免费医学论文发表-通过最大似然法将全原子模型温和快速地细化到冷冻电镜密度
抽象
更好的探测器和自动数据收集产生了大量的高分辨率冷冻电镜图，这反过来又重新引起了人们对改进确定与这些图谱对应的结构模型的方法的兴趣。然而，随着原子分辨率的增加，自动拟合原子密度变得困难，并且细化潜力具有大量的局部最小值。在实践中，当人们还想在原子位置与图谱的良好拟合之间取得平衡时，问题变得更加复杂，同时建立良好的立体化学或允许蛋白质二级结构在拟合过程中发生变化。在这里，我们使用最大似然法提出了应对这一挑战的解决方案，方法是将问题表述为识别最有可能产生观察到的密度图的结构。这使我们能够推导出基于相对熵的新型平滑细化势，并结合新颖的自适应力缩放算法，以平衡力场和基于密度的势。在低噪声场景中，正如现代冷冻电镜数据所预期的那样，基于相对熵的细化电位优于替代方案，自适应力缩放似乎有助于所有现有的细化电位。该方法可作为GROMACS分子模拟工具包中的一个组件提供。
作者摘要
冷冻电子显微镜经历了一场革命，现在定期产生分辨率为 2? 的数据。然而，这些数据以密度图的形式出现，将原子坐标拟合到这些图中可能是一个劳动密集型和具有挑战性的问题。当存在多个构象、柔性区域或分辨率较低的结构部分时，这尤其有效。在许多情况下，还需要了解分子如何在这种构象之间移动。这可以通过使用密度作为目标约束的分子动力学模拟来解决，但是当冷冻电镜图具有高分辨率时，常用的细化电位可能会扭曲蛋白质结构或卡在局部最小值。这项工作基于冷冻电镜散射过程的模型得出了新的细化潜力，该模型提供了一种温和的方法来将蛋白质结构拟合到模拟中的密度，我们还提出了一种自动启发式方法来平衡映射和模拟力场的影响。
数字
Fig 7图1图2图3Fig 4Fig 5Fig 6Fig 7图1图2图3
引文： Blau C， Yvonnesdotter L， Lindahl E （2023） 通过最大似然法将温和快速的全原子模型细化到冷冻电镜密度。公共科学图书馆计算生物学19（7）： e1011255. https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011255
编辑 器： 约亨枢纽， 德国萨尔州大学
收到： 30月 2022， 9;接受： 2023月 31， 2023;发表： <>月 <>， <>
版权： ? 2023 布劳等人。这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。
数据可用性： 模拟起始结构、生成的密度、设置参数、通过 Makefile 和 Python 脚本生成图 2 的完整工作流程设置以及图 3 和每残基 RMSD 的数据可通过 Zenodo （https://doi.org/10.5281/zenodo.4556616） 获得。执行密度引导分子动力学模拟的代码在 GROMACS 中维护，并在 2021 版及更高版本中以及 https://gitlab.com/gromacs/gromacs 的存储库中公开提供。轨迹的傅里叶壳相关分析已按照 EMAN2 [25] 中的约定在 GROMACS 代码库之上实现，可在 https://gitlab.com/gromacs/gromacs/-/commits/fscavg 上获得。用于生成图2的Python脚本，以及图3和每残基RMSD的数据可通过Zenodo（https://doi.org/10.5281/zenodo.4556616）获得。
资金： 瑞典研究委员会（EL; 2017-04641， 2018-06479， 2019-02433）， BioExcel Center of Excellence（EL;EU 823830）、克努特和爱丽丝·瓦伦堡基金会（EL; 1484505）、卡尔·特里格基金会（EL;CTS-15：298）和瑞典电子科学研究中心。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。
竞争利益： 提交人声明不存在相互竞争的利益。
1 引言
由于更好的检测器，测量技术和算法[1]，冷冻电子显微镜（cryo-EM）在过去几年中经历了一场革命，该技术现在允许以近原子分辨率快速重建生物分子“密度图”[2，3]。这些密度图描述了样品和真实空间中电子束之间的相互作用。它们（包括从X射线结构因子衍生出来的类似因素）为结构生物学的推理提供了基础。特别是，对于冷冻电镜，贝叶斯统计彻底改变了从显微照片重建密度图。这提供了一个框架，可以将关于三维密度图模型的先前假设与将该模型连接到测量数据的似然函数合理地结合起来，并确定最有可能生成观测数据的密度图，而不是直接尝试解决未确定的逆问题[4]。
然而，要了解生物大分子的结构和功能，仅具有整体冷冻电镜密度通常是不够的，还需要将单个原子的坐标建模到图中[5]。这使得能够理解例如结合位点特性，与脂质或其他亚基的相互作用，替代构象之间的结构重排，特别是可以通过分子动力学（MD）模拟在纳秒到微秒的时间尺度上模拟结构动力学[6]。如果这些模拟中使用的相互作用描述（力场）是完美的，并且可以访问无限量的采样，那么计算方法应该能够通过从粗略的初始密度开始细化来进一步改善结构，但在实践中力场和采样都有缺点。尽管如此，通过使用冷冻电镜数据作为大规模约束，同时使用力场来微调细节，特别是局部立体几何或分辨率尺度上的相互作用等细节，超出冷冻电镜数据可以解析的范围，将两全其美结合起来仍然是一个有吸引力的想法。冷冻电镜数据和立体化学约束在过去得到了有利的结合，以帮助结构建模为三维冷冻电镜密度，方法是在已建立的建模工具中添加力场项，强制执行所需的立体化学[7-11]，或者通过在分子动力学模拟[12，13]或弹性网络模型[14]中添加基于密度的启发式偏置电位。
在实践中，如何最好地将实验地图数据与仿真相结合，并取得令人满意的结果和快速收敛，并非易事。原则上，基于密度的偏置电位可以实现任意良好的拟合图谱，但代价是扭曲蛋白质结构。为了应对用冷冻电镜数据平衡所需立体化学特性的挑战，改进方案已扩展到包括二级结构约束[12]，多个分辨率范围[11，15]以及多个力常数[11，16]; 后两者要么在单个模拟中连续进行[11]，要么通过哈密顿副本交换[15，16]。所有这些方法的一个共同挑战是，随着冷冻电镜密度图分辨率的提高，施加的偏置电位函数的坚固性也会增加，以及如何正确平衡分子力学和偏置电位的力。这导致了一个明显的建模悖论，即进一步改进具有分子动力学的冷冻电镜密度的结构模型似乎越难，这些模型的高分辨率数据就越多。
为了从基本角度应对这一挑战，贝叶斯方法已被用于推导给定冷冻电镜密度的全原子结构模型的概率[17]，并权衡冷冻电镜数据与其他数据源的影响[18]。这些建模方法为冷冻电镜图中的数据内容提供了有价值的见解，并通过将其视为通用实验数据，为冷冻电镜密度建模提供了有前途的新方法。然而，它们并不反映从显微照片中获取数据和密度重建的基本物理学，并且以前没有产生适用于新质量的细化潜力，例如，在分子动力学模拟中。
