厦门论文发表-保护DNA切口免受连接，以促进减数分裂过程中的交叉形成
抽象
在大多数有性繁殖的生物体中，减数分裂期间染色体同系物之间的交叉对于产生单倍体配子至关重要。在出芽酵母减数分裂中形成的大多数交叉是由双霍利迪连接（dHJ）中间体的偏置分辨率引起的。该dHJ分离步骤涉及Rad2 / XPG家族核酸酶Exo1和Mlh1-Mlh3错配修复核酸内切酶的作用。在这里，我们在面包酵母中提供了遗传证据，证明Exo1通过保护DNA切口免受连接来促进减数分裂交叉。我们发现Exo1中与DNA相互作用的结构元件，例如在缺口/皮瓣识别过程中弯曲DNA所需的结构元件，对于其在交叉中的作用至关重要。与这些观察结果一致，Rad2/XPG家族成员Rad27的减数分裂表达部分挽救了exo1零突变体的交叉缺陷，Cdc9连接酶的减数分裂过表达将exo1 DNA结合突变体的交叉水平降低到接近exo1零的水平。 此外，我们的工作确定了Exo1在交叉干扰中的作用。总之，这些研究为Exo1保护的切口对于减数分裂交叉的形成及其分布至关重要提供了实验证据。
数字
Fig 7Fig 8Fig 1Fig 2Fig 3Fig 4Fig 5Fig 6Fig 7Fig 8Fig 1Fig 2Fig 3
引文： Gioia M， Payero L， Salim S， Fajish V. G， Farnaz AF， Pannafino G， et al. （2023） Exo1 保护 DNA 缺口免受连接，以促进减数分裂期间的交叉形成。公共科学图书馆生物学21（4）： e3002085. https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002085
学术编辑： 斯科特·基尼，纪念斯隆-凯特琳癌症中心，美国
收到： 25月 2022， 17;接受： 2023年20月2023日;发表： <>月 <>， <>
版权所有： ? 2023 焦亚等人。这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。
数据可用性： 所有相关数据均在论文及其支持信息文件中，但原始ChIP-Seq数据除外，这些数据存放在国家生物技术信息序列读取档案中，入藏号为PRJNA780068（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/?term=PRJNA780068）。
资助：M.G. G.P. V.R. J.J.C.，M.S.和EA得到了美国国立卫生研究院国家普通医学科学研究所的支持：R35GM134872。L.P.由斯隆奖学金和美国国立卫生研究院资助F31GM145163资助。S.M.是NSF（DBI1659534）支持的本科分子生物学和遗传学研究经验（MBG-REU）计划的学生，CMM得到了美国国立卫生研究院资助F32GM112435的支持。K.T.N.由科学和技术部（https://dst.gov.in/）的赠款资助（CRG/2018/000916）。S.S.由新德里科学与工业研究委员会（https://www.csir.res.in）的奖学金资助。VPA得到了大学教育资助委员会奖学金（http://www.ugc.ac.in）的支持，A.F.F得到了总理研究奖学金（https://www.pmrf.in/）的支持。A.S.得到了JSPS KAKENHI（19H00981）的资助。本作品的内容完全由作者负责，并不一定代表美国国立卫生研究院的官方观点。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。
竞争利益： 提交人声明不存在相互竞争的利益。
缩写： 钴， 巧合系数;dHJ， 双霍利迪路口;DSB， 双股断裂;MIP， Mlh1相互作用蛋白;彩信 甲基甲烷磺酸盐;SEI， 单端入侵
介绍
在大多数真核生物中，包括出芽酵母和人类，在第一次还原分裂（减数分裂I）期间同源染色体的准确分离需要在同系物之间形成交叉。交叉和交叉位点远端的姐妹染色体凝聚力产生的物理联系对于减数分裂I期间染色体对的适当分离至关重要[1-3]。无法建立这些物理连接可导致染色体分离和非整倍性不当，在人类中被认为是出生缺陷和流产的重要原因[2，4，5]。
在面包酵母交叉形成中，减数分裂前期是通过大约150至200个Spo11诱导的双链断裂（DSB;[6，7]）。这些断裂沿5′至3′方向切除，形成3′单链尾[8，9]。链交换蛋白覆盖单链尾巴，并促进它们侵入不间断同系物中的同源序列[2]。在主要的I类交叉途径中，D环中间体由ZMM蛋白（包括Zip2-Zip4-Spo16和Msh4-Msh5）稳定，形成单端侵袭中间体（SEI;图1A;[10-15]）。这种重组中间体与突触复合物同时形成，突触复合体被认为在同源搜索过程中可以去除染色体缠结和互锁[9，16，17]。SEI的DNA合成，然后是第二端捕获，导致双Holliday连接（dHJ）中间体的形成。dHJ被认为由Msh4-Msh5稳定，并以偏向解析，在酵母基因组中形成大约90个交叉（CO），这些交叉分布使它们均匀分布，每个同系物对至少接收1个交叉（图1A;[12，18-25]）。
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图1. 基于EXO1-1′嵌入式DNA复合物晶体结构的人EXO5的金属结合，活性位点相互作用和DNA接触位点。
（A）显示Msh4-Msh5，Mlh1-Mlh3和Exo1在减数分裂交叉分辨率中的作用的规范模型。有关详细信息，请参阅文本。（B）使用晶体结构PDB#1QEA对EXO3活性位点的特写[26]。我们突出显示以下残基（S指示的位置。酿酒Exo1）在本研究中发生突变（S1图）：I组;协调78个金属离子的酸性残基（D171，D173，D2）。第 II 组;作为α4-α5螺旋拱的一部分的残基参与磨损（H36，K85，K121）并与与活性位点相互作用的催化金属（R92）相邻的剪刀键。第三组;S41，F58，K61，它们是疏水楔形的一部分，在缺口部位诱导DNA急剧弯曲。第 IV 组;与双链DNA相互作用的残基（K185，G236）。第 V 组;与Mlh447相互作用的酵母Exo448区域中的残基（F1，F1）。exo1-F447A，F448A等位基因在文中缩写为exo1-MIP。映像是使用 BioRender.com 创建的。（C）702氨基酸S的概述。酿酒外1蛋白。N端催化结构域与N端人EXO1催化结构域对齐（氨基酸1-352;[26]），以及一个对与Mlh1相互作用至关重要的基序[27]，以及2个对与失配修复因子Msh2相互作用很重要的冗余基序[28]。灰色代表Exo1的非结构化C端尾部。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002085.g001
dHJs如何在I类途径中解析为交叉？DNA错配修复（MMR）核酸内切酶Mlh1-Mlh3和XPG/Rad2家族5′-3′核酸外切酶Exo1在减数分裂交叉分辨率下起作用，mlh3Δ和exo1Δ单突变体和双突变株在交叉时表现出相似的缺陷[25，29，30]。Mlh1-Mlh3的生化分析表明，其核酸内切酶活性是其在交叉形成中的作用所必需的，但不是对称切割霍利迪连接的结构特异性核酸酶[31-34]。Exo1在DNA代谢的许多步骤中起作用，包括DNA复制，端粒维持，同源重组和DNA错配修复。它显示出 5′ 至 3′ 核酸外切酶活性，导致形成 3′ 单链末端和 5′ 瓣核酸内切酶活性。Exo1包含一个N端Rad2/XPG核酸酶结构域，该结构域在Rad2/XPG家族成员中是保守的（图1B和1C;[35-37]）。在减数分裂中，exo1Δ菌株在Spo5诱导的DSB的3'至11'切除中表现出缺陷（从野生型的平均800 nt切除到exo270Δ的1 nt）和减数分裂交叉缺陷。尽管存在这些缺陷，exo1Δ突变体仍显示出野生型时机和减数分裂重组中间体的水平，包括dHJ[30]。奇怪的是，尽管1′至173′切除术的缺陷与exo5Δ相似，但破坏对核酸酶功能至关重要的金属结合位点的exo3突变（D1A）对减数分裂交叉的影响很小[30]。事实上，Exo1D173A/D173A小鼠具有生育能力，而Exo1不育[38]。最后，遗传分析表明，保守的Mlh1-I三磷酸P轮状蛋白序列（MIP盒;图1C）在Exo1 C端结构域中，减数分裂交叉中存在中间缺陷，表明Exo1通过与Mlh1的相互作用以及可能的其他因素促进减数分裂交叉[30，35，39，40]。总之，这些分析表明，Exo1与Mlh1-Mlh3的相互作用，而不是其核酸酶功能，对于交叉形成至关重要[30，41，42]。-/-
上述观察结果为Mlh1-Mlh3和Exo1如何以偏向的方式解析dHJs以形成交叉提供了提示。从孢子克隆的全基因组测序中获得额外的信息，这些孢子克隆是由含有高水平序列分歧的单倍体酵母菌株交配产生的孢子状体酵母获得的。通过分析孢子克隆中异质双链DNA束的序列，Marsolier-Kergoat及其同事[43]和Martini及其同事[44]推断出减数分裂交叉分辨率偏向DNA合成束的模型。在该模型中，维持在合成道末端的切口可以通过招募在解析机制中起作用的切口结合蛋白来引导dHJ的偏置和不对称切割。对小鼠重组事件的分析也导致了一个模型，即切口dHJ是减数分裂交叉的前体[45]。这些研究和最近的生化研究提出了Mlh1-Mlh3与Exo1、Msh4-Msh5和DNA聚合酶合成能力因子PCNA相互作用，以偏向方式解析dHJs以形成交叉[46-48]。其中一些建议的一个组成部分是dHJ中间体中存在的DNA信号对于这种分辨率至关重要。在这里，我们提供了遗传证据，证明Exo1在交叉产物形成过程中保护DNA不被连接在重组中间体中。我们还表明，它的作用是确保减数分裂交叉在减数分裂I分裂中具有广泛的间隔以实现适当的染色体分离。这些观察结果为Exo1在交叉放置中的动态和独特作用提供了证据，并为维持切口重组中间体以解析dHJs进入交叉提供了证据。
结果
鉴定Exo1中的残基对促进减数分裂交叉很重要
我们利用了先前对人和酵母EXO1家族蛋白（Exo1，Fen1 / Rad27，XPG / Rad2;S1 表）检查 Exo1 的域在减数分裂交叉中的作用。我们主要关注具有 1′ 凹陷 DNA 的人 EXO5 （PDB #3QE9） 的晶体结构，该晶体结构在 Exo2-DNA 结构的催化位点中鉴定了 1 种金属，残基 D171 协助 D173 配位 1 种金属，残基 D78 协调另一种金属，以水解 DNA 的磷酸二酯骨架（I 组;图1B、S1和S2图;[26，49-52]）。晶体结构还鉴定了Exo1中的残基，这些残基与DNA相互作用并将DNA定位在要切割的方向上[26]。例如，残基H36、K85、R92和K121（II组）有助于双链DNA碱基从其补体中磨损，并驻留在形成Exo4活性位点一部分的α5-α1螺旋拱微域内（图1B和S1图）。此外，该结构表明Exo1通过几个结构域与DNA进行关键接触（图1B）。Rad2/XPG成员的一个关键组成部分是疏水楔（图1B，III组），这是一个结构保守的结构域，可在双链-单链DNA连接处诱导急剧弯曲，并使酶家族对间隙/切口DNA底物具有特异性[26，53]。楔形基序内的几个残基与非底物链形成疏水相互作用，以及2个赖氨酸残基，它们似乎通过氢键协调非底物链的这一部分（图1B和S1图）。此外，几个保守的残基（K185，G236，IV组）稳定了与Exo1和前切口双链DNA的相互作用（图1和S1图）。G236是一种保守残基，存在于螺旋-两个转螺旋基序中，其氢键与双链DNA键远离活性位点，并且当蛋白质沿DNA骨架移动时，被认为会促进核酸外切酶的合成能力[26，54]。K185是小发夹环的一部分，该发夹环直接接触底物链的DNA骨架，远离活性位点，被认为对识别双链DNA至关重要[26，55]。
