信函）。
跳蚤采集和表型检测
在针对马达加斯加报告的鼠疫病例/聚集性病例进行的现场调查中或在2002年至2020年的被动动物监测工作中，从活的黑鼠和其他小型哺乳动物身上收集了跳蚤。我们选择了 25 X 的子集。来自22个地点的Cheopis收集用于该遗传研究（图1和表1）。小型哺乳动物被困在金属丝网和谢尔曼陷阱中，通过颈椎脱位实施安乐死，并梳理跳蚤，然后将其活体运送到马达加斯加巴斯德研究所（IPM）昆虫馆。跳蚤在形态上被鉴定为X。在特定实验室条件下饲养Cheopis，直到收集物达到足够的杀虫剂生物测定数量（表1）。在大多数情况下，来自田间收集的跳蚤不会立即进行测试，而是用于建立经过后代测试的实验室菌落。啮齿动物诱捕、跳蚤采集和饲养方法的全部细节已在前面描述[16]。本研究的所有实验室菌落均未在杀虫剂选择压力下维持;因此，从SP杀虫剂中选择的任何选择都发生在自由生活的跳蚤种群中。杀虫剂生物测定按照世界卫生组织（WHO）跳蚤方案修改的方案进行[18]，并在别处描述[16]。简而言之，将一组十只跳蚤和一条浸有工业级杀虫剂（1.5 x 6厘米，马来西亚槟城媒介控制研究单位）的纸条放入一个管中。每次测试至少重复四次，每次杀虫剂生物测定至少40只跳蚤。阴性对照由两管十只跳蚤组成，每管暴露在干净的滤纸中。死亡率以不同的时间间隔记录在测试表上，持续八小时。无法站立的跳蚤被认为是死亡或“被击倒”的。暴露24小时后，用干净的滤纸代替杀虫剂处理的纸，并将跳蚤在25°C和高于75%相对湿度的管中保存24小时。98小时后，记录活跳蚤和死跳蚤的数量。≥ 80% 的死亡率表明易感性。98%-80%的死亡率提示耐受或疑似耐药，<16%提示耐药[1]。对于每个集合，表70列出了测试活性成分的名称，其各自的浓度和获得的最终死亡率。测试后，跳蚤保存在<>%乙醇中。
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图1. 马达加斯加的非洲爪蟾跳蚤采样点。
带有指定收集编号的采样位置用彩色圆圈表示。颜色对应于在该位置收集的部分或全部跳蚤中存在的特定kdr突变;突变L1014H仅在也存在突变L1014F的位置发现。具有多个收集编号的采样点表示在同一地点但在不同年份进行的收集。海拔≥ 800 米的区域用灰色阴影表示;马达加斯加的鼠疫流行地区大多局限于这些较高的海拔地区。这张地图是由R团队使用R Studio软件创建的[26]。用于创建此地图的数据来自 GADM （https://gadm.org/data.html）。
https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0011401.g001
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表 1. 所有 25 个跳蚤收集的收集位置、测序的跳蚤数量以及相关的生物测定和遗传结果。
https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0011401.t001
研究X中对SPs的抵抗力的VGSC机制。Cheopis，我们纳入了来自1）马达加斯加地理上不同的地点，代表14个具有不同生物气候条件的地区，2）首都塔那那利佛的城市社区，以及3）监狱（图1）。我们的研究主要集中在测试对溴氰菊酯具有抗性的跳蚤上，因为自1990年代以来，它一直是马达加斯加跳蚤控制的首选杀虫剂。对于三个系列（9、23和25），我们还纳入了对另外两种杀虫剂（氯菊酯和/或滴滴涕）具有抗性的跳蚤测试。此外，对于其他三个集合（1，14和24），我们纳入了在不同时间点（因此来自不同世代）冷冻的跳蚤，以研究在没有杀虫剂选择压力的情况下实验室菌落中kdr频率随时间的变化。地图是在R版本1.4.1106中生成的[26]，使用以下软件包：ggplot2，maptools，raster，rgdal，sp，rgeos，ggsn（图1）。高程数据由亚马逊云科技地形图块提供，并通过包 elevatr（缩放级别 7）访问。
分子方法
总共从1，395 X中提取了DNA。来自马达加斯加的Cheopis跳蚤使用DNeasy血液和组织（Qiagen，Hilden，德国）和Nucleospin DNA RapidLyse（Macherey-Nagel，Düren，德国）试剂盒。确定X中VGSC结构域II片段4-6（S4-S6）的核苷酸序列。Cheopis fleas，我们从GenBank创建了公开可用的mRNA和DNA序列的多物种基因比对，以促进正向引物的设计（S1图）。基于这种比对，我们根据家养麝香VGSC蛋白（GenBank加入AAB905.911）的编号，设计并测试了位于编码结构域II片段4残基47604-1的区域的几种新的正向引物。我们还修改了先前设计的反向引物[24]，该引物编码残基1032-1038，将其向上游延伸四个核苷酸以提高特异性。我们使用传统的Sanger测序方法对编码VGSC蛋白结构域II S4-S6的基因片段进行了测序。使用正向引物DIIS4F4和反向引物A1ExtR扩增靶标，扩增子长度为535 bp（表2）。
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表 2. 引物和探针序列，用于扩增和测序编码VGSC结构域II S4-S6的基因部分。
