免费医学论文-通过靶向Zbtb7a促进多房棘球蚴感染诱导的肝星状细胞活化和肝纤维化

抽象

肝纤维化是多房棘球蚴感染期间的组织病理学特征之一。肝星状细胞（HSC）的活化是肝纤维化发展的关键事件。然而，HSC活化的分子机制在E.多房感染诱发的肝纤维化在很大程度上仍不清楚。在这里，我们报道了mmu-miR-342-3p在HSC中最主要表达，并且在HSC中响应E而上调。多房感染。我们进一步表明mmu-miR-342-3p能够与Zbtb3a基因的7' UTR结合并调节其表达。此外，MMU-miR-342-3p在HSCs中的表达与其靶基因Zbtb7a呈负相关。多房感染。敲低mmu-miR-342-3p在体外促进了Gfap在活化的HSC中的表达。在E.多房感染小鼠，敲低mmu-miR-342-3p抑制α-Sma，Col1α1和TGF-β的表达，但促进Gfap的表达。因此，mmu-miR-342-3p是HSCs激活的关键调节因子，抑制mmu-miR-342-3p促进活化HSC中Zbtb7a介导的TGF-β信号传导可能是治疗E诱导肝纤维化的新策略。多房。

作者摘要

肝纤维化是多房棘球蚴感染期间的组织病理学特征之一。肝星状细胞（HSC）的活化是肝纤维化发展的关键事件。然而，HSC活化在肝纤维化的分子机制E.多房感染在很大程度上仍然未知。近年来，越来越多的证据表明miRNA的异常表达与肝纤维化的发生和发展密切相关。E诱导的肝纤维化中miRNA的表达谱。多房感染已被广泛描述，但miRNA在肝纤维化中的作用在很大程度上尚未得到探索。在本文中，我们在E诱导的活化HSC中鉴定了一组差异表达的miRNA。多房，mmu-miR-342-3p主要在造血干细胞中表达。本研究标志着mmu-miR-342-3p在HSC激活中的重要作用，这将有助于我们更好地了解E诱导肝纤维化的机制。多房感染。

数字

Fig 4Fig 5Fig 6图1图2图3Fig 4Fig 5Fig 6图1图2图3

引文： 曹淑， 王丹， 吴毅， 张杰， 蒲林， 罗旭， 等. （2023） mmu-miRNA-342-3p通过靶向Zbtb7a促进多房棘球蚴感染诱导的肝星状细胞活化和肝纤维化。公共科学图书馆 Negl Trop Dis 17（7）： e0011520. https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0011520

编辑 器： 乌列尔·科齐奥尔，乌拉圭共和国大学：乌拉圭共和国大学，乌拉圭

收到： 24月 2022， 8;接受： 七月 2023， 25;发表： 2023月 <>， <>

版权所有： ? 2023 曹等这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。

数据可用性： 所有相关数据都在论文及其支持信息文件中。

资金： 该研究得到了国家重点研发计划（2022YFD1800200）和国家自然科学基金（32273031）对XG，浙江农林大学科学研究与开发人才基金（2021LFR038）对YZ的资助，以及动物疾病预防控制国家重点实验室（SKLVEB2020KFKT004）对XZ的资助。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。

竞争利益： 提交人声明不存在相互竞争的利益。

介绍

AE是一种严重的人畜共患寄生虫病，其特征是多房棘球蚴持续浸润性肿瘤样侵袭性生长[1]。人类偶尔会因摄入受污染的食物或水中的卵而感染。AE主要分布在我国西北地区半农半牧区，严重威胁当地群众健康[2-4]。

