《厦门论文发表 -保守的AAA ATP酶PCH-2通过C中的多个减数分裂HORMADs分配其对减数分裂前期事件的调节。秀丽隐杆线虫》期刊简介
厦门论文发表 -保守的AAA ATP酶PCH-2通过C中的多个减数分裂HORMADs分配其对减数分裂前期事件的调节。秀丽隐杆线虫
抽象
在减数分裂前期，同系物配对、突触和重组的基本事件与减数分裂进展相协调，以促进保真度并防止非整倍性。保守的AAA+ ATP酶PCH-2协调这些事件，以保证交叉保证和准确的染色体分离。PCH-2如何实现这种协调知之甚少。在这里，我们提供了PCH-2减缓C中的配对，突触和重组的证据。秀丽隐杆线虫通过重塑减数分裂的霍尔马德。我们建议PCH-2将这些驱动这些减数分裂前期事件的蛋白质的封闭版本转化为未扣的构象，破坏稳定性的同源相互作用并延迟减数分裂进展。此外，我们发现PCH-2将这种调节分布在C中的三个基本减数分裂HORMADs中。秀丽隐杆线虫：PCH-2通过HTP-3调节配对和突触，HIM-3促进交叉保证，HTP-1控制减数分裂进展。除了确定PCH-2如何调节同系物相互作用的分子机制外，我们的结果还为减数分裂HORMAD家族的扩展作为减数分裂的保守进化特征提供了可能的解释。综上所述，我们的工作表明，PCH-2对减数分裂HORMADs的重塑对同系物配对，突触，重组和减数分裂进展的速率和保真度具有功能影响，确保准确的减数分裂染色体分离。
作者摘要
有性生殖依赖于配子的产生，例如在减数分裂期间产生的卵子和精子。在这种特殊的细胞分裂过程中，染色体复制，与其同系物配对，经历突触，最后进行重组，所有这些都是正确减数分裂染色体分离所必需的。这些事件如何相互协调，以及细胞周期如何确保它们以保真度发生，目前尚不清楚。在以前的工作中，我们发现保守的酶PCH-2协调线虫C中的同系物配对，突触和重组。秀丽隐杆线虫。在这里，我们表明PCH-2通过减数分裂HORMAD蛋白家族的不同成员分配其对这些事件的调节来实现这种协调：PCH-2通过HTP-3控制配对和突触，通过HIM-3重组和通过HTP-1控制减数分裂进展。此外，这种分布可以解释为什么C中有这么多减数分裂HORMAD。秀丽隐杆线虫。最后，我们提供了一个模型，说明PCH-2如何通过其酶促功能修饰减数分裂HORMADs，分子解释其在配对，突触，重组和减数分裂进展中的作用。
数字
Fig 8图1图2图3Table 1Table 2Fig 4Fig 5Fig 6Fig 7Fig 8图1图2图3
引文： Russo AE， Giacopazzi S， Deshong A， Menon M， Ortiz V， Ego KM， et al. （2023） 保守的 AAA ATP 酶 PCH-2 通过 C 中的多个减数分裂 HORMAD 分布其对减数分裂前期事件的调节。秀丽隐杆线虫。公共科学图书馆基因19（4）： e1010708. https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010708
编辑 器： Paula E. Cohen，康奈尔大学，美国
收到： 17月 2022， 21;接受： 2023 年 14 月 2023 日;发表： <>月 <>， <>
版权所有： ? 2023 罗素等人。这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。
数据可用性： 所有图表的数据都作为标有补充数据文件的附加excel文件提供。
资金： 这项工作得到了NIH的支持（授权号T32GM008646[A.E.R]，R35GM141835[N.B.]和R35GM144121[K.D.C.]）。一些菌株由CGC提供，CGC由NIH研究基础设施计划办公室（P40 OD010440）资助。先进光源是能源部科学用户设施办公室，合同号为DE-AC02-05CH11231。ALS-ENABLE光束线部分由美国国立卫生研究院，国家普通医学科学研究所，授予P30 GM124169。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。
竞争利益： 提交人声明不存在相互竞争的利益。
介绍
所有有性繁殖的生物都依赖于称为减数分裂的特殊细胞分裂，它产生单倍体配子，如精子、卵子和花粉。在减数分裂过程中，细胞将一轮DNA复制与两轮染色体分离相结合，所有这些都受到严格调节，以确保配子继承正确数量的染色体。减数分裂中的错误可导致非整倍体配子，从而导致不孕、出生缺陷和流产[1]。因此，了解减数分裂事件如何协调对生殖健康具有重要意义。
在减数分裂的前期I期间，染色体对或同系物经历一系列称为配对，突触和交叉重组的事件。首先，同系物在细胞核内找到彼此并配对。接下来，一种称为突触复合体（SC）的分子结构在同系物之间组装，并在称为突触的过程中稳定同系物配对。最后，同系物经历交叉重组，这有两个重要目的。首先，它洗牌等位基因以创造可以通过自然选择作用的新基因组合。其次，它在物理上连接同系物对，这是同系物在第一次减数分裂期间正确重塑、在纺锤体上定向和正确分离所必需的。
尽管被描述为线性途径，但同源染色体之间的配对，突触和重组过程是高度动态的，可以同时发生，需要主动协调。此外，这些事件也可能在非同源染色体之间不恰当地启动，因此需要纠正。我们已经表明，高度保守的AAA+ATP酶，即Pachytene检查点2（PCH-2），有助于减数分裂事件的协调和纠正[2，3]。然而，它如何发挥这些作用目前尚不清楚。
PCH-2及其哺乳动物直系同源物TRIP13已被证明通过含有HORMA结构域（HORMAD蛋白）的蛋白质家族起作用，以介导多种染色体行为，包括减数分裂同系相互作用。HORMADs以该家族中在出芽酵母中发现的第一批蛋白质命名：Hop1，Rev7和Mad2[4]，减数分裂HORMADs对于组织减数分裂染色体以发生同系物配对，突触和重组的减数分裂特异性事件至关重要[5]。尽管在减数分裂前期具有重要作用，但减数分裂HORMADs在真核生物中所包含的家庭成员数量上差异很大。例如，S.酿酒师和S.庞贝各有一只减数分裂的HORMAD[6，7]，小鼠和拟南芥各有8只[10-11]和C。秀丽隐杆线虫有14个[9-10]。在小鼠和植物中，一个减数分裂HORMAD在配对、突触和重组事件中比另一个更起不可或缺的作用，表明功能有一定的特化[15，18，19-3]。在C中也观察到这种特化。秀丽隐杆线虫是三个基本HORMAD之一[12]。HTP-8负责DNA双链断裂形成[20]和REC-3介导的姐妹染色单体凝聚力[19]。HIM-21促进突触[1]和同系物通路，以确保在交叉重组过程中修复同系物与姐妹染色单体[3]。HTP-11除了与HIM-13一起有助于同系物访问外，还控制同系物正确配对后SC组装的及时启动[22，2]，以及在第一次减数分裂期间保护姐妹染色单体凝聚力[1]。第四种减数分裂HORMAD（HTP-13）不是必需的，与HTP-22在很大程度上是多余的[<>，<>]。
减数分裂HORMAD蛋白具有特征性的N末端HORMA结构域，允许HORMADs采用两种不同的构象：封闭构象和开放/解锁构象（综述于[23]）。在闭合构象中，结合伴侣上的肽称为“闭合基序”结合HORMAD的HORMA结构域的核心。这种相互作用由HORMA结构域的C端区域稳定，称为安全带，该区域缠绕在HORMAD周围，将结合伙伴的闭合基序锁定在HORMA结构域核心上。当PCH-2 / TRIP13结合并部分展开HORMA结构域的极端N末端时，HORMAD从封闭构象转变为开放构象，导致结构重排释放结合的闭合基序并导致安全带占据闭合基序相互作用位点。生化和结构研究表明，PCH-2/TRIP13直接负责有丝分裂的HORMADs Mad2 [24]和Rev7 [25]将闭合构象转化为开放构象，其中这种重塑依赖于PCH-2/TRIP13与HORMAD的N末端之间的直接相互作用[26，27]。
构象转换也被证明对减数分裂HORMAD功能至关重要。减数分裂HORMADs的封闭版本聚集在减数分裂染色体上以驱动配对、突触、重组和减数分裂进展[19]。虽然在体外或体内尚未观察到减数分裂HORMADs的稳定、开放的构象，但出芽酵母减数分裂HORMADHop1在溶液中以两种处于平衡状态的不同构象存在：闭合构象，与含有来自相互作用蛋白的闭合基序的肽片段结合，以及被称为解扣的中间“扩展”状态[28]。未扣减数分裂HORMADs在体内的生理相关性尚不清楚，但在植物和出芽酵母中的工作表明，核输入和与减数分裂染色体的关联需要解扣[29，30]。
虽然与其他HORMADs（如Mad2和Rev7）的研究为概念化PCH-2在减数分裂前期的分子机制提供了一个强大的框架，但确定PCH-2在减数分裂期间的特定作用一直具有挑战性。与Mad2和Rev7相比，由于技术困难，尝试对PCH-2 / TRIP13和减数分裂HORMADs进行类似的结构和生化分析的信息较少。然而，来自出芽酵母和植物的先前证据表明，PCH-2 / TRIP13结合并直接作用于减数分裂的HORMADs。在出芽酵母中，Pch2已被证明在体外结合并重塑单个减数分裂HORMAD，Hop1[31]，在拟南芥中，PCH2免疫沉淀减数分裂HORMAD，ASY1。此外，PCH-2在其他系统中的直系同源物已被证明通过在突触时从染色体轴消耗或重新分配减数分裂HORMADs来促进减数分裂进展[32]，包括出芽酵母[33，34]，拟南芥[35]和小鼠[10]。在小鼠中，在突触开始时去除减数分裂的HORMAD，HORMAD1在TRIP13突变体中被消除[10]或当HORMAD1的N末端被删除时[27]，表明PCH-2及其直系同源物对减数分裂HORMADs的重塑类似于其对Mad2和Rev7的重塑。但是，在某些系统中，例如C。秀丽隐杆线虫、减数分裂HORMADs不依赖PCH-2进行核输入[2]，也不会在突触时从染色体中去除[21，22，36]。此外，PCH-2及其直系同源物定位于减数分裂染色体，作为出芽酵母，植物和C突触之前的病灶。秀丽隐杆线虫[2，34，35，37，38]和减数分裂HORMADs在出芽酵母、植物或小鼠的突触过程中未完全去除[10，33，35]。这些数据提出了一个重要的问题，即减数分裂HORMADs的重塑是否在减数分裂前期发挥了额外的作用。
在这里，我们使用遗传学，细胞学和生化数据的组合来论证PCH-2重塑减数分裂HORMADs以调节和协调C中的配对，突触，交叉重组和减数分裂进展。秀丽隐杆线虫。我们表明HTP-3的HORMA结构域中的错义突变抑制了pch-2突变体的配对和突触缺陷，但加剧了其重组缺陷，表明这两种蛋白质合作促进配对和突触，但独立调节重组。我们还表明，him-3中的类似突变加剧了pch-2突变体的突触缺陷，但抑制了其重组缺陷，这表明PCH-2专门作用于HIM-3以促进交叉重组。最后，我们表明减数分裂HORMAD HTP-1中的相应突变产生减数分裂进展的延迟，对突触和重组产生影响，并且可以被pch-2突变部分抑制，这表明PCH-2与HTP-1合作调节减数分裂进展。生化分析表明，这些突变限制了减数分裂HORMADs采用其封闭构象的能力。综上所述，我们的工作强烈支持一个模型，其中PCH-2将减数分裂HORMADs从闭合到未扣构象的重塑减缓配对，突触，重组和减数分裂进展，以校对同系物相互作用并保持减数分裂保真度。此外，PCH-2将其对不同减数分裂前期事件的调节干净地委托给不同的减数分裂HORMAD，为PCH-2如何机制地协调配对，突触和重组事件提供了新的见解。最后，它提供了一个潜在的解释，解释为什么这个减数分裂的HORMADs家族在C中急剧扩展。秀丽隐杆线虫，并提供了关于为什么某些模型系统具有多个减数分裂 HORMAD 的可能解释。
