厦门论文发表 -突触强度、短期可塑性和输入同步性如何促进神经元尖峰输出
抽象
神经元从数千个突触中整合而来，这些突触的强度跨越一个数量级。有趣的是，在小鼠新皮层中，少数“强”突触是在类似调谐的细胞之间形成的，这表明它们决定了尖峰输出。这就提出了一个问题，即其他计算原语，包括来自许多“弱”突触的“背景”活动、短期可塑性和时间因素如何促成尖峰。我们使用配对记录和细胞外刺激实验来绘制桶状皮层 2/3 （L2/3） 锥体神经元之间形成的兴奋性突触后电位 （EPSP） 振幅和成对脉冲比。虽然净短期可塑性较弱，但强突触连接完全令人沮丧。重要的是，我们没有发现单个神经元上突触特性聚类的证据。相反，EPSP和汇聚到相同细胞上的连接的配对脉冲比跨越了L2 / 3观察到的整个范围，这严重限制了皮质过滤的理论模型。为了研究突触信息处理的不同计算基元如何相互作用以形成尖峰，我们开发了一个兴奋性L2 / 3电路中锥体神经元的计算模型，该模型受到我们的实验限制并发表了体内数据。我们发现，强突触在持续激活过程中显着降低，它们唤起相关尖峰的能力主要取决于它们在体内观察到的高时间同步和高放电率。然而，尽管存在这种萧条，但它们较大的EPSP振幅强烈放大了信息传递和响应能力。因此，我们的研究结果有助于建立一个细致入微的框架，说明皮质神经元如何利用时间编码、突触特性和噪声之间的协同作用，将突触输入转化为尖峰。
作者摘要
新皮层中的锥体神经元从周围的细胞接收数千个突触。大多数突触是“弱的”，即它们对突触后神经元只有很小的去极化作用。有趣的是，少数“强”突触主要形成于那些在感觉刺激期间一起活跃的神经元之间。这表明突触强度可能决定谁在大脑中一起放电。然而，已知许多其他因素有助于计算，包括尖峰相关性、放电速率和突触背景噪声。在这里，我们首先使用电生理实验表明，强突触在连续激活过程中也最压抑，这表明当神经元在体内以高频放电时，它们的强度可能会大大降低。为了更详细地研究这一点，我们建立了一个锥体神经元的计算模型。我们的模型表明，突触前尖峰训练的时间相关性主要决定了哪些输入可以唤起突触后神经元中的动作电位。当这些相关输入也形成最强的突触时，如体内所示，相关输入的信息传递和突触后神经元的反应性被进一步放大。我们的研究有助于建立一个细致入微的框架，说明锥体细胞如何利用时间编码、突触特性和噪声之间的协同作用。
数字
Fig 7Table 1图1图2图3Fig 4Fig 5Fig 6Fig 7Table 1图1图2图3
引文： Buchholz MO， Gastone Guilabert A， Ehret B， Schuhknecht GFP （2023） 突触强度、短期可塑性和输入同步性如何促进神经元尖峰输出。公共科学图书馆计算生物学19（4）： e1011046. https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011046
编辑 器： Boris S. Gutkin，法国高等师范学院，法国国家科学研究中心，法国
收到： 25月 2022， 24;接受： 2023月 17， 2023;发表： <>月 <>， <>
版权所有： ? 2023 布赫霍尔茨等人。这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。
数据可用性： 所有相关数据都在论文和支持信息文件中。
资金： 这项工作得到了瑞士国家科学基金会对GS（P2EZP3_188017和P500PB_203130）和瑞士苏黎世大学的资助。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。
竞争利益： 作者声明没有竞争利益。
介绍
皮质神经元根据周围脑组织中数千个细胞的突触输入计算尖峰反应。这些输入的强度跨越一个数量级，并遵循对数正态分布：虽然大多数突触连接唤起小的兴奋性突触后电位（EPSP），但少数引起相对较大的EPSP[1-6]。有趣的是，在小鼠初级视觉皮层（V1）中，在那些在体内表现出最相似感受野特性的神经元之间发现了“强”连接[6]。根据这些观察结果，提出了突触强度的简单组织原理，其中动作电位放电所需的大部分突触激发由一小部分强输入提供，这决定了突触后细胞的尖峰输出[6]。突触强度是新皮层回路功能特性的主要决定因素这一观点很有吸引力，因为它表明，在功能或结构分析中绘制最强的连接揭示了新皮层回路的潜在功能组织。然而，最近对雪貂V1的一项研究出现了更复杂的情况，其中发现神经元对视觉刺激的反应选择性是由所有共活性突触的累积重量决定的，并且不能简单地通过调整具有大EPSP的突触来预测[7]。