肝纤维化是一种动态病理过程，其特征是寄生虫肝病进展过程中细胞外基质（ECM）过度沉积[5]。曼氏血吸虫和日本血吸虫释放的虫卵主要沉积在门脉周围区域，引起肉芽肿性反应并引起严重的病理性肝纤维化[6]。棘球蚴寄生虫诱导肝组织内免疫应答失衡，导致肝结构扭曲和纤维化发展[7]。由此导致的肝纤维化可能与棘球蚴病的严重病理有关，伴有肉芽肿形成、胶原蓄积和炎症[8，9]。随着感染期的延长，肝损伤和纤维化的严重程度逐渐加重[7，10]。众所周知，肝星状细胞（HSC）的活化与肝纤维化的发生和发展有关，并且在许多肝脏疾病中得到了很好的研究[11-13]。在肝损伤时，静止的HSC被激活并转分化为肌成纤维细胞样细胞，其分泌大量的ECM。多房埃希菌感染也可诱导HSC的激活，HSCs表达高水平的α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、Vimentin和胶原蛋白I（Col1α1）[14，15]，但其机制尚不清楚。

MicroRNA（miRNA）是一类内源性非编码小RNA，长度为20-24 nt[16]。MiRNA通常与靶基因的3'非翻译区（UTR）结合并抑制其翻译或促进降解。越来越多的证据表明，miRNA在许多感染性肝病中起重要作用，例如病毒性、细菌性肝炎和寄生虫性肝炎[17，18]。miRNA的异常表达与肝纤维化的发生和发展密切相关。大量miRNA已被提出作为纤维化进展的预测因子[19，20]。E诱导肝纤维化的miRNA表达谱。多房感染已被广泛描述[21，22]，但miRNA在肝纤维化中的作用在很大程度上尚未得到探索。在本文中，我们在E诱导的活化HSC中鉴定了一组差异表达的miRNA。多房，mmu-miR-342-3p主要在造血干细胞中表达。我们研究了mmu-miR-342-3p在HSC激活中的作用，这将有助于我们更好地了解E诱导肝纤维化的机制。多房感染。

材料和方法

道德声明

研究中的动物实验由中国农业科学院兰州兽医研究所伦理委员会评估批准，并按照动物伦理程序良好动物规范进行。

寄生虫感染

将四周龄BALB / c小鼠（n = 160）随机分为两组。一组（n = 80）腹膜内注射600E。多房原头节，如前所述，从我们实验室感染小鼠的包虫囊肿中获得[23]。另一个（n = 80）接种0.9%盐水溶液作为未感染组。高脂饮食诱导小鼠从武汉服务生物科技有限公司订购。

组织学评估和免疫组织化学染色

将未感染（n = 3）和感染小鼠（n = 3）的肝组织样品固定在4%多聚甲醛中，脱水并包埋在石蜡中。将样品切成5μm切片，并用苏木精和伊红，Masson的三色和天狼星红染色进行。对于天狼星红染色，将切片在Picro-Sirus Red溶液（Abcam）中孵育60分钟，然后在乙酸溶液和无水酒精中快速洗涤两次。这些图像是使用光学显微镜拍摄的（德国蔡司）。测量从每只动物三个不同肝叶的15个随机20×场拍摄的图像。通过使用ImageJ的颜色阈值分割方法测量胶原蛋白沉积量。

根据以下方案进行免疫组织化学染色。简而言之，这些切片在二甲苯中脱石蜡并在分级醇中再水化。在0.01M柠檬酸钠缓冲液中抗原修复后，将组织载玻片与3%过氧化氢孵育5分钟以阻断内源性过氧化物酶活性。在TBST中用5%BSA封闭切片，然后与α-SMA抗体（1：200，Servicebio）一起孵育。洗涤后，将切片与抗兔二抗（1：1000，SeraCare）在1°C下孵育37小时。 最后，利用DAB底物试剂盒（Servicebio）开发信号，并用苏木精（Servicebio）对切片进行染色。这些图像是在光学显微镜下拍摄的（德国蔡司）。测量从每只动物三个不同肝叶的15个随机20×场拍摄的图像。使用ImageJ测量α-SMA阳性细胞的量。