结果
PCH-2的定位与减数分裂染色体轴向元件上的重塑HORMADs一致
减数分裂HORMADs与凝聚素和其他轴向蛋白合作，将减数分裂染色体组织成功能上能够进行同系物间配对、突触和重组的线性轴向元件[5]。虽然PCH-2/TRIP13与减数分裂染色体的重塑有关，以确保其可用性[29，39]和进入细胞核[30]，但它在突触前后定位于减数分裂染色体[2，34，35，37，38]表明在染色体上重塑减数分裂HORMADs的作用是调节配对，突触和重组以及减数分裂进展。为了测试这一点，我们使用结构照明显微镜更仔细地研究PCH-2的定位是否与轴向元件上的减数分裂HORMADs重塑一致。
突触前和轴组装期间，当减数分裂HORMADs在整个细胞核中弥漫时，PCH-2定位于减数分裂染色体上的病灶[2]。突触后，PCH-2沿突触复合体（SC）定位，这种定位取决于中枢元件成分SYP-1[2，40]，它在突触过程中在轴向元件之间组装（图1A）。我们对针对PCH-2和SYP-1的野生型减数分裂细胞核进行了间接免疫荧光，并进行了结构照明显微镜检查以解析轴向元件之间的距离（图1B）[41]。虽然SYP-1在所有减数分裂细胞核中显示为连续宽度的线，但PCH-2染色通常比SYP-1更宽，有时在PCH-1轨道之间与SYP-2染色分裂为平行轨道（图1B和1C中的插图和箭头）。事实上，当我们量化PCH-2和SYP-1的信号强度时，我们发现PCH-2的信号比SYP-1跨越更远的距离（图1D），表明PCH-2可以驻留在或靠近突触染色体的轴向元件上，并可能重塑染色体上的减数分裂HORMADs。
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图1. PCH-2的定位与减数分裂轴上的重塑HORMAD一致。
一个。突触复合体的卡通，具有由减数分裂 HORMADs 和中心元素组件 SYP-1 组成的轴向元素。二.用PCH-2（绿色）和SYP-1（洋红色）抗体染色的减数分裂细胞核的结构照明显微镜（SIM）图像。箭头表示PCH-2可能与减数分裂轴相关的区域。比例尺表示 5 微米。三.PCH-2 和 SYP-1 信号的裁剪插图。黄线表示测量的像素强度面积。D.PCH-2（绿色）和SYP-1（洋红色）像素强度的线扫描，以像素为单位绘制距离。
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HTP-3 H96Y抑制PCH-2突变体中配对和突触的加速
在确定PCH-2的定位与染色体上重塑减数分裂HORMADs的能力一致后，我们寻找可能支持这种可能性的遗传相互作用。htp-3（vc75）是一种错义突变，在HORMA结构域（H96Y）中用酪氨酸取代组氨酸96（图2A）。HTP-3H96Y正确定位于减数分裂染色体[42]，不影响配对、突触和交叉重组[42，43]。然而，我们和其他人之前表明，htp-3中的这种突变消除了C中的减数分裂检查点反应。秀丽隐杆线虫[42，43]。由于这种表型，我们分析了HTP-3与PCH-2在调节配对，突触，重组和减数分裂进展方面的关系。
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图2. C中减数分裂HORMADs的HORMA结构域结构。秀丽隐杆线虫。
一个。描绘HTP-3，HIM-3，HTP-1和HTP-2的蛋白质结构域的卡通。HORMA域名和闭合图案显示为彩色框并贴上标签。图中显示了由CRISPR / Cas9产生的突变。二.HTP-3，HIM-3，HTP-1和HTP-2的HORMA结构域的Clustal Omega排列。星号代表保守的残基，：代表保守的变化，代表半保守的变化。红色框表示每个相应 HORMAD 的突变目标驻留。三.C的结构。秀丽隐杆线虫HTP-3 HORMA结构域（粉红色）与闭合基序（灰色）结合，由AlphaFold 2预测[93]。右图显示了H96的位置。D.野生型叠加（灰色;PDB ID 4TRK）和C的R93Y突变体（绿色/粉红色）。秀丽隐杆线虫HIM-3。右图显示了残基93的位置，并显示整个HORMA结构域结构不因精氨酸93突变为酪氨酸而受到影响。E.C的结构。秀丽隐杆线虫HTP-1 HORMA 域 （PDB ID 4TZQ）。右图显示了残留物G97（黄色球体）的位置，该残余物部分埋在相邻的α-螺旋上。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010708.g002
为了测试PCH-2是否与HTP-3发生遗传相互作用以调节配对，我们生成了pch-2;syp-1双突变体htp-3H96Y;SYP-1 双突变体和 PCH-2;HTP-3H96Y;SYP-1三重突变体，并与SYP-1单突变体进行比较评估配对。尽管未能加载SC成分，但syp-1空突变体仍成功进行配对，特别是在称为配对中心（PC）的特定位点[40]。因此，这些实验使我们能够独立于突触分析配对。我们对定位于X染色体上的PC的HIM-8蛋白进行了免疫荧光[44]，以评估整个种系中该位点的配对：两个HIM-8病灶表明X染色体未配对，而单个HIM-8焦点表明成对的X染色体。由于减数分裂细胞核在种系中以时空梯度排列，我们将种系划分为六个大小相等的区域以执行减数分裂时程，并确定每个区域中具有单个HIM-8焦点的细胞核的百分比（图3A和3B）。
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图3. HTP-3H96Y抑制配对和突触的加速，但加剧PCH-2突变体DNA修复和交叉形成的缺陷。
一个。描绘C中定量区域的卡通。秀丽隐杆线虫种系。二.用 DAPI（品红色）和抗 HIM-2 抗体（绿色）染色的 syp-1 突变蠕虫中区域 8 区的减数分裂细胞核。三.在区域 8-1 中用成对的 HIM-6 信号定量 syp-1（蓝色）、pch-2;syp-1（红色）、htp-3 的细胞核百分比 H96Y;SYP-1（绿色）和 PCH-2;HTP-3H96Y;SYP-1（紫色）突变菌株。误差线表示 95% 置信区间。D.野生型蠕虫中3区的减数分裂细胞核，用SYP-1（洋红色）和HTP-3（绿色）抗体染色。箭头表示未突触的染色体。E.在1-6区中对野生型（蓝色），pch-2（红色），htp-3的具有完整突触的细胞核百分比进行定量H96Y（绿色）和 PCH-2;HTP-3H96Y（紫色）突变菌株。误差线表示 95% 置信区间。F.定量 1-6 区中具有完整突触的细胞核百分比，用于 meDf2/+（蓝色）、pch-2;meDf2/+（红色）、htp-3 H96Y;meDf2/+ （绿色） 和 pch-2;htp-3H96Y;meDf2/+（紫色）突变菌株。误差线表示 95% 置信区间。G.用 DAPI（洋红色）染色和抗 RAD-4（绿色）抗体染色的野生型蠕虫中第 51 区的减数分裂细胞核。H.RAD-51病灶在1-6区野生型（蓝色）、pch-2（红色）、htp-3的平均数量定量H96Y（绿色）和 PCH-2;HTP-3H96Y（紫色）突变菌株。误差线表示平均值 （SEM） 的标准误差。我。来自对照组的减数分裂细胞核和用 DNA（洋红色）染色的 pch-2 突变蠕虫和针对 GFP：：COSA-1 的抗体（绿色）。顶部表示具有 6 个 GFP：：COSA-1 病灶的代表性细胞核。底部表示具有5个GFP：：COSA-1病灶的代表性细胞核。J.用 5 GFP：：COSA-1 病灶定量野生型 （n = 464）、pch-2 （n = 382）、htp-3 的细胞核百分比H96Y（n = 433） 和 pch-2;htp-3H96Y（n = 602）突变菌株。误差线表示 95% 置信区间。在所有图像中，比例尺表示 5 微米。在所有图形中，** 表示 p 值< 0.01，**** 表示 p 值 <0.0001，使用双尾费舍尔精确检验评估显著性。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010708.g003
与之前的工作类似[2，3]，我们发现pch-2;syp-2双突变体（1%，图76C）与syp-3单突变对照（1%，图49C）相比，pch-3区中具有成对X染色体的细胞核百分比增加（p值<2.0，通过双尾Fisher精确检验）。 HTP-0001H96Y与syp-1单突变对照相比，syp-1双突变体具有相似的配对率（46%，图3C，p值= 0.4001，通过双尾费舍尔精确检验），表明该突变不影响配对率。有趣的是，我们发现pch-2;htp-3H96YSYP-1三突变体与SYP-1单突变体和HTP-3具有相似的配对率H96Y;syp-1双突变体（49%，图3C），表明htp-3H96Y抑制在PCH-2突变体中观察到的配对加速。
接下来，我们测试了突触过程中pch-2和htp-3之间的遗传相互作用。我们分析了对照组、pch-2 单突变体、htp-3H96Y单突变体和PCH-2;HTP-3H96Y通过对轴向元件HTP-3[12，36]和中心元件SYP-1[40]进行免疫荧光的双突变蠕虫。然后，我们确定了每个区域中具有完整突触的细胞核的比例。完全突触可见为HTP-3和SYP-1的完全共定位，而突触不完全的细胞核具有没有SYP-3信号的HTP-1延伸（箭头，图3D）。与之前的数据类似，我们报道pch-2空突变体在区域61的突触速率（3%，图32E）与野生型对照（3%，图0E，p值<双尾费舍尔精确测试为0001.2）相比，在第6区具有延迟的去突触[2，3]（图3E）。HTP-3H96Y与野生型对照组相比，单突变体的突触率相似（36%，图3E，双尾Fisher精确检验p值= 0.228），表明突触率在该背景下不受影响，并且加速了突触脱析，如先前报道的那样[42]。与我们的配对结果类似，我们发现pch-2;htp-3H96Y与野生型对照和HTP-3相比，双突变体具有相似的突触率H96Y单突变体（34%，图3E），表明htp-3H96Y抑制PCH-2突变体中突触的加速。
为了进一步巩固PCH-2与HTP-3相互作用以调节突触，我们分析了meDf2杂合子（meDf2 / +）中的突触。meDf2是一种从X染色体中删除PC区域的突变[45]。由于PC对于配对和突触至关重要[36]，meDf2纯合子无法配对和突触X染色体，而meDf2杂合子的行为类似于部分功能丧失突变：~50%的细胞核完全突触为X染色体，其余50%具有未突触的X染色体[36]。在pch-2;meDf2/+蠕虫中，~85%的细胞核完全突触，表明PCH-2通常在PC功能受损时抑制突触[2]。