除了上述结构工作外，我们的工作还以人类和酵母EXO1家族蛋白的突变研究为指导，这些研究显示I，II和III组突变蛋白在外切和核酸内切酶活性方面表现出强烈且通常严重的缺陷（S1表）。例如，I组或II组残基（H36A、K85A、R92A、D173A）的突变导致Exo1核酸酶活性存在强烈缺陷[26]。面包酵母中显示IV组突变exo1-K185A对DNA损伤剂的敏感性升高，突变蛋白显示核酸外切酶活性降低[55]。第二个IV组突变exo1-G236D在面包酵母中赋予Exo1依赖性DNA错配修复的缺陷[39]。
Exo1中金属配位和活性位点残基的突变不会破坏减数分裂交叉
我们使用孢子自主荧光测定法测试了I至IV组残基中突变对位于VIII染色体上的CEN8-THR1间隔减数分裂交叉的影响（图3A;野生型约39%单交叉，exo20Δ约1%;[56]）和通过对XV号染色体进行4个连续间隔的四分体分析（图4A;野生型104.9 cM图距，exo54Δ为7.1 cM;[57]）. exo1Δ、mlh3Δ 和 msh5Δ 突变在这 2 个染色体区域交叉时赋予了与先前研究相似的缺陷（图 4B;[25，31，57，58]）。此外，我们看到exo1Δ mus81Δ的交叉大幅减少（约12倍），与mlh3Δ mus81Δ相似[57]，证实了exo1Δ和mlh3Δ之间的上位相互作用。在exo46Δ mus2Δ中观察到的相对较高的孢子活力（1%，S81图）与其他突变体（mlh1Δ mms4Δ，mlh3Δ mms4Δ; [57，59]）其中I型和II型交叉途径都被破坏。尽管这些突变体在杂交方面存在重大缺陷，但这些突变体的高孢子活力的详细解释可以在Sonntag Brown及其同事中找到[59]。
我们进行了I组突变（D78A，D171A和D173A;图1B）单独或组合破坏Exo2活性位点中1种金属的配位。我们的工作动机是发现exo1-D173A在1个金属结合位点中含有突变，在闭合的环状2.7 kb DNA底物上显示出弱的DNA切性，这与Mlh1-Mlh3的切性相似。野生型Exo1未检测到这种活性（图2A和2B;pUC10在18nM exo20-D1A时约173%的切口，而20nM Mlh20-Mlh1时约3%的切口[34]）。然而，Exo1的一个或两个金属结合位点的破坏对CEN8-THR1间隔和XV染色体4个间隔的减数分裂交叉影响很小（如果有的话），提供了更确凿的证据，证明Exo1核酸酶活性不会破坏减数分裂交叉（图3B和4B;S2 和 S3 表）。然后，我们在Exo1中突变了II组残基，这些残基与DNA相互作用并将DNA定位在要切割的方向上[26]。如图3B和4B所示（另见S2和S3表），exo1-H36E，exo1-K85A / E，exo1-R92A和exo1-K121A / E突变（II组）与野生型相比对减数分裂交叉的影响非常小，这表明活性位点内用于催化的剪裂键的协调对于交叉也不重要。与这些观察结果一致，携带K1A、R85A或K92A突变的人EXO185导致核酸酶活性急剧丧失（[26，55];S1 表）进一步支持了Exo1催化活性对减数分裂交叉的可有可无性。
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图2. 外泄1-D173A核酸酶活性分析。
（A）Exo1（WT）和exo1-D173A（DA;材料和方法）在 2.7 kb 超螺旋 pUC18 质粒上。Exo1 分别存在于泳道 1 和 10 中的 2 nM 和 3 nM，exo1-D173A 在泳道 20 中以 4 nM 处存在。Exo1不太可能切开闭合的圆形底物，然后通过其核酸外切酶活性将其降解，因为我们没有看到闭合环状DNA的可测量损失（将泳道2和3与泳道1进行比较）。（B） 滴定超螺旋 （cc） pUC1 质粒上的 exo173-D1A、exo236-G1D 和 exo173-D236A G18D 核酸内切酶活性。误差线表示 4 次重复的 +/- 标准偏差。（C）Exo1（WT）和exo1-D173A（DA;材料和方法）在具有2个预先存在的刻痕的7.18 kb pUC4质粒上。DNA产物通过天然琼脂糖凝胶分离。Exo1 在泳道 6-12 中以 24 nM、2 nM 和 4 nM 存在，exo1-D173A 在泳道 20-40 中以 5 nM 和 6 nM 存在。（D）exo1-D173A和exo1-D173A G236D与5′瓣和同型双链寡核苷酸DNA底物的结合。DNA底物和过滤器结合条件在材料和方法中描述。滴定在含有 60 nM 15′ 瓣或同源双链 DNA 底物、5 mM NaCl、35 mM Tris 20.7、5.0 mg/ml BSA、04.0 mM EDTA 和 01.0 mM DTT 以及指定浓度的 exo1 的 1 μl 反应中进行。误差线，标准偏差为3次重复。基础数据可以在 S1 数据中找到。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002085.g002
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图3. 使用孢子自主荧光测定法在Chr.XV的1 cM CEN20至THR8区间测量指示的exo1菌株的交叉。
（A）孢子自主荧光测定法用于测量VIII CEN8-THR1染色体间期中的单个减数分裂交叉事件（四型）[56]。（B）所示菌株中的单个减数分裂交叉事件。根据图1B中概述的指定功能的破坏将突变分为几类。EXO1和exo1Δ水平分别用绿色和红色虚线表示，*在统计学上可与EXO1和exo1Δ区分开来;-，与EXO1可区分，但与exo1Δ无法区分。 面板 B 的基础数据可以在 S2A 表和 S2 数据中找到。（C）通过蛋白质印迹检测Exo1-13MYC（WT）和来自中对数生长酵母培养物的指示突变变体。G6PDH 作为加载控件提供。标明分子量标准品（M）的大小。有关详细信息，请参阅材料和方法。面板 C 的基础数据可以在 S3 数据中找到。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002085.g003
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图4. exo1突变株中的减数分裂交叉表型。
（A）EAY3/1108菌株背景中跨越CENXV-HIS1112间期的XV号染色体上的遗传标记[57]。实心圆表示着丝粒。以 KB 和 cM 为单位的标记之间的距离显示为野生型。带框的标记表示在XV号染色体处插入。（B）野生型（WT）和exo1菌株的累积遗传距离（cM）。野生型XV染色体URA3-HIS3区间的遗传图谱距离和指示的突变品系。每个条形被划分为对应于URA3-HIS3中遗传间隔的扇区，从四分体（T）测量。显示了从四分体分析中获得的孢子活力数据，完整的数据集如图2所示。星号表示使用斯塔尔实验室在线工具计算的标准误差测量的指示基因型中可与野生型区分开来的遗传区间（0-4）的数量。使用斯塔尔在线工具计算每个间隔的标准误差。误差线表示所有 4 个区间 （https://elizabethhousworth.com/StahlLabOnlineTools/; S3 表）。面板 B 的基础数据可以在 S3 表中找到。（C）EAY1108/EAY1102菌株背景中XV号染色体上相邻遗传区间对的干扰分析。通过测量存在和不存在相邻交叉时的cM距离来分析XV号染色体上的交叉干扰[60，61]。马尔科瓦干扰表示为存在交叉的cM与不存在交叉的cM的比率，显示间隔对I-III。破折号表示没有可检测到的正干扰。使用G检验评估四分体分布差异的显着性。具有统计学意义的p值（p < 0.05）表明遗传间隔中存在干扰。面板C的基础数据可以在S4A和S4B表中找到。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002085.g004
Exo1的DNA结合结构域中的突变赋予减数分裂交叉缺陷
与DNA，exo1-K1E和exo185-G1D接触的Exo236残基突变分别导致URA71-HIS3和CEN29-THR1区间交叉形成（1.236 cM，exo64-G9D中24.5%四型和exo1-K185E中的3.3 cM，exo8-K1E中的3.4%四型）显着降低（图2B和3B;S1 和 S236 表）。有趣的是，exo2-G1D蛋白显示出非常弱的核酸内切酶活性，与DNA结合缺陷一致（图236B）。为了验证这一假设，我们测量了exo1-D173A突变与5′瓣和同源双链寡核苷酸DNA底物（材料和方法）背景下exo1-G173D突变的结合。我们在exo1-D2A催化突变背景下进行了这些实验，因为担心野生型Exo1会降解寡核苷酸底物（图173C）。先前对人exo5-D1A的研究表明，它与62'瓣底物结合，其结合亲和力与人EXO1相似[173]。酵母exo5-D1A对173′瓣底物表现出特异性，但exo236-D5A，G2D与1′瓣和同型双链底物的结合非常弱，表明存在DNA结合缺陷（图41D）。疏水楔形突变exo64-S4E（28.4 cM，1.58%四型）和exo74-F6E（27.8 cM，1.185%四型）也赋予交叉缺陷，双突变组合赋予更严重的表型（exo236-K24E，G2D-1.41%四型;exo58-S24E，F6E-<>.<>%四型）。
我们制作了结合I组至V组突变的等位基因（图3B;S2 表）。这些突变赋予了多种表型。例如，exo1-R92A，K121A，K185A（24.3%四型）和exo1-D173A，K185E，G236D（22.4%四型）三重突变赋予的表型与exo1Δ（20.0%四型）比单组突变更相似。相反，当存在D1A组I突变时，我们观察到exo236-G173D突变体IV组的交叉频率增加（exo1-G236D / exo1Δ-29.1%四型与exo1-D173A，G236D / exo1Δ-32.7%四型;exo1-G236D/exo1-G236D-29.9%四型与exo1-D173A，G236D/exo1-D173A，G236D-35.7%四型）。最后，DNA结合和Mlh1相互作用中的单突变和双突变（exo1-G236D，exo1-K185E，exo1-MIP，exo1-G236D，MIP，exo1-K185E，MIP）赋予非常相似的四型值（图3和S2表），与Exo1 DNA结合和Mlh1相互作用参与同一功能步骤一致。 需要更多的研究来更好地了解这些多重突变如何影响Exo1功能（见讨论）。
在指数生长的营养培养物中分析了Exo1的蛋白质稳定性，重点是赋予交叉缺陷的III组和IV组突变（exo1-S41E，-F58E，-K185E，-G236D）。我们用 13 个重复的 MYC 表位 （MYC） 标记突变等位基因13 标签;[63，64]）并发现含有EXO1-13MYC等位基因的菌株在孢子自主交叉测定（S1表）中补充了Exo2交叉功能。如图3C所示，携带III组和IV组构建体的菌株显示出与野生型相似的全长Exo1蛋白，这表明这些突变不会破坏Exo1蛋白的稳定性。
