引文： Leggewie M， Scherer C， Altinli M， Gestuveo RJ， Sreenu VB， Fuss J， et al. （2023） 在与登革热和基孔肯雅病毒共同感染的背景下，埃及伊蚊RNA对寨卡病毒的干扰反应。公共科学图书馆 Negl Trop Dis 17（7）： e0011456. https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0011456
编辑 器： Jeremy V. Camp，奥地利维也纳梅迪齐尼什大学
收到： 5月 2023， 12;接受： 2023月 13， 2023;发表： <>月 <>， <>
版权： ? 2023 莱格维等人。这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。
数据可用性： 原始小RNA数据存放在NCBI序列读取档案中，生物样品加入代码ID PRJNA917075。所有其他数据（qRTPCR和荧光素酶读数）存放在Zenodo，可在DOI：10.5281 / zenodo.8046449下免费获得。
资金： 这项研究得到了德国感染研究中心（DZIF）（TTU 01.701和TTU 01.708）（ES），欧盟根据ZIKAlliance拨款协议No 2020（ES，ABF，AK）的地平线734548研究和创新计划，英国MRC（MC_UU_12014/8）（AK）的支持。该出版物得到了欧洲病毒档案走向全球（EVAg）项目的支持，该项目已根据第2020号赠款协议获得了欧盟地平线653316研究和创新计划的资助。这项工作得到了DFG研究基础设施NGS_CC（项目407495230 JF）的支持，作为下一代测序能力网络（项目423957469 JF）的一部分。NGS分析在基因组分析能力中心（基尔）进行。资助者在研究的设计中没有作用;在数据的收集、分析或解释中;在手稿的写作中;或在决定公布结果时。
竞争利益： 提交人声明不存在相互竞争的利益。
1. 简介
寨卡病毒（ZIKV）是一种虫媒病毒，属于黄病毒科（黄病毒属）。继2015年在美洲发现ZIKV并与吉兰-巴雷综合征和小头畸形相关后，ZIKV一直是国际公共卫生和研究关注的焦点[1，2]。除ZIKV外，已知其他引起公共卫生关注的重要虫媒病毒，如登革热病毒（DENV）（一种相关的黄病毒）和基孔肯雅病毒（CHIKV）（一种甲病毒）在同一地理区域传播[3]。此外，对人间病例的各种研究表明，寨卡病毒也可能与登革热病毒[4-8]、CHIKV [5，7-9]或两者兼有感染[4，8，10]，并且这些合并感染似乎在流行和流行地区都很常见，从而增加了公共卫生负担。目前明显缺乏研究评估虫媒病毒合并感染对患者短期和/或远期临床结局的影响[11]。病毒的相互作用可能很复杂，预计结果会有所不同，甚至可能因病例而异。但需要注意的是，当虫媒病毒相互支持感染或对宿主的免疫应答有加剧作用时，可能会发生疾病严重程度的增强[11]。关于CHIKV、DENV和ZIKV共享细胞嗜性和宿主免疫应答干扰机制的报告强化了这些病毒合并感染可能增强疾病严重程度的观点[11]。由于缺乏针对虫媒病毒的有效药物和疫苗，控制依赖于疾病的预防，即媒介控制[12]。寨克病毒、CHIKV和登革病毒由伊蚊属成员传播，埃及伊蚊是所有三种病毒的主要载体之一[13-15]。因此，可能发生同一蚊子的混合感染和随后的共同传播。事实上，Ae 中的合并感染研究。埃及伊蚊发现，这些蚊子可同时感染并传播寨卡病毒、CHIKV和登革热病毒的所有组合[13，16-18]。有趣的是，除CHIKV外，合并感染似乎不会影响蚊子的易感性和病媒能力[13]。
蚊子对虫媒病毒感染的主要免疫反应是RNA干扰（RNAi），它也可能在混合感染期间差异调节感染动力学中发挥作用。在艾。埃及伊蚊是参与控制虫媒病毒感染的主要RNAi途径，是外源性小干扰RNA（exo-siRNA）和P元素诱导的WIMPY testis （PIWI）相互作用RNA（piRNA）途径[19]。
