厦门论文发表 -裸胚乳IDD基因突变揭示了C叶片图案化过程中与Scarecrow的功能相互作用4草

抽象

叶子由许多不同的细胞类型组成，这些细胞类型在表皮或内细胞层的背景下形成图案。在草叶中，根据叶片是否进行C3或 C4光合作用。在这两种情况下，都会形成一系列平行的脉络，从叶基部延伸到顶端，但在祖先C中3物种静脉被更多的中间叶肉细胞分开，而不是衍生的C细胞4物种。我们之前已经证明，GRAS转录因子SCARECROW（SCR）调节C叶脉之间形成的光合叶肉细胞的数量。4种玉米，而它调节C中表皮叶层气孔的形成3物种水稻。在这里，我们表明 SCR 是 C 中内叶图案所必需的4Setaria viridis种，但在这个物种中，推定的祖先气孔图案作用也被保留。通过玉米，塞塔里亚和水稻之间的比较突变分析，我们进一步证明裸胚乳（NKD）不确定结构域（IDD）蛋白功能的丧失加剧了玉米和塞塔利亚内叶组织中Scr表型的功能丧失，而不是水稻。具体而言，在塞塔里亚和玉米中，scr;nkd突变体表现出增加的融合静脉比例，没有干预叶肉细胞。因此，SCR和NKD的联合作用可以控制C叶脉之间指定多少叶肉细胞4但不是 C3草。我们的研究结果共同为草叶细胞图案的进化提供了见解，并证明了IDD基因在C中的新模式作用4叶。

作者摘要

需要器官内细胞类型的正确模式，以确保任何生物体的适当形态和生理学。在草中，根据进行的光合作用的类型，在内部叶组织中发展出两种不同的细胞模式。先前的工作表明，转录因子SCARECROW（SCR）在水稻和玉米叶片中具有不同的图案作用，这些叶片执行'C3' 与 'C4'分别进行光合作用。SCR模式水稻叶片和玉米内部叶片组织中的表皮细胞类型。在这里，我们在另一个C中生成scr突变4植物，Setaria viridis，并揭示表皮和内叶组织的图案缺陷。这一观察结果提供了有关草中SCR图案化途径的进化轨迹的信息，但也提出了如何区分内叶图案成分与表皮作用的问题。通过鉴定SCR与第二转录因子裸胚乳（NKD）之间的遗传相互作用，我们证明了组合的SCR / NKD功能模式C中的内部叶组织4草玉米和S.维里迪斯但不在C中3草米。我们提出表皮细胞类型的图案代表了SCR在草叶中的祖先作用，并且作为C4草进化，该基因与NKD一起被招募以模式内叶细胞类型。一些 C4物种保留了祖先的功能，而玉米等其他物种则没有。

数字

Fig 7Fig 8Table 1图1图2图3Fig 4Fig 5Fig 6Fig 7Fig 8Table 1图1图2图3

引文： 休斯 TE，塞德尔尼科娃 O，托马斯 M，兰代尔 JA （2023） 裸胚乳 IDD 基因突变揭示了 C 叶片图案化过程中与 Scarecrow 的功能相互作用4草。公共科学图书馆基因19（4）： e1010715. https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010715

编辑 器： Sarah Hake，“USDA-ARS Pacific West Area”，美国

收到： 2年2023月22日;接受： 2023月 17， 2023;发表： <>月 <>， <>

版权： ? 2023 休斯等人。这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。

数据可用性： 所有相关数据都在手稿及其支持信息文件中。

资金： 这项工作由比尔和梅林达·盖茨基金会（GF）：OPP1129902和生物技术和生物科学研究委员会（BBSRC）：BB/P003117/1向JAL资助。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。TEH和OS从GF赠款中获得工资，TEH也从BBSRC赠款中获得工资。

竞争利益： 提交人声明不存在相互竞争的利益。

介绍

了解细胞模式如何受到遗传调控是发育生物学中的一个关键挑战。在草叶中，两种不同的细胞解剖结构支撑着光合作用。在水稻（Oryza sativa）等草中，执行C3光合作用，宽间隔的平行静脉被非光合束鞘（BS）细胞包围，这些细胞本身被多达十个光合叶肉（M）细胞隔开。相比之下，在表现C的草中4光合作用，如玉米（Zea mays）和绿狐尾（Setaria viridis），平行的静脉被BS和M细胞的同心层包围，两者都是光合作用的。这种细胞类型的排列被称为“Kranz”，因为这两种细胞类型在静脉周围形成花环，而Kranz在德语中是花环的意思[1]。值得注意的是，克兰兹解剖学是从C演变而来的3-类型解剖结构在多个独立场合[2，3]，每次出现都会产生比祖先形式更高的叶脉密度，因为BS细胞被较少的M细胞隔开。迄今为止，在C中发现的叶内组织中细胞模式的调节因子很少3或 C4草种。

我们之前证明，编码GRAS转录因子SCARECROW（SCR）的重复同源基因调节玉米叶原基最内层的细胞分裂，以确定静脉之间形成的M细胞数量[4]。在双Zmscr1;Zmscr1h（其中h表示同源基因拷贝）突变体，大多数BS细胞由一个而不是两个M细胞分离，在某些情况下，BS细胞与没有干预的M细胞融合。此外，许多静脉在轴向或轴向上发展异位巩膜瘤，并且一些静脉被不与脉管系统接触的其他BS细胞包围。有趣的是，当水稻中的SCR直系同源物突变时，在内叶组织中没有观察到这种模式扰动[5]。相反，水稻中功能丧失突变体无法在叶表面形成气孔[5，6]。玉米和水稻叶片突变表型的区别提出了SCR功能在叶片内组织中的部署与Kranz解剖结构的进化有关的可能性，表皮气孔的图案是草叶的祖先作用。

尽管SCR本身的功能在玉米和水稻之间可能有所不同，例如通过靶向不同的下游基因，但观察到的不同模式作用可能是由SCR相互作用蛋白的物种特异性差异引起的。关于SCR介导的模式在单子叶植物中如何调控知之甚少，但在拟南芥根中，SCR与另一种GRAS转录因子（SHORTROOT （SHR））和几种不确定结构域（IDD）C2H2锌指转录因子起作用[7-11]。IDD基因（也称为BIRD基因）既调节SCR和SHR基因表达，又共同调节下游靶基因的表达[9]。尽管草基因组中存在许多IDD基因，并且SCR和SHR在玉米和水稻中具有模式化功能，但SCR和IDD基因在单子叶植物根细胞或叶细胞类型模式化中的联系尚未建立。

我们之前提出，裸胚乳（NKD）IDD基因（最初称为ZmJAY基因）可能在玉米的Kranz模式化过程中起作用[12，13]。该提案基于这样一个事实，即ZmNKD1和ZmNKD2转录本在Kranz图案化相关阶段的早期叶片发育过程中积累[14]，这两种转录本都在成熟叶的叶肉中特异性积累[15，16]，并且在aleurone发育中都具有已知的图案功能[17，18].基于这一建议和上面提出的悬而未决的问题，我们在这里测试了两个假设。首先，SCR函数是C语言中叶内组织的图案化所必需的4草，其次，NKD是图案途径的一个组成部分。通过表征 C 中的 scr 突变体4物种 Setaria viridis 并对玉米、Setaria viridis 和水稻中的 scr;nkd 突变体进行了比较分析，我们发现了支持这两种假设的证据。

结果

SCR模式在桫椤叶的表皮和内部组织

确定SCR在水稻表皮与玉米内叶中的不同图案作用是否反映C3- 与 C4-特定功能，我们在 C 中生成了功能丧失突变体4使用CRISPR的Setaria viridis（以下简称setaria）物种（图1A和S1）。与玉米和水稻一样，两个SCR基因存在于Setaria中（SvSCR1-Sevir.7G316501和SvSCR2-Sevir.8G008100），每个基因都是物种内重复的结果[4]。在基因编辑的T2系中，鉴定出一定比例的植物发育不良，比野生型苍白，并且在发芽后存活超过3-4周（图1B-1D）。这些植物以1/4或1/16的预期分离率出现，这取决于亲本植物是否为Svscr1 / +;Svscr2（或 Svscr1;Svscr2/+） 或 Svscr1/+;分别是 Svscr2/+。在所有病例中，这些表型异常植物被证实是Svscr1和Svscr2的纯合子，表型野生型植物对于其中一个SCR基因总是杂合或野生型。由于单个Svscr突变体没有表现出生长扰动（S2图），并且水稻和玉米中的单个突变体与任何图案缺陷无关，因此使用纯合双突变体进行所有进一步的分析。Svscr1表现出的扰动生长表型;Svscr2植株比玉米Zmscr1严重得多;Zmscr1h突变体（植物可以在温室中生长6-8周而没有问题）[4]，但与Osscr1中观察到的表型相似;水稻的Osscr2突变体[5]。因此，我们推断，与水稻一样，SCR可能在setaria的气孔图案中发挥作用。Svscr1的表皮印象;Svscr2突变叶证实了这一假设，揭示了远轴和近轴叶表面都没有气孔（图2A-2F）。因此，首先在水稻中发现的气孔图案作用不是C3-特定功能。

