厦门论文发表-基因三重导致唐氏综合征小鼠模型中新皮层GABA能突触过多
抽象
唐氏综合症 （DS） 是由人类 21 号染色体 （HSA21） 的三体性引起的。唐氏综合征研究的一个主要挑战是确定引起特定症状的HSA21基因。唐氏综合症细胞粘附分子（DSCAM）由HSA21基因编码。先前的研究表明，DSCAM果蝇同系物的蛋白质水平决定了突触前末端的大小。然而，DSCAM的三重是否有助于DS的突触前发育仍然未知。在这里，我们表明DSCAM水平调节在新皮质锥体神经元（PyNs）上形成的GABA能突触。在用于DS的Ts65Dn小鼠模型中，由于DSCAM三重，DSCAM过度表达，篮子和枝形吊灯中间神经元对PyN的GABA能神经支配增加。DSCAM表达的遗传标准化挽救了过量的GABA能神经支配和PyN抑制的增加。相反，DSCAM的丧失会损害GABA能突触的发育和功能。这些发现表明DS小鼠模型的新皮层中GABA能神经支配和突触传递过度，并确定DSCAM过表达是原因。他们还暗示DSCAM水平失调是相关神经系统疾病的潜在致病驱动因素。
数字
Fig 4Fig 5Fig 6图1图2图3Fig 4Fig 5Fig 6图1图2图3
引文： 刘 H， 卡巴列罗-弗洛兰 RN， Hergenreder T， Yang T， Hull JM， Pan G， et al. （2023） DSCAM基因三重导致唐氏综合症小鼠模型中新皮层中GABA能突触过多。公共科学图书馆生物学21（4）： e3002078. https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002078
学术编辑： 韩国基础科学研究所金恩俊
收到： 14年2023月14日;接受： 2023月 20， 2023;发表： <>月 <>， <>
版权所有： ? 2023 刘等这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。
数据可用性： 这些数字所依据的数据可以在 https://doi.org/10.5281/zenodo.7714234 中公开访问。
资金： 这项工作得到了美国国立卫生研究院（R21NS094091、R01MH112669和R01EB028159）的资助;R37NS076752 至 LLI），脑研究基金会向 B.Y. 提供的种子赠款，密歇根大学蛋白质折叠疾病计划向 B.Y. 提供的赠款，密歇根大学药理学系向 P.M.J. 提供的启动资金，以及密歇根大学 Rackham 优异奖学金和 J.M.H. 的 MI-BRAIN 博士前奖学金。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。
竞争利益： 提交人声明不存在相互竞争的利益。
缩写： 行政协调会， 前扣带皮层;ACSF， 人工脑脊液;自动合成系统， 轴突初始节段;.APP 淀粉样蛋白前体蛋白;泛自闭症障碍， 自闭症谱系障碍;ChC， 枝形吊灯单元;CNV， 拷贝数变体;无害环境管理 唐氏综合症;DSCAM， 唐氏综合征细胞粘附分子;HSA21， 人类21号染色体;微微抑制标准， 微型抑制性突触后电流;PFA， 多聚甲醛;PyN， 锥体神经元;P28， 产后第28天;室温， 室温;sIPSC， 自发抑制突触后电流;SNV， 单核苷酸变异体
介绍
唐氏综合症 （DS） 是由人类 21 号染色体 （HSA21） 的额外拷贝引起的，唐氏综合征患者表现出许多疾病。DS研究的一个主要挑战是鉴定HSA21上导致特定细胞和系统改变导致症状的基因。唐氏综合征细胞粘附分子（DSCAM）是一种进化保守的I型跨膜蛋白，由HSA21基因编码[1]。在人类中，DSCAM基因位于HSA21的DS临界区域[1]，这与唐氏综合征的许多症状有关。我们之前表明，DSCAM的果蝇同系物Dscam的蛋白质水平[2]决定了感觉神经元中突触前末端的大小，而不需要果蝇Dscam基因的外域多样性[3]。此外，其他人报告说，Dscam的过表达会损害果蝇的突触靶向和传递[4，5]。这些发现表明，DSCAM水平失调可能导致人类脑部疾病的神经元缺陷。事实上，DSCAM水平改变见于多种脑部疾病，包括唐氏综合征[6]、自闭症谱系障碍[7-9]、顽固性癫痫[10]、双相情感障碍[11]，以及可能的脆性X综合征[3，4，12，13]。尽管最近的研究结果表明DSCAM在促进脊椎动物突触前生长方面具有保守作用[14，15]，但DSCAM表达失调是否会导致脑部疾病中的神经元缺陷仍有待经验确定。
在这项工作中，我们试图确定DSCAM水平改变对DS小鼠模型的影响，其中DSCAM基因一式三份。先前的研究表明，增强的GABA能抑制会损害Ts65Dn小鼠的认知[16-20]，这是使用最广泛的DS动物模型[21，22]。此外，Ts65Dn小鼠在海马体中表现出过度的GABA能抑制[16，23-31]。Olig1和Olig2三重导致GABA能神经元过度生成，导致海马体过度抑制[29-31]。然而，一些证据表明唐氏综合征脑部疾病的病因不同，使得不同的脑区域表现出不同的分子、细胞和生理缺陷。例如，Ts1Dn小鼠海马齿状回的微型抑制性突触后电流（mIPSC）频率增加，但CA65区没有增加[25，31]。与DS动物模型海马体中GABA能缺陷的广泛报道相反，人们对GABA能信号传导是否在新皮层中改变知之甚少。既往研究表明，抑制性突触体的大小在Ts65Dn小鼠的新皮层中增大，提示该区域GABA能突触功能可能改变[32，33]。在本研究中，我们展示了Ts65Dn中对新皮质锥体神经元（PyN）的过度GABA能神经支配和突触传递，并证明DSCAM在GABA能神经元中的过表达在这一过程中起着关键作用。
通过结合稀疏标记和全细胞膜片钳记录的遗传工具，我们发现枝形吊灯细胞（ChC）和篮形细胞在Ts65Dn小鼠中过度的GABA能神经支配和抑制皮质PyN。DSCAM水平的遗传标准化挽救了GABA能神经元的突触前过度生长和过度突触传递。DSCAM的缺失始终损害了ChC突触前生长并降低了PyN的抑制。此外，我们发现野生型和Ts65Dn小鼠的ChC轴突末端生长和bouton数量与DSCAM水平呈偶联并呈正相关。因此，这些发现强调了DSCAM水平在调节新皮层GABA能突触中的关键作用。因此，DSCAM表达水平失调可能是相关神经系统疾病中GABA能功能障碍的常见原因。
结果
Ts65Dn小鼠DSCAM过表达增加新皮层PyN体细胞上GABA能体细胞的数量
DSCAM在唐氏综合征患者的大脑中过表达[6]。我们发现它在Ts65Dn小鼠（图1A）中也有过表达，这是一种广泛使用的DS模型，其中DSCAM以3个拷贝存在[21]。先前对Ts65Dn新皮质的研究表明，GABA能突触的数量增加[34]和这些突触的扩大[32，33]，但对哪种HSA21基因引起GABA能突触的变化知之甚少。DSCAM在GABA能神经元中表达[35]。因此，我们询问Ts65Dn小鼠中的GABA能突触数是否改变，如果是，DSCAM是否负责。
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图1. DSCAM水平的遗传标准化挽救了Ts65Dn小鼠PyN体细胞上形成的GABA能体细胞的数量。
(A）通过引入DSCAM将DSCAM过表达标准化为Ts65Dn小鼠的整倍体水平2焦耳功能丧失等位基因。通过雌性Ts65Dn小鼠与雄性DSCAM杂交获得Euploid，Ts65Dn和Ts65Dn：DSCAM+/+/?小鼠2焦耳.图中显示了来自每个指定基因型的新皮质样品的代表性蛋白质印迹（顶部）和定量（底部）。条形图中的每个点表示来自 1 个鼠标的样本。（B）为实验生产小鼠的程序示意图。（C） 整倍体（野生型）、Ts65Dn 和 Ts65Dn：DSCAM+/+/? 的 ACC 第 II/III 层支配 PyN 的周围体周围 GABA能 bouton 的代表性图像（即 DSCAM 剂量的全局标准化）。每个基因型组中的右侧面板是左侧图中虚线框住的区域的放大视图。PyN的体细胞和近端树突由GRASP1标记。黄色箭头指向GABA能boutons，如Bassoon+点状物所示，与VGAT+点点重叠。（D）整倍体：Lhx6-Cre+/? ACC 第 II/III 层支配 PyN 的周围体际 GABA 能体位的代表性图像;（2） TS65Dn：Lhx6-Cre+/?;和 （3） Ts65Dn：Lhx6-Cre+/?/DSCAM絮絮（即，DSCAM剂量的GABA能神经元正常化）。（东、女）定量DSCAM剂量实验的全局（E）和GABA能神经元（F）标准化中每PyN的周围体体GABA能子的数量。对于每只小鼠，分析5-7个PyN;图表中的每个数据点代表 1 只鼠标的平均值。除非另有说明，否则平均± SEM 显示在图中，统计检验是用于多组比较的单因素方差分析，用于成对比较的是事后学生 t 检验。**： p < 0.01;： p < 0.001;： P < 0.0001。该数字所依据的数据可以在 https://doi.org/10.5281/zenodo.7714234 中找到。ACC，前扣带皮层;DSCAM，唐氏综合症细胞粘附分子;PyN，锥体神经元。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002078.g001
