磷酸戊糖途径突变体中的代谢重编程和改变的细胞包膜特征增加了 MRSA 对 β-内酰胺类抗生素的耐药性

抽象

中枢代谢途径控制毒力和抗生素耐药性，并构成抗菌药物的潜在靶标。在金黄色葡萄球菌中，磷酸戊糖途径（PPP）的作用在很大程度上仍未得到探索。编码PPP氧化期唯一非必需酶的6-磷酸葡萄糖酸内酯酶基因pgl的突变显着增加了MRSA对β-内酰胺类抗生素的耐药性，特别是在具有生理相关葡萄糖浓度的化学定义培养基中，并减少了苯唑西林（OX）诱导的裂解。耐甲氧西林青霉素结合蛋白2a和肽聚糖结构的表达不受影响。碳示踪和代谢组学揭示了pgl突变体中广泛的代谢重编程，包括糖酵解通量增加，TCA循环和几种细胞包膜前体，这与增加的β-内酰胺抗性一致。在形态学上，pgl突变细胞比野生型细胞小，在OX中生长时细胞壁更厚，表面有皱褶。pgl突变降低了对刚果红，磺胺甲噁唑和氧化应激的抵抗力，并增加了对targocil，磷霉素和万古霉素的抵抗力。pgl中脂磷壁酸（LTAs）的水平显着降低，这可能会限制细胞裂解，而pgl细胞的表面电荷显着更正。pgl中的vraG突变逆转了增加的OX抗性表型，并部分恢复了野生型表面电荷，但没有恢复LTA水平。来自调节DltABCD介导的乳酪酸d-丙氨酰化（反过来控制β-内酰胺抗性和表面电荷）的VraFG / GraRS复合物的vraF或graRS突变也恢复了野生型OX敏感性。这些数据共同表明，LTA和OX诱导的裂解水平降低，细胞表面正电荷的VraFG / GraRS依赖性增加伴随着MRSA pgl突变体中OX抗性的显着增加。（266字）

作者摘要

对青霉素型（β-内酰胺）抗生素的高水平耐药性显著限制了需要使用新型药物的MRSA感染患者的治疗选择，已经描述了敏感性降低。在这里，我们首次报道了中枢代谢磷酸戊糖途径控制MRSA对青霉素型抗生素的耐药性。我们全面证明了PPP基因pgl的突变扰乱了MRSA中的代谢，导致细胞包膜前体的通量增加，从而推动抗生素耐药性增加。此外，抗性增加与细胞包膜中脂磷壁酸水平降低、β-内酰胺胁迫下细胞裂解速率降低有关，并且依赖于控制 d-丙烷化和细胞表面电荷的 VraRG/GraRS 多酶膜复合物。我们的数据为MRSA的β-内酰胺耐药机制提供了新的见解，这将支持扩大由这种和其他抗菌素耐药病原体引起的感染的治疗选择的努力。（149字）

数字

Fig 9图1表1图2Fig 3Fig 4Fig 5Fig 6Fig 7Fig 8Fig 9图1表1图2

引文： Zeden MS， Gallagher LA， Bueno E， Nolan AC， Ahn J， Shinde D， et al. （2023） 磷酸戊糖途径突变体中的代谢重编程和改变的细胞包膜特征增加了 MRSA 对 β-内酰胺类抗生素的耐药性。公共科学图书馆病理19（7）： e1011536. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011536

编辑 器： 张巩义，美国国家犹太人健康中心

收到： 3月 2023， 4;接受： 七月 2023， 24;发表： 2023月 <>， <>

版权所有： ? 2023 泽登等人。这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。

数据可用性： 全基因组序列数据可从欧洲核苷酸档案馆（https://www.ebi.ac.uk/ena），注册项目PRJEB59981，样本入藏号ERS14733509-ERS14733512和运行入藏号ERR10960504-ERR10960507获得。SAUSA300_FRP3757（TaxID：451515）参考基因组序列可从NCBI（www.ncbi.nlm.nih.gov）获得。

资金： 这项研究得到了健康研究委员会（ILP-POR-2019-102和HRA-POR-2015-1158至J.P.O'G.），爱尔兰科学基金会（19 / FFP / 6441至J.P.O'G.），爱尔兰研究委员会（GOIPG / 2019 / 2011至J.P.O'G.），国家过敏和传染病研究所（P01 AI083211和R01 AI125588至V.C.T.），瑞典研究委员会（至F.C.）的支持。 瑞典分子感染医学实验室（致FC），Knut和Alice Wallenberg基金会（致FC）和Kempe基金会（至F.C.）。资助者在研究设计、数据收集和解释、手稿撰写或提交作品发表的决定中没有任何作用。

竞争利益： 提交人声明不存在相互竞争的利益。

介绍

世界卫生组织（WHO）最近报道，人类病原体的抗菌素耐药性（AMR）急剧增加[1，2]。AMR危机的恶化是由滥用和过度使用最后手段的抗生素、批准用于临床的新抗菌药物的减少以及对细菌病原体中AMR缺乏机制理解所致[1，2]。金黄色葡萄球菌是最具挑战性的AMR人类病原体之一，可引起多种感染。皮肤和软组织感染可局限于或进入脉管系统[3，4]，而骨髓炎、化脓性关节炎、感染性心内膜炎和肺炎是深部和全身性的[5-13]。

引入青霉素治疗S.1940 年代早期的金黄色葡萄球菌菌血症患者紧随其后的是青霉素耐药性 S。金黄色葡萄球菌菌株[14]。在S.金黄色葡萄球菌，青霉素耐药性由blaZ编码的β-内酰胺酶介导，该酶切割β-内酰胺环，从而破坏β-内酰胺类抗生素的活性[14，15]。甲氧西林是一种对β-内酰胺酶水解具有抗性的青霉素衍生物，于 1960 年代推出，但紧随其后的是耐甲氧西林 S 的出现。金黄色葡萄球菌[16]。甲氧西林耐药驱动于获得盒式葡萄球菌染色体mec（SCCmec）元件上的mecA基因，该基因编码另一种青霉素结合蛋白PBP2a，但对β-内酰胺类的亲和力降低[17-21]。除mecA外，辅助因子也有助于高水平的MRSA β-内酰胺抗性[22-36]，包括几种参与细胞壁前体合成以及其他生理过程的因素。

S的能力。金黄色葡萄球菌适应不同的宿主环境与其从宿主组织获取必需营养素的能力有关[37，38]，这反过来又依赖于代谢重编程。越来越多的文献将中枢代谢途径与S的致病性联系起来。金黄色葡萄球菌，从其在宿主内增殖的能力，到控制抗生素耐药性[22，37-41]。因此，新药靶点和抗菌策略的鉴定依赖于首先了解与中枢代谢途径重编程相关的毒力机制及其在发病机制和抗菌素耐药性中的作用。

细菌从糖酵解、磷酸戊糖途径（PPP）和三羧酸（TCA）循环衍生的13种生物合成中间体合成大分子[42]。金黄色葡萄球菌具有所有三种途径的完整酶集，尽管它缺乏乙醛酸分流[42]。除了产生用于核苷酸和几种氨基酸生物合成的戊糖前体外，PPP在细胞代谢中起着关键作用，通过葡萄糖周转维持碳稳态，并有助于NADPH形式的还原力再生[43-48]。PPP中有两个分支：氧化分支通过产生NADPH / H形式的还原力来促进氧化应激耐受性，非氧化分支产生核糖-5-P，用于从头嘌呤合成和核苷酸库（ATP，ADP，AMP，c-di-AMP，GTP，GDP，GMP，ppGpp，pppGpp，IMP，XMP等）用于修复和合成芳香族氨基酸和肽聚糖[47， 48]. 革兰氏阳性生物中的PPP活性因环境胁迫而增加[48，49]。+

即使糖酵解/糖异生和PPP对S细胞内持久性的贡献。金黄色葡萄球菌一直是许多研究的主题[37，38，40，45，46，48，49]，这些主要的葡萄糖代谢途径在S抗生素耐药性中的作用。 金黄色在很大程度上仍未得到研究。PPP酶的突变先前已在缓慢生长的万古霉素中间体S中发现。金黄色葡萄球菌分离株[50]。

我们和其他人之前报道过，嘌呤核苷酸稳态在MRSA中调节β-内酰胺耐药中起关键作用[49-53]。pur操纵子和嘌呤挽救途径的突变与耐药增加有关，而MRSA暴露于嘌呤核苷鸟苷或黄嘌呤碱会降低β-内酰胺类药物耐药[53]。嘌呤衍生的第二信使信号分子（p）ppGpp和c-di-AMP调节S中β-内酰胺耐药性，并暴露于外源性鸟苷下调c-di-AMP水平。金黄色葡萄球菌[53]。

在这项研究中，我们研究了嘌呤生物合成上游的突变是否也控制β-内酰胺抗性，重点是pgl，pgl是PPP氧化阶段唯一的可变基因。我们表明，MRSA菌株JE2中的pgl突变导致实验室生长培养基中的轻微生长缺陷，增加β-内酰胺抗性，但不引起PBP2a水平或肽聚糖结构的变化。碳示踪和代谢组学实验显示糖酵解通量增加和几种细胞包膜前体。野生型JE2对β-内酰胺类抗生素的敏感性在含有葡萄糖（CDMG）的化学定义培养基中显着增加，并伴有广泛的细胞裂解，而pgl突变体保持高度耐药性，表现出厚细胞壁，完整的隔膜和褶皱的细胞表面。pgl突变体中的脂磷壁酸（LTA）水平降低，pgl细胞的表面电荷显着增加。PGL突变体中的β-内酰胺抗性通过ABC转运蛋白VraFG和同源双组分调节系统GraRS的突变恢复到野生型水平。这些数据表明，MRSA pgl突变体中的代谢重编程通过细胞包膜生物发生的VraFG / GraRS依赖性变化增加β-内酰胺抗性。

结果

MRSA pgl 突变体中的 β-内酰胺耐药性增加

根据先前的数据推断，嘌呤代谢控制β-内酰胺抗性[26，41，53-56]，我们将注意力转向PPP，它产生核糖-5-P，这是嘌呤和嘧啶生物合成的主要底物（图1）。鉴于PPP在中枢代谢和还原力产生中的重要作用，内布拉斯加州转座子突变体库（NTML）中没有该途径中关键酶（包括zwf和GND）的突变也就不足为奇了[57]。然而，NTML确实含有单顺反子pgl基因（SAUSA300_1902，NE202）的突变，该基因编码6-磷酸葡萄糖酸内酯酶，这是PPP氧化阶段的第二种酶，可将6-P-葡萄糖酸内酯转化为葡萄糖酸-6-P。