exo1菌株表现出可分离的减数分裂交叉和DNA修复缺陷
诱导进入减数分裂的exo1null纯合菌株显示出孢子活力模式（73%孢子活力;4，2，0个活四联体>3，1）与减数分裂I非分离表型一致（图4B和S2图;[41，65]）。奇怪的是，这种将减数分裂交叉缺陷与减数分裂I非分离联系起来的模式在含有exo1点突变的菌株中没有看到。此外，相对于exo1零表现出强减数分裂交叉缺陷的exo1突变体（exo185-K1E，exo185-K236E，G1D，exo1-MIP显示出71%至89%的孢子活力。对这些差异的可能解释是，Exo1在减数分裂中具有影响孢子活力的多种作用，其中一些与其亲交叉功能无关。为了支持这一假设，上面分析的一些exo1突变赋予了DNA修复缺陷，这是通过对甲基甲烷磺酸盐（MMS;S3 图）但赋予功能减数分裂交叉。例如，exo1-D78A，exo1-D171A和exo1-D173A催化突变体对MMS敏感，但在减数分裂杂交方面几乎是野生型。 对于活性位点突变exo1-K85E和exo1-K121A，DNA结合突变体exo1-K185E和MLH相互作用突变体exo1-MIP也观察到DNA修复和交叉表型之间的差异。这些观察结果提供了证据，证明Exo1具有多种细胞功能，其中一部分在减数分裂交叉中起作用（参见下面的干扰分析）。
RAD27在减数分裂中的表达部分补充了exo1null交叉缺陷
基于我们对Exo1的结构功能分析，我们假设一种模仿Exo1的DNA结合特异性的蛋白质可能补充其在减数分裂交叉中的功能。Rad2家族核酸酶由4个进化保守的成员组成：酵母/人类中的RAD2/XPG、EXO1/EXO1、RAD27/FEN1和YEN1/GEN1[66-68]。 在酵母中，RAD27与EXO1具有相似的最高序列，先前的研究表明EXO1可以补充一些RAD27功能[69-71]。S.酿酒Rad27蛋白（长度为382个氨基酸）含有与EXO339催化结构域同源的1个氨基酸N端催化结构域（图1C），其次是包含PCNA相互作用基序和非结构化区域的C端结构域[66]。Rad27是一种5′瓣核酸内切酶，作用于冈崎片段成熟，通过在蛋白质结合时诱导DNA底物急剧弯曲，以结构类似的方式与DNA结合[26，72，73]。
我们测试了Rad27是否可以补充Exo1减数分裂功能，注意到rad27Δ / rad27Δ二倍体菌株显示出在孢子自主荧光测定中测量的野生型减数分裂交叉水平（S2表）。当RAD1通过其天然启动子表达时，我们没有观察到exo27Δ的互补。然而，当RAD27通过EXO1启动子（pEXO1-RAD27）在两条VIII染色体上表达时，观察到交叉显着增加（从21.5%到29.9%四型;图5A;S2B 表）和十五（从53.8厘米到72.6厘米;图5C;S3 表）。这种互补可能是由于Rad27通过EXO1启动子的高水平减数分裂表达（S4图;[74]）。 此外，核酸酶死pEXO1-rad27-D179A等位基因的表达[75，76]具有相似水平的交叉互补（图5A;S2B 表）。这一观察结果鼓励我们进一步验证我们的假设，根据先前对Rad5，FEN27的人类同系物的生化和结构表征，进行27个rad1突变（S1表;[77，78]）。如图5A所示，rad27-R101A、rad27-R105A和rad27-K130A在协调断裂键进行催化的结构域中发生突变（FEN1中同源位置的突变破坏皮瓣裂解; S1表），补充了exo1Δ的交叉缺陷，与exo1组II突变所表现出的表型一致。有趣的是，rad27-A45E和rad27-H191E突变（分别类似于III组和IV组）并没有补充exo1Δ交叉缺陷，正如预测的那样破坏关键蛋白质 - DNA相互作用的突变。
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图5. 由EXO27启动子表达的RAD1可以恢复exo1Δ菌株的交叉功能。
（A）pEXO1-EXO1，ARS-CEN （pEAA715），pEXO1-RAD27，ARS-CEN （pEAA720），指示的突变rad27衍生物（pEAA724，pEAA727-731）和空的ARS-CEN载体（pRS416），转化为exo1Δ菌株，并检查在CEN8-THR1位点的交叉。 将rad27突变分组（I，金属配位;二、活性位点;三、疏水楔形;IV，双链DNA），就像Exo1（图1B）一样。使用双尾费雪精确检验确定与含有空载体的exo0Δ菌株相比的显著性（**p < 01.1）。 （B）mlh3Δ和指示的exo1菌株用pEXO1-RAD27（pEAA720），pEXO1-rad27-D179A（pEAA724）和空载体（pRS416）转化，并检查在CEN8-THR1位点的交叉。使用双尾费舍尔精确检验确定含有空载体的指示突变菌株与 RAD0 质粒之间的显著性 （*p < 05.27）。 （C） 将 pEXO1-RAD27 质粒 pEAI482 转化为 exo1Δ 菌株（以 pEXO1、ARS CEN-pEAI483 和空 ARS-CEN 载体 pLZ259 作为对照）以测量 URA3-HIS3 中的交叉 EAY1108/1112 背景中的间隔。星号表示可与包含空载体的exo1Δ区分开来的遗传间隔数，使用通过斯塔尔实验室在线工具（https://elizabethhousworth.com/StahlLabOnlineTools/ 计算的标准误差进行测量; S3 表）。面板A和B的基础数据可以在S2B表和S2数据中找到。面板 C 的基础数据可以在 S3 表中找到。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002085.g005
我们还测试了来自EXO27启动子的RAD1表达是否可以改善携带DNA结合域（exo1-K1E）内或外部突变的exo185菌株的减数分裂交叉功能。如图1B所示，在含有pEXO5-RAD1的细胞中，exo185-K1E中的减数分裂交叉增加，但exo1-MIP中没有增加。这些观察结果与Rad27能够替代Exo27 DNA结合功能一致，因为在DNA结合突变体（exo1-K1E）中观察到pEXO27-RAD1的改进互补性，但在预测具有DNA结合功能的突变体中没有，但在与其他交叉因子（exo185-MIP）相互作用方面存在缺陷。最后，我们没有观察到pEXO1-RAD1在缺乏功能性Mlh27-Mlh1（mlh3Δ）的菌株中减数分裂交叉的互补性，表明Rad3互补是Exo27功能特有的，并且没有绕过Mlh1-Mlh1-Exo3依赖性dHJ分辨率步骤。
干扰分析表明Exo1在交叉分辨率之前起作用
在EXO27启动子（pEXO1-RAD1质粒）下RAD27的表达可以部分补充exo1Δ菌株中的CO缺陷;然而，这种表达并没有改善exo1Δ菌株中减数分裂孢子活力或MMS抗性，这表明Exo1特异性功能可能对赋予高孢子活力至关重要（图5C和S2图）。我们进行了交叉干扰分析，以确定exo1Δ菌株除了DSB切除和CO消退之外是否还显示出缺陷。使用马尔科娃和重合系数（COC）方法测量对XV号染色体的交叉干扰（S4表;[60，61，79]）。Malkova方法计算在相邻间隔中存在和不存在交叉的情况下遗传间隔的映射距离，而COC测量在没有干扰的情况下与预期速率相比的双交叉速率。如S4A表所示，COC比率显示出类似的趋势，因此，我们专注于马尔科娃分析。
马尔科瓦方法的测量值以比率表示，其中0表示完全干扰，1表示无干扰。测试了三对间隔（URA3-LEU2-LYS2、LEU2-LYS2-ADE2和LYS2-ADE2-HIS3）的干扰。在测试的所有3个间隔对中，exo1Δ与野生型相比显示出干扰损失。最引人注目的是，在野生型菌株中表现出强烈干扰的2个间隔对（URA0-LEU48-LYS3的Malkova比值为2.2，在LEU0-LYS43-ADE2时为2.2）在exo1Δ中显示出干扰损失（分别为1.07和0.72;图4C）。在exo1Δ中观察到的干扰缺陷（所有3个区间对都显示缺乏干扰）比在mlh3Δ应变中观察到的干扰缺陷更强（2个间隔显示缺乏干扰;另见[80]），表明Exo1在促进干扰方面的作用独立于其在交叉分辨率中与Mlh1-Mlh3的关联。此外，exo1Δ表现出的干扰缺陷与msh4Δ和msh5Δ的缺陷更相似，其中所有间隔都显示出缺乏干扰（[65，81–83];图4C）。有趣的是，在含有pEXO3-RAD1的exo1Δ菌株的所有27个区间对中都观察到缺乏干扰（区间对I，II，III的马尔科娃比值分别为1.18，0.94和0.89;S4表），支持减数分裂中RAD27表达可以部分补充Exo依赖叉功能的观点，但不能补充减数分裂I中准确染色体分离所需的均匀间隔和专叉所需的Exo1功能并产生活孢子。这种Exo1功能可能存在于其C端尾部，在Rad27中缺失，其中包含Mlh1和Msh2相互作用基序（图1C）。总之，这些数据表明Exo1在建立交叉干扰方面具有以前未表征的作用。
为了测试Exo1的早期切除作用[30]是否可以解释Exo1在交叉干扰中的作用，分析了exo1-D171A，D173A和exo1-D78A，D173A催化突变体的干扰缺陷（S4A和S4B表）。 这些突变体表现出与野生型相似或更强的干扰（见讨论）。事实上，在exo1Δ中观察到的干扰缺陷在任何测试的exo1等位基因中都没有被概括。这些结果表明，Exo1通过一种不同于其亲交叉作用的机制促进干扰。
Msh5 DNA相互作用和病灶不依赖于Exo1
交叉干扰涉及 ZMM 蛋白的募集，这些 ZMM 蛋白稳定并鉴定一组 dHJ 以实现 I 类交叉分辨率。这类因子包括Msh4-Msh5，它在链入侵后稳定SEIs[12]。msh5Δ和exo1Δ的干扰和交叉形成均显著降低，从而有可能在exo5Δ背景中影响Msh1募集。缺乏Exo1介导的切除术不太可能损害Msh5的定位，因为先前的研究表明，在exo1Δ中，尽管交叉减少约50%，但关节分子形成是正常的[29，30，84]。然而，Exo1仍有可能通过与减数分裂DNA中间体和/或Msh5本身的相互作用更直接地促进Msh5的募集。为了解决这个问题，我们使用ChIP-qPCR，ChIP-Seq和细胞学方法的组合分析了exo5Δ突变体中的Msh1结合。我们在代表性的DSB热点（BUD5，ECM1，CCT23），染色体轴（轴I，轴II和轴III），着丝粒（CENIII，CENVIII）和DSB冷点（YCRO3W;[6]）. 相对于野生型在 93 小时和 85 小时，在一些代表性的 DSB 热点（ECM5、CCT1）的 exo3Δ 中观察到增强的 Msh6 结合。在exo4Δ中轴和着丝粒处的Msh5结合与野生型相似，从5到1小时（图3A）。
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图6. Msh5定位到野生型和exo1Δ菌株中的染色体。
