厦门论文发表-核糖体复合物的动态结构协调新生多肽链的顺序修饰
抽象
新生多肽链的共翻译修饰是新蛋白质诞生过程中的首批事件之一。在真核生物中，蛋氨酸氨基肽酶（MetAPs）裂解起始蛋氨酸，而N-乙酰转移酶（NAT）催化N末端乙酰化。MetAPs和NAT与其他共翻译作用的伴侣竞争，如核糖体相关复合物（RAC），蛋白质靶向和易位因子（SRP和Sec61）在核糖体隧道出口处的结合位点。然而，虽然核糖体结合的RAC，SRP和Sec61的解析良好的结构是可用的，但关于真核MetAPs或五个共翻译活性NAT的核糖体相互作用模式的结构信息仅适用于NatA。在这里，我们介绍了与核糖体新生链复合物结合的酵母Map1和NatB的冷冻电镜结构。Map1主要与动态rRNA扩增片段ES27a相关，从而保持在隧道出口下方的理想位置，以作用于新兴的底物新生链。对于NatB，我们观察到NatB复合体的两个副本。NatB-1直接在隧道出口下方结合，再次涉及ES27a，NatB-2位于第二个通用适配器站点（eL31和uL22）下方。核糖体上两种NatB复合物的结合模式与NatA和Map1的结合模式不同但重叠，这意味着NatB仅与隧道出口结合。我们进一步观察到，ES27a在与NatA，NatB或Map1结合时采用不同的构象，共同表明有助于协调核糖体出口隧道处新兴新生链上这些因素的顺序活动。
数字
Fig 4图1图2图3Fig 4图1图2图3
引文： Knorr AG， Mackens-Kiani T， Musial J， Berninghausen O， Becker T， Beatrix B， et al. （2023） Map1-和NatB-核糖体复合物的动态结构协调了新生多肽链的顺序修饰。公共科学图书馆生物学21（4）： e3001995. https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001995
学术编辑： Jamie H. D. Cate，加州大学伯克利分校，美国
收到： 10月 2021， 10;接受： 2023月 20， 2023;发表： <>月 <>， <>
版权所有： ? 2023 家乐等。这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。
数据可用性： 所有冷冻电子显微镜图谱均可在EM数据库中获得，加入代码为EMD-16182，用于Map1-C1-核糖体复合物，EMD-16191用于Map1-C2-核糖体复合物，EMD-16090用于具有两个稳定结合的NatB（I类）的NatB-RNC复合物，EMD-16086用于专注于NatB-2（II类）的NatB-RNC图谱。所有模型均可在蛋白质数据库 （PDB） 获得，加入代码 8BQD 用于 Map1-C1-核糖体复合物，8BQX 用于 Map1-C2-核糖体复合物，8BJQ 用于具有两个稳定结合的 NatB（I 类）的 NatB-RNC 复合物和 8BIP 用于专注于 NatB-2（II 类）的 NatB-RNC 图谱。
资助：AGK通过慕尼黑定量生物科学研究生院获得资助。R.B.由德国研究协会（GRK1721）和欧洲研究委员会（ERC）高级资助（人类核糖发生，参考编号885711）资助。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。
竞争利益： 提交人声明不存在相互竞争的利益。
缩写：乙酰辅酶A， 乙酰辅酶A;AF2， 阿尔法折叠 2;APD， 氨基肽酶结构域;周大福， 对比传递函数;帝斯曼 扩展部分;梅塔普， 蛋氨酸氨基肽酶;NAC， 新生多肽相关复合物;纳特， N-乙酰转移酶;.PDF 肽基脱模酶;RAC， 核糖体相关复合物;RNC， 核糖体新生链复合体;RTRNC， 核糖核酸酶I处理的核糖核酸酶;锡 液;SRP， 信号识别粒子;水龙头 串联亲和纯化;TEV， 烟草蚀刻病毒;TPR， 四三肽重复;陷阱 易位相关蛋白;wt， 野生型
介绍
在所有生命王国中，新生的多肽链一旦从核糖体出口隧道出现就会受到化学修饰。真核生物中最早和最常见的修饰是N-末端氨基酸的裂解和Nα-乙酰化，这两者都可以在新制备的多肽的靶向、折叠和稳定性中发挥重要作用。
绝大多数mRNA的翻译始于具有蛋氨酸结合引发剂tRNA（Met-tRNAi-Met）的AUG密码子，导致蛋氨酸成为大多数蛋白质的第一个氨基酸。当这种起始蛋氨酸之后跟着一个小的不带电荷的氨基酸，如Ala、Cys、Gly、Pro、Ser、Thr或Val，它通常被进化保守的蛋氨酸氨基肽酶（MetAPs）共翻译去除[1-3]。有两种类型的 MetAP。虽然I型在真细菌中发现，II型在古细菌中发现，但真核生物拥有两种类型的MetAP。这两种类型的不同之处在于II型酶催化域中的特征插入（约60aa）[4]。共同的催化结构域属于进化保守的金属蛋白酶家族，采用典型的氨基肽酶折叠，也称为“皮塔面包”蛋白酶折叠[5]。催化通常需要一个或两个二价阳离子（参见[6，7]）。与细菌MetAPs相比，真核MetAP1具有额外的N末端延伸，其中包含两个锌指结构域，一个无名指样Cys2-Cys2锌指（酵母中的aas 22至40）和一个与RNA结合锌指相关的Cys2-His2锌指（酵母中的aas 50至66）。这种延伸被认为对于酵母中核糖体上Map1的正确功能排列很重要[8]。真核II.型MetAPs还包含一个N末端延伸，带有带正电荷的富含Lys的拉伸[7，9]。
N-末端蛋氨酸去除的根本重要性反映在真细菌[10，11]和酵母[4]中所有MetAP编码基因缺失引起的致死性上。在面包酵母（酿酒酵母;酿酒酵母），Map1（I型MetAP）代表主要亚型，与map1无效突变体相比，mat2空突变体的拷贝数更高，生长表型更强[12-14]。Map1和Map2先前均被证明与核糖体结合[8，15]，并且Map1的核糖体相互作用被证明对盐敏感且独立于新生的多肽链。此外，通过交联研究将Map1相互作用区域映射到60S亚基的肽出口隧道外围，可能接触uL23和uL29覆盖的区域[16]。该位置与各种出口隧道结合因子的接触位点重叠，例如伴侣RAC（核糖体相关复合物）和NAC（新生多肽相关复合物），以及分泌途径因子SRP（信号识别颗粒）和Sec61蛋白传导通道。此外，由于ES27最长螺旋的缺失导致S中Map27和Map1核糖体关联的减少，因此提供了rRNA扩增片段ES2参与MAP与核糖体相互作用的证据。酿酒酵母[17，18]。
对于未修饰的新生肽以及蛋氨酸裂解后的新生肽，Nα-乙酰化是真核生物中另一种高度频繁的共翻译修饰。它由Nα-乙酰转移酶（NATs）催化，Nα-乙酰转移酶将乙酰基从乙酰辅酶A（乙酰辅酶A）转移到新兴新生链的α-氨基基团。除NatD外，核糖体相关NAT形成二聚体或三聚体异构体复合物，通常由一个小的催化和至少一个额外的大辅助亚基组成[19]。在人类中，存在19种NAT亚型：NatA至NatH，其中前三种亚型NatA、NatB和NatC乙酰化大多数底物蛋白[21-<>]。Nα-乙酰转移酶家族中最丰富的成员是NatA，它在引发蛋氨酸被MetAPs去除后，用N-末端Ser，Ala，Thr，Gly，Val或Cys修饰新生链。相反，NatB和NatC的Nα乙酰化没有引发剂蛋氨酸去除，因为它们直接乙酰化这种蛋氨酸，当随后是Asp，Glu，Asn或Grn（在NatB的情况下）或大的疏水残基，包括Leu，Ile，Phe和Tyr（在NatC的情况下）。
在酵母中，研究表明，虽然NatA的N-α-乙酰化似乎在全身适应控制中发挥作用，但NatB的修饰似乎对蛋白质折叠相当重要[22]。此外，NatB亚基耗竭至野生型水平的30%导致拟南芥生长减少50%[23]，人NatB催化域NAA20的错义突变被证明会导致常染色体隐性遗传发育迟缓、智力障碍和小头畸形，强调了NatB功能对细胞的重要性[24]。
鉴于底物特异性和引发剂蛋氨酸去除要求的差异，问题在于MetAPs和不同NAT对肽出口位点的访问如何在空间和时间上协调。在这里，最近与携带新生链的天然80S核糖体结合的酵母NatA的冷冻电镜结构表明，NatA通过与核糖体rRNA扩增片段（ESs）的相互作用直接锚定在出口隧道[25]。发现NatA处于空间排除其他共翻译作用伴侣（RAC/Ssb）、SRP以及Sec61伴随结合的位置。同样在最近，分别通过X射线晶体学和冷冻电镜测定了来自白色念珠菌[26]和人类NatB [27]以及嗜热毛壳虫Naa20与竞争性抑制剂[28]的结构。然而，对于真核MAP或其他NATs，在很大程度上缺乏关于其核糖体相互作用模式的结构信息，因此对出口隧道中这些因素的相互作用知之甚少。
在这里，我们介绍了新生链携带80S核糖体的冷冻电镜结构与Map1或来自S的NatB复合物复合物。酿酒会的总体分辨率分别为3.8至3.9 ?（对于Map1-80S）和3.1至3.8 ?（对于NatB-80S）。我们观察到Map1主要灵活地与动态rRNA扩增片段ES27a结合，该片段将其定位为直接并列肽出口隧道。这个位置将允许非常早期地遇到底物新生链，并在它们从核糖体隧道中出现时立即解释它们的修饰。此外，观察到的Map1结合模式可能排除了伴随的NatA结合，用于新N末端的后续Nα乙酰化。
尽管也被募集到肽隧道出口外围，但与NatA相比，NatB在出口位点显示出显着不同的结合模式。有趣的是，我们观察到NatB的两个拷贝，一个直接绑定在隧道出口站点下方并绑定到ES27a（NatB-1），另一个绑定到第二个通用适配器站点（UAS-II）以获取出口因子（NatB-2）[29]。与NatA相反，NatB-2也通过接触rRNA和核糖体蛋白eL31的刚性部分。对于这两种NatB，催化亚基位于隧道出口下方，使得新生链可以以大约55个氨基酸的长度与它们接合。然而，我们推测NatB-2更有可能与基质接合，而NatB-1可能通过ES2a定位NatB-27。
结果
Map1-核糖体复合物的冷冻电镜结构
内源性MetAP-核糖体复合物的冷冻电镜样品是从核糖体结合的TAP标记的Map1的天然拉出中获得的，基本上如前所述[25，30]（图1A和S1）。使用烟草蚀刻病毒（TEV）蛋白酶裂解Map1标签洗脱后，在冷冻网格制备之前，通过化学交联剂戊二醛处理稳定Map1-核糖体复合物。如之前在环己胺处理样品的天然拔出中观察到的[25，30]，3D分类显示程序化核糖体的类别主要处于易位前状态，tRNA存在于规范A和P位点，但也存在代表终止/预再循环复合物（具有eRF1和ABCE1）和闲置（无tRNA）核糖体（S2图）的类别（S27图）).值得注意的是，在大多数类别中，ES27a被发现在肽出口隧道（ES27-exit）下方的位置，并且连接到ES3a，我们观察到额外的密度到达肽出口隧道。我们加入了这些类，并使用出口隧道/ ES27a区域的软掩码对它们进行了集中的27D分类。两类富集，显示出突出的球状非核糖体额外密度附着在肽出口下方不同构象的ES27a上。这两类主要区别在于ES1a的位置及其附着的非核糖体密度，但在整体核糖体状态上没有差异。尽管由于其灵活性，无法更好地解决额外的密度，但基于其位置，整体形状和尺寸，我们将其分配给Map1（图1B，2C和S27）。作为Map1主要结合位点的出口位置的ES27a与缺失实验一致，其中ES1a的尖端缩短，导致核糖体相关Map17水平降低[18，1]。此外，我们的分配与基于化学交联的生化发现一致，显示Map29接近uL16，uL<>是一种位于隧道出口附近的蛋白质[<>]。
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图1. Map1的冷冻电镜结构通过扩增段ES27a与核糖体结合。
(A） 从 Map1-TAP 亲和纯化中获得的浓缩洗脱液显示在 12% Nu-PAGE 上。质谱分析证实了Map1和核糖体蛋白的存在。来自病毒蛋白的污染标有星号。有关原始凝胶图像，请参阅 S1 原始图像。（B）Map1与两种不同构象的翻译80S核糖体复合物中的冷冻电镜结构（左：Map1-C1-80S;中：Map1-C2-80S;右：肽出口隧道的底部视图）。地图根据当地分辨率进行过滤。在最终的CTF精炼后提取分离的密度。（C） 底部视图的卡通表示，如 （B） 所示，带有叠加（左）和单独的视图（右）。（D）Map2的AlphaFold 1模型被安装到密度中，显示为前视图。使用高斯低通滤波器将映射滤波到20 ?。（E-H）隧道出口上的两个视图突出显示了Map1-C1（E，G）和Map1-C2（F，H）相对于核糖体蛋白质周围隧道出口的位置，如下图所示。（I）体外结合测定解决ES27a对核糖体-Map1结合的贡献。使用重组Map1和纯化的RNaseI处理（rtRNC）或未处理的RNC的造粒测定样品应用于15%SDS-PAGE。仅对于Map1，显示上清液（SN）级分，对于所有其他样品，显示沉淀（P）级分。Map1与核糖体的共沉淀通过密度测定法定量。当ESs被RNAseI消化时，与Map1与未处理的40S核糖体的结合相比，Map1结合显着降低至约80%。TE：隧道出口。ZF：锌指域。APD：氨基肽酶结构域。Map1-C1：浅绿色，Map1-C2：深绿色，eL22：紫色，H59：橙色，40S SU：浅黄色，60S SU：灰色，ES27a：青色，tRNA：深蓝色，新生链（NC）：粉红色。有关原始凝胶图像，请参见S1原始图像，有关定量基础数值数据，请参阅S1数据。
