《厦门论文发表-厦门论文发表-授粉服务的最佳恢复增加了森林覆盖率，同时使农业利润翻了一番》期刊简介
厦门论文发表-厦门论文发表-授粉服务的最佳恢复增加了森林覆盖率，同时使农业利润翻了一番
抽象
背景
布尼亚病毒感染，包括由布尼亚姆维拉血清型正布尼亚病毒引起的感染，是轻至中度人类发热感染的一个重要原因，但可能仍然被大大低估。在严重的情况下，这些感染还会导致神经系统疾病，特别是脑膜炎和脑炎，感染甚至可能是致命的。然而，除了少数例外，关于此类感染的神经侵袭和神经发病机制的信息有限。这部分是由于缺乏促进此类研究的动物模型。
方法/主要发现
为了开发一种免疫功能正常的Bunyamwera血清组正布尼亚病毒感染模型，我们通过腹膜内或皮下途径感染了4-6周大的雌性仓鼠，其中106pfu/布尼亚姆维拉病毒（BUNV）、巴泰病毒或恩加里病毒的动物。只有BUNV感染导致临床疾病，其特征是体重减轻，嗜睡和神经系统体征（即头部或四肢震颤，矫正反射丧失，“华尔兹”）。虽然两种途径的症状严重程度相似，但在皮下接种后更频繁地发生。与这些临床症状一致，抗原染色和组织病理学异常在整个大脑中广泛发现。
结论/意义
报道的BUNV感染仓鼠模型为研究正布尼亚病毒感染，特别是神经侵袭和神经病理学的发展提供了新的工具。该模型特别重要，因为它利用免疫功能正常的动物，并依赖于皮下接种途径，该途径更接近于虫媒病毒的自然感染途径，从而在感染的初始部位提供更真实的细胞和免疫学背景。
作者摘要
布尼亚病毒引起大量人类感染，虽然大多数是相对良性的，但在严重的情况下，脑炎和/或脑膜炎可能会发展。关于允许布尼亚病毒进入大脑的生物过程知之甚少，以及为什么在某些情况下会导致神经病理学。可用的模型通常基于免疫系统受损或发育不全的动物的直接颅内感染。在这里，我们通过腹膜内或皮下途径感染了亚成年仓鼠，感染了三种不同的布尼亚病毒之一：布尼亚姆维拉病毒（BUNV），巴泰病毒或恩加里病毒。只有尿素病毒感染导致临床疾病，受感染的动物表现出体重减轻、嗜睡和疾病的神经系统体征。与这些观察结果一致，在整个大脑中广泛发现了病理异常和病毒抗原。这种新模型的建立意义重大，因为它利用了免疫能力正常的动物，并依赖于一种接种途径，该途径更接近地模仿通过昆虫叮咬的自然感染途径。因此，它为研究布尼亚病毒感染期间的神经侵袭和神经病理学的发展以及针对这些病毒的抗病毒方法的测试提供了重要基础。
数字
表1图1图2表1图1图2表1图1图2
引文： 格罗斯 A、加德纳 D、米德-怀特 K、阿姆勒 S、Ebihara H （2023） 免疫功能正常的仓鼠作为正布尼亚病毒诱导的神经侵袭和神经病理学的模型。PLoS Negl Trop Dis 17（5）： e0011355. https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0011355
编辑 器： Michael R. Holbrook，NIAID综合研究设施，美国
收到： 1月 2022， 6;接受： 2023月 26， 2023;发表： <>月 <>， <>
这是一篇开放获取的文章，没有任何版权，任何人都可以出于任何合法目的自由复制、分发、传输、修改、建立或以其他方式使用。该作品在知识共享CC0公有领域奉献下提供。
数据可用性： 所有相关数据都在手稿及其支持信息文件中。
资金： 这项研究得到了NIH，NIAID（DG，KMW和HE）的校内研究计划以及Friedrich-Loeffler研究所（SA和AG）的校内资助的支持。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。
竞争利益： 提交人声明不存在相互竞争的利益。
介绍
最近创建的Peribunyaviridae家族包括一个庞大且高度多样化的单链负义RNA病毒群，其基因组分为3个片段：S段，M段和L段。迄今为止，只有Orthobunya病毒属的成员（目前包含100多种公认的物种[1]）已被证明可以感染人类或牲畜物种。虽然加利福尼亚血清型的成员是北美脑炎的流行病因，但通常被认为是这些病毒中对人类疾病最具医学意义的，而Bunyamwera血清组的成员也与人类和动物疾病有关[2]。Bunyamwera血清型病毒可以在世界大部分地区找到，但个别病毒的地理分布更为有限，它们主要通过蚊子传播，在少数情况下，也通过叮咬蠓传播[3]。不幸的是，我们对布尼亚姆维拉血清型病毒的流行和疾病负担的了解目前有限，这主要是由于缺乏系统的数据收集。
该组的原型BUNV发生于整个撒哈拉以南非洲地区，据报道，该地区的人类抗体患病率为>50%[4]。根据少数可获得临床数据的病例，在其他方面健康的成人中，BUNV感染似乎主要导致轻度自限性感染，伴有发热、头痛、关节痛和皮疹[4，5]。然而，这些病例中有很大一部分也报告了以视力障碍和眩晕的形式受累的中枢神经系统，这是该疾病迄今为止未被充分认识的一个方面[4]。此外，在免疫功能低下患者中，BUNV感染可导致重度脑炎和/或脑膜炎[6]。与此相反，据报道，BATV感染相关病毒仅可引起非描述性的发热性疾病，在某些情况下伴有呼吸道和/或胃肠道成分[7]。迄今为止，尚未在人类中报道该病的神经系统成分，但最近在受感染的海豹中报道了脑炎[8]。BATV遍布欧洲和亚洲，人类血清阳性率不一（<1-32%），尽管这些地区的牲畜感染率较高，但血清阳性率也可能保持较低水平[2，9-11]。令人惊讶的是，Bunyamwera 血清组病毒也显示出通过重组显着增加其致病性的能力。这是在天然存在的BUNV和BATV重组体中观察到的（S邦夫/米巴特电视/L邦夫) [12，13]又称NRIV，见于中非，可引起致命性出血热[12，14-16]。