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图1. SvSCR1和SvSCR2的突变影响植物生长。

A）两个独立系（C1-2和C402052-6）中的突变Svscr402054和Svscr7等位基因序列。野生型（WT）序列显示在顶部，突变等位基因序列显示在下面。指南序列以蓝色表示，WT和突变序列之间的不匹配以红色表示。B-D）WT ME034V （B）， Svscr1-m3 的照片;Svscr2-m4 （C） 和 Svscr1-m2-Svscr2-m1 （D） 植株播种后 20 天。比例尺：10厘米。

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图2. Svscr1;Svscr2突变植物没有气孔，分离静脉的叶肉细胞较少。

A-F）野生型（WT）ME034V （A，D），Svscr1-m1的气孔印象;Svscr2-m4 （B，E） 和 Svscr1-m2;Svscr2-m1 （C，F） 叶 3 从远轴 （A-C） 或近轴 （D-F） 表面。气孔是假橙色的。比例尺：100μm。G-H）使用WT ME034V（G）和Svscr1-m1的紫外照明成像的横向截面;Svscr2-m4 （H） 叶 4，取自沿近端-远端轴的中点。每对静脉之间的叶肉细胞数量在叶子上方指示。比例尺：100μm。I） 直方图总结了WT ME034V和两个独立Svscr1中分离静脉的叶肉细胞的平均数量;Svscr2突变体。生物重复的数量在每个图的上方标明，每个图右上角的字母表示统计上不同的组（P≤0.05，单因素方差分析和Tukey's HSD），使用每个基因型中叶肉细胞的平均数量计算（S1表中的原始数据）。

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确定SCR是否也在枸杞、野生型横截面和Svscr1的内叶图案中发挥作用;检查Svscr2突变叶（图2G和2H）。在ME034V野生型叶中，大约70-80%的叶脉被两个M细胞隔开，其余的被三个细胞隔开（这一特征在玉米中比在玉米中更常见）（图2I）。相比之下，Svscr20 中 30-1% 的静脉;Svscr2突变叶仅由单个M细胞隔开（图2I）。这些数据表明，与玉米一样，SvSCR基因调节地面分生组织中的细胞分裂，以确定BS细胞之间发育的M细胞数量。有趣的是，SvSCR基因除了在气孔图案化中的作用外，还承担这种内叶图案的作用。

反馈回路可能将玉米中的SCR和NKD IDD基因表达联系起来

SCR基因在玉米，水稻和setaria中的不同作用 - 分别在叶片的内层，表皮或两个组织层中图案化 - 可能是由于相互作用的IDD基因活性的物种特异性差异，其中NKD基因是潜在的候选者。为了确定ZmSCR1 / h基因的表达是否与玉米中的ZmNKD1 / 2基因功能相互关联（如拟南芥中的SCR和IDD基因），我们首先量化了现有双Zmscr1-m2中每个基因的转录本水平;Zmscr1h-m1 [4] 和双 Zmnkd1-Ds;Zmnkd2-Ds [17]突变体（图3A和S3）。ZmSCR1和ZmSCR1h转录本在Zmnkd1-DS中以升高水平积累;Zmnkd2-Ds突变体，在这两种情况下相对于野生型增加约两倍（图3C）。相比之下，ZmNKD1和ZmNKD2转录本在Zmscr1-m2中以较低水平积累;Zmscr1h-m1突变体比野生型低，ZmNKD1平均降低到野生型水平的60%，ZmNKD2降低到野生型水平的50%（图3A）。这些差异相当温和，但这两种蛋白质作为转录因子的作用可能允许在下游放大微小的倍数差异。如果基因表达仅限于组织中的一个细胞子集，这种情况尤其合理。为了确定是否是这种情况，进行了原位杂交以定位发育中的叶原基转录本。图3B显示NKD1和SCR1转录本优先积累在发育中的血管中心周围的地面分生组织细胞中。这些数据共同表明，负反馈环路（直接或间接）可能会影响ZmSCR1 / 1h和ZmNKD1 / 2转录水平，ZmSCR1 / ZmSCR1h对ZmNKD1 / ZmNKD2的表达产生积极影响，ZmNKD1 / ZmNKD2对ZmSCR1 / ZmSCR1h的表达产生负面影响。

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图3. NKD和SCR转录本在同一空间域中累积，其水平由反馈循环确定。

A） Zmnkd1-DS 中 ZmSCR2 和 ZmSCR1 转录本的定量 RT-PCR;Zmnkd2-Ds突变体，以及Zmscr1-m2中的ZmNKD1和ZmNKD2 ;Zmscr1h-m2突变体。开放圆圈是单个生物学重复，黑色十字架表示每个基因型的平均值。通过韦尔奇t检验（双尾）在对数变换的折叠变化数据上计算的统计显著性，如每个图所示：*P≤0.05;**P≤0.01;P≤0.001（S1 表中的原始数据）。B）玉米野生型B1顶点与ZmNKD1和ZmSCR73的原位杂交。在每个图像中，P2原基以蓝色勾勒，P3为红色，P4为紫色，P5为绿色，如相邻的卡通图所示。深紫色信号表示与每个感兴趣的转录本成功杂交。比例尺：50μm。C）单子叶植物中NKD基因的最大可能性系统发育。NKD分支以绿色突出显示，相邻的单子叶植物分支以紫色突出显示。引导值显示在系统发育的每个分支上。

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功能丧失 nkd 突变体不表现出受干扰的叶片发育

鉴于SCR在玉米、桫椤和水稻叶片中的模式作用，以及SCR和NKD基因表达在玉米中的相互作用，我们接下来试图确定NKD在3个物种叶片发育中的作用。为此，我们首先通过构建最大似然系统发育来鉴定SETARIA和水稻中的NKD直系同源物。图7C显示，NKD作为单拷贝基因存在于水稻和水稻中（SvNKD—Sevir.212900G04，OsNKD—LOC_Os47860g1），表明玉米中的两个拷贝（ZmNKD2和ZmNKD19）是由最近的全基因组复制引起的[17]。 玉米中NKD的两个拷贝可能已经经历了功能分歧，然而，鉴于它们在种子发育的背景下具有冗余功能[20]，并且大多数玉米同源基因对在发育中的叶片中具有匹配的表达谱[1]，最简洁的是它们在叶片发育过程中具有冗余功能。对于表型表征，纯合双Zmnkd2-Ds;将Zmnkd4-Ds系和新生成的CRISPR功能丧失突变体与来自相同遗传背景的野生型系进行比较（图1A，S4和S1）。纯合子Zmnkd2-Ds;Zmnkd5-Ds种子表现出由aleurone层图案缺陷引起的特征性萎缩内核表型，但在Svnkd或Osnkd突变体中未观察到改变的种子表型（S4图）。玉米、桫椤和水稻nkd突变体的总体植株生长正常（图4B），未观察到叶片图案扰动（图4C-6J和S1）。在Zmnkd2-DS中;Zmnkd1-Ds突变体，叶片脉密度或2级与4级中间脉之比没有相对于野生型的变化（图4G和1H），这些性状在Zmscr1中均发生改变;Zmscr4h突变体。此外，在玉米或setaria nkd突变体中分离静脉的M细胞数量（等效scr突变体中渗透性最强的表型）没有变化（图4I和<>J）。综上所述，这些结果表明NKD对于玉米，桫椤或水稻的正常叶片发育不是必需的。

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图4. NKD功能丧失突变不会干扰玉米，水稻或Setaria的生长。