HSC的分离、培养和转染

如前所述，通过胶原酶IV灌注从未感染（n=6）和感染（n=6）小鼠肝脏中分离原发性HSC，然后如前所述密度梯度离心[24]。简而言之，肝脏在0°C下以09mL / min的流速灌注肝脏5分钟，然后在42°C下以2mL / min的流速灌注含有0.04%胶原酶的酶缓冲液5分钟IV。切除消化的肝脏，并在含有42.6%胶原酶IV和80%DNase的0mL酶缓冲液中在08°C下进行体外消化1分钟。将细胞通过尼龙过滤器（37μm）并在30°C下以70g离心50分钟。将上清液以4g离心4分钟，用Gey平衡盐溶液（GBSS）在600°C下以10g洗涤沉淀500分钟，以获得非实质细胞（NPC）。将NPC重悬于4 mL GBSS中，并轻轻涂覆不同浓度的Optiprep溶液，上层为5 mL 5.8%Optiprep，下层为11 mL 5% Optiprep，并在4°C下以20，1 ×g不间断离心400分钟。将上层细胞（HSC）转移到试管中并用GBSS洗涤三次。将细胞在含有4%FBS的DMEM培养基中培养用于后续实验。

为了进一步验证，我们首先使用HSC标记物（Glail原纤维酸性蛋白，GFAP）进行了流式细胞术分析。接下来，使用荧光显微镜在328nm的波长下检测分离的原发性HSC中的维生素A脂质液滴自发荧光（德国蔡司）。第三，HSC（α-SMA，GFAP和Col1α1），肝细胞（白蛋白，Alb;通过qRT-PCR测定细胞角蛋白18，CK18）和巨噬细胞（含有EGF样模块的粘蛋白样激素受体样1，Emr1）。

在含有10%FBS的DMEM培养基中培养原代HSC，并进行转染实验（分离后5天）。造血干细胞 （5 × 105每孔细胞）接种到12孔板中，并使用脂质菌胺RNAiMAX转染试剂（Invitrogen）转染50 nM mmu-miR-342-3p抑制剂或50 nM阴性对照（NC）（Ambion/Invitrogen）。转染10小时后，用补充有10%FBS的新鲜DMEM培养基替换培养基。每次转染独立重复三次。

鉴定差异表达的已知miRNA

E.采用高通量测序法研究多房感染[25]。随后生成原始读取，这些读取以入藏号PRJNA732233存放在NCBI序列读取存档（SRA）中。根据先前报道的方法对原始测序数据进行处理，并进行一些修改。简而言之，在去除具有低质量和衔接序列的读段后，将干净的读段映射到小鼠基因组的完整注释基因组（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/genomes/52）。之后，所有映射的读段都用于鉴定miRNA（miRBase，http://www.mirbase.org/index.shtml）。采用DESeq R包（1.8.3）分析<>组miRNA的相对表达水平，鉴定感染后不同时间点未感染组和感染组之间差异表达的miRNA。

随后生成原始读取，这些读取以入藏号PRJNA732233存放在NCBI序列读取存档（SRA）中。鉴定未感染组和感染组在感染后不同时间点的差异表达miRNA。

定量逆转录聚合酶链反应分析

为了检查miRNA的表达，使用一体化miRNA第一链cDNA合成试剂盒（GeneCopoia）合成第一链cDNA，并选择U6 snRNA作为内源性对照。为了检查mRNA表达，使用RevertAid第一链cDNA合成试剂盒（Invitrogen）合成第一链cDNA，并选择GAPDH作为内源性参考基因。将cDNA混合物用无核酸酶水稀释5倍。使用7500实时荧光定量PCR系统（应用生物系统）在以下条件下使用多合一qPCR混合物（GeneCopoeia）进行定量RT-PCR：95°C持续10分钟，然后40次95°C循环10秒，60°C持续1分钟。所有引物均购自GeneCopoeia（S1文本中的表A）。使用2-ΔΔCt公式。统计分析数据取自三个独立实验。