抗病毒外切 siRNA 途径由源自病毒复制的病毒双链 （ds） RNA 的存在引发。一旦检测到，dsRNA被Dicer 2（Dcr2）酶切割成21核苷酸（nt）大小的病毒特异性（v）siRNA。然后将这些掺入RNA诱导的沉默复合物（RISC）中，在那里它们与Argonaute 2（Ago2）蛋白结合，Argonaute 19（Ago20）蛋白使用vsiRNA的单链作为指导来定位和靶向细胞内的互补病毒RNA序列。病毒RNA随后被复合物裂解，从而抑制病毒复制[21，2]。外显siRNA途径参与控制所有主要的虫媒病毒，如从受感染的蚊子和衍生细胞中分离出vsiRNA所示[2]。对于大多数测试的虫媒病毒，外切siRNA途径的关键参与者（包括Dcr22和Ago27）的敲低（KD）或敲除（KO）可导致病毒复制增加[2-2]。ZIKV除外，与Dcr28敲除相比，沉默或敲除Ago29无显著抗病毒作用[<>，<>]。
piRNA是具有24-30 nt的相对较宽大小范围的小型RNA。虫媒病毒来源的piRNA已在蚊子和蚊子来源的细胞中都有报道[22-25，29-39]。Ae中病毒衍生piRNA生物发生的关键参与者。埃及伊蚊来源的Aag2细胞被鉴定为Piwi5 / Piwi6和Ago3。RNA转录本由Piwi5 / 6或Ago3结合，并进入所谓的乒乓扩增循环。乒乓扩增循环产生的piRNA分子进一步表现为位置1（U1;反义序列）的尿苷酸偏差或位置10（A10;检测序列）的腺嘌呤明显偏向，以及10个核苷酸的序列重叠[29，32，34，39]。另一种Piwi蛋白Piwi4不直接参与乒乓球循环piRNA的生物发生[24，31，33]。然而，它结合源自Ae中病毒cDNA的DENV特异性piRNA。埃及伊蚊[24]，与piRNA和siRNA途径的蛋白质相互作用[24，31，40]，对所有测试的虫媒病毒具有抗病毒作用[22-24，29，31-33]。
RNAi参与控制Ae的ZIKV [29]，DENV [24，25，38，39]和CHIKV [32，36，37，41]感染。埃及伊蚊来源的细胞。然而，目前尚不清楚单一虫媒病毒感染和合并感染之间蚊子免疫系统的动态是否不同。在这里，我们研究了ZIKV-CHIKV或ZIKV-DENV共同感染与Ae中RNAi反应的相互作用。埃及伊蚊来源的细胞和蚊子。我们确认以前的报告，即蚊子对合并感染的耐受性很好。体外对ZIKV-CHIKV混合感染的RNAi反应类似于先前单个病毒感染的结果。为了了解蚊子RNAi反应是否调节蚊子的虫媒病毒合并感染，我们沉默/敲除蚊子细胞中的RNAi反应效应子。在相应病毒的单一和合并感染的情况下，相同的抗病毒RNAi蛋白导致沉默/敲除时病毒感染增加。然而，以病毒依赖性方式观察到抗病毒RNAi蛋白作用的差异。Piwi4对ZIKV具有抗病毒作用。在CHIKV中观察到Ago2抗病毒活性，但对ZIKV没有观察到。与以前的报告相反，我们发现沉默或敲除任何选定的RNAi蛋白都没有显示出对DENV-1的抗病毒活性，无论是在ZIKV的单一感染还是共同感染中。
综上所述，当RNAi反应起作用时，蚊子和衍生细胞支持ZIKV与CHIKV或DENV的混合感染，其水平与单一感染相似。
2. 方法
细胞系和蚊子
Aag2-AF5细胞（从欧洲细胞培养物保藏（ECACC）获得;19022601;称为AF5）是Ae的单克隆细胞系。埃及伊蚊来源的Aag2细胞[42]。Aag2-AF525（AF525）是源自上述Aag2-AF2细胞的Ago5敲除系[28]。蚊子来源的细胞系在Leibovitz的L-15培养基（赛默飞世尔科技，美国）中生长，并补充有10%胎牛血清（FCS）（GIBCO Thermo Fisher Scientific，美国），青霉素 - 链霉素（P / S，最终浓度分别为100单位/ ml和100μg/ ml）（赛默飞世尔科技，美国）和10%色糖磷酸盐肉汤（TPB）（GIBCO Thermo Fisher Scientifc，美国）。
A549/BVDV-NPro（A549 Npro）细胞，稳定表达牛病毒性腹泻病毒NPro蛋白（由英国圣安德鲁斯大学的R.E. Randall提供）[43]和Vero细胞（Vero81;ATCC CCL-81，Cercopithecus aethiops）保存在Dulbecco的改良鹰培养基（DMEM）（德国PAN Biotech）中。培养基补充有10%（A549 NPro）或5%（Vero81）FCS，10%TPB和P / S.细胞在37°C / 5%CO下生长2.