规避反映三维冷冻电镜密度重建所需的模型假设数量的一种方法是采用直接连接显微照片和全原子集合的贝叶斯模型[19]。这些尝试以前已被证明是获得分子动力学模拟驱动力的一种方式，成本过高，因为单个力评估需要将模型原子坐标投影到数百万个冷冻电镜粒子图像（即分子图像）上。
在这项工作中，我们展示了如何借用非常成功的密度重建方法，并使用来自结构的冷冻电镜密度图的最大似然建模来推导出新的偏置电位，该偏置电位是平滑的，长的，并且比基于互相关[11，13]或内积的既定电位（相当于使用与倒置冷冻电镜密度成比例的电位[12]).这提供了许多优势，包括能够克服密度障碍，特别是避免冷冻电镜密度图中较大的局部梯度导致的过度偏置力。它还避免了对二级结构等约束的需要，而是允许模拟自由探索局部构象空间，而实验数据用于将采样偏置到全局构象空间的实验有利区域。
我们进一步展示了如何通过从热力学原理得出的自适应力缩放来实现力场和冷冻电镜密度分量之间的更好平衡。这允许以较低的计算成本使用单个固定参数对一系列系统规模和初始模型质量进行优化。此外，为了评估基于模型与冷冻电镜密度比较的偏置电位，我们建议将全原子结构转换为反映冷冻电镜特定特征的模型密度，同时最大限度地减少计算工作量。
我们研究了在实际应用中新获得的电位与无噪声和实验冷冻电镜数据中已建立的内积和互相关偏置电位相比的优缺点。最后，我们展示了所提出的细化方法如何纠正具有冷冻电镜数据的扭曲初始模型。完整的开源实现作为 GROMACS 分子动力学模拟代码 [20] 的一部分免费提供。
2 结果
2.1 推导细化力
我们用分子动力学将全原子模型细化为冷冻电镜密度图ρ的算法是基于最初粗略对齐密度图和目标结构，从坐标生成模型密度，然后确定拟合电位U适合基于生成的模型密度和目标冷冻电镜密度的比较（图1）。该电位用于推导拟合力，然后将其与力场势UFF和ff基于密度派生的力和由力常数 K 确定的力场之间的启发式平衡。
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图1. 原子结构模型使用偏置力细化为冷冻电镜密度，以最大限度地提高模型和地图之间的相似性。
使用原子模型（橙色）和密度图（蓝色）初始化优化/模拟。在每个体素（灰色框）中生成模型密度。模型密度和冷冻电镜密度之间的体素相似性得分类似于噪声模型（浅蓝色曲线）。相似性得分的梯度决定了拟合力（蓝色箭头）。与分子动力学力场（红色箭头）一起，拟合力可实现模型坐标更新（深橙色），使模型与力场约束下的密度更相似。在仿真的每个时间步长中，从更新的模型迭代生成新模型密度，直到达到可接受的收敛性。
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组合驱动力由总势能决定，
(1)
假设原子的单一配置产生观察到的冷冻电镜密度，贝叶斯定理量化了给定模型将冷冻电镜数据描述为[17]
(2)
温度 T 下的玻尔兹曼反演连接方程 （1） 和 （2） [21] 的左侧，其中 c 是任意势能偏移
(3)
(4)
在这种形式化中，力场提供了无需任何额外观察即可确定模型的先验，而拟合势提供了特定给定结构产生目标密度的条件概率。
将拟合电位分解为与坐标和密度无关的力常数k和相似性得分揭示了与先前方法的相似性[8，12]。我们发现，施加的密度力意味着模型结构和目标密度之间的相似性得分，反之亦然。有了这个ansatz，方程（4）将诸如互相关或内积之类的相似性度量与其对上述似然函数的隐含假设相关联，从而能够构建新的相似性分数，从而根据有关基础测量过程的假设来推动细化过程。
2.2 最大似然模型产生负相对熵作为相似性得分
为了从测量给定结构密度的可能性中获得新的细化潜力，我们假设冷冻电镜密度与原子 - 电子散射概率有关，其中电子 - 原子相互作用导致电子的相移。根据此假设，需要两个步骤才能根据坐标计算密度似然。一、电子散射概率密度ρs从给定结构创建。其次，将该密度与给定的测量密度进行比较。另外两个假设可以推导出新的相似性分数。
对于每体素散射概率，我们提出了两组不同的假设，导致每组假设都有自己的细化潜力。可以提出更多的假设;在这里，我们选择展示那些超越先前建模的模型，但在模型复杂性方面可以很好地处理，并且可以集成到分子动力学框架中，其中力必须以数值稳定和快速的方式计算。因此，我们选择不将显微镜检测器的完整图像形成集成到三维密度中，而是从三维密度和对每个体素代表的内容的一些额外假设开始建模过程。通过对密度中的体素值提出两种不同的方法，应该更清楚地了解如何使我们的建模适应更复杂的模型。
在第一个模型中，我们假设入射电子将正好在一个体素处散射，并且体素散射的概率与密度值成正比。这需要∑v ρ = 1，我们通过重新缩放密度值来实现。冷冻电镜密度值的自由重新缩放是从图像处理过程中粒子区域周围的归一化到单位方差的动机[22]。引入预期的密度相互作用数s，散射过程通过狄利克雷分布描述，
(5)
通过一些近似值（S1附录），我们发现
(6)
这种新发现的潜力通过定义相似性得分与传统使用的细化潜力相关
(7)
使用此定义，我们观察到缩放参数 s 和力常数通过 k = k 相关 B啧啧。
尽管 s 可以通过贝叶斯方法估计，对具有先验 p（s） 的 s 进行条件后验估计，为了获得观察密度的可能性，给定坐标（参见 S1 附录），我们出于以下原因选择了不同的方法。对这个条件后验的贡献与 S 呈指数加权我，因此参数的良好估计取决于创建与结构相似的足够代表性分布的能力。然而，在大多数情况下，我们预计我们需要密度引导的模拟，以迫使分子远离重要的能量障碍的初始配置，以便能够对有助于估计s的相关配置进行采样。为了克服这些问题，我们使用下面描述的协议启发式扩展s。这使我们能够生成具有不断增加结构到映射重叠可能性的轨迹，但不可否认的是，代价是没有从适当的后验分布中采样。
在这个基于狄利克雷分布的图片中，报告的密度被视为概率密度，需要去除负值并归一化为统一。这种建模方法的结果潜力与具有自由缩放参数的模拟密度和实验密度之间的Kullback-Leibler散度成正比。反过来，这种电位可以看作是基于内积的电位，其中密度被其对数所取代。
在另一张图片中，每个体素报告的冷冻电镜密度与相互作用计数 rρ 成正比vN入射电子，其中比例因子r如上所述未确定。我们假设每个体素测量的散射概率与其他体素值无关。这并不排除密度数据之间的空间相关性，但指出一个体素中的散射过程不会影响其他体素中的电子相互作用。有了这个结果，就足以在每个体素处定义一个概率分布。