尽管人们越来越认识到它们与有时严重的疾病结果的联系，但目前对毒力决定因素或病理生理过程知之甚少，这些决定因素是布尼亚姆维拉血清组病毒感染期间疾病发展的基础。特别是，此类研究的一个主要挑战是，迄今为止报道导致严重疾病/死亡的模型是基于直接颅内接种，通常使用免疫学上未成熟或免疫缺陷的动物，这绕过了外周感染部位的神经侵袭需求[17-22]。然而，过去使用仓鼠模拟由其他脑炎和HF引起的病毒引起的感染（例如[23-28]）的成功表明，这也可能是模拟与这些严重疾病表型相关的布尼亚病毒感染的可行方法。事实上，轶事报道甚至表明，BUNV对仓鼠的外周感染可能导致致命性疾病，特别是致命性脑炎，但这种模型的细节及其临床结局从未报道过[19]。
因此，我们试图确定仓鼠感染是否确实可以作为与正布尼亚病毒感染（即神经病理学和/或出血热）相关的严重疾病表现发展的模型。为此，我们用BUNV，BATV或NRIV感染叙利亚金仓鼠群，并监测临床症状的发展，并表征这些动物的伴随病理。根据结果，我们确实可以确认BUNV感染导致外周接种后BUNV诱导的神经系统疾病的部分致死模型。
方法
道德声明
用于免疫的动物被安置在落基山实验室（RML）BSL-2动物设施中，研究是根据协议#2011-68.11进行的。用于感染研究的动物被安置在RML BSL-4高生物防护实验室，并根据协议#2012-053-E进行研究。这两项协议均由国家过敏和传染病研究所/RML机构动物护理和使用委员会根据其指南批准。进行这项研究的设施已获得国际实验动物护理评估和认证协会的全面认可，并拥有经批准的实验动物福利保证办公室（#A4149-01）。所有程序均由训练有素的人员进行，所有侵入性临床程序均在动物麻醉时进行。机构动物护理和使用委员会批准的评分参数规定的早期终点标准用于确定何时应人道地对动物实施安乐死。
细胞系和病毒
VeroE6（非洲绿猴肾）细胞维持在Dulbecco的改良鹰培养基（DMEM，生命技术）中，并补充有10%胎牛血清（FBS，生命技术），2mM L-谷氨酰胺（Q;Life Technologies），100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素（PS;生命科技），并在 37°C 下生长，CO 含量为 5%2.
BUNV（菌株6547-8）和BATV（菌株UgMP 6830）由世界新兴病毒和虫媒病毒参考中心（WRCEVA）的Bob Tesh提供，而NRIV（菌株9800535）由疾病控制和预防中心的Pierre Rollin和Stuart Nichol提供（表1）。本研究中使用的BUNV（菌株6547-8）分离物先前已在哺乳小鼠脑中传代47次，在Vero细胞中传代一次，然后在VeroE6细胞上再传代两次以制备工作储备。使用的BATV（菌株UgMP 6830）分离物先前已在哺乳小鼠脑中传代4次，并在VeroE6细胞上传代14次以制备工作储备。所使用的NRIV菌株最初通过Vero细胞的生长分离[2]，并在VeroE6细胞上再进行29次传代以制备我们的工作储备液。这些病毒库的身份在使用前通过完整的基因组测序得到确认。在BATV和NRIV的案例中，这些序列先前已发表[30，6547]，而对于BUNV，发现所得序列与表8中在所有三个片段中提供的BUNV的GenBank参考序列（菌株1-99）几乎相同（S：8.99%，M：5.99%，L：9.<>%核苷酸同一性）。
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表 1. 挑战病毒株。
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NRIV的所有工作以及所有三种病毒的感染实验都是在落基山实验室（国立卫生研究院国家过敏和传染病研究所校内研究部）的BSL-4高生物防护实验室进行的。
仓鼠感染
从商业供应商（Harlan Laboratories，现为Envigo）购买了四到六周大的雌性叙利亚金仓鼠（Mesocricetus auratus），并在实验开始前一周适应高生物防护实验室。动物被贴上耳标以进行识别，并将每个笼子3只动物（或对照组2只）饲养在一次性IVC笼中，作为带有白杨片垫料的Innovive IVC大鼠笼系统的一部分（P.J. Murphy的Sani-Chips）。他们通过架空钢丝条食物漏斗随意提供 2016 年 Teklad 啮齿动物食物周 （Envigo）。每组 6 人被 1x10 感染6BUNV（菌株6547-8），巴泰病毒（菌株UgMP6830）或NRIV（菌株9800535）的PFU，总体积为400μl DMEM，在右下腹象限的两个相邻部位注射给药。或者，组用1x10感染皮下6200ul体积的PFU病毒作为颈部后部的单次注射。如上所述，对照动物（总n = 4）以相同的体积接受皮下（n = 2）或腹膜（n = 2）的DMEM。所有组的平均起始重量相当（范围：72.6-80.7克）。鉴于这是一项探索性研究，无法获得有关结局的信息，因此根据资源方程式法选择组规模[31]。
每天监测仓鼠的体重减轻和疾病迹象。当动物符合动物使用协议定义的人道终点标准（即体重减轻>20%，神经系统体征或疾病出血症状）时，动物被安乐死。在安乐死时从选定的动物身上收集器官样本（即肝脏，脾脏和大脑），并进行处理以进行组织病理学分析，如下所述。在安乐死时也通过心脏穿刺收集血液，并储存在-80°C，直到处理用于斑块测定，也如下所述。所有幸存的动物在感染后第21天被安乐死。