其他一些观察结果进一步强调了突触强度不足以解释神经元反应特性的观点。突触是复杂的生物物理装置，其持续激活期间的反应仅被单个权重参数充分捕获。有趣的是，那些引发最大EPSP的突触也往往表现出最明显的短期抑制[8-10]，这可以大大减少突触在重复激活期间可以传递给突触后伴侣的总电荷[11-16]。因此，体外记录的大EPSP的突触连接可能由于持续的自发和刺激诱发激活而在体内基本上处于抑制状态[15]。此外，即使是最大的EPSP振幅也只能提供驱动皮质神经元的膜电位通过尖峰阈值所需的去极化电荷的一小部分。因此，突触前尖峰序列中的时间巧合必然是新皮层信息编码的重要因素[7，16-19]。最后，体内神经元在突触背景活动的连续轰击下运作。体内啮齿动物感觉区表层锥体细胞的自燃率为0.1-0.4Hz[20-25]。由于啮齿动物感觉区域的锥体神经元估计接收多达~8000个突触的输入[26]，因此它们每秒必须经历数百至数千次自发突触事件。在啮齿动物V1中，与小EPSP的突触连接主要发生在表现出不同反应特性的细胞之间，因此在视觉刺激期间几乎没有时间同步[6]。因此，在啮齿动物的感觉区域中，与任何锥体神经元形成的绝大多数兴奋性突触提供了与该神经元的调谐相对无关的激发的持续轰击。因此，为了计算来自突触输入的尖峰反应，新皮层神经元在复杂的参数空间中工作。虽然已经对突触强度的计算作用（例如[6，7，27]）、短期可塑性（例如[12，13，17，28-30]）以及突触输入中的时间结构（例如[16-19]）进行了大量研究，但对这些参数如何相互作用以塑造感觉区域的信息传递的研究仍然少得多。
在这里，我们将实验工作和数据驱动的计算建模相结合，系统地研究了这个复杂的参数空间如何塑造小鼠桶皮层（S2）L3/1中锥体神经元的尖峰反应。动作电位放电率[21，23，25，31]，突触强度[6，27，32]，神经元活动内的相关性[22，33]以及汇聚到同一神经元的突触输入内的时间相关性[6]的分布和模式已经很好地表征了体内啮齿动物感觉区域中的L2 / 3.然而，尽管已经测量了所有皮质层以及不同区域和物种的兴奋性突触的配对脉冲比，但大多数研究依赖于旨在检测平均值一般差异的小数据集[4，8–10，32，34]。因此，缺少小鼠感觉L2 / 3中短期可塑性的确切统计分布的详细表征。同样，L2/3的突触强度与短期可塑性之间的关系也没有明确表征。最后，这仍然是一个受理论启发的开放问题，如果单个神经元分别主要接受抑制或促进突触，则收敛到同一神经元上的突触连接是否表现出EPSP振幅[35]或短期可塑性的系统性偏差，这可能会赋予单个神经元低通滤波器或高通滤波器特性[14，36-38]。].我们通过使用两种互补方法来绘制桶皮层切片中L2 / 3锥体神经元之间的突触传递来解决这些问题：（1）推定的单轴突的最小细胞外刺激与L2 / 3锥体细胞的全细胞记录相结合和（2）突触连接的L2 / 3锥体神经元的配对记录。然后，我们开发了一个L2/3锥体神经元的计算模型，该模型接收来自其他270个L2/3神经元的兴奋性输入[39]，其突触强度和短期可塑性是根据我们的实验数据建模的。突触前输入设置为显示受体内数据约束的时间放电模式：引发大型EPSP的少数突触连接以高频发射时间相关的尖峰，被称为“强”输入，而触发小EPSP的更多连接（称为“弱”输入）以较低频率触发不相关的尖峰[6].通过选择性地操纵突触输入中突触强度、短期可塑性和时间结构之间的关系，我们表征了这些参数中每个参数的重要性及其在模拟中的相互依赖关系。
结果
绘制L2/3中的突触强度和短期可塑性
我们表征了EPSP振幅的分布和与桶皮层L2/3中的规则尖峰神经元形成的兴奋性突触连接的相应配对脉冲比，并测试了理论预测，即汇聚到同一突触后细胞上的突触连接可能具有系统性偏倚强度[35]或短期可塑性特性。虽然配对记录是测量已识别神经元之间突触传递的最先进方法，但它们通常只允许记录与同一细胞形成的一个或几个突触连接。因此，为了能够表征由同一突触后神经元形成的多个不同的突触连接，我们测量了体细胞全细胞对周围 L2/3 中多个位置推定单轴突的细胞外配对脉冲刺激的反应（图 1A 和 1B）。
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图1. 与桶皮层中 L2/3 锥体神经元形成的兴奋性突触连接的 EPSP 振幅和成对脉冲比。