质粒构建和荧光素酶测定

使用一对引物扩增锌指和含BTB结构域的3A（Zbtb7a）基因的7'UTR片段：5'-GAGCTCGGTGAATTTGCGTGT-3'和5'-GTCGACCCTGTGTCCCTCCTA-3'（限制性内切酶位点下划线）。将PCR产物克隆到PmirGLO双荧光素酶载体（美国Promega）中，并通过测序确认，命名为WT-Zbtb7a。人工合成了具有结合位点突变的Zbtb3a的7'UTR（中国桑贡），克隆到PmirGLO双荧光素酶载体中并通过测序确认，命名为Mut-Zbtb7a。

HEK293T细胞（1×105每孔细胞）接种到24孔板中，并使用Lipofectamine 1（赛默飞世尔科技）转染7μgWT-Zbtb7a或Mut-Zbtb30a与342 pmol的mmu-miR-3-2000p模拟物或NC模拟物组合。在转染后24小时，使用双Glo荧光素酶测定系统（Promega）通过GloMax 96微孔板光度计（Promega）测量Renilla和萤火虫荧光素酶活性。每次转染独立重复三次。

蛋白质印迹

使用补充有蛋白酶抑制剂（Sigma）的RIPA缓冲液（赛默飞世尔科技）从细胞中分离总蛋白。使用BCA蛋白质测定试剂盒（赛默飞世尔科技）测量总蛋白质的浓度。通过SDS-PAGE分离总共50μg蛋白质并转移到PVDF膜（密理博）上。随后，在TBST中用5%BSA封闭膜，然后与Zbtb7a抗体（1：500，BBI）在4°C孵育过夜。洗涤后，将膜与抗兔二抗（1：1000，Abcam）在室温下孵育1小时，然后加入Pierce ECL蛋白质印迹底物（赛默飞世尔科技）。使用化学发光检测系统（G-Box，Syngene）记录发光。

体内研究

壳聚糖（CS）-miRNA纳米颗粒根据先前描述的方法制备，并进行微小修改[26]。简而言之，将95%脱乙酰化的CS溶解在乙酸溶液（2.0 mg / mL，调节至pH 5.5）中。使用三聚磷酸钠溶液（TPP;2.0 mg/mL）作为交联剂。为了制备CS-miRNA纳米颗粒，将含有250nmol miRNA抑制剂的3 μLTPP溶液逐滴添加到2.5 mL CS溶液中，并将所得溶液在室温下保持30分钟。

八E.将多房感染小鼠随机分为两组，分别通过尾静脉注射100μLCS-NC纳米颗粒（CSNP-NC）或CS-mmu-miR-342-3p抑制剂纳米颗粒（CSNP-抑制剂）。40小时后，人道地杀死小鼠并收集肝脏以供进一步使用。

统计分析

所有统计分析均使用GraphPad Prism 8（美国拉霍亚）进行，并使用两组的双尾不配对t检验和三组的方差分析比较差异。p < 0.05 被认为具有统计学意义。

结果

E期间HSC的激活和肝纤维化。多房感染

使用苏木精和伊红、马森三色和天狼星红染色进行的组织病理学分析显示，E肝脏中metacetodes周围的胶原蛋白过度沉积。多房感染小鼠，高于对照小鼠和高脂肪饮食诱导小鼠（图1A和S1）。α-SMA免疫染色结果显示，肌成纤维细胞造血干细胞（MF-HSCs）主要分布在E.多房感染小鼠周围的metacestodes（图2A）。E肝脏中MF-HSC（α-SMA阳性细胞）和巨噬细胞（Emr1阳性细胞）的比例。多房感染小鼠高于未感染组，而肝细胞（CK18阳性细胞）显着减少（图2B和S2）。评估E.多房感染 在HSC激活时，分离原发HSC，并检查HSC生物标志物的表达。流式细胞术分析表明，分离的HSC约占90%（图2D），并表现出醒目的蓝色自发荧光（图2C）。此外，高度表达三种HSC生物标志物（由α-SMA，GFAP和Col1α1测定）的分离HSC减少了肝细胞（由Alb和CK18测定）和巨噬细胞（由Emr1测定）的污染（S3图）。正如预期的那样，与未感染组相比，感染后1天、1天、30天，α-Sma、Col60α90和Vimentin的表达显著上调（图2E）。在E的HSC中观察到蛋白质水平上α-Sma的表达增加。多房感染小鼠感染后30天，60天和90天（图2F）。这些结果表明，肝纤维化和HSC活化是对E的反应。多房感染。