将雌性Ts65Dn小鼠与目的基因（例如DSCAM）的雄性功能丧失突变体杂交产生具有该基因2个功能拷贝的三体小鼠。如果使用杂合突变体，后代还包括常规的三体和整倍体同窝（图1B）。因此，Ts65Dn小鼠中一式三份的特定基因的贡献可以通过比较目的基因“标准化”的小鼠与三体小鼠来确定[31，36]。为了使用这种遗传方案测试DSCAM三重的效果，我们使用了蛋白质零等位基因DSCAM2焦耳 [37–39]（称为DSCAM ?/?这里）。在DSCAM基因剂量标准化的Ts65Dn小鼠（Ts65Dn：DSCAM+/+/?基因型）中，DSCAM蛋白的平均水平在统计学上与整倍体小鼠无法区分（图1A）。作为对照，标准化DSCAM基因剂量并未改变Ts65Dn（S1A图）中淀粉样蛋白前体蛋白（APP）水平的增加，Ts21Dn由另一个对DS脑部疾病很重要的HSA36基因编码[<>]。
篮状细胞是最常见的皮质中间神经元，优先支配PyN的体细胞和近端树突[40，41]。我们分析了出生后第28天（P28）在前扣带皮层（ACC）皮质层II/III上形成的GABA能bouton（即主要由篮状细胞形成），这是篮子细胞发育基本完成之后的一段时间[42]。为了可视化周围GABA能体介子，脑切片被三重标记为抗巴松管（突触前活动区）[43]、抗VGAT（突触前GABA能体）[44]和抗GRASP1（突触前GABA能体突）[45]。我们确定了每个PyN体细胞周围的GABA能bouton数量 - 如与VGAT+信号重叠的Bassoon+点（S1B 图）所示 - 是否因DSCAM基因的丢失而改变。定量以双盲方式进行，以避免实验者偏倚。
与先前的报道一致[33，34]，我们发现在ACC（图65C和1E）和躯体感觉皮层（S1图）中，Ts2Dn中每个PyN体细胞周围的GABA能体的平均数量显着增加。引人注目的是，标准化DSCAM表达水平完全挽救了增加的bouton数量。Ts65Dn或Ts65Dn：DSCAM+/+/?小鼠中PyN的平均体细胞大小不受影响（S1D图）。这些数据表明，Ts65Dn小鼠中的DSCAM过表达增加了PyN体上GABA能bouton的数量。
DSCAM在GABA能神经元中表达[35]。接下来，我们确定了GABA能神经元中DSCAM基因的额外拷贝是否会导致PyN体细胞上过量的GABA能boutons。先前对果蝇感觉神经元[3]和小鼠视网膜神经节细胞[15]的研究表明，DSCAM在促进轴突生长方面具有细胞自主作用。为了解决这个问题，我们利用了Lhx6-Cre小鼠系，该系在早期发育阶段靶向GABA能中间神经元，包括篮细胞和ChC细胞[46，47]。将Lhx6-Cre小鼠与携带絮状DSCAM等位基因（DSCAM絮絮) [48]在Ts65Dn背景中导致DSCAM基因表达的正常化，特异性地在GABA能神经元中。标准化GABA能神经元中的DSCAM剂量将周围体状GABA能体的数量减少到整倍体水平（图1D和1F）。这些结果表明，GABA能神经元中DSCAM的额外拷贝导致PyN体上过量的GABA能boutons。
使DSCAM水平正常化可挽救Ts65Dn新皮层中过量的GABA能突触传递
尽管已有报道表明Ts65Dn新皮质中GABA能突触的数量增加和扩大[32-34]，但这些小鼠新皮层中的GABA能突触传递是否增加仍有待确定。我们发现Ts65Dn小鼠中过度表达的DSCAM增加了新皮层中的GABA能boutons，这促使我们测试了这种可能性。
我们检查了急性新皮质切片中的GABA能突触传递，使用全细胞膜片钳记录ACC第二/三层中的PyN。我们发现，与整倍体同窝小鼠相比，Ts63Dn小鼠的mIPSC频率增加了约65%（图2A和2B），这与篮形细胞中布顿数量的增加一致（图1C和1E）。相比之下，我们发现整倍体同窝小鼠和Ts65Dn小鼠之间的mIPSC振幅没有差异（图2A和2C），这表明突触后反应可能不受三体性的影响。与DSCAM在Ts65Dn小鼠GABA能bouton数量增加中的作用一致（图1C和1E），标准化DSCAM表达阻止了这些小鼠中mIPSC频率的增加（图2A和2B），表明DSCAM过表达导致过度的GABA能突触传递。在整倍体、Ts65Dn 和 Ts65Dn：DSCAM+/+/? 小鼠的自发抑制性突触后电流 （sIPSC） 中观察到类似的频率变化，但幅度没有变化（S3 图），与 GABA 突触位点增加一致。
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图2. 标准化DSCAM水平可以挽救Ts65Dn新皮层中增强的GABA能突触传递。
(A-C）Ts65Dn小鼠DSCAM基因剂量的全局标准化。从整倍体、Ts65Dn和Ts65Dn：DSCAM+/+/?小鼠的脑切片中记录mIPSC，这些切片是通过雌性Ts65Dn和雄性DSCAM交配获得的。2焦耳小 鼠。（A） 来自ACC第II/III层PyN的mIPSC的代表性痕迹。 （B，C）mIPSC频率（B）和振幅（C）的量化。共分析6只整倍体对照小鼠，6只Ts65Dn和6只Ts65Dn：DSCAM+/+/?小鼠。对于每只鼠标，记录 2-4 个 PyN。（D-F）Ts65Dn小鼠GABA能神经元中DSCAM基因剂量的标准化。Lhx6-Cre小鼠与DSCAM杂交絮絮小鼠生成Lhx6-Cre：DSCAM絮絮Ts65Dn背景中的小鼠（Ts65Dn：Lhx6-Cre：DSCAM絮絮).（D） 来自ACC第二/三层PyN的mIPSC的代表性痕迹，在整倍体：Lhx6-Cre，Ts65Dn：Lhx6-Cre和Ts65Dn：Lhx6-Cre：DSCAM中絮絮脑切片。（东、女）mIPSC频率（E）和幅度（F）的量化。总共 4 个整倍体对照、4 个 Ts65Dn 和 4 个 Ts65Dn：Lhx6-Cre：DSCAM絮絮对小鼠进行分析。对于每只鼠标，记录 2-4 个 PyN。用于多组比较的单因素方差分析和用于成对比较的事后学生 t 检验。**： p < 0.01;： p < 0.001;NS：不显著（P > 0.05）。该数字背后的数据可以在 https://doi.org/10.5281/zenodo.7714234 中找到。ACC，前扣带皮层;DSCAM，唐氏综合症细胞粘附分子;mIPSC，微型抑制性突触后电流;PyN，锥体神经元。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002078.g002
PyN的静息电位、阈值和动作电位幅度在整倍体、Ts65Dn和Ts65Dn：DSCAM+/+/?小鼠中无法区分（S4A-S4C图）。我们观察到Ts65Dn和整倍体之间的动作电位半宽存在细微差异（S4D图）;然而，这种微小的变化并没有影响4组之间没有差异的去极化和复极化速度（dv/dt）（S4E和S3F图）。这些结果表明，PyN的膜特性不受2个DSCAM拷贝的三体或三体性的影响。此外，在整倍体、Ts65Dn 和 Ts65Dn：DSCAM+/+/? 小鼠中，发射频率和流变基（定义为唤起动作电位所需的最小电流）无法区分（S4G 和 S4H 图）。这表明 PyN 的兴奋性在很大程度上不受 2 个 DSCAM 拷贝的三体性或三体性的影响。
我们进一步确定，在GABA能神经元中特异性地标准化DSCAM剂量是否可以挽救Ts65Dn新皮层中mIPSC频率的增加。Lhx6-Cre小鼠与DSCAM杂交絮絮小鼠生成Lhx6-Cre：DSCAM絮絮Ts65Dn背景中的小鼠（Ts65Dn：Lhx6-Cre：DSCAM絮絮).标准化Ts65Dn小鼠GABA能神经元中的DSCAM剂量完全将mIPSC频率拯救到整倍体水平（图2D和2E）。mIPSC的振幅在整倍体和Ts65Dn小鼠之间或Ts65Dn和Ts65Dn：Lhx6-Cre：DSCAM之间没有差异絮絮 (图2D和2F）。这些结果与形态学结果一致，表明DSCAM基因的额外拷贝导致PyN体细胞上GABA能bouton数量的增加（图1C-1F）。
篮状细胞和ChC细胞构成新皮层中表达小白蛋白（PV+）的中间神经元[40]。值得注意的是，标准化DSCAM水平并没有挽救Ts65Dn小鼠ACC区域中PV +神经元密度的增加（S5A和S5B图）。因此，Ts65Dn新皮层中过表达的DSCAM通过增加GABA能bouton的数量而不是通过影响PV + GABA能神经元的数量来引起过度的GABA能突触传递。
DSCAM过表达增加Ts65Dn小鼠的ChC突触前末端和卵泡
既往对果蝇的研究表明，Dscam水平决定了突触前末端的大小，Dscam水平升高会导致突触前末端过度生长[3，49]。DSCAM的增加是否也会导致小鼠突触前末端的过度生长尚不清楚。与篮形细胞相比[50]，新皮质ChC的形态相对刻板，且可可靠量化[51-54]。每个ChC在其轴突初始段（AIS）处支配大约200个PyN[55]，其中产生动作电位[56，57]。