测试htp-3是否H96Y还抑制了pch-2;meDf2 / +蠕虫中的突触，我们产生了pch-2;htp-3H96YmeDf2 / +三重突变体并分析了突触率，并将其与对照组进行比较。与之前的结果类似，我们发现pch-87;meDf2 / +双突变体中2%的细胞核在区域5中实现完全突触，而meDf48 / +单突变蠕虫的完全突触为2%（图3F）。HTP-3H96YmeDf2/+蠕虫有52%的细胞核，在第5区有完整的突触，类似于meDf2/+单突变体（图3F）。PCH-2;HTP-3H96YmeDf2/+三重突变体在区域4中显示出最大水平的突触（36%，图3F），并且更接近于htp-3中观察到的突触水平。H96YmeDf2/+ 双突变体和 meDf2/+ 单突变体比 pch-2;meDf2/+ 双突变体。这些数据表明，当PC功能受损时，PCH-2抑制突触的能力取决于HTP-3的功能，也许更具体地说，取决于HTP-3的HORMA域，类似于我们在PC功能完全发挥作用时观察到的情况（图3E）。为了确定突触中的这些缺陷是否会产生染色体分离错误，我们对这些菌株中男性后代的百分比进行了评分。与 XX 雌雄同体相比，男性后代具有基因型 XO，可诊断为减数分裂中 X 染色体的错偏。HTP-3的能力H96Y抑制pch-2中X染色体的突触;在pch-2中观察到的男性后代的增加进一步支持meDf2 / +;htp-3 H96YmeDf2/+三突变体（10.84%，表1）与pch-2的比较;meDf2/+双突变体（0.83%，表1）。
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表 1. 生存能力和男性自我后代百分比。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010708.t001
HTP-3 H96Y加剧PCH-2突变体DNA修复和交叉形成的缺陷
接下来，我们测试了PCH-2是否通过测定pch-3;htp-2中的DNA修复和交叉形成来调节HTP-3的重组。H96Y双重突变体。通过量化整个种系中每个细胞核的RAD-51病灶数量来评估DNA修复率（图3G）。减数分裂染色体上RAD-51病灶的出现与DNA双链断裂的引入有关，它们的消失与DNA双链断裂进入修复途径有关[46]。与在酵母、小鼠和植物中观察到的情况形成鲜明对比的是，秀丽隐杆线虫的RAD-51病灶要少得多，这些病灶的数量在减数分裂前期后期达到峰值[46]。 例如，RAD-51 数量在野生型动物的第 4 区达到峰值，每个细胞核平均增加到 2 个，并且随着 DNA 修复过程中 RAD-51 被移除而减少。pch-2单突变体在51-4区每个细胞核的平均RAD-6病灶较低（图3H），这与先前的发现一致，即与野生型对照相比，pch-2突变体表现出更快的DNA修复速度[2]。HTP-3H96Y单个突变体显示出与野生型种系相似的DNA修复率（图3H），尽管RAD-51病灶的平均数量略低于野生型[42]。相比之下，pch-2;htp-3H96Y双突变体不仅表现出加速的DNA修复速度，类似于pch-2单突变体，它们在51区的平均RAD-5病灶数量减少（0.75病灶，图3H），表明htp-3的突变加剧了pch-2突变体DNA修复的加速。因为 htp-3H96Y而PCH-2突变体的DNA双链断裂数量并未减少[2，42]，这些结果反映了DNA修复速率的变化。此外，这表明，与我们的配对和突触发现相反，PCH-2不通过HTP-3来调节DNA修复速率。相反，这两种蛋白质都独立地调节DNA修复。
我们之前报道过pch-2;htp-3H96Y双突变体比任何一个单一突变体表现出更多的蝴蝶染色体[2]，表明双突变体在减数分裂交叉重组方面比任何一个单一突变体具有更严重的缺陷，并且与我们的DNA修复分析一致（图3H）。为了进一步验证交叉形成的结果，我们量化了每个减数分裂核的GFP：：COSA-1病灶的数量。COSA-1是一种细胞周期蛋白样蛋白，可特异性定位于推定的交叉，作为交叉形成的细胞学标志物[47]。因为C.秀丽隐杆线虫包含6对染色体并表现出强烈的交叉干扰，大多数野生型细胞核每个细胞核有6个GFP：：COSA-1病灶（图3I）[47]。我们的研究结果也反映了这一点，我们报告只有3%的细胞核具有少于6 GFP：：COSA-1病灶（图3J）。我们还发现，在pch-6单突变体中，GFP：：COSA-1病灶小于9的细胞核发生率增加到2%的细胞核（图3J，p值
总之，我们对配对、突触和交叉重组的分析表明，PCH-2和HTP-3共同调节配对和突触，但独立调节DNA修复和交叉形成（表2）。自 htp-3 以来H96Y单个突变体也显示出DNA损伤反应的缺陷[43]，而PCH-2突变体则没有[48]（见表2），这种功能分离并不一定令人惊讶。然而，更重要的是，这些数据强烈支持PCH-2通过HTP-3的HORMA结构域起作用的模型，以控制配对和突触的速度，而不是减数分裂重组的过程。
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表 2. 本研究中描述的与减数分裂HORMAD突变相关的表型摘要。
具有存活后代和雄性百分比的表格。括号中列出的后代总数。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010708.t002
HTP-3H96Y不影响减数分裂进展
在出芽酵母中，Pch2与减数分裂的HORMAD，Hop1一起工作，以控制减数分裂进展[32]。自 htp-3 以来H96Y突变体与C中的pch-2突变体发生遗传相互作用。秀丽隐杆线虫，我们还测试了HTP-3是否H96Y突变体影响减数分裂进展。我们之前报道过，尽管pch-2突变体的配对、突触和DNA修复加速，但在减数分裂进展中没有缺陷[2]。我们通过对DNA双链断裂形成所需的因子DSB-1（S1A图）进行免疫荧光来评估减数分裂进展。DSB-1定位于减数分裂染色体，促进DNA双链断裂形成[49]。为了应对减数分裂缺陷，DSB-1在染色体上持续存在，以维持DNA双链断裂形成的能力期，以促进交叉保证[49]，这种持久性与减数分裂进展延迟的其他标志物相关[50，51]。我们量化了DSB-1阳性的减数分裂细胞核的比例，并且无法检测到对照组和htp-3之间的任何差异。H96Y突变种系（S1B 图，p 值 = 0.8269 通过费舍尔精确测试），说明这种突变不会影响减数分裂进展。
htp-3的零突变消除了突触缺陷时观察到的减数分裂进展延迟，例如syp-1突变体[50]。要确定 htp-3 是否H96Y影响SYP-1突变体的减数分裂进展，我们量化了syp-1单突变体和syp-1;htp-1中DSB-3阳性减数分裂核的比例H96Y双突变体，并且无法观察到这些基因型之间的任何差异（S1C 图，p 值 = 1.0 通过 Fisher 的精确测试），表明 htp-3H96Y不影响存在减数分裂缺陷时观察到的减数分裂进展的扩展。
HIM-3R93Y不抑制PCH-2突变体中配对或突触的加速
我们发现PCH-2通过HTP-3促进配对和突触，而不是重组，这表明PCH-2通过HTP-3独立机制调节重组。此外，尚不清楚PCH-2是否仅通过与HTP-3的相互作用来调节配对和突触，或者其他减数分裂HORMADs是否也有助于这种调节。为了解决这些可能性，我们接下来测试了pch-2是否与him-3或htp-1中的类似突变发生遗传相互作用，这些基因编码了C减数分裂所必需的另外两个HORMADs。秀丽隐杆线虫。
我们对HTP-3与其他三种减数分裂HORMADs进行了Clustal Omega比对[52]，并观察到htp-3H96Y不属于守恒定基，但在所有四个减数分裂HORMAD中与两个不变残基相邻（图2B中的红框）。此外，基于这种对齐，HIM-93位置3的精氨酸应该在HORMA结构域内相似地定位（图2C和2D）。使用CRISPR / Cas9基因编辑，我们对htp-3进行了相应的错义突变。H96YHIM-3中的等位基因，其中精氨酸93被酪氨酸取代（HIM-3 R93Y).间接免疫荧光证实，该突变不影响HIM-3对染色体的定位（S2图）、后代活力或雄性后代的产生（表1）。
首先，我们分析了syp-1，pch-2;syp-1，him-3中的配对。 R93Y;syp-1 和 pch-2;him-3R93Ysyp-1突变体通过对HIM-8进行免疫荧光（图4A和4B）。HIM-3R93Ysyp-1双突变体在区域44中显示出2%的细胞核完成配对，类似于syp-1单突变体（双尾费舍尔精确检验p值= 1.00），表明这种突变不影响配对（图4B）。与我们对 htp-3 的分析相反H96Y等位基因，我们发现pch-2;him-3R93Y;syp-1三突变体也显示出与pch-63相似的配对表型加速率（4%，图2B）;syp-1双突变体（p值= 0.52，通过双尾费舍尔精确检验）。因此，我们检测到pch-2和him-3之间没有遗传相互作用。R93Y影响配对率。
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图4. HIM-3R93Y不抑制配对、突触或DNA修复的加速，但抑制PCH-2突变体交叉形成的缺陷。
一个。用 DAPI（洋红色）和 HIM-2 抗体（绿色）染色的 syp-1 突变体中区域 8 区的减数分裂细胞核。二.在区域 8-1 中用成对的 HIM-6 信号定量 syp-1（蓝色）、pch-2;syp-1（红色）、him-3 的细胞核百分比 R93Y;SYP-1（绿色）和 PCH-2;HIM-3R93Y;SYP-1（紫色）突变菌株。误差线表示 95% 置信区间。C.野生型蠕虫中3区的减数分裂细胞核，用SYP-1（洋红色）和HTP-3（绿色）抗体染色。箭头表示未突触的染色体。D.在1-6区中具有完整突触的野生型（蓝色），pch-2（红色），him-3的核百分比的定量R93Y（绿色）和 PCH-2;HIM-3R93Y（紫色）突变菌株。误差线表示 95% 置信区间。E.定量在区域1-6中具有完整突触的细胞百分比，用于meDf2 / +（蓝色），pch-2;meDf2 / +（红色），him-3R93Y;meDf2/+ （绿色） 和 pch-2;him-3R93Y;meDf2/+（紫色）突变菌株。误差线表示 95% 置信区间。F.用DAPI（洋红色）和抗RAD-4抗体（绿色）染色的野生型蠕虫中51区的减数分裂细胞核。G. 野生型（蓝色）、pch-51（红色）、him-1 区 6-2 区 RAD-3 病灶平均数量的定量R93Y（绿色）和 PCH-2;HIM-3R93Y（紫色）突变菌株。误差线表示平均值 （SEM） 的标准误差。H.来自对照的减数分裂细胞核和用DNA染色的pch-2突变蠕虫（洋红色）和针对GFP：：COSA-1（绿色）的抗体。顶部表示具有 6 个 GFP：：COSA-1 病灶的代表性细胞核。底部表示具有5个GFP：：COSA-1病灶的代表性细胞核。I.用5 GFP：：COSA-1病灶定量野生型（n = 392），pch-2（n = 398），him-3的细胞核百分比R93Y（n = 382） 和 pch-2;him-3R93Y（n = 378）突变菌株。误差线表示 95% 置信区间。J.来自野生型和用DAPI染色的pch-2突变蠕虫的卵母细胞。左图表示单价为零的代表性卵母细胞。右图表示具有单价（箭头）的代表性卵母细胞。比例尺表示 5 微米。K.用单价卵母细胞百分比定量野生型（n = 155），pch-2（n = 232），him-3R93Y（n = 174） 和 pch-2;him-3R93Y（n = 158）突变菌株。误差线表示 95% 置信区间。在所有图形中，NS 表示不显著，* 表示 p 值< 0.05，** 表示 p 值< 0.01，*** 表示 p 值< 0.001，**** 表示 p 值<0.0001。使用双尾费舍尔精确检验评估显著性。在所有图像中，比例尺表示 5 微米。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010708.g004