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图1. E.多房感染对小鼠肝纤维化的影响。

（A）苏木精和伊红（H&E），Masson's Trichrome和Picrosirius Red染色用于对照小鼠，高脂肪饮食诱导小鼠和E的肝纤维化的代表性图片。多房感染小鼠。箭头表示囊肿。（B） 通过使用 ImageJ 进行基于颜色阈值的分割，在 Masson 的三色或皮克罗天狼星红色染色切片中量化双折射胶原蛋白含量。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0011520.g001

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图2. E诱导的HSCs的激活。多房感染。

（A）E肝脏中α-SMA免疫荧光染色的代表性图片。多房感染和未感染的小鼠。箭头表示囊肿。（B）E肝脏中α-SMA阳性细胞的定量。多房感染和未感染的小鼠。（C）使用荧光显微镜在328nm的波长下检测分离的原代HSC中的维生素A脂质液滴自发荧光。（D）使用Gfap对分离的小鼠HSC进行流式细胞术分析。（E）α E的HSCsma，col1α1和vimentin在HSC中的表达。通过qRT-PCR感染后30天，60天和90天（dpi）感染多房的小鼠。（F）来自E的HSCs中α-SMA的表达。通过蛋白质印迹感染后30天，60天和90天（DPI）感染多房感染小鼠。最终统计分析的数据取自3个独立实验。*p <0.05， **p < 0.01， ****p < 0.001.

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0011520.g002

E期间HSC中mmu-miR-342-3p的失调。多房感染

考虑到miRNA在HSC活化中的重要作用，我们最近表征了E期间肝细胞（HCs），Kupffer细胞（KCs）和HSCs中lncRNA-miRNA-mRNAs的全球分析。多房感染[27]。我们发现49和67个miRNA分别在感染后60天和90天的HSC中差异表达（S1文本中的表B和C）。其中，33个是共享的（图3A）。KEGG通路分析表明，这些miRNA的靶基因主要参与癌症通路、河马信号通路、TGF-β信号通路和PI3K-Akt信号通路（图3B）。在这些差异表达的miRNA中，mmu-miR-342-3p在HSCs中主要表达，而在HCs和KCs中表达（p < 0.001，图3C）。因此，我们分析了mmu-miR-342-3p在感染后不同时间点在HSC中的动态表达。qRT-PCR分析表明，mmu-miR-342-3p的表达在E的HSCs中显着上调。多房感染小鼠感染后30天和60天，而其表达在感染后90天降低（p <0.001，图3D）。

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图3. E期间肝脏HSC中mmu-miR-342-3p的失调。多房感染。

（A）来自E的两个肝脏HSC之间差异表达的miRNA的火山图。感染后60天和90天（dpi）的多房感染小鼠，其中红色和绿色分别表示显着上调miRNA（向上）和下调miRNA（向下）。（B）靶基因的KEGG通路富集分析。（C）mmu-miR-342-3p在肝细胞（HCs），Kupffer细胞（KCs）和肝星状细胞（HSCs）中的表达。（D）来自E的肝脏HSC中mmu-miR-342-3p的表达。感染后30天，60天和90天（DPI）的多房感染小鼠。在每个采样时间点使用未感染的小鼠作为对照。最终统计分析的数据取自3个独立实验。<0.001。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0011520.g003