https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0011401.t002
聚合酶链反应 （PCR） 以 10 μL 体积进行，含有 2 μL DNA 模板、5.14 μL 超纯 DNase/RNase 无核糖核酸蒸馏水（Invitrogen）和以下试剂（以最终浓度给出）：1 X PCR 缓冲液、2.5 mM MgCl2、0.2 mM dNTP、0.08 U 铂 Taq 聚合酶（Invitrogen，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德）和 0.4 μM 每种引物。根据以下热循环仪条件扩增靶标：96°C扩增5分钟，然后进行40次循环，95°C持续30秒，60°C持续45秒，72°C持续30秒，最后延伸步骤为72°C，持续5分钟。然后用ExoSAP-IT（Affymetrix，加利福尼亚州圣克拉拉，美国）处理PCR产物，在以下条件下，每1μL PCR产物使用7μLExoSAP-IT消化未使用的引物和dNTP：37°C15分钟，然后80°C15分钟。然后将处理过的产物稀释至1/30（或更低，根据琼脂糖凝胶上的条带强度），并使用相同的PCR引物在单独的正向和反向Sanger测序反应中与BigDye Terminator v3.1预处理反应混合物（应用生物系统，美国加利福尼亚州福斯特城）进行双向测序。我们使用 10 μL 体积进行含有 5 μL 稀释 PCR 产物和以下试剂（以最终浓度给出）的反应：1 X 测序缓冲液、1 mM BigDye 终止剂 v3.1 预处理混合物和 1 μM 引物。使用以下热循环仪条件：96°C 20秒，然后 30 次循环，96°C 持续 10 秒，50°C 持续 5 秒，60°C 持续 4 分钟。
Sanger测序反应在16毛细管AB3130xl自动测序仪上运行（应用生物系统，美国加利福尼亚州福斯特城）。使用来自Lasergene软件包（DNASTAR，麦迪逊，WI）的SeqMan Pro将每个跳蚤的正向和反向序列对齐成一个重叠群，并且目视检查每个序列电泳图以确保数据质量。如果两个核苷酸峰在电泳图中占据相同的碱基位置并且具有大致相同的峰高度，则称为杂合位置。如果其中一个可能的碱基信号不足，则将其标记为可能的污染，并将跳蚤排除在进一步分析之外。由于污染，只有十个样品需要移除。仅在一个个体中发现的任何单核苷酸多态性（SNP）通过第二次扩增和测序VGSC基因区域来确认。如结果部分所述，我们在结构域II中残基1014的第一和第二密码子位置发现了两个非同义SNP，它们都编码不同的氨基酸（L1014F和L1014H）。我们通过T载体克隆和来自18个个体克隆的PCR扩增子测序验证了四个个体子集的等位基因序列。
许多跳蚤在乙醇中储存了很长时间，导致DNA降解。为了恢复这些样品的序列，我们设计了一种内部引物（IF1），该引物扩增了一个182 bp片段，当与反向引物A1ExtR（表2）配对时，该片段仍覆盖kdr位置。我们使用引物IF1和A1ExtR治疗314只跳蚤，这些跳蚤在完整的535 bp测定中未能扩增，并且能够回收120（38%）。PCR使用与上述相同的所有条件进行，但退火温度除外，退火温度根据样品的不同在50-60°C之间变化。总的来说，我们无法从194只跳蚤中获得序列。
促进X中kdr突变的快速基因分型。cheopis，我们开发了一种TaqMan实时测定法，以区分我们在密码子位置1014（L1014F / H）发现的所有三种可能的等位基因状态。我们利用上述1 bp扩增子的引物IF1和A182ExtR，并使用Primer Express v2.3软件（应用生物系统，加利福尼亚州福斯特城）设计了新的TaqMan探针（表0）。PCR在384孔光学板中进行，并以10 μL体积进行，其中含有1 μLDNA模板，0.9 μLUltraPure.DNase/RNase无蒸馏水和以下试剂（以最终浓度给出）：1 X TaqMan环境PCR预混液（应用生物系统），引物和探针，0.35 M 甜菜碱和0.25 U铂Taq聚合酶（Invitrogen）。使用的引物浓度为0.90μM;Probe1_CTT_FAM和Probe3_CAT_NED的终浓度为0.15μM，Probe2_TTT_VIC终浓度为0.30μM。在 QuantStudio 12K Flex 实时荧光定量 PCR 系统（赛默飞世尔科技）上使用以下条件进行热循环：50°C 2 分钟，95°C 10 分钟，然后 45 次循环，95°C 持续 15 秒，60°C 持续 1 分钟。使用已测序的跳蚤（包括1，191 X）验证基因分型呼叫。来自马达加斯加的Cheopis跳蚤以及45 X。来自乌干达的 cheopis 和 51 X。来自美国的Cheopis。探针阈值设置为0.1进行分析，仅当两个探针信号在四个PCR循环（Cts）内超过阈值时才调用杂合子。
统计分析
统计测试在R版本1.4.1106中进行[26]。我们使用普通最小二乘回归（OLS）来检验跳蚤集合中kdr突变的频率与0.05%溴氰菊酯存活频率之间是否存在线性关系。我们使用夏皮罗-威尔克检验评估了模型中残差的正态性，其中包括 kdr 突变对存活率百分比的频率，该检验未能否定残差呈正态分布的原假设 （p = 0.705）。出于这种线性回归的目的，我们仅纳入了用溴氰菊酯处理的具有30个或更多稳健跳蚤序列的集合，以减少由小样本量引起的偏差的可能性，这导致排除了三个集合（7，12和20）。我们还使用 OLS 通过执行存活百分比的平方根变换来拟合指数模型。