（A） 在野生型和外星型 5Δ 中，DSB 热点（BUD23、ECM3 和 CCT6）、着丝粒区域（CEN III 和 CEN VIII）和轴区域（轴 I、轴 II 和轴 III）相对于 DSB 冷点 （YCR093W） 的 Msh1 结合的 ChIP-qPCR 分析 在将细胞转移到孢子培养基后3，4和5小时。使用输入对样本进行归一化，并在与冷点值除以后绘制。误差条表示 2 个独立生物学重复的标准偏差。参见Nandanan及其同事[85]的区域分配。面板 A 的基础数据可以在 S4 数据中找到。（B）外显5Δ突变体中Msh1结合的ChIP-Seq分析。代表性图像显示诱导减数分裂后 III 染色体 exo5Δ（1 个重复）中标准化的 Msh2 ChIP-seq 读数 （NCIS） 在 t = 3 小时、4 小时和 5 小时。放大图像显示着丝粒区域、轴区域、1 个 DSB 热点 （BUD23） 和 1 个 DSB 冷点 （YCR093W）。Red1和Spo11数据来自Sun及其同事[89]以及Pan及其同事[7]。黑色圆圈表示着丝粒。B组的基础数据可以在国家生物技术信息中心序列读取档案中找到，入藏号PRJNA780068。（C）在孢子培养基中孵育5小时时野生型和exo1Δ细胞染色体扩散的Msh5染色的代表性图像。Msh5，绿色;DAPI，蓝色。条形表示 2 μm。（d） 顶部;在指定时间，Msh5病灶的数量计入Msh5焦点正价差。在每个时间点，计数30个细胞核。显示了 3 个独立时间过程的平均 +/- 标准差。（d） 底部;量化了Msh5强度与DAPI强度的相对比值。在每个时间点，分析30个Msh5阳性细胞核。显示了 3 个独立时间过程的平均值+/- 标准差。面板 D 的基础数据可以在 S5 数据中找到。DSB，双链断裂。
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Msh5 ChIP-Seq 在 2、1 和 3 小时 exo4Δ 突变体的 5 个独立生物学重复中以减数分裂时间过程进行（材料和方法）。使用输入对 Msh5 ChIP-seq 数据进行归一化。来自5个重复的Msh2结合数据高度相关（r > 0.88）（S5图）。在进入减数分裂（S3文件）后448小时，在exo5Δ突变体中总共观察到1，5个Msh1峰（参见材料和方法）。这些峰中约有70%（2，380个峰）与野生型Msh5峰（3，397个峰，[85]）重叠。在exo5Δ中Msh1结合在III号染色体上的代表性图谱显示，Msh5与在野生型菌株中观察到的DSB热点，轴和着丝粒结合（图6B）。这些结果表明，exo5Δ和野生型中的Msh1结合位点相似。
在所有时间点（5 h、5 h、1 h;图 3B 和 S4A 图）。为了进一步理解这一观察结果，我们比较了减数分裂DSB冷点的野生型和exo5Δ Msh6 ChIP-seq信号的强度。如S6A图所示，所有重叠峰位置的平均Msh1读数计数范围从最小5到最大6。对于YCR5W冷点[48]，野生型和exo74Δ的平均读取计数（+/- 093 bp）均为86（S100B图）。然后，我们扩展了该分析以分析一组0个减数分裂DSB冷点（S1C图;[6，25]）。野生型和exo6Δ的平均Msh87读取计数（+/- 88 bp）在野生型和exo5Δ中都非常低（最小为100，最大为1;S0C 图）。虽然非常低，但野生型3个冷点的平均读取计数在所有时间点都高于exo6Δ（p < 25.1，Wilcoxon秩和检验）。此外，与野生型相比，在 exo0Δ 背景中，Msh001 读取计数似乎变化更大，这使得评估在 exo5Δ 中观察到的增强型 Msh1 读取计数的意义更加困难（S5C 图）。因此，虽然 ChIP-seq 数据显示 Msh1 在 exo6Δ 菌株中募集，但在表明 exo5Δ 中的 Msh1 募集相对于野生型增强方面，它们的结论性较差。
Msh5 ChIP研究鼓励我们对减数分裂中形成的Msh5病灶进行分析（图6C）。在5小时（1）、3小时（34）和4小时（45）时exo5Δ中每个细胞的平均Msh48病灶数与同一时间点（分别为5、33和42）野生型Msh48病灶的数量相当（图6D）。然而，病灶强度的测量表明，Msh5病灶在exo1Δ中显得更亮（图6D）。这些观察结果支持 ChIP-qPCR 数据显示 exo5Δ 突变体中某些 DSB 热点位点的 Msh1 结合增强。ChIP 和 Msh5 定位研究表明，Msh4-Msh5 定位既不依赖于 Exo1 的远距离切除活性也不依赖于与 Exo1 的相互作用。该信息与exo1核酸酶缺陷突变体的干扰分析相结合，支持Exo1在建立干扰中的直接作用。总体而言，这些结果表明Msh5结合在exo1Δ中没有缺陷，并且Exo1负调节Msh4-Msh5的结合。
Cdc9连接酶过表达破坏exo1 DNA结合结构域突变体中的减数分裂交叉
如果Exo1在减数分裂重组中的作用涉及切口结合/保护，我们推断CDC9（参与DNA复制的出芽酵母DNA连接酶）的减数分裂过表达可能导致DNA合成相关切口的过早连接，这对于维持偏倚分辨率至关重要。这一想法受到雷耶斯及其同事[90]的鼓励，他们表明出芽酵母连接酶Cdc9的过表达通过作为关键修复信号的复制相关切口的过早连接来破坏DNA错配修复。此外，我们假设一些保持接近野生型杂交水平的exo1 DNA结合突变体可能特别容易受到Cdc9过表达的影响。
在减数分裂期间，CDC9相对于HOP1的表达似乎较低，其在减数分裂前期的表达显着增加，并通过dHJ分辨率保持高水平（减数分裂中约6小时;S4 图）。因此，我们在HOP9启动子的控制下表达CDC1。如图7A所示，在含有完整DNA结合结构域的野生型或exo1突变体（EXO1，exo1-MIP，exo1-D173A，I组）中，我们没有看到杂交的中断，也没有发现在DNA弯曲后预测有缺陷的突变体（exo1-K85E，II组）的统计学上不显着的减少[26]。 然而，我们看到2个exo1 DNA结合突变次型的交叉有适度到严重的损失。如图7A所示，pHOP1-CDC9将exo1-K185A（第四组）中的单交叉从35.3%降低到31.3%，将exo1-K61E（第三组）的单交叉从35.1%减少到25.2%。此外，当CDC1在赋予致死性的连接酶活性位点中含有突变（K61A;图9B;[9-419]）。然而，当CDC7含有F90A，F93A突变时，仍然观察到这种丢失，这些突变在体外破坏了Cdc9和PCNA之间的相互作用，但不具有致死性[44]。这些观察结果与Cdc45连接酶活性对交叉缺失很重要一致，但与Cdc9-PCNA相互作用一致，后者被认为在DNA复制过程中协调冈崎片段连接[94]。重要的是，结合RAD9互补实验，它们为Exo9在交叉形成中的划痕保护作用提供了证据。
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图 7. 减数分裂中的CDC9过表达破坏exo1 DNA结合突变体的交叉功能。
（A）具有指示的exo1基因型（S5表）的二倍体菌株用不含插入片段（空2μ，pRS3）或从HOP2启动子（pHOP426-CDC9，1μ，pEAM1）表达的CDC9的2μ URA329载体转化，然后在CEN8-THR1间期评估减数分裂交叉。使用双尾费舍尔精确检验显示每个空向量-pHOP1-CDC9 对之间的显著性，** 表示 p < 0.01。（B）含有exo1-K61E等位基因的二倍体菌株与不含插入片段（空2μ），CDC3，cdc2-F9A，F9A或cdc44-K45A的9μ URA419载体从HOP1启动子表达，然后在CEN8-THR1间隔内评估减数分裂交叉。 使用双尾费舍尔精确检验显示每个空的 2μ 向量-pHOP1-CDC9 对之间的显著性，** 表示 p < 0.01。面板 A 的基础数据可以在 S2C 表和 S2 数据中找到，面板 B 的基础数据可以在 S2D 表和 S2 数据中找到。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002085.g007
讨论
在这项研究中，我们确定了Exo1在减数分裂交叉中的作用，这取决于它与切口/拍打DNA结构结合的能力。这一结论得到了以下发现的支持：结构相似的Rad27核酸酶的减数分裂表达可以部分补偿在没有Exo1的情况下交叉的损失，并且Cdc9连接酶的减数分裂过表达在exo1 DNA结合结构域突变体中赋予了显着的交叉缺陷。基于这些观察结果，我们提出Exo1通过结合类似于滞后链DNA合成过程中产生的刻痕/瓣的刻痕/瓣来作用于减数分裂交叉形成（图8）。与Rad27和Exo1在复制过程中的功能相反，Exo5在促进连接所得切口的机制中切割95′瓣[1]，Exo1减数分裂交叉功能独立于核酸酶活性发生。这种核酸酶非依赖性活性可能有助于保护重组中间体中的切口或瓣膜免于过早连接，确保它们被纳入消退机制。此外，缺口/襟翼结合的Exo1可以作用于将Mlh3-Mlh34招募到dHJ。为了支持这一观点，Manhart及其同事[1]的工作表明，Mlh3-Mlh<>聚合物在切口链上的存在可以指导核酸内切酶切割相反的链，为如何发生偏置分辨率提供了一种可能的机制。
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图8. dHJ偏置分辨率模型。
（一）规范模型。在主要的干扰依赖叉途径中，D环中间体由包括Msh4-Msh5在内的ZMM蛋白稳定以形成SEI中间体。SEI的DNA合成，然后是第二端捕获，导致dHJ中间体的形成，该中间体由Msh4-Msh5稳定。 2个结的偏置分辨率会导致交叉形成。在这个模型中，Exo1保护缺口/皮瓣结构招募Mlh1-Mlh3来切口与Exo1保护的缺口相反的DNA链。（B）通过有限的分支迁移解决dHJ（参考文献[43];上图;参考文献[96]，下图）。在这些模型中，dHJ 的 1 个或两个结在解析之前移动。在上图中所示的模型中，Exo1保护由DNA合成产生的未连接切口，并募集Mlh1-Mlh3，如图A所示。通过与分辨率无关的昵称转换事件会导致分支迁移期间的短暂修复补丁（由黑色箭头显示）。在下图所示的模型中，刻痕的Exo1保护会招募Mlh1-Mlh3，如图A所示。 （C）dHJ通过扩展分支迁移进行解析[97]。分支迁移为Mlh1-Mlh3聚合创造了底物[34]。在这样的模型中，Exo1与刻痕结合所施加的信号在远处起作用。Mlh1-Mlh3被Exo1募集并形成具有特定极性的聚合物，可以取代其他因子或在与这些因子相互作用时被激活。聚合物被激活以在II型dHJ上的1链双链DNA上引入切口，当它形成稳定性所需的临界长度时。有关详细信息，请参阅文本。dHJ，双霍利迪路口;SEI，单端入侵。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002085.g008
将刻痕保护与动态 dHJ 模型相结合