培养活化造血干细胞中mmu-miR-342-3p的上调

由于已知初级HSC在培养过程中被激活[28]，因此将静止HSC分离并在塑料平板中培养9天。正如预期的那样，与第1天相比，α-Sma和Col1α9的表达在第0天显着上调，而HSC静止的生物标志物Gfap的表达显着下调（p < 0.01，图4A）。免疫荧光染色一致地显示α-SMA蛋白在培养活化的HSC中高表达（第9天），表明原代HSC被激活（图4B）。接下来，我们评估了培养激活的HSC中mmu-miR-342-3p的表达是否发生了变化。我们发现，与第9天相比，它在第0天显着上调（图4C）。结果表明，mmu-miR-342-3p可能参与HSC激活。

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图4. 培养活化造血干细胞中mmu-miR-342-3p的上调。

（A）体外培养激活的HSC中α-SMA，Col1α1，Gfap的qRT-PCR分析。 （B）体外培养激活的HSC中α-SMA的免疫荧光染色。 比例尺 = 50 μm （C）mmu-miR-342-3p在体外培养激活的HSC中的表达。 最终统计分析的数据取自3个独立实验。**p < 0.01， ***p < 0.001。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0011520.g004

mmu-miR-7-342p通过直接结合其3′UTR抑制Zbtb3a

确定mmu-miR-342-3p在E过程中HSC活化中的潜在作用。多房感染，其潜在靶点通过TargetScan，PicTar和 miRNA.org 进行识别。共筛选出14个共同的靶标，主要参与细胞周期、细胞分化、细胞增殖和肿瘤发生（S1文本中的表D）。在这些候选物中，首先选择Zbtb7a进行下游分析，其中含有MMU-miR-342-3p的推定结合位点（图5A）。为了验证结合能力，构建了WT-Zbtb7a-3′UTR和Mut-Zbtb7a-3′-UTR荧光素酶报告系统，并分别与mmu-miR-342-3p模拟物或NC共转染到HEK293T细胞中。荧光素酶报告基因检测显示，与对照相比，mmu-miR-342-3p模拟物显着降低了WT-Zbtb7a-3′UTR转染HEK293T细胞中的荧光素酶活性（p <0.001，图5A）。然而，在Mut-Zbtb7a-3′-UTR转染细胞中未观察到减少（p > 0.05，图5A），这表明mmu-miR-342-3p能够与Zbtb7a-3′-UTR结合。一致地，在从E下调HSC中的mmu-miR-342-3p后。通过转染mmu-miR-342-3p抑制剂（p <0.05，图5B）感染多房的小鼠，Zbtb7a在mRNA和蛋白质水平上均显着上调（图5C）。此外，Zbtb7a的表达与E的HSCs中的mmu-miR-342-3p表达呈负相关。多房感染小鼠（p = 0.0031，图5D和E）。这些结果表明，mmu-miR-342-3p通过靶向Zbtb7a参与HSC激活。

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图5. 通过mmu-miR-7-342p直接结合其3′UTR抑制Zbtb3a。

（A）在Zbtb342a的3'UTR中mmu-miR-3-7p的推定结合位点的示意图（上）和双Glo荧光素酶测定在mmu-miR-342-3p-Mimics和Zbtb7a之间的相互作用（下）。miRNA“种子”序列以黑色粗体表示。WT：将WT-Zbtb7a或Mut-Zbtb7a构建体共转染到具有模拟阴性对照（模拟NC）或mmu-miR-293-342p模拟物（miR-3-342p模拟物）的3T细胞中，并在转染24小时后测量荧光素酶活性。（B）来自E的HSC中mmu-miR-342-3p的表达。通过RT-qPCR转染抑制剂阴性对照（NC）或mmu-miR-342-3p抑制剂（抑制剂）的多房感染小鼠。 （C）来自E的HSC中mRNA和蛋白质水平的Zbtb7a表达。多房感染小鼠转染MMU-miR-342-3p抑制剂（抑制剂）。（D）来自E的原代HSC中zbtb7a的表达。感染后30天，60天和90天（DPI）的多房感染小鼠。（E）Zbtb7a和mmu-miR-342-3p表达之间的相关性。（n = 9，斯皮尔曼相关分析;r，相关系数）最终统计分析的数据取自3个独立实验。**p < 0.01;p < 0.001。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0011520.g005