接下来，我们评估了野生型pch-2，him-3的突触率R93Y和 pch-2;HIM-3R93Y通过对SYP-1和HTP-3进行免疫荧光的种系（图4C和4D）。在 pch-2 和 him-3 中R93Y单突变体，我们发现在区域2中完成突触的细胞核数量增加（两者均为13%，而野生型对照为3%，图4D），这表明两个突变体的突触都加速了（p值<0.0001，通过双尾费舍尔精确测试进行两次比较）。然而，我们发现pch-2;him-3R93Y双突变体比任何单个突变体表现出更严重的突触缺陷：突触速率在整个区域2-5中延迟，并且这些双突变体在整个种系中仅达到87%的完全突触（图4D）。这些结果表明，PCH-2和HIM-3相互独立地调节突触的进展。
最后，我们进一步评估了him-3的突触R93Y 和 pch-2;HIM-3R93Y通过对meDf2杂合子（meDf2 / +）中的突触进行评分突变体。与调节突触的作用一致，him-3R93Y与meDf2/+对照组相比，meDf4 / +双突变体显示出较低的突触率（图2E）（参见区域4和5）。这种效应在pch-2;him-3中是中间的。R93Y;meDf2 / +三重突变蠕虫，进一步支持PCH-2和HIM-3都调节突触，但通过独立的机制实现这一目标。
HIM-3R93Y不抑制pch-2突变体中的DNA修复缺陷
接下来，我们测试了pch-2是否与他-3发生遗传相互作用。R93Y在通过对 N51、pch-2、him-2 中的 RAD-3 病灶进行评分来调节 DNA 修复期间R93Y和 pch-2;HIM-3R93Y突变体（图4F）。在他-3R93Y单突变体，51区RAD-3病灶的平均数量高于PCH-2和对照种系，表明RAD-51的安装速度更快，并且可能有更多的DNA双链断裂。然而，DNA修复率与野生型相似（图4G）。PCH-2;HIM-3R93Y蠕虫更像他-3R93Y单突变体比 PCH-2 在 3 区单突变体，但在 him-3 之间R93Y和2区的pch-4单突变体（图4G），表明在pch-2突变体中观察到的DNA修复加速速率并未被him-3完全抑制R93Y突变，并且这两个因素不在同一途径中调节DNA修复。
HIM-3R93Y抑制PCH-2突变体的交叉重组缺陷
分析他-3的效果R93Y在交叉重组中，并测试与PCH-2突变体的遗传相互作用，我们对野生型，PCH-1，HIM-2中的GFP：：COSA-3病灶进行了评分。R93Y和 pch-2;HIM-3R93Y突变菌株（图4H）。与pch-2单突变体类似，我们发现him-5中的细胞核增加了1个GFP：：COSA-3病灶。R93Y突变体与野生型对照相比（10%，图4I，p值= 0.0004，通过双尾费舍尔精确检验），表明HIM-3中这种残基的突变导致交叉保证的丧失。与 pch-2 突变体和 him-3 相反R93Y单突变体，PCH-2;HIM-3R93Y与任何一个单突变体相比，双突变体的细胞核数量减少，病灶少于6个，并且更接近于在野生型核中观察到的频率（5%，图4I，p值= 0.016和0.0214，分别通过双尾费舍尔精确检验）。因此，him-3R93Y抑制在PCH-2突变体中观察到的交叉保证缺陷。
接下来，我们设想了我们是否可以在减数分裂阶段的后期观察到这种遗传抑制，当染色体对通过交叉连接时。野生型C.秀丽隐杆线虫卵母细胞含有 6 对染色体或二价体，这些可以可视化为 6 个“DAPI 染色体”。重组缺陷在卵母细胞中产生没有交叉或单价的同系物（箭头，图4J）。在我们对野生型卵母细胞的分析中，我们没有观察到任何单价（图4K）。与我们之前的发现类似[2]，我们发现与野生型对照相比，pch-2单突变体中具有单价的细胞核百分比增加（0.8%，图4K），进一步证明了交叉保证的丧失，导致achiasmate同系物对。虽然这种差异在统计学上并不显着，但它具有生物学意义，因为我们从未在野生型卵母细胞中看到单价。与我们的GFP：：COSA-1分析相关，him-3R93Y单突变体含有单价的卵母细胞数量也有所增加（1.3%，图4K），表明him-3R93Y突变体也观察到交叉保证的丧失。在 pch-2;him-3 中R93Y双突变体，我们没有发现单价的实例（图4K），进一步表明这两个突变等位基因在交叉重组的背景下相互遗传抑制。
综上所述，我们的结果与PCH-2通过HIM-3促进交叉重组但不促进配对或突触的模型一致（表2）。此外，两个减数分裂HORMAD的作用似乎被明确委派，PCH-2通过HTP-3控制配对和突触，通过HIM-3交叉重组。由于我们在分析pch-2;him-3中的DNA修复时没有观察到类似的遗传相互作用。R93Y双突变体，这种交叉重组的调节发生在RAD-51的安装和移除之后。
HIM-3R93Y不影响减数分裂进展
接下来我们测试了他-3R93Y突变体通过对DSB-1进行免疫荧光并量化野生型和him-1中DSB-3阳性的部分来影响减数分裂进展R93Y突变菌株（S3A图）。我们发现野生型和him-1之间的DSB-3阳性核数量没有显着差异R93Y突变菌株（S3B图，p值= 0.645空白，通过双尾费舍尔精确测试），表明这种突变不影响减数分裂进展。
我们进一步测试了him-3是否R93Y突变通过量化syp-1和him-1中DSB-3阳性细胞核的比例影响减数分裂进展R93Y;SYP-1突变株。类似于我们对 htp-3 的发现H96Y，我们发现syp-1单突变体s和him-1之间的DSB-3阳性核数量没有显着差异R93Y;syp-1双突变体（S3C图，p值= 1.00，通过双尾费舍尔精确检验）。这一结果进一步证明了他-3R93Y不影响减数分裂进展。
HTP-1G97T不抑制PCH-2突变体的加速配对速率
我们的研究结果表明，PCH-2通过HTP-3促进配对和突触，HIM-3促进交叉形成。接下来，我们想测试pch-2是否与htp-1中的类似突变发生遗传相互作用，htp-<>是编码C中最终必需减数分裂HORMAD的基因。秀丽隐杆线虫。
HTP-1的HORMA结构域的初步结构分析表明，分别类似于HTP-3和HIM-3的组氨酸和精氨酸残基的甘氨酸残基（图2B）位于HORMA结构域的内部（图2E），因此在不影响HTP-1稳定性的情况下，我们可以在该位点引入的突变中可能受到更多限制。事实上，当我们通过CRISPR / Cas9基因编辑（htp-1G97Y)，这种突变表型类似于HTP-1（ME84）空等位基因[11]，其中这种甘氨酸残基突变为谷氨酸，产生很少的活后代和高发生率的雄性（HIM）表型。鉴于 htp-1 的严重性G97Y突变将排除我们对减数分裂前期事件的分析，我们试图创建一个不太严重的HTP-1亚态等位基因，以测试它是否与PCH-2零突变发生遗传相互作用。
为了鉴定可以分析配对，突触，重组和减数分裂进展的突变，我们使用CRISPR / Cas9用氨基酸代替甘氨酸97，氨基酸逐渐在该位置添加更庞大的侧链（htp-1G97A， HTP-1G97S和 HTP-1G97T).在对这些菌株进行初步检查时，我们观察到与htp-1相关的HIM表型G97T突变株（表1），表明该突变导致减数分裂染色体错偏。这种HIM表型伴随着胚胎活力的降低（表1）。因此，我们将测试与pch-2的遗传相互作用以进行配对，突触和重组的分析限制在htp-1上。G97T突变 体。间接免疫荧光显示HTP-1对减数分裂染色体的负载在htp-1中没有差异G97T突变体或 HTP-1G97T HTP-2双突变体（S4图）。
我们首先通过在syp-8，pch-1;syp-2，htp-1中对HIM-1进行免疫荧光来测试该菌株中的配对是否被破坏G97T;SYP-1和PCH-2;HTP-1G97T;syp-1突变种系（图5A和5B）。在 htp-1 中G97T;syp-1 双突变体，在区域 2 中完成配对的细胞核百分比与 syp-1 单突变体相似（图 5B，p 值 = 0.553，通过双尾费舍尔精确检验），表明 htp-1G97T;SYP-1双突变体在配对进展中没有缺陷。PCH-2;HTP-1G97T;与pch-1相比，syp-2三突变体在区域2中的配对率相似;syp-1双突变体（图5B，p值= 0.311，通过双尾费舍尔精确检验），表明htp-1G97T突变不会抑制在PCH-2突变体中观察到的配对加速。
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图5. HTP-1G97T在配对、突触、DNA修复或交叉形成的背景下不与PCH-2发生遗传相互作用。
一个。用 DAPI（洋红色）和 HIM-2 抗体（绿色）染色的 syp-1 突变体中区域 8 区的减数分裂细胞核。二.在区域 8-1 中用成对的 HIM-6 信号定量 syp-1（蓝色）、pch-2;syp-1（红色）、htp-1 的细胞核百分比 G97T;SYP-1（绿色）和 PCH-2;HTP-1G97T;SYP-1（紫色）突变菌株。误差线表示 95% 置信区间。三.野生型蠕虫中3区的减数分裂细胞核，用SYP-1（洋红色）和HTP-3（绿色）抗体染色。箭头表示未突触的染色体。D.在1-6区中对野生型（蓝色），pch-2（红色），htp-1的具有完整突触的细胞核百分比进行定量G97T（绿色）和 PCH-2;HTP-1G97T（紫色）突变菌株。误差线表示 95% 置信区间。E.用DAPI（洋红色）和抗RAD-3抗体（绿色）染色的野生型蠕虫中区域51的减数分裂细胞核。F.野生型（蓝色）、pch-51（红色）、htp-1 区域 6-2 区 RAD-1 病灶平均数量的定量G97T（绿色）和 PCH-2;HTP-1G97T（紫色）突变菌株。误差线表示平均值 （SEM） 的标准误差。G.对照中的减数分裂细胞核和用 DNA（洋红色）和抗 GFP：：COSA-2（绿色）抗体染色的 pch-1 突变蠕虫。顶部表示具有 6 个 GFP：：COSA-1 病灶的代表性细胞核。底部表示具有5个GFP：：COSA-1病灶的代表性细胞核。H.野生型 （n = 1）、pch-298 （n = 2）、htp-334 每个细胞核 GFP：：COSA-1 病灶分布的定量G97T（n = 241） 和 pch-2;htp-1G97T（n = 254））突变菌株。E.来自野生型的卵母细胞和用DAPI染色的pch-2突变蠕虫。顶部表示具有零单价的代表性卵母细胞。底部表示具有单价（箭头）的代表性卵母细胞。F.具有单价的卵母细胞百分比定量野生型 （n = 94）、pch-2 （n = 92）、htp-1G97Y（n = 104） 和 pch-2;htp-1G97Y（n = 92）突变菌株。在所有图形中，NS 表示不显著，**** 表示 p 值< 0.0001。使用双尾费舍尔精确检验评估显著性。在所有图像中，比例尺表示 5 微米。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010708.g005
