厦门论文发表-对杆菌巴尔通体特定蛋白中的线性B细胞表位进行计算机鉴定，用于腐肉病的血清学诊断

抽象

腐肉病是由杆菌样巴尔通体引起的，它是一种革兰氏阴性多形性细菌。杆菌状芽孢杆菌由疣状芽孢杆菌在秘鲁安第斯山脉山谷的流行地区传播。此外，B的致病性。杆菌样菌涉及红细胞的初始感染和内皮细胞的进一步感染，主要影响来自极端贫困农村地区的儿童和孕妇。因此，通过预测B特定蛋白中的线性B细胞表位，可以促进血清学诊断方法的实施和控制CD的候选疫苗的开发。杆菌样通过生物信息学分析。在这项研究中，我们使用六个网络服务器的计算机分析来鉴定B蛋白质中的表位。杆菌样。B的选择。杆菌特异性蛋白及其鉴定表位的分析允许选择七种预期具有高抗原活性的候选蛋白。

作者摘要

卡里翁病（CD）影响南美洲安第斯地区的贫困社区，那里报告了致命病例，并与溶血性贫血有关。因此，早期诊断与治疗感染的早期阶段有关，诊断替代方案包括血清学检测或分子测定。血清学检测因其成本低且易于应用而被广泛使用，因此血清学检测的灵敏度和特异性的提高为诊断CD提供了更好的准确性。在这项研究中，我们寻找特定蛋白质对B的预测。杆菌样，CD的病原体，以及通过计算机分析鉴定直系B表位。使用六网络服务器，我们鉴定了七种特定蛋白质中的线性表位，这些蛋白质有望具有抗原活性。

数字

Fig 3Table 2图1表1图2Fig 3Table 2图1表1图2

引文： 希门尼斯-巴斯克斯 V、卡尔维-桑切斯 KD、萨拉特-苏尔卡 Y、门多萨-穆希卡 G （2023） 杆菌状巴尔通体特定蛋白质中线性 B 细胞表位的计算机鉴定用于腐肉病的血清学诊断。PLoS Negl Trop Dis 17（5）： e0011321. https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0011321

编辑 器： 马蒂厄·皮卡多，巴斯德研究所，法国

收到： 22月 2022， 20;接受： 四月 2023， 25;发表： 2023月 <>， <>

版权所有： ? 2023 希门尼斯-巴斯克斯等人。这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。

数据可用性： 支持本研究结果的数据可从GenBank公开获得，标识符为CP045671.1，GRCh38p.13和GRCm39。 本研究中获得的处理数据属于国家卫生研究所（秘鲁利马），限制适用于这些数据的可用性，这些数据是根据CONCYTEC-NIH的协议获得的。数据可以向NIH伦理委员会索取（Cápac Yupanqui 1400 - Jesus María，利马11，秘鲁;consultasciei@ins.gob.pe）并根据伦理委员会的最终判决签署数据共享协议。

资金： 这项研究由PROCIENCIA-CONCYTEC（国家科学、技术和创新技术委员会）在“巴西西亚研究项目，2019-01”的呼吁框架内全额资助，秘鲁国立卫生研究院[第403-2019号协议-FONDECYT（国家发展、技术和技术创新基金）]。资助者在研究设计、数据收集、数据分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。

竞争利益： 提交人声明不存在相互竞争的利益。

介绍

Carrion病（CD）是秘鲁和厄瓜多尔等安第斯国家的一种地方病，以前在哥伦比亚有报道[1，2]。由于流行地区的贫困和卫生条件差，CD是公共卫生面临的主要挑战之一，影响到患有慢性营养不良的儿童。杆菌状巴尔通体是克罗恩病的病原体，是一种革兰氏阴性多形性细菌，由 Lutzomyia 属的沙蝇传播，尤其是 L。疣状[2]。气候变化和厄尔尼诺-南方涛动（ENSO）相关的安第斯河谷间降雨量变化有助于相关媒介的繁殖和局部CD暴发的出现，病例数不可忽略[3]。