通过事后生物细胞蛋白组织学可视化的小鼠桶皮层中记录的规则尖峰 L2/3 神经元的示例。蓝点表示细胞外刺激成功的位置，蓝色移液器表示细胞外刺激电极。神经元在三个不同位置（标记为1-3）对刺激的反应显示在B.B.B体细胞电压记录中，在数字指示的位置进行20毫秒配对脉冲刺激后。灰色痕迹，个别试验;黑色痕迹，平均响应;指示配对脉冲比 （PPR）。有关细胞外刺激脉冲（虚线）的时间，请注意体细胞电压响应中的电刺激伪影。C 散点图显示了对于所有突触连接，对配对脉冲刺激范式的第二个脉冲的响应与对第一个脉冲的响应（对应于 EPSP 幅度）。大点，每个连接的平均值 （n = 74）;小点，每个连接随机选择六个单试验响应（n = 444）。对角线下方的数据点表示令人沮丧的突触连接，对角线上方的点表示促进连接。电压迹线，与 B 中的迹线 2 和 3 相同，具有相同的比例尺。D 平均EPSP振幅分布，直方图与对数正态函数拟合（R2，适合的好）。E 平均配对脉冲比分布，直方图与高斯函数拟合（R2，适合的好）。F 左，散点图显示 EPSP 幅度和配对脉冲比之间的关系;大点，每个连接的平均值（n = 74;浅绿色，便于连接;深绿色，令人沮丧的连接）;小点，每个连接随机选择六个单试验响应。该线使用线性回归拟合，单次试验数据的皮尔逊相关结果显示。右图为“小”（EPSP < 2 mV）和“大”（EPSP > 2 mV）突触连接的配对脉冲比比较（参数韦尔奇t检验）。
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我们从20个规则尖峰神经元中获得了记录，我们总共确定了74个位点，在这些位点上，最小的细胞外刺激诱发了EPSP（每个神经元平均3.7个突触连接）。对于这些细胞的一个子集，我们进行了事后生物细胞蛋白组织学检查，以确认它们确实是锥体神经元（图1A;见方法）。我们应用了严格的质量控制，以确保我们用我们的最小刺激方案激活推定的单轴突传代（见方法）。简而言之，我们仅纳入了在一小部分试验中以全有或全无方式诱发最小可观察到EPSP的突触连接，并且平均EPSP振幅和失败率在整个记录过程中保持不变[40，41]。为了避免重复记录相同的轴突，只有当它们的刺激位置距离所有先前的刺激位置>50μm时，才包括收敛到同一突触后细胞上的不同突触连接。
74个EPSP的峰值幅度分布范围为0.29 mV至4.15 mV（平均± s.d.：1.23 ± 0.75 mV），明显右偏，可以很好地拟合对数正态分布（R2= 0.97）（图 1D）。平均变异系数为 0.19 ± 0.06，平均 EPSP 起始潜伏期为 2.14 ± 1.12 毫秒，平均 10–90% 上升时间为 2.54 ± 0.86 毫秒。对于所有74个突触连接，我们还记录了20毫秒（对应于50 Hz频率）的尖峰间隔的配对脉冲比。有趣的是，配对脉冲比的分布似乎明显对称，平均± s.d.为0.93±0.20，并且可以很好地拟合正态分布（R2= 0.93）（图 1E）。我们发现EPSP振幅或配对脉冲比与动物年龄之间没有相关性[8]（S1图）。
由于EPSP振幅服从对数正态分布，而它们相应的配对脉冲比呈正态分布，因此出现了如何将它们相互映射的问题，即突触强度和短期可塑性之间是否存在系统关系。有趣的是，响应幅度的散点图为 2德·刺激脉冲对响应幅度为1圣刺激脉冲（对应于EPSP振幅）显示出具有较大EPSP的突触连接压抑的趋势，而具有较小EPSP的连接表现出一系列促进和抑制配对脉冲比（图1C和1F）。虽然在我们的数据集中，平均EPSP振幅和短期塑性之间没有显著相关性，但当我们在试验间的基础上绘制EPSP振幅和相应的短期塑性时，出现了负相关（图1F）。
为了进一步研究这个问题，我们根据突触连接的平均EPSP振幅（分为0.5 mV箱，S1数据）对突触连接数据集进行了分组。至关重要的是，我们发现在所有EPSP振幅低于2 mV的箱中，突触连接显示出一系列促进和抑制的配对脉冲比。相比之下，EPSP振幅高于2 mV的所有连接都令人沮丧（n = 10）（图1F）。当我们相应地拆分数据集时，我们发现低于2 mV的连接的平均配对脉冲比为0.95±0.20（即，表现出很少的净短期可塑性），而高于2 mV的连接具有较低的平均配对脉冲比，为0.83±0.10（图1F）。
单个突触后神经元上没有具有相似突触特性的连接聚类
接下来，我们研究了悬而未决的问题，即由相同的突触后神经元形成的突触连接的EPSP振幅和短期可塑性是否遵循与所有规则尖峰神经元上所有74个连接的相同分布。或者，给定皮质神经元的突触输入可能在统计学上相关，即单个神经元可以接收具有系统偏置EPSP振幅或配对脉冲比的突触连接，这些波幅或配对脉冲比偏离了L2/3上发现的整体分布，这可能构成赋予单个细胞高通或低通过滤特性的机制[14，38].对于总共8个神经元，我们能够表征至少5个不同的传入突触连接（总共47个连接，每个细胞平均5.9个连接）。我们将所有记录的突触中配对脉冲比率和EPSP振幅的分布称为“群体分布”，并将聚集到单个细胞上的突触连接的配对脉冲比率和EPSP的分布称为“细胞分布”。我们使用非参数Kolmogorov-Smirnov检验来检测各自的细胞分布和群体分布之间是否存在显着差异。有趣的是，对于所有8个细胞，EPSP振幅和配对脉冲比的细胞分布与群体分布没有显着差异（图2A和2B）。我们没有在多重比较中纠正这些结果;相反，我们进行了功效分析，以估计整个实验系列中可检测到的效应大小，这解释了我们的多重测试策略。