HTP-1G97T导致严重的突触缺陷，这些缺陷不被PCH-2突变抑制
接下来，我们测试了突触是否在htp-1中受到干扰G97T突变体以及该等位基因是否与pch-2空等位基因发生遗传相互作用（图5C和5D）。突触在HTP-1中受到严重破坏G97T突变体：尽管一些染色体完成突触（图5D），但几乎所有减数分裂细胞核在整个种系中都有一定数量的未突触染色体，其中只有1.3%的细胞核达到完全突触（图5D）。在 pch-2 中;HTP-1G97T双突变体，我们发现突触被破坏得与HTP-1一样严重G97T单突变体，其中1.3%的细胞核也达到完全突触（图5D，p值= 0.717通过双尾费舍尔精确测试），表明这些等位基因不会相互独立地遗传相互作用和调节突触。
HTP-1G97T导致 RAD-51 去除延迟，但 pch-2 突变未抑制
接下来，我们评估了htp-1中DNA修复的进展G97T和PCH-2;HTP-1G97T通过在整个种系中对RAD-51病灶进行评分的突变体（图5E和5F）。与对照种系相比，htp-1G97T单个突变体在RAD-51病灶的安装中表现出延迟（图5F）。然而，随着减数分裂前期的继续，htp-1中的减数分裂核G97T单个突变体具有更多的RAD-51病灶，并显着延迟其去除，可能是我们在该突变体中观察到的突触缺陷的间接结果（图5D）。PCH-2;HTP-1G97T双突变体在RAD-51安装中不再表现出这种延迟，表明该特定表型的部分抑制，但显示更多的RAD-51病灶，特别是在区域4和5，而不是野生型减数分裂核和pch-2单突变体，类似于HTP-1G97T单突变体。因此，PCH-2和HTP-1似乎没有遗传相互作用来调节DNA修复的速度。
HTP-1G97T导致交叉重组缺陷，这些缺陷未被PCH-2突变抑制
为了继续我们的分析，我们通过对野生型中每个细胞核的GFP：：COSA-1病灶数量进行评分来分析交叉重组，pch-2，htp-1G97T和 PCH-2;HTP-1G97T突变体（图5G和5H）。令人惊讶的是，我们发现在 htp-1G97T单突变体，COSA-1病灶的数量在细胞核间差异很大，从4到9不等，只有39%的细胞核有6个GFP：：COSA-1病灶（图5H），表明htp-1G97T突变导致交叉形成的失调。除了交叉保证的丧失（小于6 GFP：：COSA-1焦点的细胞核）之外，我们还观察到交叉干扰的丧失（大于6 GFP：：COSA-1焦点的原子核），表明htp-1中交叉控制普遍丧失G97T突变 体。在 pch-2 中;HTP-1G97T双突变体，我们观察到类似的表型，其中GFP：：COSA-1的数量在细胞核中变化，范围从4到9，只有45%具有6个COSA-1病灶（图5H，p值= 0.1725通过双尾费舍尔精确测试）。总体而言，这些数据表明PCH-2和HTP-1没有遗传相互作用来调节交叉重组。
我们通过直接观察卵母细胞中的二价物进一步分析了交叉形成，并量化了野生型pch-2，htp-1中单价的频率G97T和 PCH-2;HTP-1G97T突变体（图5I和5J）。在 htp-1 中G97T单突变体，我们发现单价的频率显着增加到41%（图5J，p值<0.0001通过双尾费舍尔精确测试），进一步验证了htp-1中交叉形成的缺陷G97T单突变体。对于 pch-2;HTP-1G97T双突变体，我们还发现，与野生型卵母细胞相比，单价的频率在统计学上更高（31%，图5J，p值<双尾费舍尔精确测试为0.0001），但与htp-1相比没有显着差异G97T单突变体（31%，图5J，p值= 0.182，通过双尾费舍尔精确检验）。综上所述，这表明pch-2和htp-1都促进了交叉保证，但通过不同的机制对其进行了调节。
HTP-1G97T延缓减数分裂进展，这种延迟被PCH-2突变部分抑制
缺少HTP-1会加速减数分裂进展，产生非同源突触和更快速的DNA修复[11]。相反，HTP-1的HORMA结构域内的突变阻止其在减数分裂染色体上的负载，导致减数分裂进展延迟，产生突触[53]。我们测试了htp-1是否G97T突变同样通过对DSB-1进行免疫染色来影响减数分裂进展。
我们量化了野生型和htp-1中DSB-1阳性减数分裂细胞核的比例G97T突变种系（图6A）。我们发现 htp-1G97T突变体在DSB-1阳性细胞核的比例中显示出统计学上的显着增加（81%，p值<0.0001，通过双尾费舍尔精确测试图6B），表明该突变产生减数分裂进展的延迟。由于DSB-1是DNA双链断裂形成所必需的，因此DSB-1的扩展可能解释了htp-51中RAD-5病灶的增加（图5F）和交叉干扰的衰减（图1H）G97T突变 体。此外，由于RAD-51病灶形成的增加（图5F）伴随着GFP：：COSA-1病灶的增加（图5H），htp-1G97T突变体似乎在交叉稳态中也存在缺陷，这种机制可确保即使交叉前体的数量（例如DNA双链断裂）发生变化，交叉的数量保持不变[54]，并且在C中特别稳健。秀丽隐杆线虫[47]。
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图6. HTP-1G97T延缓减数分裂进展，这种延迟被PCH-2突变部分抑制。
一个。用DAPI（洋红色）和DSB-1抗体（绿色）染色的全长代表性种系。黄色虚线表示DSB-1阳性细胞核的区域。比例尺表示 20 微米。二.DSB-1阳性减数分裂核的定量分析（n = 2355），htp-1G97A（n = 2340）， HTP-1G97S（n = 2113）， HTP-1G97T（n = 1955） 和 pch-2;htp-1G97T（n = 1763）突变菌株。NS 表示不显著。** 表示 p 值 <0.01。表示 p 值< 0.001。表示 p 值 <0.0001。使用双尾费舍尔精确检验评估统计学显著性。误差线表示 95% 置信区间。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010708.g006
鉴于这种表型的严重程度，我们想知道我们产生的不太严重的突变，htp-1G97A和 HTP-1G97S突变体也可能影响减数分裂进展，尽管影响较弱（图6A）。虽然 htp-1G97A突变体不影响DSB-1阳性细胞核HTP-1的比例G97S突变体在减数分裂进展中产生了小但统计学上显着的延迟（63% DSB-1阳性细胞核，图6B，p值= 0.0006，通过双尾Fisher精确测试），表明在该残基上引入体积较大的氨基酸产生关于减数分裂进展缺陷的等位基因序列。
接下来，我们测试了htp-1减数分裂进展中的这种缺陷G97T单个突变体被PCH-2突变抑制。我们发现 pch-1 中 DSB-2 染色细胞核的百分比略低但显着降低;HTP-1G97T双突变体（77%，图6B）与htp-1的比较G97T单突变体（图6B，p值=0.0047，通过双尾费舍尔精确检验），表明htp-1中的减数分裂进展缺陷G97T突变体被PCH-2突变部分抑制，并且这两种蛋白质合作调节减数分裂进展（表2）。
HIM-3R93Y和 HTP-1G97T突变体具有功能性减数分裂检查点
我们之前表明 htp-3H96Y突变体消除了DNA损伤反应和突触检查点[43]，类似于HTP-3和HIM-3中的零突变[55]。htp-1的零突变仅影响突触检查点[55]。确定他-3R93Y或 HTP-1G97T突变体影响减数分裂检查点激活，我们将每个突变引入SYP-1突变体背景并评估种系凋亡的水平。SYP-1突变体激活DNA损伤反应和突触检查点，产生高水平的种系凋亡[48]。HIM-3R93Y突变体显示出野生型细胞凋亡水平，而HTP-1G97T突变体表现出与syp-1单突变体相似的种系凋亡（S6图，p值<学生t检验为0.0001），可能是由于我们观察到的突触和重组缺陷的结果（图5）。两个syp-1;him-3R93Y和 syp-1;htp-1G97T双突变体表现出与SYP-1单突变体相似的种系凋亡水平（S6图），表明Him-3R93Y或 HTP-1G97T突变体能够进行减数分裂检查点激活，与 HTP-3 不同H96Y突变体[43]。
HIM-3R93Y突变体保持HORMA结构域的结构，但对闭合基序的亲和力降低
到目前为止，我们的数据表明，pch-2与htp-3，him-3和htp-1的特定等位基因发生遗传相互作用，对配对，突触，重组和减数分裂进展具有不同的影响。然而，这些遗传相互作用如何转化为对PCH-2和这些减数分裂HORMADs之间功能关系的分子理解尚不清楚。为了解决这个问题，我们测试了这些突变对减数分裂HORMADs结合其闭合基序并采用闭合构象的能力的影响。
虽然HTP-3的闭合基序尚不清楚，但已知HIM-3结合HTP-3C末端尾部内的闭合基序[19]。HIM-3在其自身的C端也包含一个闭合基序，但它优先结合HTP-3中的闭合基序，以有助于分层的HORMAD组装[19]。我们克隆并表达了野生型HIM-3和HIM-3R93Y在E.大肠杆菌，纯化每种蛋白质，并进行荧光偏振肽结合测定以测试HIM-3R93Y在体外结合编码HTP-3闭合基序#4的肽。与之前的工作一致，我们发现野生型HIM-3将HTP-3闭合基序与Kd220 +/- 20 nM，发现它不与具有混乱序列的对照肽结合（图7A）。HIM-3R93Y结合相同的闭合主题，增加 Kd的 690 +/- 130 nM，表明 HIM-3R93Y与野生型HIM-3相比，结合HTP-3闭合基序的亲和力降低（图7A）。HIM-3的热稳定性R93Y与野生型HIM-3相似（S5图），晶体结构为HIM-3R93Y在闭合构象中相当于野生型HIM-3（图2D），表明对HIM-3闭合基序的亲和力降低R93Y不是由于蛋白质的不稳定或无法采用封闭构象。这些结果表明，HIM-3R93YHTP-3闭合基序的结合不如野生型HIM-3容易，这可能会限制其在体内采用闭合构象的能力（图7B）。由于该残基在所有三种必需减数分裂HORMADs中的位置相似（图2B），我们对HIM-3的生化分析R93Y可推广到 HTP-3 和 HTP-1 的突变版本：HTP-3H96Y和 HTP-1G97T可以结合它们各自的闭合基序，亲和力较低，影响它们在体内采用闭合构象的能力。
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图7. HIM-3R93Y突变体对闭合基序的亲和力降低。
一个。HIM-3（蓝色）和HIM-3的荧光偏振肽结合试验R93Y（绿色）并测量了 Kd。二.描绘野生型HIM-3和HIM-3的开放和封闭构象转换模型的漫画R93Y.