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图1. 磷酸戊糖途径的氧化阶段摘要，包括6-磷酸葡萄糖酸内酯酶（Pgl），其将6-P-葡萄糖酸内酯转化为葡萄糖酸-6-P。

作为参考，还显示了关键的糖酵解、TCA 循环、核苷酸和细胞壁生物合成途径中间体。果糖-6-P通过UDP-N-乙酰葡糖胺（UDP-GlcNAc）和UDP-N-乙酰胞壁酸（UDP-MurNAc）从糖酵解到肽聚糖（PG），壁状胶酸（WTA）和脂磷壁酸（LTA）。磷霉素（FOS）靶向MurA，MurA与MurB一起是UDP-GlcNAc转化为UDP-MurNAc所必需的。苯唑西林（OX）靶向PG交联所需的青霉素结合蛋白的转肽酶活性。推定的葡萄糖酸分流涉及6-磷酸葡萄糖酸内酯的输出，其自发降解为葡萄糖酸盐，然后被葡萄糖酸盐渗透酶GntP转运到细胞中并被葡萄糖酸激酶GntK磷酸化 Biorender.com。

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当在Mueller Hinton2%NaCl肉汤（MHB）中生长时，pgl突变体NE202在圆盘扩散测定中表现出对头孢西丁的抗性显着增加（JE11的区域直径为2mm，pgl为8mm）和肉汤稀释测定中的苯唑西林（OX）（表1）。比较全基因组测序分析证实，在NE202的pgl位点外没有意外的二次突变。NE202表型通过（i）验证，表明在pgl：：Erm转导后，野生型获得了增加的OX抗性r等位基因和（ii）NE202与野生型PGL基因（PGL比较) (表 1）。pgl/mecA突变体对OX敏感（表1），蛋白质免疫印迹显示野生型JE2、pgl和pgl之间的PBP2a表达没有差异 比较生长在补充有OX 0.5μg/ml（S1A图）或补充有OX 2μg/ml的MHB 32%NaCl（S1B图）的TSB中生长。因此，pgl中的高水平OX抗性依赖于mecA，但与PBP2a表达增加无关。

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表 1. 本研究中使用的菌株对苯唑西林（OX），targocil（TG），妥尼霉素（TM），磷霉素（FOS），D-环丝氨酸（DCS），刚果红（CR），万古霉素（VAN），阿马林（AMS），磺胺甲噁唑（SMX）和多粘菌素B（PMB）的最小抑制浓度（μg/ ml;刚果红的百分比）在Mueller Hinton肉汤中（+ 2%NaCl用于OX）。

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pgl OX抗性表型是葡萄糖依赖性的，与肽聚糖（PG）结构的变化无关

在MHA平板上，pgl的菌落小于JE2（S2A图），并且在没有抗生素的情况下，pgl突变对MHB的生长产生负面影响（S2B图），但在LB，TSB和BHI中的程度较小（S2C-S2E图）。在含有葡萄糖（CDMG）的化学定义培养基中也测量了pgl生长缺陷，但在不含葡萄糖的CDM中未测量（S2F和S2G图）。补充PGL的增长比较在所有测试的培养条件下，突变体与野生型JE2无法区分（S2B-S2F图）。MHB和CDMG中pgl的轻度生长缺陷与OX MICs的显着增加相关（表1，图2A），而CDM中pgl的MIC更相似（32-64μg/ ml）与野生型JE2（16-32μg/ ml;图2A）。值得注意的是，在CMDG中，不仅pgl比野生型JE2更具抗性，而且在该生长培养基中野生型JE2 OX抗性显着降低（MIC = 0.5–1μg/ ml;图2A）。野生型JE2和pgl在CDM OX 10 μg/ml中生长相似（图2B），而只有pgl能够在CDMG OX 10 μg/ml中生长（图2C）。CDMG葡萄糖浓度从5 g/l（28 mM）加倍稀释进一步表明，即使在测试的最低葡萄糖浓度0.07 g/l（0.43 mM）下，OX中的JE2生长也显着受损（S3A图）。同样，在葡萄糖浓度>2.32 g/l （64.1 mM）下，CDMG 中 JE0 的 OX MIC 从 3–1 降低到 ≤75 μg/ml（S3B 图）。这些数据表明，在生理相关浓度下，pgl的突变显着增加了JE2中OX抗性的葡萄糖依赖性降低。与野生型JE2不同，pgl突变体能够在1%或25%的人血清中以OX浓度>70μg/ ml生长（S4图），并且在补充高达70%的人血清的CDMG或MHB中表现出更高的OX MIC（S1表），进一步证明了该表型的体内相关性。pgl突变增加了对氧化应激的敏感性（H2O2）的CDMG（S5图），与先前使用BHI培养基对单核细胞增生李斯特菌的观察相似[58]。

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图2. pgl的突变增加了对苯唑西林的耐药性。

一个。JE2、pgl 的苯唑西林 MIC 和 Mueller Hinton 肉汤中含有 2% NaCl （MHB）、化学定义培养基 （CDM） 和含葡萄糖 （CDMG） 的 CDM 的补充 pgl 突变体。请注意，Y 轴（苯唑西林 MIC）是一个 log2 刻度。B和C。JE2、pgl 和 pgl 的增长比较在 25°C 下在补充有 OX 35 μg/ml 的 CDM （B） 和 CDMG （C） 中放置 10 小时。生长（外径600）在Tecan读板器中以15分钟的间隔测量。数据是 3 个独立实验的平均值，误差线表示标准偏差。

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共聚焦显微镜显示，来自过夜CDMG培养物的pgl细胞直径明显小于野生型JE2或pgl 比较细胞（图3A，B）。我们和其他人之前报道的OX诱导的MRSA细胞大小显着增加[31，53，59-61]，在野生型JE2和pgl中更为明显。比较比pgl突变体（图3C）。此外，野生型JE2和pgl的细胞大小增加比较在CDMG OX中与经历可见裂解的细胞数量急剧增加有关（图3D），这一观察结果与OD的突然下降一致600野生型JE2和PGL比较在这些生长条件下生长4-5小时后的培养物（图2C）。壁酰胺酶消化的多肽片段的定量PG组成分析显示野生型JE2、pgl和pgl的寡聚化谱和交联相似比较在CDMG中生长的菌株，或补充有亚抑制性0.05μg/ ml OX，MHB 2%NaCl，MHB 2%NaCl补充0.5μg/ ml OX（S6A-S6D图）。在这些生长条件下，所有三种菌株的总PG含量也相似（S6E-S6H图）。因此，除了不变的PBP2a表达（S1图）外，pgl OX抗性的增加与PG结构或量的变化无关（S6图）。

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图3. pgl的突变减小了CDMG中的细胞大小并阻止了OX诱导的细胞裂解。

A 和 B。JE2、pgl 和 pgl 的代表性显微图像比较在CDMG（A）或CDMG中生长的细胞补充有OX 0.05μg/ ml （B），并用万古霉素BODIPY FL标记，其与肽聚糖干肽（绿色，顶部图）或WGA Alexa Fluor 594中的末端d-ala-d-ala结合，其与细胞包膜中的GlcNAc和其他糖结合（红色，底图）。三.JE2、pgl 和 pgl 的平均直径比较在CDMG或CDMG OX中生长的细胞。使用Fv3000共聚焦显微镜和软件获取来自四个生物重复的细胞图像，CDMG的每个生物重复测量50个细胞（总共200个细胞），CDMG OX（由于细胞裂解）总共计数60个细胞，并使用GraphPad Prism V9生成四个生物重复的小提琴图。星号表示根据使用克鲁斯卡尔-瓦利斯检验后跟邓恩多重比较检验在统计上显着的差异。指示调整后的 p 值 * p<0.05、*** p<0.001 和 **** p<0.0001。D.JE2 和 pgl 的广泛裂解比较（但不是PGL）在CDMG OX 0.05μg/ ml培养物中。用WGA Alexa Fluor 594标记细胞，并显示具有代表性的显微图像。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011536.g003

外源性d-葡萄糖酸酯或gntPK葡萄糖酸分流基因突变未恢复pgl突变体的野生型OX抗性

在大肠杆菌和L.单核细胞增生，在PGL突变体中积累的6-磷酸葡萄糖酸内酯被去磷酸化为不稳定的葡萄糖酸内酯，其从细胞中输出出来，在那里自发水解为葡萄糖酸盐[58，62]。在S.金黄色葡萄球菌，预测的葡萄糖酸盐分流基因gntP（SAUSA300_2442）和gntK（SAUSA300_2443）与gntR调节因子共同位于染色体上。在先前的RNAseq分析中，我们报道了gntP被OX上调[63]。野生型JE2、pgl和pgl的生长和抗OX比较在补充5 g/l d-葡萄糖酸酯和CDMG OX d-葡萄糖酸的CDMG中相似（S7A和S7B图）。pgl突变体中gntP或gntK的失活伴随着CDMG OX的适度生长延迟，但并未恢复野生型OX易感性水平（S7C图）。因此，外源性d-葡萄糖酸和葡萄糖酸分流基因在pgl突变体的OX抗性表型增加中没有显着参与。

pgl的失活通过PPP降低碳通量

采用液相色谱-串联质谱分析法追踪[1，2-13C2]通过糖酵解和野生型JE2，PGL和PGL中的PPP的葡萄糖通量比较.如前所述[64]，六碳[1，2-13C]葡萄糖可以通过糖酵解和PPP代谢产生三碳13C2-丙酮酸（M+2）和13C1-丙酮酸（M+1）（图4A）。M+1馏分是在PPP中脱羧反应释放后产生的13一氧化碳2 (图4A）。在pgl中，M+1丙酮酸水平降低，表明PPP活性降低（图4B），而主要来自糖酵解的M+2丙酮酸水平相似（图4B）。M+2/M+1比值进一步说明了pgl的PPP活性受损，并显示葡萄糖在pgl中直接进入糖酵解产生的丙酮酸比野生型JE2或pgl多>2倍 比较 (图4C）。