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图2. 与L2 / 3神经元形成的兴奋性突触连接不表现出EPSP振幅和短期可塑性的系统聚类。
顶部，记录在所有规则尖峰神经元上的EPSP振幅分布（群体分布）。底部是 8 个神经元测量的 EPSP 振幅分布，其中至少发现了 5 个突触（细胞分布）。N，每个细胞记录的突触数;p，每个细胞分布和群体分布之间的非参数柯尔莫哥罗夫-斯米尔诺夫检验，指示中位数。请注意，在任何给定的实验中，与突触后细胞形成的突触都从与细胞进行比较的相应群体分布中去除。B 与A中的短期塑性数据、面板布局分析相同;浅绿色，促进突触连接;深绿色，令人沮丧的连接，表示表示。请注意，在任何给定的实验中，与突触后细胞形成的突触都从与细胞进行比较的相应群体分布中去除。C 估计在 5% 显著性水平下整个实验序列中可检测到的效应大小。
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突触短期可塑性的精确定量需要电生理记录。然而，使用全细胞膜片钳记录与对通道轴突的最小刺激相结合，限制了可以为任何给定神经元记录的突触连接的数量，从而在单个细胞的水平上产生低统计功效。因此，我们进行了功效分析，以估计数据集中可检测的效应大小（有关详细信息，请参阅方法）。为了检测 0 个配对脉冲比细胞分布中的每一个与群体分布之间的显着 （α = 05.8） 差异，Kolmogorov-Smirnov 检验在效应大小为 17.0 时的平均功效为 1%，对于效应大小为 53.0 的平均功效为 2%，对于效应大小为 85.0 时，功效为 3%， 其中效应大小对应于细胞分布均值的系统差异。因此，在单个实验的水平上，统计功效较低。然而，因为我们可以重复实验8次，即使是细胞分布和群体分布之间的微小系统差异，虽然在单个实验中无法检测到，但应该在我们记录的8个神经元中的至少一个或几个中揭示出来。
为了进一步研究这一点，我们使用二项式模型（见方法）来评估整个实验系列的功效，方法是询问：在8个实验中的至少一个实验中，应该观察到95%显著性水平的配对脉冲比的系统差异？我们发现，对于效应大小为 78.0，在整个数据集中检测到显著差异的概率为 1%，对于效应大小为 99.7 时为 0.2%，在效应大小为 95.0 时，15% 的显著性水平。至关重要的是，0.15的效应大小低于我们在L0/16中检测到的小EPSP和大EPSP连接之间检测到的2.3的配对脉冲比差异（图2C）。因此，我们的实验系列获得了必要的统计功效，以检测我们在L2 / 3中发现的生理幅度下的配对脉冲比的差异。这表明由单个L2 / 3锥体神经元形成的兴奋性突触的短期可塑性跨越了L2 / 3中观察到的整个范围，并且在单细胞水平上没有显着的功能聚集。
同样，为了检测8个EPSP细胞分布和群体分布之间的显着差异，Kolmogorov-Smirnov测试对于4.9 mV的效应大小的平均功效为0.2%，对于15.0 mV的效应大小，功率为4%，对于46.0 mV的效应大小，功率为6%。类似的蒙特卡洛斯模拟表明，对于72.0 mV的系统效应大小，我们整个数据集中检测到平均EPSP振幅显着差异的概率为4%，对于99.3 mV的系统效应大小为0.6%，95%的显着性水平为0.52 mV（图2C）。总之，这些都是重要的实验结果，与理论启发的假设不一致，即突触输入到单个皮质神经元上可能在统计学上相关[35]。
用成对的全细胞记录映射突触传递
虽然对传代轴突的最小刺激为我们提供了能够映射由相同突触后神经元形成的多个突触连接的关键优势，但该方法有几个技术限制，可能会产生偏倚的EPSP和配对脉冲比分布。这包括受刺激轴突的起源仍然未知，可能位于L2 / 3之外，如果刺激强度未得到精确控制，可能会刺激多个传代轴突，与配对记录相比，动作电位可能不太可靠，不同的输入可能不是独立的，并且抑制性轴突可能与兴奋性轴突一起被激活。为了交叉检查我们用细胞外刺激测量的突触特性是否确实代表L2 / 3神经元之间的兴奋性突触连接，我们还在小鼠桶皮层的L22 / 2中同时进行了3对突触连接的锥体细胞的全细胞记录（图3）。令人放心的是，我们可以重现以前用最少刺激实验获得的所有结果：用配对记录测量的EPSP振幅服从对数正态分布，而配对脉冲比呈正态分布（图3C），这些分布与用最小模拟实验测量的分布没有区别（图3D).与我们的最小刺激数据一样，我们发现EPSP幅度与配对脉冲比在单次试验水平上呈负相关（图3E）。