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虽然这两个类别都可以分别细化到3.8和3.9 ?的整体分辨率（称为Map1-C1-80S和Map1-C2-80S），但绑定到ES1a的Map27的局部分辨率仅限于7 ?及以下（S3图）。这表明Map1-核糖体相互作用具有高度的灵活性，部分原因可能是其结合伙伴ES27a的灵活性，它可以覆盖隧道出口部位和L1突起之间的连续构象空间[31]。然而，由于在RELION中使用多体方法的局部细化尝试也失败了，我们得出结论，ES27a的灵活性不仅会阻止更高的分辨率，而且Map1本身与ES27a的结合是灵活的。因此，我们无法获得为包含ES27a和Map1的区域构建分子模型所需的更高局部分辨率。
在这两类中，Map1在出口隧道的位置与参与1S亚基生物发生、酵母Arx60（与核糖体出口复合蛋白1相关）和人EBP1（ErbB1结合蛋白3）的Map1同系物相似[32-35]。此外，Map1-C1与来自大肠杆菌的PDF-Map-70S核糖体复合物中可视化的细菌Map很好地叠加[36]（S4图）。
因此，尽管分辨率相当低，但重建使我们能够将AlphaFold 1（AF2）[2]生成的Map37模型拟合到各自的密度中，从而提供了Map1相对于核糖体的整体定位的想法（图1D）。拟合由核糖体结合的EBP1的高分辨率冷冻电镜结构引导[34，35，38]（S4图）。在将人类80S-EBP1模型拟合到我们的密度中以确定Map1的整体方向后，我们将Map2的AF1模型叠加在一起，刚体将其单独拟合到孤立的密度中（图1D和S5A-S5D）。这导致Map1的球状氨基肽酶结构域（APD）位于与ES27a和H59接触的肽出口隧道下方。APD的密度从UAS II（包括eL31和eL22）到UAS I（包括uL23和uL29）（图1E-1H）[29]，因此与已发表的交联数据一致[16]。此外，新生链的密度是可见的，代表了通过原生拉出获得的新生链的组成和长度的广泛变化。因此，无法解决新生链的性质和长度差异对两个观察到的Map1状态的可能影响。
除了大的APD之外，AF2还预测了Map1的两个锌指（ZF）结构域的结构，其位置与我们的地图中观察到的额外密度一致，将锌指定位在核糖体蛋白eL22附近（图1D-1F）。
如上所述，ES27a是Map1与60S核糖体亚基的主要接触位点。ES27由三个A螺旋组成，它们可以在连接rRNA螺旋H63，ES27a和ES27b的三向连接周围灵活地改变它们的位置（根据Petrov及其同事[39]的命名法）。最长的螺旋，ES27a，因此经历了最严重的构象变化。到目前为止，在酵母中，已知两个主要位置，一个ES27a的尖端朝向1S的L60柄（L1位置），另一个面向肽出口隧道（出口位置）[31]。有趣的是，当与Map27结合时，我们在两种新颖的稳定构象中观察到ES1a-exit。与ES27a结合的NatA配合物相比，在Map1配合物中，ES27a以三向结作为枢轴旋转31度（构象1），构象19旋转2度（S6图）。
为了确认ES27a对Map1核糖体结合的主要贡献，我们用纯化的Map1和核糖体新生链复合物（RNC）或RNaseI处理的RNC（rtRNC）进行了体外结合测定，就像之前对NatA所做的那样[25]。如前所述，在rtRNCs中，rRNA ES被RNAseI处理剪掉[25]。与未经处理的RNC相比，Map1与rtRNC的结合显着降低了约60%，再次证实了ES27a是Map1募集到核糖体出口位点的主要结合位点（图1I）。
综上所述，我们的分析表明，Map1主要通过与动态rRNA ES80a的柔性结合与核糖体隧道出口附近的27S核糖体结合。这使得Map1处于理想的位置，一旦新生的多肽链从核糖体隧道进入细胞质，就可以作用于它们。
NatB-核糖体复合物的冷冻电镜结构
为了进一步了解蛋氨酸裂解和N-乙酰化之间的协调，我们遵循了使用纯化组分的体外复溶方法。我们纯化了携带完善的NatB底物的RNC作为新生链，其中游离N末端以氨基酸序列MDEL（RNC）结束MDEL).相同的序列以CoA-Ac-MDEL抑制剂的形式用于与嗜热毛壳体Naa20共结晶[28]。高盐洗RNCMDEL用重组纯化的NatB（Naa18 / Naa25）过量20×摩尔复溶，并进行冷冻电镜和单颗粒分析（S7图）。CryoSPARC 中的 3D 变异性分析和对出口隧道区域的集中分选揭示了与 80S 核糖体相关的 NatB 复合物具有额外密度的类别，但显示出高度的组成和构象异质性（S8 图）。包含对应于NatB的额外密度的类别可以分为两组：一组具有仅用于灵活连接到ES1a的NatB拷贝（NatB-20;由Naa1-25和Naa1-27组成）的额外密度，另一组具有与UAS-II结合的第二个NatB复合物的额外密度[29]（图2A）。第二个NatB复合物（以下简称NatB-2）在其存在的类别中通常表现出较低的构象方差，并且它与核糖体的相互作用得到了很好的解决。为了解决ES27a结合的NatB-1表现出更大的构象异质性的事实，我们对这种密度进行了集中分选，揭示了一类（9.645个颗粒），其中两个NatB复合物都显示出二级结构分辨率。在这里，ES27a结合的NatB-1复合物位于NatB-2附近，并且表现出比其他类别低得多的构象灵活性。该类（I类）被改进为最终总分辨率为3.8 ?（NatB配合物的局部分辨率范围约为4至9 ?;S9 图，左图），它明确揭示了两个 NatB 复合体的架构。此外，我们对所有含有NatB-2（和柔性NatB-1）的颗粒进行了3D变异性分析，重点是NatB-2区域，产生了一类（II类）含有特别好的分辨率NatB-2（45.530个颗粒），并将该类改进为3.1 ?的整体分辨率（NatB-3的局部分辨率范围从6到2 ?;S9 图，右图）。
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图2. 冷冻电镜结构和NatB-核糖体复合物模型。
(A） 显示 NatB 与翻译 80S 核糖体复合物中的冷冻电镜结构的复合图（RNCMDEl） 根据本地分辨率进行过滤。在最终精炼后提取了NatB-1（来自I类）和NatB-2（来自II类）的分离密度。视图显示在肽隧道出口（左;底视图）、水平旋转 70°（中;前视图）和垂直旋转 60°（右;侧视图）。（B）放大肽出口位点，在前面（左）和侧视图（右）显示NatB-核糖体分子模型（NatB-1和NatB-2），如（A）所示。概述（左上图（C））和放大视图（D-F），重点是Naa25-2核糖体接触位点。图中显示了Naa35-25 C末端的（D）螺旋α2与H100/101和H94/98结的相互作用，（E）Naa25-2 α34-α35环（Lys720）与eL6 N端的Asp31的相互作用，以及Naa791-794的C端（α36）处的Lys25和Arg2与H3153/3293结内的U94和U98的相互作用。为清楚起见，省略了NatB-1。（G）与（C）相同的视图显示了密度停靠的NatB-2核糖体复合物的模型，并突出显示了Naa25-2 C末端（橙色）。（H） Naa25 C型终点站模型，突出了四个阳性斑块（PP）的位置。如所示，所有贴剂都含有两种带电氨基酸。产生电荷反转双突变体（PP1，PP3，PP4和PPall）。（I） 使用重组野生型或突变型 NatB 复合物和闲置 （80S） 或 RNaseI 处理的 80S 核糖体 （rt80S） 对沉降测定（一式三份）进行蛋白质印迹分析。上图：通过蛋白质印迹图像的密度分析定量的与核糖体结合的NatB部分。下图：代表性蛋白质印迹，显示两个此类实验的上清液（SN）和沉淀（P）级分。有关所有原始蛋白质印迹图像，请参见S1原始图像，有关定量基础的数值数据，请参阅S1数据。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001995.g002
这揭示了核糖体近端区域的α螺旋二级结构，并使我们能够明确地鉴定出含有Naa25亚基的圆盘形α螺旋四肽重复序列（TPR）对于I类中两种核糖体结合的NatB（S5E-S5J图）。我们进一步注意到球状催化Naa20亚基的分离度较差（与Naa25相比），这表明了灵活性，特别是在ES27a结合的NatB-1中。然后，我们对与C晶体结构高度相似的AF2模型进行了刚体拟合。白色国家乙 （PDB 5K18） [26]。简而言之，Naa12的0个四重（TPR-）重复序列（α29-α25）及其C端螺旋结构域（α30-α36）形成环状结构，N端和C端靠近。Naa20位于由Naa25 TPR重复形成的圆形口袋中并从中突出。这种结构只需对两种NatB密度进行微小调整即可拟合（S5E-S5J图和S1表）。
总体而言，两种NatB密度覆盖了从ES60a到第二个UAS的出口因子（eL27和uL31）的22S出口位点以下的区域[29]。NatB-1锚定在59S rRNA的H25和ES27a A螺旋的长臂之间（图2B）。在这里，接触通过夹在两个rRNA元件之间的Naa25-1 N端TPR（TPR1和2）的环建立。与ES27a尖端的另一个接触由Naa25-1 C末端（α34-α36）的TPR螺旋建立。在这种构象中，催化亚基Naa20-1朝向出口隧道，但密度仅在与Naa25-1（包括Naa2的高度保守的Thr48和Glu20以及Naa296的Arg25）的保守接触界面处可见[40]，表明它在很大程度上是离域的。
NatB-2锚定在核糖体表面，与60S的隧道出口有些偏移，并且布置使得两个催化Naa20亚基彼此面对。与NatB-1相反，在这种情况下，核糖体接触主要通过rRNA建立，但也通过核糖体蛋白eL31建立，但仅涉及Naa25-2的C端TPR（图2C）。详细地说，在对NatB-25（II类）进行重点细化后，我们确定了Naa2-2与图中核糖体出口位点的三个不同的相互作用位点：第一个位点围绕100S rRNA的H101和H25的连接以及Naa35-25的α2的N末端部分（图2D）建立，其中包含一系列带正电荷的氨基酸（Lys725， Lys729、Lys732 和 Lys736）。第二个接触位点位于α25和α2之间的环中的Naa720-34 Lys35与核糖体蛋白eL6的N末端的Asp31之间建立（图2E）。
第三个位点包括H94和H98交界处的碱基，它们结合Naa36-25的C末端（α2）（图2F）。在这里，H3153/3293结内的碱基U94和U98在Naa791-794的C端由Lys 25和Arg2接触，可能是通过阳离子π堆栈。
为了测试上述残基对核糖体结合的贡献，我们在Naa25的C末端选择了阳性斑块（每个贴片包含两个紧密间隔的碱性氨基酸）（图2G）和同一区域的不相关的阳性斑块（Lys 747和Lys 751）。我们为每个贴片（PP1至PP4;图2H）或用于所有补丁（PPall），类似于文献[41]中所述。纯化的野生型（wt）和突变的NatB复合物在Naa25上携带N端His标签（用于蛋白质印迹检测）用于体外结合测定。为了防止特定新生链的任何偏差，我们在这些测定中选择了纯化的闲置80S核糖体而不是RNC（S7图）。蛋白质印迹分析显示，K80E、K723E（阳性贴片PP725;1%的wt结合）和K47E、R791E（PP794;4%）突变显著降低了NatB与31S核糖体的结合，而在我们的结构中不直接参与核糖体结合的K747E、K751E仅显示出非常弱的效果（PP3;83%）。当所有阳性贴片（PPall）发生突变时，结合几乎完全消除（wt结合的6%），证实了这些阳性贴片对NatB与核糖体相互作用的贡献（图2I）。这表明Naa25 C末端表面的正电荷通过建立用于rRNA相互作用的复合结合贴片对核糖体结合具有加性作用。这些结合测定的结果证实了所描述的Naa25和核糖体之间相互作用斑块的重要性。在Naa25-1中，这些带正电荷的氨基酸与ES27a相互作用，而在Naa25-2中，它们能够与H94 / H98和H100 / H101连接结合（图2D-2F）。
有趣的是，正如在NatA和Map1中观察到的那样，在显示具有两个NatB配合物（I类）的稳定组装的类别中，ES27a采用了特定的构象。与ES1a最接近隧道出口的Map1-C27位置相比，NatB绑定位置与隧道出口旋转37°（S6图）。
因此，我们通过使用空的80S或RNAse-I处理的80S（如[25]所述和图1I中的Map1去除ES）进行定量结合测定来评估ESs对NatB结合的贡献（S7图）。与NatB与未经处理的8S核糖体的结合相比，ES的缺失确实将NatB的结合降低到80%，证实了ES在将两个NatB拷贝募集到核糖体中的重要作用（图2I）。