这张图片假设玻璃冰不会导致散射，散射通常是通过改变冷冻电镜密度的偏移来实现的，以便水密度用在零附近波动的体素值表示。仅考虑正密度，我们通过带有参数的泊松分布来描述这种散射相互作用过程。虽然理论上可以扩展模型以包括噪声波动和负密度，但为了降低模型复杂性，我们省略了这一点。
有了这些假设（S1附录中的详细代数变换），
(8)
与上述类似，未知比例因子 r 将被视为尺度参数，可以从条件后验分布进行估计，但保留为此处启发式缩放的自由参数。我们获得了模拟模型密度和冷冻电镜密度之间的相似性分数，与负相对熵成正比，或者在归一化ρ后获得Kullback-Leibler散度，使得∑v r1ρv= 1，r = r1r2,
(9)
与上面类似，我们发现通过这个相似性分数定义，力常数和r2由 k = r 相关2kBT（见S1附录）。
新推导的基于相对熵的相似性得分的域为 [?∞， 0]，完全一致为零。由于该术语，它与已建立的相似性得分（如互相关[11]和内积）（表述为遵循平滑倒置密度梯度的力，在这种方法中是等效的[12];见S1附录）有很大不同。相比之下，基于相对熵的分数从体素获得最大的贡献，其中冷冻电镜数据没有相应的模型密度数据。
这导致与与冷冻电镜数据局部良好一致性的局部最小值建立的相似性分数的行为不同，而基于相对熵的电位只有在结构和密度之间存在良好全局一致性的情况下才会具有最小值。因此，基于相对熵的密度势有望在其他电位无法逃脱局部最小值的情况下表现得更好，代价是对数据中噪声的敏感性更高，尤其是原子模型中未考虑的额外密度数据。
2.3 基于相对熵的势能景观是平滑的
所提出的相对熵密度密度与密度相似性度量在将一个和两个粒子细化为参考密度的一维模型方面具有有利的性质（图2）。对于我们的一维模型案例，两个新推导的势具有相同的分析形式。
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图2. 相似性得分决定了有效细化势能景观的坚固性，在平衡结构偏差时也是如此。
从上到下：单个粒子（黑色圆圈）向高斯形密度（灰色）的一维细化，内积（紫色）、互相关（赭石）、相对熵交换（深蓝色）和相对熵（绿色）作为相似性得分。b 具有两个粒子的扩展模型（黑色圆圈，x1更小和 x2更大）具有一维密度和目标分布（灰色）中的两个振幅峰，以及所得的内积、互相关、交换相对熵和相对熵相似性度量的二维有效势能景观。c 相似性测量和力场对势能景观的贡献的组合，例如调和键，使粒子保持在高斯中心之间距离的一半。对于细化势和键势能景观贡献的所有相对权重（比率 1：2 上图，2：1 中面板，如左图比例所示），相对熵相似性得分生成平滑景观，在模型输入的预期位置处具有最小值。
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与在一个维度上具有陡峭和突然的细化力的互相关和内积相似性度量相比，相对熵相似性得分具有具有长程相互作用的谐波形状，可以有效地最小化。使用相对熵，待提炼的粒子被谐波弹簧状电位吸引到最佳拟合位置;远离最小力很大，但随着接近最小力，它们的大小单调减小。然而，基于内积和互相关的拟合势对高斯扩散宽度之外的粒子几乎不施加力，而在靠近高斯中心时施加突然增加的力，并且在非常接近最小值时微不足道。
对于两个粒子的细化，这种优势仅在新推导的势之一中保持，其中基于相对熵的势能景观不那么崎岖，并且具有比内积和基于互相关势的相应景观更少的显着特征和最小值（图2）。在基于相对熵的势景观中只发现了一个对角线屏障，对应于粒子位置的“交换”，这减轻了对全局最小值的搜索。基于内积的自由能景观在两个粒子以最高密度处于同一位置的配置中具有最小值。这个问题可以在实际应用中通过力场先验来缓解，该力场将强制原子之间的最小距离（例如通过范德华相互作用）。另一方面，交换的相对熵势表现出与内积相似的行为，具有相似的最小值，但整体能量格局更平滑。
为了模拟力场的影响，两个粒子通过谐波键连接，其影响越来越大。基于密度的力和键之间的平衡强烈地决定了产生的能量景观的形状，但在这里，相对熵也提供了一个更平滑的景观，对细化和键势的特定相对权重不太敏感。
2.4 自适应力缩放减少了细化过程中的功，并允许比较基于密度的电位
为了使结构和密度之间收敛到高度相似而不扭曲二级结构，我们采用了自适应力缩放启发式方法。必须手动确定力常数的既定协议需要迭代试错法。我们通过引入图3a中描述的自适应力缩放来解决这个问题，以在细化过程中自动平衡力场和基于密度的力。
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图3. 力场和冷冻电镜密度数据的贡献自适应缩放克服了潜在的能量障碍，而无需过多的工作投入。
a 自适应力缩放在细化模拟期间启发式地平衡力场和密度影响。b 能量景观中的粒子，密度相似性沿黑色曲线从左到右增加。对于大腿替代方案，尽管存在偏置力（勃艮第箭头），但相似性仍会降低，这会导致偏置强度增加。相反，在相似性保持较高的场景（小腿）的情况下，偏置力将逐渐减小，以使系统能够更好地对局部景观进行采样。c 布朗扩散在电位中的扩散分别具有固定（灰色）和自适应（勃艮第）偏置力。恒定偏置力被缩放，使得两种力加法方案产生相同的平均平均首次通过时间，从左到右移动。相对熵方法导致系统（分别为灰色曲线和勃艮第曲线下的面积）显着降低，从而减少了系统动力学的扰动。
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冷冻电镜细化仿真是非平衡仿真，旨在将系统从初始模型状态驱动到尽可能与冷冻电镜密度相似的最终状态，同时避免非物理路径等导致的结构变形。为了避免或至少减少后者在细化过程中，已经设计了一种启发式协议，旨在最大限度地减少对系统施加的工作，同时仍然需要尽可能少的时间来细化。
相似性 S 作为从初始拟合 S 驱动系统时的反应坐标开始到 S结束，密度引导仿真电位的施加功仅由系统进展时力常数的变化决定：
(10)
方程（10）表明，任何在Δ S>0时减小k的协议，如果ΔS<0减小，则相反地增加k，保证比将力恒定固定在自适应缩放协议的最终值（给定S 开始 < S结束.图3b显示了自适应力缩放如何从低力常数k开始实现这种行为。
使用一维布朗扩散模型系统（图3c）来测试本文方法部分所述的混凝土缩放协议的性能。在此模型中，相似性得分只是随着粒子坐标值的增加而增加。与恒定力相比，将系统偏向于使用自适应力缩放增加坐标值，允许粒子在相同的平均首次通过时间内以低得多的平均功输入达到给定的坐标值。除了通过粒子轨迹之外，没有将自由能景观与自适应力缩放协议进行任何耦合，自适应力缩放将力增加到足以克服能量障碍，但随后再次减小它。
我们没有为自适应力缩放启发式设置限制，而是选择继续力缩放，直到达到分子动力学积分算法的极限，这样做的好处是使用代表立体化学和数据之间广泛平衡的结构创建轨迹。