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图4. PPP 活性在 pgl 突变体中受损。

一个。JE2、pgl和互补的pgl突变体在CDM中生长[1，2-13C]如前所述，比较了糖酵解和磷酸戊糖途径（PPP）的葡萄糖和通量[64]。M+2丙酮酸是糖酵解所特有的，M+1丙酮酸是PPP特有的。因此，M+2/M+1比率表示糖酵解相对于PPP的碳通量。M+0丙酮酸可以来自不同的来源，包括[1，2-13C]与葡萄糖一起消耗的葡萄糖和热生氨基酸。二.在JE1、pgl和pgl中，M+2丙酮酸的相对水平表明PPP活性，M+2丙酮酸的相对水平表明糖酵解活性比较.三.M+2/M+1 比值表明丙酮酸直接由葡萄糖通量通过 JE2、pgl 和 pgl 中的糖酵解产生比较.数据是三个独立实验的平均值，并显示标准偏差。使用普通单因素方差分析确定显著差异，使用GraphPad Prism V9进行邓内特多重比较，并指示调整后的p值**** p<0.0001。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011536.g004

PGL突变体中的OX抗性与TCA循环或糖原性和生酮氨基酸无关

HPLC用于研究从PPP到糖酵解的重定向葡萄糖通量是否影响CDMG中氨基酸的消耗，并揭示了与JE2或pgl相比，PGL培养物上清液中苏氨酸，支链氨基酸（BCAAs）缬氨酸，亮氨酸和异亮氨酸以及苯丙氨酸，色氨酸和酪氨酸，组氨酸，蛋氨酸和天冬氨酸的水平增加比较生长7.5小时后（S8A图）。有趣的是，在pgl的CDMG上清液中，TCA循环中间体苹果酸盐，琥珀酸盐，特别是α-酮戊二酸的水平也升高（S8B图），这可能与糖原性和生酮氨基酸的需求减少一致。为了研究这种脯氨酸脱氢酶（putA：：Ermr）和谷氨酸脱氢酶（gudB：：Ermr）突变，预测会干扰氨基酸向α-酮戊二酸的通量，从NTML [57]转导为pgl：：Kmr.所得的pgl/putA和pgl/gudB突变体在CDMG和CDMG OX中的生长与pgl：：Km r (S8C 和 S8D 图）。同样，pgl TCA循环双突变体pgl/sdhA、pgl/sucA和pgl/sucC仍然能够在CDMG OX（S8C和S8D图）中生长，尽管pgl/sucC表现出延长的滞后阶段，这与我们之前的报告一致，即由于琥珀酰辅酶A的积累增加，sucC突变使MRSA对β-内酰胺类抗生素重新敏感[39 ].总的来说，这些数据表明，完整的TCA循环或培养上清液中TCA循环中间体和生酮氨基酸的积累与pgl突变体的β-内酰胺抗性增加无关。

通过将碳通量重定向到细胞壁前体，促进PGL中对β-内酰胺类抗生素的耐药性增加

在JE2，pgl和pgl上进行全细胞代谢组学比较在CDMG或CDMG OX中生长（图5）。与PPP在还原力和核苷酸生物合成中的重要作用一致，pgl中关键氧化还原载体和六个核苷酸的水平显着降低，并在互补突变体中恢复到JE2水平（图5）。有趣的是，核苷酸水平降低与pgl突变体对磺胺甲噁唑的敏感性增加2-4倍相关，磺胺甲噁唑抑制叶酸合成途径中的二氢蝶酸合成酶（表1）。PPP中Pgl下游的景天庚酮糖7-P水平在pgl中也降低，在CDMG中达到显着性，而核糖5-P和赤藓糖5-P显着增加（图5），表明pgl突变体中存在复杂的代谢重编程。

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图5. JE2、pgl 和 pgl 中细胞壁、磷酸戊糖途径 （PPP）/糖酵解、TCA 循环、氧化还原、核苷酸和氨基酸代谢物的热图比较比较.

在JE2，pgl和pgl上进行全细胞代谢组学比较在CDMG和CDMG OX 10μg/ ml中生长，并在4-5小时后（早期指数期）收集细胞。所提供的数据是使用GraphPad Prism V2分析的三个生物重复（FAD的9个生物重复）的平均值。使用单因素方差分析与土耳其在CDMG，CDMG OX或两者中生长的PGL事后显着不同的单个代谢物水平以粗体文本突出显示。* CDMG 或 CDMG OX 存在显著差异。** CDMG和CDMG OX的显著差异。

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符合 [1，2-13C]葡萄糖示踪实验，从中衍生细胞壁前体的果糖6-P的积累，在CDMG OX中增加，在CDMG中显着增加（图5）。此外，下游糖酵解中间体果糖1，6-双-P、磷酸二羟基丙酮（DHAP）、甘油醛3-P和磷酸烯醇丙酮酸（PEP）均被还原（图5）。虽然有几种可能的解释，但一种可能性是积累的果糖6-P可能被通量到PPP或细胞壁。事实上，在CDMG OX中生长的pgl中测量到UDP-mono和UDP-penta水平显着增加，但在CDMG中没有（图5）。相比之下，UDP-GlcNAc和UDP-MurNAc的水平显着降低（图5），可能反映了CDMG OX中UDP-mono和UDP-penta生产中这些底物的消耗增加。UDP-mono和UPD-penta的积累增加与pgl突变体对磷霉素（FOS）的耐药性增加相关（表1，S9图），这是一种抑制MurA酶的抗生素，它与MurB一起催化UDP-GlcNAc转化为UDP-MurNAc（图1）。此外，在棋盘稀释测定中，与野生型JE2相比，pgl对OX/FOS组合的抗性显着增加（S9图）。肉汤微稀释敏感性实验显示，pgl突变体对万古霉素（VAN）的耐药性高出1-2倍，万古霉素靶向PG干肽的末端d-ala-d-ala（表1）。

综上所述，这些数据表明，将碳通量重定向到pgl中的细胞壁前体有助于增加对β-内酰胺类抗生素的耐药性。此外，pgl的活力似乎得到了糖酵解和PPP中间体复杂且受调节的相互转化的支持，这也可以解释为什么糖酵解分流基因在这些培养条件下对于pgl突变体的生长是可有可无的。

pgl 的突变改变了对靶向壁膜酸 （WTA） 和脂磷壁酸 （LTA） 的抗菌剂的敏感性，并伴有细胞包膜的形态变化

野生型JE2和pgl对TarO抑制剂tunicamycin的MIC相同，而pgl对TarGH抑制剂targocil更具耐药性，对d-丙氨酰化抑制剂amsacrine 更敏感（表1），揭示了针对WTA生物合成中不同步骤的抗菌剂的不同效果。TarO催化N-乙酰葡糖胺-1-磷酸从UDP-GlcNAc转移到十一碳烯基-P，以启动WTA合成[65]。TarGH ABC转运蛋白将WTA转运过细胞质膜[66]，然后聚合物被DltABCD复合物d-alany化[67]。pgl突变体对靶向LTA合酶LtaS的刚果红也更敏感[68]（表1）。重要的是，LTA也被DltABCD所取代。与野生型相比，pgl对靶向d-ala-d-ala途径中丙氨酸消旋酶和连接酶的d-环丝氨酸的敏感性没有变化，代谢组学分析也显示野生型JE2，pgl和pgl中d-ala-d-ala的水平没有显着差异比较 (图5）。

透射电子显微镜（TEM）显示，与JE2细胞相比，在CDMG OX中生长的pgl细胞具有明显的皱褶表面特征和厚实的完整隔膜（图6）。与先前的显微镜分析（图3）一致，TEM显示分裂野生型细胞以及接受裂解的细胞中隔膜有缺陷/截短（图6）。相比之下，在没有OX的情况下生长的野生型细胞和pgl细胞大致相似（S10图）。综上所述，这些数据表明，pgl突变体中的细胞包膜变化是TarGH，LtaAS-YpfP和DltABCD膜复合物活性改变的结果，这些复合物参与WTA和LTA的输出和d-丙氨化，共同导致OX抗性增加。

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图6. pgl突变体中OX抗性的增加与褶皱的表面形态，较厚的细胞壁和分裂细胞之间的隔膜较厚有关。

在JE30（A），pgl（B）和pgl上以000，100×（左）和000，2×（右）放大倍率进行透 射电子显微镜检查比较（C）从指数期培养物中收集的细胞在CDMG OX 4μg/ ml中生长5.1小时，标准化为OD600= 1在PBS中固定并制备薄片之前。显示了来自每种菌株的代表性细胞。比例尺在 500，30 × 放大倍率下表示 000 nm，或在 100，100× 放大倍率下表示 000 nm。

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pgl突变体中的OX抗性取决于vraF和vraG

在实验过程中去除 Ermr在NE202中分离出一种pgl无标记转座子突变体，该突变体已恢复为野生型生长模式，特别是在CDMG OX中（图7A和7B）。这种突变体的全基因组测序，命名为pglR1，确定了putA上游73bp的胸腺嘧啶缺失和Gln394停止在 VraG 中替换。pgl双突变体和三突变体的构建表明，pgl OX抗性表型依赖于vraG而不是putA（图7A和7B）。vraG编码膜渗透酶，其与其同源ATP酶VraF一起包含先前与阳离子抗菌肽、多粘菌素B和万古霉素抗性的ABC外排泵[69-73]有关，可能通过输出细胞壁/泰胆酸前体或修饰亚基[71]。与此一致，pgl / vraF突变体在CDMG和CDMG OX中的生长与pgl / vraG和JE2相似（图7A和7B）。VraFG也是与糖肽抗相关的GraRS双组分系统的多组分复合物的一部分，该系统调节vraFG以及dltABCD操纵子和mprF[69-71]。与JE2和pgl/vraF或pgl/vraG突变体相比，pgl/graR突变体在CDMG OX中生长时表现出中间表型（图7B），揭示了整个VraFG/GraRS复合物在pgl OX抗性表型中的作用。相比之下，与已发表的数据一致[74]，vraG突变与多粘菌素B的易感性显着增加有关，与pgl无关（表1）。

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图 7. vraG的突变恢复了CDMG中生长的pgl突变体中的野生型OX抗性，但不能恢复细胞大小。