系统发育分析
为了评估易感和耐药等位基因的进化历史，我们首先需要鉴定马达加斯加跳蚤中存在的特定VGSC等位基因。为此，我们从纯合序列的已知等位基因开始。大多数杂合子是由我们通过Sanger测序鉴定的已知等位基因的组合引起的。然而，在少数杂合子中，我们需要推断单倍型阶段，因为一个等位基因没有在纯合序列中表示[27]。为了使这个过程尽可能保守，我们推断出解释每个杂合子序列所需的最小数量的SNP。例如，我们假设仅由一个SNP推断出的等位基因与已知等位基因不同的等位基因比需要更多SNP来解释Sanger序列中杂合位置的替代基因更有可能。一旦我们推断出最少数量的SNP和等位基因来解释所有观察到的序列类型，我们就创建了每个可能的等位基因对的矩阵。这些配对代表了我们在X中观察到的所有可能的基因型。Cheopis 数据集。为了确定产生每个观察到的杂合序列的最可能的等位基因组合，我们使用了计算单倍型阶段[27]。该策略依赖于哈代-温伯格原理，即在个体中观察到的两种单倍型的频率彼此独立。因此，观察具有单倍型p和q的杂合子个体的概率可以由（p x q）给出。等位基因的频率是从马达加斯加的所有跳蚤计算的，这些跳蚤具有1）完整的535 bp扩增子的稳健序列数据，以及2）仅由一个等位基因组合解释的序列类型。然后，我们计算了观察每个等位基因组合的概率。
在MEGA X中使用最大简约（MP）方法推断了敏感和耐药等位基因的可能进化史[28]。为了提供更广泛的背景，我们纳入了来自科罗拉多州柯林斯堡美国疾病控制和预防中心的实验室菌落的其他跳蚤，这些跳蚤起源于X。在乌干达（n = 32）和美国马里兰州（n = 51）收集的Cheopis种群。我们重复了前面描述的过程，以测序和确定这些集合中存在的等位基因。我们在最终数据集中使用了所有535个核苷酸位置，其中20个是信息丰富的。MP树是使用子树修剪-重新移植（SPR）算法（参考文献[126]中的第29页）获得的，搜索级别为1，其中初始树是通过随机添加序列（100个重复）获得的。对于与至少50%的引导重复中复制的分区相对应的分支，分支旁边显示了在引导测试中相关分类群聚集在一起的复制树的百分比（10，000个重复）[30]。在MEGA X中进行进化分析[28]。我们使用这些树广泛研究了马达加斯加kdr突变的进化和传播。
结果
表型检测
我们发现X对SP具有很高的抵抗力。在整个马达加斯加采集了蜈蚣种群样本。我们专注于IPM档案中的25个跳蚤收集，这些跳蚤通过生物测定评估了抗性表型，并有足够的样本量（n≥30）可用于遗传分析。其中，22个收集组进行了溴氰菊酯抗性测试，一个集合（9b）还测试了氯菊酯抗性，另外两个集合（23和25）对氯菊酯和滴滴涕进行了抗性测试，总共进行了27项表型试验（表1）。生物测定表明，在测试22.0%溴氰菊酯（05a和1a）的14个集合中，只有两个是易感的（死亡率为98-100%）。其余20个非易感收集的平均跳蚤死亡率为42.6%。根据WHO标准，6组（13例和0例）被认为耐受05.80%溴氰菊酯（死亡率为97-18%），其余80组耐药（死亡率<31%）[53]。对氯菊酯和滴滴涕抗性进行检测的收集结果平均死亡率分别为7.19%和4.<>%。
VGSC突变
与表型结果一致，我们发现kdr突变的频率很高。总的来说，我们从1，191只跳蚤中获得了强大的VGSC序列。在跳蚤的kdr位点发现1014密码子第一个位置的突变导致氨基酸变化（L1014F）[32，33]，在X中发现频率非常高。来自马达加斯加的Cheopis跳蚤（表1）。VGSC序列在很大程度上是保守的;我们在马达加斯加跳蚤的12 bp序列中仅发现了535个单核苷酸多态性（SNP），其中包括三个外显子和两个内含子。内含子（S2图中的小写字母）包含四个SNP（核苷酸位置152，410，412和423），在测序的马达加斯加跳蚤中大约5%中发现，以及仅在一个马达加斯加跳蚤中发现的两个罕见SNP（核苷酸位置402和415）。在核苷酸位置99、231、264和297的外显子中发现的四个同义SNP分别在0.10、0.05、0.01和0.01的总频率下发现（S2图中下划线），并且不改变任何氨基酸。然而，两个外显子SNP（核苷酸在我们的PCR片段中的位置391和392;在完整的Musca家养mRNA序列中的位置3，117 bp–3，118 bp;GenBank Accession KX431043.1）在氨基酸位置1014的密码子的第一和第二位置中是非同义词，并且分别将氨基酸从亮氨酸（L）更改为苯丙氨酸（F）或组氨酸（H）。L1014F突变先前在X中描述过。来自乌干达[24]和中国[25]的Cheopis。据我们所知，我们正在报告X中第二位置SNP（L1014H）的第一个描述。切皮斯。L1014F突变在马达加斯加的总频率（82%）远高于L1014H突变（4%）。L1014F突变在所有25个集合中被发现，代表马达加斯加的14个地区。低频L1014H突变在地理上也很广泛，在八个地区的12个集合中发现（图1）。有趣的是，我们只在也存在L1014F突变的集合中发现了L1014H突变。包含L1014H突变的122个收藏品位于塔那那利佛省，但也在位于Fianarantsoa的一个收藏品和Toamasina的两个收藏品中发现。大多数跳蚤是kdr突变的纯合子，1，191个跳蚤中只有10个（2.<>%）是携带一个kdr等位基因和一个敏感等位基因的杂合子。