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图3. 通过配对的全细胞记录测量已识别的L2 / 3锥体神经元之间的突触传递。
通过事后生物细胞毒素组织学可视化的小鼠桶皮层中一对突触连接的 L2/3 锥体神经元的示例。B 散点图显示了对于所有突触连接，对配对脉冲刺激范式的第二个脉冲的响应与对第一个脉冲的响应（对应于 EPSP 幅度）。大点，每个连接的平均值 （n = 22）;小点，每个连接随机选择六个单试验响应（n = 132）。对角线下方的数据点表示令人沮丧的突触连接，对角线上方的点表示促进连接。C Top，连接L2/3神经元之间记录的平均EPSP振幅分布，直方图与对数正态函数拟合。下图，记录L2/3神经元间平均配对脉冲比的分布，直方图与高斯函数拟合;R2，合身的好。D 左，在最小刺激（n = 74;与图1D和2A相同）和配对记录（n = 22）下记录的平均EPSP振幅的比较。右图，在最小刺激（n = 74;与图1E和2B相同）和配对记录（n = 22）下记录的平均配对脉冲比的比较。指示非参数柯尔莫哥罗夫-斯米尔诺夫 p 值。E 散点图显示了通过配对记录获得的 L2/3 锥体神经元之间突触连接的 EPSP 幅度和配对脉冲比的关系。大点，每个连接的平均值（n = 22;浅绿色，便于连接;深绿色，令人沮丧的连接）;小点，每个连接随机选择六个单试验响应。该线使用线性回归拟合，单次试验数据的皮尔逊相关结果显示。
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最后，我们测试了我们的配对脉冲比测量是否代表正在进行的突触刺激期间L2 / 3突触的短期动力学。或者，在静止前两个脉冲之间抑制的突触可能在持续激活期间显示出促进作用，例如丘脑皮质与小鼠桶皮层的连接已经证明了这一点[30]。因此，在配对记录的子集中，我们用一系列50Hz的四个动作电位激活突触，这应该足以揭示这种可变的短期可塑性[30]。所有测试的突触都显示前两个脉冲之间的配对脉冲抑制，有趣的是，它们在持续的刺激期间继续进一步抑制（S2图）。这表明在丘脑皮质传入中观察到的可变短期动力学可能是一种特定的适应，例如，对丘脑皮质通路中更高的放电率，而L2/3锥体神经元之间突触连接的短期可塑性在连续激活期间表现得更均匀。
对突触强度、短期可塑性和输入同步的相互作用进行建模
我们生成了L2 / 3锥体神经元的线性积分和火模型，以研究突触输入中的突触强度，短期可塑性和时间结构如何在兴奋性L2 / 3电路内相互作用以塑造皮质神经元的反应特性（图4A –4C;有关详细信息，请参阅方法）。为此，我们开发了一种数据驱动的建模方法：我们通过体内观察来限制突触前输入的放电速率和成对相关性，并通过以最小刺激获得的体外实验数据来限制突触强度和短期可塑性特性。
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图4. L2/3泄漏积分和发射神经元模型的默认设置。
馈送到模型单元的输入尖峰训练示例。与弱输入（底部）相比，强输入（顶部）以更高的频率和时间相关性（颜色编码）触发。垂直灰色条带表示模型单元格中生成的尖峰时序（与 C 中的相同）。一些弱输入在描述的200 ms时间窗口中没有尖峰，因为它们的点火率低。B 根据我们的体外记录，强输入被设置为具有较大的EPSP振幅和相应的短期抑郁，而弱输入被设置为唤起较小的EPSP，具有较弱的净短期可塑性。C 模拟模型神经元激活后与 A 所示的输入尖峰序列的膜电位，D 左，270 个输入尖峰序列的 EPSP 振幅。中心，强输入和弱输入的EPSP振幅比较（中位数，25-75%百分位数和范围）。对，绘制的数据与直方图相同。E 左，20 个输入尖峰序列上的 270 ms 配对脉冲比。中心，强弱输入的配对脉冲比比较（中位数，25-75% 百分位数和范围指示）。对，绘制的数据与直方图相同。F 左，270 个输入尖峰列车与用于生成成对相关结构的模板尖峰列车之间的皮尔逊相关系数（参见方法）;颜色代码如 A、B. 中心，强弱输入与模板尖峰序列的相关性比较（中位数，25-75% 百分位数和范围指示）。对，绘制的数据与直方图相同。G 左，270 个输入尖峰列车的发射速率。中心，强弱输入的发射率比较（中位数，25-75% 百分位数和范围指示）。对，绘制的数据与直方图相同。