已经提出了切口重组中间体在形成减数分裂交叉中的作用，下面提供了一些研究的摘要。（1）从厚皮烯酵母培养物中纯化的Holliday连接结构的电子显微镜研究未能揭示完全连接连接的开放中心[98]，尽管dHJs在体内的结构尚不清楚。（2）切口HJ是体外溶解酶蛋白解析的有利底物[99]，切口HJs包含很大一部分Holliday连接结构，这些突变体在结构选择性核酸酶Yen1和Mms4-Mus81缺陷的突变体中观察到，这表明它们代表有丝分裂重组中间体[100]。（3）减数分裂孢子后代的全基因组测序推断，dHJ的分辨率偏向于新的DNA合成束，这意味着这些束包含明显的特征，如缺口[43]。（4）生化研究已经产生了在dHJ形成过程中持续存在的切口可以为dHJ分辨率中涉及的MMR/复制因子的持续加载提供底物（例如，RFC，PCNA，Msh4-Msh5;[46，48]）。此外，Kulkarni及其同事[48]和Cannavo及其同事[46]表明，在DNA复制过程中加载到引物模板连接上的PCNA促进了Msh4-Msh5和Mlh1-Mlh3的切口。然而，上述观察结果很难与S中的观察结果相协调。酿酒表明dHJ中存在的单链DNA似乎是连续的（至少在变性碱性凝胶的分辨率下;[20，21]）dHJ的动态性比基于规范DSB修复模型的预测要大得多（[43，96，97];图 8A）。切口重组中间体可能未被检测到，因为它们是瞬态的，但能够提供对交叉形成至关重要的信号，例如PCNA的负载。从这个意义上说，在exo1Δ菌株[30]中检测到的关节分子在结构上可能与野生型中的关节分子不同。
dHJ通常被描述为静态中间体，被限制在引发DSB的位置（图8A）。虽然这里提出的缺口保护机制可以在规范模型的背景下理解，其中Exo1招募Mlh1-Mlh3以切开与Exo1保护的缺口相反的单链DNA（图8A），但最近的研究表明dHJ在体内经历显着的分支迁移。最近，Marsolier-Kergoat及其同事[43]，Peterson及其同事[96]以及Ahuja及其同事[97]在减数分裂中表明，dHJ的1个或两个连接点可以在消解之前独立或协同移动。Marsolier-Kergoat及其同事[43]估计分支迁移的频率约为28%，Ahuja及其同事[97]基于对包含高密度单核苷酸多态性的明确定义的重组热点的详细分析，推断大约50%的交叉发生在两个HJ都位于起始DSB一侧的位置， 更多的交叉显示一些迁移。
如何将昵称保护纳入涉及 HJ 分支迁移的交叉机制中？一种可能性是缺口通过“昵称翻译”[43]易位。对于某些类型的分支迁移，这种机制会将刻痕推到新的dHJ位置，从而允许保持偏差（图8B，上图）。在一个这样的模型中[43]，当DNA合成遇到1'末端并且Mlh5-Mlh1的分辨率会发生时，就会发生Exo3缺口保护（图8B）。或者，Mlh1-Mlh3可能会与受Exo1保护的切口保持一定距离的切口（[96]，图8B，下图），根据先前的研究表明MLH蛋白在DNA上形成聚合物并且可以在DNA上产生多个切口，可以调和[34，101-103]。在Marsolier-Kergoat[43]模型中，假设新DNA束的合成随后处理产生的5'瓣以产生缺口。虽然该模型很吸引人，但需要与我们的发现相平衡，即Rad27的催化活性对于挽救exo1Δ菌株中的交叉不是必需的，这为Exo1在交叉分解过程中减弱的催化活性提供了支持。
广泛分支迁移的一个关键方面是，它应该防止DNA切口作为偏倚分辨率的底物，因为它们远离dHJ分辨率的位点。为了将这一观察结果与我们对Exo1的分析相协调，我们建议这些缺口充当Mlh1-Mlh3聚合物活化的底物（图8C）。先前的研究表明，Mlh1-Mlh3需要大的DNA底物才能激活核酸酶，聚合屏障阻碍了其核酸酶活性[34]。因此，分支迁移可以提供一种方法，将 dHJ 从受约束状态中移动，该状态被建立 dHJ 的因素（如 Msh4-Msh5）占用。在这样的模型中，Exo1与缺口结合所施加的信号传导可以跨越一定距离，并通过初始Exo1-Mlh1-Mlh3相互作用，允许Mlh1-Mlh3聚合物占据相对不受约束的DNA远离侵袭位点（图8C）。因此，我们可以将Exo1-nick相互作用位点视为Mlh1-Mlh3的成核点。这将增加聚合物的不对称性，并确保Mlh1-Mlh3以偏向的方式划痕。我们在Manhart及其同事提出的模型[34]的背景下说明了这一点，其中Mlh1-Mlh3需要跨多个千碱基的聚合才能具有催化活性以切割II型Holliday连接。Kulkarni及其同事已经提出了这种模型的变体[48]。这些模型还将解释减数分裂交叉过程中Exo1-Mlh1-Mlh3相互作用的重要性（但见下文）。在这个模型中，我们将Exo1-切口相互作用视为保护基本切口免受过早结扎的一种手段。这将确保dHJ在Mlh1-Mlh3聚合和活化需要时保持“柔韧性”。这些模型并不相互排斥，需要进一步的工作来了解分辨率因子如何与移动和静态 dHJ 相互作用。
图8中模型的另一个挑战是，虽然Exo1和FEN1结合皮瓣结构以协调尾部去除和连接步骤，但这些蛋白质的核酸内切酶活性似乎不是交叉分离所必需的。然而，连接酶过表达可以破坏exo1 DNA结合亚型中的交叉的发现表明，可连接切口可作为关键的重组中间体。一种可能性是Mlh1-Mlh1对Exo3的协调位移，从而在相反的链上诱导Mlh1-Mlh3划痕。在这样的模型中，可能存在其他去除5′瓣的处理事件，例如涉及Msh2-Msh3识别皮瓣，然后是Rad1-Rad10的核酸内切酶切割[104]。还值得注意的是，在能够去除1'瓣的RAD1菌株背景中观察到exo27Δ菌株与pEXO179-rad27-D5A质粒的互补。
Exo1 会直接 Mlh1-Mlh3 划痕吗？减数分裂重组需要一组协调的步骤，以促进 Exo1 介导的 DSB 切除、D 环形成、DNA 聚合酶介导的入侵 3′ 链的合成、皮瓣/缺口的 Exo1 保护和裂解的 dHJ 的连接。这些步骤之间的过渡很可能通过涉及翻译后修饰的机制（例如，[105]）。最近的研究表明，Exo1在通过Cdc1激酶激活Mlh3-Mlh5中起关键作用[47]，蛋白质关联/质谱研究[106]表明Mlh1-Mlh3与Exo1的减数分裂相互作用是动态的。然而，我们和其他人已经表明，Mlh1相互作用中的exo1-MIP突变体缺陷在减数分裂交叉中表现出中间缺陷（本研究和[30]），这表明其他因素/结构可能促进Mlh1-Mlh3核酸内切酶激活。与此一致，在没有Exo1的情况下，Mlh3-Mlh1病灶似乎在减数分裂前期形成[47]，并且exo27Δ交叉缺陷的RAD1互补不完整，并且没有改善交叉干扰（S4表）。与上述观察结果一致的一种机制是，在减数分裂重组过程中形成DNA结构或蛋白质屏障，激活Mlh1-Mlh3核酸内切酶，类似于通过2种易位酶的正面碰撞激活I型限制性内切酶[107]。了解这些转变是如何发生的，既需要使用纯化的蛋白质进行体外重建研究，也需要新的体内方法来鉴定dHJ中间体中的切口。
Exo1在促进遗传干扰中的作用
在面包酵母中，ZMM因子Zip3是在物理交叉形成之前交叉指定和干扰的早期标记，以前的研究表明，交叉干扰和交叉保证是由ZMM作为不同的功能执行的[108]。这些观察表明，交越干扰是在dHJ消解之前早期建立的（参见[109]）。有趣的是，虽然mlh3Δ突变体失去dHJ分辨率偏差，但mlh3Δ突变体中的残余干扰表明干扰不需要偏置分辨率。相比之下，exo1Δ中更严重的交叉干扰丢失（图4C）表明在保留分辨率偏差之前起作用，类似于指定交叉并确保干扰成熟dHJ的ZMM蛋白。Exo1的干扰作用也反映在孢子活力模式中，因为只有完整的exo1Δ表现出与非分离一致的活力模式。虽然不可能使用我们的数据来精确确定在exo1Δ中如何破坏交叉图案，但在exo1Δ菌株中看到的强干涉缺陷和非分离孢子活力模式与ZMM蛋白相似，ZMM蛋白在施加干扰的早期起作用。
在exo5Δ和exo3-D1A菌株中观察到的减数分裂DSB加工中的1′至173′切除缺陷[30]是否解释了为什么exo1Δ突变体显示出干扰缺陷？例如，Exo1介导的切除术中的缺陷可以通过阻止ZMM因子的募集来破坏交叉干扰，这些因子稳定了在交叉干扰中起作用的减数分裂重组中间体。以下观察结果反对这一观点：（1）Msh5与染色质的关联在exoΔ背景中出现得更高，反对失去在交叉干扰中起作用的关键ZMM募集因子（图6）。（2）靶向Exo1催化位点的exo1点突变体（例如exo1-D173A）显示出强烈的干扰（S4表）。（3）当I组催化突变也存在时，我们观察到exo1-G236D交叉缺陷受到抑制（exo1-D173A，G236D;图3B）。这种表型可以通过一个模型来解释，其中exo1-Group I突变体在ZMM途径中被过度激活（而不是有缺陷），并且exo1-G236D突变减少了Exo1与DNA的结合，抑制了exo1-I组突变表型。总之，这些观察结果以及先前的工作表明，联合分子形成发生在exo1Δ突变体的野生型水平[30]中，表明exo1Δ突变体中观察到的干扰缺陷不是切除依赖性关节分子不稳定或招募Msh4-Msh5缺陷的结果。
我们假设在exo5Δ中观察到的Msh1结合/聚焦强度的增加是由于减数分裂重组中间体的延迟周转。这一论点与Zakharyevich及其同事[30]先前的工作一致，他们表明，虽然重组中间体（单端侵袭，同源物dHJs）的外观和水平在exo1Δ中没有减少，但与野生型相比，它们持续的时间更长（在SK1菌株中约1小时）。我们能否将exo5Δ中增强的Msh1结合/聚焦强度与其减少的交叉干涉表型联系起来？鉴于Exo1小鼠卵母细胞[110]和Exo1 -/-D173A [38]小鼠精细胞精通MLH1 / MLH3定位，Exo1可能在Mlh1-Mlh3的周转中具有独特的作用，可能是通过负调节其负载的方式与其在交叉干扰中的作用有关。在这样的模型中，exo1Δ中这种负载的破坏将导致减数分裂重组中间体最终在减数分裂I期间被Mms4-Mus81和减数分裂II期间的Slx1-Slx4和Yen1解析，以产生与干扰无关的II类交叉。
虽然Exo1的切除作用对于维持遗传干扰似乎是可有可无的，但目前尚不清楚Exo1如何促进交叉干扰。有趣的是，已经观察到Exo1通过Msh2相互作用肽盒（SHIP;图2C;[1]），这表明Msh28-Msh4也与Exo5相互作用的可能性。然而，与Msh1-Msh4的直接相互作用尚未表征，虽然Msh5-Msh4定位不依赖于Exo5（图1），但我们尚未确定这种定位是否对下游Exo6功能至关重要。顺便说一句，我们试图通过表达Rad1融合到包含SHIP盒的Exo1的C末端区域来改善exo27Δ菌株中交叉功能的pEXO1-RAD27互补;不幸的是，这些结构不起作用。梳理Exo1如何在交叉选择和分辨率中协调角色对于理解偏置dHJ分辨率的机制至关重要。
材料和方法
培养基和酵母菌株
本研究中使用的酿酒酵母SK1酵母菌株（S5表）在30°C下在酵母提取物蛋白胨-葡萄糖（YPD）或补充有2%葡萄糖的合成完全培养基中生长[111]。必要时，将遗传素（Invitrogen，圣地亚哥）或诺苏藓素（Werner BioAgents，德国）以推荐浓度添加到培养基中[112]。使用孢子自主测定法在SK1等基因背景中分析减数分裂杂交，以测量VIII号染色体（SKY8 / SKY1亲本二倍体，[3576]）和SK3575同源EAY54 / EAY1背景（XV号染色体上的1108个间隔，[1112]）上的CEN4-THR57间隔的杂交。孢子培养基的制备如下所述[57]。
应变结构
突变等位基因转化为S。使用标准技术对整合质粒、geneXΔ：：KANMX PCR片段或CEN6-ARSH4和2μ质粒（S6表）进行酿酒[111，113]。为了确认整合事件，如前所述分离了来自转化体的基因组DNA[114]。通过使用引物AO1和AO1分析PCR产生的DNA片段，筛选携带EXO4061：：KANMX和exo3838：：KANMX突变体衍生物的转化体以进行整合（本研究中的所有引物均购自美利坚合众国爱荷华州Coralville的Integrated DNA Technologies）。通过使用引物AO1和AO3666（S3399表）对PCR产生的DNA片段进行DNA测序，证实了exo7等位基因的整合。为了确认基因XΔ：：KANMX突变的整合，使用了在基因XΔ：：KANMX PCR片段之外的引物（S7表）。每种基因型至少制备了2个独立的转化体。