A）对玉米（Zm），setaria（Sv）和水稻（Os）中nkd等位基因功能丧失的卡通描绘。在每种情况下，5'和3'未翻译区域用紫色表示，内含子用橙色表示，编码区域用绿色表示。转座子插入由黄色三角形表示。对于塞塔里亚和水稻，CRISPR引导序列分别以蓝色和栗色表示，下方的突变等位基因序列以红色突出显示编辑。B）玉米、桫椤和水稻nkd突变体的全株表型。照片在播种后31天（玉米），20天（setaria）或14天（水稻）拍摄。比例尺：10厘米。 C-F）玉米野生型（WT）的横向截面（WT）W22（C），Zmnkd1-Ds;Zmnkd2-Ds （D），setaria WT ME034V （E） 和 Svnkd-m1 （F），在明场（玉米）或紫外线照明（setaria）下成像。图像是在沿叶5（玉米）或叶4（setaria）的近端-远端轴的中点拍摄的。比例尺：100μm。G-H）WT W1（蓝色）和Zmnkd2-Ds的静脉密度（G）和rank22：rank1中间静脉（H）的比率的定量;Zmnkd-Ds（绿色）突变体。开放圆圈表示不同的生物学重复，黑色十字架表示每个基因型的平均值。由韦尔奇 t 检验（双尾）计算的统计显著性，在每个图的上方所示：n.s. P>0.05（S1 表中的原始数据）。I-J）直方图总结了WT W22与Zmnkd1-Ds中分离静脉的叶肉细胞的平均数量;Zmnkd2-Ds （I） 和 WT ME034V 与两条独立的 Svnkd-m1 线路 （J）。误差条是平均值的标准误差，生物重复次数在每个图的上方指示。每个图右上角的字母表示使用每个基因型中叶肉细胞的平均数量（S0表中的原始数据）计算的统计学上不同的组（P≤05.1，单因子方差分析和Tukey's HSD）。WT是蓝色的，nkd突变体是绿色的。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010715.g004

在玉米和雪茄中，但不在水稻中，nkd功能丧失突变增强scr突变叶表型

为了确定在没有SCR功能的情况下NKD在叶片图案中的作用，产生了玉米的四重scr1;scr1h;nkd1;nkd2突变体和三重scr1;scr2;scr5;setaria和水稻的nkd突变体（图1，S4和S1）。对总体生长表型的初步评估显示，三个独立的三重Osscr2;Osscr1;Osnkd突变系的扰动与双Osscr2;Osscr5突变体中的扰动相似（图5B-1D）。相比之下，三重 Svscr2;Svscr1;Svnkd突变体表现出比双Svscr2更严重的扰动;Svscr5突变体（图5E-1I）。在Svscr2的后代中;Svscr1/+;来自两个独立品系的Svnkd/+植株，产生的三重突变体较小，死亡速度快于双Svscr2;Svscr5突变兄弟姐妹（图5H和8I）。这在Svnkd固定的线中是一致的，其中只有来自两个独立Svscr20的8/34和1/2三重突变体;Svscr22;Svnkd系在播种后存活了14天，而Svscr15为13/17和1/2;Svscr1双突变体。在玉米中，四倍Zmscr2-m1;Zmscr1h-m1;Zmnkd2-Ds;Zmnkd1-Ds突变体看起来类似于双Zmscr2-m1;Zmscr1h-m1突变体，叶子苍白，下垂，身材比野生型或双Zmnkd2-Ds矮;Zmnkd5-Ds突变植物（图5J-<>O）。

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图5. 功能丧失的nkd突变会增强塞塔利亚的scr突变体的生长扰动，而不是水稻。

A）水稻和塞塔里亚三个独立品系中的突变scr1;scr2;nkd等位基因序列。野生型序列如上所示，参考线以栗色（大米）或蓝色（塞塔里亚）突出显示。编辑内容以红色突出显示。注意 Svscr1-m2 等位基因包含在图 1 中。B-O）水稻（B-D）、塞塔里亚（E-I）和玉米（J-O）的全株表型。分别在播种水稻、桫椤和玉米后14、20或21天拍摄图像。（H）和（I）中的植物在每种情况下都来自分离的科，使得Svscr1;Svscr2 和 Svscr1;Svscr2;每个面板中的 Svnkd 都是同级姐妹。比例尺：10厘米。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010715.g005

为了确定SCR和NKD相互作用对叶片发育的影响，在四重（玉米）和三重（塞塔里亚和水稻）突变体中检查了叶内模式。值得注意的是，在双scr1;scr2突变体中气孔表型的完全外显率排除了在气孔发育过程中与NKD相互作用的评估，但在单个Svnkd或Osnkd突变体中没有观察到气孔模式的变化（S6图）。在内叶组织中，水稻的三个独立的三重Osscr1;Osscr2;Osnkd突变系的水稻之间的M细胞数量与相应的双Osscr1;Osscr2突变体相同，在所有情况下M细胞的模态数为6个（图6A-1C）。相比之下，在三重Svscr2中观察到融合静脉（其中相邻静脉的BS细胞与没有干预的M细胞接触）;Svscr1;塞塔里亚的Svnkd突变体，但不在双Svscr2中;Svscr6突变体（图6D-10F）。在检查的每个三重突变体中都没有发现这种融合，在两个独立系的两个实验中的22/6样本中观察到了示例（图7，S8和S1）。然而，在2个双Svscr7中仅观察到一次融合静脉的出现;Svscr7突变体样本。在玉米的四重突变体中也观察到融合的静脉（图1A-2H）。与双Zmscr1-m1相比，四突变体没有表现出更高的静脉密度或与巩膜相关的静脉增加;Zmscr7h-m7突变体（图7I和7J），但融合到相邻静脉的静脉数量的增加是一致的，并且具有统计学意义（图7F，7H和1K-2M）。此外，只有两个相邻的矿脉融合成双Zmscr1-m1;Zmscr7h-m20突变体，三条或更多融合静脉的组经常出现在四重突变体中（图40L）。这些融合的静脉导致没有M细胞分离的静脉数量大幅增加，在四突变体中只有~1%的静脉被正常的两个M细胞分开，而在双Zmscr2-m1中略高于1%;Zmscr6h-m7突变体。在玉米和塞塔里亚中，仅由一个M细胞分开的静脉比例在双突变体和四重/三突变体中相似（图1F和2M）。确保这些差异不是由Zmscr1-m1杂交后未连接位点的杂合性引起的;Zmscr1h-m2 和 Zmnkd1-Ds;Zmnkd2-D双突变体，我们还比较了Zmscr1-m1;Zmscr9h-m1突变体在杂交前和杂交后，发现融合静脉的比例没有差异（S2图）。此外，我们使用独立的Zmnkd9-Ds验证了来自杂交的另外两个四重突变体的表型是一致的;Zmnkd<>-Ds植物（S<>B图）。这些结果共同表明，在4种玉米和塞塔里亚，但不在C中3水稻种，NKD基因与SCR一起起作用，以确定M细胞是否以及有多少M细胞位于静脉之间。

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图6. 功能丧失的nkd突变诱导在雪茄的scr突变体中形成融合的叶脉，而不是水稻。

A-B）Osscr1-m7;Osscr2-m3 （A） 和 Osscr1-m7;Osscr2-m9;Osnkd-m3 （B） 突变叶的横截面，沿叶片 5 的近端-远端轴拍摄在中点。C）直方图总结了两个独立的Osscr1;Osscr2（黄色）和三个独立的Osscr1;Osscr2;Osnkd（紫色）突变系中分离静脉的叶肉细胞的平均数量。误差线是平均值的标准误差（S1 表中的原始数据）。样本量（n =）是生物学重复。D-E）Svscr1-m1的横截面;Svscr2-m4 （D） 和 Svscr1-m2;Svscr2-m1;Svnkd-m1 （E） 突变叶，在沿叶 4 近端-远端轴的中点拍摄，在紫外线照明下成像。分离静脉的叶肉细胞数量显示在每个区域上方。在（E）中，白色箭头和插图显示了没有分离叶肉细胞的融合静脉的示例。F） 直方图总结了野生型 （WT） ME034V（蓝色）、Svscr1-m1 中分离静脉的叶肉细胞的平均数量; Svscr2-m4（黄色）和Svscr1-m4;Svscr2-m1;Svnkd-m1（紫色）突变体。误差线是平均值的标准误差。样本量 （n =） 是生物学重复，每个图右上角（样本量下方）的字母表示使用每个基因型中叶肉细胞的平均数量（S0 表中的原始数据）计算的统计学上不同的组（P≤05.1、单因素方差分析和 Tukey HSD）。比例尺：100 μm。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010715.g006

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图 7. Zmscr1;Zmscr1h;Zmnkd1;与Zmscr2相比，Zmnkd1四重突变体的融合叶脉数量显着增加;Zmscr1h双突变体。