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简而言之，模型神经元接收了来自270个突触前神经元的兴奋性输入[4，39]，在我们的细胞外刺激实验之后，其EPSP振幅（图4D）和短期可塑性特性（图4E）受到限制（参见方法）。请注意，突触前L2/3细胞的数量是基于L2/3神经元与L3/2突触后伙伴平均形成3个解剖突触的假设[4，39]。在我们的模型中，这是通过这样一个事实来捕获的，即我们在最小刺激下激活的通道轴突也必须平均与记录的神经元形成多个解剖突触。将我们在最小刺激下记录的EPSP振幅范围（0.29-4.15mV）与从配对记录（0.15-2.25mV）获得的EPSP振幅范围进行比较时，这一点很明显，其中每个连接的解剖突触数量（平均值为1.6）是从EM中另外确定的[42]。6个突触输入的时间输入相关性[4]（图25F）和放电率[4]（图270G）受到已公布的啮齿动物皮层体内数据的限制（参见方法），使得少量强突触输入在高频下发射时间相关的尖峰，并表现出较大的EPSP振幅和相应的短期抑制。其余大多数提供“背景”活动的弱突触被设置为以低频和时间不相关的模式发射，类似于随机泊松过程，并表现出小的EPSP振幅，没有明显的净短期可塑性（图4A和4B）。
以这种方式建立模型后，我们验证了所有参数都是按照实验数据分布的，并且EPSP幅度和短期塑性与EPSP幅度和时间相关结构[6]之间的相互依赖性得以保留（S3图）。
为了检查突触输入和模型神经元的输出触发模式之间的信息传递，我们测量了每个输入尖峰序列和模型神经元的输出尖峰序列之间的皮尔逊相关系数。我们通过映射模型细胞的输入输出关系（即，峰值概率作为重合突触输入数量的函数）进一步表征了模型细胞的神经元增益。通过选择性地操纵突触输入中突触强度、短期可塑性和时间结构之间的关系，我们系统地表征了这些参数中的每一个对信息传递和神经元增益的贡献。每个实验重复总共100次模拟运行;对于每次迭代，我们随机重新生成一组新的 270 个输入尖峰序列。
最后，由于模型的尖峰输出直接由特定的模型参数集决定，我们通过进行详细的鲁棒性分析来评估结果的可靠性。简而言之，我们在体外和体内实验报道的L2 / 3锥体神经元范围内改变了单个模型参数或参数组合（见方法）。我们发现，虽然模型的绝对触发率取决于特定的参数设置，但我们的相关和增益分析的定性结果在测试参数组合范围内相对不受影响，前提是模型神经元在其默认设置中允许以足够的触发速率（即> 2 Hz）尖峰，以实现相关性和增益分析（S4 图）。
首先，我们在其默认的“生理”设置中运行模拟，即使用在我们的体外记录中找到的参数和参数映射并发布体内数据（图4和5，参见方法）。为此，我们设置静息膜电位（V休息）至-70 mV，根据小鼠桶皮层L5/7体内峰值速率的实验测量结果，平均输出放电率为0.3±4.5 Hz（图2C和3F）[25]。在此设置中，模型的平均膜电位（Vm）在突触轰击期间，弱输入和强输入为-59.8±0.2mV（图4C，5B和5D），这与小鼠L2的体内全细胞记录相似[9]。正如预期的那样，强突触输入与模型的输出尖峰序列共享最高的皮尔逊相关系数（平均±标准差：0.15±0.04;范围：0.11至0.23），而弱输入显示的相关系数小一个数量级（平均±标准差：6.0±02.0;范围：02至0.0）（图10E）。在所有输入中，具有降低内在相关性、较小EPSP幅度和较低尖峰速率的尖峰序列与输出尖峰序列的相关系数越来越低（图5E）。我们确认了皮尔逊相关系数确实检测到尖峰时序的相关性，而不是通过随机泊松过程的输出尖峰时间，同时保持输出发射速率相同，检测到尖峰时序而不是发射速率的相关性。令人欣慰的是，所有输入和输出峰值序列之间的相关性随后降至零。
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图5. 弱输入的不相关活动增强了强突触输入的信息传递。
删除弱输入的模型设置示意图。B 模型单元的默认设置中的示例尖峰序列（灰色），当弱输入完全被移除时（橙色），以及当弱输入被去极化程度更高的 V 替换时休息（红色）。C 模型设置示意图，删除了强输入。D 模型单元的默认设置（灰色）和删除强输入（紫色）时的峰值序列示例。E 270 个输入尖峰列车与模型单元的输出尖峰列车的 P earson 相关系数。显示了三种模型设置的结果：默认仿真（灰色;所有输入，如图4所示）和A中引入的设置（橙色，弱输入被删除;红色，弱输入替换为去极化V）休息).点表示平均值，阴影区域表示 100 次模拟运行的相关系数的标准偏差。F 顶部，A中介绍的默认模拟和设置的模型神经元的强突触输入和输出尖峰序列之间的Pearson相关系数。（数据是100次模拟运行的平均值;指示中位数和25-75%的百分位数;非参数Kolmogorov-Smirnov检验，* p < 0.05。G 输出尖峰概率与所有输入尖峰序列的重合尖峰数量呈函数关系（灰色，默认仿真;红色，弱输入替换为去极化 V休息).