重组BUNV N表达和抗体生成
为了允许重组BUNV N的表达而不增加NSs的表达，通过pATX-BUNV N（即T106C;T109C）。这导致N ORF（即HD>HD）中相应位点的沉默突变。然后将所得的NΔNSs编码序列亚克隆到pGEX-6P-1载体（GE医疗）中，用于E中的蛋白质表达。大肠杆菌菌株BL-21（GE医疗）根据制造商的说明（GE医疗）使用0.1mM异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导后。如前所述，通过亲和色谱纯化[32]。简而言之，使用鸡蛋清溶菌酶（Sigma）和超声处理裂解细菌，然后根据制造商的指示（GE医疗）使用与谷胱甘肽 - 琼脂糖4B树脂的批量结合实现纯化。
对于多克隆抗体生产，两只10个月大的成年雌性豚鼠在每条大腿尾部肌肉注射含有1ug纯化的重组GST-BUNV N乳化1：1和TitreMax金（Sigma），体积为100ul。另外两次加强免疫以相同的方式每隔4周进行一次，但使用不完全的弗氏佐剂（Sigma）。最后一次免疫后十天，使用真空容器血清分离管（BD）收集血液，将其在20°C下孵育37分钟，然后在1100×g下离心10分钟。收集所得血清级分，等分并储存在-80°C直至使用。
组织病理学和免疫组织化学
将收集的组织在4°C下在7%中性缓冲福尔马林中固定至少10天，然后转移到新鲜福尔马林中以从高生物防护实验室中取出。然后将组织放入盒中，并使用VIP-5 Tissue Tek处理器（Sakura Finetek）使用分级系列乙醇，二甲苯和ParaPlast Extra进行处理。将包埋的组织以5μm厚度切片，并在42°C下干燥过夜，然后用苏木精/伊红染色。或者，对于免疫组织化学，使用Discovery XT自动染色机（Ventana医疗系统）和DABMap试剂盒（Ventana医疗系统）处理组织，使用多克隆豚鼠抗BUNV NΔNSs一抗（如上所述产生;1：100稀释），Biogenex生物素化抗豚鼠二抗和苏木精反染色。样本由董事会认证的病理学家评估坏死和/或炎症细胞浸润的迹象。
斑块测定
在滴定前一天将VeroE6细胞接种到24孔板中。解冻血液样品并连续稀释（10?1到 10?6）在没有FBS的DMEM中制备。从细胞中取出培养基，并在孔中接种1ml每种病毒稀释液。一小时后，取出接种物，并用1x MEM的1：2混合物覆盖孔，该混合物补充有4%FBS，2x Q和2x PS与1.8%超纯琼脂糖（Life Technologies）。将细胞在37°C下孵育3天，然后加入含有10.0%（w / v）结晶紫的1%福尔马林。孵育过夜后，除去结晶紫溶液和琼脂糖覆盖层并计数斑块。
统计方法
生存分析以卡普兰-迈尔曲线表示，并使用双侧对数秩检验进行分析。使用具有固定和随机系数的线性混合模型比较平均体重变化，以解释随着时间的推移对同一主题进行重复测量时的纵向数据结构，并考虑不同时间点受试者可能退出的情况。数据分析必须被认为是探索性的，因此没有对多样性进行调整。使用R软件[33]和Graphpad PRISM进行数据分析，p值≤0.05被认为是显着的。
结果
临床观察
亚成体（5-7周龄）雌性仓鼠感染BUNV，BATV或NRIV通过SC或ip途径使用1x10进行6相应病毒的 PFU。所有受BATV和NRIV感染的仓鼠在整个21天的实验过程中幸存下来，在此期间，与各自的对照组（S1和S2无花果）相比，疾病的唯一证据是体重增加的适度延迟，这对于BATV sc.c.（p = 0.01），NRIV sc.c.（p = 0.005）和NRIV ip.p.（p = 0.03）组具有统计学意义。
相比之下，在感染BUNV的仓鼠中，腹腔内组2只动物中的6只和皮下组4只动物中的6只符合预先确定的安乐死标准（图1A），该标准基于严重体重减轻和神经系统疾病体征的组合。受影响的动物不仅体重不能正常增加，而且体重减轻得很严重（图1B）。与路线匹配的对照组相比，BUNV s.c.感染动物的体重随时间增加的差异具有统计学意义（p = 0.028）;然而，由于动物之间结局的高度差异（即2/6的体重明显减轻，2/6的体重增加延迟，2的生长基本正常），BUNV腹内膜组的差异并不显着。两组的体重减轻通常伴有嗜睡，在一些动物中，还伴有驼背姿势、缺乏肌肉张力和/或矫正延迟。这些发现代表了显性疾病的最初迹象，之后受影响的动物总是进展到满足安乐死标准（图1A）。安乐死发生在皮下组的第7、8、13和14天，腹膜组发生在第6天和第13天。在安乐死时，观察到体重减轻了9.1-22.4%（图1B）。然而，在这项研究中，仅过度减肥就代表了仅对单一动物实施安乐死的唯一标准（图1B，左图，BUNV i.p. #4），即使在这种动物中也观察到可能的短暂性斜颈。所有其他患病动物都表现出明显的疾病神经系统体征。这些包括头部震颤（BUNV s.c. #6）或前爪（BUNV s.c. #1）、华尔兹（逆时针;BUNV s.c. #2， #4， #6） 和面部按压 （BUNV s.c. #4），在一只动物中，明显的癫痫发作导致无法右转，再加上一条后腿的持续不协调踢腿（BUNV i.p. #3）。有趣的是，在其他明确的神经系统体征出现之前，一只动物在受到干扰时表现出过度兴奋，尽管其他方面明显昏昏欲睡（BUNV s.c. #2）。总体而言，患病的BUNV感染动物的临床观察结果（包括死亡时间）在所检查的两种感染途径之间是一致的，但与腹膜组（4/6动物）相比，皮下组（2/6动物）的动物发生疾病的频率更高（图1A和1B）。由于这项初步探索性研究中包括的对照动物数量很少，并且在受感染动物中观察到的结局不一，即使在结合腹腔内膜和皮下皮下对照动物后，也无法证明BUNV ip.或s.c.感染组的生存率存在统计学上的显着差异，尽管这产生的值在p≤0.05水平（即p = 0.053）上接近BUNV SC感染动物的显着性。