A 和 B。JE2的增长，pgl：：Kmr，pgl R1，putA，graR，vraG，pgl / putA，pgl / graR，pgl / vraG，pgl / putA / vraG在25°C下在CDMG （A）和CDMG中补充OX 35μg/ ml （B）10小时。生长（外径600）在Tecan读板器中以15分钟的间隔测量。数据是 3 个独立实验的平均值，误差线表示标准偏差。三.JE2，pgl，pgl的代表性显微图像比较， pgl：：Kmr，在CDMG中生长的pgl R1，vraG和pgl / vraG细胞，并用万古霉素BODIPY FL（绿色，顶部图）或WGA Alexa Fluor 594（红色，底图）标记。D.JE2的平均直径，pgl：：Kmr，在CDMG中生长的pgl R1，vraG和pgl / vraG细胞。使用Fv3000共聚焦显微镜和软件获取来自三个生物重复的细胞图像，每个生物重复测量50个细胞（总共150个细胞），并使用GraphPad Prism V9生成三个生物重复的小提琴图。星号表示根据使用克鲁斯卡尔-瓦利斯检验后跟邓恩多重比较检验在统计上显着的差异。指示调整后的 p 值 **** p<0.0001 或 ns，不显著。

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有趣的是，在MHB中生长的pgl突变体增加的VAN MIC在pgl / vraG中从2-4μg/ ml降低到0.5μg/ ml（表1），进一步表明细胞包膜变化的逆转。然而，pgl / vraG和pgl细胞在CDMG和CDMG OX中大小相同（图7C和7D），表明vraG突变不会逆转pgl突变体中的其他中枢代谢相关表型。

在CDMG中，putA，vraF，vraG和 pgl/putA的OX MICs与JE2相同，而pgl / graR降低到32-64μg/ml，pgl / putA / vraG，pgl / vraF和pgl / vraG降低到8μg/ ml，而pgl和pgl：：Km r (S11 图）。有趣的是，在MHB 2%NaCl中，pgl突变体（128-256μg/ ml）的增加OX MIC在pgl / vraG或pgl / vraF突变体中没有逆转（表1），强调了外源葡萄糖在pgl相关表型中的重要性，并表明pgl突变体中的VraFG依赖性OX抗性受到环境调节。

脂磷壁酸在pgl突变体中减少

使用几种测定方法比较了pgl，vraF，vraG和 graR菌株中的teichoic酸水平。小麦胚芽凝集素（WGA）Alexa Fluor 594与WTA，LTA和PG中的GlcNAc和其他糖的结合在pgl和pgl中显着降低：：Km r与JE2，vraF，vraG和graR菌株相比（图8A）。此外，WGA结合在pgl R1，pgl / vraF，pgl / vraG，pgl / putA / vraG和pgl / graR中恢复到野生型水平（图8A）。 在CDMG OX中生长的pgl中，作为WTA和LTAs骨干的核糖醇水平也降低，在CDMG中显着降低（图5）。在CDMG中生长的所有菌株中，在阿尔新蓝染色WTA凝胶上观察到的WTA水平相似（图8B）。在CDMG OX中，与JE2相比，pgl突变体中的WTA总量略有减少（图8B），但来自3个独立实验的ImageJ密度分析表明这并不显着。通过ImageJ密度测定法对LTA免疫印迹的分析显示，与JE0相比，pgl和pgl/vraG中LTA的相对水平显着降低（p <05.2）（图8C）。pgl中LTA水平的降低与WGA结合的减少（图8A）和pgl突变体对靶向LtaS的刚果红的敏感性增加（图8D）相关。LTA积聚在细胞分裂部位[75]，这种糖聚合物水平的降低可能导致pgl的细胞分裂缺陷和细胞大小表型减小（图6）。此外，由于高水平的LTA与细胞裂解增加有关[76]，这些数据也可以部分解释与pgl相比，野生型对CDMG OX裂解的敏感性增加。

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图8. 脂壁酸减少，细胞表面在pgl突变体中带更正电。

一个。小麦胚芽凝集素（WGA）Alexa Fluor 594与JE2，pgl，pgl结合的比较 比较， pgl：：Kmr，vraG，vraF，graR，putA，pgl / vraG，pgl / vraF，pgl / graR，pgl / putA，pgl / putA / vraG和pglR1细胞在CDMG OX中使用荧光显微镜在4nm激发/ 5nm检测下生长594.618小时。 数据是 2 个独立实验的平均值，误差线表示标准偏差。使用土耳其事后分析的双向方差分析确定了显著差异。指示调整后的 p 值 **** p<0.0001 或 ns，不显著。二.JE2、pgl、pgl中相对壁茶酸（WTA）水平的比较比较，在CDMG和CDMG OX 0.05 mg / ml中生长的vraG，pgl / vraG和tagO（阴性对照）。纯化的WTA样品在20%天然聚丙烯酰胺（PAA）凝胶上分离，然后用0.1%阿尔新蓝染色。显示了来自3个独立生物重复序列的代表性图像。三.JE2，pgl，pgl中相对脂磷壁酸（LTA）水平的比较比较， pgl：：Kmr，vraG，pgl / vraG，USA300 LAC*和ltaS / gdpP（阴性对照）在CDMG和CDMG OX 0.05 mg / ml中生长（ltaS / gdpP突变体对OX敏感，仅在CDMG中生长）。提取的LTA在15% PAA凝胶上分离，转移到PVDF膜上并用LTA抗体（1：5000）探测，然后进行HRP偶联蛋白G（1：2000）和使用Opti-4CN底物试剂盒进行比色检测。进行了三个独立的实验，并显示了代表性的印迹。D.vraG的突变部分恢复了pgl突变体中的刚果红抗性。JE10、pgl、pgl 的 2 倍系列稀释液比较，将vraG和pgl/vraG接种到补充有0.125%刚果红的TSA上，并在24°C下生长37小时。 该实验重复三次，并显示代表性板。E.使用cyctochrome c结合测定在CDMG和CDMG OX 2.0mg / ml中生长的JE05，pgl，vraG和pgl / vraG中的细胞表面电荷比较。带正电荷的细胞色素c与带负电荷的细胞结合更强烈。数据是 3 个独立实验的平均值，误差条代表标准偏差 使用普通单因素方差分析确定显著差异，然后进行土耳其的多重比较事后检验（* p<0.05，**** p<0.0001）。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011536.g008

在pgl中改变细胞表面电荷的VraG依赖性控制的证据

pgl突变体中LTA水平的降低引发了关于改变的WTA：LTA比率对pgl细胞包膜和/或teichoic acid（TAs）的翻译后修饰的影响的问题。先前与OX抗性增加有关的WTA糖基化[63，77]被排除，因为pgl突变体的OX MIC不受WTA α突变的影响，β糖基化酶基因tarM和tarS（S11图）。由于TAs有助于细胞表面电荷，因此进行了cyctochrome c结合测定[74]，并显示pgl细胞在CDMG OX中带的正电荷显着更高（图8E）。在CDMG中也观察到了类似的趋势，但没有达到显着性。与已发表的数据一致[74]，vraG突变体比野生型更带负电荷，尽管没有达到显着性（图8E）。vraG突变部分恢复了pgl突变体的表面电荷。随着LTA水平的降低，增加的正电荷进一步证明了pgl中细胞包膜的组成和装饰发生了变化。此外，这些观察结果与 VraFG/GraRS 依赖性增加、DltABCD 介导的 TA 的 d-丙氨化和 pgl 中 OX 抗性增加一致。未来在pgl中表征VraFG / GraRS控制的WTA / LTA聚合物长度和装饰[76，78，79]以及LTA释放模式[27，80]的研究将提供信息。总之，这里提供的数据表明，MRSA pgl突变体中广泛的代谢重编程伴随着OX抗性的增加，这与将碳通量重定向到细胞包膜前体，LTA和细胞裂解水平降低以及VraFG / GraRS依赖性的细胞表面电荷显着增加有关。

讨论

除了PPP的氧化相在产生还原力和用于核苷酸和氨基酸生物合成的5种碳糖中的核心作用之外，由于该途径中大多数酶的必需性，其对细菌中其他表型的贡献仍然知之甚少。一个例外是6-磷酸葡萄糖内酯酶（Pgl）。在这里，我们首次报告了pgl在控制MRSA β-内酰胺类抗生素耐药性，生长，细胞大小和细胞表面形态中的作用。我们的分析揭示了pgl突变对（i）PPP本身和下游核苷酸生物合成，（ii）糖酵解和TCA循环以及（iii）细胞壁通量，WTA和LTA前体的多效性影响。所有这三种途径先前都与MRSA β-内酰胺抗性的控制有关，为pgl突变体的OX抗性表型增加提供了多方面的解释。

尽管野生型JE2和pgl突变体的OX MIC依赖于培养基，但pgl突变体始终具有显着更高的抗性，并且两种菌株之间最显着的差异是在化学定义的葡萄糖（CDMG）培养基中测量的，这是PPP的底物。引人注目的是，野生型JE2 OX MIC在CDMG中降低到1μg/ ml，而MHB 64%NaCl中为2μg/ ml，而pgl OX MIC在两种培养基中相似（128-256μg/ ml）。鉴于JE2 OX MIC在CDM中为4-16μg/ml，其中S.金黄色葡萄球菌依赖于氨基酸分解代谢，葡萄糖似乎在控制JE2的OX敏感性中起重要作用，但在中枢代谢受到显着干扰的PGL突变体中起重要作用。MHB 2% NaCl是用于测量S敏感性的标准培养基。金黄色葡萄球菌在诊断实验室中分离出苯唑西林，这些实验提出了一个问题，即CDMG在预测β-内酰胺类药物在MRSA感染患者中的体内有效性方面是否更具生理相关性。

pgl基因先前在E中发生突变。大肠杆菌和L.单核细胞增生[58，62]，导致葡萄糖酸盐的积累，葡萄糖酸盐可以运输回细胞并磷酸化，从而可能绕过PPP中的Pgl催化反应[58，62]。 然而，在S.金黄色葡萄球菌 PGL突变体的较慢生长和OX抗性表型不依赖于葡萄糖酸转运和分解代谢基因GNTPK或培养基中外源性d-葡萄糖酸的存在。因此，关于S中葡萄糖酸分流的重要性和调节仍然存在疑问。金黄色。

在CDMG中，与野生型相比，pgl突变细胞大小显着减小。细胞大小的减小可能与pgl的β-内酰胺抗性增加有关，如先前报道的c-di-AMP磷酸二酯酶gdpP突变体[41]。除了先前报道的OX诱导的细胞大小增加[31，53，59，61]外，在CDMG中生长的野生型JE2中也观察到显着的细胞裂解表型，具有亚抑制性OX（0.05μg/ ml），而不是在pgl突变体中。