A-H）野生型（WT）W22（A&C），Zmnkd1-Ds的横向横截面;Zmnkd2-Ds （B & D）， Zmscr1-m2;Zmscr1h-m1 （E & G） 和 Zmscr1-m2;Zmscr1h-m1;Zmnkd1-Ds;Zmnkd2-Ds（F&H）叶3，从中点沿近端远端轴线，在明场（A-B，E-F）或UV（C-D，G-H）照明下成像。四重突变体在自体Zmscr1-m2的后代中分离;Zmscr1h-m1/+;Zmnkd1-Ds;Zmnkd2-Ds父母，nkd双突变体来源于自体Zmnkd1-Ds;Zmnkd2-Ds 亲本和来自自体 Zmscr1-m2/+ 的 scr 双突变体;Zmscr1h-m1 父母。箭头指向融合的静脉。比例尺：100 μm。I-L）带状图总结了静脉密度的量化 （I）、等级 1：等级 2 中间矿脉的比率 （J）、融合矿脉的百分比 （K） 和在 ≥3 条融合矿脉 （L） 的运行中形成的矿脉百分比。开放圆圈表示来自独立生物学重复的测量值，黑色交叉表示每种基因型的平均值。生物重复次数 （n =） 显示在每个图的上方，每个图顶部的字母表示统计上不同的组（P≤0.05、单因素方差分析和 Tukey HSD）（S1 表中的原始数据）。M）直方图总结了WT W22（蓝色），Zmnkd1-Ds中分离静脉的叶肉细胞的平均数量;Zmnkd2-Ds （绿色）， Zmscr1-m2;Zmscr1h-m1（黄色）和Zmscr1-m2;Zmscr1h-m1;Zmnkd1-Ds;Zmnkd2-Ds（紫色）突变体。误差线是平均值的标准误差。样本量（n =）是生物学重复，每个图的右上角（样本量下方）的字母表示统计上不同的组（P≤0.05，单因子方差分析和Tukey's HSD），使用每个基因型中叶肉细胞的平均数量（S1表中的原始数据）计算。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010715.g007

NKD介导的对玉米胚胎发生过程中叶片图案影响的证据

当表型四重Zmscr1-m2的叶子时;Zmscr1h-m1;Zmnkd1-Ds;Zmnkd2-Ds突变体我们注意到来自不同父母的个体之间的表型严重程度存在差异。鉴于表型是在叶片3上进行的，该叶在胚胎中启动并部分模式化，我们假设观察到的差异首先在胚胎发生过程中表现出来。为了研究这种可能性，我们从Zmscr1-m2 / +中切片了三个胚胎;Zmscr1h-m1;Zmnkd1-Ds/+;Zmnkd2-Ds/+（nkd杂合子）亲本和1个来自Zmscr2-m1/+;Zmscr1h-m1;Zmnkd2-Ds;Zmnkd1-Ds（nkd纯合子）亲本，以及三个野生型Zmscr2-m1;Zmscr1h-m1 和 Zmnkd2-Ds;Zmnkd1-Ds胚胎。为了定量脉络，在分生组织和P4-P4叶基（P1将继续形成叶3，P2叶8等）的尖端处检查横截面（图4A）。由于在细胞分裂和分化正在进行中的年轻叶原基中识别融合脉的预期挑战，我们首先量化了最古老的原基中的静脉密度，以测试它是否可以用作融合脉增加的代表。在大多数情况下，最古老的原基是P1，但在双Zmscr2-m1之一中;Zmscr1h-m1突变体，只有三个原基被启动。基因型间静脉密度无显著差异，但在Zmnkd2-Ds的双突变后代中观察到密度略高;Zmnkd1-Ds 纯合亲本和 Zmscr2-m1/+ 的四重突变后代;Zmscr1h-m1;Zmnkd2-Ds;Zmnkd8-Ds（nkd纯合子）父母（图8B）。接下来，我们记录了在每个胚胎最古老的原基中与中脉相邻的前两个侧静脉之间启动的中间静脉的数量和位置。选择这个区域是因为它是发育最发达的区域，因此可以确定划分血管中心（图1C）。中脉区域被排除在外，因为缺乏可识别的内地面分生组织层使得原寒酸起始期间的细胞分裂模式更难解释。值得注意的是，在源自Zmnkd2-Ds的胚胎中启动了更多的静脉;Zmnkd1-Ds双突变父母和Zmscr2-m1 / +的四突变后代;Zmscr1h-m1;Zmnkd2-Ds;Zmnkd8-Ds（nkd纯合子）父母（图10D和S1）。在来自nkd纯合亲本的四突变后代的情况下，数量显着高于来自nkd杂合亲本和Zmscr2-m1的四突变体;Zmscr1h-m1双突变体（S1表）。在两个Zmnkd2-D中;Zmnkd10-Ds双突变体，在鞘膜中也观察到额外的静脉，存在四条血管痕迹，而不是正常的两条（S<>图）。这种表型在任何其他基因型中都不明显。这些结果表明，在nkd突变核的背景下发育的胚胎的叶原基中，原糖可以过早和/或异位启动。

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图8. 胚胎叶片表型揭示了胚胎发生过程中的图案缺陷。

A）横跨分生组织（M）尖端的野生型（WT）W22胚胎的横截面，使得P1-P4叶原基可见。比例尺：100 μm。B）P4原初静脉密度的定量。开放圆圈表示来自独立生物学重复的测量值，黑色交叉表示每个基因型的平均值（S1表中的原始数据）。C）在叶片最内层的地面分生组织层中看到的基本细胞分裂模式示意图，因为原荸开始形成中间脉。D）在每种基因型的三个成熟胚胎的P4原基中观察到的两对侧静脉（中静脉两侧各一条）之间的血管中心数量。数据来源于S10图中的图像。E） 显示用于对融合静脉表型进行评分的标准示意图。除非同时发生过反斜区和纵周分裂，否则血管中心不进行评分。F-J）来自WT W4（F），Zmscr22-m1的P2原基的代表性横截面;Zmscr1h-m1 （G）， Zmnkd1-Ds;Zmnkd2-DS （H）， Zmscr1-m2;Zmscr1h-m1;Zmnkd1-Ds;来自杂合子NKD/NKD亲本（I）和Zmscr2-m1的Zmnkd2-Ds;Zmscr1h-m1;Zmnkd1-Ds;来自纯合子 nkd 亲本 （J） 的 Zmnkd2-Ds，显示一对侧 （L） 静脉之间发育的中间静脉（红色星号）。完整图像显示在S10图中 比例尺：40 μm。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010715.g008

为了量化融合静脉，记录了发育中的血管中心彼此直接相邻的情况，而不是被最内层叶层中的一个或多个地面分生组织细胞隔开。如果最内层叶层的首字母在反斜和周围至少分裂一次，则血管中心被归类为血管中心（图8E）。在两个Zmscr1-m2中观察到一个或两个融合的静脉实例;Zmscr1h-m1双突变胚胎，在源自Zmscr1-m2 / +的两个四突变体中观察到单个实例;Zmscr1h-m1;Zmnkd1-Ds/+;Zmnkd2-Ds/+（nkd杂合子）亲本，在源自Zmscr1-m2 / +的三个胚胎中的每一个中观察到至少两个实例;Zmscr1h-m1;Zmnkd1-Ds;Zmnkd2-Ds（nkd纯合子）亲本（总共8个事件）（图8F-10J和S1）。这些结果表明，SCR功能的丧失在胚胎发生和萌发后都会导致叶片图案缺陷，并提出了当与NKD功能丧失相结合时观察到的增强图案缺陷可能是纯合Zmnkd2-Ds内核结构改变的间接后果;Zmnkd6-Ds植物与NKD功能丧失的直接影响相反。因此，为了评估NKD是否具有直接作用，我们检查了源自Zmscr1-m2 / +的四重突变体的第1页;Zmscr1h-m1;Zmnkd2-Ds;Zmnkd1-Ds 父级。这些叶子在发芽后有图案，相对于双Zmscr2-m1，融合脉的比例也有所增加;Zmscr1h-m9突变体（S9C-S<>F图），证明了NKD在胚胎发生以外的叶图案中的作用。