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图1. 布尼亚姆维拉病毒 （BUNV） 感染仓鼠的存活和体重减轻。
每组6只叙利亚金仓鼠通过腹膜内（ip）或皮下（s.c.）途径接种106BUNV的斑块形成单位。（A）受感染仓鼠的存活率。Kaplan-Meier存活曲线显示了每组动物随时间推移的存活率。（B）受感染仓鼠的体重减轻。显示腹膜感染（左图）和皮下感染（右图）动物的体重随时间的变化，作为标准差±组平均值（上图）和单个动物体重（下图）。单把匕首 （?） 表示在安乐死时收集血液样本进行病毒滴定的动物，而双匕首 （??） 表示从中采集样本进行组织病理学的动物。（C）患病动物安乐死时的病毒血症。在达到安乐死标准时，从（B）中指示的动物中收集血液样本，并通过斑块测定滴定以确定病毒载量。
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大体病理学和病毒学
在安乐死时对六只患病的BUNV感染动物中的两只进行了完整的尸检（如图1B所示）。在BUNV s.c.#4中，除了轻微的脾肿大外，在两种尸检动物的内脏器官中均未观察到明显的病理变化。然而，这还不够明显，无法明确病理和/或与实验性病毒感染相关。在安乐死时通过心脏穿刺收集血液，通过其他4只显示明显疾病的BUNV感染动物的斑块测定进行分析。取样的动物均表现出病毒血症，滴度在6x10之间2和 7x104死亡时的PFU/mL，在死亡较快的动物中观察到的滴度最高（即7 dpi，而其他测试动物为13-14 dpi）（图1C）。
组织病理学观察
从图1B所示的坏死性尿素感染动物（即尿素皮下#4和尿素皮肌#3）中收集选定的内脏组织（即脾脏和肝脏）以及整个大脑，并在处理苏木精/伊红染色和免疫组织化学之前进行福尔马林固定。未见肝脏或脾白髓病变;然而，与BUNV s.c.#4中轻度脾肿大的总病理发现一致，该动物的红色牙髓表现出急性中性粒细胞性脾炎，并有充血的证据（图2A，图I）。
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Fig 2. Histopathological changes in tissues from BUNV-infected hamsters.
（A）苏木精/伊红染色。在安乐死时从BUNV感染的动物中收集选定的器官，并固定在10%福尔马林中，然后用苏木精/伊红对其进行切片和过滤。（i） 脾红色牙髓，嵌件显示中性粒细胞浸润，（ii） 下丘脑/腹侧中脑，（iii） 颅骨，（iv） 丘脑，（v） 小脑和 （vi） 海马体。主要病理观察如下：红细胞充血/出血（*），血栓形成（#），血管坏死（实心箭头），血管周围袖带（开放箭头），软脑膜炎（细箭头），神经元细胞死亡（厚箭头），神经胶质细胞死亡（黑星）。（B）尿素抗原的免疫组织化学标记。从BUNV感染动物中选定的脑切片固定并切片如（A）所示，然后与多克隆豚鼠抗BUNV N抗体，二级生物素标记的抗豚鼠抗体和3，3′-二氨基联苯胺（DAB）显色原一起孵育。比例尺表示100μm。
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与内脏器官中有限的显着发现相反，从患病的BUNV感染动物中收集的大脑不同区域的检查表现出多种病理特征。下丘脑（图2A，图ii）显示急性脑炎以及血管损伤（包括血栓形成，血管坏死和血管周围出血）的证据。在颅骨（图2A，图III）和丘脑（图2A，图iv）中均有血管周围袖带。颅骨丘也显示出软脑膜炎的明显证据。在丘脑、小脑和海马体的切片中观察到神经元和神经胶质细胞死亡（图2A，图iv，v和vi）。在检查的所有脑切片中或多或少地观察到中性粒细胞浸润和变性，与这些不同的炎症和细胞死亡迹象一致。此外，使用抗BUNV N抗体对病毒蛋白进行的免疫组织化学分析显示，在细胞体和神经元过程中都有强大的抗原积累，如丘脑和小脑部分所示，其中所有层（即分子，浦肯野和颗粒）都明显受到影响（图2B）。
讨论
尽管代表了与各种直布尼亚病毒感染（包括 Bunyamwera 血清组感染）相关的临床疾病的一个重要方面，但在大多数情况下，对感染期间神经侵袭到中枢神经系统或神经病理学发展的潜在机制知之甚少（综述于 [34]).虽然准确概括人类疾病各个方面的小动物模型，在许多情况下还可以包括其他健康免疫功能正常的成年人的症状感染，将为解决布尼亚病毒研究中的这些和其他重要的开放问题提供有价值的工具，但目前很少有这样的模型存在这些病毒。此外，目前可用的方法大多基于免疫缺陷（例如IFN敲除）或免疫学上不成熟（例如新生儿、哺乳或断奶）动物的直接颅内接种[17-19]。然而，虽然这些模型对神经病理学的研究具有重要价值，但它们无法模拟来自外周感染部位的神经侵袭，这代表了神经系统疾病病理生理学的一个关键方面。然而，最近的工作清楚地表明，基于外周感染的免疫功能疾病模型在某些情况下是可能的，例如Cache Valley热病毒[35]和最近发现的Ebinur Lake病毒[36]。尽管如此，对于作为该组原型的Bunyamwera病毒以及目前存在最多分子工具的成员，尚未报告此类模型。相关巴泰病毒和引起HF的BUNV / BATV重组NRIV的适当模型也缺乏，这阻碍了与这种重组事件如何可能导致NRIV致病性增强相关的研究。