接下来，我们将核糖体结合的NatB-1和NatB-2与NatA复合物进行了比较。在此，提出了几点意见。（i）出口位点下方占用的整体空间是重叠的，表明在观察到的构象中，NatA和NatB只能完全结合（图3A）。（ii）核糖体结合的NatB的结构与NatA-核糖体复合物明显不同，并显示出独特的60S结合模式。NatA主要采用25S rRNA ES进行60S结合。在这里，ES27a和ES39将辅助Naa15（Nat1）亚基锚定在出口位点，Naa50（Nat5）——在NatB中没有等价物——与ES7进行第三次接触。虽然NatB-1也与ES27a结合，但2S的NatB-60结合与NatA结合不同，不涉及ES27a或其他ES。（iii）与NatA复合物的催化亚基Naa10（Ard1）一样，NatB的Naa20-1和Naa20-2都与核糖体没有直接接触。我们进一步注意到，Naa20-2 的解析效果更好，而 Naa20-1 除了与 Naa25-1 的接触位点外，在很大程度上是离域的。值得注意的是，NatB-2模型与NatB-1的刚体配合会导致Naa20-1和Naa25-2之间的冲突，这表明与NatB-20（和X射线结构[1]）相比，Naa25-2需要调整其相对于Naa26的方向。然而，为了评估它们贡献催化活性的主要潜力，我们将Naa20-1的这种刚体拟合与我们的Nat20-2和Naa10模型进行了比较，因为它代表了Naa20-1整体位置的足够准确的近似值（图3C和S10）。
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图3. 核糖体结合的NatB和NatA复合物的比较。
(A） 底视图（上图）和前视图（下图）显示了 NatB-1（粉红色）和 NatB-2（橙色）核糖体结构的叠加，核糖体结合的 NatA（亮绿色）具有分离密度 （EMD-0201;（25]）。 （B）NatA和NatB-2催化亚基（Naa10和Naa20）相对于60S亚基的位置比较，如正面和俯视图所示。显示了乙酰辅酶A（Ac-CoA）的位置和新生链的假定模型。为清楚起见，仅显示了NatB-20的Naa2。（C） 左图：NatB 核糖体冷冻电镜图的切口前视图，突出显示新生多肽链以及 NatB-1 和 NatB-2 的位置（左图）。右图：放大视图突出显示了催化 Naa20-2 亚基，并说明了新生链到达 Naa20-2 活性位点必须跨越的最小距离。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001995.g003
有趣的是，假设从tRNA的55′-CCA端到隧道出口并从那里进入Naa3催化中心（出口隧道内20 aa，出口隧道外30 aa）的新生链需要大致相同的最小长度才能到达任何一个催化中心（图25C）。Naa3-20在乙酰辅酶A的位置和新生链N末端的可及性方面与NatA [2]的Naa10相似（图25B和3C）。虽然基板可以从隧道出口以直线路径进入Naa3-20，但它需要形成一个转弯才能到达Naa2-20的中心，其入口位于侧面（S1图）。因此，Naa10的两个拷贝（在NatB-20和NatB-1中）原则上都可以具有催化活性。然而，考虑到Naa2-20相对于其辅助亚基的离域和高度灵活性，与定位更稳定的Naa1-20相比，并且考虑到新生链可以采取更直接的途径进入Naa2-20，我们推测Naa2-20而不是Naa2-20将作用于N-乙酰化大多数NatB底物。
虽然 NatA 和 NatB 的结合似乎是相互排斥的，但我们想知道在多大程度上允许 Map1 的伴随结合。与前面所述[25]不同，结合模式的比较表明，C1和C1位置的Map2可能会与NatA发生冲突，尽管Map1-C1和NatA之间的冲突相当小。然而，两个NatB复合体，特别是ES27a结合的NatB-1，将与两个观察到的Map1位置严重重叠（S11图）。因此，这种比较对于Map1和NAT的竞争性结合相当有启发性。这一观点得到了ES27a取向对于每个配体显然不同的观察结果的进一步支持。
讨论
在新生多肽的翻译过程中，各种因子与核糖体肽出口位点动态相互作用，以探测新兴新生链的生化和生物物理特性。例如，修饰酶Map1和NAT的活性取决于N端蛋氨酸之后氨基酸的性质。含有Hsp70同系物Ssz1的核糖体相关复合物RAC结合各种（部分展开的）新生链，而SRP识别疏水的，部分螺旋的N端信号序列。
通常，所有这些因子都能够与核糖体相互作用，即使在没有新生链的情况下，也能使用快速的开和关速率来扫描核糖体以寻找新兴的新生链底物。然而，许多结构研究表明，核糖体上大多数出口位点因子的结合位点是重叠的。基于这些结构，NatA、RAC或SRP都不能与出口位点结合，至少在观察到的构象中不能结合。这意味着这些因素在新生链上的动态和顺序或协作核糖体相互作用和活性取决于同源新生链N末端底物的存在，这将改变各个因子的明显脱落率（参见图4中的方案）。这在SRP中得到了最好的记录，SRP在初次接触后，在整个靶向周期中仍与RNC结合，但只有在参与足够疏水的信号序列之后[42-44]。
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图4. 描述核糖体出口位点因素可能相互作用的方案。
暴露新生多肽链的翻译核糖体由主要出口位点因子（NAC，Map1，NatB，SRP）参与，具体取决于新兴链N末端的性质。在这些主要因子发挥其活性后，次要因子（例如，NatA，RAC，Sec61）可以访问新生链。虽然其中一些可以在核糖体上共存（例如，NatA和Map1-C1或NAC和SRP），但其他不能或必须顺序结合（例如，NatA和NatB）。ES：扩增段，RNC：核糖体新生链复合物。隧道出口由黄色虚线圆圈表示。因子的颜色代码和电子显微镜数据库（EMD）的条目代码如下。EMD 2844 的参考编号为 [45]，EMD 6105 的参考编号为 [46]，EMD 1651 的参考编号为 [47]，EMD 4938 的参考编号为 [48]。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001995.g004
这项研究调查了Map1和NatB的核糖体结合，扩展了我们对核糖体上的退出位点因子如何由动态rRNA扩增片段ES27a协调的知识。我们注意到，正如在NatA复合物中观察到的那样，Map1和NatB直接与ES27a结合，并有趣地将rRNA A螺旋定位在相对于隧道出口的非常特定的构象中（见S6图）。切割N端蛋氨酸的Map1可能是最早的新生链结合剂之一，因为至少对于细菌MAP而言，一旦新生链达到44个氨基酸的长度，就会发生切割[49]。我们发现它主要与ES27a结合，并且能够富集两种不同的构象，使ES1a的Map27结合尖端比NatA更接近隧道出口。相反，当与两个NatB配合物结合时，ES27a比NatA结合时离隧道出口更远。因此，我们假设ES27a通过采用退出因子特异性构象，在为不同因子提供特异性和可能排他性结合方面发挥作用。
除了ES27a相互作用外，大多数出口位点因子利用静电相互作用与25S/28S rRNA结合。例如，带正电荷的斑片存在于NAC [29，48，50]、NatA、细菌Map[49]和RAC/Ssb1复合物中[46，51，52]。有趣的是，核糖体上的精确静电相互作用位点因因素而异。NatA和NatB都在其含有TPR重复的亚基上使用带电贴片。NatA 的 Naa15 接触由 rRNA H24 和 H47 形成的结合口袋，靠近 eL31 与其带电的 N 末端，以及靠近 ES39 的区域（H98-H100 区域）与其 C 末端的赖氨酸斑块接触。如上所述，我们结构中的两个Naa25亚基都使用带正电荷的贴片与rRNA结合，其中Naa25-2与Naa2（NatA）相似但不相同的退出位点区域（见图2C-15F），因此显示出不同的特异性结合模式。
我们提出了一个模型，根据该模型，退出位点因素Map1，NatA和NatB都需要与ES27a的柔性臂相互作用。然而，此外，这些因子与核糖体出口位点的结合专门定位于因子本身以及ES27a处于不同的状态，从而能够探测新生链作为潜在底物的性质。
因此，我们推测，与翻译因子的移动P-s茎类似[53-55]，ES27a可能是修饰酶的主要结合枢纽，使它们保持与新生链底物附近以探测其性质。然后可以通过因子特异性相互作用发生更刚性的核糖体结合，主要涉及与出口位点rRNA的静电相互作用，导致ES27a的特异性固定和暂时排除其他竞争性出口位点因子。
NatA介导的N-乙酰化的底物需要事先通过Map1去除第一个蛋氨酸，而对于NatB活性，N-末端蛋氨酸仍然需要存在。有趣的是，在我们的结构中，我们观察到NatB的两个拷贝，一个在肽出口隧道旁边（在UAS-II）旁边刚性结合，与ES27a没有接触，另一个主要与ES27a更灵活地结合。我们进一步表明，ES27a的存在对于两种NatB与核糖体结合是必要的（图2I），因为RNaseI去除ES27a几乎完全消除了核糖体结合。这表明NatB-2（不接触ES27a）的空间约束和正确定位可能取决于NatB-1和ES27a的存在。观察结果进一步支持了这一点，即在分类过程中，所有显示NatB-2的类别在ES1a也含有额外的NatB-27密度，而并非所有显示NatB-1的类别都显示NatB-2。这开启了NatB-1首先通过ES27a与核糖体结合的可能性，并且需要将NatB-2稳定地放置在隧道出口旁边。这类似于最近的一项研究表明，NAC和SRP等退出因素原则上可以合作[56]。对于共翻译ER靶向，NAC充当守门人，屏蔽新生链，这些链不是SRP的底物，同时促进SRP募集到核糖体。另一项研究表明，易位相关蛋白（TRAP）可能有助于将核糖体募集到ER，随后有助于稳定RNC-Sec61复合物，并有助于膜蛋白的生物发生[57]。
与NatB相反，NatA和Map1-C1的伴随结合，但不是Map1-C2，仍然是可能的，因为它们几乎不会发生空间冲突（S11图）。有趣的是，细菌Map在靠近出口隧道的核糖体表面也占据了两个不同的位置，其中只有一个允许同时结合肽基-变形酶（PDF）[36]。鉴于酵母Map1主要通过ES27a与核糖体结合，并且其位置取决于ES27a运动，我们倾向于Map1-NatA相互作用的模型，其中ES27a协调Map1和NatA在其底物上的顺序作用。这与我们在核糖体上一起可视化Map1和NatA的所有尝试的失败一致。
在核糖体上观察到两个NatB拷贝有点令人费解的一个可能原因可能反映了Map1，NatA和NatB底物之间有效区分的功能。在本研究中讨论的共翻译作用的新生链修饰因子中，Map1是最丰富的蛋白质（根据酵母基因组数据库（www.yeastgenome.org;14，218 +/? 5，474），其次是NatA（Naa15;8，398 +/- 4，076）和NatB（Naa25;5，693 +/-1，503）。因此，RNC 被 Map1 或 NatA 探测的可能性更高。然而，如果第一个NatB与具有空置ES27a的RNC结合，它将自动排除Map1或NatA（重新）结合，从而将该RNC作为第二个（可能是催化活性）NatB-2的可能底物。然而，在这一点上，我们无法清楚地决定两个或只有一个NatB拷贝在修改新生链时是活跃的。考虑到观察到的NatB-20的Naa1的构象变形以及新生链到其催化亚基的相当模糊的路径，我们推测NatB-2可能是提供大部分修饰活性的更活跃的复合物。
综上所述，我们建议新生链的主要和次要相互作用者（见图4）可以遵循协作模式（如NAC和SRP的情况）或顺序模式（如Map1和NatA的情况），以实现各种修饰酶的生产性相互作用。至少对于新生的链修饰酶，ES27a在核糖体肽出口位点的募集和编排中起着核心作用。然而，为了完全理解，有必要定量评估与新生链依赖性RNC结合和解离相关的不同修饰，伴侣和靶向因子的动力学特性。
材料和方法
重组Map1的纯化
包含 N 端 His 的 Map18-标签后跟接头和HRV 3C切割位点，由pET28a载体表达。通过在 SCL6000 转子 （Sorvall） 中以 10，4 rpm 和 500°C 离心 4 分钟收获大肠杆菌细胞。 用1×PBS洗涤后，将沉淀重悬于冷裂解缓冲液（50mM Tris（pH 8.0），500mM NaCl，1mM PMSF，1无EDTA蛋白酶抑制剂鸡尾酒丸/ 50ml（罗氏））中，并使用微流化器（微流体）进行机械裂解。在15°C的SS15转子（Sorvall）中以000，34rpm旋转4分钟后获得澄清的裂解物。 过滤裂解物后，将其应用于用HT-20缓冲液（50 mM Tris（pH 7.5），500 mM NaCl，20 mM咪唑，10 mM β-巯基乙醇）平衡的HisTrap HP色谱柱（GE医疗）。在高盐条件下用HRV 3C蛋白酶洗脱后，将主要馏分上样到SP FF色谱柱（GE医疗）上，该色谱柱与pH 20.7的0 mM HEPES平衡。通过高达1 M NaCl的线性盐梯度进行洗脱，汇集显示纯化Map1蛋白的主要级分，并将缓冲液调节至20 mM HEPES（pH 7.5），100 mM KOAc，2.5 mM Mg（OAc）2，1 mM DTT，0.5 mM PMSF，10 μg/ ml环己酰亚胺，包括蛋白酶抑制剂鸡尾酒片剂（罗氏）。
重组NatB复合物的纯化
Naa25 包含一个 N 端 His。8-标签后跟接头和HRV 3C切割位点，从pRSFDuet-1载体（Novagen）的MCS1表达。编码 Naa25 的催化无活性 E74A 和 H20A 双突变体的密码子优化版本的基因 [26] 用于 E。大肠杆菌表达由Eurofins合成。引入了额外的M36L突变以防止内部翻译启动。该修饰的NAA20基因被克隆到同一pRSFDuet-2载体的MCS1中。为了克服助剂与催化亚基的比例失调，Naa20也被单独克隆到pET21a中，并与二聚体NatB构建体共表达。将两种质粒转化为E后。大肠杆菌BL21（DE3）细胞，培养物在LB培养基中生长，并在1°C下用16mM IPTG进行诱导过夜。收获和裂解物制备按照Map1的描述进行。