下调mmu-miR-342-3p对E期间HSC活化的体内效应。多房感染

为了研究mmu-miR-342-3p表达对E过程中HSC活化的影响。多房感染，从E中分离出原发性HSC。多房感染小鼠。我们发现下调mmu-miR-342-3p可显著促进Gfap的表达，而α-Sma和Vimentin无显著变化（图6A和6B）。为了在体内评估mmu-miR-342-3p对肝纤维化的影响，通过尾巴将CS-mmu-miR-342-3p纳米颗粒注射到小鼠体内。正如预期的那样，发现mmu-miR-342-3p下调（p < 0.01，图6C），其靶基因Zbtb7a在注射CSNP-mmu-miR-342-3p抑制剂的小鼠肝脏中的mRNA和蛋白质水平显着增加（p < 0.01，图6D和6E）。 此外，Col1α1、Vimentin和TGF-β显著下调，而Gfap显著上调（p <0.05，图6F）。这些结果表明，寄生虫感染通过mmu-miR-342-3p-Zbtb7a轴诱导HSC激活。

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图6. 下调mmu-miR-342-3p对E期间HSC活化的影响。多房感染。

（A）来自E的HSC中mmu-miR-342-3p的表达。用抑制剂阴性对照（NC）或mmu-miR-342-3p抑制剂（抑制剂）转染后多房感染小鼠。（B）下调mmu-miR-342-3p对E型HSC中HSC活化标志物（α-Sma和Vimentin）和静态标志物Gfap表达的影响。多房感染小鼠。（C）与CS抑制剂阴性对照纳米颗粒（CSNP-NC）相比，CS-mmu-miR-342-3p抑制剂纳米颗粒（CSNP-抑制剂）在小鼠肝脏中的mmu-miR-342-3p表达显着下调。（D）在mRNA和蛋白质水平上的Zbtb7a表达在E的肝脏中显着上调。通过注射CS-mmu-miR-342-3p抑制剂纳米颗粒感染多房感染小鼠。（F）mmu-miR-342-3p对E肝中α-SMA，Col1α1，Vimentin和TGF-β表达的影响。通过注射CS-mmu-miR-342-3p抑制剂纳米颗粒感染多房感染小鼠。最终统计分析的数据取自3个独立实验。p < 0.001。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0011520.g006

讨论

肝纤维化是AE的重要组织学标志，HSC的激活是肝纤维化发生和进展的核心环节[15]。HSC主要被激活并迅速转化为增殖性、迁移性和细胞外基质生成肌成纤维细胞[29]。在这项研究中，我们发现肝纤维化是对E的反应。多房感染，其特征在于胶原在后方肝脏中过度沉积。与此一致，我们还发现AE小鼠肝HSC中肌成纤维细胞HSC的比例较高，Vimentin，Col1α1和α-Sma的表达较高。我们的结果证实，HSCs响应E而被激活。多房感染，溶血性肺病促进肝纤维化进程。