不出所料，pgl突变显着扰乱了代谢组。然而，PPP和糖酵解中几种个体代谢物的积累并未受到均匀影响，这表明在没有Pgl的情况下实现生长所需的稳态恢复是复杂的。例如，在PPP中Pgl的下游，核糖-5-P的水平增加，而景天庚酮糖7-P和核苷酸水平降低。尽管tkt突变体中肌苷-5-单磷酸、黄嘌呤-7-单磷酸和次黄嘌呤的水平增加，但缺乏来自PPP非氧化期转酮醇酶tkt基因的突变体中核糖-5-P的积累也伴随着景天庚酮糖5-P降低[48]。pgl突变体中嘌呤（和嘧啶）核苷酸积累的减少与其对磺胺甲噁唑的敏感性一致，并且先前的研究表明，嘌呤生物合成和挽救途径中的突变伴随着OX抗性的增加[26，53]。这里提供的代谢组学数据表明，pgl的突变伴随着糖酵解和PPP中间体的复杂且错综复杂的调节相互转化，以确保维持支持生长所需的关键中心代谢物。

对PG结构，交联和总浓度的分析显示野生型和pgl菌株之间没有差异，这表明细胞包膜的其他变化是导致pgl OX抗性增加的原因。然而，降低WGA结合和teichoic酸水平，特别是LTA，是特别令人感兴趣的。Hesser等人[76]最近提出，在S中产生长期而丰富的LTA。金黄色葡萄球菌促进细胞裂解，而丰富的WTA水平具有相反的作用并限制细胞裂解。我们的数据似乎与这一假设一致，并揭示了pgl中LTA水平显着降低与OX应激下细胞裂解减少之间的相关性。反过来，pgl细胞裂解的减少也可能有助于增加OX抗性。UDP-葡萄糖水平的降低和对针对LtaS的刚果红的抗性增加也与pgl中LTA水平的降低一致。

引人注目的是，VraFG/GraSR的突变逆转了CDMG中pgl增加的OX抗性表型，以及MHB中VAN抗性增加和刚果红抗性降低。Meehl等人先前提出，由于vraG的突变增加了S中结构不同的万古霉素和多粘菌素B的易感性。金黄色葡萄球菌菌株Mu50和COL、VraFG可能在细胞壁/替胆酸前体或修饰亚基的输出中发挥更广泛的作用，而不是特异性抗菌剂[71]。WTA的d-丙氨酰化在graRS突变体中也显示减少[72]，进一步暗示这种多酶膜复合物与细胞包膜生物发生有关。与其对OX抗性的影响相反，vraG的突变并没有逆转pgl突变对LTA水平或细胞大小的影响，这表明破坏的PPP对细胞大小的更广泛的代谢后果与更精确的VraFG / GraRS依赖性OX抗性增加不同。

pgl中LTA水平的VraG非依赖性降低引发了关于改变的WTA：LTA比率对pgl细胞包膜和/或茶酸翻译后修饰的影响的问题。虽然pgl/tarM和pgl/tarS双突变体的构建分别排除了WTA的α和β糖基化的作用，但pgl突变体在OX中明显带了更多的正电荷，并且vraG突变部分逆转了这种情况。因此，尽管LTAs的水平降低，但这些观察结果与LTA和WTA的d-丙烷化增加以及pgl中OX抗性的增加一致。

GraSR也被证明可以调节mprF的转录，mprF编码与CAMPs和达托霉素耐药有关的LysPG翻转酶[81-83]。值得注意的是，与细胞大小增加和达托霉素耐药性相关的mprF错义突变也被证明可以降低MRSA OX耐药性[84]，这增加了改变的MprF活性可能以VraFG / GraRS依赖性方式促进pgl表型的可能性。

枯草芽孢杆菌中的GraRS/VraFG复合物与BceRS/BceAB具有显著的氨基酸序列相似性，在杆菌肽耐药性中起重要作用。杆菌肽靶向脂质II循环中间体十一碳烯基焦磷酸盐（UPP），据信在PG生物合成过程中可能由BecAB ABC转运蛋白翻转/转运穿过膜[85，86]。BceR反应调节因子上调bceAB表达和BceAB构象的变化似乎可以保护UPP免受杆菌肽抑制[85]。因此，虽然PG结构和交联不受pgl突变体的影响，但很容易推测，在CDMG的OX胁迫下，UPP在膜上的翻转可能对PGL突变体的PG生物合成特别重要，这是由GraRS双组分系统检测到的。已知 GraRS 是 S 所必需的。金黄色葡萄球菌在高温和氧化应激下生长[87]，支持了PGL中VRAFG依赖性OX抗性增加也受到环境调节的结论，不同培养基中OX MIC的变化证明了这一点。

综上所述，我们的数据显示CDMG中野生型JE2的OX敏感性和裂解率显着增加，与pgl相比，这可能与相对较高的LTA水平有关。这种脆弱性显然被pgl突变细胞的LTA水平降低和较高的正细胞表面电荷所逆转，pgl突变细胞更小，表面形态皱巴巴，细胞壁较厚，隔膜完整。反过来，pgl OX电阻表型和增加的正表面电荷取决于VraFG和GraRS。然而，pgl背景中vraG的突变并没有恢复LTA水平或导致细胞大小的增加。我们提出了一个可能的模型（图9），其中降低水平的LTA和VraFG / GraRS依赖性DltABCD介导的pgl中WTA和LTA的d-丙氨酰化的综合作用导致β-内酰胺抗性增加，并防止野生型JE2中明显的广泛的OX诱导裂解。

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图 9. MRSA pgl突变体中VraFG依赖性高水平β-内酰胺抗性的推荐模型。

一个。CDMG OX生长过程中JE2和pgl细胞分裂的图示。当在CDMG中生长并经历正常的细胞分裂时，pgl细胞比野生型JE2小，而在野生型细胞中广泛裂解是明显的。B和C。肽聚糖 （PG）、壁硬苯酸 （WTA） 和脂磷壁酸 （LTA） 在野生型 JE2 （B） 和 pgl （C） 中的生物合成图示。vraF，vraG和较小程度的graR突变逆转了pgl突变体增加的OX抗性表型。pgl突变体中的代谢重编程通过依赖于VraFG / GraRS控制的WTA/LTA生物合成，输出或翻译后修饰的调节机制增加细胞包膜前体的碳通量和β-内酰胺抗性。先前的研究已经涉及VraFG / GraRS复合物对阳离子抗菌肽的抗性和dltABCD和mprF转录的调节，并且还被认为在肽聚糖或teichoic酸前体的输出或修饰亚基中发挥作用。与JE2（B）相比，pgl（C）中LTA水平降低可能有助于减少OX应激下的细胞裂解。与JE2（B）相比，pgl突变体（C）中显着增加的正电荷被vraG突变部分逆转，这表明pgl突变体中LTA水平降低和VraFG / GraRS依赖性d-丙氨化增加WTA和LTAs相结合以增加OX抗性。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011536.g009

材料和方法

细菌菌株和生长条件

本研究中使用的细菌菌株和质粒可以在S2表中找到。大肠杆菌菌株生长在溶原肉汤/Luria Bertani肉汤（LB）肉汤或琼脂（LBA）中，金黄色葡萄球菌菌株生长在胰蛋白酶大豆汤（TSB），胰蛋白酶大豆琼脂（TSA），穆勒-辛顿肉汤（MHB）中，补充2%NaCl，穆勒 - 辛顿琼脂（MHA）补充2%NaCl，脑心脏输液（BHI）肉汤，LB肉汤， 化学成分明确的培养基（CDM）[38]或补充葡萄糖（5g/L）的化学成分确定培养基（CDMG）。培养基补充不同浓度的红霉素（Erm）10μg/ml，氯霉素（Cm）10μg/ml，氨苄西林（Amp）100μg/ml，卡那霉素（Km）90μg/ml，苯唑西林（OX）不同浓度。

S的基因操作。金黄色葡萄球菌，NE202（pgl）的互补和PGL双三突变体的构建

为了验证NE202增加的OX抗性表型，使用噬菌体80α转导pgl：：Ermr等位基因变成野生型JE2，如前所述[39，57]。pgl：：Erm 的存在rNE202 中的等位基因和转导剂通过 PCR 扩增与引物 NE202_check_F、NE202_check_R、Martn_ermF 和 Martn_ermR 进行验证（S3 表）。

为了补充NE202，首先使用pgl_Fwd和pgl_Rev引物从JE2基因组DNA扩增pgl基因，包括其启动子和上游调控序列，克隆到e中的pDrive（Qiagen）。大肠杆菌TOP3（Invitrogen），在将EcoRI限制性片段亚克隆到E之前，通过Sanger测序（Source Biosciences）验证。大肠杆菌-葡萄球菌穿梭质粒pLI10 [50]并转化为E。大肠杆菌HST88（高良生物）。然后分离pLI08_pgl质粒并通过电穿孔转化为限制性缺陷菌株RN50，随后转化为NE4220。所有质粒携带菌株均在补充有202μg/ml氨苄青霉素（E.大肠杆菌）或 100 μg/ml 氯霉素 （S.金黄色）以维持质粒选择。

生成 pgl：：Kmr突变体，从IM57B中分离pKAN 质粒 [08] 并电穿孔成 NE202 （pgl：：Ermr）和厄姆r标记换成公里r使用等位基因交换的标记[57]。为了构建无标记的Δ pgl突变体，将来自RN57 pTNT的pTNT质粒[4220]分离并电穿孔成NE202（pgl：：Ermr）和厄姆r标记换成转座子插入的较短，无标记版本，在PGL基因中留下少量缺失。pgl：：Kmr使用引物NE202_check_F、NE202_check_R、KanR_fwd和KanR_rev通过PCR验证Δpgl突变体（S3表)

构建用于转导Erm的pgl双突变体噬菌体80αr-来自以下内布拉斯加州转座子库 [57] 突变体的标记等位基因为 PGL：：Kmr： NE1868 （mecA）， NE952 （gntP）， NE1124 （gntK）， NE569 （sucC）， NE547 （sucA）， NE76 （leuB）， NE239 （putA）， NE1518 （gudB）， NE70 （vraG）， NE645 （vraF）， NE481 （graR）， NE942 （tarS）， NE611 （tarM） NE626 （sdhA）.通过使用S3表中列出的引物的PCR确认基因中转座子插入的存在。