按照制造商的方案通过Ni-NTA纯化NatB及其突变体（PP1至PPall），不同之处在于洗涤后的蛋白质在50 mM MES（pH 6.0），500 mM NaCl和500 mM咪唑中洗脱。洗脱的NatB随后在GF缓冲液（200 mM MES （pH 10.6）、0 mM KOAc、400 mM Mg（OAc））中的Superdex 5（GE医疗）上进行体积排阻色谱2和 1 mM DTT）。使用Ultra-4离心过滤装置（Amicon，MWCO 50 kDa）汇集和浓缩含有NatB的馏分，并储存在-80°C的GF缓冲液中。
对于冷冻电镜样品，His标签被3C蛋白酶去除。约 200 微克他的8-NatB在GF缓冲液中与25μg他的孵育6-3C 蛋白酶在 45°C 下在转动轮上 20 分钟。劈开了他的8-标签和他的6-3C蛋白酶使用10μl磁珠去除（His标签分离和下拉;赛默飞世尔），上清液用于重建NatB-RNCMDEL复杂，适用于单颗粒分析。
电荷反转突变体NatB复合物的产生和纯化
Naa25上的几个阳性贴片被确定为核糖体结合的潜在候选者：包含K1和K723的补丁725，包含K2和K729的补丁736，包含K3和K747的补丁751，以及包含K4和R791的补丁794。我们生成了所有四个阳性斑块（PP1至PP4）突变为E的电荷反转突变体（类似于Magin及其同事[41]），以及一个所有PP氨基酸突变为E的突变体。DNA序列中的突变是通过PCR引入的。为此，使用引入电荷反转的引物扩增含有NAA1插入片段的pRSFDuet-25载体（见上文）。根据制造商手册进行现场定向诱变。表达和纯化的方法与上述相同。
纯化天然Map1-核糖体复合物
对于Map1-核糖体复合物的天然拉出，一个S。表达来自Euroscarf（基因型SC1;马塔;乌拉圭0000-3;列伊52-2，3;YLR112c：：TAP-KlURA244;使用入藏号SC3）。将细胞在YPD培养基中生长至OD600将4.0和5g湿细胞重悬于裂解缓冲液（LB-2.5;20 mM HEPES （pH 7.5），100 mM KOAc，2.5 mM Mg（OAc）2，1 mM DTT，0.5 mM PMSF，10 μg/ ml环己胺，蛋白酶抑制剂鸡尾酒片（罗氏））。使用冷冻机（6970 EFM）进行细胞破碎。将粉末重悬于15ml LB-2.5中，裂解物在15°C下在SS-4转子（Sorvall）中以34，15rpm旋转000分钟以澄清裂解物。将SN加载到几个600μl蔗糖垫（LB-750.2中的5mM蔗糖）上，并在1°C的TLA 100.000（Sorvall）中以100，3rpm离心4小时。 将沉淀重悬于LB-2.5中并汇集以进行随后的TAP纯化。将大约 150 μl 磁性 IgG 偶联 Dynabeads M-270 环氧树脂（生命技术）与含有 300.2% TritonX-5 （LB-0.5+T） 的 100 μl LB-2.5 平衡两次并添加到混合样品中。将样品与珠子在1°C下在旋转轮上孵育4小时，在磁铁上收获，并重悬于500μlLB-2.5 + T中。用500μlLB-2.5洗涤步骤三个洗涤步骤和用500μlLB-2.5（样品：W4-6）洗涤步骤三个后，将核糖体-Map1复合物在含有120单位Ac-TEV蛋白酶（赛默飞世尔）的2μlLB-5.70中洗脱1小时在20°C下。 浓度为 14 A260/ml是在NanoDrop（Implen）上测量的。随后在12%Nu-PAGE凝胶上分析样品，然后进行蛋白质印迹分析。
天然Map1-核糖体复合物的质谱
在30°C下使用55 mM二硫代赤藓糖醇（DTE）在45 mM NH中将蛋白质在凝胶内还原50分钟4HCO3.半胱氨酸在室温下在30mM碘乙酰胺/ 100mM NH中氨基甲酰甲基化50分钟4HCO3.用37 ng猪胰蛋白酶在70°C下进行凝胶内消化过夜（美国威斯康星州菲奇堡Promega）。使用70%乙腈提取肽。在液相色谱之前，使用SpeedVac真空浓缩器对样品进行干燥。肽色谱在Ultimate 3000纳米液相色谱系统（赛默飞世尔科技）上使用EasySpray分离柱（PepMap RSLC C18，长50 cm，内径75 μm ID，赛默飞世尔科技）以250 nl/min的流速进行。作为溶剂A，使用0.1%甲酸。色谱法在3分钟内测定25%至0%溶剂B（1.30%甲酸乙腈溶液）的梯度，在25分钟内测定40%至5%B的梯度。质谱分析在Q Exactive HF-X质谱仪（赛默飞世尔科技）上使用前12种数据依赖性采集方法进行。使用MASCOT V2.4（Matrix Science，英国伦敦）和S搜索光谱。UniProt 数据库的酿酒会子集。结果被过滤为FDR <1%。
核糖体新生链复合物的体外翻译和纯化
核糖体新生链复合物在无细胞酵母翻译提取物中对mRNA报告基因进行体外翻译后纯化。对于用 Map1 重构，前面描述的截断的 uL4 构造 [25] 包含一个 N 端 His8-HA标签用于纯化和免疫印迹，然后使用TEV切割位点，使用uL64的前4个氨基酸和“CMV”停滞序列（His-HA-TEV-CMV-uL4 mRNA）。为了用NatB重构，上述结构被修改为NatB底物的代码。uL4的前五个残基被MDEL序列取代，MDEL序列前面有一个8-V5标签，后跟Xa因子切割位点。
His-V5-Xa-CMV-uL4 mRNA和His-HA-TEV-CMV-uL4 mRNA是使用T7消息机套件（Thermo Fisher）生产的。用于制备 uL4-CMV-RNC 或 uL4-CMV-RNCMDEL，使用来自ski2Δ细胞（用于uL4-RNC）或BY4741细胞（用于uL4-RNC）的无酵母翻译提取物对核糖体进行编程MDEL).如前所述，体外翻译在17°C下进行75分钟，并通过加入200μg/ ml环己酰亚胺（仅适用于uL4-CMV-RNC）停止。uL4-CMV-RNC使用磁性Ni-NTA磁珠（Dynabeads）进行亲和纯化。为此，将翻译反应与预平衡的Dynabeads在250缓冲液（50 mM Tris/HCl （pH 7.0），250 mM KOAc，25 mM Mg（OAc））中混合2、5 mM β-巯基乙醇、250 mM 蔗糖、10 μg/ml 环己胺、0.1% Nikkol、0.1% 不含 EDTA 的蛋白酶抑制剂鸡尾酒丸（罗氏）、0.1% 超级酶-In、20 U/l（赛默飞世尔）），含 10 μg ml?1酵母tRNA混合物（Sigma-Aldrich）在15°C下4分钟，使用800μl珠子浆液用于1，250μl样品。将珠状树脂用3缓冲液洗涤4至250次。使用250缓冲液和350mM咪唑在5分钟内进行洗脱。将样品上样到400μl高盐蔗糖垫（1M蔗糖50mM Tris/HCl（pH 7.0），500mM KOAc，25mM Mg（OAc）2，5mM β-巯基乙醇，10μg/ ml环己酰胺，0.1%Nikkol，0.1%无EDTA蛋白酶抑制剂鸡尾酒丸（罗氏））和核糖体通过使用TLA 120.2转子（贝克曼）在45，100rpm和000°C下离心4分钟，并在摇动时在冰上的30μl 250缓冲液中重悬30分钟。随后，在室温下使用TEV蛋白酶在250缓冲液中裂解N-末端His-HA标签45分钟。将混合物再次在TLA 600转子（贝克曼）中的100μl蔗糖垫中以45，100rpm和000°C旋转4分钟。 之后，将沉淀重悬于30μl网格缓冲液（20mM Tris / HCl（pH 7.0），50mM KOAc，2.5mM Mg（OAc）2，1 mM DTT，125 mM 蔗糖，100 μg/mL 环己胺，0.05% Nikkol）在冰上摇动 30 至 45 分钟。
uL4-CMV-RNCMDEL如上所述，通过以下修改进行纯化：在所有缓冲液中，使用50 mM HEPES/KOAc（pH 7.5）代替Tris/HCl（pH 7.0），并且所有缓冲液中省略环己酰亚胺。洗脱前，加入额外的高盐洗涤液（50 mM HEPES/KOAc （pH 7.5）、500 mM KOAc、25 mM Mg（OAc）2，5 mM β-巯基乙醇，250 mM蔗糖，0.1%尼可尔，0.1%不含EDTA的蛋白酶抑制剂鸡尾酒丸（罗氏））。离心后，将核糖体沉淀重悬于因子Xa裂解缓冲液（20mM HEPES/KOH，150 mM KOAc，5 mM Mg（OAc）中2， 5 毫米钙（氯化）2125 mM 蔗糖，5 mM β-巯基乙醇，0.1% 尼可尔）。劈开他的8-V5标签并获得游离的MDEL N末端，将因子Xa蛋白酶加入重悬的RNC中至终浓度为0.25mg / ml，并将样品在室温下在旋转轮上孵育3小时。随后，通过高盐蔗糖垫再次旋转反应（见上文）uL4-CMV-RNCMDEL（简称 RNCMDEL），以及我们重悬于网格缓冲液中的颗粒（20 mM HEPES/KOH、100 mM KOAc、5 mM Mg（OAc）2，125 mM蔗糖，5 mM β-巯基乙醇，0.05%尼可尔）。
非程序化80S核糖体
从S中纯化空闲的，未编程的80S核糖体。酿酒W303-1a细胞。以对数生长收获细胞，重悬于裂解缓冲液（20mM HEPES-KOH （PH 7.5），100 mM KOAc，10 mM Mg（OAc）2，1 mM DTT，蛋白酶抑制剂（罗氏）），并使用法国压榨机打开。通过离心分离细胞碎片（SS34转子，15，000rpm，20°C下4分钟）。通过另一次离心（Ti70转子，37，000rpm，30°C下4分钟）清除上清液，得到“S100提取物”。将约3ml该S100上清液上样于1ml蔗糖垫（20mM HEPES-KOH （PH 7.5），500 mM KOAc，10 mM Mg（OAc）2，1 mM DTT，蛋白酶抑制剂（罗氏）和 1.5 M 蔗糖），核糖体沉淀（TLA110 转子，100，000 rpm，1 小时，4°C）。将沉淀重悬于300μl缓冲液A（20mM HEPES-KOH （PH 7.5），500 mM KOAc，12.5 mM Mg（OAc）中2，1 mM DTT），与等体积的 2× 嘌呤霉素缓冲液（20 mM HEPES-KOH （PH 7.5）、500 mM KOAc、12.5 mM Mg（OAc）混合2、1 mM DTT、2 mM 嘌呤霉素和 0.01% RNasin），并在 30°C 下孵育 25 分钟。 然后将反应物加载到缓冲液A中的10%至40%蔗糖梯度上并旋转20小时（SW40转子，13，400rpm，4°C）。使用梯度站（Biocomp）收获梯度，收集80S峰，通过沉淀（TLA110，100，000rpm，1小时，4°C）浓缩核糖体，并将80S核糖体重悬于裂解缓冲液中。
RNase I处理80S核糖体和核糖体新生链复合物
为了选择性去除真核特异性扩增片段，将RNC或非程序核糖体（80S）与每40 A1 U RNase I（赛默飞世尔）一起孵育260核糖体单位在45°C下25分钟。 每0U U RNase I用5.1U超酶-In（赛默飞世尔）RNase抑制剂停止反应，并将样品置于冰上。RNase I处理的80S和RNC分别称为rt80S和rtRNC。
Map1-核糖体复合物的体外重建
为了表征Map1与核糖体的结合，Map1在体外用uL4-RNC或RNaseI处理的uL4-RNC（rtRNC）重组。使用2pmol核糖体（80nM）和30倍摩尔过量（2，4μM）纯化的Map1进行结合反应。将结合缓冲液调节至终浓度为50 mM Tris（pH 7.0）、150 mM KOAc和2.5 mM Mg（OAc）2.除核糖体以外的所有组分在冰上预孵育5分钟后，加入2pmol核糖体，并将样品在室温下孵育15分钟。将反应物加载到600μl蔗糖垫（750mM蔗糖，20mMHEPES（pH 7.5），150mM KOAc，2.5mM Mg（OAc）2，1 mM DTT），并在 SW2Ti 转子（贝克曼）中以 5，55 rpm 和 40°C 旋转 000.4 小时。 立即将试管在液氮中冷冻，并从底部切割1/3。上部2/3含有上清液（SN），而下部1/3含有沉淀级分（P）。TCA沉淀后，用SimplyBlue SafeT染色（赛默飞世尔）染色后，通过SDS-PAGE分析Map1与核糖体的结合，并使用ImageJ版本1.53Q进行密度测定。有关所有原始凝胶图像，请参见S1原始图像，有关密度定量基础数值数据，请参阅S1数据。
NatB-核糖体复合物的体外重建
使用80S和纯化的NatB复合物（使用wt Naa25或PP突变体Naa25变体）进行结合测定。所有测定均使用2pmol（80nM）核糖体和20倍摩尔过量的NatB（1.6μM）进行。将用于NatB-核糖体复合物形成的结合缓冲液调节至50 mM Tris（pH 7.5），150 mM KOAc，5 mM Mg（OAc）2和 1 mM 乙酰辅酶 A。样品反应通过蔗糖垫（750 mM 蔗糖、20 mM HEPES （pH 7.5）、150 mM KOAc、5 mM Mg（OAc）2、1 mM DTT 和 10 μg/ml 环己胺）。在Nu-PAGE凝胶上分离上清液和沉淀级分并转移到PVDF膜上。转移后，膜的下半部分用针对uL29的多克隆抗血清装饰，上半部分使用抗His抗体（罗氏）进行分析。二抗与辣根过氧化物酶偶联。在Amersham LAS Imager 600上通过化学发光分析蛋白质印迹，并使用ImageJ版本1.53Q进行密度测定。有关所有原始蛋白质印迹图像，请参见S1原始图像，有关密度定量基础数值数据，请参阅S1数据。