基因型和表型的关联
我们发现kdr等位基因的频率与暴露于溴氰菊酯后幸存下来的个体比例之间存在中等相关性（图2，皮尔逊r = 0.53，p = 0.02）。使用简单的线性回归模型，L1014F 和 L1014H 等位基因的频率可显著预测跳蚤存活至 0.05% 溴氰菊酯 （R2= 0.28）。我们没有发现两个kdr突变对存活率的影响之间的显着差异（t = 1.19，p = 0.25），因此我们将L1014F和L1014H的频率合并为一个解释变量，我们随后将其称为kdr频率。在杀虫剂处理之前检测跳蚤收集中这些突变的能力对于为跳蚤控制工作提供信息非常有价值。因此，我们开发了一种TaqMan PCR检测方法，用于快速检测kdr密码子的耐药突变。我们发现，该测定的失败率低于Sanger测序（15%对23%），并且对先前测序的1，174只跳蚤中的1，201只（98%）进行了准确的基因分型。我们进一步调查了两种方法之间基因型不匹配的27只跳蚤，发现12只可能是由测序过程中的污染引起的，17种可能是由PCR错误或污染引起的。对于这<>只跳蚤，从基因组DNA中重新运行TaqMan和/或测序测定导致匹配的基因型。其余十只跳蚤继续产生相互矛盾的结果，可能是由于DNA质量低或基因组DNA的交叉污染，并被排除在进一步分析之外。
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图2. 非洲爪蟾收集中kdr等位基因的频率与跳蚤存活率之间的关系。
A） 使用 1014.1014% 溴氰菊酯（0 个集合）、05.22% 氯菊酯（0 个集合）和 75.4% DDT（0 个集合）的每个群体样本中 L0F/L05H 等位基因的频率与生物测定存活频率（y 轴）之间的关系。B） 仅针对至少 30 个稳健序列（19 个集合）的 0.2% 溴氰菊酯测试的集合，与 A 中呈现的关系相同。根据WHO标准，橙色虚线将易感（2-20%存活率）和耐受性（31-20%存活率）的跳蚤聚集区分开[0]。红色虚线分隔耐受性和抗性（>53%存活率）的跳蚤集合。线性回归分析显示存在显著关系（r = <>.<>，R2= 0.28，p = 0.02）。
https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0011401.g002
VGSC等位基因的系统发育分析
我们总共在马达加斯加的跳蚤中发现了七个已知的VGSC等位基因（1-6，10）和五个推断等位基因（7-9，11-12），其中五个携带L1014F突变，两个携带L1014H突变（表3）。等位基因 1、2、3、6 和 8 与先前报道的 X 的 VGSC 序列相同。来自中国的Cheopis（该研究中分别为单倍型H1-F、H5-L、H2-F、H6-L和H4-L），基于较短的基因片段（369bp）[25]。在马达加斯加鉴定的12个等位基因可以产生66种可能的序列组合，其中一些可以通过不同的等位基因组合在Sanger序列中产生相同的杂合核苷酸位置。在马达加斯加跳蚤中发现的22种序列类型中，有99种可能通过不同的等位基因组合发生。所有具有最高概率的等位基因组合也是最有可能基于单个集合中存在的观察到的等位基因频率。经过验证的真实等位基因的组合频率占总数据集的13%以上，从而为系统发育分析提供了对这些等位基因的高度置信度。此外，我们在乌干达的跳蚤中发现了四个已知的VGSC等位基因（16-17）和四个推断等位基因（20-28），这产生了5种可能的序列组合。观察到的任何序列类型都不可能是通过替代等位基因组合发生的。最后，我们在马里兰州的跳蚤中发现了两个来自马达加斯加的已知VGSC等位基因（等位基因10和3，表<>）。
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表 3. 用于系统发育分析的观察和推断等位基因列表。
https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0011401.t003
图中的树 #1 在 70 棵最简约的树中（图 3）。所有站点的一致性指数为0.58，保留指数为0.78，综合指数为0.46。从这些DNA序列重建的系统发育树显示，12个马达加斯加等位基因聚集成三个主要谱系，每个谱系都包含具有祖先基因型（L1014L）和共同抗kdr基因型（L1014F）的易感等位基因。不太常见的 L1014H 突变仅在马达加斯加谱系 1 中发现。此外，在谱系1中，似乎含有kdr突变的等位基因形成两个不同的簇。从这种系统发育分析中，我们推断抗性等位基因L1014F在马达加斯加至少独立出现三次。L1014H突变是另一个最有可能出现在马达加斯加的独立事件。乌干达等位基因（13-20）主要形成一个独特的谱系，其中三个等位基因属于马达加斯加谱系。两个美国等位基因（5和10）都属于马达加斯加谱系1。
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图3. 来自马达加斯加、乌干达、美国和中国的非洲爪蟾蚤中电压门控钠通道 （VGSC） 等位基因的系统发育分析。