为了构建 pgl/vraG/putA 三重突变体，NE239 putA：：Ermr首先用从IM57B pSPC分离的pSPC质粒[08]转化菌株，并如前所述进行等位基因交换[57]以产生putA：：Specr.普特A：：规范r然后使用噬菌体80α将等位基因转导到pgl / vraG双突变体中。pgl、vraG和putA基因中转座子插入的存在通过使用S3表中列出的引物通过PCR确认。

特肯生长曲线

配备麦哲伦软件的Tecan Sunrise微孔板仪器用于记录在96孔板中进行的生长实验的数据。将培养物划线在TSA平板上，必要时补充抗生素，并在37°C下生长24小时。第二天，将菌落重悬于1ml PBS中，然后在PBS中洗涤。将PBS洗涤的细胞悬浮液调整为OD600在0ml PBS中2.1和10μl接种到含有190μl生长培养基（MHB，LB，TSB，BHI，CDM，CDMG，CDM 10μg/ ml OX，CDMG 10μg/ ml OX，补充有d-葡萄糖酸钾（5g / L）（有或没有OX 10μg/ ml）（起始OD600= 0.01），然后在35–37°C下振荡和OD孵育24小时600每隔 15 分钟记录一次。对于 H2O2灵敏度测定（S5图），CDMG和含500μM H的CDMG2O2在起始OD接种600的 0.05。对于人血清生长曲线，将人血清（来自人男性AB血浆，默克）与CDMG v / v混合（分别为70%-30%，50%-50%，25%-75%和10%-90%）。首先在37°C下在TSA 2%NaCl上培养菌株24小时，并将5-10个菌落重悬于0.85%盐水中，然后调节至0.5McFarland标准（A600= 0.1）。然后将细胞悬液在PBS中以1：20稀释，10μl用于接种100μl人血清 - CDMG混合物，并以起始OD接种600的 0.005。对每种菌株进行三次独立的生物学重复，并使用GraphPad Prism软件V9绘制结果数据。

抗生素椎间盘弥散敏感性测定

盘扩散敏感性测试根据临床实验室标准协会（CLSI）指南[89]进行，如前所述[53]，稍作修改。简而言之，将过夜培养物稀释到5ml新鲜TSB中，并在3°C下以37rpm振荡生长200小时。然后将3小时生长的培养物调整至A600= 0.5和150μl该悬浮液在MHA板表面均匀擦拭3次（4mm琼脂厚度）。用20μl抗生素（头孢西丁1.5mg / ml储备液）点样37mm空白盘（OXOID）。干燥后，将圆盘施用在用培养悬浮液铺展的MHA平板上，然后在<>°C孵育CLSI指南规定的抗生素时间。 对每个菌株进行三次独立测量，并测量并记录抑制区。

抗生素最低抑菌浓度 （MIC） 测量和协同作用/棋盘格测定

根据CLSI方法进行肉汤微量稀释的MIC测量，用于葡萄球菌的稀释敏感性测试[90]，并进行修改。简而言之，菌株首先在37°C下在MHA 2%NaCl上生长24小时，并将5-10个菌落重悬于0.85%盐水中，然后调节至0.5McFarland标准（A600= 0.1）。然后将细胞悬液在PBS中以1：20稀释，10μl用于接种含有连续稀释的抗生素（苯唑西林，磷霉素，targocil，tunicamycin，刚果红，amsacrine，DCS，万古霉素，磺胺甲噁唑和多粘菌素B）的100μl培养基（MHB / MHB 2%NaCl / CDM / CDMG）在96孔板中。对于人血清MIC，将人血清（来自人男性AB血浆，默克）与CDMG或MHB 2%NaCl v/v（70%-30%，50%-50%，25%-75%和10%-90%）混合并如上所述接种。将96孔板在35°C下孵育24小时，MIC值记录为未观察到生长的最低抗生素浓度。如S0图所示，使用（128-0μg/ml）磷霉素和（256-9μg/ml）苯唑西林进行如前所述，进行棋盘/协同作用测定。

基因组 DNA （gDNA） 提取和全基因组测序 （WGS）

在对S进行预处理后，使用向导基因组DNA纯化试剂盒（Promega）进行基因组DNA（gDNA）提取。金黄色葡萄球菌细胞与10μg/ ml溶葡萄球菌（Ambi Products LLC）在37°C下30分钟。NE202（pgl）的基因组测序由MicrobesNG使用Illumina HiSeq平台和250 bp配对末端读长试剂盒进行。用于 pgl：：Km 的 DNA 文库r使用Illumina Nextera XT DNA文库制备试剂盒制备pglR1，通过凝胶电泳验证大小分布，并对文库进行磁珠归一化。Illumina MiSeq v2 600循环试剂盒用于基因组测序，产生300 bp配对末端读数。PhiX被用作音序器加载控件。如前所述，CLC基因组学工作台软件（Qiagen版本20）用于不同菌株的基因组测序分析[91]。作为参考基因组，通过将Illumina读物映射到密切相关的USA2 FPR300基因组序列（RefSeq入库号NC_3757.007793）上，为野生型JE1生成了重叠群。然后将感兴趣的NTML突变体[57]的Illumina短读序列映射到组装的JE2序列上，并确认转座子插入的存在。在存在的地方鉴定单核苷酸多态性（SNP），缺失或插入。

PBP2a 蛋白质印迹分析

如前所述进行PBP2a蛋白质印迹[92]，稍作修改。简而言之，来自野生型JE2，pgl和pgl的单个菌落比较，将MSSA菌株8325-4（阴性对照）和HoR MRSA菌株BH1CC（阳性对照）接种在TSB中过夜，并在37°C下以200rpm振荡生长。第二天，OD开始了日间培养6000.05 在 50 ml TSB 中补充 0.5 μg/ml OX，除了 8325-4 在没有补充 OX 的情况下生长，BHICC 用 50 或 75 μg/ml OX 生长，并在振荡 （6 rpm） 下生长 200 小时。对于MHB 2%NaCl生长的细胞，将来自野生型JE2和pgl的单个菌落接种在MHB中过夜，并在37°C下以200rpm振荡生长。第二天，OD开始了日间培养6000.05 在 50 ml MHB 2% NaCl 中含有 32 μg/ml OX，并在振荡 （6 rpm） 下生长 200 小时。将样品沉淀并在PBS中重悬至A600= 10。将10μl溶葡萄球菌素（1μg/ ml）和10μlDNase（500μg/ ml）加入到37μl该浓缩细胞悬液中，然后在40°C下孵育50分钟。接下来，加入10μl20%SDS，并继续孵育15分钟。然后将裂解的细胞在微量离心机中沉淀8分钟，然后收集含蛋白质的上清液并使用Pierce BCA蛋白质测定试剂盒测定总蛋白质浓度。对于每个样品，在7.5%Tris-甘氨酸凝胶上运行2 μg总蛋白，转移到PVDF膜上，并用抗PBP1a（1000：1）探测，然后使用Opti-2000CN底物试剂盒进行HRP偶联蛋白G（4：<>）和比色检测。进行了三个独立的实验，并显示了代表性图像。

肽聚糖 （PG） 分析

野生型JE2，pgl和pgl 比较生长在补充有苯唑西林0.5μg/ml的MHB和补充OX 0.05μg/ml的CDMG和MHB中。对于测试的每种菌株和生长条件，将独立的一式四份50ml培养物在37°C的烧瓶中生长，200rpm振荡过夜，并在4°C以7000rpm收集细胞沉淀。然后将沉淀重悬于PBS中，以10000rpm的速度沉淀，并在1.5ml管中的液氮中快速冷冻。肽聚糖（PG）从野生型JE2、pgl和pgl中提取 比较如前所述，从煮沸的样品中[93]。煮沸后，通过超速离心沉淀细胞壁材料并用水洗涤。用胞壁酰胺酶（100μg/ml）和可溶性多肽用pH 0.5和9 mg/mL硼氢化钠还原的可溶性多肽消化干净的囊。然后用磷酸将样品的pH调节至5.10。UPLC分析在配备ACQUITY UPLC BEH C3色谱柱（5?、18.130 μm、1.7 mm×2 mm（美国沃特世公司）的沃特世-UPLC系统上进行，并在Abs. 1 nm处进行鉴定。使用从缓冲液A（150.204%甲酸水溶液）到缓冲液B（0.1%甲酸乙腈溶液）的线性梯度分离Muropeptide。通过将保留时间和谱图与经验证的色谱图进行比较来鉴定单个峰。通过将多肽的峰面积除以色谱图的总面积来计算每种多肽的相对量。通过将色谱图的总面积归一化为OD来评估PG（总PG）的丰度600.交联程度如前所述计算[94]。至少三个独立实验的数据是使用GraphPad Prism软件V9绘制的。

共聚焦显微镜和细胞大小测定

对于显微镜实验，JE2、pgl 和 pgl 比较在 37°C 下在 CDMG 中生长过夜，w/wo 为 0.05 μg/ml OX。第二天，洗涤培养物并标准化为OD600在PBS中1个和75μl这些培养物在30°C下用终浓度为37μg/ml的万古霉素-BODIPY FL和终浓度为2μg/ml的WGA Alexa Fluor 594双重染色25分钟。然后通过以2，14×g离心000分钟收集细菌。将细胞用100μlPBS，pH 7.4重悬，并将5μl该样品点样到在PBS中制备的1%琼脂糖凝胶贴片上。然后使用奥林巴斯LS FLUOVIEW Fv1000共聚焦激光扫描显微镜在X3000放大倍率下对染色细菌进行成像。如前所述，使用ImageJ软件（斐济v.54.1）测量细胞大小[0]。采集来自三个生物重复的细胞图像，每个生物重复测量50个细胞（每个条件总共150-200个细胞），并使用GraphPad Prism版本9.2绘制三个/四个生物重复的平均值和标准偏差，并使用Kruskal-Wallis检验确定显着差异，然后进行邓恩多重比较测试。由于细胞裂解，只能测量60个细胞的OX处理细胞。