Map1-核糖体复合物的冷冻电子显微镜
样品制备。
将来自天然Map4-TAP拉出的新鲜制备的样品的约1 pmol调节至40μl总样品体积，其中含有Nikkol的LB-2.5至终浓度为0.05%（w / v）。为了交联，加入戊二醛至终浓度为0.02%（w / v），并将样品在冰上孵育15分钟。在台式离心机（Eppendorf）中以5°C和4，14rpm短旋转000分钟后，将3.5μl施加到2nm预包被的Quantifoil R3 / 3多孔碳支撑网格中。在样品应用之前，将网格在30.0 mbar下发光放电3 s。
玻璃化和数据处理。
玻璃化是通过使用 Vitrobot Mark IV（FEI 公司/赛默飞世尔）将网格冷冻到液态乙烷中进行的，孵育时间为 45 秒，并在 2°C 和湿度为 3% 的条件下印迹 4 至 95 秒。数据是在配备K3直接探测器（Gatan）的Titan Krios G2（赛默飞世尔）上使用半自动数据采集软件EPU（赛默飞世尔）在300 keV下收集的。共48帧，剂量为1.17e?/?2每帧在-0.5至-3.2μm的离焦范围内收集。放大设置导致像素大小为 1.059 ?/像素。帧对齐使用MotionCor2 [58]执行，对比度传递函数（CTF）的估计使用Gctf [59]执行。
手动筛选显微照片的冰质量，所得的8，358张显微照片用于Gautomatch（https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/download/gautomatch-056/）中的自动颗粒拾取。在RELION 2.3 [0]中进行二维（60D）分类以丢弃非核糖体颗粒后，总共有115，082个颗粒进行了初步细化。随后的3D分类为八类，导致三类仅包含分辨率差的80S核糖体（7%与8，234颗粒，1%与1，226颗粒，0.01%与149颗粒）和一类仅显示60S亚基（6%，6，728颗粒）。其余四类显示出分辨良好的80S核糖体，所有这些核糖体都用tRNA编程（主要处于A / A和P / P状态），并且显示移动扩增片段ES27a仅在出口位置，并且在ES27a和隧道出口之间具有较弱的额外密度。其中一类（12%，13，804个粒子）包含eRF1和ABCE1 / Rli1。这四类被合并以进行进一步处理（86%，98，745个颗粒）。随后使用包围ES3a和TE下方区域的二元软掩模进行27D分类，揭示了一类（25%，25，245个粒子），该类显示出形状良好的ES27a以及预期的Map1定义的额外密度。所有其他类别在预期的Map27位置显示出分辨率差的ES1a或碎片密度（24%的23，499个粒子，28%的27，590个粒子，23%的22，411个粒子）。分辨率良好的类别被进一步细化，并进行了另一轮局部3D分类，这次使用掩模仅覆盖ES27a的尖端和假定的Map1密度。由此产生的两个类别表现出两种不同的构象，要么与ES1a紧密连接（27%，47，11个粒子），要么与ES938a（27%，53，13个粒子）紧密连接。根据金标准分辨率标准（FSC = 307.3），两种类别的CTF均经过细化至9.3 ?和8.0 ?的整体分辨率，分别占143D分类后颗粒总数的10%或12%。随后使用RELION计算局部分辨率。
Map1-核糖体复合体的模型。
为了解释Map1的密度，AF2生成了一个同源模型[37]。
为了将该模型定位在低分辨率密度内，将其叠加在与核糖体结合的人Ebp1的高分辨率冷冻电镜模型（PDB 6SXO;[35]）。 随后将Map1模型刚体拟合到两个孤立的密度中。
NatB-核糖体复合物的冷冻电子显微镜
样品制备。
约 2.5 pmol uL4-RNCMDEL在体外用18倍摩尔过量（44pmol）的重组纯化无活性NatB复合物复溶。最终缓冲条件为50 mM HEPES（pH 7.5），116 mM KOAc，5 mM Mg（OAc）2， 1 毫米DTT， 0.05% 日可尔 （w/v）， 1 毫米乙酰辅酶A.冷冻网格制造的总反应体积为25μl。
玻璃化和数据处理。
将新鲜制备的样品施用到2 nm预包被的Quantifoil R3 / 3多孔碳支撑网格中，并在与Map1-核糖体复合物描述的相同条件下进行冷冻。数据是在配备K3直接探测器（Gatan）的Titan Krios G2（赛默飞世尔）上使用半自动数据采集软件EPU（赛默飞世尔）在300 keV下收集的。共40帧，剂量为1.409e?/?2每帧在0.5至3.5μm的离焦范围内收集。放大倍率设置导致标称像素大小为 1.049 ?/像素。帧对齐是用MotionCor2 [58]进行的。
除非另有说明，否则所有进一步的处理步骤均在CryoSPARC版本4.0.0 [61]中进行。对于总共10，380张选定的显微照片，使用CryoSPARC中基于贴片的CTF估计器进行了CTF估计。首先使用 CryoSPARC 的斑点选择器从显微照片的子集中生成模板并进行 80D 分类，然后使用模板选择器和由此生成的 2D 模板从所有显微照片中挑选 2S 核糖体颗粒。
经过二维分类，选择2，447个粒子进行从头重建和共识图的均匀细化。然后使用围绕大核糖体亚基上的肽隧道出口区域的软掩模对对齐的颗粒进行 470D 变异性分析。
大约一半的粒子（45.5%，203，513个粒子）被分类为在掩蔽区域没有额外密度，在出口位置没有ES27a，或者只有可能对应于ES1a周围NatB-27的噪声信号，因此被丢弃。
其余三个类别中的两个（77，918个粒子和50，791个粒子）在2S隧道出口的第二个通用适配器站点显示出NatB（NatB-60）的刚性结合拷贝的密度，并且NatB-1的密度只有模糊。第三类115，238个粒子仅包含NatB-1的密度，但没有NatB-2的信号。所有这三个类都经过了额外的集中分类和细化，使用围绕NatB-1预期位置的掩模进行。
在此过程中，大多数颗粒（224，091或初始分选后选择的颗粒的91.9%）表现出NatB-1的高度连续构象异质性，并且没有进一步处理。然而，一个由9，645个粒子组成的子类显示了NatB-2和NatB-1的定义密度，其中NatB1位于NatB-2的正下方。该级别被称为“I类”，并根据黄金标准（FSC = 3.8）改进为0.143 ?的分辨率。
所有含有NatB-2的初始类也以类似的方式对NatB-2进行集中分选，所得的具有刚性结合的NatB-2（45，530个颗粒）的颗粒类，称为“II类”，以2.3 ?的分辨率重建NatB1-核糖体复合物。
NatB-核糖体复合物的模型。
核糖体模型是通过调整停滞在80S核糖体亚基的CGA-CCG抑制密码子组合上的酵母62S核糖体模型[60]和ES27a在NatA-核糖体复合物的出口位置[25]而生成的。通过在多聚体模式下使用AF25获得了NatB（包括Naa20和Naa2）的同源模型[37]。所有型号都是在经过微小调整后首次安装在ChimeraX [63]中的刚体，例如基于II类的更高分辨率重建重新排列ES27a和Naa25的C端螺旋。II类的模型，仅包含NatB-2，不包含NatB-1，然后使用Phenix [64]中的实际空间细化和WinCoot [65]中使用ProSmart和RCrane模块[66，67]的手动调整进行改进。然后，通过刚体将II类模型和NatB-1的Alphafold模型拟合到相应的密度中，并在Phenix中进行一轮实际空间细化，然后在WinCoot中进行手动调整，从而生成I类模型。所有冷冻电镜结构和模型均用ChimeraX显示[63]。
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天然Map1-核糖体复合物的亲和纯化。
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S1 图 天然Map1-核糖体复合物的亲和纯化。
(A） 在 1% Nu-PAGE 凝胶上分离的 Map12-TAP 纯化样品的酰胺黑色染色 PVDF 膜。（B）使用针对TAP标签的CaMBD（α-CAB）部分和核糖体蛋白uL29的抗体进行蛋白质印迹后ECL开发的PVDF膜。TEV切割时α-CAB信号的偏移表明TAP标签上的蛋白A结构域成功裂解，在洗脱级分中留下Map1-CaMBD和共纯化的核糖体。（C）从Map12核糖体纯化1%的洗脱级分。Ly，裂解物;SN，上清液;P，颗粒;FT，流过;R，重悬;W，洗;E，洗脱;B、煮珠。0.1 安培260的 E 被加载;对于洗涤级分，将体积的1/17上样到凝胶上;对于Ly，SN，P和FT，加载3μl样品，对应于L的1/6，000，SN的1/8，000和P和FT的1/1，000。 TAP = 串联亲和纯化;CaMBD = 钙调蛋白结合结构域。*，病毒蛋白污染。参见S1 Raw图像，了解（A、B和C）所示的所有原始凝胶和蛋白质印迹图像。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001995.s001
（提夫）
S2 图 天然Map1-核糖体复合物的分类方案。
用Gautomatch挑选颗粒，然后在RELION中进行2D分类以丢弃非核糖体颗粒。随后的细化和 3D 分类为八个类，导致四个高分辨率类都显示在退出位置。这些类别占所有粒子的86%，在ES27和TE周围区域被连接并接受屏蔽分类。四分之一的粒子形成了一个稳定的类别，具有定义的ES27和Map1的额外密度。该类被进一步细分，应用覆盖ES27尖端和Map1密度的掩模。由此产生的两个稳定类显示Map1有两种构象（红色，蓝色），包含所有粒子的10%和13%。两个类别都经过CTF改进，总体分辨率分别为3.9 ?和3.8 ?。所有地图都以相同的等值线级别显示;百分比是指前面的处理步骤。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001995.s002
（提夫）
S3 图 Map1-C1-80S 和 Map1-C2-80S 冷冻电镜重建的局部分辨率和 FSC 曲线。
(A） Map1-C1-80S和Map1-C2-80S的冷冻电镜贴图在后处理前，并根据RELION确定的局部分辨率进行着色。两张地图中Map1的局部分辨率范围从6.5 ?到12.5 ?以下，表明灵活性很高。（B）两个精制类别的FSC曲线;平均分辨率是根据黄金标准估算的。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001995.s003
（提夫）
S4 图 结合在核糖体隧道出口的Map1与Map1同系物的比较。
(A） 聚焦于 Map1-C1-80S 地图的隧道出口区域的缩放视图与 S 相比。c. 含Arx1的60S前（EMD-6615），H。EBP1结合的80S（EMD-10344和10609）和来自E的PDF-Map-70S核糖体复合物。大肠杆菌（EMD-9753）。（B）Map1-C1-80S图谱的叠加层，上面显示的ES27a，Arx1，EBP1和细菌图谱（bMap）的分离密度。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001995.s004
（提夫）
S5 图 将 Map1 和 NatB 模型拟合到密度中。
(A-D）两个视图显示了Map1 AlphaFold-2模型与Map1-C1类（A，B）和Map1-C2类（C，D）的隔离密度的拟合。（E）将ES27a结合的NatB-1模型拟合到I类隔离密度中（彩虹中的Naa25-1，Naa20紫色，ES27a蓝色）。（F） （E） 侧视图。（G） 显示两个 NatB 模型拟合到 I 类密度的视图。 （H） NatB-2 模型拟合到 II 类的隔离密度中（在对 NatB-2 进行集中排序后）。Naa25-1以彩虹显示，Naa20以灰色显示。（一）（H）侧视图。（J）突出显示Naa25-2（来自NatB-2）的C端α-螺旋与核糖体RNA相互作用的视图。（H，I）。所有地图均根据当地分辨率进行过滤。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001995.s005
（提夫）
S6 图 ES27a 在 Map1、NatA 和 NatB 结合的核糖体复合物中的构象。
聚焦于出口隧道的视图，概述了在NatA核糖体结构[27]，Map25核糖体结构（C1和C1类）和NatB核糖体结构（I类，两个稳定的NatB结合）中观察到的ES2a位置。显示了围绕H63，ES27a和ES27b三向结的相对旋转角度以及各自ES27a尖端位置之间的距离。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001995.s006
（提夫）
S7 图 NatB，80S核糖体，RNC和NatB突变体的NuPAGE分析。