嘶。埃及伊蚊Urca（2016年使用产卵器在里约热内卢收集;[44]）蚊子菌株保持在10-27°C的28%蔗糖溶液上，光相为12h，相对湿度约为80%。
病毒库存
对于关键RNAi蛋白的沉默和敲除实验，使用以下病毒。巴西ZIKV菌株PE243已在别处描述[45]。CHIKV （001V-02242;菌株UVE/CHIKV/2014/FR/CNR_24）和DENV-1（001V-02228;菌株UVE/DENV-1/2014/FR/CNR_25329）由艾克斯-马赛大学（AMU）的欧洲病毒档案馆-全球（EVAg）提供。ZIKV和DENV-1储备是在A549 NPro电池上生产的。为了生产CHIKV原液，使用了Vero81细胞。通过50%组织培养感染剂量（TCID）滴定最终储备液50），使用Vero81细胞（CHIKV和ZIKV）或A549 NPro细胞（DENV）。
以下病毒储备用于小RNA测序分析：DENV-1株DENV-1 / MX / BID-V7614 / 2009（KJ189345），ZIKV株MRS_OPY_Martinique_PaRi_2015（KU647676）和CHIKV株06-021（AM258992）。
dsRNA合成
用于 Ae 的体外转录 dsRNA。埃及伊蚊如前所述，Ago2、Ago3、Piwi4、Piwi5和Piwi6以及eGFP是使用PCR扩增片段通过T7 RNA聚合酶转录产生的[33]。简而言之，通过PCR扩增由T7 RNA聚合酶启动子序列组成的基因特异性片段。所有PCR扩增的片段均通过Sanger测序验证并用于体外转录。随后使用MEGAscript RNAi试剂盒（美国赛默飞世尔科技）进行基于色谱柱的纯化，根据制造商的说明进行。
小RNA测序和分析
研究混合感染和单次感染过程中病毒特异性小RNA的产生，Ae。埃及伊蚊感染了寨卡病毒或混合感染了登非病毒+寨卡病毒或呼吸道病毒+寨卡病毒（107每种病毒的FFU/ml浓度）[46]。根据制造商的说明，在感染后1天（dpi）用TRIzol LS（美国Invitrogen）分离总RNA（混合和非混合蚊子样本;详见S14文件中表B）。如前所述，华大基因（中国香港）的BGISEQ-1使用500 μg总RNA进行小RNA测序[28]。
此外，使用AF5细胞在体外研究了混合感染和单次感染期间病毒特异性小RNA的产生。为此，8x105将细胞接种到6孔板中并感染ZIKV（MOI 1）或与DENV + ZIKV或CHIKV + ZIKV的混合物（每种病毒MOI 1）混合感染。根据制造商的说明，用TRIzol（美国Invitrogen）以96 hpi分离总RNA。在CCGA（德国基尔）使用Nextflex小RNA-Seq试剂盒v100（美国珀金埃尔默公司）使用3 ng总RNA进行文库制备，然后在NovaSeq6000 SP v1.0平台上进行文库测序。
如前所述，对小RNA进行分析[33]。映射到ZIKV基因组或抗基因组的读段表示为%映射读量或百万分之一读数（RPM），以使数据标准化，从而在单次和合并感染实验之间进行比较。
对于蚊子样品（ZIKV：2次重复，ZIKV+CHIKV：4次重复和ZIKV+DENV：5次重复）和细胞（ZIKV：2次重复，ZIKV+CHIKV：2次重复和ZIKV+DENV：1）的小RNA分析，首先单独分析来自独立样品的数据;在此之后，确定了病毒特异性小RNA的平均值。
为了确定单感染与混合感染实验中ZIKV衍生的siRNA之间的关系，在单独ZIKV（x轴）的RPM平均读数与ZIKV+CHIKV或ZIKV+DENV（y轴）之间进行了线性回归分析。r平方值反映了作为单次或合并感染的结果映射到基因组或抗基因组的ZIKV衍生siRNA的变异程度。此外，为了揭示与CHIKV或DENV共同感染期间ZIKV衍生siRNA丰度的模式，将平均读数转换为log2（ZIKV + CHIKV或ZIKV + DENV相对于单独的ZIKV）的每个nt位置（基因组或反基因组）的倍数变化，并可视化为散点图。