自适应力缩放进一步使相对熵与冷冻电镜数据模拟中其他已建立的基于密度的电位进行比较，因为它将力常数选择的影响与细化电位的选择分开。为了将冷冻电镜数据与我们框架内新得出的相似性评分进行比较，需要一个模型密度生成协议，如下所示。
2.5 为冷冻电镜数据细化推导出最佳模型密度生成
为了评估结构模型和冷冻电镜密度之间的相似性，从原子位置生成了电子散射概率密度模型。在模拟电子散射概率时，两个主要效应是复杂的：每个原子的散射截面及其热运动。两者都用振幅 A 和宽度 σ 的高斯函数近似。散射截面确定A（S1表）。为方便起见，我们用所有重原子的单位和氢原子的零来近似散射振幅。原子在低温下的热波动大小决定了扩散宽度σ。
在实践中，模型分辨率的这些限制被测量仪器的有限性能和重建过程所取代，其中结构异质性、检测器像素尺寸、显微镜透镜和颗粒对齐限制了分辨率。我们不考虑结构异质性，因为它是一种集合效应。本文介绍的方法与集成模型之间的联系可以通过采用概率分布而不是方程（2）并利用集成模拟[23]来实现。其他分辨率限制效应通过对生成的映射进行具有高斯核的额外卷积来近似。我们不是要重现与实验地图中相同的模糊，而是努力从物理模型中保留尽可能多的信息。
一方面，由于网格采样不足而导致的信息丢失与由于粗略模糊引起的信息丢失之间找到了平衡，其中一半最大高度处的高斯宽度等于分辨率。网格上的最大可表示分辨率对应于 Nyqvist 频率δ（对应于像素和体素大小）的两倍，因此在细化模拟中，高斯宽度σ从最高局部分辨率近似，或者在数据不适用的情况下，从体素大小，
(11)
为了提高计算效率，本出版物中的所有模拟的高斯扩散在4σ处被截断，占密度的99.8%以上（S1附录中的图A）。通过此截止值，初始模型结构和冷冻电镜密度之间最大距离的微小限制已被证明与所有实际目的无关，因为一旦模型密度和冷冻电镜密度之间存在最小的重叠，基于密度的力就会将结构“拉”成密度，这可以通过初始对齐轻松实现。有趣的是，这种方法导致高斯扩散宽度比以前应用的方法更小，这些方法旨在重现与实验冷冻电镜密度具有相同整体分辨率的密度图。因此，它可以在模型密度中保留尽可能多的结构信息，同时仍降低计算成本。
2.6 针对无噪声数据的细化
为了区分实验数据中的其他噪声效应和上述模型中的可能限制，我们首先使用理想数据评估细化，其中针对扭结配置中相同螺旋的合成生成目标密度对小直线螺旋模型系统[14]进行了细化。如图4a所示，自适应力缩放和相对熵作为相似性得分有效地将螺旋拟合到合成冷冻电镜密度中[24]。
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图4. 通过自适应力缩放细化为无噪声数据。
a 螺旋的对齐（左）和未对齐（右）起始构象（黑棒），经过细化模拟，合成生成的冷冻电镜密度（灰色网格）。b 从对齐构象开始的最终精炼模型的每个残基的RMSD，与合成密度图所依据的地面真实模型进行比较。每个重复 （n=7） 通过使用的相似性度量、内积（紫色）、互相关（赭色）、相对熵交换（深蓝色）和相对熵（绿色）着色。c 与合成密度图基础的地面真实模型相比，从未对齐构象开始的最终精炼模型的每个残基的RMSD。每个重复 （n=7） 通过使用的相似性度量、内积（紫色）、互相关（赭色）、相对熵交换（深蓝色）和相对熵（绿色）着色。
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当螺旋与密度对齐时，自适应力缩放和不同相似性得分的组合实现了一致的全局拟合，由于分子动力学模拟的随机性质，结果有一些波动（图3c）。所有四个相似性度量都导致自适应力常数的质相似演变（S1图;绝对值没有意义，因为它只是描述力场和密度拟合之间平衡的相对因子）。从对齐和未对齐的起始位置开始的模拟偶尔会卡在局部最小值中，这可能会导致拟合不良。从对齐位置开始，所有重复的平均总RMSD对于相对熵最低，并且在螺旋最初未对齐时进一步改善（S2和S3表）。基于相对熵的势在未对齐细化中显示出明显更好的结果，并且在 1 次重复中有 6 次实现了 7? RMSD 较少的拟合，而在某些情况下，基于内积、互相关和相对熵交换的电位完全无法对齐螺旋（S2 和 S3 图）。对于单个螺旋，这是一个稍微人为的情况，但在经历显着转变的大型结构中，一些二级结构元素在改进的初始阶段不与目标密度重叠是很常见的。
2.7 对实验冷冻电镜数据的细化
使用醛缩酶和GroEl亚基的实验冷冻电镜密度来测试适应力缩放的性能，并结合实验数据的不同细化电位，我们的模型描述中未考虑的密度增加，以及模型假设无法完全解释的噪声。
通过将先前发表的兔-肌肉-醛缩酶 [25] 的 X 射线结构与最近发表的独立测定的冷冻电镜结构 [26] 进行自适应力缩放细化，我们始终如一地在所有电位中实现准确的细化具有良好的立体化学（S4 和 S5 表）。图5a显示了最终的细化模型，其全局偏差与使用内积和互相关测量的沉积模型的重原子均方根偏差（RMSD）小于1?，相对熵的密度势略高于1?。
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图5. 将全原子 X 射线醛缩酶结构 （PDB id 6ALD） 细化为实验冷冻电镜密度 （EMD-21023）。
a 来自密度引导模拟的最终结构模型，使用不同的相似性分数，由手动构建模型（PDB id 6V20）的每个残基未对齐的均方根坐标偏差（RMSD）着色。b 起始结构的傅里叶壳相关性（灰线）、起始模型与目标密度的刚体拟合（蓝色）以及最后一个仿真帧中的细化结果（实线）。报告的冷冻电镜图分辨率和 0.143 FSC 用灰线表示。c 改进模拟过程中未加权的FSC平均数。
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与冷冻电镜数据的紧密一致性反映在针对密度（图5b）与沉积模型几乎无法区分的模型的FSC中。基于相对熵的势强调与全局特征的一致性，但代价是局部分辨率（S4图），同时仍然为冷冻电镜密度提供了良好的一致性。
未加权的FSC平均值[27]是一个既定的相似性分数，与用于改进系统的偏置电位无关（图5b）。所有潜在电位似乎都会导致精炼模拟在不到2 ns的时间内收敛，如图5c所示。基于相对熵的密度力的不那么坚固和长期势的性质反映在快速刚体（如初始拟合）上，而其他势则显示出逐渐改善的拟合。
由冷冻电镜 [28] 确定的两种不同构象的 GroEl 亚基的细化扩展了我们细化潜力的模型假设的极限，将其与映射到模型对应关系不完全的噪声模型进行细化。与醛缩酶细化类似，自适应力缩放允许快速可靠地细化模型密度，如图6（S6和S7表）所示。然而，基于相对熵的势倾向于考虑所有密度，导致在全原子模型中密度没有对应的区域中与已发布的模型发生偏差（S5和S6图）。