含有 L3L、L1014F 和 L1014H 基因型的等位基因（表 1014）分别以蓝色、橙色和绿色显示。分支标签对应于基于 10，000 次重复的引导值;不显示小于 0.50 的值。该树植根于包含乌干达等位基因 14、17、18、19 和 20 的谱系。序列China_H7-L_MN103334和China_H3-L_MN103330分别从NCBI Genbank条目中提取，入藏号分别为MN103334.1和MN103330.1（21）。
https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0011401.g003
KDR突变的潜在适应度成本
为了更好地了解kdr等位基因可能携带健身成本的可能性，我们比较了收集后两个时间点来自三个跳蚤菌落（1，14和24）的跳蚤。在收集后11年，集合1的L1014F频率为0.67，然后在18年后（收集后14年）下降到零。收集1014的L0F频率在收集两年后为75.0，在收集后07年下降到24.1014。收集1014的L0F和L83H频率在收集一个月后分别为0.11和1014.1。采集八年后，L00F频率增加并固定在1014.4，而L<>H和易感基因型在第二个时间点均降至零（表<>）。我们强调，这些实验室菌落都没有在IPM昆虫馆的杀虫剂选择压力下得到维持。
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表 4. 尽管没有溴氰菊酯的选择压力，但三个非洲爪蟾实验室菌落中 kdr 等位基因状态的频率随时间而变化。
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讨论
溴氰菊酯耐药性在 X 中广泛存在。来自马达加斯加的Cheopis种群。根据WHO确定的标准，本研究中使用的溴氰菊酯检测跳蚤中约有78%被认为耐药[31]。这些耐药跳蚤是在14个地区和18年中收集的，这表明马达加斯加对SP的耐药性很广泛，并且至少在过去二十年中一直存在。这些数据得到了先前关于跳蚤对溴氰菊酯耐药性的报道的支持，该报道于1996年首次报道[34]。最近的研究发现，在马达加斯加各地收集的被测跳蚤种群中，80%-100%对溴氰菊酯具有中度至高度耐药性，这是跳蚤控制工作的关键问题[14，16]。
敲低突变在X中以高频存在。在马达加斯加各地收集的Cheopis。在溴氰菊酯测试的集合中，kdr突变的平均频率为0.83。我们的结果发现，基于每个集合的生物测定结果，kdr抗性基因型的频率与群体对溴氰菊酯的表型耐药水平之间存在正线性关系（图2，r = 0.53，p = 0.02）。对其他昆虫的研究也报道了SP抗性与kdr等位基因频率之间的关联[35-37]。Jamroz等人（1998）发现，在实验室中每周接受氯氟氰菊酯治疗的超耐药角蝇种群的kdr等位基因频率为0.98，而耐药性和易感性较低的种群的kdr等位基因频率分别为0.66和0.00[38]。冈比亚按蚊kdr突变的频率与溴氰菊酯、氯菊酯和DDT的耐药性显著相关[39]。在A中也观察到kdr等位基因的增加。冈比亚启动室内滞留喷洒（IRS）计划后。最初在50%的纳入蚊子中发现了kdr突变，这解释了SPs最初未能减少蚊子数量的原因[40]。需要注意的是，kdr等位基因频率不必特别大，也不一定会导致矢量控制程序失败。
尽管我们发现跳蚤种群对溴氰菊酯暴露的存活率与kdr突变的频率之间存在很强的关联，但该变量仅解释了生物测定数据中观察到的约28%的变异，并且这种变异性有几种可能的解释。首先，代谢解毒是许多昆虫物种SP抗性的另一种重要替代机制，这可能使易感和耐药基因型的存活率超过回归线的预期水平。在蚊子中，VGSC突变的频率和谷胱甘肽S-转移酶的活性有助于对SP的耐药性[41]。此外，X.从乌干达有IRS病史的地方收集的Cheopis的α-酯酶和β-酯酶表达水平显著高于从没有IRS病史的地方采集的跳蚤[24]。这表明这些酶的表达增加也可能在增强昆虫对杀虫剂的耐受性中发挥作用，并且可以使用包括增效剂在内的生物测定在马达加斯加人群中研究这种机制，以增强活性成分的作用。其次，尚未测序的VGSC基因中的其他突变可能在SP抗性中起作用，但这些突变在X中仍未描述。来自马达加斯加的奇奥皮斯。例如，结构域III第1534段的F6S突变与我们的535 bp扩增子未涵盖，与蚊子的SP耐药性相关[42]。第三，生物测定结果可能因几个因素而异，包括所使用的测定类型。具体而言，比较CDC瓶试验[43]和标准化WHO管试验[18]的蚊子研究发现结果不同[44，45]。世卫组织标准生物测定方案和诊断性杀虫剂浓度是从世卫组织为成年蚊子（一种飞行昆虫）设计的生物测定方案改编而来的，并可能出现有关跳蚤适当剂量和不经常接触杀虫剂的问题。不一致的暴露可能会导致比预期更高或更低的存活率，具体取决于每个跳蚤的最终暴露。混杂随机效应也可能由跳蚤身体状况不佳引起（在本研究的局限性中描述）。较低的剂量和使用培养皿而不是试管可以提供更准确的X药敏数据。芷薇[24]。此外，还可以对成年跳蚤局部使用杀虫剂，以提供更精确的剂量反应信息[46]。尽管存在这些注意事项，但大量证据表明，L1014F和L1014H突变在赋予SP耐药性方面均起重要作用[21，47-50]。未来的研究需要进一步探索代谢解毒在X中的作用。对SP具有抗性的Cheopis跳蚤。 此外，有必要重新评估广泛使用的WHO跳蚤方案，以确保跳蚤的生物测定结果一致和准确。