为了开发可以支持这些病毒研究的动物模型，我们检查了BUNV以及BATV和NRIV在外周接种后引起叙利亚金仓鼠疾病的可能性。虽然BATV或NRIV感染最多导致体重增加的适度延迟，但我们发现BUNV感染导致严重的体重减轻和明显的神经系统体征的发展，需要对受影响的动物实施安乐死（图1）。虽然皮下组（67%）观察到严重疾病的频率高于腹腔内组（33%），但无论感染途径如何，死亡时间和临床观察结果都相似（图1）。与观察到的疾病的神经系统体征一致，脑切片分析显示脑炎和脑膜炎，导致出血的血管损伤以及神经元细胞死亡的证据（图2）。此外，病毒抗原在大脑（包括神经元）中广泛传播和丰富的存在表明，仓鼠感染BUNV后观察到的神经病理学影响可能至少部分是由于直接感染引起的损伤，尽管当然不能排除额外的免疫病理学成分。
虽然在某些方面是不幸的，特别是从减少动物群体大小的角度来看，即使在相对较高的挑战剂量下，通过测试的两种途径也无法实现均匀的致死率，但在皮下接种后临床疾病仍然足够频繁（即67%的受感染动物），并且患病动物的临床表现足够一致， 使该模型成为有用的研究工具。然而，在选择动物群体规模时，此类研究肯定必须考虑到这些混合结果，以确保能够实现与所研究假设相关的统计学意义。
重要的是，本研究中使用的动物直到5-7周龄才被感染，这是它们达到性成熟开始并接近理想成年体重的点[37，38]，因此，可以预期它们具有完全免疫功能正常——这一观察结果也得到了它们对本研究中使用的其他病毒感染的相对抵抗力的支持。 即 BATV 和 NRIV。如果需要更一致的结局，一种可行的选择可能是使用较年轻的动物，即感染断奶（3-4周龄）仓鼠，就像其他几种直布尼亚病毒感染模型所做的那样[39-41]。然而，虽然这种方法可能适用于某些应用，但它也引入了很大的局限性，因为它可能规避了对免疫系统作用的考虑，无论是在控制病毒感染还是有助于免疫病理学方面[34]。因此，对于免疫功能正常个体（这是感染Bunyamwera血清组病毒感染的重要但经常被低估的目标群体）的发病机制研究，其中免疫系统通常起着关键作用，并且可能特别影响神经侵袭和/或神经系统疾病的发展，我们预计本研究中使用的动物的成熟度将代表显着优势。出于同样的原因，它们也可能代表一种更真实，因此具有预测性的环境来测试抗病毒疗法，特别是那些针对宿主免疫反应方面的疗法。这项研究的另一个优势是使用外周感染途径，这允许研究神经侵袭。事实上，在我们的研究中比较腹腔内和皮下感染动物之间严重疾病的频率可以看出感染途径对结果的贡献。在这种情况下，有趣的是，皮下途径更频繁地观察到严重的疾病结果，虽然侵入性较小，但也更接近通过昆虫叮咬感染的自然途径。这表明，使用皮内接种，它给出了最接近昆虫叮咬的实验近似（不使用活昆虫载体），可能允许进一步完善模型，尽管必须指出，内径接种在技术上难以保持一致性，特别是在小动物模型中和高密闭条件下， 由于真皮层的薄。
这项工作的观察结果支持先前的轶事报道，即使用巴泰病毒（菌株Calovo）对仓鼠的致命感染仅在颅内接种后发生，而不是外周接种[20，22]。此外，它表明，缺乏任何关于仓鼠感染NRIV的报告，也可能是由于这些方法在生成严重疾病模型方面缺乏成功。因此，虽然这些病毒的致命感染仍然有可能通过其他菌株或使用本研究（或其他研究）中未测试的途径来实现，但我们的数据表明仓鼠不适合这些病原体的疾病模型。尽管如此，我们仍然观察到BATV（SC）和NRIV（SC和IP）感染仓鼠的体重增加有统计学上的显着降低，这表明它们确实被感染了。因此，仓鼠感染这些病毒可能提供一个合适的系统来研究与轻度疾病结局和有效病毒控制相关的病理生理过程，例如作为与BUNV感染所见的严重疾病的对应物。然而，在未来专注于病毒血症和组织分布的连续采样的研究中，需要更彻底地探索这种潜力。
鉴于NRIV和BUNV之间存在密切的遗传关系，BUNV是NRIV重组的S段和L段供体[12，13]，因此这些病毒在受感染仓鼠中产生如此不同的临床结局是相当显着的。一种可能的解释是，BATV提供的M段在该表型中起着决定性的作用。然而，还必须考虑到本研究中使用的BUNV染色剂是原型6547-8菌株。虽然从技术和实验的角度来看，专注于这种菌株进行模型开发是有意义的，但鉴于基本上所有关于BUNV的研究和目前可用的所有分子资源也都基于这种菌株，因此还必须考虑其广泛的传代历史。具体来说，从WRCEVA获得的分离物在吸吮小鼠中经历了47次记录在案的传代[42]，这也可以解释其在这些病毒中引起仓鼠致命疾病（包括神经病理学）的独特能力。然而，为了澄清这个问题，需要进行更广泛的研究，一方面使用遗传多样性和传播范围少得多的BUNV分离物来确定啮齿动物物种中可能的感染/疾病预适应的作用，以及测试具有各种基因组星座的其他BUNV / BATV重组体，以确定编码的BUNV G的M段与致命表型之间是否存在决定性联系仓 鼠。这里介绍的BUNV仓鼠模型现在为进行此类研究提供了适当的基础。