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突触后台活动增强了强输入的信息传递
我们探索了强突触输入与弱突触输入对模型细胞输出尖峰的相对影响。至关重要的是，当我们完全去除弱输入时（图5A和5B），强输入和输出尖峰序列之间的平均相关性降低到0.04±0.01（图5E和5F）。模型神经元的输出放电率降至0.29 ± 0.12 Hz（图5F），其平均值Vm超极化至-63.8 mV±0.07 mV。尽管强突触输入的信息传递急剧下降，但那些具有最高内在相关性和突触强度的输入仍然与输出尖峰保持最高的相关性（图5E）。
为了研究在我们的模拟中，突触背景活动是否仅仅通过将膜电位去极化到更接近尖峰阈值或通过随机膜波动来增强强输入，我们将弱输入与去极化V交换。休息（相当于中位数 Vm当只有弱输入处于活动状态时测量）。我们发现，在没有随机膜波动的情况下，强输入的相关系数与默认设置没有差异;然而，模型神经元的整体反应性仍然降低（图5F）[43]。用去极化V替换弱输入休息也导致输入输出曲线的斜率更陡（图5G），证实了突触“背景噪声”对神经元增益具有分裂作用。这种噪声通过增加可以整合重合输入以唤起尖峰的时间窗口，拓宽了神经元对输入尖峰序列中时间相关性范围的敏感性，这一发现与以前的研究一致[44]。
当我们从模拟中删除强突触输入时（图5C），弱输入提供的不相关活动本身无法驱动突触后神经元超过峰值阈值（图5F）。这是因为 235 个弱输入以 1.2 ± 0.9 Hz 的平均频率发射，平均 EPSP 振幅为 1.03 ± 0.42 mV，导致平均 Vm-62.4 mV，很少超过尖峰阈值（图5D）。因此，仅弱突触的不相关活动无法引起尖峰，并且不会传递在其自身的尖峰序列中编码的信息（图5E）。
输出尖峰需要强输入的相关性和高点火率
接下来，我们通过在输入尖峰序列中随机分配EPSP振幅及其相应的短期可塑性特性，将强输入的高时间相关性和高放电率与其较大的突触强度解耦（图6A）。本实验保持了EPSP振幅与短期可塑性之间的原始耦合，即具有较大EPSP的突触仍表现出凹陷，而具有较小EPSP的突触表现出促进作用。
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图6. 时间相关性和发射速率主要决定输出尖峰，突触强度增强响应能力。
带有随机EPSP振幅的模型设置示意图;EPSP振幅与短期塑性的关系得以维持。B 模型单元的峰值序列示例，其默认设置（灰色）和随机 EPSP 振幅（蓝色）。C 270 个输入尖峰列车与模型单元的输出尖峰列车的皮尔逊相关系数。显示了两种模型设置的结果：默认模拟（如图 4 所示）和 A 中引入的设置.点表示均值，阴影区域表示 100 次模拟运行的相关系数的标准偏差。D 顶部，A 中介绍的默认模拟和设置的模型神经元的强突触输入和输出尖峰序列之间的 Pearson 相关系数。 底部，默认模拟的模型单元的输出触发率和 A 中引入的设置。 （数据是 100 次模拟运行的平均值;指示中位数和 25-75% 百分位数;非参数柯尔莫哥罗夫-斯米尔诺夫检验， * p < 0.05.）E 输出尖峰的概率是所有输入尖峰序列中重合尖峰数量的函数（灰色，默认模拟;蓝色，带有随机EPSP的模型设置）。
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当以这种方式建立模型时，输出神经元的放电率降低到1.3±0.3 Hz（图6B和6D）。至关重要的是，与具有较低时间相关性和较低放电率（平均± s.d.：0.08± 0.02）的输入相比，具有较高时间相关性和较高放电率的输入对模型神经元的放电贡献更大（皮尔逊相关平均值± s.d.：0.02 ± 0.02）（图6C）。这意味着突触强度本身并不能确定哪些输入向输出神经元的尖峰序列传递了最多的信息。相反，在我们的模拟中，高时间相关性和升高的放电率的组合是唤起输出神经元中相关尖峰的主要决定因素。然而，将较大的EPSP振幅与具有高时间相关性和高放电率的输入（即我们的默认设置）相匹配，如在体内强突触输入中观察到的那样[6]，它们与模型神经元的尖峰序列的相关性进一步提高了2倍，并显着增强了模型细胞的响应性（图6C和6D).将大EPSP振幅与相关输入解耦（通过在所有输入尖峰序列之间随机排列EPSP振幅）也会导致模型的输入-输出曲线斜率变平，并对重合输入的响应能力降低（图6E）。这表明，将最大的EPSP振幅分配给那些具有高时间相关性的输入对神经元增益具有乘法效应，导致信号放大成为提高强输入有效信息传输的机制[44]。