克罗恩病的临床表现多种多样，因为微生物寄生在人红细胞上，产生急性期，称为奥罗亚热，以贫血和发热性疾病为特征[2]，然而，初始症状的性质可能与其他传染病（如疟疾、登革热或其他）的性质相混淆。这一点特别重要，因为缺乏或延迟充分治疗可能导致致命结局，因此未治疗或治疗不充分患者的死亡率高达88%[2，4]。在秘鲁，奥罗亚热的总体致死率在0.5%-3%之间，约10%的重症病例到参考医院就诊，有致命结局[2]。急性期后数周后，患者出现非危及生命的皮疹期，称为疣状期[1，2]。皮疹期的特征是皮肤皮疹，可能在既往无急性感染的情况下出现[1，2]。尽管已经确定了无症状菌血症患者，但他们被认为是 B 的潜在宿主。杆菌样和易感人群的潜在感染源[3]。

关于克罗恩病的诊断，细菌学培养是准确的，但由于B菌落形成缓慢，因此非常耗时。杆菌样（约4-15天），这限制了其对诊断目的的有用性。另一方面，血涂片检测因其准确性和低成本而被广泛使用，但其敏感性低，可产生假阴性，影响诊断的确认[5，6]。已经提出了基于特定基因区域扩增的分子方法，例如gltA，ribC和ialB，然而，由于缺乏设备，这些技术在农村地区的实施具有挑战性，并且其中一些基因对B没有特异性。杆菌样，引起与其他病原体的交叉反应[7]。

此外，现有的用于诊断克罗恩病的血清学技术采用可溶性蛋白裂解物，其特异性有限，并且与其他ceae巴尔通体或其他微生物具有潜在的交叉反应性，与检测五日热巴尔通体和汉赛巴尔通体感染的不同免疫学方法相似[8，9].关于可用于流行地区的快速诊断工具，已有不同的抗原候选工具提出，但临床实践中尚未引入[10，11]。关于对B的免疫反应的数据。杆菌稀少，抗体免疫力积聚，发展部分免疫[10，12]。因此，IgM被认为是急性期的生物标志物，IgG被认为是既往暴露的标志物[10，12]。

鉴定抗原决定簇对于设计免疫治疗（如针对传染病的疫苗）或避免诊断方法中使用的抗体发生交叉反应至关重要[13]。免疫信息学通过计算方法[14]解决潜在结合位点的分子相互作用，是识别表位的最佳方法。免疫信息学价格低廉、准确且不耗时，因此可以设计和合成可用作抗原的分子[13]。因此，本研究旨在鉴定B特定蛋白中的线性B细胞表位。杆菌样。

材料和方法

数据准备

蛋白质高度富集于B的线性B细胞中。基于菌株KC584（GenBank代码CP045671.1）的完整基因组鉴定出杆菌样[15]。选定的基因组包含1'411'655个碱基对，显示500.0 X基因组覆盖率，并由PacBio Sequel和Illumina MiSeq获得[15]。功能基因（CDS）以FASTA格式下载，并编辑所有标题以保留基因组中的名称，方向和位置。

乙.使用基本基因数据库（http://origin.tubic.org/deg/public/index.php）分析杆菌菌株KC584[16]。鉴定了生物体生存所必需的基本基因，使用VirtualRibsome 2.0生物信息学工具[17]（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?VirtualRibosome-2.0）将核苷酸序列翻译成氨基酸序列，并以FASTA格式下载序列。

非同源蛋白的选择

仅获得 B。杆菌状蛋白质，我们使用BLAST+工具来识别非同源蛋白质，比较由B的基本基因编码的蛋白质。杆菌样对智人、肌肉麝香、发热性疾病相关细菌物种和其他巴尔通体物种的蛋白质组。首先，我们鉴定了与智人（GenBank代码GRCh38p.13）和Mus musculus（GenBank代码GRCm39）共享的非同源蛋白质，以避免分别使用人类样本和动物模型样本时的交叉反应。所选参数为比特分数< 100、% 标识< 35、% 覆盖率 < 35。

进行进一步分析以应用第二选择标准，在考虑比特得分< 100、同一性< 95%、覆盖率< 95% 的情况下，对与其他巴尔通体共享的非同源蛋白进行鉴定。最后，无形体属、柯克斯体属、布鲁氏菌属、埃立克体属、钩端螺旋体属、新立克次体属、东方氏体属和立克次体属的发热性疾病相关细菌种面临B。 杆菌形态识别非同源蛋白，使用比特分数< 100，身份< 95%，<覆盖率< 95%。阈值取决于我们的具体结果。