重要的是，无论BUNV（菌株6547-8）感染仓鼠的能力背后的机制基础如何，它显然会产生具有神经系统临床症状的致命疾病。在这里，观察到的更严重的症状包括矫正延迟，头部或前爪震颤，华尔兹和面部按压，以及可能的癫痫发作。这些症状与新生小鼠感染BUNV期间的症状大致一致，据报道BUNV可引起震颤、定向障碍和后肢麻痹[18]。此外，基于使用年轻仓鼠（即 3-4 周）建立的其他正布尼亚病毒感染仓鼠模型显示出类似的神经系统疾病体征。例如，感染Melao病毒（株BE AR633512）导致运动协调性缺失、颤抖和后肢麻痹[39]，而奥罗普切病毒（OROV）感染可导致神经系统症状，包括行走困难、频繁绊倒和偶发后肢麻痹[41]。有趣的是，这项研究还报告说，没有瘫痪的OROV感染动物会长时间跳华尔兹[41]，类似于我们在BUNV感染中观察到的情况，并表明这种症状是感染引起的神经损伤特有的。与本文报道的BUNV类似，仓鼠外周感染Melao或OROV可导致脑部感染，同时观察到病毒抗原和病理改变，包括脑膜炎或脑膜脑炎的发生[39，41]。即使我们在BUNV感染后观察到的疾病结局不均匀，似乎也与UROV感染仓鼠的报告相符，其中只有55%的感染动物发生疾病[41]。尽管如此，仍需要进一步的研究来更全面地表征仓鼠的BUNV感染，包括对组织分布的详细研究，以及与存活或发展为致命神经系统疾病的动物感染相关的病毒血症和抗体发育的动力学。
最近对加利福尼亚血清组（CSG）成员的工作很好地说明了高质量免疫功能动物模型的研究价值，这些模型可以概括来自外围的神经侵袭（综述于[34]）。在这里，这些病毒与神经系统疾病之间的流行病学联系是明确的，并且适当的模型的可用性现在使得与神经侵袭和神经病理学相关的病理生理机制越来越被理解[34]。基于其对皮下皮下接种后大多数受感染动物严重神经系统疾病症状的概括能力，我们预计这种BUNV感染的仓鼠模型现在将有助于通过促进目前无法使用现有模型充分解决的实验，将这种类型的研究扩展到其他正布尼亚病毒。具体而言，我们可以设想将其用于直接检查Bunyamwera血清组病毒的神经侵袭和神经发病机制的研究，以及BUNV致病决定簇的研究，特别是与缺乏先天免疫调节重要因子的现有重组BUNVs（例如NSs）联合使用[18，43，44]，以便更清楚地定义它们在免疫功能正常的动物环境中感染中的作用。
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巴泰病毒（BATV）感染仓鼠的存活和体重减轻。
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S1 图 巴泰病毒（BATV）感染仓鼠的存活和体重减轻。
每组6只叙利亚金仓鼠通过腹膜内（ip）或皮下（s.c.）途径接种106BATV的斑块形成单位。（A）受感染仓鼠的存活率。Kaplan-Meier存活曲线显示了每组动物随时间推移的存活率。（B）受感染仓鼠的体重减轻。显示腹膜感染（左图）和皮下感染（右图）动物的体重随时间的变化，作为标准差±组平均值（上图）和单个动物体重（下图）。
https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0011355.s001
（巴布亚新几内亚）
S2 图 恩加里病毒（NRIV）感染仓鼠的存活和体重减轻。
每组6只叙利亚金仓鼠通过腹膜内（ip）或皮下（s.c.）途径接种106NRIV的斑块形成单位。（A）受感染仓鼠的存活率。Kaplan-Meier存活曲线显示了每组动物随时间推移的存活率。（B）受感染仓鼠的体重减轻。显示腹膜感染（左图）和皮下感染（右图）动物的体重随时间的变化，作为标准差±组平均值（上图）和单个动物体重（下图）。
https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0011355.s002
（巴布亚新几内亚）
确认
作者感谢Heinz Feldmann在动物程序培训方面的帮助，感谢Yoshimi Tsuda和Friederike Feldmann分别在样本收集和固定方面的帮助，以及落基山实验室最大收容实验室的动物管理员的出色技术援助。此外，作者非常感谢Angele Breithaupt对病理学数据的宝贵见解。
引用
1.Hughes HR， Adkins S， Alkhovskiy S， Beer M， Blair C， Calisher CH， et al. ICTV病毒分类概况：Peribunyaviridae。J 根维罗尔。2020;101(1):1–2.密码：31846417
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
2.冈萨雷斯·斯卡拉诺;F. B K.， Nathanson N. 由布尼亚病毒属病毒引起的疾病的发病机制。在：艾略特R，编辑。布尼亚维里科：全会出版社;1996.第227–51页。
3.卡利舍 CH. 布尼亚维里科病毒的历史、分类和分类学.在：艾略特R，编辑。布尼亚维里科：全会出版社;1996.第1–17页。
4.伍德尔太平绅士。人类感染者与布尼亚姆维拉组的乔木。在：Bardos V，编辑。加利福尼亚复合体和布尼亚姆维拉组的虫媒病毒，斯洛伐克科学院论文集研讨会，斯洛伐克布拉迪斯拉发，18 年 21 月 1966 日至 1969 日。斯洛伐克布拉迪斯拉发：斯洛伐克科学院出版社;317.第32–<>页。
5.科克诺特，史密斯本，德梅隆B，帕特森何。从自然感染的人中分离出Bunyamwera病毒，并从伊蚊（Banksinella）环犀草中进一步分离。Am J Trop Med Hyg.1958;7(6):579–84.密码：13595198
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
6.绍瑟姆CM，摩尔AE。西尼罗河、伊尔赫斯和布尼亚姆维拉病毒感染在人类中。1951;31(6):724–41.密码：14894758
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