我们使用Nkx2.1-CreERT2小鼠系和tdTomato报告基因系Ai14标记新皮层中的单个ChCs[58]（图3A）。单个ChC仅延伸几个树突分支，而是数百个突触前末端，称为轴突盒，每个末端支配一个PyN的AIS[59]。在ChC发育完成后的P28处双盲定量单个ChC的轴突盒和突触前bouton[59]。分析了ACC第二层/第三层中的ChC，因为该区域ChC的形态最刻板。
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图3. 标准化DSCAM表达可挽救Ts65Dn小鼠中ChC轴突盒和突触前bouton的过度生长。
(A）为实验生产小鼠的程序示意图。（B）ACC第II/III层中单个ChC的代表性图像，显示的是整倍体，Ts65Dn和Ts65Dn的ChC，在P65处具有DSCAM等位基因归一化（Ts28Dn：DSCAM+/+/?）小鼠。比例尺，20 μm。（C） 总墨盒长度的量化。对于每个 ChC，分析所有支配 PyN AIS 的轴突盒（约 15-40），体积为 120 μm（长度）× 80 μm（宽度）× 30 μm（厚度），ChC 细胞体位于顶部中间（S6 图）。对于每只小鼠，分析4-6个ChC;分析4只整倍体，5只Ts65Dn和4只Ts65Dn：DSCAM+/+/?小鼠。（D）支配PyN的AIS的ChC轴突盒的代表性图像。单个ChC的墨盒标有tdTomato（红色）。PyN的AIS被标记为抗磷酸化IκB（pIκB，绿色）。箭头指向盒装区域中 ChC 的突触前布顿。（东、女）量化布顿数 （E） 和大小 （F）。对于每个ChC，分析轴突盒中在定义体积内支配AIS的所有bouton（S6图）以获取bouton数;分析最靠近细胞体的10个墨盒中的布顿尺寸。对于每只小鼠，分析4-6只ChC，并分析4只整倍体，5只Ts65Dn和4只Ts65Dn：DSCAM+/+/?小鼠。图表中的每个点代表 1 个鼠标。用于多组比较的单因素方差分析和用于成对比较的事后学生 t 检验。*： p < 0.05;： p < 0.0001。该图背后的数据可以在 https://doi.org/10.5281/zenodo.7714234 中找到。ACC，前扣带皮层;AIS，轴突初始节段;ChC，枝形吊灯单元;DSCAM，唐氏综合症细胞粘附分子;PyN，锥体神经元;P28，产后第28天。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002078.g003
为了确定Ts65Dn新皮层中ChC轴突末端的形态是否改变以及DSCAM三重是否有助于任何形态变化，我们将Nkx2.1-CreERT2和Ai14整合到Ts65Dn中，并将雌性Ts65Dn小鼠与雄性DSCAM+/?小鼠杂交。这种遗传方案产生了常规三体Ts65Dn小鼠（Ts65Dn：DSCAM+/+/+）以及仅包含65个DSCAM功能拷贝的Ts2Dn（Ts65Dn：DSCAM+/+/?）（图3A）。
与整倍体垫料相比，总筒长（即量化体积中单个墨盒的总和）增加了42%（图3B和3C）。此外，Ts65Dn小鼠中的ChCs在突触体的数量和大小上均有显着增加。每个ChC的平均bouton数量增加了36%（图3D和3E），突触前bouton的平均大小增加了22%（图3D和3F）。在三体小鼠中，相邻bouton之间的平均间隔距离和AIS长度不受影响（S7A和S7B图）。因此，我们发现Ts65Dn小鼠中单个ChC的突触前末端和bouton显着增加。
标准化DSCAM水平挽救了Ts65Dn小鼠的ChC突触前过度生长。与Ts65Dn同窝小鼠相比，单个ChC的总筒长逆转至与Ts65Dn：DSCAM+/+/?小鼠的整倍体无法区分的水平（图3B和3C）。此外，通过标准化DSCAM表达来挽救增加的布顿数量和布顿大小（图3D-3F）。与整倍体或Ts65Dn小鼠相比，在bouton距离或AIS长度方面没有观察到变化（S7A和S7B图）。这些结果表明，Ts65Dn小鼠的ChC突触前末端过度生长主要是由DSCAM过表达引起的。
DSCAM的缺失减少了PyN体细胞和轴突初始节段上GABA能子的数量
上述研究表明，DSCAM在三体小鼠模型中的过表达导致PyN体细胞和AIS上的GABA能boutons过多。DSCAM的缺失会导致相反的表型吗？为了回答这个问题，我们评估了功能丧失DSCAM突变型DSCAM中的体周GABA能boutons。2焦耳.如前所述[37，38]，DSCAM未检测到DSCAM蛋白2J/2J (数码相机?/?）通过蛋白质印迹（S8A图）。脑切片用抗巴松管（用于突触前活动区）、抗VGAT（用于突触前GABA能体）和抗GRASP1（用于PyN体细胞和近端树突）进行三重染色。我们以双盲方式量化数据以避免实验者偏差，并比较了DSCAM?/?， DSCAM+/?和 DSCAM 组。在DSCAM的新皮质中，每个PyN体细胞周围的GABA能bouton的平均数量减少了41%+/+?/?小鼠与DSCAM的比较+/?小鼠（图4A和4B）。DSCAM中DSCAM蛋白的水平+/?小鼠是DSCAM小鼠的65%（S8B图）。与突触发育中的DSCAM功能是剂量依赖性的观点一致[3]，DSCAM中的PyN是一致的+/++/?小鼠的周围GABA能体量也比DSCAM小鼠少（图4C和4D）。这些数据表明，DSCAM是新皮层PyN体细胞上形成适当数量的GABA能体顿所必需的。此外，DSCAM功能的剂量依赖性突出了DSCAM表达水平在调节突触发育中的重要性。+/+
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图4. DSCAM的缺失会损害ACC第II/III层中支配PyN的周围体细胞GABA能体。
(A和C）支配DSCAM的PyN的周围GABA能boutons的代表性图像2j/+（+/?） 和 DSCAM2J/2J（?/?）小鼠（A）以及DSCAM（+/+）和DSCAM的小鼠+/+2j/+（+/?） 小鼠 （C）。（B和D） 量化。图表中的每个数据点代表 1 只鼠标的平均值。学生 t 测试。**： p < 0.01;： P < 0.0001。该数字背后的数据可以在 https://doi.org/10.5281/zenodo.7714234 中找到。ACC，前扣带皮层;DSCAM，唐氏综合症细胞粘附分子;PyN，锥体神经元。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002078.g004
与其在果蝇突触前发育中的作用类似[3，49]，DSCAM的缺失显著阻碍了ChC突触前末端的发育。与杂合同窝相比，平均总筒长减少了24%（图5A和5B）。此外，突触前体的平均数量和大小分别显着减少了20%和15%（图5C-5E）。这2组之间的间隔距离或AIS长度没有差异（S7C和S7D图），表明DSCAM不调节布顿密度。这些结果表明，DSCAM是小鼠ChC突触前发育所必需的。
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图5. DSCAM的丢失会损害ChC轴突盒和布顿的生长。
(A） ACC 第 II/III 层中单个 ChC 的代表性图像，显示的是 DSCAM 的 ChC2j/+（+/?） 和 DSCAM2J/2J（?/?）小鼠在P28。本文中的所有ChC图像均来自P28小鼠的大脑区域。比例尺，20 μm。（B） 总墨盒长度的量化 （A）。对于每个 ChC，分析所有支配 PyN AIS 的轴突盒（约 15-40），体积为 120 μm（长度）× 80 μm（宽度）× 30 μm（厚度），ChC 细胞体位于顶部中间（S6 图）。对于每只小鼠，分析4-6只ChC，并分析4只DSCAM+/?和4只DSCAM?/?小鼠。（C） 支配 PyN AIS 的 ChC 轴突盒的代表性图像。单个ChC的墨盒标有tdTomato（红色）。PyN的AIS被标记为抗磷酸化IκB（pIκB，绿色）。箭头指向盒装区域中 ChC 的突触前布顿。（D、E）量化布顿数 （D） 和大小 （E）。对于每个ChC，分析轴突盒中在定义体积内支配AIS的所有bouton（S6图）以获取bouton数;分析最靠近细胞体的10个墨盒中的布顿尺寸。在每只小鼠中，分析4-6个ChC。共分析4只DSCAM+/?和4只DSCAM?/?小鼠。每个点代表 1 个鼠标。学生t检验*：p <0.05;： P < 0.001。该图背后的数据可以在 https://doi.org/10.5281/zenodo.7714234 中找到。ACC，前扣带皮层;AIS，轴突初始节段;ChC，枝形吊灯单元;DSCAM，唐氏综合症细胞粘附分子;PyN，锥体神经元;P28，产后第28天。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002078.g005
与正常化DSCAM水平并不能挽救Ts65Dn小鼠中PV +神经元密度增加的观察结果一致（S5A和S5B图），PV +神经元的数量不受DSCAM丢失的影响（S5C和S5D图）。
DSCAM的缺失损害了GABA向PyN的能突触传递