肝纤维化受多种生长因子和细胞因子的调节。在这些调节剂中，最著名的硬化介质是TGF-β家族[11]。MiRNA被称为小调节RNA，最近已成为慢性肝病的关键调节分子[30]。许多研究表明，miRNA的异常表达与肝纤维化发展过程中的HSC活化密切相关[18]。在这项研究中，我们鉴定了大量响应E的HSC中异常表达的miRNA。多房感染。正如预期的那样，据报道，其中一些包括mmu-miR-29、mmu-miR-192和mmu-miR-378与HSC的激活有关[31]。为了了解这些差异表达的miRNA的调控作用，对靶基因进行了预测。其中，部分参与TGF-β信号通路和PI3K-Akt信号通路。例如，miR-29在HSC中高表达，可能通过靶向PI3K/AKT信号通路来抑制HSC激活[31]。同样，S.日本miR-29b-3p通过抑制COL1A1和COL3A1来预防寄生虫诱导的肝纤维化[32]。miR-192在静态HSC中高表达，可通过靶向TGF-β1/Smad信号传导来抑制HSC活化[33]。

在这项研究中，mmu-miR-342-3p被证明主要在HSC中表达。我们还观察到它在E的HSCs中的表达增加。感染后 30 天和 60 天感染多房的小鼠肝脏。这些结果表明，mmu-miR-342-3p是一种有希望的候选miRNA，影响E诱导的肝纤维化进展。多房感染。接下来，我们发现mmu-miR-342-3p在体外培养激活的HSC中显着上调，表明其在HSC激活中的潜在作用。荧光素酶报告基因检测显示，mmu-miR-342-3p模拟物可以直接与Zbtb7a结合。此外，我们观察到转染mmu-miR-7-342p抑制剂的活化HSC中Zbtb3a上调。Zbtb7a的表达与E的HSCs中的mmu-miR-342-3p表达呈负相关。多房感染小鼠。这些结果表明，mmu-miR-342-3p可以通过直接靶向其7'-UTR来抑制Zbtb3a表达。研究表明，Zbtb7a的高甲基化与肝成纤维细胞活化和纤维化有关[34]。Zbtb7a可以通过间接抑制TGF-β1的启动子活性来抑制TGF-β1的表达[34]。TGF-β是最有效的纤维化因子，是HSC转化为肌成纤维细胞的主要因素[33，34]。TGF-β通过与丝氨酸/苏氨酸激酶跨膜TGF-β受体I和II结合发挥作用，导致细胞外基质（ECM）蛋白（如Col1α1，α-SMA和纤连蛋白）沉积[35]。Col1α1是纤维化肝脏的主要成分，已知其表达由TGF-β诱导[36]。我们发现下调的mmu-miR-342-3p降低了包括Col1α1和Vimentin在内的纤维化基因的表达，并上调了静止相关基因Gfap。mmu-miR-342-3p可能在E期间通过靶向Zbtb7a介导的TGF-β信号传导来促进HSC激活。多房感染。

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Excel电子表格，在单独的工作表中包含图面板1B，2B，2E，3C，3D，4A，4C，5A，5B，5C，5D，6A，6B，6C，6D，6F和S3的基础数字数据和统计分析。

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S1 Data. Excel spreadsheet containing, in separate sheets, the underlying numerical data and statistical analysis for Figure panels 1B, 2B, 2E, 3C, 3D, 4A, 4C, 5A, 5B, 5C, 5D, 6A, 6B, 6C, 6D, 6F and S3.

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0011520.s001

(XLSX)

S1 图 E.观察多房感染小鼠。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0011520.s002

（提夫）

S2 图 未感染小鼠或E的肝脏中CLEC4F（KC标志物）和细胞角蛋白18（HC标志物）的免疫染色。多房感染小鼠。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0011520.s003

（提夫）

S3 图 通过RT-qPCR测定分离的HC（Alb和CK18），HSC（α-SMA，Gfap和Col1α1）和KC（Emr1）中生物标志物的mRNA表达水平。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0011520.s004

（蒂夫）

S1 文本。

表 A.研究中使用的qRT-PCR引物。表B.E中肝脏HSC中差异表达miRNA的摘要。感染后60天感染多房的小鼠。表C.E中肝脏HSC中差异表达miRNA的摘要。感染后90天感染多房的小鼠。表D.mmu-miR-342-3p的推定靶基因。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0011520.s005

（文档）

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