7.斯卢卡·卡洛沃病毒感染的临床表现。在：Bardos V，编辑。加利福尼亚复合体和布尼亚姆维拉组的虫媒病毒，斯洛伐克科学院论文集研讨会，斯洛伐克布拉迪斯拉发，18 年 21 月 1966 日至 1969 日。斯洛伐克布拉迪斯拉发：斯洛伐克科学院出版社;337.第9-<>页。
8.Jo WK， Pfankuche VM， Lehmbecker A， Martina B， Rubio-Garcia A， Becker S， et al.德国海豹巴泰病毒感染和脑炎协会，2016 年。新兴感染分析， 2018;24（9）：1691–5.密码：30124416
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
9.Cichon N， Eiden M， Schulz J， Gunther A， Wysocki P， Holicki CM， et al.德国萨克森-安哈尔特州反刍动物中巴泰病毒感染的血清学和分子学调查，2018年。病毒。2021;13(3).密码：33652882
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
10.兰伯特 AJ， 胡塔莫 E， 迪法塔 T， 德安德里亚 M， 博雷拉 A， 瓦帕拉赫蒂 O， 等.巴泰病毒感染的血清学证据，意大利北部牛，2011年。媒介传播人畜共患疾病 2014;14（9）：688–9.pmid：25198523
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
11.Ziegler U， Groschup MH， Wysocki P， Press F， Gehrmann B， Fast C， et al.东德反刍动物中巴泰病毒的血清流行。兽医微生物。2018;227:97–102.密码：30473359
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
12.布里斯 T， 伯德 B， 卡普尔 V， 尼科尔 ST， 利普金威斯康星州.巴泰和恩加里病毒：M节段重组以及与东非严重发热性疾病暴发的关联。J 维罗尔。2006;80(11):5627–30.密码：16699043
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
13.柳濑T， 加藤T， 山川M， 孝义K， 中村K， 国场T， 等.巴泰病毒的遗传特征表明自然界中正布尼亚病毒之间存在基因组重组。拱形维罗尔。2006;151(11):2253–60.密码：16820982
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
14.Bowen MD， Trappier SG， Sanchez AJ， Meyer RF， Goldsmith CS， Zaki SR， et al.从肯尼亚和索马里急性出血热病例中分离出的一种重组布尼亚病毒。病毒学。2001;291(2):185–90.密码：11878887
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
15.杰拉德SR，李L，巴雷特AD，尼科尔圣加里病毒是一种布尼亚姆维拉病毒重组体，可能与非洲出血热的大规模暴发有关。J 维罗尔。2004;78(16):8922–6.密码：15280501
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
16.Zeller HG， Diallo M， Angel G， Traore-Lamizana M， Thonnon J， Digoutte JP， et al. [Ngari病毒（Bunyaviridae： Bunyavirus）.塞内加尔首次从人类中分离出来，新的蚊媒，其流行病学]。公牛索克悲情外出。1996;89(1):12–6.
查看文章谷歌学术搜索
17.Odhiambo C， Venter M， Limbaso K， Swanepoel R， Sang R. 肯尼亚北部Bunyamwera和Ngari病毒分离株体外和体内表型的基因组序列分析。公共图书馆一号。2014;9（8）：e105446.pmid：25153316
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
18.韦伯 F， 布里根 A， 法扎克利 JK， 斯特赖滕菲尔德 H， 凯斯勒 N， 兰德尔 RE， 等.布尼亚姆维拉布尼亚病毒非结构蛋白 NS 抵消 α/β 干扰素的诱导。J 维罗尔。2002;76(16):7949–55.pmid：12133999
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
19.伍德尔太平绅士。布尼亚姆维拉。在：N K，编辑。虫媒病毒国际目录，包括某些其他脊椎动物病毒。第3版，德克萨斯州圣安东尼奥：Am. Soc. Trop. Med. Hyg.;1985.
20.卡洛沃·巴尔多斯诉在：N K，编辑。虫媒病毒国际目录，包括某些其他脊椎动物病毒。第3版，德克萨斯州圣安东尼奥：Am. Soc. Trop. Med. Hyg.;1985.
21.埃利斯伯格B，比舍尔，E.L.巴泰。在：N K，编辑。虫媒病毒国际目录，包括某些其他脊椎动物病毒。第3版，德克萨斯州圣安东尼奥：Am. Soc. Trop. Med. Hyg.;1985.