寻找共感染病毒的病毒基因组相似性区域。
为了研究在共同感染实验期间，来自一种病毒的vsiRNA理论上是否可以靶向共同感染的病毒，使用GenBank数据库来获取DENV 1型（GenBank id：KJ189345），ZIKV株MRS_OPY_Martinique_PaRi_2015（GenBank id：KU647676）和CHIKV（GenBank id：AM258992）的基因组序列。使用EMBOSS软件（版本6.6.0.0）的分离器程序将序列分成21-mer（k-mers，k = 21）序列，重叠20 nt。使用原始细胞的预设设置，将每个k-mer集与病毒基因组进行比较。选择具有至少20个核苷酸身份的序列作为匹配。
敲低研究
将AF5细胞接种在24孔板中，2x105细胞/井。第二天，使用200μlDharmafect1试剂（GE Dharmacon）每孔转染2ng基因特异性dsRNA或对照dsRNA（eGFP）的细胞。在转染后24小时（hpt），以技术重复方式进行ZIKV，DENV或CHIKV（MOI 1）的单次感染或ZIKV+CHIKV或ZIKV+DENV组合中的混合感染（每种病毒的MOI 1）。在感染后96小时（hpi），汇集技术重复，并使用TRIzol（美国Invitrogen）从细胞中分离RNA。使用1.5μgRNA使用莫洛尼鼠白血病病毒（M-MLV）逆转录酶（美国Promega）和随机六聚体引物（美国赛默飞世尔科技）生产cDNA。使用基因特异性引物对病毒靶标进行了SYBR绿色qPCR（德国QIAGEN）（S1文件中的表A）。使用2-ΔΔCT方法以核糖体蛋白S7 RNA为管家基因，eGFP dsRNA样品为对照组。总体而言，每个实验独立重复三次。
敲除细胞系的病毒感染
将AF5和AF525细胞以24x2接种在10孔板中5细胞/井。第二天，细胞单独感染ZIKV，DENV或CHIKV（MOI 1）或ZIKV + CHIKV或ZIKV + DENV的组合（每种病毒MOI 1）。所有感染场景都是一式两份设置的。在96 hpi下，合并重复项，并使用TRIzol（美国Invitrogen）从细胞中分离RNA。如上述敲低实验所述进一步处理RNA。值得注意的是，在这种情况下，AF5细胞被用作对照组。每个实验独立重复三次。
统计分析
所有统计分析和数据可视化都在R版本4.1.2中运行，除了在GraphPad Prism v.7中执行的线性关联和散点图分析。使用方差分析或成对t检验分析正态分布数据。使用Kruskall-Wallis（KW）和Dunn事后检验分析非正态分布的数据。所有多重比较的P值均使用Bonferroni校正进行校正。P 值 <0.05 被视为具有统计显著性。统计分析的结果合并在S1文件的表C，D和F中。
3. 结果
体外和体内单次或同时感染 CHIKV 或 DENV 期间 ZIKV 的小 RNA 产生谱
为了比较混合感染和单一感染之间的病毒特异性小RNA产生，Ae。埃及伊蚊要么仅感染寨克病毒，要么通过血粉同时感染（寨克病毒+志克病毒、寨克病毒+登病毒）。14天后通过qPCR验证成功感染并分离总RNA（S1文件中的表B）。在此之后，对小RNA进行测序，定位到病毒基因组并进行分析（S1文件中的表B）。
在所有样本中，大多数病毒特异性小RNA的长度为21 nt，并且大部分与基因组和抗基因组相似（图1），没有真正的重点或明显偏好特定区域（图2）。值得注意的是，与单一ZIKV感染或DENV合并感染相比，在CHIKV合并感染期间观察到的ZIKV特异性21 nt vsiRNA较少（S1文件中的图1A和表B）。我们研究了单一ZIKV感染与混合感染的映射读数之间的线性关系。与定位于抗基因组的ZIKV特异性siRNA相比，定位于基因组的ZIKV特异性siRNA显示出更高的正相关关系（S1文件中的图1A和A）。