为了确定由DSCAM缺失引起的GABA能bouton数缺陷是否会损害GABA能突触传递，采用全细胞配置中的膜片钳记录来记录急性新皮质脑切片ACC第二/III层PyN中的抑制电流。与ChCs中轴突生长受损和bouton数量一致，我们发现DSCAM中mIPSC的平均频率降低了约35%?/?小鼠比杂合同窝小鼠（图6A和6B）。此外，mIPSC的平均振幅降低了42%，表明突触后反应因DSCAM的缺失而受损（图6C）。在sIPSC的频率和振幅方面也观察到了类似的变化（图6D-6F）。
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图6. DSCAM的缺失会损害GABA能突触传递到新皮质PyN。
(A）DSCAM+/?和DSCAM?/?脑切片中ACC第二/III层PyN的mIPSC的代表性痕迹。（乙、丙）mIPSC频率（B）和振幅（C）的量化。对于每只小鼠，记录3-5个PyN。共分析5只DSCAM+/?和4只DSCAM?/?小鼠。N：DSCAM+/?为16，DSCAM?/?为13。 （D）DSCAM+/?和DSCAM?/?脑切片中ACC第二/III层PyN的sIPSC的代表性痕迹。（东、女）量化sIPSC频率（E）和幅度（F）。每只小鼠记录大约 3-5 个 PyN。共分析5只DSCAM+/?和4只DSCAM?/?小鼠。N：17 表示 DSCAM+/?，14 表示 DSCAM?/?。学生 t 测试。*： P < 0.05.该数字背后的数据可以在 https://doi.org/10.5281/zenodo.7714234 中找到。ACC，前扣带皮层;DSCAM，唐氏综合症细胞粘附分子;mIPSC，微型抑制性突触后电流;PyN，锥体神经元;sIPSC，自发抑制性突触后电流。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002078.g006
ChC 轴突末端生长和胸花数量与新皮质 DSCAM 水平呈正相关
突触前末端生长和突触发生是形成适当神经元连接的并发过程[60]。关于这两种事件是否以及如何在哺乳动物GABA能中间神经元中协调，知之甚少。ChC的稀疏标记为以单细胞分辨率解决这些问题提供了机会。我们研究了单个ChC中筒长度与突触体的2种形态学方面的关系，即布顿数量，大小和密度（由间隔距离反映）。我们发现在两种野生型（整倍体）中，每个ChC的弹筒长度与bouton数量之间存在很强的相关性（R2= 0.82，p < 10?7）和Ts65Dn小鼠（R2= 0.79，p < 10?15) (S9A图）。尽管DSCAM对墨盒长度和口数均有正向调节（图3B-3F和5），但DSCAM的损耗并未损害其耦合（R2= 0.89，p < 10?8) (S9B 图）。在野生型和Ts65Dn小鼠中，墨盒长度和bouton大小之间也存在显着的相关性（S9C图），尽管它弱于墨盒长度和bouton数量之间的相关性。DSCAM的损失似乎轻微损害了墨盒长度和布顿尺寸之间的耦合（S9D图）。在任何测试的基因型中，墨盒长度和布顿密度之间都没有相关性（S9E和S9F图）。综上所述，这些结果表明突触前末端生长和布顿数在ChC发育中呈正耦合。
在果蝇中，Dscam水平决定了突触前乔木的大小[3]。蛋白质印迹结果表明，新皮层中的DSCAM水平在整倍体，Ts65Dn和Ts65Dn：DSCAM+/+/?小鼠中表现出个体变化（S10A图）。我们绘制了每只小鼠的新皮质DSCAM水平，如蛋白质印迹分析的那样，与每只小鼠的平均墨盒长度，bouton数量，大小或密度。我们观察到DSCAM水平与小鼠的墨盒长度，胸捏数量和布顿大小之间存在很强的相关性（S10B-S10D图）。相比之下，DSCAM水平与间隔距离之间没有发现相关性（S10E图），再次支持布顿密度不受DSCAM调节（S7图）。剂量依赖性突出了DSCAM表达水平在调节ChC突触前发育中的重要性。
讨论
在这项研究中，我们发现DS小鼠模型中DSCAM的额外拷贝导致ChC和篮子细胞的突触前过度生长，这是新皮层中两种主要类型的抑制神经元。通过使DSCAM水平正常化来挽救Ts2Dn中PyN的过度神经支配和过度GABA能抑制。在DSCAM功能丧失突变小鼠中观察到相反的表型。GABA能突触发育和功能对DSCAM表达水平的敏感性表明，DSCAM表达失调可能是表现出异常DSCAM表达的神经系统疾病（包括DSAM，ASD，顽固性癫痫，双相情感障碍以及可能的脆性X综合征）中GABA能功能障碍的基础。
DSCAM的影响不太可能源于有丝分裂增殖，原因有几个。首先，DSCAM在分化神经元中表达，但不在有丝分裂祖细胞中表达[1，61-63]。其次，我们的结果表明，标准化DSCAM水平并不能挽救Ts65Dn小鼠ACC区域中PV +神经元密度的增加（S5A和S5B图）。始终如一地，皮质PV +神经元的数量在DSCAM无效小鼠中不受影响（S5C和S5D图）。
DSCAM表达水平决定了哺乳动物神经元的突触前末端大小
ChCs轴突轴突轴和突触前末端的刻板形态有利于定量评估[51，52]。此外，ChCs基因标记的最新进展允许对单个ChC进行稀疏标记，以单细胞分辨率量化突触前末端[58，64]。通过利用该系统，我们在这项研究中表明，DSCAM过表达导致新皮层中ChC的突触前过度生长。值得注意的是，ChC 墨盒长度、布顿数和布顿大小与 DSCAM 表达水平相关（S10B–S10D 图），表明 ChC 发育对 DSCAM 水平的敏感性。因此，这项工作支持DSCAM在调节果蝇和小鼠突触前末端生长中的保守作用。
由于技术困难，DSCAM是否自主地发挥细胞功能以促进ChC突触前末端生长仍然是一个悬而未决的问题。DSCAM在单个ChC中的遗传缺失具有挑战性，因为Nkx2.1-CreER小鼠系中的Cre活性较弱。由于他莫昔芬的给药不能保证絮凝小鼠中所有或绝大多数细胞中靶基因的缺失，因此需要免疫染色或原位杂交以确认缺失。然而，现有的抗DSCAM抗体不利于新皮层的免疫染色[6]。此外，原位杂交的实验程序与免疫染色对ChCs的形态学研究不兼容。未来具有可靠的ChC特异性基因缺失（例如，通过更强的Cre）的研究将确定DSCAM是否具有细胞自主功能。
我们使用靶向GABA能中间神经元的Lhx6-Cre小鼠系的研究表明，GABA能神经元中DSCAM的额外拷贝导致PyN体细胞上的GABA能子过多（图1D和1F）和PyN中的mIPSC频率增加（图2D-2F）。Lhx6-Cre转基因不仅在篮形细胞中表达，篮形细胞在PyN上形成周围体GABA能突触[40，41]，而且在ChC细胞和生长抑素+GABA能神经元中表达[46，47]。因此，这些结果并不能证明篮状细胞中DSCAM的额外拷贝会导致过多的bouton或增加的mIPSC频率。测试DSCAM在周围突触发育中的细胞自主功能需要去除篮形细胞中DSCAM的额外拷贝。
DSCAM在新皮层GABA能突触传递中的作用
全细胞膜片钳记录显示，Ts65Dn小鼠中PyN的mIPSC频率增加，并且正常化DSCAM水平挽救了这种变化（图2）。此外，在DSCAM中，PyN的mIPSC频率降低。?/?小鼠（图6A和6B）。由于mIPSC频率指示输入数和突触前释放位点，因此这些发现与DSCAM在增加篮子细胞中的布顿数中的作用一致（图1C，1E和4）。
我们发现整倍体和Ts65Dn小鼠之间的PyN的mIPSC振幅没有差异（图2A和2C），这表明突触后反应可能不受三体性的影响。相比之下，在DSCAM中，PyN的mIPSC幅度降低?/?小鼠（图6C），表明突触后反应因DSCAM丢失而受损。综上所述，这些结果表明，虽然DSCAM对于PyN上形成的抑制性突触的突触后反应可能是必不可少的，但它们的过表达不足以改变突触后反应，至少在Ts65Dn小鼠中是这样。
DSCAM在DS小鼠模型新皮层兴奋性突触传递中的潜在作用
在这项研究中，我们发现ACC中PyN的sEPSC频率也增加了，通过标准化DSCAM基因剂量降低了sEPSC频率（S4I图）。这一结果表明，兴奋性突触前末端的活性也受到DSCAM表达水平的调节。相比之下，我们没有观察到ChCs中sEPSC的频率有任何差异（S11图），这表明HSA21三体性对新皮层中的兴奋性突触传递具有细胞类型特异性影响。全面分析DSCAM对DS模型中兴奋性突触传递的贡献是一个有趣的未来方向。
与PyN类似，ChCs在整倍体，Ts65Dn和Ts65Dn：DSCAM+/+/?小鼠之间的单动作电位或膜特性没有任何差异（S11A-S11F图），除了Ts65Dn小鼠阈值的微小变化（S11B图）。这种微小的变化对神经元兴奋性没有影响，因为流变基不受影响（流变基被定义为唤起动作电位所需的最小电流）（S11H图）。与PyN不同，Ts65Dn小鼠和Ts65Dn：DSCAM+/+/?小鼠的ChC均表现出比整倍体小鼠更低的放电频率（S11G图）。这表明ChC可能会接受增加的抑制输入或减少的兴奋性输入，与DSCAM无关。PyN放电速率在整倍体，Ts65Dn和Ts65Dn：DSCAM+/+/?小鼠中无法区分（S4G图）的事实表明，过量的GABA能抑制PyN可能被过量的谷氨酸能激发所平衡。
突触前末端生长与ChCs中的布顿数之间的耦合