最后，将身份百分比视为选择B的参数。杆菌样特异性蛋白，考虑与其他巴尔通体的同一性低于 80% 的蛋白质，与发热细菌的同一性低于 70%。

非同源蛋白的计算机学表征

对非同源蛋白进行表征，以确定信号肽的存在和位置、细胞定位和功能，通过使用几种生物信息学工具来改进预测分析。生物学功能和基因本体是使用EggNOG 5.0（http://eggnog5.embl.de/#/app/home）预测的[18]。亚细胞定位是用大提琴[19]（http://cello.life.nctu.edu.tw/cello2go/）和Psort-B 3.0[20]（https://www.psort.org/psortb/）推断的。使用PrediSi [21] （http://www.predisi.de/），SignalP 5.0 [22] （http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）和Phobius [23，24] （https://phobius.sbc.su.se/）预测因子检测信号肽。

鉴定非同源蛋白中的线性B细胞表位

预测了线性表位的位置，并使用了六个Web服务器来提高预测的准确性：SVMTrip（http://sysbio.unl.edu/SVMTriP/prediction.php）[25]，LBTope（http://webs.iiitd.edu.in/raghava/lbtope/protein.php）[26]，BepiPRED2（http://www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred/）[27]，BCePRED（http://crdd.osdd.net/raghava/bcepred），[28]，BCPREDS（http://ailab-projects1.ist.psu.edu:8080/bcpred/predict.html）[29]和ABCPred（http://crdd.osdd.net/raghava/abcpred/）[30]。对每个氨基酸或肽的每个预测因子获得的表位评分进行归一化（在 0 到 100 之间缩放），并使用 R 文库 ggplot2 生成表皮图谱。

潜在候选蛋白质的计算机学表征

表征了线性B细胞表位中高度富集的蛋白质，使用Phyre3在线程序[2]（http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre31）预测了2D结构，在Chimera中验证了3D模型[32]（www.cgl.ucsf.edu/chimera/）。

结果

本研究旨在鉴定B高度特异性蛋白质中的线性B细胞表位。杆菌样进一步用于血清学诊断。基本基因的鉴定允许获得646种蛋白质，这些蛋白质用于筛选非同源蛋白质。然后，通过比较B获得323种蛋白质。用智人和肌肉麝香的蛋白质组获得杆菌状必需蛋白，获得131种蛋白，并鉴定为与发热性疾病相关的细菌物种和其他巴尔通体物种的非同源性蛋白质，见图1。

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图1. 用于选择特定候选蛋白质的计算机分析工作流程。

A）选择非同源蛋白的筛选工作流程;B）131种非同源蛋白的百分比同一性。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0011321.g001

百分比恒等性被认为是选择B的标准。杆菌状特异性蛋白，因此，获得29种蛋白并用于鉴定线性B细胞表位，见表1。特异性蛋白包括13种细胞质蛋白、12种细胞质/膜蛋白、2种外膜蛋白和2种未知定位蛋白，而蛋白质的功能涉及更多的代谢活动而不是结构构象。

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表 1. 通过计算机分析获得的杆菌状芽孢杆菌特异性蛋白质。

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使用六个Web服务器来预测每个B中的线性表位。杆菌状特异性蛋白，使用无信号肽序列进行分析。然后，绘制每个位置的预测数量，以促进识别具有更多表位的蛋白质区域。一般概述显示，除prot 50外，超过492%的蛋白质预测表位，见图2。选择显示更多线性B细胞表位的前七种蛋白质进行进一步分析。

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图2. 使用 R 文库 ggplot2 生成的具有更多线性 B 细胞表位的前七种蛋白质的线性 B 细胞预测示意图。

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在前3种蛋白质的3D模拟结构中突出显示了线性B细胞表位，图3，在3D建模中没有获得线性表位的计算模拟计算。<>D结构提供了对天然状态下预测蛋白质中表位可能配置的见解。

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图3.