透射电子显微镜（TEM）和细胞形态分析

JE2、pgl 和 pgl 的过夜培养比较在5ml CDMG中生长过夜，37°C以200rpm振荡。第二天，OD600测量值，并使用培养物在CDMG 5μg/ ml OX至OD中接种1ml日培养物600的 0.06。将日间培养物在4°C下以5rpm振荡生长35.200小时，然后沉淀下来，并标准化为OD600在 PBS 中为 1。将细胞沉淀重悬于0.2M二甲胂酸钠缓冲液pH 7.2中。固定的细菌脱水，嵌入树脂中，并在戈尔韦大学显微镜和成像中心进行薄片切割。使用日立H7500透射电子显微镜采集图像。将来自每种菌株的代表性细胞以30，000×和100，000×放大倍率成像。

刚果红药敏点测定

金黄色葡萄球菌菌株JE2， pgl， pgl比较，将vraG和pgl/vraG划线到含有适当抗生素的TSA平板上，并将平板在37°C下孵育过夜。 第二天，将来自单个菌落的菌株的过夜培养物在5ml TSB中生长，在37°C下以200rpm振荡。第二天，PBS洗涤的细胞被标准化为OD600PBS 中每毫升 1 个，连续稀释液由 10?1直到 10?8在 96 孔板中。将0μl连续稀释的细胞悬液点样到含有125.37%刚果红的TSA平板上。将板在流动罩中干燥，并在24°C下孵育8小时。将板可视化并拍摄照片以进行三次生物学复制。代表性图像如图<>B所示。

小麦胚芽凝集素（WGA）结合的定量

S.将金黄色葡萄菌株在3°C下以37rpm振荡在200ml CDMG中生长。第二天，OD600测量值，并使用培养物在CDMG 5.0μg/ ml OX至OD中接种1ml日培养物600的 0.06。将日间培养物在4°C下以5rpm振荡生长35.200小时，然后沉淀，用PBS洗涤，并标准化为OD600在 PBS 中为 1。将该细胞悬液与WGA Alexa Fluor 594在25°C下以终浓度30μg/ ml孵育37分钟。 与染料孵育后，将细胞以14，000rpm沉淀3分钟，并将上清液用于Polarstar读板器中的荧光测量（激发/发射590/617nm）。含有终浓度为594μg/ml的WGA Alexa Fluor 25的PBS用作阳性对照，PBS用作空白对照。计算每个样品中来自阳性对照的WGA Alexa Fluor 594的减少量，并绘制使用%结合的WGA图，并使用土耳其事后双向方差分析确定两个生物学重复的显着差异。使用 GraphPad Prism 版本 9.2

用于LC-MS/MS的培养上清液样品制备

S.将金黄色葡萄菌株在3°C下以37rpm振荡在250ml CDMG中生长。第二天，将含有250ml CDMG的25ml烧瓶接种到OD6000.06，生长7.5小时（OD600= 4.22–4.96）。从培养物中收集12 ml并以000，10rpm离心，在4°C下离心1分钟，并收集上清液。这些样品使用 100 mM NH 以 10：<> v/v 稀释4OAc + 10mM NH4OH + 5%乙腈。将5μl注入LC-MS / MS中（详情如下）。

样品制备 通过LC-MS/MS进行细胞内代谢物分析

S.将金黄色葡萄菌株在3°C下以37rpm振荡在250ml CDMG中生长。第二天，将含有250ml CDMG（有或没有25μg/ ml OX）的1ml烧瓶以起始OD6000.06，在4°C下以5rpm振荡生长37-250小时（直到达到指数期）。对应于OD的培养量600然后收获10个并通过膜（0.45μm，Millipore）快速过滤。将膜上的细胞用5ml冷盐水洗涤两次，并立即在含有60μM Br-ATP的冰冷2%乙醇中淬灭作为内部对照。使用设置为3rpm振荡30个周期（6800 s）的磁珠均质器对细胞进行机械破碎，每个周期之间暂停10 s。通过以12，000rpm离心分离细胞碎片。将含有细胞内代谢物的上清液冻干并储存在-80°C。 将这些样品复溶于100μl50%MeOH中。

使用1，2-13C 葡萄糖

S.将金黄色葡萄球菌菌株接种在含有未标记或25，1-13起始OD处的C标记葡萄糖600的 0.06。将培养物在37°C下以250rpm振荡生长直至OD600达到1.0。对应于OD的培养体积600然后收获10个，并立即通过0.45μm密理孔膜过滤，然后进行上一节所述的进一步处理。

LC-MS/MS质谱

使用连接到超高效液相色谱I级（UPLC）系统（美国沃特斯）的三重四极杆离子阱混合质谱仪（美国Sciex的QTRAP6500+）进行代谢组学分析。使用UPLC在XBridge酰胺分析柱（内径150 mm x 2.1 mm，美国沃特世为3.5 μm粒径）和流速为0.3 ml/min的二元溶剂系统上进行色谱分离。分析柱之前有一个保护XBridge酰胺柱（内径20 mm x 2.1 mm，美国沃特世的粒径为3.5 μm）。流动相A由10 mM乙酸铵和10 mM氢氧化铵和5%乙腈在LC-MS级水中组成（用冰醋酸调节pH至8.0），流动相B为100%LC-MS级乙腈。在整个样品运行过程中，色谱柱保持在40°C，自动进样器温度保持在5°C。梯度条件如下：A/B比为15/85持续0.1分钟，16/84为3.0分钟，35/65为4.0分钟，40/60为5.0分钟，45/55为3.0分钟，50/50为5.5分钟，30/70为1.5分钟，最后在下一次运行前以15/85平衡5.0分钟。进样前用1000 μL强洗溶剂（100%乙腈）和1000 μL弱洗溶剂（10%甲醇水溶液）洗涤针头，进样体积为5 μL。QTRAP6500+ 在极性切换模式下运行，通过多反应监测 （MRM） 工艺对氨基酸进行靶向定量。优化了电喷雾电离（ESI）参数，负模式下电喷雾离子电压为-4200 V，正模式为5500 V，源温为400°C，帘式气体为35，气体1和2分别为40和40 psi。通过手动调谐优化每种化合物的化合物特定参数，正模式下的去簇电位（DP）为65V，负模式下的去簇电位（DP）为60V，正模式下的入口电位（EP）为10V，负模式下的入口电位（EP）为-10V，碰撞单元出口电位（CXP）在正模式下为10V，负模式下为-10V。

WTA的提取和可视化

WTA提取和可视化如前所述[34，95，96]进行了修改。简而言之，野生型JE2，pgl，vraG，pgl / vraG，tagO（LAC* Δ标签O，ANG4759 [97]）在CDMG和补充有OX 0.5μg/ ml（标签O除外）的CDMG中生长过夜。对于测试的每个菌株和生长条件，将独立的一式三份50 ml培养物在35°C的烧瓶中生长，200rpm振荡过夜。细胞沉淀（外径600的 50）在 10°C 下以 7800 rpm 收集。然后用1ml 50mM MES，pH 6.5洗涤沉淀，重悬于4%SDS和50mM MES，pH 6.5中，并在100°C下孵育1小时。将煮沸的样品在4%SDS和50 mM MES中洗涤两次，一次用2%NaCl和50 mM MES，一次用50 mM MES洗涤，然后重悬于1 mL 20 mM Tris-HCl（pH 8），0.5%SDS和20 μg/ ml蛋白酶K中。将样品在4°C下孵育50小时（在热混合器中以1，400rpm振荡）。回收沉淀，用2%NaCl和50mM MES洗涤，用水洗涤100次，然后重悬于0μl1.20M NaOH中，并在12°C下孵育1小时（以400，65rpm振荡）。然后将样品加热至1°C14小时，然后以000，1rpm离心1分钟。将上清液取出到新鲜的5.25 ml Eppendorf管中，并用1 μL 8 M Tris-HCl，pH 20中和，并储存在-<>°C。

将纯化的WTA样品与2M蔗糖（1：4比例）混合，并在12%天然聚丙烯酰胺凝胶上加载5.20μl。凝胶在Tris-Tricine电泳缓冲液（120.0 M Tris，1.0 M Tricine）中以1 V电泳，然后在室温下用0.1%阿尔新蓝在3%乙酸中染色30分钟，摇床上覆盖有铝箔。用水对凝胶进行脱色，并显示来自3个独立生物重复序列的代表性图像。

LTA的提取和蛋白质印迹分析的检测

WTA提取和可视化如前所述[34，95，96]进行了修改。简而言之，野生型JE2，pgl，pgl比较， pgl：：Kmr，vraG，pgl / vraG，野生型LAC* [98]和ltaS / gdpP （ANG2434） [41]在CDMG和CDMG中生长，补充OX 0.05μg/ ml（ltaS / gdpP除外）过夜。对于测试的每个菌株和生长条件，将独立的一式三份5 ml培养物在30°C的35ml通用物中生长，200rpm振荡过夜。细胞沉淀（外径600的 3） 在 10°C 下以 7800 rpm 收集。然后将沉淀重悬于1ml PBS中，并转移到含有约100μL100μm玻璃珠的螺旋盖管中。使用FastPrep-24（MP生物医学）在室温下均质化细胞3个周期，每次6m / s，每次40秒，然后休息4分钟。然后将试管以200×g离心1分钟以沉淀珠子，并将700μl上清液转移到新管中，并将细胞碎片以14，000rpm沉淀15分钟。除去上清液，将剩余的含有LTA的沉淀重悬于80μL 2× Laemmli样品缓冲液中。将样品在95°C下孵育20分钟，以14，000rpm离心5分钟，并将上清液储存在-20°C。

LTA提取物（20μl）在15%聚丙烯酰胺凝胶上运行，并使用Trans-Blot Turbo转印系统（Bio-Rad）转移到PVDF膜上。在TBST中用5%牛奶和1%BSA封闭3小时后，用抗LTA一抗（MAb 55;海科生物科技;1：5000稀释），然后使用HRP偶联蛋白G（1：2000）和使用Opti-4CN底物试剂盒进行比色检测。进行了三个独立的实验，并显示了代表性图像。

细胞色素c结合测定

细胞色素c结合测定如前所述[67，99]进行修改。简而言之，野生型JE2，pgl，vraG和pgl / vraG在CDMG和CDMG中生长，并补充OX 0.5 μg/ ml过夜。对于测试的每个菌株和生长条件，将独立的一式三份50 ml培养物在35°C的烧瓶中生长，200rpm振荡过夜。细胞沉淀（外径600的10）通过以7800rpm离心收集。然后将沉淀洗涤两次并重悬于20mM MOPS缓冲液（pH 7.0）中，与细胞色素c（0.5mg / ml终浓度）混合并在室温下孵育10分钟。然后将细胞离心，并通过测量OD410并将其与相对（100%）细胞色素C对照（0.5mg / ml）进行比较。