散点图观察了单次和合并感染期间映射到ZIKV的读段的相对表达，显示映射到ZIKV抗基因组的读段具有很强的分散性，同时CHIKV和DENV共同感染的映射读段增加。这些分析支持在混合感染期间，特别是与CHIKV的vsiRNA定位到ZIKV抗基因组的分散差异（S1文件中的图1A和A）。它们还支持ZIKV衍生的vsiRNA在混合感染期间抗基因组图谱的显着差异。在ZIKV和DENV合并感染后，与ZIKV相比，来自DENV的vsiRNA量相对较少（图1A和1C）。
总体而言，映射到vpiRNA大小的读取数量很少（25-29 nts）（图1，以及S1文件中的B，C和表B）。仅对于CHIKV，观察到具有乒乓球生产特异性特征的vpiRNA（S1文件中的图C）。ZIKV和DENV均未观察到这种情况，无论单次感染还是合并感染。
为了了解单次感染和共同感染之间病毒特异性小RNA的这些差异是否也会发生在蚊子细胞中，在细胞培养中进行感染。嘶。埃及伊蚊来源的AF5细胞是单次感染（ZIKV）或混合感染（ZIKV + CHIKV和ZIKV + DENV），分离总RNA，小RNA测序，定位和分析（S1文件中的表B）。
ZIKV特异性小RNA的长度大多为21 nt，来源于基因组和抗基因组（图3A）。AF5细胞中单感染和混合感染之间的ZIKV特异性siRNA的数量非常相似（S3文件中的图4A，1A和D）。 在AF5细胞中产生的病毒特异性piRNA获得的数据与在蚊子中获得的结果相当，尽管CHIKV特异性piRNA的数量（S1文件中的图E）和序列特征并不那么明显（S1文件中的图F）。这可能是由于由于不同的文库/测序方法，这些样品中piRNA大小范围内的小RNA数量通常较低。先前在这些测序方案中观察到piRNA大小的小RNA也有类似的减少[28]。与受感染的蚊子相比，沿着基因组/抗基因组的小RNA图谱和分布，特别是CHIKV的vsiRNA在细胞中相似（图2B和4B）。在DENV特异性小RNA的情况下，感染细胞中产生的vsiRNA数量非常低，因此，不可能沿着基因组和抗基因组进行良好的映射（图4C）。
为了研究来源于一种病毒的vsiRNA是否可以靶向共同感染的病毒，进行了计算机分析。ZIKV基因组被分成21个，并分析了与CHIKV或DENV基因组的互补性，不允许任何或1个错配。在ZIKV和CHIKV的情况下，没有发现可能交叉靶向共同感染病毒的完美互补对。在ZIKV和DENV的情况下，确定了少量的高相似性对（允许1个不匹配）。一对与包膜蛋白中的一个区域匹配，另外3对与NS5的不同区域匹配（S1文件中的表E）。
沉默或敲除RNAi效应子对虫媒病毒单一感染与合并感染的影响。埃及伊蚊来源的细胞
基于dsRNA的RNAi效应子沉默。
RNAi效应蛋白的抗病毒活性仅用于单一虫媒病毒感染。在混合感染和单一虫媒病毒感染期间，这些蛋白质的相互作用及其抗病毒作用的能力是否相同，目前尚不清楚。为了研究哪些RNAi效应子在混合感染期间具有抗病毒作用，在Ae中进行了基于dsRNA的沉默实验。埃及伊蚊来源的AF5细胞，然后是单个（ZIKV，CHIKV或DENV）或混合感染（ZIKV+CHIKV或ZIKV+DENV）。用特异性dsRNA转染细胞（靶向Ago2，Ago3，Piwi4，Piwi5，Piwi6和eGFP作为对照），24小时后在MOI 1感染。以96 hpi分离总RNA，并使用dseGFP转染细胞作为对照，通过qPCR验证目标转录本的成功沉默。病毒RNA水平通过qPCR确定，并与单次和合并感染之间的dseGFP对照细胞相比对病毒感染的影响。
RNAi效应子沉默对ZIKV复制的影响通常不受混合感染的影响（图5A）。更具体地说，无论感染类型如何，ZIKV复制都不会受到沉默Ago2，Piwi5或Piwi6的显着影响。ZIKV复制仅在Piwi4沉默时显着增加（图5A）。RNAi效应蛋白对CHIKV的抗病毒活性对于单一感染和合并感染是相同的（图5C）。在这两种情况下，CHIKV复制仅在Ago2沉默细胞中显着增加。