在不同类型的GABA能神经元中，ChC被认为是新皮层抑制的强大来源[65]。这些神经元形成独特的轴突-轴突GABA能突触，选择性地支配AIS处的PyN，从而产生动作电位[56，57];每个ChC支配大约200个PyN[55]。ChC突触前生长受损见于癫痫和精神分裂症患者，这两者都被认为部分是由GABA能信号传导中断引起的[65-69]。最近的研究表明，删除ChCs中精神分裂症相关基因Erbb4会导致小鼠出现精神分裂症样表型，表明ChC缺陷与精神分裂症之间存在因果关系[46，54]。除ErbB4外，还发现神经调节蛋白1、DOCK7、Fgf13和L1CAM可调节ChC和PyN之间的突触形成[51-53，70]。
在本研究中，对单细胞分辨率下的盒生长和布顿数的详细调查揭示了ChC开发的几个有趣特征。首先，突触前盒的生长与布顿数量密切相关，在较小程度上与布顿大小密切相关（S9A-S9D图）。这一观察结果支持了突触致性模型，该模型提出突触发生可稳定神经发育中的轴突轴生长[71]。其次，调节墨盒生长和突触发生的因素不一定是这两个过程耦合的因素。尽管DSCAM调节墨盒生长和布顿数量，但在缺乏DSCAM功能的小鼠中，这两种过程的偶联仍然完好无损，这表明DSCAM不是偶联因子。识别和区分调节器的耦合因子是迈向机械理解ChC发展的重要一步。
DSCAM调节抑制性突触的可能机制
通过在三体性背景中恢复DSCAM水平，我们证明了DSCAM在DS小鼠模型中抑制性突触变化中的作用的因果关系。与DSCAM作用相关的详细分子机制仍然难以捉摸。在三体性背景中GABA能神经元中条件敲除1个DSCAM基因拷贝，将GABA能神经元的数量和mIPSC频率降低到正常水平（图1D，1F，2D-2F和S3D-S3F），表明GABA能神经元中DSCAM水平的增加是突触变化的原因。此外，我们没有观察到PyN的大小或AIS（S1D，S7B和S7D无花果）长度的变化，进一步支持DSCAM在抑制性突触中的作用是由它们在GABA能神经元中的表达引起的。先前的研究表明，有几种分子介导DSCAM下游的信号传导，包括Abelson酪氨酸激酶[49]，Pak1 [72-74]和Dock [74]。此外，DSCAM可能调节GABA能神经元的电活动，从而改变其突触前末端和突触。这些是未来可以研究的有趣机制。
对其他脑部疾病的见解
DSCAM表达水平改变与多种脑部疾病有关，包括唐氏综合征、ASD、顽固性癫痫和双相情感障碍[6-11]，可能还有脆性X综合征[3，4，12，13]。本工作已经建立了DSCAM水平失调与GABA能神经元的发育和功能缺陷之间的因果关系。DSCAM的剂量依赖性功能表明，DSCAM水平失调可能是与神经系统疾病相关的GABA能功能障碍的常见致病驱动因素。例如，遗传学分析显示，特发性ASD个体的DSCAM基因中存在多种破坏性单核苷酸变异（SNV）和拷贝数变异（CNV），增加了DSCAM表达水平改变的可能性[7-9，75]。鉴于本研究中发现的DSCAM水平对GABA能信号传导的调节以及GABA能信号传导受损在ASD中的既定作用[76]，可以假设DSCAM表达减少会导致ASD中的GABA能信号传导受损。为了支持这一观点，一些DSCAM中增强子区域缺失CNV的ASD个体表现出非热性惊厥[9]，这种症状也见于DSCAM功能缺陷的小鼠[77]。因此，重要的是检查自闭症个体尸检样本中的DSCAM水平，并确定改变的DSCAM表达是否会导致ASD小鼠模型中的GABA能功能障碍。
方法和材料
道德声明
密歇根大学的机构动物护理和使用委员会审查并批准了所有涉及小鼠的实验程序（协议号PRO00005862和PRO00007778）。对于免疫组织化学，小鼠被CO杀死2，紧接着心内输注（见下文）。对于电生理学，在异氟醚和USP麻醉下将小鼠斩首，并将大脑迅速从颅骨中取出以进行进一步处理（见下文）。
小鼠育种和他莫昔芬给药
所有实验均使用年龄匹配的同窝伴侣。Ts65Dn小鼠系（Ts（17（16））65Dn）购自杰克逊实验室（库存号：005252），并通过与C57BL/C3H F1杂交雄性杂交进行维护，该杂交雄性由C57BL / 6J（库存号：000664）与C3Sn.BLiA-Pde6b/DnJ系（库存号：003648）杂交。+
为了研究在PyN上形成的周围GABA能bouton，将C65BL / C17H混合背景上的雌性Ts16Dn小鼠（Ts（65（57））3Dn）培育为雄性C3H / HeDiSn-Dscam2焦耳来自杰克逊实验室的/GrsrJ小鼠（库存号：006038）产生整倍体，Ts65Dn和Ts65Dn：DSCAM+/+/?同窝伴侣用于数据收集。
为了确定GABA能神经元中DSCAM基因的额外拷贝是否会导致PyN体细胞上过量的GABA能boutons，我们对皮质GABA能神经元内的DSCAM基因剂量进行了标准化。Lhx6-Cre小鼠与DSCAM杂交絮絮小鼠（库存号：17689）产生雄性Lhx6-Cre+/?，DSCAM絮絮+/? （Lhx6-Cre/DSCAM絮絮）小鼠，反过来，将其繁殖到雌性Ts65Dn（Ts（17（16））65Dn;在C57BL / C3H混合背景上）以产生（1）Lhx6-Cre+/?：整倍体;（2） TS65Dn：Lhx6-Cre+/?;和 （3） Ts65Dn：Lhx6-Cre+/?/DSCAM絮絮同窝动物。他莫昔芬（Sigma，T5648-1G）溶解在玉米油中，通过腹膜内注射以18mg / kg体重的剂量输送给E80的孕妇，以使皮质GABA能神经元内的DSCAM基因剂量正常化。
为了标记Ts65Dn小鼠中的单个ChC，将Ts65Dn雌性与Nkx2杂交。混合C1BL / C14H背景的57-CreER+/?，Ai3?/?，DSCAM+/?雄性小鼠获得与Nkx65的整倍体，Ts65Dn和Ts2Dn：DSCAM+/+/?同窝。1-CreER+/?， Ai14+/? 转基因。他莫昔芬（Sigma，T5648-1G）溶解在玉米油中，通过腹膜内注射以0mg / kg体重的剂量输送给P80幼崽。提前准备假母坝以泌乳幼崽，因为幼崽经常在给予他莫昔芬后被Ts65Dn母坝丢弃。用于在DSCAM中标记单个CHC2焦耳小鼠，C3H背景的雌性DSCAM+/?小鼠与Nkx2杂交。1-CreER+/?， Ai14?/?， DSCAM+/? 混合 C57BL/C3H 背景的雄性小鼠，以获得具有 Nkx2 的 DSCAM+/? 和 DSCAM?/? 幼崽。1-CreER+/?， Ai14+/? 转基因。如上所述，他莫昔芬被输送给P0幼崽。在P0处杀死强壮的幼崽，以保持4至5的窝大小，以提高DSCAM?/?幼崽的存活率。Nkx2.1-CreER+/?，Ai14?/?，DSCAM+/?雄性小鼠在雌性分娩前从笼子中取出，因为雄性成虫可能会攻击并杀死DSCAM?/-幼崽。
由于DSCAM?/?幼崽较弱，在对周围体GABA能幼崽的研究中，我们在P5至P7处杀死了野生型同窝，以促进DSCAM?/?幼崽的存活。因此，几乎不可能从同一窝收集野生型、杂合子和纯合子。因此，我们比较了DSCAM+/+和DSCAM+/?小鼠之间以及DSCAM+/?和DSCAM?/?小鼠之间的周围体GABA能boutons（图4）。
对于电生理学记录，将Ts65Dn雌性与C3H DSCAM+/?雄性小鼠杂交以获得整倍体，Ts65Dn和Ts65Dn：DSCAM+/+/-同窝小鼠。对C3H DSCAM+/?小鼠进行杂交以获得DSCAM+/?和DSCAM?/?幼崽进行记录。
根据杰克逊实验室的方案，对纯化的尾尖进行至少2次PCR基因分型，以确认基因型。所有涉及小鼠的工作均由密歇根大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准，并符合国家研究委员会实验动物护理和使用指南（NIH）。
免疫组化
P28小鼠被CO杀死2紧接着在4×PBS中心内输注4%多聚甲醛（PFA）和1%蔗糖。然后将脑取出并在4°C下在4%PFA中过夜，然后在30%蔗糖（wt/vol）中孵育至少1天。将大脑嵌入OCT化合物（Fisher HealthCare）中，在-20°C下冷冻过夜，然后用徕卡CM100S低温恒温器切片成3050μm厚的切片。切片的脑切片保存在含有1.0%叠氮化钠的05×PBS中，温度为4°C直至免疫染色。
对于 ChC 和 AIS 染色，将冠状脑切片 （100 μm） 在含有 8.1% 叠氮化钠的 PBST （0× PBS + 1.100% Triton x-0） 中用 05% BSA 在 37°C 下封闭 1 小时，然后与以下一抗在 37°C 的封闭溶液中孵育过夜。使用抗磷酸化IκB抗体（pIκB）对AIS进行免疫标记[51，52，58，78]，这与小鼠新皮层中ankyrin-G抗体标记的AIS密切相关[79]（S6B和S6C图）。使用的一抗是用于神经元形态的抗mCherry（SICGEN，AB0081;1：300）和用于标记AIS的抗磷酸化Iκβ-α（细胞信号传导，14D4兔单克隆抗体;1：500）。在PBST中以3°C洗涤1次（每次37小时）后，将脑切片与37°C封闭溶液中的以下二抗孵育过夜：驴抗山羊罗丹明RX（RRX）（杰克逊免疫研究，705-297-003;1：300），驴抗兔Alexa Fluor 488（杰克逊免疫研究，711-545-152;1：300）。在PBST中在3°C下洗涤1×共37小时后，将切片安装在sRIMS 中[80]。