22.胡巴莱克 Z. 欧洲的蚊媒病毒。寄生虫研究 2008;103 增刊 1：S29–43.密码：19030884
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
23.DeBuysscher BL，de Wit E，Munster VJ，Scott D，Feldmann H，Prescott J.来自孟加拉国和马来西亚的尼帕病毒分离株在叙利亚仓鼠中的致病性比较。公共科学图书馆 2013;7（1）：e2024.密码：23342177
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
24.Ebihara H， Zivcec M， Gardner D， Falzarano D， LaCasse R， Rosenke R， et al.叙利亚金仓鼠模型概括了埃博拉出血热。感染杂志 2013;207（2）：306–18.密码：23045629
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
25.尼克拉松 BS， 米多斯 GF， 彼得斯 CJ.针对叙利亚仓鼠裂谷热病毒感染的主动和被动免疫。病理微生物学报 免疫学报 C. 1984;92（4）：197–200.密码：6507105
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
26.斯布拉纳 E， 马特奥 RI， 肖 SY， 波波夫 VL， 纽曼 PC， 泰什 RB.实验性感染了皮里塔尔病毒（沙粒病毒科）的仓鼠的临床实验室、病毒学和病理学变化：拉沙热的啮齿动物模型。Am J Trop Med Hyg.2006;74(6):1096–102.密码：16760527
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
27.Gowen BB， Julander JG， London NR， Wong MH， Larson D， Morrey JD， et al.评估病毒性出血热仓鼠模型中血管通透性的变化。维罗尔 J. 2010;7：240.pmid：20846417
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
28.Scharton D， Bailey KW， Vest Z， Westover JB， Kumaki Y， Van Wettere A， et al. 法匹拉韦 （T-705） 可预防急性裂谷热病毒感染，并减少利巴韦林治疗观察到的迟发性神经系统疾病。抗病毒研究 2014;104：84–92.密码：24486952
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
29.Groseth A，Matsuno K，Dahlstrom E，Anzick SL，Porcella SF，Ebihara H.四种地理上不同的Batai病毒株的完整基因组测序。J 维罗尔。2012;86(24):13844–5.密码：23166251
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
30.Groseth A，Weisend C，Ebihara H.蚊子和人类Ngari病毒分离株的完整基因组测序。J 维罗尔。2012;86(24):13846–7.密码：23166252
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
31.查兰 J， 坎塔里亚 ND.如何计算动物研究中的样本量？J 药理学药理学。2013;4(4):303–6.pmid：24250214
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
32.Groseth A， Charton JE， Sauerborn M， Feldmann F， Jones SM， Hoenen T， et al.埃博拉病毒核糖核蛋白复合物：鉴定出一种新的VP30-L相互作用。病毒研究 2009;140（1–2）：8–14.密码：19041915
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
33.R 核心团队。R：统计计算的语言和环境。R 统计计算基金会，奥地利维也纳。2022. https://www.R-project.org
34.埃文斯AB，彼得森KE。扔掉地图：全球扩张的正布尼亚病毒加利福尼亚血清群的神经发病机制。病毒。2019;11(9).pmid：31470541
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
35.洛佩兹 K， 威尔逊 SN， 库特马什-奥特 S， 塔内勒斯 M， 斯通 WB， 波里尔 DL， 等.用于研究Cache Valley病毒发病机制和子宫内传播的新型小鼠模型。新兴微生物感染。2021;10(1):1649–59.pmid：34353229
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
36.赵玲， 罗华， 黄丹， 于平， 董炳， 姆瓦利科， 等.埃比努尔湖病毒的发病机制和免疫反应：一种新发现的正布尼亚病毒，在小鼠中表现出很强的毒力。前微生物。2020;11:625661.密码：33597934
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
37.Miedel EL，Hankenson F.C. Biology and Diseases of Hamsters。在：福克斯JG，编辑。实验动物医学。第3版：学术出版社;2015.第209–45页。
38.Dutta S， Sengupta P. Age of Laboratory Hamster and Human： Draw the Connexion.生物医学与药理学杂志 2019;12（1）：49–56.
查看文章谷歌学术搜索
39.卡瓦略 VL， 努内斯 MR， 达席尔瓦 EV， 维埃拉 CM， 戈麦斯 M， 卡塞布 SM， 等.正布尼亚病毒Melao，菌株BE AR633512和BE AR8033的遗传特征，以及黄金仓鼠（Mesocricetus auratus）的实验性感染。J 根维罗尔。2009;90（Pt 1）：223–33.pmid：19088293
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
40.马托斯 GC， 费雷拉 MS， 马丁斯·菲略 AJ， 阿马多尔·内托 OP， 坎波斯 VM， 利马 MLG， 等.金仓鼠与瓜马病毒（Peribunyaviridae，Orthobunyavirus）的实验性感染。微生物病理学。2019;135:103627.pmid：31326560
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
41.罗德里格斯， 桑托斯， 阿里西 GM， 伯纳德斯 ES， 席尔瓦 ML， 罗西马， 等.金仓鼠（Mesocrisetus auratus）中的Oropouche病毒实验感染。病毒研究 2011;155（1）：35–41.密码：20727376
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
42.Dutuze MF， Mayton EH， Macaluso JD， Christofferson RC.重组正布尼亚病毒Ngari与假定的亲本病毒Bunyamwera和Batai的比较表征：体外表征和离体稳定性。J 根维罗尔。2021;102(2).pmid：33258753
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
43.Bridgen A， Weber F， Fazakerley JK， Elliott RM. Bunyamwera bunyavirus非结构蛋白NSs是一种非必需的基因产物，有助于病毒发病机制。美国国家科学院院刊， 2001;98（2）：664–9.密码：11209062
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
44.Streitenfeld H， Boyd A， Fazakerley JK， Bridgen A， Elliott RM， Weber F. Bunyamwera病毒对PKR的激活与病毒干扰素拮抗剂NSs无关。 J Virol。2003;77(9):5507–11.密码：12692253
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索