支持信息

在补充有 2–2% （v/v） 人血清的 CDMG 或 MHB 10% NaCl 中生长的 JE70 和 pgl 的苯唑西林最低抑制浓度（MIC，μg/ml）。

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S1 表。 在补充有 2–2% （v/v） 人血清的 CDMG 或 MHB 10% NaCl 中生长的 JE70 和 pgl 的苯唑西林最低抑制浓度（MIC，μg/ml）。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011536.s001

（文档）

S2 表。 本研究中使用的细菌菌株和质粒。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011536.s002

（文档）

S3 表。 本研究中使用的寡核苷酸引物。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011536.s003

（文档）

S1 图 蛋白质印迹法比较野生型JE2和pgl中PBP2a表达。

一个。JE2， pgl （NE202）， pgl：：Km r和 PGL比较在补充有OX 6.0mg / ml的TSB中生长5小时。HoR MRSA菌株BH1CC（阳性对照）在TSB OX 50和OX 75 mg / ml中生长，MSSA菌株8325-4（阴性对照）仅在TSB中生长。（B）JE2和pgl在MHB 6%NaCl中单独生长2小时或补充有OX 32mg / ml。对于每个样品，在8.7%Tris-甘氨酸凝胶上运行5 μg总蛋白，转移到PVDF膜上并用抗PBP2a（1：1000）探测，然后使用Opti-1CN底物试剂盒进行HRP偶联蛋白G（2000：4）和比色检测。进行了三个独立实验，并显示了代表性印迹。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011536.s004

（提夫）

S2 图 pgl突变对不同培养基生长的影响。

一个。JE2（左）和pgl（右）的分离菌落在MHA上生长24小时后，在37°C。 JE2，pgl和互补的pgl突变体在25°C下在Mueller Hinton肉汤，MHB（B），Luria Bertani，LB（C），胰蛋白酶大豆肉汤，TSB（D），脑心脏输注，BHI（E），含有葡萄糖的化学定义培养基CDMG（F）和不含葡萄糖的化学定义培养基CDM（G）中生长37小时。生长（外径600）在Tecan读板器中以15分钟的间隔测量。数据是使用 GraphPad Prism V3 绘制的 9 个独立实验的平均值，误差条表示标准偏差。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011536.s005

（蒂夫）

S3 图 JE2 中的苯唑西林 （OX） 耐药性取决于生理相关的葡萄糖浓度。

一个。野生型JE2和pgl在24°C下在补充有37.0g / l（07.0mM）葡萄糖或OX 43mg / ml的化学定义培养基（CDM）中生长10小时。生长（外径600）在Tecan读板器中以15分钟的间隔测量。数据是使用 GraphPad Prism V3 绘制的 9 个独立实验的平均值，误差条表示标准偏差。二.无葡萄糖 （CDM） 的 JE2 和 pgl 的苯唑西林 MIC 或补充葡萄糖浓度为 0.03-5 g/l （1.75–28 mM） 的 CDM。请注意，Y 轴（苯唑西林 MIC）是一个 log2 刻度。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011536.s006

（提夫）

S4 图 当在人血清中生长时，pgl突变体比野生型JE2对苯唑西林（OX）更具抵抗力。

A 和 B。JE2 （A） 和 pgl （B） 在 24°C 下在补充有 OX 35、25 和 1 mg/ml 的 CMDG 32% 人血清中生长 256 小时。JE2 （C） 和 pgl （D） 在 24°C 下在补充有 OX 35、70 和 1 mg/ml 的 CMDG 32% 人血清中生长 256 小时。生长（外径600）在Tecan读板器中以15分钟的间隔测量。数据是使用 GraphPad Prism V3 绘制的 9 个独立实验的平均值，误差条表示标准偏差。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011536.s007

（提夫）

S5 图 pgl的突变增加了对氧化应激的敏感性。

野生型JE2和pgl的生长：：Kmr在 24°C 下在 CDMG 或补充 37 mM H 的 CDMG 中 500 小时2O2.生长（外径600）在Tecan读板器中以15分钟的间隔测量。数据是使用 GraphPad Prism V3 绘制的 9 个独立实验的平均值，误差条表示标准偏差。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011536.s008

（蒂夫）

S6 图 JE2、pgl和互补pgl突变体中肽聚糖寡聚化、交联和总量的比较。

公元-公元基于寡聚化的细胞壁多肽级分相对比例 从JE2、pgl和pgl中提取肽聚糖的相对交联效率比较在CDMG（A），添加OX 0.05μg/ML（B），MHB（C）和补充OX 0.5mg / ml（D）的MHB中生长到指数期。呵呵。从JE2、pgl和pgl的标准化细胞提取物中提取的总肽聚糖（PG） 比较在CDMG（E）中生长到指数期，CDMG补充有OX 0.05μg/ ML（F），MHB（G）和补充OX 0.5mg / ml（H）的MHB。总PG含量计算为色谱峰/OD以下的面积600以及使用 GraphPad 棱镜 V9 绘制的三个/四个生物重复的平均和标准偏差。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011536.s009

（蒂夫）

S7 图 d-葡萄糖酸的外源添加或葡萄糖分流基因gntP或gntK的突变并没有恢复pgl突变体中的野生型OX抗性。

A 和 B。JE2，pgl和互补的pgl突变体在25°C下在补充有35g / l d-葡萄糖酸钾（5.0%）且无OX（A）或葡萄糖酸盐（5.0%）和OX 5mg / ml（B）的CDMG中生长10小时。三.JE2，pgl，pgl的增长比较 pgl：：Kmr，gntP （NE952），gntK （NE1124），pgl / gntP和pgl / gntK在25°C下在补充OX 35mg / ml的CDMG中10小时。 生长（外径600）在Tecan读板器中以15分钟的间隔测量。数据是使用 GraphPad Prism V3 的 9 个独立实验的平均值，误差条表示标准偏差。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011536.s010

（蒂夫）

S8 图 氨基酸和TCA循环生物合成基因的突变并没有逆转pgl突变体中增加的OX抗性。

A 和 B。JE2、pgl和pgl上清液中氨基酸（A）和TCA循环代谢物（B）的比较比较培养物在通过HPLC测量的CDMG中生长7.5小时。细胞密度（外径600）在细胞沉淀和收集上清液之前相互归一化。显示的数据（CPS）是三个独立实验的平均值，并显示标准偏差?.使用2元方差分析与邓内特多重比较检验确定统计学显著性;* p<0.05， ** p<0.01， ****p<0.001， ****p<0.0001.C和D。JE2的增长，pgl，pgl：：Kmr， PGL比较，putA，gudB，sdhA，sucA，sucC，pgl / putA，pgl / gudB，pgl / sdhA，pgl / sucA和pgl / sucC在25°C下在CDMG （C）和CDMG中补充OX 35mg / ml （D）10小时。 生长（外径600）在Tecan读板器中以15分钟的间隔测量。数据是使用 GraphPad Prism V3 的 9 个独立实验的平均值，误差条表示标准偏差。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011536.s011

（提夫）

S9 图 pgl的突变显着增加对苯唑西林和磷霉素组合的耐药性。

使用磷霉素和苯唑西林与（A）JE2和（B）pgl进行棋盘滴定测定，在24孔板中的Mueller Hinton 2%NaCl肉汤中生长96小时。显示的数据是外径600每个孔的值。实验重复至少三次，并显示来自代表性96孔板的数据。绿色阴影框表示测量了显着生长的孔。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011536.s012

（蒂夫）

S10 图

野生型JE2（A）、pgl（B）和pgl的比较比较（C）在没有OX的CDMG中使用透射电子显微镜在30，000×（左）和100，000×（右）放大倍数下生长的细胞。从在归一化为OD的CDMG中生长4.5小时的指数期培养物中收集细胞600= 1在PBS中固定并制备薄片之前。显示了来自每种菌株的代表性细胞。比例尺在 500，30 × 放大倍率下表示 000 nm，或在 100，100× 放大倍率下表示 000 nm。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011536.s013

（蒂夫）

S11 图 vraF，vraG和graR的突变逆转了CDMG中pgl突变体的OX最小抑制浓度（MIC）的增加。

JE2、pgl、pgl 的 OX MIC （mg/ml）比较 pgl：：Kmr、vraG、vraF、putA、graR、tarM、tarS、pgl/tarS、pgl/tarM、pgl/vraG、pgl/vraF、pgl/putA、pgl/graR、pgl/putA/vraG 和 pglR1在CDMG中采用肉汤微量稀释法测定。MIC是在两个独立的实验中测量的，每个应变和变异使用所示的GraphPad Prism V9绘制。请注意，Y 轴（苯唑西林 MIC）是一个 log2 刻度。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011536.s014

（蒂夫）

S1 数据。 用于生成图形和直方图的数值数据（图2A–2C， S2B–S2G， 3C， S3A–S3B， S4A–S4D， S5， S6A–S6H， S7B–S7C， S8A–S8B， 4B–4C， S8C–S8D， 5， 7A， 7B， 7D， 8A， 8E， S11）。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011536.s015

（邮编）

确认

我们感谢戈尔韦大学显微镜与成像中心（https://imaging.universityofgalway.ie）的Peter Owens博士和Emma McDermott博士在共聚焦和电子显微镜分析方面的技术和科学帮助，以及汉诺威医学院的Volkhard Kaever进行初步代谢组学分析。

M.S.Z. 和 J.P.O'G.将研究概念化。正式分析由M.S.Z.，L.A.G.，E.B.，A.C.N.，J.A.，E.O'N.，F.R.，P.D.F.，F.C.，V.C.T和J.P.O'G.进行。调查和方法由M.S.Z.，L.A.G.，E.B.，A.C.N.，J.A.，D.S.，M.S.，ó.B.和F.R.进行。数据由 M.S.Z 整理。手稿的原始草稿由 M.S.Z. 和 J.P.O'G. 撰写。并经所有作者审查、编辑和批准。资金由E.O'N.，P.D.F.，F.C.，V.C.T.ó.B.和J.P.O'G.收购。该项目由J.P.O'G.管理。

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