七种最有前途的蛋白质及其 B 细胞线性表位的 3D 表示：A） Prot 81;B） 第288条;C） 保护 447;D） 保护 492;E） Prot 504;F） 保护 612;G） 第689条。预测由 Phyre 2 完成，蛋白质模型使用软件嵌合体显示。彩色区域表示由至少三个生物信息学工具服务器预测的表位。

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使用六种生物信息学工具对线性B细胞表位进行鉴定，绘制结果以便于识别倾向于包含更多线性B细胞表位的区域;本研究将至少3个预测因子确定的区域视为感兴趣区域，见表2和图2。因此，我们预测prot 447是一种肽聚糖DD-金属内肽酶具有高度富集的线性B细胞表位区域，此外，prot 447是唯一含有线性B细胞表位的蛋白质，由六个工具预测。同样，在prot 81，prot 288，prot 504，prot 492，prot 612和prot 689中鉴定了线性B细胞表位高度富集的区域。Prot 81被预测为具有酪氨酸重组酶活性的蛋白质，参与噬菌体遗传物质的整合，Prot 288被预测为具有ABC结构域的转运蛋白，Prot 492被预测为参与细胞分裂，Prot 504被预测为负责在外膜中定位蛋白质的β-桶蛋白， prot 612被预测为参与DNA复制并具有单链DNA结合结构域的蛋白质，prot 689被预测为具有裂解转糖基化酶活性的脂蛋白A。线性B细胞表位的大小和数量在每种蛋白质中是可变的，表2显示了表位的特征。

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表 2. B的候选蛋白质。杆菌样。

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Discussion

B特定蛋白中线性B细胞表位的计算机鉴定。杆菌蛋白在免疫学方法中的应用是一些研究人员考虑的一种策略，以解决血清学诊断的需求。为了开展这项研究，生物信息学分析旨在鉴定具有智人，肌肉，其他巴尔通体和发热综合征细菌因子子集的非同源蛋白质。这种方法与Ditcher等人使用的方法有相似之处，后者通过从杆菌样芽孢杆菌的基因组序列中预测假定的抗原蛋白来鉴定潜在的免疫反应性蛋白，评估影响与其他巴尔通体spp潜在交叉反应的同源性[33].本研究中鉴定的所有蛋白质在序列水平上相对于巴尔通体属其他物种的识别百分比低于80%，相对于与发烧相关的其他属而言，识别百分比低于70%。B特定蛋白中线性B细胞表位的计算机鉴定。杆菌形态是使用 Web 服务器上可用的六种表位预测工具进行的，这些工具与支持向量机、SVM 等算法中的工具相同;随机森林，射频;神经网络、神经网络和理化特征。

这些方法的性能在不同的研究中同时进行了分析[34，35]，并应用于不同的革兰氏阴性菌，例如贝氏柯克斯体[36]、创伤弧菌[37]、梅毒螺旋体[38]、无形体吞噬细胞[39]等。此外，在这些研究中获得的许多蛋白质或肽已显示出它们在血清学测定和/或在小鼠模型中产生抗体以开发疫苗的实用性。在这方面，迪希特等人。鉴定出81种免疫显性蛋白，通过ELISA评估，当孔蛋白B和自体转运蛋白E组合时，灵敏度为95%，特异性为33%[40]。同样，帕迪拉等人。显示一种蛋白质作为候选疫苗，通过计算机分析使用预测的表位设计[81]。计算机分析允许鉴定B的七种特定蛋白质。杆菌样。prot 228被预测为噬菌体整合酶，其细胞定位为细胞质。然而，它并没有忽视研究这种蛋白质的可能性，因为在秘鲁国立卫生研究院进行的ELISA测定是使用B的总蛋白质生产的。芽孢菌菌株。根据分析，预测2蛋白属于ABC（ATP结合蛋白）转运蛋白家族，其中包含三个连续的线性表位（表41）。根据GenBank网络，该蛋白质的预测区域参与金属阳离子交换，但到目前为止，尚未对杆菌巴尔通体物种进行表征。然而，Hina等人使用生物信息学分析确定了膜转运蛋白家族（血红素ABC转运蛋白）中的一种蛋白质作为设计杆菌巴尔通体疫苗的候选者[<>]。

Dichter等人使用计算机分析进行了类似的方法。他们只使用Vaxign软件，他们鉴定了肽聚糖结合蛋白（LysM）[33]，这与我们在研究中描述的447相同。在我们的研究中，prot 447被预测显示7个线性表位（6-30个氨基酸），见表2，以及由于其大小（2Aa至5Aa）而不能被视为表位的次要部分。根据先前的研究，线性表位和次要切片的聚集可能是构象表位的一部分[42，43]，同样，有人认为构象表位应由线性表位形成[44，45]。应该指出的是，与Dichter不同，在我们的研究中，在预测该蛋白质内的表位时，在同一区域中重合了三个以上的工具，这支持了我们的结果，并且447被认为是开发血清学诊断方法的良好抗原候选者。