exo1 整合和 EXO1、RAD27 和 CDC9 表达质粒
本研究产生的质粒显示在S6表中，用于制造质粒的寡核苷酸引物显示在S7表中。质粒中表达的基因来自SK1菌株背景[115]。
pEAI422 （4.7 KB;exo1Δ：：KANMX）是使用HiFi DNA组装（新英格兰生物实验室）构建的。它包含完全删除的 EXO1 开放式阅读框，但保留了 280 bp 的 5' 侧翼和 340 bp 的侧翼 3' 序列。该质粒在转化前用SpeI和SmaI消化以释放exo1Δ：：KANMX片段。
pEAI423 （7.2KB;EXO1-KANMX）包含整个EXO1基因，其中约300 bp的启动子序列和与KANMX标记相连的终止密码子下游约500 bp序列。在该构建体中，大约有300个直接下游序列的碱基对保留在EXO1之后立即发现的未知功能的小基因，其次是KANMX，然后是下游同源性。pEAI423是使用以下DNA片段的HiFi组装创建的：（1）BamH1消化的pUC18。（2）用引物AO1和AO1对SK4030基因组DNA进行PCR扩增而制成的EXO4031基因片段。（3）通过PCR扩增质粒pFA6[116]与AO4032和AO4033制成的KANMX基因片段。（4）用AO1和AO1对SK4034基因组DNA进行PCR扩增的下游EXO4035序列。该构建体的整合赋予野生型EXO1基因型。使用Q423诱变试剂盒（新英格兰生物实验室）构建含有EXO1突变的pEAI5衍生物，使用pEAI423作为模板和S7表所示的寡核苷酸。EXO1在野生型和突变体构建体中的整个开放阅读框的序列通过康奈尔生物资源中心的DNA测序使用引物AO275，AO643，AO694，AO804，AO2383，AO3886，AO4028确认。用SpeI和NheI消化pEAI423和突变衍生物，通过基因替换将EXO1：：KANMX或exo1：：KANMX片段引入SKY3576和SKY3575中。
pEAA726 （10.5 KB;MLH3，CEN6-ARSH4，URA3）是一种MLH3互补载体，通过将pEAA3中的Bam HI-SalI MLH636-KANMX片段连接到pRS416（ARS / CEN，URA3; [117]）骨干用BamHI和SalI消化。
pEAA722 （6.4 KB;RAD27， CEN6-ARSH4， URA3）是RAD27互补载体，分两步构建。首先，通过使用引物AO2 + AO27对SK259基因组DNA进行PCR扩增，创建了含有300 bp上游序列和1 bp下游序列的RAD4707基因片段。所得片段用SpeI + Kpn I消化，并连接到用SpeI + KpnI酶解的pRS4708中以产生pEAA416。
pEAA715 （7.8 KB;EXO1，CEN6-ARSH4，URA3）分2个步骤构建。首先，通过使用引物AO1和AO400对SK1基因组DNA进行PCR扩增，创建了含有4631 bp上游和下游序列的EXO4636基因片段。所得片段用SpeI + Kpn I消化，并连接到用SpeI + KpnI酶解的pRS416中以产生pEAA715。
pEAA720 （6.8 KB），一个pEXO1-RAD27（EXO1启动子驱动RAD27表达），CEN6-ARSH4，URA3载体，由HiFi组装（新英格兰生物实验室）使用以下片段构建：（1）pRS416（CEN6-ARSH4，URA3）用KpnI + XbaI消化。 （2）使用AO1 + AO400从SK1基因组扩增的EXO4643启动子区域（4644 bp直接上游ATG）。 （3）使用AO27 + AO1从SK4645基因组DNA扩增的整个RAD4637 ORF。（4）使用AO1 + AO400从SK1基因组DNA扩增的EXO4638下游区域（终止密码子下游的4636 bp）。rad27突变等位基因是用Q5诱变试剂盒（新英格兰生物实验室）构建的，使用pEAA720作为模板。用于制造等位基因的寡核苷酸如S7表所示。所有RAD27质粒构建体均通过DNA测序确认。
pEAM327 （9.3 KB），CDC9，2μ，URA3质粒，分两步构建。首先，通过使用引物AO2和AO9对SK1基因组DNA进行PCR扩增，创建了含有000，400 bp上游序列和1 bp下游序列的CDC4783 ORF片段。所得片段用Hind III和Kpn I消化，然后连接到pRS4784（426μ，URA2），骨架也用HindIII和KpnI消化以产生pEAM3。
pEAM329 （8.8 KB） 是一种 2μ URA3 质粒，表达来自 HOP9 启动子 （pHOP1-CDC1） 的 CDC9。它是使用以下片段通过Hifi组装构建的：（1）通过使用引物AO327和AO4837对pEAM4838进行PCR扩增来创建DNA骨架;由此产生的DNA片段缺乏CDC9启动子。（2）通过使用引物AO500和AO1对SK1基因组DNA进行PCR扩增，创建了HOP1启动子的4839 bp DNA片段（直到HOP4840起始密码子）。然后使用Hifi组装组装2个片段以创建pEAM329，并通过DNA测序证实。
四联体分析
来源于EAY1108/EAY1112的二倍体采用零生长交配方案进行孢子化[118]。简而言之，将单倍体亲本菌株修补在一起，允许在完整的最小板上交配过夜，然后敲击到选择板上以选择二倍体。然后将所得二倍体从单个菌落转移到孢子板中，在那里它们在30°C下孵育3天。将四分体在最小的完整板上解剖，然后在30°C下孵育3至4天。将孢子克隆复制接种到相关的选择性平板上，并在孵育过夜后评估生长情况。遗传图谱距离由珀金斯的公式确定[119]。三点间隔的干扰计算如下所述[82，120，121]。统计分析是使用斯塔尔实验室在线工具（https://elizabethhousworth.com/StahlLabOnlineTools/）和VassarStats（http://faculty.vassar.edu/lowry/VassarStats.html）和生物统计手册（http://udel.edu/mcdonald/statintro.html）进行的。
用马尔科瓦法测量干扰[60]。该方法在存在和不存在相邻分频器的情况下测量cM距离。这 2 个距离的比值表示干扰强度，接近 1 的值表示干扰丢失。使用G检验[122]测量四分体分布的显著性，p<0.05的值被认为是干扰的指示。还通过计算观察到的双交叉与预期的双交叉的比率来测量每个间隔的COC。
孢子自主荧光测定
我们分析了VIII号染色体CEN8-THR1位点（SKY3576，SKY3575;[56]）. 为了产生二倍体菌株用于孢子自主荧光测定中的分析，通过将来自新鲜条纹菌落的YPD上修补在一起来交配相反交配类型的单倍体酵母并使其交配4小时，然后转移到色氨酸和亮氨酸辍学最小培养基板以选择二倍体。将从单个菌落生长的二倍体修补到孢子板上并在30°C下孵育约72小时。含有ARS-CEN或2μ质粒的二倍体菌株也在选择性培养基上生长，以保持质粒直到修补到孢子板上之前。孢子用0.5%NP40处理，并在使用蔡司AxioImager.M2分析之前进行短暂超声处理。对每种基因型至少500个四分体进行计数以确定%的四分体。测量每个等位基因两个独立的转化体。基于χ1分析，与野生型和exo2Δ对照相比，具有统计学意义的差异用于将每个等位基因分类为表现出野生型，中间型或零表型。我们以123%的错误发现率应用了Benjamini-Hochberg校正[5]，以尽量减少由于多重比较而导致的α膨胀。有关显示此更正的基础数据集，请参阅 S2 数据。
对甲基甲烷磺酸盐敏感
将酵母菌株在YPD液体培养基中生长至饱和，然后在水中稀释并以10倍的连续稀释液（未稀释至10?5） 到 YPD 培养基上，其中包含 0.04% 彩信 （v/v;西格玛）。在2°C孵育30天后拍摄板。 S3图是至少5个独立板的代表性图像。
Exo1 同源性模型
人EXO1与5′凹陷DNA（氨基酸2至356;[26]）用于绘制对功能至关重要的酵母Exo1中的残基。使用Phyre1软件（http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index）构建了同源模型（图2B）。预测的结构与使用Pymol（https://pymol.org/1/）的人类EXO3（PDB ID：2QEB）对齐。本研究中突变的金属结合残基为D78、D171和D173。突变的活性位点残基为H36、K85、R92和K121。疏水楔形残基突变为S41、F58和K61，DNA结合残基突变为K185和G236。对于S1图，来自S的Exo1蛋白序列。酿酒会被提交给NCBI的BLASTP服务器，并针对具有里程碑意义的数据库运行。使用默认设置，使用MAFFT生成来自不同模式生物的Exo1同系物的多序列比对[124]。
外星1的纯化
如制造商（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆市Invitrogen）所述，从杆状病毒/Sf1表达系统中的pFastBac1构建体（S1表）中纯化Exo173-FLAG变体（Exo1，exo236-D1A，exo6-G9D），并进行以下修改[125]。简而言之，将250 ml Sf9细胞沉淀重悬于含有7 mM Tris （pH 5.50）、7 mM EDTA、9.1 mM PMSF、0.5 mM β-巯基乙醇、0 μg/mL 亮肽素和 5.20× Halt 蛋白酶抑制剂混合物的 0.25 ml 缓冲液中（赛默飞世尔科技，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）。将悬浮液在冰上孵育15分钟，之后加入NaCl至终浓度为100mM，加入甘油至浓度为18%（v / v）并在冰上孵育30分钟。将细胞以30，000xg离心30分钟。将清除的裂解物以约2 ml / h的速率施加到15 ml SP琼脂糖快速流动柱上。用含有10 mM Tris（pH 50.7）、9%甘油、10 mM NaCl、100.0 mM PMSF、5 mM β-巯基乙醇和5.6 μg/ml亮肽素的7 ml缓冲液洗涤色谱柱。用上述含有1 mM NaCl的缓冲液洗脱Exo700变体。将含有Exo1蛋白变体的级分合并并分批施用于0.3ml M2抗FLAG琼脂糖珠（Sigma-Aldrich，圣路易斯，密苏里州，美国），在1°C下旋转孵育约5.4小时。 通过在2°C的摆动桶离心机中以000，5RPM离心4分钟分离未结合的蛋白质。 将树脂重悬于含有7 mM Tris（pH 20.7）、9 mM NaCl、150%甘油、10.0% NP1、40.0 mM PMSF、5.0 mM β-巯基乙醇、5.6 μg/ml 亮肽素和三分之一的完全蛋白酶片（罗氏，巴塞尔，瑞士）的缓冲液中，每 7 ml 缓冲液，并以约 100 ml/h 的速度流入空柱中， 允许打包。然后用15.0ml上述缓冲液（不包括NP6）（洗涤缓冲液II）洗涤色谱柱。使用含有40.1 mg/ml 0x-FLAG肽（Sigma）的洗涤缓冲液II洗脱Exo1-FLAG变体。施用洗脱缓冲液后，在收集前3个馏分后停止流动并孵育约3小时，然后恢复流动并收集馏分。将含有Exo1变体的馏分合并，在液氮中快速冷冻，并储存在-1°C。 所有纯化步骤均在80°C下进行。 蛋白质浓度通过布拉德福德的方法测定[4]。