GABA能神经元和PyN染色的程序与上述相同，只是抗体孵育在室温（RT）下进行，并使用不同的一抗。使用的一抗是抗小白蛋白（Swant，PVG213;1：1，000），抗CAMKIIα（LSBio，6G9;1：5，000）。使用的二抗是驴抗山羊RRX（Jackson ImmunoResearch，705-297-003;1：500）和驴抗小鼠Alexa Fluor 488（Jackson ImmunoResearch，715-545-150;1：500）。
为了染色周围体GABA能布顿，在10°C下在20μM柠檬酸钠中进行抗原修复95分钟[81]。在PBS中短暂冲洗后，将切片在封闭缓冲液（1×PBS，0.3%Triton x-100，3%正常驴血清，0.05%叠氮化钠）中在室温下封闭1小时，然后在封闭溶液中与以下一抗在4°C孵育过夜：小鼠抗巴松管（ENZO，SAP7F407; 1：1，000），豚鼠抗VGAT（突触系统， 131 004;1：1，000），兔抗GRASP1（1：2，000）[45]。在PBST的室温下洗涤3次（每次20分钟）后，将脑切片与室温阻断溶液中的以下二抗在室温3小时：驴抗小鼠Alexa Fluor 488（Jackson ImmunoResearch，715-545-150;1：300），驴抗豚鼠RRX（Jackson ImmunoResearch，706-295-148;1：300），驴抗兔Alexa Fluor 647（Jackson ImmunoResearch，711-605-152;1：300）。切片在PBST的室温下洗涤3次后进行成像，共1小时。
Image acquisition and quantitative analysis
所有图像均使用配备共振扫描仪的徕卡SP5共聚焦显微镜从皮质层II / III采集，除了周围GABA能探针（见下文）。对于ChCs成像，将针孔设置为艾里1，按顺序对不同的荧光通道进行成像。使用数值孔径为63.1的4×物镜。以100.0μm z步长收集3个连续光学切片的共聚焦图像堆栈。细胞体位于30μm深度的中间。单个ChC的轴突盒和突触前体在基于ChC体细胞位置定义的三维体积中定量（S6A图）。在量化之前，图像堆栈沿z轴进行最大投影。设置120μm（长度）×80μm（宽度）的区域，细胞体位于顶部中间进行定量。与AIS共定位的墨盒和bouton通过NeuroLucida软件（MBF Bioscience）进行量化。墨盒/布顿数量定义为该区域内的弹药筒/弹药筒数量。对AIS共定位盒和突触前骨筒进行定量。墨盒长度定义为从与 AIS 共定位的第一个回合到该墨盒中与 AIS 共定位的最后一个回合的距离。布顿尺寸被定义为与AIS平行的布顿长度。我们量化了最靠近细胞体的10个墨盒中bouton的大小。布顿间距离定义为2个相邻布顿之间的距离。
在徕卡SP8共聚焦显微镜上用63×物镜（NA 1.4）对周围体GABA能探针进行成像。对于每个PyN，在PyN细胞体占据最大面积的z位置拍摄单个共聚焦图像。图像使用惠更斯软件（科学体积成像）进行解卷积。如S1C图所示，通过NeuroLucida软件（MBF Bioscience）对Perisomatic VGAT+和Bassoon + pncta在定义的PyN soma区域中进行定量。周围GABA能bouton被计为点，其中包含VGAT和巴松管阳性的像素。
为了消除实验者的偏见，这些实验以双盲方式进行。使用了两种双盲方法。首先，主要实验者获得的图像由第二个实验室成员编码和随机化。在主要实验者量化数据后，对数据进行解码以进行统计分析。其次，来自主要实验者的小鼠大脑由第二个实验室成员编码和随机化。第二个实验室成员将编码的小鼠大脑发送给第三个实验室成员进行切片。在主要实验者对编码的脑切片进行免疫染色和量化后，对数据进行解码以进行最终的统计分析。
蛋白质印迹
PFA灌注后立即去除小鼠新皮质。将相似体积的组织在SDS样品缓冲液中匀浆并上样用于电泳。将蛋白质转移到PVDF膜上，并在室温下用5%牛奶（wt/vol）封闭1小时。将印迹膜在4°C下与山羊抗DSCAR（R&D Systems，AF3666;1：500），抗APP（Cell Signaling Technology，2452;1：1，000）或小鼠抗微管蛋白（12G10，1：5，000，DSHB）一起孵育过夜。洗涤后，将印迹膜与HRP偶联的二抗（2：1，5）孵育000小时，并通过化学发光（Pierce，32106）开发。使用ImageJ进行定量。
电生理学记录和分析
Electrophysiological recordings of single action potential properties, firing frequency, and spontaneous and miniature postsynaptic currents were performed as described previously [81]. Brains were obtained from euploid, Ts65Dn, and Ts65Dn/DSCAM+/+/? mice at around P28. The animals were killed by decapitation under isoflurane and USP anesthesia. The brain was quickly removed from the skull and placed in 4°C slicing solution containing (in mM) 62.5 NaCl, 2.5 KCl, 1.25 KH2PO4, 26 NaHCO3, 5 MgCl2, 0.5 CaCl2, 20 glucose, and 100 sucrose (pH maintained at 7.4 by saturation with 95% O2 + 5% CO2). Acute coronal brain slices (300 to 350 μm thick) containing layers II/III of the ACC neocortex were cut with a microtome (VF-300, Compresstome). The slices were then transferred to a holding chamber and maintained at RT in artificial cerebrospinal fluid (ACSF) containing (in mM) 125 NaCl, 2.9 KCl, 1.25 KH2PO4, 26 NaHCO3, 1 MgCl2, 2 CaCl2, and 20 glucose (pH 7.4) (with 95% O2 and 5% CO2在溶液中冒泡）在录制前至少 1 小时。平衡后，将单个切片转移到记录室中，连续灌注ACSF（1至2mL / min）。从硼硅酸盐玻璃毛细管（1.5 mm 外径哈佛仪器）中取出记录微量移液器，最终电阻为 3 至 6 MΩ，并填充含有 135 CsCl、4 NaCl、0.4 GTP、2 Mg-ATP、0.5 CaCl 的溶液2、5 EGTA 和 10 HEPES。信号是用Axoclamp 700B放大器（Axon Instruments，Union City，CA）记录的。电流和电压钳位记录是从ACC区域II/III层的PyN和ChC获得的。这些大脑区域中的细胞使用带有1×水浸物镜的尼康Eclipse FN-40显微镜和DAGE MTI IR-1000摄像机进行鉴定。使用IR-DIC可视化神经元以评估其方向和形态。ChC中间神经元通过Nkx2.1-CreERT2 / Ai14的红色荧光鉴定。全细胞膜片钳记录以高细胞电阻（磨合前大于8 GΩ）进行。电压钳位配置中的sIPSC和mIPSC记录以2 kHz频率采集，将电压固定在?70 mV。在NMDA受体拮抗剂DL-2-氨基-5-膦酰基戊酸（AP-5）和AMPA/kainite拮抗剂50-氰基-6-硝基喹喔啉-7，2-二酮（CNQX）在3μM下记录IPSC。为了测量mIPSC，在灌注溶液中加入10μM河豚毒素（TTX）以阻断依赖于AP的突触反应。
为了研究兴奋性和EPSC，将内部溶液中的CsCl替换为K-葡萄糖酸盐，并用10 kHz的低通滤波器记录信号。对于PyN和ChC，获得了具有高电池电阻的电流钳配置下的全细胞膜片钳记录[81]。通过施加10 pA和1000 ms的负电流和正电流脉冲来计算放电频率和50 ms的正脉冲来测量单个AP的特征，从而对神经元进行电生理学表征。 在存在双库林（10μM）的情况下测量EPSC，同时使用K-葡萄糖酸内溶液将静息膜电位保持在-70mV。在整个实验过程中监测访问电阻，如果发生大于20%的变化，则丢弃结果。使用微型分析（Synaptosoft）自动识别峰值事件，并进行目视监控以排除错误的噪声。分析了事件的频率、幅度和分布。一个mIPSC频率为1.20 Hz的整倍体神经元（8个中的9个）被Grubbs测试定义为异常值，并从量化中删除。使用学生t检验比较平均值。为了分析急性脑切片中神经元的诱发动作电位频率，进行了双向方差分析和Tukey的事后分析。数据以平均± SEM 表示。