对一些昆虫物种的kdr遗传模式的研究表明，kdr是一种隐性性状。目前尚不清楚 kdr 在 X 中是否也是隐性的。切皮斯。如果是这样，指数模型将比线性回归模型更适合解释观察到的数据，线性回归模型隐含地假设 kdr 是一个共显性特征 （i.例如，杂合子同时表达敏感和耐药等位基因）。如果 kdr 是一种隐性性状，我们预计 kdr 等位基因的频率与跳蚤收集的存活率之间存在指数关系，因为 kdr 突变的单个拷贝不会赋予抗性，只有纯合子 kdr 跳蚤才能在暴露于溴氰菊酯中幸存下来。因此，我们的指数模型比线性关系模型解释了生物测定数据中观察到的更多变异性（r = 0.70，R2= 0.49， p = 0.0008， 图 4）。我们在122，1只测序跳蚤中发现了191个跳蚤杂合的kdr突变（0.102）。在对104.0%溴氰菊酯进行测试的05个杂合子中，71个在暴露于0.05%溴氰菊酯后死亡，而33个存活下来。当考虑单个收集时，在12个杂合跳蚤集合中的14个中观察到类似的模式。总之，这些结果与跳蚤中的kdr突变是隐性的可能性一致。在 A.冈比亚、氯菊酯、溴氰菊酯或DDT暴露对杂合子蚊子的影响似乎与纯合子易感个体相同，而耐药性主要见于L1014F纯合子[51，52]。在M.在国内，L1014F似乎是不完全隐性的，一些杂合子存活下来，而L1014H似乎不完全显性（杂合子和kdr纯合子的存活率相似）[53]。未来的研究将需要证实kdr在X中是隐性的假设。切皮斯。
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Fig 4. An exponential regression model supports the possibility that kdr resistance is recessive in Xenopsylla cheopis.
There is a significant linear relationship (r = 0.70, R2 = 0.49, p = 0.00084) between the frequency of kdr alleles (x-axis) and the square root of the frequency of survivorship to 0.05% deltamethrin (y-axis) in 19 X. cheopis collections that had at least 30 robust sequences, which explains the observed data better than the linear relationship in Fig 2 (r = 0.53, R2 = 0.28, p = 0.02). The solid black line shows the regression line for the observed data; the blue dotted line shows the theoretical relationship between the frequency of kdr alleles and percent survivorship under the assumptions that kdr is recessive and only fleas homozygous for the kdr resistance mutation would survive exposure to deltamethrin; the red dotted line shows the theoretical relationship assuming kdr is dominant.
https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0011401.g004
由于广泛使用溴氰菊酯而导致的遗传耐药性的上升可能会对使用相同机制的其他杀虫剂产生交叉耐药性。马达加斯加的跳蚤采集也显示出对氯菊酯（一种相关的SP）以及滴滴涕的抗性，几十年来，滴滴涕在马达加斯加一直没有用于病媒控制。虽然滴滴涕是一种有机氯化物杀虫剂，但它的功能与SPS相似。也就是说，这些杀虫剂优先结合昆虫钠通道的开放构象导致通道打开时间延长，导致过度兴奋状态，最终导致瘫痪和死亡[54]。在许多昆虫物种中已经记录了kdr突变对SP和DDT产生抗性的能力[39，55，56]，并表明这些突变通过一种一般机制起作用，该机制不受杀虫剂结合特性的微小差异的抑制。事实上，对VGSC蛋白的开放状态构象进行建模的尝试表明，kdr突变并不位于预测的杀虫剂结合口袋中，而是位于结构域III门控铰链附近，这对于蛋白质的构象变化很重要[22]。因此，kdr突变可能通过降低开放状态通道的可用性以及降低SP和DDT与开放通道的结合亲和力来引起耐药性[21-23]。L1014F突变通过这种机制导致黑腹果蝇对溴氰菊酯不敏感，使杀虫剂与开放通道的结合亲和力降低20倍，并增加药物与开放通道结合后的解离率[48]。此外，不同的kdr突变可以赋予SP和DDT不同的交叉抗性特征。例如，L1014F突变对溴氰菊酯、氯菊酯和DDT具有相对相等的抗性，而L1014H突变在爪蟾卵母细胞中表达时对溴氰菊酯更有效，而对氯菊酯和DDT的效果较差[50]。当使用某些杀虫剂时，这可能会对kdr突变的替代适应性产生有趣的影响。虽然 L1014H 突变对溴氰菊酯更有效，但在 X 中很少见。马达加斯加的Cheopis收集，这可能表明它是一个相对较新的突变。kdr突变可导致对许多杀虫剂产生耐药性的发现引起了人们对马达加斯加SP控制跳蚤的整体功效的担忧。