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010708.g007
与出芽酵母减数分裂HORMAD不同，Hop1[56]，HIM-3除了其封闭构象[19]外，很难在任何构象中纯化，这阻止了我们直接评估HIM-3是否R93Y突变影响蛋白质的闭合与未扣构象平衡。然而，HIM-3的亲和力降低R93Y对于HTP-3闭合基序，当与Hop1的既定构象动力学[56]相结合时，通过结构照明显微镜定位PCH-2（图1）以及我们对这些突变等位基因如何抑制在PCH-3突变体中观察到的一些缺陷的遗传和细胞学分析（图6-2）提出了一个与PCH-2一致的模型，从减数分裂染色体上的封闭到未扣的构象进行重塑以控制 配对、突触、减数分裂重组和细胞周期进展的进展（图8）。
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图8. PCH-2通过重塑不同的减数分裂HORMADs来分配其对减数分裂前期事件的调节。
描绘PCH-2调节减数分裂前期事件的拟议模型的漫画。PCH-2通过HTP-3调节配对的进展，通过HIM-3的交叉重组，并可能通过HTP-1调节减数分裂进展。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010708.g008
讨论
自从2多年前在出芽酵母中发现Pch20以来[38]，Pch2 / PCH-2 / TRIP13在减数分裂中的特殊作用一直是神秘的。最近，哺乳动物TRIP13如何通过重塑HORMA结构域蛋白MAD2来促进纺锤体检查点进展的生化和结构分析[24，26，27]为建立Pch2 / PCH-2 / TRIP13在构建减数分裂染色体以进行同系物配对，突触和重组以及信号减数分裂进展中的不同作用提供了一个有用的框架。在纺锤体检查点中，PCH-2/TRIP13通过维持可溶性“开放”MAD2池来促进检查点活化，MAD57用于在未连接的动粒处构建有丝分裂检查点复合物并延迟期发作[59-13]。动粒附着后，TRIP2在人细胞中发挥额外的作用，通过重塑MAD60来分解有丝分裂检查点复合物，促进检查点失活和后期进展[61，59]。这种活动不一定是保守的，因为在C中没有观察到在使检查点沉默方面起的类似作用。秀丽隐杆线虫[62，2]，Pch38在S的减数分裂之外不表达。酿酒[13]。尽管如此，在某些系统中，TRIP2似乎在纺锤体检查点激活和失活中起着双重作用，通过将“封闭的”MAD<>转化为“开放的”构象体的单一生化活性。
最近，对出芽酵母以及植物和哺乳动物中Pch2的研究表明，这种酶在减数分裂染色体组织，同源重组和减数分裂进展中起着类似的双重作用。在大多数生物体中，减数分裂HORMADs采用“自闭合”构象，其HORMA结构域与自身C末端的闭合基序结合[19，28，30]。在出芽酵母和植物中，需要Pch2/TRIP13的重塑活性将这些“自闭”的HORMADs转化为“开放”或“未扣”的构象，以促进其核输入和与染色体的关联[29，30]。HORMADs组装成减数分裂染色体的轴向元件后，可能通过与伙伴蛋白的直接蛋白质-蛋白质相互作用促进减数分裂重组和同系物配对[6，63]。一旦同系物重组和突触，Pch23/TRIP2就会被募集到突触复合物中[13，34，35]，在那里它被认为会分解HORMAD轴蛋白复合物以消耗它们[38，10，33]。HORMAD耗竭下调重组，促进剩余DNA断裂的快速修复，并促进减数分裂进展[35，64]。
在C.秀丽隐杆线虫，相对于酵母，植物和哺乳动物的减数分裂事件时间的几个关键差异，需要重新思考PCH-2在减数分裂进展中的作用。首先，同系物配对和突触的发生独立于C中的重组。秀丽隐杆线虫[66]，使得突触不能像其他生物体那样作为成功同系物重组的信号。其次，减数分裂HORMADs独立于PCH-2定位于减数分裂染色体[2]，并且不会因突触而明显耗尽[21，22，36]，这表明Pch2 / TRIP13在其他系统中提出的双重作用与理解PCH-2在C中的功能无关。秀丽隐杆线虫减数分裂。最后，pch-2的零突变或消除其ATP水解活性的突变会导致加速的同系物配对、突触和减数分裂重组，从而导致减数分裂保真度的丧失[2，3]。由于这些事件可能是由减数分裂染色体上的直接HORMAD-伴侣蛋白相互作用介导的，并且PCH-2在减数分裂前期的相关阶段定位于染色体（图1）[2]，因此这些表型表明PCH-2要么降低染色体上HORMADs的总体水平，要么增加其关联解离动力学以调节这些关键事件。
我们在这项研究中的实验进一步阐明了这个模型。我们已经确定了HTP-3和HIM-3的HORMA结构域中的突变（图2A），这些突变似乎在染色体上正常加载[42]（S2和S4图），降低了体外闭合基序相互作用的亲和力（图7），并分别抑制了同系物配对/突触和重组中pch-2零突变的特定缺陷（图3和4).这些数据促使我们提出了一个模型，其中PCH-2将染色体相关HORMAD的HORMA结构域从“封闭”构象重塑为“开放/未扣”构象，以暂时降低HORMAD在染色体上的占用，减速HORMAD依赖性同系物配对，突触和重组以促进减数分裂保真度（图8).该模型的一个有吸引力但仍然具有推测性的扩展是PCH-2对减数分裂HORMADs的重塑破坏了HORMAD-伴侣蛋白相互作用的稳定性，这对于同系物配对，突触和重组至关重要，故意减缓其进展。
我们的模型对Pch2 / TRIP13在其他生物体中的既定作用具有重要意义。首先，酵母和植物中的Pch2/PCH2特异性定位于与突触启动和重组相关的位点[34，35]，这表明在突触之前暂时降低这些位点的HORMAD占据率具有类似的作用。此外，尽管观察到Pch2/TRIP13在突触时强烈消耗染色体上的减数分裂HORMADs，但这些蛋白质并未从任何生物体的染色体中完全去除[10，33，35]，这表明即使在染色体突触后，减数分裂HORMADs和Pch2/TRIP13也起作用。鉴于当染色体在出芽酵母、植物和小鼠中突触时，交叉形成的逐渐实施部分重叠[67-70]，我们建议突触染色体上Pch2 / TRIP13的存在重塑减数分裂HORMADS以调节交叉的数量和位置，类似于PCH-2在C中的一个作用。秀丽隐杆线虫[2，71]。
PCH-2和HTP-1之间的关系不太清楚。尽管HIM-3和HTP-1之间存在微小的结构差异（图2E），需要我们对HTP-1的突变分析进行一些调整，但我们预测HTP-1G97T还显示出HTP-3和HIM-3中对其闭合基序的亲和力降低，可能将其平衡转向未扣的构象。这种蛋白质功能差异的后果是减数分裂进展的显著延迟（图6B）以及突触、DNA修复和交叉重组的缺陷（图5D、5F和5H），与先前的数据一致[11，53，72]。然而，鉴于我们的数据，我们赞成将htp-1的主要缺陷解释为HTP-<>G97T突变体是减数分裂进展的延迟，对突触和重组产生继发性间接后果。pch-2的突变部分抑制了减数分裂进展中的这种缺陷（图6B），对突触或重组几乎没有影响（图5D和5H），支持我们的解释。减数分裂进展的延迟如何阻止完全突触或重组的正常完成？这种减数分裂延迟可能维持细胞周期状态，其中突触复合物和/或重组中间体更加不稳定并且通过翻译后修饰、高染色体迁移率、其他一些未知条件或这些条件的某种组合等机制进行周转。最后，如果我们是正确的，并且未扣的HTP-1增加G97T负责减数分裂延迟，对突触和重组产生间接影响，我们的数据还表明，与开放的MAD2不同，减数分裂HORMADs的未扣版本除了作为重要的结构中间体准备与伴侣蛋白中的闭合基序结合外，可能还具有其他功能。
pch-2的突变仅微弱地抑制了我们在htp-1中观察到的减数分裂进展的延迟。G97T突变体提出了两种可能性：1）HTP-1G97T突变太严重，无法让我们观察到这种遗传相互作用;或2）PCH-2不直接作用于HTP-1来调节减数分裂进展。PCH-2如何在不直接重塑HTP-1的情况下促进减数分裂进展的调节？由于HTP-3和HIM-3在其C末端都有HTP-1闭合基序[19]，PCH-2对HTP-3和HIM-3的重塑可能间接导致HTP-1的去除和重塑，有助于减数分裂进展的调节。这种可能性特别有吸引力，因为它明确地协调减数分裂进程与配对，突触和重组的速率。
最后，我们的工作表明，PCH-2对配对，突触，重组和减数分裂进展的调节被明确地委托给不同减数分裂HORMADs的重塑：我们建议PCH-2将HTP-3从封闭到未弹拨的构象重塑，以减缓配对和突触并有助于检查点激活，HIM-3直接或间接地减缓交叉重组和HTP-1， 控制减数分裂进展。这种减速允许校对作为这些事件基础的同系物相互作用并确保保真度[3]。在植物和小鼠中也观察到类似的功能分离：各有两个减数分裂HORMAD，其中只有一个（小鼠为HORMAD1，植物为ASY1），似乎是配对、突触和重组所必需的[9，15-17，73]。就小鼠而言，配对、突触或重组不需要第二个HORMAD2，但对于有效的减数分裂检查点反应至关重要[18，74]。在植物中，尚未报道ASY2的作用。我们在 C 中观察到的功能分离。秀丽隐杆线虫略有不同：三种基本的减数分裂HORMAD具有重叠但不同的角色，但对配对，突触和重组有显着影响[11-13，19，21，22]。然而，正是通过PCH-2的调节，它们的独特作用变得更加清晰，允许配对，突触，重组和减数分裂进展的协调。正如PCH-2的调控所揭示的那样，这种任务的委派也可以解释为什么这个家族在C中如此显着地扩展。秀丽隐杆线虫。由于包括哺乳动物在内的多个系统也具有多个减数分裂HORMAD，因此这种任务委派可能是减数分裂的保守进化特征。
另一个可能促成该家族在C中扩展的因素。秀丽隐杆线虫是减数分裂重组与突触的机制解耦。小鼠、出芽酵母和植物都依赖于减数分裂重组的启动[75-78]来促进准确的突触。同样，所有这些生物体都有一个基本的减数分裂HORMAD控制配对，突触和重组[6，9，15]，这表明这些观察结果之间可能存在联系。与这些系统相比，C.秀丽隐杆线虫不依赖于减数分裂重组来获得准确的染色体突触[66]，这表明减数分裂HORMADs家族可能已经扩大，以适应突触和重组受该系统中两种不同机制调节的事实。