讨论

SCARECROW最近成为单子叶植物发育的调节因子[4-6，21]。在这里，我们已经证明，与玉米和水稻不同，在玉米和水稻中，SCR在内叶（玉米）或气孔（水稻）图案中具有不同的功能，在C4单子叶植物 Setaria viridis 它承担两种图案功能（图 1 和 2）。在这项研究之前，没有发现在单子叶植物叶图案中与SCR一起起作用的调节剂。在这里，我们表明NKD IDD基因至少在C4单子叶植物（图3）。尽管玉米、桫椤和水稻中nkd突变体的功能丧失在叶片发育中没有明显的扰动（图4），但当突变与功能丧失scr突变相结合时，在玉米和雪茄中均观察到协同相互作用，但在水稻中则未观察到协同相互作用（图5-7）。最引人注目的是，玉米和塞塔里亚中的scr;nkd突变体表现出融合静脉的比例增加，其中相邻维管束的BS细胞与没有干预的M细胞直接接触（图6和7）。有趣的是，玉米胚胎叶片中这种表型的严重程度表明，胚中的正常叶片模式可能受到胚乳中NKD功能丧失的干扰（图8）。表1总结了本研究和先前报告中检查的所有scr，nkd和scr;nkd突变体的叶表型。综上所述，我们的结果为单子叶植物中SCR功能的演变提供了见解，并确定了图案途径的另一个组成部分。

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表 1. 本研究及既往工作的玉米、桫椤和水稻scr、NKD和SCR;NKD突变体的叶片表型摘要[4，5]。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010715.t001

我们之前提出SCR在玉米内叶组织图案中的作用可能代表C4-特异性功能，并且水稻中的气孔作用可能是C3-特定功能 [5]。这里提出的分析反对后者，因为 Svscr1;C 的 Svscr2 突变体4种 Setaria viridis 不会发展气孔。然而，在Svscr1中也观察到内叶图案扰动;Svscr2突变体，因此内叶图案函数仍然是合理的 C4-特定。在这种情况下，SCR的祖先作用将是表皮图案，在那些进化出C的单子叶植物中招募到Kranz图案中。4路。这种情况与拟南芥（C3) scr突变体形成正常的气孔，但BS细胞身份紊乱[22，23]。根据水稻的基因表达模式和突变表型，有人提出SCR在表皮中起作用，以解释从内叶静脉发出的位置信号（可能是SHR）[24，25]。通过这种方式，气孔文件被正确定位在与下层静脉相邻的行中。如果SCR也像玉米一样在内叶中表达，很难想象这种情况在setaria中会发生，特别是考虑到SCR功能的典型模型表明SCR阻止SHR移动到SCR积累的细胞层之外[8，26-28]。表皮和内叶图案化过程如何通过SCR途径介导是未来研究的问题。

这项研究的另一个悬而未决的问题是，为什么玉米中融合静脉表型的严重程度远高于塞塔利亚scr;nkd突变体。在玉米中，许多四重突变体表现出超过30%的叶脉融合到相邻脉络，而在setaria中，这些事件更为罕见，并且没有发现两个以上脉融合在一起的例子。一种可能的解释是，由于塞塔里亚中的scr;nkd突变体没有气孔，因此它们比玉米中的突变体弱得多。因此，存活下来的植物较少，并且必须对这些幸存者评估内叶表型，这可能使分析偏向受影响较小的突变体。另一种可能性是setaria中的突变等位基因是亚态的而不是空的。SvSCR和SvNKD基因的成功编辑位于序列的3'末端，分别影响最终20%和40%的编码蛋白。鉴于我们可以确信，由于Svscr1的保守表型，Svscr等位基因为零;Svscr2突变体与水稻和玉米，Svnkd等位基因可能保留了一些野生型功能，并且Svscr更严重;如果基因5'末端的编辑成功，将观察到Svnkd静脉聚类表型。如果这些技术解释都不正确，那么在玉米和塞塔里亚之间观察到的差异必须代表两个物种之间的生物学差异，这是合理的，因为它们被数百万年的进化所分隔，并且在不同的发育环境中清楚地部署了SCR途径。

IDD基因长期以来一直被认为可以调节拟南芥的SCR/SHR途径。例如，已知JACKDAW与SCR-SHR复合物发生物理相互作用[9]，并且有人提出，这种与IDD C2H2转录因子伴侣的相互作用使SCR-SHR能够结合DNA并激活下游靶标的表达[29]。单子叶植物基因组中有IDD直系同源物，但对其作用的功能见解很少。这可能部分是由于草基因组中广泛的功能冗余，再加上在单子叶植物中产生功能丧失系的挑战，使得功能分析具有挑战性。为了支持这一说法，即使在拟南芥中，许多IDD突变体已被鉴定，表型扰动通常仅在检查高阶突变体时观察到[11]。这一观察结果符合我们的发现，即NKD在玉米和雪茄叶片模式中的作用仅在NKD基因与SCR基因一起突变时才被揭示。Zmnkd1叶片缺乏表型扰动;Zmnkd2突变体可以通过NKD和SCR之间的直接或间接反馈回路来解释（图3A）。在Zmnkd1的叶子中;Zmnkd2突变体，ZmSCR1和ZmSCR1h转录本的积累水平比正常水平高约两倍（图3A），这可能至少部分补偿NKD功能的丧失。相反，ZmNKD1 和 ZmNKD2 转录本在 Zmscr1 中积累的水平低于正常水平;Zmscr1h突变体（图3A），创造了一个更接近四重突变体的场景。尽管缺乏关于单子叶植物中IDD基因功能的研究，但最近显示IDD12和IDD13与水稻中的SHR一起调节叶片中的地面分生组织增殖[30]。这一发现很有趣，因为我们在这里发现NKD与C中的SCR起着类似的作用。4内叶图案化，但这两个基因在水稻内叶中都没有功能（图6）[5]。可能是不同的IDD基因通过控制不同发育环境中不同下游靶点的激活来微调SCR和SHR的作用。

SCR和NKD转录本在发育中的静脉之间的地面分生干细胞中的积累，以及在玉米和塞塔利亚scr;nkd突变体中观察到的融合静脉意味着SCR和NKD功能的两种可能机制。首先是SCR和NKD的共同作用促进了地上分生组织的细胞分裂，然后将这些细胞指定为叶肉。在该模型中，在没有SCR和NKD的情况下，地面分生组织细胞不会分裂和/或被错误指定，从而使静脉彼此直接接触。这类似于SCR在拟南芥根中所起的作用，其中基因功能的丧失导致内胚层细胞层的缺失和错误规格[7]。第二种是SCR和NKD的作用是抑制现有静脉之间区域静脉的形成。在没有它们的情况下，静脉在已经指定的静脉之间的区域形成，导致在玉米和塞塔利亚scr;nkd突变体中观察到融合的静脉的运行。这种机制可能类似于在叶片表面形成毛状体和气孔的横向抑制机制[31-33]，其中融合的脉代表由缺乏抑制剂引起的聚集表型。由于SCR和NKD不会积聚在发育中的静脉中，在这种情况下，它们很可能会解释来自相邻指定静脉的抑制信号。在任何一种情况下，在SCR中观察到的内叶扰动而不是NKD突变体表明SCR可以补偿内叶模式通路中NKD功能的丧失（通过转录反馈环或通过替代途径），而NKD不能补偿SCR功能的丧失，这种关系类似于SCR和IDD蛋白相互作用的其他途径[9-11].另一种假设是，未识别的第三因素与SCR和NKD一起起作用。在这种情况下，未识别的因素将完全补偿NKD功能的丧失，但只能部分补偿SCR功能的丧失，从而解释了nkd突变叶片的正常表型以及为什么即使在scr;nkd四突变体中某些静脉正常发育。

NKD在玉米胚乳中具有明确的作用，它的作用是抑制aleurone层的增殖 - aleurone是野生型胚乳中的单细胞层，而在NKD1;NKD2突变体中它是多层的[17]。在胚乳中，NKD1和NKD2在胚乳和淀粉胚乳中均表达，其中一个基因的功能丧失通过上调另一个基因来补偿[17]。尽管在发育中的胚胎中也报道了低水平的NKD基因表达[17]，但此处报告的数据表明，胚乳中NKD功能的丧失可能会扰乱胚胎中叶片的图案。如果没有进一步的实验，就不可能确定这种大概是非细胞自主效应的机制基础。在NKD1;NKD2突变种子内发育的胚胎中叶片图案的扰动可能是通过突变aleurone层的信号传导中断的间接后果，或者是NKD和/或其下游靶标活性丧失的直接后果。现阶段的推测还为时过早，因为需要互惠杂交来确定是否存在直接（母系）效应。综上所述，这里提供的数据表明NKD是C语言中叶子图案的调节因子。4草，与SCR一起作用以促进M细胞规格或抑制静脉规格，并可能以非细胞自主方式影响胚胎叶的图案化。