统计分析
数据以平均±SEM表示。 除非另有说明，否则组间平均差的比较由单因素方差分析进行多组比较，事后学生t检验进行成对比较。P < 0.05被认为具有统计学意义。对于所有定量，*：p < 0.05;**： p < 0.01;： p < 0.001;： p < 0.0001;NS：不显著（P > 0.05）。
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PyN上周围体体GABA能boutons的定量（与图1和4相关）。
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S1 图 PyN上周围体体GABA能boutons的定量（与图1和4相关）。
(A）标准化DSCAM基因剂量不会改变Ts65Dn皮质中APP水平的增加。图中显示了来自每个指定基因型的新皮质样品的代表性蛋白质印迹（左）和定量（右）。条形图中的每个点表示来自 1 个鼠标的样本。（B） ACC 第 II/III 层 PyN 的代表性共聚焦图像。体细胞由抗GRASP1（蓝色）标记。突触前活性区由反巴松管（绿色）标记。GABA能神经元突触前末端的GABA囊泡被抗VGAT标记（红色）。与VGAT+点重叠的巴松管+点被量化为GABA能点（黄色箭头）。绿色箭头表示与VGAT无关的巴松管+标点。（C）为了定义用于量化体周GABA能boutons的体细胞区域，我们绘制了一条既垂直于顶端树突又切向PyN核边缘的线，然后在线下方的GRASP1+区域中量化GABA能boutons。（D）ACC中PyN的体细胞大小在Ts65Dn或Ts65Dn：DSCAM+/+/?小鼠中不受影响。量化显示了躯体的平均周长。每个数据点都是鼠标中的平均值。统计检验是用于多组比较的单因素方差分析，用于成对比较的是事后学生 t 检验。**： p < 0.01;NS：不显著（P > 0.05）。除非另有说明，否则平均± SEM 显示在图中。该数字背后的数据可以在 https://doi.org/10.5281/zenodo.7714234 中找到。ACC，前扣带皮层;APP，淀粉样蛋白前体蛋白;DSCAM，唐氏综合症细胞粘附分子;PyN，锥体神经元。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002078.s001
（提夫）
S2 图 DSCAM水平的遗传标准化挽救了Ts65Dn小鼠体感皮层中PyN体细胞上形成的过量GABA能bouton（与图1相关）。
(A） 整倍体（野生型）、Ts65Dn 和 Ts65Dn：DSCAM+/+/? 的体周 GABA 能支配 PyN 层的代表性图像。每个基因型组中的右侧面板是左侧图中虚线框住的区域的放大视图。PyN的体细胞和近端树突由GRASP1标记。黄色箭头指向GABA能boutons，如Bassoon+点指示，与VGAT+点重叠。（B）量化躯体感觉皮层中每PyN的周围体周围GABA能boutons的数量。图表中的每个数据点表示 1 只鼠标的平均值。用于多组比较的单因素方差分析和用于成对比较的事后学生 t 检验。： P < 0.001。该数字背后的数据可以在 https://doi.org/10.5281/zenodo.7714234 中找到。DSCAM，唐氏综合症细胞粘附分子;PyN，锥体神经元。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002078.s002
（提夫）
S3 图 标准化DSCAM水平可以挽救Ts65Dn新皮层中PyN中增加的sIPSC（与图2相关）。
(A）来自ACC第二层/第三层的PyN的sIPSC的代表性痕迹，在整倍体，Ts65Dn和Ts65Dn：DSCAM+/+/?脑切片中。（乙、丙）sIPSC频率（B）和幅度（C）的量化。每只小鼠记录大约 2-4 个 PyN。共分析6只整倍体，7只Ts65Dn和6只Ts65Dn：DSCAM+/+/?小鼠。N：19 表示整倍体，19 表示 Ts65Dn，16 Ts65Dn：DSCAM+/+/?。（D） 来自ACC第二/第三层PyN的sIPSC的代表性痕迹，在整倍体：Lhx6-Cre，Ts65Dn：Lhx6-Cre和Ts65Dn：Lhx6-Cre：DSCAM中絮絮脑切片。DSCAM基因剂量在Ts65Dn：Lhx6-Cre：DSCAM的GABA能神经元中标准化絮絮小 鼠。（东、女）量化sIPSC频率（E）和幅度（F）。对于每只鼠标，记录 2-4 个 PyN。总共 4 个整倍体对照、4 个 Ts65Dn 和 4 个 Ts65Dn：Lhx6-Cre：DSCAM絮絮对小鼠进行分析。N：12 表示整倍体，14 表示 Ts65Dn，17 Ts65Dn：DSCAM+/+/?。用于多组比较的单因素方差分析和用于成对比较的事后学生 t 检验。*： p < 0.05;**： p < 0.01;： p < 0.001;： p < 0.0001;NS：不显著（P > 0.05）。该数字背后的数据可以在 https://doi.org/10.5281/zenodo.7714234 中找到。ACC，前扣带皮层;DSCAM，唐氏综合症细胞粘附分子;PyN，锥体神经元;sIPSC，自发抑制性突触后电流。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002078.s003
（提夫）
S4 图 PyN的兴奋性、烧成速率和sEPSC（与图2相关）。
定量 ACC 中 PyN 在整倍体（灰色）、Ts65Dn（浅蓝色）和 Ts65Dn：DSCAM+/+/?（粉红色）脑切片中的电生理学参数。数据显示为平均±SEM。 Kruskal-Wallis检验与事后Mann-Whitney检验进行两组比较，（G）除外。*： p < 0.05;**： p < 0.01;NS：不显著（P > 0.05）。（A-F）膜电位 （mV） （A）、阈值 （mV） （B）、SAP 振幅 （mV） （C）、SAP 半宽 （ms） （D）、SAP 去极化速度 （dv/dt） （E） 和 SAP 复极化速度 （dv/dt） （F） 的量化。细胞数：19 表示整倍体，18 表示 Ts65Dn 和 17 Ts65Dn：DSCAM+/+/?。 （G） 显示诱发 AP （Hz） 的平均点火频率与 PyN 中的电流 （pA） 之间关系的曲线。双向方差分析，Tukey的多重比较测试。NS：P > 0.05。（H） （G） 中 PyN 的流变碱基 （pA）。单因素方差分析与事后克鲁斯卡尔-瓦利斯检验。NS：P > 0.05。N：16 表示整倍体，18 表示 Ts65Dn，17 Ts65Dn：DSCAM+/+/?。 （I，J）sEPSC频率（I）和振幅（J）的定量。对于每只鼠标，记录 2-4 个 PyN。该数字背后的数据可以在 https://doi.org/10.5281/zenodo.7714234 中找到。ACC，前扣带皮层;PyN，锥体神经元;SAP，单动作电位;sEPSC，自发兴奋性突触后电流。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002078.s004
（提夫）
S5 图 DSCAM不调节新皮层中GABA能神经元的数量（与图1，3，4和5有关）。
(A， B）Ts65Dn小鼠中的DSCAM过表达不影响新皮层中GABA能神经元的数量。P28小鼠的脑切片用抗PV免疫染色。代表性图像如（A）所示，PV+神经元密度的量化如（B）所示。每个点代表来自 1 个成像场的值，即 252.4 μm（宽度）× 200 μm（长度）× 5 μm（厚度）。图像是从行政协调会的第二/第三层收集的。随机选择每只小鼠中的三个字段进行成像。共分析5只整倍体，6只Ts65Dn和5只Ts65Dn：DSCAM+/+/?小鼠。用于多组比较的单因素方差分析和用于成对比较的事后学生 t 检验。*： p < 0.05;NS：不显著（P > 0.05）。（中、丁）DSCAM的缺失不会影响ACC中GABA能神经元的数量，代表性图像和定量分别显示在（C）和（D）中。共分析4只DSCAM+/?和4只DSCAM?/?小鼠。学生 t 测试。NS：不显著（P > 0.05）。该图背后的数据可以在 https://doi.org/10.5281/zenodo.7714234 中找到。ACC，前扣带皮层;DSCAM，唐氏综合症细胞粘附分子;PV，小白蛋白;P28，产后第28天。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002078.s005
（提夫）
S6 图 ChC轴突末端和bouton的定量（与图3和5相关）。