虽然C.秀丽隐杆线虫的独特之处在于它有四个减数分裂 HORMAD，它们组装成一个分层复合体，从形式上讲，其他系统也可能具有不同的功能类别的减数分裂 HORMAD，即使它们的基因组中只有一个减数分裂 HORMAD。例如，在出芽酵母中，Hop1可以直接与核小体DNA结合[79]，这是轴蛋白Red1中的闭合基序，一旦与Red1结合，就可以与Hop1中的闭合基序结合，产生寡聚化[28]。这三类不同类别的Hop1，可能由它们与减数分裂染色体结合的分子性质定义，也可能分层组装，并对减数分裂前期的事件产生不同的影响。这些差异可能会影响Pch2对它们的调节，产生类似于我们在HTP-3，HIM-3和HTP-1中观察到的功能委派。例如，在出芽酵母中已经表明，在与端粒相邻的区域，Hop1对Pch2介导的再分布具有抗性[80]，这与Pch2差异调节的可能性一致。
我们的数据表明，PCH-2对减数分裂HORMADs的重塑对减数分裂前期事件的进展，协调性和保真度有影响。这项工作产生的主要问题是：1）PCH-2活性如何在某些情况下仅限于减数分裂HORMADs，而在其他情况下则不限于减数分裂HORMADs;2）这些减数分裂HORMADs如何促进配对，突触和交叉重组的事件？HTP-3分子如何参与配对和突触？HIM-3如何促进交叉重组？HTP-1如何控制减数分裂进展？未来的研究重点是了解减数分裂HORMADs如何分子相互作用，其他轴蛋白和/或其他结合伙伴，这将为减数分裂HORMADs如何与PCH-2合作，驱动减数分裂前期事件的协调以促进保真度和预防非整倍性提供新的线索。
材料和方法
遗传学和蠕虫品系
在整个研究中，秀丽隐杆线虫布里斯托尔N2菌株被用作野生型菌株[81]。除非另有说明，否则所有菌株均在标准条件下在20°C下生长。使用的突变和重排如下：
LG I： htp-3（vc75）， mnDp66
LG II： pch-2（tm1458）， meIs8 [Ppie-1：：GFP：：cosa-1 + unc-119（+）]
LG IV： him-3（blt9）， htp-1（blt10）， htp-1（blt11）， htp-1（blt12）， htp-2（tm2543）， nT1[unc-？ （n754让-？（m435）]
LG V： syp-1（me17）， bcIs39[Plim-7：：ced-1：：gfp; lin-15（+）]
LG X： meDf2
meDf2是X染色体左端的终末缺陷，可去除X染色体配对中心（PC）以及许多必需基因。因此，同合和半合meDf2动物也携带重复（mnDp66），包括这些必需基因，但不会干扰正常的X染色体分离[82]。
他-3R93Y (HIM-3[BLT9]）， HTP-1G97A (HTP-1[BLT10]）， HTP-1G97S (HTP-1[BLT11]）和HTP-1G97T (HTP-1[BLT12]）由CRISPR-Cas9基因组编辑辅以dpy-10共转换方法产生[83]。
使用以下引导RNA序列：
dpy-10 sgRNA： 5'GCU ACC AUA GGC ACC ACG AGG UUU UAG AGC UAU GCU 3'
HIM-3 SGRNA： 5'CGU GUG UCU UCA ACA UUC GAG UUU UAG AGC UAU GCU 3'
htp-1 sgRNA： 5' UCA ACU ACU UCG AAA UGC UGG UUU UAG AGC UAU GCU 3'
使用以下DNA修复寡核苷酸序列：
DPY-10： 5' CAC TTG AAC TTC AAT ACG GCA AGA TGA GAA TGA CTG GAA ACC GTA CCG CAT GCG GTG CCT ATG GTA GCG GAG GCG CTT CAC ATG GCT TCA GAC CAA CAG CCT AT 3'
HIM-3R93Y： 5' GCA TTC CAG AGC AGT GTT CCT GCC GCA AAG CGT GTG TCT TCA ACA TTT GAC GGA TTG TAC GAT GCG ATT CAA CAA GGC TAT TTG CGA GAG TTC GCA ATC GTG TAC AAG 3'
HTP-1G97A： 5' GCT TCA GAA ACC CAC GGT CTA ACC AAA TCG CTC AAC TAC TTC GAA ATG CTG ATG CAA CAA AGG ATG GGT TTC TGA AAG AAG TCT CCC TCG TGA TCA CAA ATG 3'
HTP-1G97S： 5' GCT TCA GAA ACC CAC GGT CTA ACC AAA TCG CTC AAC TAC TTC GAA ATG CTT CAG CAA CAA AGG ATG GGT TTC TGA AAG AAG TCT CCC TCG TGA TCA CAA ATG 3'
HTP-1 G97T： 5' 5' GCT TCA GAA ACC CAC GGT CTA ACC AAA TCG CTC AAC TAC TTC GAA ATG CTA CAG CAA CAA AGG ATG GGT TTC TGA AAG AAG TCT CCC TCG TGA TCA CAA ATG 3'
对于CRISPR / Cas9基因编辑，所有突变均在N2野生型菌株中进行，除了htp-1G97T HTP-2双突变菌株，其中HTP-1 G97T突变是在HTP-2（TM2543）突变背景中引入的。sgRNA和寡核苷酸修复模板由集成DNA技术合成（IDT，Coraville，IA）。注射混合物含有htp-1或him-3 sgRNA（100μM最终），dpy-10 sgRNA（100μM最终，[83]），tracrRNA（100μM最终，IDT），纯化的Cas9蛋白（40μM最终），htp-1或him-3 DNA修复寡核苷酸（50μM最终，IDT）和dpy-10修复寡核苷酸（50μM最终，IDT，[83]）。 年轻人被注射，恢复并在15或20度下储存。将滚轮或dpy F1单打到接种有OP50的单个平板上，并通过PCR和BspHI限制性酶切（htp-1）或RsaI限制性酶切（him-3）筛选突变等位基因的存在。然后从含有等位基因的F2平板中分离单个F1以鉴定纯合菌株。
所有突变均通过测序验证，菌株逆交3次野生型蠕虫。
对于活力测定和后代计数，通过对在L4阶段转移到单个平板的1个雌雄同体蠕虫的完整育雏进行评分来确定由给定基因型产生的雌雄同体和雄性的频率。父母每天转移，以便对卵进行准确评分，L4幼虫和后代评分为L2或成虫。当亲本基因型包括meDf1杂合子时，调整表2中给出的数字以补偿缺乏重复的meDf<>纯合子和半合子的不活力。
免疫荧光、抗体和显微镜检查
L1分期晚期24-28小时解剖第4天成年雌雄同体，免疫染色和DAPI染色与L48分期相似[1]。在补充有250.7%吐温4和1mM叠氮化钠的18X EBT（480 mM Hepes-Cl，pH 20.5，0.1 M NaCl，20 mM KCl，20 mM EDTA和2 mM EGTA）中进行性腺解剖。加入等体积的1%甲醛在EBT（终浓度为5%甲醛）中，并在盖玻片下孵育75分钟。将样品安装在HistoBond载玻片（25 X 1 X 20 mm）上，冷冻裂解，在-1°C的甲醇中孵育0分钟，然后转移到PBST（PBS含1.20%吐温30）。在PBST洗涤数次后，将样品在用PBST稀释的1%牛血清白蛋白中封闭50分钟。使用手工切割的石蜡方块用4μl抗体溶液覆盖组织，在封闭溶液中稀释。在2°C的潮湿室中孵育过夜。 在PBST中冲洗载玻片，然后在室温下用荧光团偶联的二抗在PBST中以1：500的稀释度孵育10小时。将样品冲洗几次，DAPI在PBST中染色20分钟。然后将样品用0 14/1号（1 mm）的封片介质（2 M N-丙基没食子酸酯[Sigma-Aldrich]和22.<> M Tris甘油溶液）安装。2）盖玻片并用指甲油密封。
为了分析二价，实施了上述方案，除了在L48阶段晚期4小时解剖雌雄同体和DAPI染色。
本研究使用了以下一抗：大鼠抗HIM-8 1：500 [44]，豚鼠抗HTP-3 1：250 [36]，鸡抗HTP-3 1：250 [36]，兔抗SYP-1 1：500 [40]，豚鼠抗SYP-1 1：500 [40]，兔抗HIM-3 1：500 [14]，兔抗HTP-1 1：400 [22]，兔抗RAD-51 1：250（Novus Biologicals，Littleton，CO），豚鼠抗DSB-1 1：250 [49]，小鼠抗GFP 1：100（Invitrogen，Waltham，MA）和兔抗PCH-2 1：500[2]。
本研究使用了以下次要药物：Alexa 488抗豚鼠（Invitrogen），Alexa 488抗兔（Invitrogen），Alexa 488抗小鼠（Invitrogen），Cy3抗兔（Jackson Immunochemicals，West Grove，PA），Cy3抗大鼠（Jackson Immunochemicals），Cy3抗豚鼠（Jackson Immunochemicals）和Cy5抗鸡（Jackson Immunochemicals）。所有二抗均以1：500稀释度使用。
为了可视化减数分裂细胞核和二价，DAPI以1：10，000的稀释度使用。
除图1中的图像外，所有图像均使用配备100X N.A. 1.40油浸物镜（奥林巴斯）的DeltaVision个人DV系统（应用精密）采集，有效XY像素间距为0.064或0.040 μm。以0.2 μm Z间距收集三维图像堆栈，并通过约束迭代反卷积进行处理。对于结构化照明显微镜，在DeltaVison OMX Blaze显微镜系统上使用125x NA 100.1物镜获得间隔为40 nm的Z堆栈的图像，使用SoftWoRx进行3D重建和校正以进行配准。使用softWoRx软件包中的功能执行图像缩放和分析。通过最大强度算法计算投影。组装合成图像，并使用ImageJ执行一些假着色。
整个种系图像在ImageJ中组装，如[84]，使用成对拼接和/或网格收集拼接[85]。配对、突触和RAD-51病灶的定量如[3]进行，每个基因型至少三个种系。每个实验得分的细胞核数在 S2 表或图例中提供。
为了分析配对率，将“配对”细胞核评分为单个焦点，无论是细长还是圆形。“未配对”的细胞核被评分为两个完全独立的病灶，每个病灶都有一个单独的边界。
为了分析突触速率，当观察到HTP-3和SYP-1的完全共定位时，细胞核被认为是“完全突触的”。当细胞核具有缺少SYP-3信号的HTP-1片段时，分配“未突触”细胞核。