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图6. 将全原子 GroEL 冷冻电镜结构（PDB ID 5W0S 状态 1）细化为实验冷冻电镜密度（EMD-8750，附加图 3）。
a 来自密度引导模拟的最终结构模型，使用不同的相似性分数，由沉积模型的每个残基未对齐的均方根坐标偏差 （RMSD） 着色（PDB id 5W0S 状态 3）。b 起始结构的傅里叶壳相关性（灰线）、起始模型与目标密度的刚体拟合（蓝色）以及平衡模拟的最后一个仿真帧（实线）偏差的细化结果（虚线）。c 改进模拟过程中未加权的FSC平均数。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011255.g006
2.8 结合力场和冷冻电镜数据的模型整流
为了评估较大结构转变中的性能，我们重复了醛缩酶细化，当从初始模型结构开始时，这些结构因加热而部分展开的二级结构元素而扭曲（图7，如方法中所述）。图7b显示了最终的基于相对熵的细化过程模型，该模型从手动构建的模型中实现了1.13 ?重原子RMSD。地图分辨率下的结构细节与辅助结构元素匹配。与未扭曲的X射线结构的细化相比，基于相对熵的势能从势的长程性和大尺度特征的快速对齐中获得的收益较少，因为所有长度尺度都需要结构重排。自适应力缩放协议减轻了基于密度的电位在细化速度方面的差异，并允许在不到 3 ns 的时间内以良好的结构一致性进行细化（S7 图）。自适应力缩放协议允许建模更多地由冷冻电镜数据引导，并达到仅使用力场的立体化学信息进行建模无法访问的模型结构。
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图 7. 冷冻电镜数据通过密度引导模拟纠正模型失真。
a 相对于手动构建的模型（PDB ID 6V20）的起始模型 RMSD 失真。b 使用自适应力缩放和相对熵相似性评分细化为冷冻电镜密度 （EMD-21023） 后的最终模型结构。c 最终仿真模型的结构特征（绿线）和冷冻电镜密度（灰网）的特写。d 起始结构的傅里叶壳相关性（灰线）以及最后一个仿真帧中的细化结果（实线）。报告的冷冻电镜图分辨率和 0.143 FSC 值用灰线表示。e 细化模拟过程中未加权FSC平均数。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011255.g007
3 讨论
虽然定义纯粹的经验相似性度量有时足以使结构适合冷冻电镜密度，但将相似性度量与目标密度的基础测量过程联系起来可以推导出自然相似性度量。从极少数假设中，这会产生基于密度的电位，该电位来自最大似然，该电位与模型/仿真原子坐标生成的模型密度与目标冷冻电镜密度之间的相对熵一致。
新定义的势具有有利的特征，其中基于泊松统计的相对熵势最突出地表现出长距离和低坚固性。它避免了在细化过程中与所需配置不符的局部最小值，并允许快速对齐大比例特征，并且在使用合成密度图的零噪声设置中优于已建立的细化。当前冷冻电镜密度中的噪声含量可能仍然太高，无法用当前的简约模型假设来处理，但随着冷冻电镜和其他中低分辨率技术的质量继续快速提高，我们相信不依赖于平滑的模型将具有更多优势。此外，自适应力缩放提供了一种令人惊讶的简单方法来解决在我们的模型假设中力场和基于密度的力之间无法达到平衡的问题。它允许无参数细化，比当前建立的协议快一到两个数量级。从概念上讲，它与多分辨率方案正交，并且很容易与多分辨率方案结合使用[15]。
我们的框架在处理力场与拟合力方面有用的另一个例证是，它如何使我们能够推断出接近最优的模型密度分布以进行细化，更重要的是，该值与将其设置为等于实验分辨率的常见做法不同。虽然其中许多因素仍然可以手动调整，但将它们作为自由参数删除意味着更少的任意设置，以避免过度拟合或欠拟合，这在尝试组合多个实验数据源时更为重要。为了针对最近的冷冻电镜数据进行试验结构改进，我们表明我们实现了与初始模型质量无关的出色拟合。
当前配方的一个局限性是它没有明确考虑冷冻电镜密度重建过程中的更多信息。拓宽本文介绍的方法的第一步是考虑来自冷冻电镜图的局部分辨率信息，这些信息可以被视为密度数据噪声的度量。在实践中，局部分辨率仍会影响拟合，因为较低的局部分辨率将对应于地图中较平滑的区域，而较低量级梯度将导致这些区域中的量级拟合力较低。然而，解决这个问题的一种形式上更正确的方法是将目标冷冻电镜密度视为具有空间分辨方差的统计分布——这是我们打算在未来追求的事情，看看它是否可以进一步改善相对熵势的问题与更多的噪声数据。
我们目前的算法通过生成结构为完全贝叶斯方法开辟了道路，从中可以估计狄利克雷和泊松模型的正确概率分布以及尺度参数 s 和 r，从而估计力场和冷冻电镜数据之间的正确平衡。这也将减轻一个缺点，即自适应力缩放是一种固有的非平衡方法，可能被认为是进一步平衡采样的“初始结构生成器”。
这项工作中提出的算法作为GROMACS的一部分是免费提供、集成和维护的[29]。总体而言，提供了三个独立的构建块来帮助对冷冻电镜数据进行建模，每个构建块都可以在当前的建模工具中单独实现：新的细化潜力，如何计算模型密度的新标准，两者都基于最大似然法的推理，以及自适应力缩放，以温和和自动地偏置立体化学和冷冻电镜数据的影响。该实现还提供了监视优化过程的工具。尽管任何自动化方法仍然难以与经验丰富的结构生物学家的手动模型构建竞争，但我们相信这些方法提供了以最小的人力和计算成本从冷冻电镜密度中提取尽可能多的结构信息的新方法，这对于全自动模型构建特别有吸引力。
4 方法
4.1 计算基于密度的力
为了便于实现和计算效率，方程（4）的导数被分解为相似性测度导数和模拟密度模型导数，在所有密度体素v
(12)
虽然方程（12）中的卷积可能会在傅里叶空间中评估可能的性能优势，但我们已经实现了更直接的实空间方法。
正向模型 ρs使用[30]中使用的快速高斯扩散计算;体素上三维高斯函数上的积分近似于其在体素中心 V 处的函数值，信息损失很小（S1 附录中的图 B）。高斯函数的振幅[31]已经近似为除氢以外的所有原子的单位。S（ρ， ρs），并在 S1 附录中说明。
4.2 基于密度的力的多重时间步长
为了提高计算效率，基于密度的力仅每N施加一次适合步骤。施加的力按 N 缩放适合近似于每一步施加力时的有效哈密顿量，同时保持时间可逆性和能量守恒[32，33]。最大时间步长不应超过映射电位内任何原子的最快振荡周期除以π。该振荡周期取决于参考密度的选择、相似性测量和力常数，因此已通过启发式估算。
4.3 自适应力缩放
自适应力常数缩放在相似性增加因子 1 + α 时降低力常数，α> 0，并在相似性降低时反向增加因子 1 + 2α。增加大于减少因子强制相似性随时间增加。