对于DENV-1，感染类型和沉默对病毒复制有显著影响（图5B）。有趣的是，Ago2，Ago3和Piwi 6沉默导致DENV-1在单次感染期间显着减少，但在DENV+ZIKV混合感染细胞中并非如此（图5B）。
虫媒病毒感染在Ago2-敲除Ae。埃及伊蚊来源的细胞。
为了进一步了解抗病毒RNAi反应的作用，在敲除细胞中重复实验。为此，使用Ago2敲除细胞（AF525）。AF525或AF5（对照）细胞在MOI 1处为单个或共同感染（ZIKV + CHIKV，ZIKV + DENV），并在96 hpi下分离总RNA。通过qPCR测定病毒RNA水平，并在单个和混合感染样品之间以及AF525和AF5细胞之间进行比较。
总体而言，与AF525细胞相比，AF5中的ZIKV RNA水平较低（图6A）;然而，ZIKV的单次感染导致AF5和AF525细胞中相似的ZIKV RNA水平。相比之下，在与CHIKV或DENV共同感染的情况下，AF525细胞中的ZIKV RNA水平显着低于AF5细胞（S6文件中的图1和表D） 比较AF525细胞中的不同感染情况，在与CHIKV混合感染期间观察到ZIKV最强的下降（图6A）。相比之下，与AF525对照细胞相比，ZIKV共感染AF5细胞中的CHIKV复制增加，尽管这种增加没有统计学意义（图6C）。使用表达荧光素酶的病毒，在AF5和AF525细胞中观察到CHIKV和ZIKV的类似结果（S1文件中的图F和表F）。
与我们观察到的ZIKV RNA水平类似，与AF1细胞相比，AF525细胞中的DENV-5普遍降低（图6B）。然而，对DENV-1的这种影响仅在与ZIKV合并感染时才显着（S1文件中的表D）。
4. 讨论
调查Ae载体能力的研究。埃及伊蚊合并感染ZIKV、DENV和CHIKV表明，合并感染对蚊子对任何单个病毒的能力没有影响[13，16]。事实上，单个感染者和合并感染者的传播率相似[13]。目前，尚不清楚抗病毒RNAi反应是否能够以相似的程度靶向两种共同感染的虫媒病毒。在这里，我们研究了在与DENV或CHIKV共同感染的背景下对ZIKV的RNAi反应。我们的结果表明，在大多数情况下，ZIKV在合并感染期间的RNAi反应与在单次感染期间一样有效。总体而言，在单次感染或合并感染期间，病毒特异性小RNA的产生显示出相似的ZIKV模式，其方式与先前的报道相当[29]。大多数21 nt vsiRNA在ZIKV感染期间产生，包括蚊子和细胞，沿基因组和抗基因组均匀分布。相比之下，vpiRNA大小的小RNA主要由基因组产生，并映射到少量不同的序列。
与ZIKV类似，与ZIKV合并感染期间的CHIKV和DENV-1特异性小RNA与先前发表的数据相当，但使用了不同的病毒株（CHIKV）甚至不同的血清型（DENV-1 vs DENV-2）[25，37，39]。CHIKV和DENV-1感染主要产生21 nt vsiRNA在基因组和抗基因组中的定位。对于CHIKV，产生了乒乓球产生的vpiRNA，主要映射到亚基因组RNA的5'末端区域周围的基因组。相比之下，DENV仅产生（类似于ZIKV）少量vpiRNA大小的小RNA，主要映射到病毒基因组的特定区域。
RNAi反应在急性合并感染的情况下有效靶向虫媒病毒感染的能力进一步得到靶向RNAi效应子的沉默实验的支持。对于ZIKV和CHIKV，在单次和混合感染实验中都观察到RNAi效应子的抗病毒活性。然而，观察到关于抗病毒效应物的差异。Piwi4的沉默增加了ZIKV复制，与Aag2细胞的先前结果相对应[29]，但仅显示CHIKV没有显着增加。先前的研究表明，Piwi4沉默细胞中的CHIKV显着增加。