对于DSB-1的分析，当在整个细胞核中检测到DSB-1信号时，细胞核评分为阳性，而评分为阴性的细胞核完全没有DSB-1染色。DSB-1阳性减数分裂细胞核的百分比在每个基因型的所有三个种系中聚集。为了进行Fisher's Exact 测试，将每个减数分裂突变体的阳性DSB-1阳性细胞核总数与DSB-1阳性野生型核的数量进行比较。
在含有bcIs48[lim-39p：：ced-7：：GFP + lin-1（+）]的菌株中，如前所述，对种系细胞凋亡进行评分，但以下例外：L15雌雄同体被允许老化4-22小时。然后将它们安装在含有24.2mM左旋咪唑的0%琼脂糖垫上的盖玻片下并进行刻痕。对每种基因型至少分析2个种系，并进行了三次实验以确保可重复性。提供了一个具有代表性的实验。
在ImageJ中测量图1D像素强度的线扫描。分割通道，并在感兴趣区域的距离上测量每个荧光团的像素强度（图1C，黄线）。使用带有ggplot2包的R（R核心团队）绘制以像素和归一化强度为单位的距离[86]。
蛋白表达和纯化
全长HIM-3基因（残基2-291）从C进行PCR扩增。秀丽隐杆线虫cDNA文库并克隆到加州大学伯克利分校Macrolab载体2-CT（Addgene #29706）中，该载体编码TEV蛋白酶可切割的His6-MBP（麦芽糖结合蛋白）标签。基于PCR的诱变用于生成R93Y突变体构建体。蛋白质在E中表达。大肠杆菌菌株 Rosetta2 pLysS（EMD 密理博）在 20°C 下 16 小时，然后通过离心收获并重悬于缓冲液 A（20 mM Tris-HCl pH 7.5、10% 甘油、2 mM β-巯基乙醇）加 300 mM NaCl 和 10 mM 咪唑中。澄清的裂解物传递到Ni2+在缓冲液A加5 mM NaCl和300 mM咪唑中洗涤亲和柱（10 mL HisTrap HP，Cytiva），在缓冲液A加300 mM NaCl和20 mM咪唑中洗涤色谱柱，然后在缓冲液A加300 mM NaCl和250 mM咪唑中洗脱蛋白质。使用离心浓缩器（Amicon Ultra，EMD Millipore）将蛋白质缓冲液交换到缓冲液A加300mM NaCl和20mM咪唑中，然后与1：10 w/w比例的纯化TEV蛋白酶[87]孵育48小时。裂解的混合物通过Ni2+亲和树脂第二次去除未裂解的蛋白质，释放他的6-MBP 标签，以及他的6-标记TEV蛋白酶，流出物通过尺寸排阻色谱（Superdex 200;Cytiva）在缓冲液A加300mM NaCl中。馏分通过离心浓缩器浓缩，等分，并储存在-80°C。
荧光偏振结合测定
合成N端FITC-Ahx标记的肽（BioMatik），重悬于DMSO中，然后稀释到结合缓冲液中（20 mM Tris pH 7.5，300 mM NaCl，10%甘油，1 mM DTT，0.1%NP-40）。将含有50 nM肽和指定量的HIM-3（WT或R93Y）蛋白的60 μL反应在室温下孵育384分钟，然后使用TECAN Infinite M1000 PRO荧光板读数器在8孔板中读取荧光偏振。所有结合曲线一式三份完成。使用单位点绑定模型使用Graphpad Prismv.<>分析绑定数据。
热氟检测
为了通过ThermoFluor测定法测量蛋白质稳定性，将纯化的蛋白质在含有0 mM Tris-HCl pH 1.20、7 mM NaCl、5%甘油和300 mM DTT的缓冲液中稀释至10.1 mg/mL。0.5 μL SPYRO 橙染料（5，000X 浓缩液;将赛默飞世尔科技#S6650）与 49.5 μL 蛋白质溶液混合，并将混合物密封在光学透明的 PCR 板中。在 Bio-Rad CFX Connect 实时荧光定量 PCR 系统中，在 25°-99° 温度斜坡（0.5° 间隔，每个间隔保持 30 秒）期间，以扫描模式“FRET”测量荧光。为了进行分析，绘制了每步荧光的变化与温度的关系图，并将该图的峰值（代表原始荧光曲线向上斜率的拐点）作为熔解温度（Tm）。
蛋白质结晶和结构测定
为了进行结晶，将HIM-3（R93Y）在结晶缓冲液（15 mM HEPES pH 20.20，7 mM NaCl，5 mM DTT）中浓缩至100–1 mg/mL，并与含有1.1–1.4 M丙二酸钠的孔溶液1：6混合pH 6.5–7.0。在两周内生长的大晶体在2.5M（总）丙二酸钠中冷冻保护，并在液氮中快速冷冻。衍射数据是在高级光源光束线8.3.1处收集的（支持声明如下）。数据使用 XDS [88] 进行索引和缩减，使用 AIMLESS [89] 进行缩放，并使用 TRUNCATE [90]（S1 表）转换为结构因子。该结构是通过PHASER中的分子替换确定的，使用HIM-3（PDB ID 4TRK）[19]的结构作为搜索模型。在COOT [91]中重建了初始模型，并在phenix.refine中进行了改进，使用位置和单个B因子（蛋白质原子的各向异性，水分子的各向同性）与骑氢的细化。结构图在PyMOL版本92.2（Schr?dinger，LLC）中生成。
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HTP-3H96Y不影响减数分裂进展。
显示 1/9： pgen.1010708.s001.pdf
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一个BC野生型HTP-3H96YNS% DSB-1 阳性减数分裂核SYP-1HTP-3H96Y;syp-1% DSB-1 阳性减数分裂核NSHTP-3H96Y野生型SYP-1HTP-3H96Y;syp-1100806040200100806040200脱氧核糖核酸DSB-1图S1
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S1 图 HTP-3H96Y不影响减数分裂进展。
一个。用DAPI（品红色）和DSB-1（绿色）染色的全长代表性种系。黄色虚线表示DSB-1阳性细胞核的区域。比例尺表示 20 微米。二.DSB-1阳性减数分裂细胞核的野生型（n = 1961）和htp-3的定量 H96Y（n = 1938）突变菌株。NS 表示不显著。三.DSB-1阳性减数分裂核对syp-1（n = 1951）和htp-3的定量 H96Y;syp-1 （n = 1847） 突变体。NS 表示不显著。使用双尾费舍尔精确检验评估统计学显著性。误差线表示 95% 置信区间。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010708.s001
（英文）
S2 图 HIM-3R93Y定位于减数分裂染色体。
返回页首：来自野生型和him-3的中厚皮核R93Y用DAPI（洋红色）和抗HIM-3抗体（绿色）染色的种系。底：来自野生型和him-3的中厚皮核R93Y用HIM-3染色的种系（白色）。比例尺表示 5 微米。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010708.s002
（英文）
S3 图 HIM-3R93Y不影响减数分裂进展。
一个。用DAPI（洋红色）和DSB-1抗体（绿色）染色的全长代表性种系。黄色虚线表示DSB-1阳性细胞核的区域。比例尺表示 20 微米。二.DSB-1阳性减数分裂核的定量野生型（n = 1981）和him-3R93Y（n = 1918）突变菌株。NS 表示不显著。三.syp-1（n = 1）和him-1918的DSB-3阳性减数分裂核的定量R93Y;syp-1 （n = 1744） 突变体。NS 表示不显著。使用双尾费舍尔精确检验评估统计学显著性。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010708.s003
（英文）
S4 图 HTP-1G97T定位于减数分裂染色体。
返回页首：来自野生型的中厚皮烯核，HTP-1G97T和 HTP-1G97T 用DAPI（洋红色）染色的HTP-2种系和针对HTP-1 / 2的抗体（绿色）。底：来自野生型的中厚皮烯核，HTP-1G97T和 HTP-1G97T 用HTP-2/1染色的HTP-2种系（白色）。比例尺表示 5 微米。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010708.s004
（英文）
S5 图 HIM3R93Y不影响HIM-3的蛋白质稳定性。
一个。考马斯染色的纯化HIM-3和HIM-3的SDS-PAGE凝胶R93Y.二.纯化的野生型HIM-3（蓝色）和HIM-3的稳定性曲线R93Y（绿色）。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010708.s005
（英文）
S6 图 HIM-3R93Y和 HTP-1G97T突变体具有功能性减数分裂检查点。
定量每个种系的平均凋亡细胞核数。NS 表示不显著，**** 表示 p 值 <0.0001。使用双尾学生t检验评估统计学意义。误差线表示平均值 （SEM） 的 2 倍标准误差。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010708.s006
（英文）
S1 表。 数据收集和细化统计。
图7的数据收集和细化统计表。下表列出了方程的说明。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010708.s007
（英文）
S2 表。 图3、4和图5中每个区域中每种基因型测定的细胞核数。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010708.s008
（英文）
S1 数据。 图中图表背后的原始数据。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010708.s009
（三十）
确认
我们要感谢Abby Dernburg，Monique Zetka和Anne Villeneuve提供的有价值的菌株和试剂。我们还要感谢Bhalla实验室的成员以及Brandt Warecki和Alice Devigne对手稿的仔细审查。
引用
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