为了避免力常数的虚假快速变化，通过比较指数移动平均线的相似性得分来确定相似性的减少和增加。仿真时间尺度通过设置耦合到自适应力缩放协议，其中Δt是模拟的最小时间增量步长，τ确定耦合的时间尺度。
这种自适应力缩放协议可确保密度数据在仿真过程中的影响越来越大，最终主导力场。当系统上的整体力太大而无法与积分时间步长兼容时，具有自适应力缩放的仿真将终止。
4.4 将精细结构与手动构建模型进行比较
所有重原子坐标（不包括氢原子）的均方根偏差（RMSD）使用绝对位置而不叠加作为结构，因为冷冻电镜密度提供了绝对参考系。这是使用旋转和平移对齐计算的细化模型和平移模型之间的 RMSD 值上限。
4.5 精细结构与冷冻电镜密度的比较
傅里叶壳相关曲线和未加权傅里叶壳相关平均值 [27] 是通过使用 4.0 ? 的高斯σ从模型结构生成密度，以 45 ps 的间隔计算轨迹期间结构的傅里叶壳相关曲线和未加权傅里叶壳相关平均值 [2]，对应于 EMAN24 [2] 至 <>? 中定义的分辨率。
4.6 细化前的地图和模型准备
4.6.1 螺旋。
在2 ?体素网格上以1?模拟分辨率的无噪声螺旋密度图是从使用嵌合体提供的“molmap”的原子模型生成的[34]。从螺旋模型的平衡模拟中获取的两个帧被用作后续密度引导细化的起始模型。
4.6.2 醛缩酶。
使用精确尺寸的模拟盒作为醛缩酶密度图EMD-21023。相应的醛缩酶模型（PDB id 6V20）被视为RMSD计算的基本事实。先前确定的X射线模型（PDB id 6ALD）用作起始结构。该系统在安装前经过了能量最小化。模拟中没有使用对称约束。
4.6.3 格罗埃尔。
GroEL的密度引导模拟是在单个低聚物内的构象状态之间进行的[28]。状态 1（PDB id 5W0S（1））用作起始模型并拟合构象状态 3（EMD-8750，附加映射 3）。使用对应于单个低聚物的密度图的一部分作为目标。目标图是使用ChimeraX [35]创建的，并且包括先前确定的对应于状态5（PDB id 3W5S（0））的模型的3 ?范围内的任何体积数据。目标密度在地图中居中，并使用relion图像处理程序将地图大小设置为1003[36]。
4.7 扭曲模型的生成
为了产生扭曲的起始模型，将醛缩酶蛋白X射线在433 ns的时间内加热至5 K。在加热过程中，使用Berendsen气压器控制压力，有利于模拟稳定性而不是热力学考虑。为了解开降低温度和拟合的影响，在开始具有上述相同协议的密度引导模拟之前，将扭曲的结构在5 K下进行300 ns的平衡。
4.8 分子动力学模拟
所有模拟均使用 GROMACS 版本 2021.3 [29] 和 CHARMM27 力场 [37， 38] 在 NPT 和 NVT 集合中进行，并在 150 mM NaCl 溶液中具有中和的全原子系统。当结构与冷冻电镜密度非常不同（即远离平衡）时，使用速度重标恒温器以0.2 ps的耦合频率调节温度，以确保快速耗散基于密度的电位中的多余能量。使用Parinello-Rahman气压恒温器控制压力以进行醛缩酶模拟，在恒定体积下进行螺旋模拟。醛缩酶和GroEL通过将它们的几何中心放在冷冻电镜密度盒的中心，大致与密度对齐。密度引导模拟的力每N个施加一次适合= 根据上述方案的10步[33]。所有针对密度优化结构的模拟都是通过自适应力缩放进行的。我们使用τ = 4 ps的耦合常数，平衡结果的时间与结构松弛的时间。对于醛缩酶模拟，高斯扩散宽度是通过使用最高估计局部分辨率 1.83 ? 的下限来确定的。GroEl 模拟的扩散宽度设置为 1.0455?，基于用于优化的地图中的 1.23? 体素大小。周期性边界条件的处理方式如 S1 附录中所述。所有仿真设置参数和工作流程均已提供。
支持信息
精炼潜力的推导。
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支持信息 S1 附录温和快速的全原子模型细化为冷冻电镜通过最大似然法的密度克里斯蒂安·布劳、琳妮娅·伊冯内斯多特、埃里克·林达尔** erik.lindahl@dbb.su.se1 潜在的衍生细节1.1 从泊松噪声推导相对熵势假设通过使用玻尔兹曼反演来计算总可能性.logp(ρ|ρs(~x)) =?1kBTU适合(~x，ρ) +c.(1)以及电子在体素中独立散射的假设p(ρ|ρs(~x)) =∏v∈体素p(ρv|ρsv)(2).logp(ρ|ρs(~x)) =∑v∈体素.logp(ρv|ρsv),(3)以及每个体素中具有分布参数的泊松分布泊斯（Nρsv，rρv),哪里rρv=: ?ρv表示交互计数，p(ρv|ρsv) = (Nρsv)?ρvexp（?Nρsv)/?ρv!(4).logp(ρv|ρsv) = ?ρv日志 （Nρsv)?Nρsv?日志（ ?ρv!).(5)我们得到对数似然.logp(ρ|ρs(~x)) =∑v∈体素?Nρsv+ ?ρv.logN+ ?ρv.logρsv?日志 ?ρv!.(6)与斯特林近似日志 ?ρv!≈?ρv日志 ?ρv??ρv若?ρv足够了大，这简化为.logp(ρ|ρs) =?∑v∈体素Nρsv+∑v∈体素?ρv（日志N+ 1) +∑v∈体素?ρv.logρsv??ρv日志 ?ρv(7)1
根据等式（1），相似性分数可以重新调整为一个常数，该常数表示术语∑v?ρv（日志N+ 1)不依赖于模型坐标可能从等式（7）的右侧掉落。当总和的电子散射概率是恒定的，例如，当从下面使用的高斯之和，总和∑vNρsv也是恒定的。有了这个重新我们获得的测量.logp(ρ|ρs(~x)) =∑v∈体素?ρv.logρsv?ρv+ 常量.(8)1.1.1 条件后验缩放参数r对于上面的模拟密度可以从一组估计坐标为p(r|~x，ρ)∝1r经验(∑vrρv.logρsv(~x)rρv)(9)1.2 交换相对熵势的推导狄利克雷分布假设为了从正文中的方程（5）推导出拟合电位，我们应用了.log,.logp我(ρ|~x，s） = 日志Γ(∑vsρsv)?∑v日志Γ （sρvs) +∑v(sρsv?1） 日志ρv,(10)并利用我们将模拟密度归一化为统一的事实，∑vρsv= 1,.logp我(ρ|~x，s) =s∑vρsv.logρv?∑v.logρv?∑v日志Γ （sρvs),(11)使用斯特林的系列，.logp我(ρ|~x，s)≈s∑vρsv.logρv?∑v.logρv?∑v(12日志（2π) +(sρvs?12).logsρvs?sρvs),(12)跳过所有常量项，因为潜力可以任意转移，我们获得.logp我(ρ|~x，s)≈s∑vρsv.logρv?∑v((sρvs?12).logsρvs),(13)我们假设第二个总和的变化小于第一个总和，这是有保证的当衍生物.logp我在所有体素v关于ρsv第一个较小召唤比第二个，.logρv>日志（sρsv) + 1?12sρsv(14)ρv> sρsv经验(1?12sρsv).(15)2