观察到的差异可能是由于所使用的实验设置、病毒株、MOI（0.01 vs 1）、检测时间（48 hpi 对 96 hpi）和检测方法（例如，细胞中的病毒 RNA 水平、上清液中的感染性病毒颗粒、细胞中的荧光素酶蛋白）的差异。Ago2如预期的那样显示出抗CHIKV的抗病毒活性[32，47]。正如在其他甲病毒中观察到的那样[24，28，33，48，49]，针对CHIKV的RNAi反应似乎集中在外切siRNA途径上，其中Ago2沉默产生最强的病毒增加。然而，在沉默Ago2的情况下，没有观察到ZIKV复制的显着增加。这一观察结果与先前的观察结果相呼应[28，29]。值得注意的是，在AF5细胞中与DENV或CHIKV共同感染期间，对ZIKV复制的影响也没有变化。这表明在混合感染的情况下，对ZIKV的RNAi反应是不变的，并且共同感染病毒不会对这种反应产生积极或消极的影响。这与分析vsiRNA可能的交叉靶向效应的计算机数据一致。尽管在ZIKV和DENV中鉴定出少量具有互补性的21个ntsiRNA（有一个错配），但无法检测到干扰。这与先前关于棕榈溪病毒与虫媒病毒相互作用的发现一致，其中未检测到核苷酸相似程度与干扰发生之间的相关性[50]。
有趣的是，在Ago2敲除的情况下，CHIKV在合并感染期间对ZIKV感染产生负面影响，但对AF5细胞没有负面影响。相比之下，在DENV-2合并感染期间，寨卡病毒感染在Ago1敲除细胞中没有受到负面影响。这一观察结果与AF525细胞中CHIKV的增加（S1文件中的图G）和观察到的Ago2对CHIKV的抗病毒活性密切相关[32];与对ZIKV没有影响相反。在Ae的体内也描述了类似的观察结果。埃及伊蚊同时感染寨卡病毒和奇克病毒[13]，其中奇克病毒/寨卡病毒感染导致寨卡病毒感染率略有降低。作者假设这种减少可能与竞争效应有关[13]。在没有Ago2的情况下，这种作用可能会被放大，Ago<>对CHIKV具有高度抗病毒作用。
我们专注于一个时间点，我们预计会有明确的病毒感染。目前尚不清楚病毒特异性小RNA产生或RNAi效应子在感染的早期时间点有何不同。先前的研究表明，在特定情况下（例如病毒组合，时间点），可以在Ae中观察到感染，传播和/或传播的差异。埃及伊蚊[13，51]，但感染早期的这种差异并不总是转化为后期时间点的差异。我们研究的一个显着局限性是关注对病毒感染的晚期反应（例如蚊子为14 dpi，细胞为96 hpi）。在感染建立期间，对每种病毒的RNAi反应可能不同，这可能会影响最终结果，具体取决于共同感染表型。在病毒混合感染对RNAi的影响的未来研究中应包括较早的时间点。
发现DENV-1的沉默结果与以前关于DENV的报告不同;尽管DENV特异性小RNA非常相似[25，38，39]。没有观察到DENV-1复制的增加，以响应任何RNAi效应子的沉默。相比之下，既往报道显示Ago2、Dcr2和Piwi4对DENV具有抗病毒作用[24-26]。然而，除了使用不同的DENV菌株（DENV2而不是DENV1）外，这些研究还利用了不同的细胞系或在体内进行实验。此外，在单次或合并感染ZIKV后，AF1细胞中的DENV-525复制没有增加。相反，在没有Ago1的情况下，DENV-2复制似乎总体减少，表明该RNAi效应子具有促病毒作用。
据推测，虫媒病毒和蚊子媒介之间的微妙平衡对于蚊子成功感染和传播虫媒病毒至关重要。虫媒病毒复制和蚊子免疫反应之间的平衡确保虫媒病毒感染足以传播，而不会在蚊子媒介中产生高致病性。我们的研究提供了证据表明，ZIKV与DENV或CHIKV的合并感染在RNAi反应方面与单一感染相当;嘶。埃及伊蚊能够在类似的程度上靶向一种病毒和两种病毒。重要的是，只要蚊子（或细胞）能够产生功能性抗病毒RNAi反应，情况就是如此。如果部分免疫反应功能失调，则不同病毒的病毒复制平衡可能会受到影响。这特别适用于免疫系统的RNAi效应子，它们似乎对虫媒病毒的作用不同，例如Ago2对CHIKV起作用，但对ZIKV没有抗病毒作用。当免疫效应物成为干预策略的目标时，需要考虑这一点。