材料和方法

系统发育学

从Phytozome73下载了来自Zea mays（B12）、双色高粱、意大利塞塔里卡、维里迪斯、水稻、短吻合苣苔、短吻苔、科莫斯、拟南芥、石蒜茄和帕滕斯的初级转录本蛋白质组[34]。ZmNKD1（GRMZM2G129261）一蛋白序列被用作针对这些蛋白质组的BLASTp搜索（e值为1e-3）的查询。使用MAFFT-linsi [100]对齐前35个结果，然后使用IQtree[36，37]将对齐用于生成最大似然系统发育。

植物材料和生长条件

玉米自交系W22和Zmnkd1-Ds;Zmnkd2-Ds（渗入W22）种子来自爱荷华州立大学的Phil Becraft。Zmscr1-m2;Zmscr1h-m1种子的产生和先前报道[4]。W22在所有玉米实验中都被用作野生型对照，但使用自交系B73的原位杂交实验除外。采用桫椤加入ME034V作为所有桫椤实验的野生型对照，粳稻cv。Kitaake被用作所有水稻实验的野生型对照。Osscr1;Osscr2种子是先前生成和报道的[5]

用于表型分析的玉米和桫椤植株生长在英国牛津的温室中，光照16小时/ 黑暗循环8小时，白天温度28°C，夜间温度20°C，当自然光水平低于120μmol光子m时提供补充光?2s?1[4]]玉米种子如前所述发芽生长[4]。在发芽前，在潮湿的泥炭藓（Zoo-Med Laboratories Inc）中在3°C下处理塞塔里亚种子至少4周以打破休眠状态。然后将种子在密封培养皿中的湿纸巾上发芽，在与温室条件相同的生长柜中。七天后，将幼苗转移到 60 孔模块化托盘中的 Sinclair 堆肥中，以便在温室中生长。为种子繁殖而种植的植物在4周后重新盆栽到具有相同堆肥的7.5cm盆中，以便生长至成熟。如前所述，水稻种子在发芽前在50/5MS培养基上灭菌，随后转移到<>ml猎鹰管中的水培生长系统中[<>]。

突变命名法

玉米、塞塔里亚和水稻突变等位基因分别由后缀Zm，Sv和Os表示。SCR 和 NKD 突变等位基因以小写斜体表示，特定等位基因用破折号和等位基因参考表示（例如 Zmscr1-m2）。高阶突变体由分号分隔的单个等位基因表示，特定等位基因的杂合植物由正斜杠后跟第二个等位基因或加号表示野生型等位基因（例如Zmscr1-m2 / +;Zmscr1h-m1）。

玉米四重突变体和基因分型的产生

来自Zmscr1-m2 / +的花粉;Zmscr1h-m1植物（双突变体不产生花粉或穗）用于杂交Zmnkd1-Ds;Zmnkd2-Ds 纯合子耳朵。因此，50%的F1植物对所有四个突变等位基因都是杂合的，并且这些植物是自花授粉的。在随后的F2中，选择具有缩小的nkd1 / nkd2表型的内核进行自花授粉。F3种子来源于Zmscr1 / +个体;Zmscr1h;Zmnkd1;Zmnkd2 或 Zmscr1;Zmscr1h/+;Zmnkd1;然后将Zmnkd2基因型用于四突变体分析。

如前所述，根据要处理的样品数量，使用改良的SDS 96孔板法或CTAB方法提取用于基因分型的基因组DNA[4]。PCR基因分型测定用于跟踪各代每个位点的基因型。如前所述，Zmscr1-m2和Zmscr1h-m1等位基因进行基因分型[4]。Zmnkd1-Ds 等位基因中预期的 Ds 插入位点通过两种单独的 PCR 测定得到证实，一种使用两个引物（nkd1-F、TATCTTATCCGTCGATGCGTTG 和 nkd1-R、TCGGTCATGGCATCCTGCCTCCG）在插入位点两侧产生野生型 ZmNKD1 序列的扩增子，另一个使用一个侧翼引物 （nkd1-F） 和嵌套在 Ds 转座子序列内的第二个引物 （W22-Ds-R1， GGAGCTGGCCATATTGCAGTCATC），当Zmnkd1-Ds序列存在时产生扩增子。这里提到的Zmnkd2-Ds等位基因以前被描述为nkd2-Ds0766，并且认为与Zmnkd1-Ds一样，是由插入Ds转座子引起的功能丧失等位基因。然而，尝试从Ds转座子序列扩增到插入侧翼区域失败。相反，我们证明了该等位基因的功能丧失是由于基因5'末端的缺失，扩增（引物ZmNKD2-F2，CTTGTTGCCGTTGTGTGTGGATTG和ZmNKD2-R2，GTGCCATGTGGCTCCTATTT）在纯合Zmnkd786-Ds植物中产生的片段比野生型植物小2bp（图4A和S11）。这种缺失被认为是由染色体重排引起的（Phil Becraft，个人通讯）。正如预期的那样，Zmnkd1-Ds;Zmnkd2-Ds种子始终表现出Zmnkd1的收缩核表型特征;Zmnkd2双突变体。使用 GoTaq DNA 聚合酶 （Promega） 和 95°C 的 PCR 循环进行 PCR 扩增 5 分钟;35 次循环，95°C 持续 30 秒，57–64°C 持续 30 秒，72°C 持续 60–90 秒;和 72°C 5 分钟。甜菜碱（1 M;Sigma Aldrich）被添加到所有反应中，以帮助扩增具有高GC含量的区域。

水稻和塞塔利亚CRISPR系的产生

从图3所示的系统发育中鉴定出水稻和塞塔利亚NKD直系同源物。从先前发表的系统发育中鉴定出Setaria SCR直系同源物[4]。OsNKD序列是从植物体V12中获得的，并使用CRISPOR [5]设计了两个靶向c尾序列38'末端的向导RNA（OsNKD-g59：CTTCGGGATTAGCAGGGATG，OsNKD-g72：GTGATATCAGCGGCTTAATC）。靶向OsSCR1和OsSCR2的向导RNA先前已被设计和使用[5]，其中两个（OsSCR1-g397：TCCACCCAAGCCGTACTAGG，OsSCR2-g507：CGAGGTCGGGGTTACATGGC）用于本研究。如前所述，将指南克隆为针对OsNKD（EC17821：OsNKD-g59和EC17822：OsNKD-g72）或OsSCR1，OsSCR2和OsNKD（EC17827：OsSCR1-g397，OsSCR2-g507，OsNKD-g59和EC17828：OsSCR1-g397，OsSCR2-g507，OsNKD-g72）的四种结构。 SvSCR1、SvSCR2和SvNKD序列分别来自植物体V12，但由于用于转化的ME034V加入物与测序的加入不同，我们首先扩增了ME034V基因序列的靶区。令人惊讶的是，我们发现ME034V SvSCR1和SvSCR2序列与已发表的Setaria italica序列更匹配，ME034V SvNKD序列介于已发表的viridis和斜体序列之间。确认的ME034V序列用于随后的引导RNA设计。

由于Setaria viridis中向导RNA的编辑效率低（Daniela Vlad，个人通讯），针对每个基因设计了多个向导（S1图）。由于SvSCR1和SvSCR2具有很高的序列相似性，因此设计了一组共同的六个向导来同时靶向两个基因。对于SvSCR和SvNKD，向导被定位在基因的5'末端，以使完全功能丧失等位基因的可能性更大。然而，至少有一个向导被放置在靠近基因的3'末端的位置，以增加获得突变的机会，并使大多数基因序列的潜在切除成为可能。为了尽量减少转化的构建体数量，将向导克隆到由tRNA间隔物隔开的多顺反子表达模块中[39]。组装了两个这样的多顺反子导向阵列，一个带有六个SvSCR导向，一个带有四个SvNKD导向（S1图），均由水稻U3启动子驱动。然后将这些阵列组合成三个结构，使用前面描述的相同的金门克隆系统[5]：C402052（SvSCR阵列），C402053（SvNKD阵列）和C402054（SvSCR和SvNKD阵列）。克隆了三种相同的构建体，其中包括先前显示的GRF-GIF1融合，可提高水稻和小麦的转化效率[40]。这里没有观察到setaria转化的增强，然而，从这些构建体之一（C402057：SvSCR和SvNKD阵列）生成的一条系用于构建体（以及因此GRF-GIF1融合）与突变分离后的后续表型分析。