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S1 附录。 精炼潜力的推导。
从泊松噪声假设、网格散射假设、模型密度梯度和相似性度量定义推导出相对熵度量。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011255.s001
（英文）
S1 表。 散射截面。
生物分子中常见原子在150keV时的散射振幅，来自参考文献[31]中的附录C。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011255.s002
（英文）
S2 表。 对齐螺旋接头。
最后一帧处的重原子RMSD [?]与产生密度的构象相比。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011255.s003
（英文）
S3 表。 未对齐的螺旋拟合。
最后一帧处的重原子RMSD [?]与产生密度的构象相比。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011255.s004
（英文）
S4 表。 醛缩酶拟合。
来自最终仿真帧的重原子 RMSD [?]，与 PDB id 6V20 相比。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011255.s005
（英文）
S5 表。 醛缩酶模型统计。
使用Phenix-1.18.2–3874计算的属性，使用molprobity，CABLAM和EMRinger方法。所有数据都反映最终帧，无需任何进一步的几何优化。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011255.s006
（英文）
S6 表。 格罗埃尔配件。
来自最终模拟帧的重原子 RMSD [?]，与 PDB id 3W5S 的构象状态 0 相比。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011255.s007
（英文）
S7 表。 格罗埃尔模型统计。
使用Phenix-1.18.2–3874计算的属性，使用molprobity，CABLAM和EMRinger方法。所有数据都反映最终帧，无需任何进一步的几何优化。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011255.s008
（英文）
S1 图 自适应力常数变化。
内积（紫色）、互相关（赭石）、相对熵（绿色）和相对熵交换（蓝色）对齐螺旋细化过程中力常数（任意单位）的演变。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011255.s009
（英文）
S2 图 对齐螺旋拟合的最终结果。
使用内积、互相关、相对熵交换和相对熵（从上到下排序）从对齐的起始构象的自适应力缩放进行模拟。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011255.s010
（英文）
S3 图 未对齐螺旋拟合的最终结果。
使用内积、互相关、相对熵交换和相对熵（从上到下排序）从对齐的起始构象的自适应力缩放进行模拟。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011255.s011
（英文）
S4 图 醛缩酶细化。
基于细化最终帧（实心）的内积（紫色）、互相关（赭石）、交换相对熵（蓝色）和相对熵（绿色）的FSC与沉积醛缩酶模型的差异。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011255.s012
（英文）
S5 图 格罗埃尔亚基细化。
基于细化最终帧（实心）的内积（紫色）、互相关（赭石）、交换相对熵（蓝色）和相对熵（绿色）的FSC与沉积GroEL模型的差异。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011255.s013
（英文）
S6 图 相对熵可能对额外的密度敏感。
基于相对熵的细化（蓝-红，根据 RMSD 到已发布的模型）在地图中存在额外密度的区域可能会挣扎，而基于互相关的势（赭石）则遵循由密度定义的局部最小值。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011255.s014
（提夫）
S7 图 从扭曲的结构中细化醛缩酶。
FSC与手动构建的基于内积（紫色），互相关（赭色），相对熵交换（深蓝色）和相对熵（绿色）的细化与最佳接受的FSC（点状）和最终FSC（实心）的模型的差异。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011255.s015
（英文）
确认
我们要感谢Rebecca J. Howard和Marta Carroni对手稿的深刻讨论。
引用
1.单粒子冷冻电镜——它是如何到达这里的，它将走向何方。科学。2018;361(6405):876–880.密码：30166484
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
2.Yip KM， Fischer N， Paknia E， Chari A， Stark H. 通过冷冻电镜测定原子分辨率蛋白质结构。自然界。2020;587(7832):157–161.pmid：33087927
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
3.Nakane T， Kotecha A， Sente A， McMullan G， Masiulis S， Brown PM， et al.原子分辨率的单粒子冷冻电镜。自然界。2020;587(7832):152–156.密码：33087931
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
4.Scheres SH. RELION：实施贝叶斯方法进行冷冻电镜结构测定。结构生物学杂志。2012;180(3):519–530.密码：23000701
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
5.Alnabati E，Kihara D.冷冻电子显微镜图的结构建模方法的进展。分子。2020;25(1):82.