12%Nu-PAGE凝胶显示用于NatB项目的纯化组分。（A） RNC 1 车道MDEL;车道 2，标记（页面标尺未染色，赛默飞世尔，#26614）;泳道3，rt80S核糖体;泳道4，80S核糖体，泳道5，空;6 号车道，国家重量.（二）车道1号，标志物;2 号车道，国家QPP， 车道 3， 国家QPP;4 号车道，国家队QPP;车道 5 纳特布博尔.有关所有原始凝胶图像，请参阅S1原始凝胶图像。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001995.s007
（提夫）
S8 图 体外重组NatB-RNC复合物的分类方案。
在 CryoSPARC 中进行颗粒拾取和 2D 分类后，选择了 447，470 个颗粒进行从头重建和共识图的均匀细化。基于肽出口隧道下方区域的3D变异性分析，分离出2个主要类别。两类显示了60S隧道出口处第二个通用适配器站点的NatB（NatB-1）刚性绑定副本的密度和NatB-115的模糊密度。第三类238，1个粒子仅包含NatB-2的密度，但没有NatB-1的信号。所有这三个类都经过了额外的集中分类和细化，使用围绕NatB-2预期位置的掩模进行。这揭示了一个亚类，显示了NatB-1和NatB-9的定义密度。根据金标准（FSC = 645.3），该子类（I类;8，0个粒子）被细化为143.27 ?的分辨率。其他亚类对ES2a和结合的NatB表现出高度的构象异质性，如此处显示的一些选定类所示。在另一个独立的分类分支中，所有含有NatB-2的初始类别都对NatB-45进行集中分选，从而产生II类（530，3个颗粒），并进一步细化至1.<> ?的分辨率。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001995.s008
（提夫）
S9 图 NatB-核糖体复合物的局部分辨率和FSC曲线。
(A）NatB-核糖体复合物的两大类的冷冻电镜图根据CryoSPARC中的局部分辨率进行低通过滤和着色。I类（左）中的两个NatB的局部分辨率范围约为4 ?至9 ?，II类聚焦精制NatB-3的局部分辨率范围约为6 ?至2 ?（右）。（B）两种精制NatB-核糖体类别的FSC曲线;根据黄金标准估计平均分辨率分别为3.8 ?和3.1 ?。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001995.s009
（提夫）
S10 图 核糖体结合的NatB-1和NatB-2的比较。
(A）NatB-1和NatB-2模型（Naa25灰色，Naa20-1蓝色，Naa20-2红色）相对于60S亚基的位置（显示为灰色密度）。此外，还显示了与每个Naas20亚基结合的乙酰辅酶A（Ac-CoA）的位置以及新生链的假定模型，一旦到达Naa20-1（绿色）的催化中心，一次进入Naa20-2（黄色）。（B）与（A）相同的视图，但缩放并仅显示两个催化Naa20亚基。（中、丁）整个NatB复合物（C）的（A）和（B）（从隧道出口向下）的俯视图或仅关注两个Naa20亚基（D）。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001995.s010
（提夫）
S11 图 核糖体结合的NAT和Map1复合物的比较。
(A，B）底部视图显示了NatA-核糖体结构（A）NatB-核糖体结构（B）的叠加，在C1和C1位置具有核糖体结合Map2的分离密度。（C） 和 （D） 显示侧视图。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001995.s011
（提夫）
S1 表。 NatB-核糖体复合物的冷冻电镜数据收集、细化和验证统计。
NatB-RNC 的冷冻电镜数据收集、数据处理和模型拟合参数概述MDEL结构。类 I 表示具有两个稳定绑定的 NatB 的数据子集，类 I 表示专注于在 NatB-1 上排序的数据子集。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001995.s012
（英文）
S1 原始映像。 原始凝胶和蛋白质印迹图像。
(A） 来自 Map12-TAP 亲和纯化的 1% Nu-PAGE 凝胶的原始图像。图1A和S1C所示的车道标有“S”。标有“X”的泳道在手稿中没有显示或讨论。（B）图15I中使用的Coomassie染色1%SDS-PAGE凝胶的原始图像。图中显示了来自 Map1 共沉降测定的样品，其中包含 RNC、RNaseI 处理的 RNC （rtRNC） 和非程序化核糖体 （np80S）。标有“X”的泳道在手稿中没有显示或讨论。（C） 使用野生型 （WT） NatB 和 PP1、PP4 和 PP_all NatB 突变体进行 NatB 结合测定首次重复的蛋白质印迹的原始图像。上图：化学发光图像;调整水平以获得最佳对比度。该图像还用于量化图2I所示的NatB结合（另见S1数据）。底部：调整后的化学发光图像和可见光图像的叠加，用于标记。标有“X”的泳道未用于定量。（D）使用野生型（WT）NatB和PP1，PP4和PP_all NatB突变体的NatB结合测定的第二次重复的蛋白质印迹的原始图像。上图：化学发光图像;调整水平以获得最佳对比度。该图像还用于图2I所示的NatB结合的定量（另见S1数据），并在图2I中显示为代表性的蛋白质印迹。底部：调整后的化学发光图像和可见光图像的叠加，用于标记。标有“S”的车道在图2I中显示为代表性信号。带有“X”的泳道未用于定量或显示在手稿中。（E） 使用野生型 （WT） NatB 和 PP1、PP4 和 PP_all NatB 突变体进行第三次 NatB 结合测定的蛋白质印迹的原始图像。上图：化学发光图像;调整水平以获得最佳对比度。该图像还用于量化图2I所示的NatB结合（另见S1数据）。底部：调整后的化学发光图像和可见光图像的叠加，用于标记。标有“X”的泳道未用于定量。（F）使用野生型（WT）NatB和PP3 NatB突变体的NatB结合测定的蛋白质印迹的原始图像。上图：化学发光图像;调整水平以获得最佳对比度。该图像还用于量化图2I所示的NatB结合（另见S1数据）。底部：调整后的化学发光图像和可见光图像的叠加，用于标记。标有“X”的泳道未用于定量。（G）使用闲置核糖体（80S）或RNaseI处理的闲置核糖体（rt80S）的NatB结合测定的蛋白质印迹的原始图像。上图：化学发光图像;调整水平以获得最佳对比度。该图像还用于量化图2I所示的NatB结合（另见S1数据）。底部：调整后的化学发光图像和可见光图像的叠加，用于标记。标有“S”的车道在图2I中显示为代表性信号。标有“X”的泳道未用于定量或显示在手稿中。（H） S1A 图中使用的天然 Map1-核糖体复合物亲和纯化的蛋白质印迹中用 Amido 黑色染色的 PVDF 膜的原始图像。（I）来自天然Map1-核糖体复合物亲和纯化的蛋白质印迹的原始化学发光图像，如S1B图所示。上图：用抗CAB抗体孵育后的原始图像。下图：用抗uL29抗体孵育后的原始图像。水平被统一调整以获得最佳对比度。（J）库马斯染色的12%NuPAGE凝胶的原始图像，显示用于NatB结合测定的输入样品（图2I）。野生型NatB （NatB文晔）、RNC、RNaseI处理的核糖体（rt80S）和未处理的核糖体（80S）被标记并用于S7A图。标有“X”的泳道在手稿中没有显示或讨论。（K）Coomassie染色的12%NuPAGE凝胶的原始图像，显示纯化的NatB阳性贴片突变体。S7B图中显示的车道被标记。标有“X”的泳道在手稿中没有显示或讨论。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001995.s013
（英文）
S1 数据。 用于密度定量的数值数据。
使用ImageJ版本1.53Q对凝胶和蛋白质印迹图像进行密度定量获得的数值数据，以及图1I和2I所示的平均值和误差计算。对于图1I，测定库马斯染色凝胶中相对于Map1条带背景的条带强度，并用未处理的RNC归一化为对照。对于图2I，确定了上清液和沉淀级分对应于Naa25和uL29的条带在背景上的条带强度，并计算了每对馏分的Naa25条带强度之比。通过测量每个相应沉淀级分中核糖体蛋白的条带强度来归一化比率。从重复中确定这些比率的平均值，并将其归一化到野生型对照实验中，其中对照中的结合效率设置为100%。误差计算为从重复确定的平均值的标准偏差。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001995.s014
（三十）
确认
我们感谢Charlotte Ungewickell和Susanne Rieder的技术支持以及Thomas Fr?hlich博士的质谱分析。
引用
1.Sherman F， Stewart JW， Tsunasawa S. 蛋氨酸或不是蛋氨酸在蛋白质的开头。传记。1985;3(1):27–31.Epub 1985/07/01.pmid：3024631。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
2.黄淑， 艾略特， 刘PS， 科杜里， 魏克曼， 李建华， 等.酵母中蛋白质共翻译氨基末端加工的特异性。生物化学。1987;26(25):8242–8246.Epub 1987/12/15.pmid：3327521。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
3.瓦尔沙夫斯基·N端规则：功能，奥秘，用途。美国国家科学院院刊， 1996;93（22）：12142–12149.Epub 1996/10/29.pmid：8901547;PubMed Central PMCID：PMC37957。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
4.李旭， 常永华.酿酒酵母中的氨基末端蛋白加工是一项基本功能，需要两种不同的蛋氨酸氨基肽酶。美国国家科学院院刊， 1995;92（26）：12357–12361.Epub 1995/12/19.邮编：8618900;PubMed Central PMCID：PMC40356。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
5.罗德里克SL，马修斯BW。来自大肠杆菌的钴依赖性蛋氨酸氨基肽酶的结构：一种新型蛋白水解酶。生物化学。1993;32(15):3907–3912.Epub 1993/04/20.pmid：8471602。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
6.布拉德肖RA，布里基WW，沃克KW。N-末端加工：蛋氨酸氨基肽酶和Nα-乙酰转移酶家族。趋势生物化学科学 1998;23（7）：263–267.Epub 1998/08/11.pmid：9697417。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
7.Giglione C，Fieulaine S，Meinnel T.N末端蛋白质修饰：重新发挥核糖体的作用。生物化学。2015;114:134–146.Epub 2014/12/03.PMID：25450248。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
8.贾维特罗， 张永华.酵母蛋氨酸氨基肽酶 1 型与核糖体相关，需要其 N 末端锌指结构域才能在体内正常发挥作用。J细胞生物化学。2002;85(4):678–688.Epub 2002/04/23.pmid：11968008。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
9.达塔B.从原核到真核王国的道路的MAPs和POEP。生物化学。2000;82(2):95–107.Epub 2000/03/23.PMID：10727764。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
10.Chang SY， McGary EC， Chang S. 大肠杆菌的蛋氨酸氨基肽酶基因对细胞生长至关重要。细菌学杂志. 1989;171（7）：4071–4072.Epub 1989/07/01.pmid：2544569;PubMed Central PMCID： PMC210164.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
11.Miller CG， Kukral AM， Miller JL， Movva NR.pepM是鼠伤寒沙门氏菌的必需基因。细菌学杂志. 1989;171（9）：5215–5217.Epub 1989/09/01.pmid：2670909;PubMed Central PMCID：PMC210346。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