脱氧核糖核酸结合检测
Exo1 DNA结合测定在60°C下在10μl反应中进行30分钟。 每个反应含有15nM同型双链（AO3878退火至AO3144;S7 表）或 19 nt 5' 瓣（AO3145 和 AO3940 退火至 AO3144）基底（每个由 8%32P 标记和 92% 未标记）、35 mM NaCl、20 mM Tris 7.5、0.04 mg/ml BSA、0.01 mM EDTA 和 0.1 mM DTT。使用Hoeffer Scientific Instruments FH127过滤单元（美国加利福尼亚州旧金山）通过过滤器与KOH处理的硝酸纤维素过滤器结合[225]来分析反应。过滤器结合协议的详细描述可以在Chi和Kolodner中找到[128]。实验一式三份进行（每次重复在不同的日期进行），数据在图2D中表示为平均值+/-标准差。寡核苷酸购自IDT（美国爱荷华州Coralville），AO3144在5'末端用[γ?32P]ATP（Perkin Elmer）和T4多核苷酸激酶（新英格兰生物实验室）标记。寡核苷酸在10 mM Tris（pH 8.0），50 mM NaCl，1 mM EDTA中以等摩尔比混合。将混合物在加热块中加热至95°C5分钟，然后通过将模块关闭至室温（约3小时）来缓慢冷却。退火的寡核苷酸底物通过凝胶过滤（HR S-200离心柱，阿默舍姆生物科学公司）纯化，并通过凝胶电泳验证。
蛋白质印迹分析
通过蛋白质印迹法测定EXO1-1MYC菌株中的Exo13蛋白水平。简而言之，EXO1-13MYC-KANMX积分载体（pEAI517;S6 表）用于将EXO1-13MYC和突变衍生物引入酵母（S5表）。pEAI517由pEAI423（EXO1-KANMX）和pFA6a-13MYC：：KanMX6 [63]构成。pEAI423使用AO5293和AO5294（S7表）进行PCR扩增，pFA13a-6MYC：：KanMX13的6MYC标签使用AO5295和AO5296进行PCR扩增。PCR片段被凝胶提取（Qiagen）并使用Hifi组装（新英格兰生物实验室）连接以创建pEAI517。pEAI517被用作Q5诱变（新英格兰生物实验室）的模板，以制作S1表所示的exo13-6MYC整合载体。整合载体在使用前进行DNA测序。
含有EXO1-13MYC和突变衍生物（S5表）的菌株在YPD至对数中期生长×，在50μl裂解缓冲液（3mM Tris-HCL（pH 60.250），50mM KCL，7mM EDTA，9.120%NP-5，0%甘油，1mM PMSF）和等体积的酸洗玻璃珠（40微米， 西格玛G10）。收集裂解物并用裂解缓冲液额外洗涤1μl玻璃珠。然后将裂解物在500°C下以8772，250RPM离心13分钟，然后将000×Laemmli缓冲液（Bio-Rad）加入上清液中，并通过30%SDS-PAGE分离蛋白质并使用湿转转移到硝酸纤维素膜上。用抗Myc（4：2，10，1A13，Sigma-Aldrich）和过氧化物酶偶联抗小鼠IgG二抗（1：1，000，Sigma-Aldrich）检测exo4-6MYC标记的等位基因。使用抗G1PDH抗体（10：000，6，Sigma-Aldrich）和过氧化物酶偶联抗兔IgG二抗（6：1，5，Invitrogen）检测葡萄糖-000-磷酸脱氢酶。印迹采用Clarity Western ECL底物（Bio-Rad）开发，并使用Bio-Rad ChemiDoc MP成像仪成像。
核酸酶检测
Exo1核酸酶反应在超螺旋的2.7 kb pUC18 DNA（Invitrogen）或pUC18 DNA上进行，该DNA通过与Nt.BstNBI孵育而切口（新英格兰生物实验室，美国马萨诸塞州伊普斯威奇;[32，34]）。简而言之，将20μl反应（0至30nM Exo1或具有3.6nM质粒DNA的突变衍生物）组装在含有20mM HEPES-KOH（PH 7.5），20mM KCl，0.2mg / ml BSA，1%甘油和5mM MgCl的缓冲液中2.通过加入含有终浓度为37.1%SDS，0mM EDTA和1.14mg / ml蛋白酶K（新英格兰生物实验室）的终止混合物溶液停止反应（0°C，1小时），并在37°C下孵育20分钟。产物通过含有1.2 μg/mL溴化乙锭的0.1%琼脂糖凝胶分离。如前所述制备样品并运行凝胶[34]。使用GelEval（FrogDance软件，v1.37）使用阴性对照反应作为背景进行独立反应的凝胶定量。
染色质免疫沉淀
用于 ChIP-Seq、ChIP-qPCR 和 Msh753 定位分析（图 756）的酵母菌株 KTY757、KTY1162、KTY1168、NHY5 和 NHY6 都是 S 的衍生物。酿酒SK1 菌株。KTY1、KTY4和KTY753中的exo756Δ：：KanMX757标记是在NHY1162/1168背景中使用基于同源重组的基因敲除方法创建的[61]。使用为EXO1侧翼区域设计的引物通过PCR验证转化的菌落。如Nandanan及其同事所述，使用多克隆Msh5抗体（在兔中产生）和蛋白A琼脂糖珠（GE医疗，芝加哥，伊利诺伊州，美国）在同步减数分裂培养物上进行Msh5 ChIP[85]。在进入减数分裂后3 h、4 h和5 h收集免疫沉淀的DNA，用于ChIP-qPCR和ChIP-Seq。
Msh5 ChIP-qPCR 的 DNA 富集是参考每个时间点的输入量估算的。野生型的Msh5富集数据来自Nandanan及其同事[85]。对来自exo2Δ的Msh5免疫沉淀DNA样品的1个独立的生物学重复（3小时，4小时和5小时）进行了ChIP-qPCR。误差条使用来自 2 个独立生物学重复的标准偏差进行估计。在具有代表性的DSB热点（BUD5，ECM23，CCT3），轴（轴I，轴II，轴III），着丝粒（CENIII，CENVIII）和DSB冷点（YCR6W）上分析Msh093结合。这些区域的染色体坐标和用于qPCR的引物集在Nandanan及其同事中描述[85]。
来自Illumina平台的Msh5 ChIP-Seq数据按照Nandanan及其同事的描述进行处理[85]）。原始序列数据存放在国家生物技术信息中心序列读取档案中，入藏号为PRJNA780068（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/?term=PRJNA780068）。exo5Δ中的全基因组Msh1结合图是通过将基因组分成大小相等的10 bp箱来生成的。如Nandanan及其同事所述，使用NCIS计算每个样本的每个箱中Msh5读数的数量，并用其各自的对照样本（输入）进行归一化[85]。使用带宽为 1 kb 的 ksmooth（R 中的函数）平滑读取计数。读取、背景减去、平滑和绘图的规范化是使用 R（版本 3.3）完成的。
为了鉴定exo5Δ中的Msh1峰，我们考虑了基因组中唯一映射的读段。由于exo1Δ ChIP-Seq重复序列显示出高相关性（r > 0.88），我们使用合并重复来鉴定Msh5峰。Msh5峰使用MACS（基于模型的ChIP-Seq分析;http://liulab.dfci.harvard.edu/MACS/[129]），如Nandanan及其同事[85]所述。P 值> 10 的峰值?5被滤除，最终的Msh5峰显示在S1文件中。
Msh5病灶的细胞学分析
如前所述，从同步减数分裂培养物（3小时、4小时和5小时）制备染色体扩散（3小时、4小时和5小时）[108，130，131]。使用针对Msh5的一抗进行Msh5染色[108]，稀释度为1：500，然后以488：1，1稀释度进行二抗（Alexa fluor 500，赛默飞世尔科技）。使用落射荧光显微镜（BX5，奥林巴斯）以51×物镜（NA，100.1）对Msh3染色样品进行成像。图像由使用iVision（Sillicon）软件处理的CCD相机（CoolSNAP，Roper）捕获。为了量化Msh5聚焦强度，用斐济量化了整个细胞核的平均荧光（ImageJ）。Msh5的最终荧光强度用每个细胞核的DAPI强度归一化。荧光强度是指染色体扩散上每单位面积的像素强度。
支持信息
来自S的Exo1蛋白序列的比对。酿酒会（加入#NP_014676），S。庞贝（NP_596050.1），H.智人（NP_003677），M.肌肉（NP_036142）和D。黑腹肌（NP_477145）。
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S1 图 来自S的Exo1蛋白序列的比对。酿酒会（加入#NP_014676），S.庞贝（NP_596050.1），H.智人（NP_003677），M.肌肉（NP_036142）和D。黑腹肌（NP_477145）。
来自不同物种的Exo1的序列比对。三角形表示本研究中发生的突变。有关序列比对的详细信息，请参阅材料和方法。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002085.s001
（蒂夫）
S2 图 野生型孢子活力谱和EAY1/EAY1108菌株背景中指示的exo1112菌株。
图4所示的解剖显示了具有3、2、1、0和4个活孢子的四分体的百分比，以及解剖的四分体总数和整体孢子活力。基础数据可以在 S6 数据中找到。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002085.s002
（蒂夫）
S3 图 exo1突变体对DNA损伤剂MMS的敏感性。
在含有1.10%MMS（材料和方法）的YPD和YPD培养基上以0倍的连续稀释液发现野生型和指示的exo04突变体。在2°C孵育30天后拍摄板。 在最底部的面板中，用不含插入片段（pRS1）、EXO4778（pEAA416）或从EXO1启动子表达的RAD715（pEXO27-RAD1，pEAA1）的ARS-CEN载体转化exo27Δ菌株（EAY720）。 基础数据可在 S7 数据中找到。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002085.s003
（蒂夫）
S4 图 SK1减数分裂中EXO27，RAD9，CDC1和HOP1表达的mRNA序列和核糖体分析。
从Brar及其同事获得的数据[74]。RPKM = 每百万次映射读取每千碱基编码序列的读取数。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002085.s004
（蒂夫）
S5 图 在 T = 2 小时（图 A）、5 小时（图 B）和 1 小时（图 C）时，exo3Δ 重复 （a， b） 的 Msh4 读数的 log5 （参考输入的倍数变化）的相关分析。
图中显示了皮尔逊相关系数 （r）。基础数据可以在国家生物技术信息中心序列读取档案中找到，入藏号PRJNA780068。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002085.s005
（蒂夫）
S6 图 Msh5 在 1 个 DSB 冷点处读取野生型和 exo25Δ 计数。