查看文章谷歌学术搜索
6.博克， 布劳 C， 施罗德 GF， 达维多夫二世， 菲舍尔 N， 斯塔克 H， 等.tRNA通过核糖体易位的能量屏障和驱动力。自然结构与分子生物学。2013;20(12):1390–1396.密码：24186064
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
7.Eswar N， Webb B， Marti-Renom MA， Madhusudhan M， Eramian D， Shen My， et al.使用Modeller进行比较蛋白质结构建模。生物信息学中的当前协议。2006;15(1):5–6.密码：18428767
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
8.Topf M，Lasker K，Webb B，Wolfson H，Chiu W，Sali A.由冷冻电镜密度指导的蛋白质结构拟合和细化。结构。2008;16(2):295–307.密码：18275820
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
9.Kim DN， Moriarty NW， Kirmizialtin S， Afonine PV， Poon B， Sobolev OV， et al.Cryo_fit：冷冻电镜柔性接头的民主化。结构生物学杂志。2019;208(1):1–6.pmid：31279069
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
10.Liebschner D， Afonine PV， Baker ML， Bunkóczi G， Chen VB， Croll TI， et al.使用X射线，中子和电子测定大分子结构：Phenix的最新发展。晶体学报D部分：结构生物学。2019;75(10):861–877.pmid：31588918
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
11.Igaev M，Kutzner C，Bock LV，Vaiana AC，Grubmüller H.使用相关驱动的分子动力学自动冷冻电镜结构细化。生活。2019;8：e43542.密码：30829573
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
12.Trabuco LG，Villa E，Mitra K，Frank J，Schulten K.使用分子动力学将原子结构灵活拟合到电子显微镜图中。结构。2008;16(5):673–683.密码：18462672
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
13.Ahmed A， Whitford PC， Sanbonmatsu KY， Tama F. 柔性拟合方法之间的共识改善了冷冻电镜数据的解释。结构生物学杂志。2012;177(2):561–570.pmid：22019767
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
14.王孜， 施罗德.使用 DireX 进行真实空间细化：从全局装配到侧链改进。生物聚合物。2012;97(9):687–697.密码：22696405
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
15.Singharoy A， Teo I， McGreevy R， Stone JE， Zhao J， Schulten K. 基于分子动力学的亚5 ?冷冻电子显微镜图谱的细化和验证。生活。2016;5：e16105.密码：27383269
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
16.宫下O，小林C，森T，杉田Y，多摩F.使用集成分子动力学模拟灵活拟合冷冻电镜密度图。计算化学学报.2017;38(16):1447–1461.密码：28370077
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
17.具有冷冻电镜图的生物分子组件的Habeck M. Bayesian建模。分子生物科学前沿。2017;4:15.pmid：28382301
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
18.Bonomi M， Hanot S， Greenberg CH， Sali A， Nilges M， Vendruscolo M， et al.电子冷冻显微镜数据的贝叶斯称量，用于综合结构建模。结构。2019;27(1):175–188.密码：30393052
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
19.Cossio P，Rohr D，Baruffa F，Rampp M，Lindenstruth V，Hummer G. BioEM：电子显微镜图像贝叶斯推理的GPU加速计算。计算机物理通信。2017;210:163–171.
查看文章谷歌学术搜索
20.Páll S， Zhmurov A， Bauer P， Abraham M， Lundborg M， Gray A， et al.GROMACS中分子动力学模拟的异构并行化和加速。化学物理学杂志 2020;153：134110.密码：33032406
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
21.杰恩斯·信息论和统计力学。身体检查。1957;106(4):620.
查看文章谷歌学术搜索
22.程 Y， 格里戈里耶夫 N， 彭切克 PA， 沃尔兹 T.单粒子冷冻电子显微镜的入门。细胞。2015;161(3):438–449.pmid：25910204
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
23.悍马G，科芬格J.贝叶斯集合通过复制模拟和重新加权进行细化。化学物理学报.2015;143（24）：12B634_1.密码：26723635
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
24.Tang G， Peng L， Baldwin PR， Mann DS， Jiang W， Rees I， et al. EMAN2：用于电子显微镜的可扩展图像处理套件。结构生物学杂志。2007;157(1):38–46.密码：16859925
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
25.Choi KH， Mazurkie AS， Morris AJ， Utheza D， Tolan DR， Allen KN. 果糖-1，6-双（磷酸）醛缩酶配体的结构在 2.3 ? 的切割缺陷突变体中配体到其天然底物上。 生物化学。1999;38(39):12655–12664.密码：10504235
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
26.Wu M， Lander GC， Herzik MA Jr. Sub-2 Angstrom 分辨率结构测定使用单颗粒冷冻电镜在 200 keV 下测定。结构生物学杂志： X. 2020;4：100020.pmid：32647824
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
27.Brown A， Long F， Nicholls RA， Toots J， Emsley P， Murshudov G. 用于构建大分子模型和细化为电子冷冻显微镜重建的工具。晶体学报D部分：生物晶体学。2015;71(1):136–153.密码：25615868
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
28.Roh SH， Hryc CF， Jeong HH， Fei X， Jakana J， Lorimer GH， et al.通过冷冻电镜分离的单个 GroEL 低聚物内的亚基构象变化。美国国家科学院院刊.2017;114(31):8259–8264.pmid：28710336
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
29.Páll S， Zhmurov A， Bauer P， Abraham M， Lundborg M， Gray A， et al.GROMACS中分子动力学模拟的异构并行化和加速。化学物理学报.2020;153(13):134110.密码：33032406
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
30.格林加德 L， 李 JY.加速非均匀快速傅里叶变换。暹罗审查。2004;46(3):443–454.
查看文章谷歌学术搜索
31.柯克兰·电子显微镜中的高级计算。斯普林格;1998.
32.Leimkuhler BJ， Reich S， Skeel RD. 分子动力学的积分方法.在：生物分子结构和动力学的数学方法。斯普林格;1996.第161–185页。
33.Ferrarotti MJ， Bottaro S， Pérez-Villa A， Bussi G. 偏置分子模拟中的精确多时间步长。化学理论与计算学报.2015;11(1):139–146.pmid：26574212
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
34.Pettersen EF， Goddard TD， Huang CC， Couch GS， Greenblatt DM， Meng EC， et al. UCSF Chimera——用于探索性研究和分析的可视化系统。计算化学学报.2004;25(13):1605–1612.密码：15264254
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
35.Pettersen EF， Goddard TD， Huang CC， Meng EC， Couch GS， Croll TI， et al. UCSF ChimeraX：面向研究人员、教育工作者和开发人员的结构可视化。蛋白质科学。2021;30(1):70–82.pmid：32881101
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
36.Zivanov J， Nakane T， Forsberg BO， Kimanius D， Hagen WJ， Lindahl E， et al.用于在RELION-3中自动测定高分辨率冷冻电镜结构的新工具。elife.2018;7：e42166.密码：30412051
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
37.小鲭鱼，费格·扩展蛋白质力场中骨架能量学的处理：气相量子力学在分子动力学模拟中再现蛋白质构象分布的局限性。计算化学学报.2004;25(11):1400–1415.密码：15185334
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38.Bjelkmar P，Larsson P，Cuendet MA，Hess B，Lindahl E.CHARMM力场在GROMACS中的实现：分析来自校正图，虚拟相互作用位点和水模型的蛋白质稳定性效应。化学理论与计算学报.2010;6(2):459–466.密码：26617301
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