12.张永华， 泰克特·乌， 史密斯·来自酿酒酵母的蛋氨酸氨基肽酶基因的分子克隆、测序、缺失和过表达。生物学杂志 1992;267（12）：8007–8011.Epub 1992/04/25.pmid：1569059。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
13.陈 S， 维特罗 贾， 张永华.酿酒酵母中两种不同的蛋氨酸氨基肽酶的体内特异性。拱生物化学生物物理学。2002;398(1):87–93.Epub 2002/01/29.pmid：11811952。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
14.Giglione C， Boularot A， Meinnel T. 蛋白 N-末端蛋氨酸切除术。细胞分子生命科学 2004;61（12）：1455–1474.Epub 2004/06/16.PMID：15197470。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
15.Raue U，Oellerer S，Rospert S.酵母核糖体隧道出口处蛋白质生物发生因子的关联受翻译状态和新生多肽序列的影响。生物学杂志 2007;282（11）：7809–7816.Epub 2007/01/19.pmid：17229726。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
16.对核糖体出口位点蛋白质生物发生因子相互作用的分析揭示了NAC的新作用。细胞生物学杂志. 2015;210（2）：287–301.Epub 2015/07/22.pmid：26195668;PubMed Central PMCID：PMC4508901。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
17.Fujii K， Susanto TT， Saurabh S， Barna M. 解码核糖体中扩增片段的功能。摩尔细胞。2018;72（6）：1013–1020 e6.Epub 2018/12/24.pmid：30576652;PubMed Central PMCID：PMC6407129。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
18.Shankar V， Rauscher R， Reuther J， Gharib WH， Koch M， Polacek N. rRNA扩增片段27Lb调节酵母核糖体的因子募集能力并塑造蛋白质组。核酸研究 2020;48（6）：3244–3256.Epub 2020/01/22.pmid：31960048;PubMed Central PMCID：PMC7102955。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
19.阿克斯内斯 H， 德拉齐奇 A， 玛丽 M， 阿内森 T.第一件事：N-末端乙酰转移酶的重要蛋白质标记。趋势生物化学科学 2016;41（9）：746–760.Epub 2016/08/09.pmid：27498224。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
20.Starheim KK，Gevaert K，Arnesen T.蛋白N端乙酰转移酶：当开始重要时。趋势生物化学科学 2012;37（4）：152–161.Epub 2012/03/13.PMID：22405572。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
21.Arnesen T. 迈向蛋白质N端乙酰化的功能理解。公共科学图书馆生物学. 2011;9（5）：e1001074.Epub 2011/06/10.pmid：21655309;PubMed Central PMCID：PMC3104970。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
22.Friedrich UA， Zedan M， Hessling B， Fenzl K， Gillet L， Barry J， et al. NatA和NatB对蛋白质的N（α）末端乙酰化在酿酒酵母中起着不同的生理作用。细胞代表 2021;34（5）：108711.Epub 2021/02/04.pmid：33535049。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
23.Huber M， Bienvenut WV， Linster E， Stephan I， Armbruster L， Sticht C， et al. NatB介导的N-末端乙酰化影响生长和生物应激反应。植物生理学. 2020;182（2）：792–806.Epub 2019/11/21.pmid：31744933;PubMed Central PMCID：PMC6997699。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
24.莫里森 J， 阿尔图瓦伊吉里 NK， 布朗斯塔德 K， 阿克斯内斯 H， 阿尔赛夫 HS， 埃文斯 A， 等.损害 NatB 蛋白 N 末端乙酰转移酶的错义 NAA20 变异导致常染色体隐性遗传发育迟缓、智力障碍和小头畸形。基因医学 2021.Epub 2021/07/08.PMID：34230638。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
25.克诺尔公司， 施密特 C， 泰西娜 P， 伯宁豪森 O， 贝克尔 T， 比阿特丽克斯 B， 等.核糖体-NatA结构揭示了rRNA扩增片段协调N末端乙酰化。分子生物学. 2019;26（1）：35–39.Epub 2018/12/17.pmid：30559462。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
26.洪华， 蔡茹， 张 S， 丁华， 王华， 韩 A. N-末端乙酰转移酶NatB的底物特异性乙酰化的分子基础.结构。2017;25（4）：641–649 e3.Epub 2017/04/06.pmid：28380339。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
27.Deng S， Pan B， Gottlieb L， Petersson EJ， Marmorstein R. 人NatB进行N-末端α-突触核蛋白乙酰化的分子基础。生活。2020;9.Epub 2020/09/05.pmid：32885784;PubMed Central PMCID：PMC7494357。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
28.D层，Kopp J，Fontanillo M，K?hn M，Lapouge K，Sinning I.Naa20活性对规范NatB底物的结构基础。生物学杂志， 2021;4（1）：2.Epub 2021/01/04.pmid：33398031;PubMed Central PMCID：PMC7782713。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
29.Pech M，Spreter T，Beckmann R，Beatrix B.新生多肽相关复合物的双重结合模式揭示了核糖体上一种新的通用适配器位点。生物学杂志 2010;285（25）：19679–19687.Epub 2010/04/23.pmid：20410297;PubMed Central PMCID：PMC2885246。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
30.施密特 C， 科瓦林斯基 E， Shanmuganathan V， Defenouillere Q， Braunger K， Heuer A， et al.核糖体-Ski2-Ski3-Ski8解旋酶复合物的冷冻电镜结构。科学。2016;354(6318):1431–1433.Epub 2016/12/17.PMID：27980209。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
31.贝克曼 R， 斯潘 CM， 埃斯瓦尔 N， 赫尔默斯 J， 彭切克 PA， 萨利 A， 等.与翻译80S核糖体相关的蛋白质传导通道的结构。细胞。2001;107(3):361–372.Epub 2001/11/10.噗嗤：11701126。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
32.布拉达奇 B， 莱迪格 C， 格兰纳曼 S， 格纳迪格 M， 托勒维 D， 博彻 B， 等.60S前核糖体亚基的结构，核输出因子Arx1在出口隧道处结合。分子生物学. 2012;19（12）：1234–1241.Epub 2012/11/13.pmid：23142978;PubMed Central PMCID：PMC3678077。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
33.吴淑， 图通措格鲁， 闫珂， 布朗H， 张莹， 谭丹， 等.晚期核前60年代核糖体结构揭示的组装因子的不同作用。自然界。2016;534(7605):133–137.Epub 2016/06/03.pmid：27251291;PubMed Central PMCID：PMC5237361。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
34.Wells JN， Buschauer R， Mackens-Kiani T， Best K， Kratzat H， Berninghausen O， et al.酵母Lso2和人CCDC124与冬眠核糖体结合的结构和功能。公共科学图书馆生物学. 2020;18（7）：e3000780.Epub 2020/07/21.pmid：32687489;PubMed Central PMCID：PMC7392345。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
35.Wild K， Aleksic M， Lapouge K， Juaire KD， Flemming D， Pfeffer S， et al. MetAP样Ebp1占据人核糖体隧道出口并招募灵活的rRNA扩增片段。纳特公社。2020;11(1):776.Epub 2020/02/09.pmid：32034140;PubMed Central PMCID：PMC7005732。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
36.Bhakta S，Akbar S，Sengupta J.冷冻电镜结构揭示了在核糖体隧道出口处存在其他蛋白质生物发生因子的情况下MetAP的重新定位。分子生物学杂志. 2019;431（7）：1426–1439.Epub 2019/02/13.普米德：30753870。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
37.Jumper J， Evans R， Pritzel A， Green T， Figurnov M， Ronneberger O， et al.使用 AlphaFold 进行高度准确的蛋白质结构预测。自然界。2021;596(7873):583–589.Epub 2021/07/16.pmid：34265844;PubMed Central PMCID：PMC8371605。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
38.Kraushar ML， Krupp F， Harnett D， Turko P， Ambrozkiewicz MC， Sprink T， et al. 在近原子分辨率下发育中的新皮层中的蛋白质合成揭示了 Ebp1 介导的 60S 隧道出口处的神经元蛋白质平衡。摩尔细胞。2021;81（2）：304–322 e16.Epub 2020/12/29.pmid：33357414;PubMed Central PMCID：PMC8163098。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
39.彼得罗夫， 伯尼尔 CR， 居伦 B， 沃特伯里 CC， 赫什科维茨 E， 萧 C， 等.来自所有三个生命领域的rRNA的二级结构。公共图书馆一号。2014;9（2）：e88222.Epub 2014/02/08.pmid：24505437;PubMed Central PMCID：PMC3914948。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