越来越多的研究表明，杀虫剂耐药性带来的健康成本从行为到生理影响不等（综述于[57]）。有趣的是，收集1（2002年收集）和14（2012年收集）最初对溴氰菊酯耐药，平均死亡率分别约为47%和44%[16，17]。这些跳蚤收集物在完全没有杀虫剂选择压力的情况下继续在IPM昆虫馆饲养，2019年针对溴氰菊酯的生物测定测试显示死亡率为100%，表明它们在7-17年内恢复到完全易感性。2020 年从这些收集中获得的基因分型样本表明，kdr 突变的频率变得非常低（集合 0a 中为 07.14%）或完全不存在（集合 1a）。对这些收集的跳蚤进行回顾性基因分型显示，过去kdr频率要高得多（分别为0.67和0.75，表4）。在这两个集合中，kdr频率随着时间的推移而降低可能表明kdr突变具有适应成本。在我们的研究中，只有一个实验室菌落（集合24）显示kdr频率随着时间的推移而增加，在相隔八年的样品中从0.83增加到1.00（表4）。在这种情况下，作用于小种群的遗传漂变可能是kdr等位基因固定的原因。有人假设健康成本是解释其他昆虫种群中已记录的易感表型回归的一种机制[58-60]。此外，一些研究报告了在没有杀虫剂选择压力的情况下，昆虫种群的kdr等位基因减少[35，61-63]。在 A.埃及伊蚊，携带KDR突变的蚊子表现出发育缓慢，繁殖力降低，行为受到影响[61]。由于这些适应成本，在没有杀虫剂选择压力的情况下，我们预计随着时间的推移，种群中的抗性突变可能会丢失;因此，避免使用特殊目的可能最终恢复其效力。然而，在收集 0 的八年后，kdr 频率从 83.1 增加到 00.24，产生了相互矛盾的结果。如果这个群体经历了小种群规模的时期，遗传漂变可能导致kdr等位基因的固定。测量 X 中 kdr 频率变化的其他研究。在没有杀虫剂选择压力的情况下，需要随着时间的推移进行Cheopis。
我们的系统发育分析表明，kdr突变独立地出现在马达加斯加的三个主要等位基因谱系中（图3），类似于X描述的进化情景。中国的Cheopis[25]。假设易感性是每个主要谱系中的祖先状态，共同抗性SNP（L1014F）似乎至少进化了三次，因此表明由溴氰菊酯的选择压力驱动的趋同进化。此外，马达加斯加强烈的杀虫剂选择压力在谱系1014中产生了第二个罕见突变（L1H）。马达加斯加的kdr等位基因1和3与中国人群的kdr单倍型H1和H2相同，这意味着谱系1014和1中的L3F突变可能起源于中国。然而，对于长期受到SP选择压力的昆虫种群来说，kdr进化几乎无处不在;因此，可以合理地预测这些突变在X之后在马达加斯加独立出现。Cheopis已经殖民了该岛，这发生在SP开发之前很久。在马达加斯加，L1014F和L1014H最初可能在当地人群中进化，然后随着时间的推移，在整个岛上广泛传播。这种情况可以解释在许多采样位置存在多个不同的谱系，每个谱系至少有一个kdr等位基因，以及每个谱系中总体上缺乏地理分层（图5）。然而，谱系 2 的等位基因（等位基因 6 和 9）在塔那那利佛没有发现，而等位基因 7、11 和 12 仅在塔那那利佛发现。此外，等位基因8，9和10仅在Toliara，Toamasina和Mahajanga的一个集合中发现。这些等位基因可能在种群中出现后不久就灭绝了，或者没有足够的时间在马达加斯加传播。尽管对 kdr 突变进化的其他解释是可能的，但最有可能的情况与由于溴氰菊酯存在较大的选择压力而发生的收敛进化一致。
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图5. 等位基因频率跨越马达加斯加的地理位置。
a） 12个跳蚤集合中每个3个等位基因（表25）的频率。b） 马达加斯加前五个省的12个等位基因的频率。等位基因 1 是我们数据集中最常见和最广泛的等位基因。
https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0011401.g005
缺乏特定位置的谱系表明马达加斯加地理上多样化的跳蚤种群之间的基因流动很高（图5）。跳蚤种群之间的基因流动很可能是由其主要啮齿动物宿主黑鼠（Rattus rattus）的运动促进的。对马达加斯加黑鼠种群结构的遗传分析表明，种群仅分为两大类：马达加斯加北部和该岛其他地区。此外，使用微卫星标记的种群结构估计非常低[64]，这表明大鼠种群之间的基因流动很高，地理距离似乎无法区分种群。马达加斯加的跳蚤种群结构略高，分为65个主要簇，有证据表明簇之间的基因流动[14]。此外，来自杀虫剂的选择压力可能发生在鼠疫流行的中部高地以外的许多跳蚤种群中。例如，收集17、22和14取自沿海监狱，这些监狱广泛使用SP来控制各种害虫[17，<>]。SP也是控制害虫的常用家用产品的一部分。由于疟疾是地方病，室内滞留喷洒通常用于减少按蚊的数量。驱虫蚊帐也被广泛用于防止按蚊叮咬;IRS和ITN方法都使用SP。 来自经过处理的房屋，监狱和鼠疫流行地区的跳蚤中的杀虫剂耐药性可以选择KDR突变，即使在鼠疫不流行的地区，KDR突变也可能在足够的选择压力下得以维持。