如前所述，使用农杆菌菌株EHA105将构建体转化为北岳水稻种子[5]。使用改进的转化方案将构建体转化为setaria ME034V[41]。简而言之，ME034V种子脱壳并用10%漂白剂加0.1%补间灭菌3分钟。将种子置于愈伤组织诱导培养基（CIM）（4.3 g/L MS盐，40 g麦芽糖，35 mg / L ZnSO4.7H 2 O， 0.6 毫克/升氯化铜4.5H20，0.5毫克/升动蛋白，2毫克/升2，4-D 4克/升凝胶，pH 5.8），4-5周后将胚胎愈伤组织移至新鲜培养基并去除凝胶状愈伤组织。再过3周后，凝胶状愈伤组织再次被去除，剩余的愈伤组织在转化前转移到新鲜培养基上1-2周。将构建体克隆到农杆菌菌株AGL1中，并在液体培养基中生长至~0.6的OD。然后通过离心收集农杆菌，并重悬于50ml液体CIM培养基中，加入40μm乙酰合环酮和0.02%合通酸。将大约100片愈伤组织添加到该悬浮液中，并在干燥前偶尔摇动孵育5分钟，然后转移到新鲜的CIM板中，滤纸放置在培养基顶部。愈伤组织在3°C下共培养22天，然后转移到CIM选择性板（含有150mg / Ltimentin和40mg / L潮霉素的CIM）在16°C下在黑暗中24天。然后将愈伤组织转移到植物再生培养基（PRM）（4.3 g / L MS盐，20 g / L蔗糖，7 g / L植物混合物，2mg / L动蛋白，150 mg / Ltimentin，15mg / L潮霉素，pH 5.8）中，并每2周移至新鲜培养基中。从愈伤组织解剖新芽并移至生根培养基（RM）（2.15 g/L MS盐，30 g / L蔗糖，7 g / L植物混合物，150 mg / Ltimentin，20 mg / L潮霉素，pH 5.7）。在这个阶段幸存下来的芽被转移到堆肥中进行基因分型。

使用与玉米相同的方法获得水稻和setaria T0基因分型的基因组DNA。首先使用扩增潮霉素基因片段的引物筛选T0幼苗[5]以评估转化成功与否。然后使用基因特异性引物对靶向编辑区域进行扩增和测序。在水稻中，所有向导都诱导了成功的编辑，然而，在构建EC17822的情况下，仅获得了少数转化的植物，因此将EC17821的编辑植物用于Osnkd单突变体表征。在setaria中，只有SCR和NKD的一个指南（SvSCR-ex2g49：GAGCAGGACCTGAGCCACTC和SvNKD-ex3g438：CATGAGTCCATGGAACGGCT）被发现始终如一地产生成功的编辑。在这两种情况下，该指南都位于更靠近基因的3'端的位置。在SCR的情况下，由成功指南产生的帧外突变导致蛋白质序列的最后~20%要么是无意义的，要么被早期终止密码子过早截断，而对于NKD，最后~40%的蛋白质受到影响。与产生水稻SCR突变体时的情况一样[5]，在T0代中没有发现在所有四个SCR等位基因中具有帧外突变的植物，所有筛选的植物至少具有一个SCR基因的未经编辑的副本。 有趣的是，一些T0植物在叶片中表现出苍白的扇区，但仅在用SCR引导阵列转化的植物中。所有Svnkd突变对应于相同的C缺失（Svnkd-m1），并且用于此编辑的纯合子植物是可行的。对于水稻和塞塔里亚，筛选T1系以识别与结构分离的突变植物。根据该分析，两个独立的Osnkd系，三个Osscr1;Osscr2;Osnkd系（以及两个先前生成的Osscr1;Osscr2系），两个Svscr1; Svscr2 线、两条 Svnkd 线和三条 Svscr1;Svscr2;Svnkd系优先用于T2和T3代的表型表征。

叶表型

使用完全展开的叶子来获得玉米，塞塔里亚和水稻的横向叶段。对于玉米和塞塔里亚，从中点沿近端 - 远端轴线切割区域并置于熔融的7%琼脂中。凝固后，块被修剪并使用强力胶安装在振动切片机上。将30-60μm的切片在3：1乙醇中清除：乙酸（玉米）或70%乙醇（setaria）10分钟。Svscr1;Svscr2 和 Svscr1;Svscr2;Svnkd叶子足够苍白，叶子解剖结构可以看到，没有任何空隙。切片被转移到载玻片上，并使用徕卡LASX图像分析软件在明场或紫外照明下使用徕卡DMRB显微镜和DFC7000T相机成像。首先从中点沿完全展开的叶5的近端-远端轴在3：1乙醇：乙酸中固定一段30分钟，然后转移到70%乙醇中，从而获得水稻叶片横向切片。将样品浸润，使用徕卡RM10旋转切片机在2135μm处切片，并如前所述用Safranin O和Fastgreen染色[5]。使用与前面描述的相同的牙科树脂和指甲油方法在相差显微镜下获得并成像Setaria叶的气孔印模[5]。

种子表型分析

将塞塔里亚种子脱壳并在水中吸收48小时，然后在切片前在FAA（4%甲醛，5%乙酸，50%乙醇）中固定2个月。然后如前所述将种子包埋在石蜡中[5]，并使用徕卡RM20旋转切片机切成2135μm切片机。将所得切片在Histoclear（2 x 10分钟）中孵育，然后在室温下通过100%，95%，90%，80%，70%，50%，30%和10%（w / v）乙醇重新水化。然后在蒸馏H中冲洗切片2O，在5.0%（w / v）甲苯胺蓝（05mM柠檬酸盐缓冲液，pH 50.4）中染色4秒，然后在蒸馏H中冲洗2O再次，最后使用一滴entellen（默克密理博）安装。使用上述相同的显微镜在明场下对载玻片进行成像。使用徕卡S9i体视显微镜拍摄水稻和雪茄全种子。

原位杂交

如[25]所述，使用蜡包埋的芽尖进行原位杂交，使用地高氧素（DIG）标记的RNA探针专门检测ZmSCR1或ZmNKD1转录本。ZmSCR1探针在第一个外显子末端是一个108 bp区域，与ZmSCR78h的相应区域共享1%的同一性[4]。ZmNKD1探针是ATG上游结束116个核苷酸的5'UTR的12 bp区域。该探针与ZmNKD59的相应区域共享2%的同一性，并且所使用的严格条件预计对ZmNKD1具有特异性。使用由0x SSC储备液（005M NaCl，20.3M Na3柠檬酸盐），计算以确保严格性。

玉米粒基因分型和胚胎成像

首先从分离的种子包中切碎内核的胚乳，并使用上述CTAB DNA提取方法用于基因分型，但在添加提取缓冲液之前对样品进行均质化。所得基因组DNA用作PCR扩增的模板，以鉴定纯合突变体以进行表型表征。然后将感兴趣的内核在水中浸泡过夜，以便在第二天取出胚胎。将胚胎固定在FAA（10%甲醛，5%乙酸，50%乙醇）中并真空浸润，然后在新鲜FAA中孵育过夜。第二天将样品转移到50%乙醇中，然后在第二天转移到70%乙醇中，并如前所述浸润蜡[5]。使用分生组织尖端下方的切片机获得10μm横向切片，其中所有原基都可见，并如上所述用Safranin O和Fastgreen染色。使用明场照明对载玻片进行成像，并使用徕卡XY构建器软件获得整个感兴趣区域。

qPCR

使用RNeasy试剂盒（Qiagen）从Zmscr1-m2的整个玉米芽中提取RNA;Zmscr1-m1 和 Zmnkd1-Ds;Zmnkd2-Ds突变体和相应的野生型系，发芽后7天。RNA经过DNase处理（TURBO DNase，Thermo Fisher）并用作生成cDNA的模板（Maxima第一链cDNA合成试剂盒，Thermo Fisher）。引物设计用于扩增ZmSCR1、ZmSCR1h、ZmNKD1和ZmNKD2基因序列的短片段以及先前验证适用于玉米qRT-PCR的两个管家基因（ZmCYP和ZmEF1α）（S3A图）[42]。RT-PCR用于验证是否扩增了正确大小的单个产物。使用SYBR-Green（赛默飞世尔）进行定量RT-PCR扩增，循环条件为95°C10分钟，然后40个95°C循环15秒和60°C循环1分钟。通过将所得产物从60°C加热到95°C来获得熔融曲线，以确认每个引物对的单个产物被扩增（S3B图）。使用cDNA模板的稀释系列评估扩增效率，其中>80%被认为是合适的。在所有情况下，从每个样品中获得三个Ct范围为<0.5的技术重复，并且所有比较都在相同的96孔板上进行。使用qPCR矿工算法[43]获得Ct值，并使用2?ΔΔCT方法[44]。使用组合的野生型平均值来比较每个单独的野生型，以指示野生型数据的范围。然后将突变样本与相同的总体野生型平均值进行比较。值 <1 表示与野生型相比相对减少，而值 >1 表示与野生型相比相对增加。