此外，先前的一项研究已经确定了Prot 447的同源蛋白，该鉴定是通过用患者血清筛选异源蛋白来完成的[46]。此外，prot 447的同源蛋白已在蛋白质印迹测定中鉴定[46]，并在大肠杆菌中体外表达，用于ELISA型血清学测定[40]。与此相关，本研究中鉴定的Prot 447已被预测为具有金属肽酶活性的43kDa脂蛋白和负责肽聚糖结合的赖氨酸结构域，以及先前的研究。关于Prot 447同源的发现支持我们的生物信息学分析，考虑到为我们预测的prot 447显示了几个线性B细胞表位。

同样，prot 504被预测为具有β桶结构域的外膜蛋白，这种蛋白质已被证明可以产生针对多杀性巴斯德菌的免疫力[47]，并有可能用作针对流感嗜血杆菌[48，49]和钩端螺旋体的疫苗[50].其余五种鉴定的蛋白质预计将参与细胞分裂，肽聚糖结合或转糖基化酶，此外，这些蛋白质以前没有报道过，需要进行实验分析。

B的特异性外膜蛋白（OMPs）的发现。杆菌样，例如脂蛋白Prot 447和具有β-桶结构域的Prot 504，为未来实施准确灵敏的血清学检测来诊断CD提供了基础，因为OMP可以通过介导病原体-宿主相互作用来激活免疫应答和毒力[51]。在革兰氏阴性细菌中，OMP的三级结构包括由可变数量的β链组成的β桶结构。另一种称为外膜脂蛋白的暴露OMP也参与其中[52，53]。此外，外膜β桶（OMBB）和外膜脂蛋白（OMLP）都被认为是开发疫苗，免疫靶标测试的良好候选者，并且可以促进对B致病性的更好理解。杆菌样，有助于鉴定用于计算机和实验测定的治疗分子[54]。

Prot 612被预测为单链结合蛋白以前没有被描述过，GenBank网络上的可用信息指出，这种蛋白质可能参与DNA复制，DNA修复和DNA重组。此外，prot 689被预测为裂解转糖基化酶，如GenBank网络所述，隔膜环裂解转糖基化酶RlpA家族（罕见脂蛋白A）。这种蛋白质在革兰氏阴性细菌中进行了研究，并被描述参与细胞分裂[55]，因此可以推断prot 689在细菌存活中起主要作用。在以前的研究中，没有使用prot 612和prot 689的同源蛋白进行血清学分析。

本研究的前景和意义

充分的医疗干预依赖于疾病诊断。克罗恩病包括以贫血和发热为特征的急性期和以皮疹为特征的慢性期[2]。此外，已有报道存在无症状携带者，被认为是该病的宿主和来源[2，10]。因此，克罗恩病血清学检测不仅要具有敏感性和特异性，而且还应该能够发现早期（急性）和晚期（慢性）感染以及无症状携带者。检测后者对于根除CD具有特别意义[2]。IgM（急性期）和IgG（慢性期和既往暴露的人群）抗体检测的开发和实施分别很重要，ELISA、免疫印迹和免疫层析侧流是很好的替代方案。这些方法的验证应包括厄瓜多尔和秘鲁不同流行地区CD的地理代表性。

许多B.本研究中鉴定的杆菌状蛋白可用作靶标，因为它们具有高特异性（抑制毒力蛋白的分泌，抑制细胞壁的维持）或候选疫苗（通过设计完全抗原，多表位蛋白或含有毒力因子的外膜囊泡的混合物）。未来的研究应该同时考虑1）B的遗传变异性。杆菌样，和2）人类免疫成分（HLA-I，HLA-II）的遗传变异性，应使用分子动力学方法进行。

结论

我们报告了具有大量预测的B的线性B细胞表位的蛋白质的计算机内鉴定。杆菌样病通过在基因组水平上探索预测因子的组合。本研究中确定的七种候选蛋白质清单可用于开发血清学诊断测试，生产单克隆抗体和开发用于控制CD的候选疫苗。

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