（A）箱线图比较重叠Msh5峰位置的野生型和exo1Δ突变体中平均Msh5读数的差异。Msh5 读取计数来自图 5B 中所示的 Msh6 ChIP-Seq 实验。Y轴表示野生型和exo5Δ中每个峰中心（100 h）的Msh5读数计数平均值+/- 1 bp，p值使用Wilcoxon秩和检验计算并使用Bonferroni校正进行调整，***表示p值<0.001。（B）YCR093W冷点的放大区域（[88];图6B）在野生型和 exo5Δ 中均显示非常低的 Msh1 读数（未平滑）。（C）在野生型和exo5Δ中比较了1个冷点的Msh25结合[87，88]，这些冷点在野生型中Msh5耗尽。这25个是通过对Gerton及其同事[49]和Shodhan及其同事[87]中的88个冷点进行排序而获得的，基于Msh5在野生型中的读取计数。然后分析了最低的25个。Y 轴显示了减数分裂诱导后 5、1 和 3 小时野生型和 exo4Δ 的 Msh5 读取计数（未平滑）。X 轴表示距冷点中心的 +/- 1 kb。给出了每个时间点（+/- 距冷点中心5 bp）的野生型（WT）和exo1Δ的平均Msh100读取计数数。（D）Gerton及其同事[49]和Shodhan及其同事[87]（左图）的88个冷点列表，其中25个（右图）在本研究中进行了分析，并按从最高（HXT1）到最低（YGR289C）Msh5计数的顺序呈现。S6图的基础数据可以在国家生物技术信息中心序列读取档案中找到，入藏号PRJNA780068。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002085.s006
（英文）
S1 表。 XPG家族蛋白的结构功能分析.
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002085.s007
（英文）
S2 表。
(A）exo1突变体的孢子自主减数分裂交叉分析。通过将2个独立构建的菌株与SKY3576中的exo1变体（含有青色荧光蛋白;S5 表）和SKY3575（含有红色荧光蛋白）背景。通过在SKY3576和EAY4151（exo1Δ）背景中将2个独立构建的菌株与exo1变体杂交而成。诱导二倍体菌株进行减数分裂，并通过确定总四型/四型和亲本二型的总和来测量CEN8-THR1区间中的%四型。每个等位基因至少计数500个四联体，除非另有说明（*1分析了转化体），否则每个背景至少分析了2个转化体。通过Fisher在突变型和野生型EXO1和exo1Δ四型值之间的精确检验来评估显着性。为了尽量减少由于多重比较而导致的α膨胀，我们以5%的错误发现率应用了Benjamini-Hochberg校正;+，与野生型无法区分;-，与 exo1Δ 无法区分;INT，可与野生型和 exo1Δ 区分开来。（B）孢子自主测定：外泌1 Δ和mlh3Δ菌株的pEXO1-RAD27互补。含有用于测量CEN8-THR1区间杂交标记的指示基因型二倍体（S5表）用指示质粒（pEAA715-EXO1，URA3，CEN6-ARSH4; pRS416-URA3，CEN6-ARSH4; pEAA722-RAD27，URA3，CEN6-ARSH4; pEAA720-pEXO1-RAD27，URA3，CEN6-ARSH4; pEAA724- pEXO1-rad27-D179A， URA3， CEN6-ARSH4; pEAA727-rad27-A45E， URA3， CEN6-ARSH4; pEAA728-rad27-R101A， URA3， CEN6-ARSH4; pEAA729-rad27-R105A， URA3， CEN6-ARSH4; pEAA73 0-rad27-K130A， URA3， CEN6-ARSH4; pEAA731-rad27-H191E， URA3， CEN6-ARSH4）并选择用于质粒保留。通过确定总四型/四型和亲本二型的总和来诱导所得菌株减数分裂，并在CEN8-THR1区间内测量%四型（单交叉）。每个等位基因/质粒组合至少计数500个四联体，每种条件至少分析2个转化体。通过Fisher对含有pRS416（空载体）的exo1Δ菌株和具有指定质粒的测试条件之间的精确测试来评估显著性（如图5A和5C所示）。为了尽量减少由于多重比较而导致的α膨胀，我们以5%的错误发现率应用了Benjamini-Hochberg校正。采用Fisher精确检验测定了含有pRS416（空载体）和pEAA720（pEXO1-RAD27）的exo1-K185E和exo1-F447A、F448A（MIP）菌株中%四型的显著性。不适用，不适用。（C）pHOP1-CDC9表达对exo1菌株。用指示的质粒（pRS426-URA3，2μ; pEAM329-pHOP1-CDC9，URA3，2μ）转化注释基因型的二倍体，并选择二倍体和质粒保留。诱导二倍体菌株进行减数分裂，并通过确定总四型/四型和亲本二型的总和来测量CEN8-THR1区间中的%四型。每个等位基因/质粒组合至少计数500个四联体，每种条件至少分析2个转化体。通过 Fisher 在 pRS426 值和 pEAM329 值之间的精确测试评估了显著性，如图 7A 所示。（D）CDC9等位基因对exo1-K61E菌株减数分裂交叉的影响。用指定的质粒转化exo1-K61E/exo1Δ二倍体，并选择二倍体和质粒保留。诱导二倍体菌株进行减数分裂，并通过确定总四型/四型和亲本二型的总和来测量CEN8-THR1区间中的%四型。每种情况至少计数500个四联体，每种情况至少分析2个转化体。通过Fisher在空载体和每个含有菌株的质粒之间的精确测试来评估显著性。应用了5%错误发现率的Benjamini-Hochberg校正（图7B）。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002085.s008
（文档）
S3 表。 染色体XV上WT、mlh1108Δ、msh1112Δ和exo3菌株中EAY5/EAY1菌株背景的遗传图谱距离（cM）以及亲本和重组后代的分布。
突变体是EAY1108/EAY1112的同基因衍生物。遗传区间对应于从四分体+/-一个标准误差计算的遗传距离。使用斯塔尔实验室在线工具网站（https://elizabethhousworth.com/StahlLabOnlineTools/）计算标准误差。对于单个孢子分析，数据显示为重组频率周围的95%置信区间。对于四分体分析，使用珀金斯[1]的公式计算厘米（cM）映射距离：50{TT+（6NPD）}/（PD+TT+NPD）。为了与四分体数据进行比较，将从单个孢子（Parental/（Parental+重组））获得的重组频率乘以100以产生遗传图距离（cM）。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002085.s009
（英文）
S4 表。
(A） 对 XV 号染色体的干扰测量。对EAY1108/EAY1112菌株背景（材料和方法，S5表中列出的菌株）中的指示基因型进行了马尔科娃比和重合系数（COC，观察到的双交叉/预期的双交叉比）。这些方法针对间隔I（URA3-LEU2-LYS2），II（LEU2-LYS2-ADE2）和III（LYS2-ADE2-HIS3）进行。0 = 绝对干扰;1 = 无干扰。使用G检验评估四分体分布差异的显着性。p<0.05的分布差异被认为是干扰的重要证据。观察到比率明显高于1的区间，并用*表示潜在的负干扰。马尔科瓦比率计算的详细分析见S4B表。（B）马尔科瓦比率的详细计算见S4A表和图4C。使用马尔科瓦方法[1，2]分析了XV号染色体的交叉干扰。对于每个遗传区间，根据参考区间内是否存在重组事件来划分四分体。对于每个参考区间，在相邻区间内测量地图距离，从而获得每个区间2个地图距离。使用G检验评估四分体分布差异的显着性。p<0.05的分布差异被认为是干扰的证据。数据表示为每个相邻间隔中 2 个地图距离的平均比率，比率越小表示干扰越强。当两个相邻的区间都没有显示出可检测到的正干扰时，一个区间被认为是具有“正干扰丧失”表型。明显大于 1 的比率用 * 表示潜在的负干扰。TT，四型;NPD，非亲本二型;PD，父母二型。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002085.s010
（英文）
S5 表。 本研究中使用的菌株。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002085.s011
（文档）
S6 表。 本研究中使用的质粒。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002085.s012
（文档）
S7 表。 本研究中使用的寡核苷酸（显示5′至3′）。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002085.s013
（文档）
S1 文件。 从5个exo2Δ重复的Msh1峰在5小时时间点重复。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002085.s014
（英文）
S1 数据。 图 2 的基础数据。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002085.s015
（英文）
S2 数据。 图3B、5A、5B、7A和7B的孢子自主荧光测定中的基础PD和TT计数。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002085.s016
（三十）
S3 数据。 图3C的基础数据。
给出了化学发光（α-myc信号）和比色（分子量标准品）数据，以及合成图像。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002085.s017
（PPTX）
S4 数据。 图6A的基础数值数据。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002085.s018
（三十）
S5 数据。 图6D、Msh5焦点计数和强度的基础数值数据。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002085.s019
（三十）
S6 数据。 S2 的基础数据 图。指定基因型的四联体中的孢子活力。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002085.s020
（三十）
S7 数据。 S3 的基础数据图整个 YPD 和 YPD-MMS 板。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002085.s021
（英文）
确认
我们感谢迈克尔·利希滕、伊利亚·芬克尔斯坦、贾斯文德·阿胡贾、马库斯·斯莫尔卡和布鲁克斯·克里卡德的有益讨论;斯科特·基尼（SKY3576/3576）菌株;Michael Liskay用于Exo1表达质粒;以及Alani实验室的成员在整个工作中提供的有用意见。
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