统计分析

使用R Studio进行了统计测试。韦尔奇t检验（双尾）仅用于仅涉及两组的分析。对涉及两组以上分析的分析进行单因素方差分析，如果方差分析p值为<0.05，则进行Tukey的HSD事后检验。在分析之前对折叠数据进行对数转换。所有统计分析的详细信息显示在S1表中。

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塞塔里亚CRISPR设计摘要。

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S1 图 塞塔里亚CRISPR设计摘要。

A）SvSCR1 / 2和SvNKD基因的卡通摘要，每个基因序列上方的黑色箭头指示指导位置。5'和3'未翻译区域用紫色表示，编码序列用绿色表示，内含子用橙色表示。B）指导RNA名称和序列。成功编辑的参考线以绿色突出显示。C）为本研究设计的1级和2级金门建筑的卡通摘要。启动子由箭头指示，表达式模块由矩形指示。D）本研究中使用的基因分型引物。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010715.s001

（提夫）

S2 图 Svscr1和Svscr2单突变体在表型上与野生型难以区分。

A-E）野生型（WT）ME034V（A），Svscr1-m1（B），Svscr1-m2（C），Svscr2-m1（D）和Svscr2-m2（E）植物的图像在播种后21天拍摄。 比例尺：10厘米。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010715.s002

（提夫）

S3 图 用于定量RT-PCR的引物。

A）本研究中用于每个基因的定量RT-PCR的引物序列。B） 每个底漆对的熔融曲线。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010715.s003

（提夫）

S4 图 水稻CRISPR设计总结。

A）OsNKD的卡通描绘，用黑色箭头指示基因上方的引导位置。5'和3'未翻译区域用紫色表示，编码序列用绿色表示，内含子用橙色表示。B）本研究中使用的指导RNA序列。C）用于产生Osnkd（2）和Osscr17821;Osscr1;Osnkd（2和17827）突变体的17828级金门结构的卡通摘要。D）用于对OsNKD编辑事件进行基因分型的引物序列和限制性酶切。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010715.s004

（提夫）

S5 图 NKD突变体在Setaria或水稻中没有扰动的种子发育。

A-D）setaria（A&B）和水稻（C&D）种子的图像，带有（A&C）或没有（B&D）野生型（WT）（顶行）和nkd突变体（底行）的外壳。E-G）楸树WT ME034V（E）、Svnkd-m1（第1行）（F）和Svnkd-m1（第2行）（G）成熟种子的横截面。每个图像中的Aleurone层由Al表示。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010715.s005

（提夫）

S6 图 Osnkd和Svnkd突变体不表现出受干扰的叶子发育。

A-D）野生型（WT）北岳水稻（A）、Osnkd-m6（B）、WT setaria ME034V（C）和Svnkd-m1（D）叶片远轴表面的气孔印象。 水稻图像拍摄叶子5和叶子3的塞塔里亚图像。气孔是假橙色的。比例尺：100 μm。E， F）WT Kitaake（E）和Osnkd-m6（F）叶5的横截面从中点沿近端-远端轴线拍摄。比例尺：200 μm。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010715.s006

（提夫）

S7 图 Svscr1;Svscr2;Svnkd突变叶偶尔表现出融合的静脉，没有中间的叶肉细胞。

定量五种塞塔里亚基因型中的M细胞数量：野生型ME034V，Svscr1-m1;Svscr2-m3， Svscr1-m2;Svscr2-m1， Svscr1-m4;Svscr2-m1;Svnkd-m1 和 Svscr1-m1;Svscr2-m2;Svnkd-m1.在叶子上进行定量 4.柱线是平均值的标准误差。表示生物学重复（n =），每个图右上角的字母表示使用每个基因型中M细胞的平均数量（S0表中的原始数据）计算的统计上不同的组（P≤05.1，单因素方差分析和Tukey's HSD）。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010715.s007

（提夫）

S8 图 Svscr1-m1中融合静脉的例子;Svscr2-m2;Svnkd-m1 植物。

A-B）两个附加Svscr1-m1的横向截面;Svscr2-m2;Svnkd-m1突变叶，沿叶4的近端-远端轴在中点拍摄，在紫外线照明下成像。白框表示融合静脉的例子。比例尺为 50 μm。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010715.s008

（提夫）

S9 图 四重 Zmscr1-m2;Zmscr1h-m1;Zmnkd1-Ds;Zmnkd2-Ds突变体在各种情况下表现出增加的融合叶脉。

A）定量双Zmscr3-m1叶片2中融合脉的百分比;Zmscr1h-m1突变体在杂交前和杂交后与Zmnkd1-Ds杂交;Zmnkd2-Ds.杂交后表型突变体也分离出Zmnkd1-Ds和Zmnkd2-Ds（图中标记的基因型）。B）定量野生型（WT）W3，Zmscr22-m1叶片2中融合脉的百分比;Zmscr1h-m1 和来自两个使用独立 Zmnkd1-D 的外交的另外两个四重突变体;Zmnkd2-DS工厂。来自两个异交的四重突变体在自体Zmscr1-m2 / +的后代中分离;Zmscr1h-m1;Zmnkd1-Ds;Zmnkd2-Ds 父母。C-E）叶片6的横截面来自WT W22，Zmscr1-m2;Zmscr1h-m1 和 Zmscr1-m2;Zmscr1h-m1;Zmnkd1-Ds;Zmnkd2-Ds 线。在（E）中，融合静脉用箭头表示。比例尺：100 μm。F）量化WT W22，Zmscr1-m2中融合静脉的百分比;Zmscr1h-m1 和 Zmscr1-m2;Zmscr1h-m1;Zmnkd1-Ds;Zmnkd2-Ds 叶 6.在（A），（B）和（F）中，开放圆圈是来自生物学重复的数据点，黑色十字架表示每个基因型的平均值。每个基因型上方的字母表示统计学上不同的组（P≤0.05，单因素方差分析和Tukey的HSD（S1表中的原始数据）。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010715.s009

（提夫）

S10 图 叶片图案缺陷在玉米成熟胚胎中很明显。

A-C）野生型W22（A）成熟胚胎的横截面，双Zmscr1-m2;Zmscr1h-m1突变体（B）和双Zmnkd1-Ds;Zmnkd2-Ds突变体（C）。双Zmscr1-m2;Zmscr1h-m1突变体来源于自体Zmscr1-m2/+;Zmscr1h-m1 父母而双 Zmnkd1-Ds;Zmnkd2-Ds突变体来源于自体双突变体父母。显示了每种基因型的三个胚胎。侧脉（L）和发育中的中间脉（V或V*，如果在发育早期）在最古老的叶原基中指示，在大多数情况下，该叶原基位于质体（P）4处。融合静脉的实例用红线表示。D） 双 Zmnkd1-D 的横截面;（C）中的Zmnkd2-Ds突变胚胎在较低放大倍数下显示，以说明胚泡表型。箭头指向鞘口的血管中心。E， F）源自自体Zmscr1-m2 / +的四重突变体;Zmscr1h-m1;Zmnkd1-Ds/+;Zmnkd2-Ds/+ （nkd 杂合子） （E） 或自化 Zmscr1-m2/+;Zmscr1h-m1;Zmnkd1-Ds;Zmnkd2-Ds （nkd 纯合子） （F） 父母。标签如 （A-C）。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010715.s010

（英文）

S11 图 Zmnkd2-Ds 基因分型。

Zmnkd2-Ds等位基因的基因分型显示786bp缺失。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010715.s011

（提夫）

S1 表。 统计分析摘要。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010715.s012

（三十）

确认

作者感谢Phil Becraft，Erik Vollbrecht，Hao Wu，Ruaridh Sawers和Ruben Rellan Alvarez在爱荷华州和墨西哥的田间实现玉米遗传学;约翰·贝克为植物摄影;Roxaana Clayton，Julie Bull和Lizzie Jamison提供技术支持;马修·卡拉扎斯（Matthew Karadzas）发起了qRT-PCR实验;Sophie Johnson，Chiara Perico，Daniela Vlad，Sovanna Tan，Julia Lambret-Frotte和Maricris Zaidem在整个实验工作和手稿准备期间进行讨论。

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