40.Lasa M， Neri L， Carte B， Gázquez C， Aragón T， Aldabe R. NAA20氨基末端的成熟对于组装NatB N-末端乙酰转移酶复合物至关重要。分子生物学杂志. 2020;432（22）：5889–5901.Epub 2020/10/05.PMID：32976911。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
41.Magin RS， Deng S， Zhang H， Cooperman B， Marmorstein R. 探测NatA与核糖体之间共翻译蛋白乙酰化的相互作用。公共图书馆一号。2017;12（10）：e0186278.Epub 2017/10/11.pmid：29016658;PubMed Central PMCID：PMC5634638。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
42.张鑫， 拉希德， 王克， 苏珊.顺序检查点控制共翻译蛋白靶向过程中的底物选择。科学。2010;328(5979):757–760.Epub 2010/05/08.pmid：20448185;PubMed Central PMCID：PMC3760334。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
43.怀尔德 K， 朱艾尔 KD， 索尼 K， 尚穆加纳坦 V， 亨德里克斯 A， 塞格尼茨 B， 等.重建人类SRP系统并对其核糖体相互作用进行定量和系统分析。核酸研究 2019;47（6）：3184–3196.Epub 2019/01/17.pmid：30649417;PubMed Central PMCID：PMC6451106。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
44.弗拉纳根， 陈建强， 苗彦， 邵毅， 林杰， 博克PE， 等.信号识别颗粒与核糖体结合的信号序列结合，具有荧光检测到的亚纳摩尔亲和力，不会随着新生链的延长而减少。生物学杂志 2003;278（20）：18628–18637.Epub 2003/03/07.pmid：12621052。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
45.贝克特 B， 克德罗夫 A， 索门 D， 肯普夫 G， 怀尔德 K， 辛宁 I， 等.原核信号识别粒子的平移停滞是由RNA相互作用介导的。分子生物学. 2015;22（10）：767–773.Epub 2015/09/07.pmid：26344568。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
46.张毅， 马春， 袁毅， 朱军， 李楠， 陈春， 等.共翻译伴侣与真核核糖体相互作用的结构基础。分子生物学. 2014;21（12）：1042–1046.Epub 2014/11/05.pmid：25362488。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
47.贝克尔 T， 布尚 S， 贾拉施 A， 阿马奇 JP， 富内斯 S， 乔西内特 F， 等.单体酵母和哺乳动物Sec61复合物的结构与翻译核糖体相互作用。科学。2009;326(5958):1369–1373.Epub 2009/10/29.pmid：19933108;PubMed Central PMCID：PMC2920595。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
48.Gamerdinger M， Kobayashi K， Wallisch A， Kreft SG， Sailer C， Schl?mer R， et al.通过NAC对核糖体隧道内新生多肽的早期扫描。摩尔细胞。2019;75（5）：996–1006.e8.Epub 2019/07/31.pmid：31377116。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
49.桑迪奇 A， 格洛格 F， 马丁内斯 M， 迈耶议员， 韦德 R， 布考 B， 等.动态酶对接到核糖体协调N端处理与多肽折叠。分子生物学. 2013;20（7）：843–850.Epub 2013/06/19.pmid：23770820。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
50.Wegrzyn RD， Hofmann D， Merz F， Nikolay R， Rauch T， Graf C， et al.保守基序是NAC与核糖体蛋白L23和新生链相互作用的先决条件。生物学杂志 2006;281（5）：2847–2857.Epub 2005/12/01.pmid：16316984。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
51.莱迪格 C， 班格 G， 科普 J， 阿姆拉彻 S， 阿拉文德 A， 威克尔斯 S， 等.真核伴侣（核糖体相关复合物）的结构表征。分子生物学. 2013;20（1）：23–28.Epub 2012/12/04.pmid：23202586。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
52.Gumiero A， Conz C， Gese GV， Zhang Y， Weyer FA， Lapouge K， et al.共翻译Hsp70 Ssb与核糖体蛋白和rRNA的相互作用取决于其盖结构域。纳特公社。2016;7:13563.Epub 2016/11/25.pmid：27882919;PubMed Central PMCID：PMC5123055。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
53.莫尔D，温特迈尔W，罗德尼娜MV。GTP酶激活核糖体上的伸长因子Tu和G。生物化学。2002;41(41):12520–12528.Epub 2002/10/09.pmid：12369843。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
54.黑尔格斯特兰德 M， 曼达瓦 CS， 穆德 FA， 莉尔哈斯 A， 桑亚尔 S， 阿克 M.核糖体茎通过L2 C端结构域的保守区域与翻译因子IF3，EF-Tu，EF-G和RF12结合。分子生物学杂志. 2007;365（2）：468–479.Epub 2006/10/31.PMID：17070545。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
55.野村N，本田T，巴巴K，长沼T，丹泽T，有坂F等。古菌核糖体茎蛋白通过其保守的C末端以核苷酸非依赖性方式与翻译因子相互作用。美国国家科学院院刊， 2012;109（10）：3748–3753.Epub 2012/02/23.pmid：22355137;PubMed Central PMCID：PMC3309737。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
56.Jomaa A， Gamerdinger M， Hsieh HH， Wallisch A， Chandrasekaran V， Ulusoy Z， et al.ER-蛋白靶向过程中核糖体上从NAC到SRP的信号序列切换机制。科学。2022;375(6583):839–844.Epub 2022/02/24.pmid：35201867;PubMed Central PMCID：PMC7612438。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
57.Mateusz J， Jomaa A， Gamerdinger M， Shrestha S， Leibundgut M， Deuerling E， et al.ER蛋白生物发生中TRAP复合物功能的分子基础。生物RXiv。2022.
查看文章谷歌学术搜索
58.郑 SQ， 帕洛夫恰克 E， 阿玛奇 JP， 韦尔巴 KA， 程 Y， 阿加德 DA.MotionCor2：光束诱导运动的各向异性校正，用于改进冷冻电子显微镜。纳特方法。2017;14(4):331–332.Epub 2017/02/27.pmid：28250466;PubMed Central PMCID：PMC5494038。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
59.Gctf：实时CTF测定和校正。结构生物学杂志. 2016;193（1）：1–12.Epub 2015/11/26.pmid：26592709;PubMed Central PMCID：PMC4711343。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
60.Zivanov J， Nakane T， Forsberg BO， Kimanius D， Hagen WJ， Lindahl E， et al.用于在RELION-3中自动测定高分辨率冷冻电镜结构的新工具。生活。2018;7.Epub 2018/11/09.pmid：30412051;PubMed Central PMCID：PMC6250425。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
61.旁贾尼A，鲁宾斯坦JL，舰队DJ，布鲁巴克马。cryoSPARC：用于快速无监督冷冻电镜结构测定的算法。纳特方法。2017;14(3):290–296.Epub 2017/02/06.pmid：28165473。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
62.Tesina P， Lessen LN， Buschauer R， Cheng J， Wu CC， Berninghausen O， et al.抑制性密码子组合和poly（A）束翻译停滞的分子机制。EMBO J. 2020;39（3）：e103365.Epub 2019/12/20.pmid：31858614;PubMed Central PMCID：PMC6996574。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
63.Pettersen EF， Goddard TD， Huang CC， Meng EC， Couch GS， Croll TI， et al. UCSF ChimeraX：面向研究人员、教育工作者和开发人员的结构可视化。蛋白质科学 2021;30（1）：70–82.Epub 2020/10/22.pmid：32881101;PubMed Central PMCID：PMC7737788。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
64.Liebschner D， Afonine PV， Baker ML， Bunkóczi G， Chen VB， Croll TI， et al.使用X射线，中子和电子测定大分子结构：Phenix的最新发展。晶体学报 D 结构生物学. 2019;75（Pt 10）：861–877.Epub 2019/10/02.pmid：31588918;PubMed Central PMCID：PMC6778852。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
65.Emsley P，Cowtan K. Coot：分子图形的模型构建工具。晶体学报 d 生物晶体学家。2004;60（Pt 12 Pt 1）：2126–2132.Epub 2004/11/26.pmid：15572765。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
66.基廷KS，派尔·RCrane：半自动RNA模型构建。晶体学报 d 生物晶体学家。2012;68（Pt 8）：985–995.Epub 2012/07/17.pmid：22868764;PubMed Central PMCID：PMC3413212。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
67.Casa?al A，Lohkamp B，Emsley P.Coot在电子冷冻显微镜和晶体学数据中建立大分子模型的当前发展。蛋白质科学 2020;29（4）：1069–1078.Epub 2020/03/02.pmid：31730249;PubMed Central PMCID：PMC7096722。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索