目前没有有效的疫苗可以预防鼠疫感染，因此除抗菌治疗外，杀虫剂是降低人类鼠疫发病率的主要工具。耐药性和kdr突变的广泛存在表明，溴氰菊酯不会有效地减少马达加斯加的许多跳蚤种群。由于kdr突变被证明对许多类型的SP和DDT具有抗性，因此跳蚤控制工作必须使用一种杀虫剂，通过替代机制杀死昆虫。在利用不同机制的杀虫剂之间切换的策略可能是长期控制病媒种群的有效方法[66]。具体而言，在非洲部分地区，从滴滴涕/拟除虫菊酯改用氨基甲酸酯可有效降低蚊子和疟疾的发病率[40，67]。为了应对对SP耐药性的担忧，马达加斯加国家鼠疫控制计划现在经常使用非硝硫磷（一种有机磷酸盐）来控制跳蚤。目前尚不清楚程序应该多久在杀虫剂之间切换一次。然而，这项研究表明，抗性逆转可能在7-17年后完全发生，但这可能取决于在没有杀虫剂选择压力的情况下失去抗药性的速度。在表型和遗传水平上了解耐药性的适应成本，将为在疾病媒介上使用杀虫剂的最有效策略提供重要的见解。此外，使用准确的杀虫剂剂量对于有效控制跳蚤非常重要，杀虫剂喷洒可能只会提供残留和短期接触该化学品的机会。使用含有杀虫剂的食用诱饵可使跳蚤通过以宿主为食而持续、集中地暴露于杀虫剂中，并可有效减少黑尾草原犬的跳蚤丰度[68]。然而，这种技术对于共生啮齿动物如R的可行性。鼠疫，主要的鼠疫宿主和X的宿主。马达加斯加的Cheopis需要更多的调查。另一种建议的替代方案是诱饵盒，它使用诱饵将啮齿动物吸引到装满杀虫剂的盒子中，目的是彻底和直接地将跳蚤暴露于杀虫剂中[69]。不幸的是，这种方法似乎在减少室内X方面无效。马达加斯加的Cheopis[70]。对替代策略的进一步研究对于鼠疫的长期预防非常重要。
这项研究有几个局限性需要注意。首先，生物测定需要许多健康的跳蚤才能准确。从田间收集的跳蚤被运送到实验室，这通常是从农村地区长途跋涉。有时很少有跳蚤在运输中幸存下来，减少了可用于建立殖民地的父母数量。正因为如此，需要从田间收集的幸存者进行繁殖，直到获得一个大而健康的菌落。因此，进行生物测定的跳蚤可能从现场收集的跳蚤中去除了几代。其次，从田间种群中抽取有限数量的跳蚤是一个遗传瓶颈。人群中存在的一些等位基因可能没有在样本中表示。此外，如果样本足够小，遗传漂变可能导致等位基因在已建立的菌落中丢失和固定。第三，大多数跳蚤是在疫情应对行动期间收集的，因此是在杀虫剂处理失败后收集的。因此，收集到的跳蚤可能已经经历了一次重大的选择事件，增加了抗性个体的数量。由于这些原因，本研究中提供的数据可能并不完全代表该领域跳蚤种群的表型和基因型。尽管有这些警告，但这项研究提供了迄今为止马达加斯加跳蚤种群中SP突变患病率的最全面了解。
使用分子工具跟踪 kdr 突变的频率可以准确预测昆虫对溴氰菊酯和其他 SP 的总体易感性。虽然这种突变可能不是赋予SP耐药性的唯一遗传机制，但它可用于快速识别耐药性可能对媒介控制造成问题的人群。促进X的快速和准确的基因分型。对于 kdr 突变，我们开发了一种 TaqMan 检测方法，该测定方法能够通过单一 PCR 测定区分三种可能的基因型。我们建议可以将该基因型信息用于生物测定数据的补充或替代，以确定跳蚤对SP的易感性状态。通过这种方式，TaqMan检测将作为生物测定的有用补充，因为它可用于更多的现场收集，并且不需要活跳蚤。它可用于从每个集合中快速对大量个体跳蚤（30 个或更多）进行基因分型，以估计预计在溴氰菊酯治疗中幸存下来的个体比例。该测定准确地对X进行了基因分型。来自马达加斯加、乌干达和美国的Cheopis，使其成为监测全球SP耐药性的重要工具。
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电压门控钠通道（VGSC）基因结构域II片段的多物种比对。
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S1 图 电压门控钠通道（VGSC）基因结构域II片段的多物种比对。
这种比对包括残基899-917（根据Musca家生氨基酸序列编号，GenBank加入AAB47604.1）。GenBank入库号列在物种名称和核苷酸序列类型之后。编码氨基酸在核苷酸序列上方表示。
https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0011401.s001
（提夫）
S2 图 非洲爪蟾电压门控钠通道（VGSC）基因结构域II S4-S6区域的核苷酸序列。
突变根据Musca家生氨基酸序列（GenBank加入AAB47604.1）进行编号。编码氨基酸表示在核苷酸序列上方，外显子表示为大写字母，内含子表示为小写字母。单核苷酸多态性 （SNP） 带有下划线。盒装位点391和392对应于kdr L1014F/H突变。引物和探针序列以粗体显示。
https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0011401.s002
（提夫）
确认
我们感谢许多受访村庄的居民和地方当局在鼠疫应对实地工作期间的帮助。我们还要感谢美国科罗拉多州柯林斯堡疾病控制和预防中心媒介传播传染病司细菌性疾病处的Kenneth L. Gage提供来自乌干达的跳蚤，这是马达加斯加跳蚤的重要比较。我们感谢IPM医学昆虫学和鼠疫部门的实验室技术人员，科学家和行政人员，特别是Malala N. Rakotomanga，Tojo R. Ramihangihajason，Manambina N. Randrianjatovo和Mandimby Rajaonarimanana。最后，我们感谢IPM医学昆虫学部门前负责人Sébastien Boyer。
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