(A）ChCs稀疏地用tdTomato（红色）标记，PyN的AISs通过抗磷酸化IκB（绿色）免疫染色标记。共聚焦图像堆栈（0 步的 3.100 μm z 步长）沿 z 轴最大投影。定量了120μm（长度）×80μm（宽度）的区域，细胞体位于顶部中间。定量了与AIS共定位的墨盒和弹药筒。墨盒编号定义为此区域内的墨盒数量。墨盒长度定义为从第一个到最后一个弹药筒的距离，该距离与该弹药筒中的AIS共定位。布顿尺寸定义为与 AIS 平行的布顿长度。布顿间距离定义为 2 个相邻波顿之间的距离。（乙、丙）磷酸化-IκB和AnkG在标记新皮质AIS方面表现出相同的保真度。（B）II/III层ACC中的AIS由磷酸化IκB（绿色）和AnkG（红色）共标记。显示的是共聚焦图像堆栈的最大投影（1 μm z 步 X 7 步）。（C）由磷酸化IκB和/或AnkG标记的AIS百分比的量化。共定量了308个AIS，其中303个由磷酸化IκB和AnkG共标记。该数字背后的数据可以在 https://doi.org/10.5281/zenodo.7714234 中找到。ACC，前扣带皮层;AIS，轴突初始节段;ChC，枝形吊灯单元;PyN，锥体神经元。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002078.s006
（提夫）
S7 图 ACC 第 II/III 层中相邻布顿之间的间隔距离和 PyN 的 AIS 长度的量化（与图 3 相关）。
(A， B）在整倍体、Ts65Dn和Ts65Dn：DSCAM+/+/?的ACC层II/III层中，相邻bouton之间的平均间隔距离和PyN的AIS长度均未受到影响。用于多组比较的单因素方差分析和用于成对比较的事后学生 t 检验。NS：不显著（P > 0.05）。图表中的每个数据点表示 8 只鼠标中 10–1 个 PyN 的平均值。（中、丁）相邻布顿之间的平均间隔距离与PyN的AIS长度在DSCAM之间没有显著差异2j/+（+/?） 和 DSCAM2J/2J（?/?）小鼠。学生 t 测试。图表中的每个数据点表示 4 只鼠标中 5-1 个 PyN 的平均值。该数字背后的数据可以在 https://doi.org/10.5281/zenodo.7714234 中找到。ACC，前扣带皮层;AIS，轴突初始节段;DSCAM，唐氏综合症细胞粘附分子;PyN，锥体神经元。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002078.s007
（提夫）
S8 图 本研究中使用的突变小鼠中的DSCAM表达水平（与图4和5相关）。
从DSCAM（+/+）的体感皮层收集的蛋白质样品的代表性蛋白质印迹和定量，DSCAM是DSCAM的+/+2j/+（+/?）和DSCAM2J/2J（?/?）小鼠。在DSCAM中未检测到DSCAM蛋白?/?通过蛋白质印迹（A）。DSCAM中DSCAM蛋白的水平+/?约为DSCAM（B）的81%。学生 t 测试。*： p < 0.05;： P < 0.0001。该数字背后的数据可以在 https://doi.org/10.5281/zenodo.7714234 中找到。DSCAM，唐氏综合症细胞粘附分子。+/+
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002078.s008
（提夫）
S9 图 ChC发育中突触前末端生长与突触发生之间的耦合（与图3和5相关）。
（A） ChC 墨盒长度和 bouton 数在整倍体和 Ts65Dn 遗传背景中密切相关。每个点表示 1 ChC。对于每只小鼠，分析4-6个ChC。共分析4只整倍体，5只Ts65Dn，4只Ts65Dn：DSCAM+/+/?小鼠。n = 21 表示整倍体（灰点），26 表示 Ts65Dn（青色点），21 Ts65Dn：DSCAM+/+/?（红点）。R2和 p 是针对线性回归计算的。灰线表示灰点的趋势线，而黑线表示蓝色和珊瑚点的趋势线。（B）ChC墨盒长度和bouton数量在DSCAM+/?和DSCAM?/?小鼠中密切相关。每个点表示 1 ChC。对于每只小鼠，分析4-6个ChC。共分析4只DSCAM+/?和4只DSCAM?/?小鼠。N：19 表示 DSCAM+/?（绿点），19 表示 DSCAM?/?（黄点）。（C） ChC 墨盒长度和 bouton 尺寸在整倍体和 Ts65Dn 背景中显示出弱但显着的相关性。每个点表示 1 ChC。 （D） 在 DSCAM 中，墨盒长度与口号之间的相关性受损?/?小 鼠。每个点表示 1 ChC。 R2在两个DSCAM中都很小+/?和DSCAM?/?小鼠，这表明线性回归只能解释一小部分样本。在DSCAM中校正微不足道?/?小鼠（p > 0.05）。（东、女）ChC 墨盒长度和间隔距离显示测试的任何 2 种基因型之间没有显着相关性。每个点表示 1 ChC。该数字背后的数据可以在 https://doi.org/10.5281/zenodo.7714234 中找到。ChC，枝形吊灯单元;DSCAM，唐氏综合症细胞粘附分子。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002078.s009
（提夫）
S10 图 DSCAM以剂量依赖性方式调节ChC盒长度和突触发生（与图3和图5相关）。
(A）蛋白质印迹显示新皮层中的DSCAM水平。灌注后立即采集小鼠新皮层。（乙-E）DSCAM表达水平与ChC墨盒长度（B）、口号（C）、梭粒尺寸（D）或弹奏间距（E）之间的相关性分析。在（B）中，鼠标的DSCAM水平与该鼠标S1图中指定的体积中总墨盒长度的平均值作图。平均墨盒长度计算为每只鼠标采样的 4-6 ChC 的平均值。共分析4只整倍体（灰点），5只Ts65Dn（青色点）和4只Ts65Dn：DSCAM+/+/?（红点）小鼠。R2和 p 是针对线性回归计算的。该数字背后的数据可以在 https://doi.org/10.5281/zenodo.7714234 中找到。ChC，枝形吊灯单元;DSCAM，唐氏综合症细胞粘附分子。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002078.s010
（提夫）
S11 图 ChC的兴奋性、烧成速率和sEPSC（与图2相关）。
定量整倍体（灰色）、Ts65Dn（浅蓝色）和 Ts65Dn：DSCAM+/+/?（粉红色）脑切片中 ACC 中 ChC 的电生理学参数。Kruskal-Wallis检验与事后Mann-Whitney检验进行两组比较，除了（G）。*： p < 0.05;NS：不显著（P > 0.05）。（A-F）膜电位 （mV） （A）、阈值 （mV） （B）、SAP 振幅 （mV） （C）、SAP 半宽 （ms） （D）、SAP 去极化速度 （dv/dt） （E） 和 SAP 复极化速度 （dv/dt） （F） 的量化。细胞数：13 个表示整倍体，9 个表示 Ts65Dn 和 8 个 Ts65Dn：DSCAM+/+/?。 （G） 显示诱发 AP （Hz） 的平均点火频率与以 ChC 为单位的电流 （pA） 之间关系的曲线。 双向方差分析，Tukey 的多重比较测试。整倍体与 Ts65Dn： p < 0.0001 （****）;Ts65Dn 与 Ts65Dn：DSCAM+/+/?： p > 0.05.（H） 来自 （G） 中 ChC 的流变碱 （pA）。细胞数：13 个表示整倍体，9 个表示 Ts65Dn 和 9 个 Ts65Dn：DSCAM+/+/?。 （I，J）sEPSC频率（I）和振幅（J）的定量。对于每只鼠标，记录 2-4 个 PyN。细胞数：12 表示整倍体，7 表示 Ts65Dn，7 表示 Ts65Dn：DSCAM+/+/?。该数字背后的数据可以在 https://doi.org/10.5281/zenodo.7714234 中找到。ACC，前扣带皮层;ChC，枝形吊灯单元;DSCAM，唐氏综合症细胞粘附分子;SAP，单动作电位;sEPSC，自发兴奋性突触后电流。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002078.s011
（提夫）
S1 原始映像。 原始、未裁剪和最小调整的图像支持图中报告的所有印迹和凝胶结果以及支持信息文件（与图1、S8和S10相关）。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002078.s012
（英文）
确认
我们感谢Seth Blackshaw博士和Thomas Kim博士为Lhx6-Cre小鼠。我们还要感谢Roman Giger博士、吴军博士、Andrew Nelson博士、蔡达文博士、Jonathan Flak博士和Martin Myers博士分享试剂或技术支持，感谢何淼、侯永杰、佩德罗·洛文斯坦、Ken Inoki、Yukiko Yamashita和Dawen Cai的有益讨论。
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