短期可塑性平衡了强输入和弱输入的计算效果
接下来，我们从所有突触中去除了短期可塑性机制，使得它们在所有尖峰间隔持续时间内表现出1的配对脉冲比，即所有EPSP振幅在重复刺激期间保持静止（图7A和7B）。
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图 7. 短期可塑性平衡了强输入和弱输入的计算效果。
模型设置示意图，去除了短期塑性机制，即所有尖峰列车的配对脉冲比均为1。B 模型单元在其默认设置（灰色）和去除短期塑性机制（浅绿色）时的尖峰序列示例。C 模型设置示意图，去除了短期塑性机制，并去除了弱输入。D 模型单元的峰值序列示例，在其默认设置（灰色）和当短期可塑性机制和弱输入被移除时（深绿色）。E 270 个输入尖峰列车与模型单元的输出尖峰列车的 P earson 相关系数。显示了三种模型设置的结果：默认模拟（如图 4 所示）和 A、C 中引入的设置.点表示均值，阴影区域表示 100 次模拟运行的相关系数的标准偏差。F Top，强突触输入与模型神经元的输出尖峰序列之间的皮尔逊相关系数，用于 A-C 中引入的默认模拟和设置。底部，默认模拟和 A-C 中引入的设置的模型单元的输出触发率。（数据是100次模拟运行的平均值;指示中位数和25-75%的百分位数;非参数Kolmogorov-Smirnov检验，* p < 0.05。G 输出尖峰概率与默认仿真（灰色）和 A-C 中引入的设置（分别为浅绿色和深绿色）的所有输入尖峰序列的重合尖峰数的函数关系。
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在此设置中运行仿真时，模型神经元以 18.0 ± 0.3 Hz 的频率发射，这比具有最高发射速率的输入尖峰序列所展示的频率还要高（图 7F）。同时，强输入与输出尖峰序列的平均相关系数翻了一番，达到0.21±0.09，最大值超过0.4（图7E和7F）。此外，弱输入与输出尖峰序列的相关系数也增加到0.02±0.03（图7E）。
这些结果表明，在我们的默认设置中，在持续激活期间，强输入的较大EPSP振幅明显降低（图4和5）。值得注意的是，由于弱突触输入平均而言只是轻微的压抑（图4E），因此去除它们的短期可塑性机制应该只会对它们的总兴奋驱动产生很小的净促进作用。为了证实这一点，我们还从模型中完全删除了弱输入（图7C和7D），发现这确实对强输入的相关系数没有影响（图7F）。因此，在去除短期可塑性后，弱输入在最大化强输入信息传递方面的计算效果变得多余。在这种状态下，仅强突触就可以确定模型神经元的尖峰特性。
此外，当去除短期可塑性机制时，输入-输出曲线的斜率明显更陡峭（图7G），这证实了强输入的短期抑制对神经元增益有分裂性影响[28，29]，因此拓宽了神经元对输入尖峰序列中时间相关性的反应[44]。
讨论
我们将实验工作和计算建模相结合，研究L2/3锥体神经元的尖峰反应如何由突触输入中时间结构的复杂参数空间、突触强度和短期可塑性塑造。
作为第一步，我们详细绘制了筒皮层L2 / 3中突触强度和短期可塑性的分布。我们发现，短期可塑性遵循具有较大方差的对称分布，并且平均略微令人沮丧。有趣的是，突触强度和短期可塑性在我们的数据集中仅呈微弱负相关。相反，它们的关系通过简单的规则更好地捕捉，即EPSP振幅低于2 mV的突触连接跨越整个抑制和促进范围，并且没有表现出明显的平均短期可塑性。相比之下，EPSP振幅高于2 mV的连接完全令人沮丧，这就提出了一个有趣的问题，即强突触抑制的计算作用是什么。
然后，我们探讨了理论预测，即不同突触后神经元上特定突触特性的聚类可能是在皮层中实现过滤功能的机制。然而，我们没有发现L2/3锥体细胞中任何明显聚类的实验证据。
最后，我们对L2 / 3神经元的计算模型表明，强突触输入在突触后细胞中引起尖峰的能力主要取决于它们的高时间相关性和高体内放电速率的结合，而不是主要取决于它们的突触强度，在体内持续激活期间应该会大大降低突触强度。.然而，正如啮齿动物V1[6]报道的那样，将这些“驱动”，共同调整的突触连接与强大的突触权重配对，大大增强了它们将信息传递到输出尖峰序列的能力。
配对记录实验确认最小刺激结果
我们使用对通道轴突的最小刺激，以便能够映射由相同的突触后神经元形成的多个不同的突触连接，这很难通过配对记录实现。为了评估最小刺激的技术警告（见结果），包括多个传入轴突被刺激的可能性，不同的输入不是独立的，以及受刺激轴突的未知来源，我们另外进行了一对突触连接的L2 / 3锥体神经元的全细胞记录。令人欣慰的是，我们发现两种方法之间的EPSP幅度，配对脉冲比及其关系的分布没有差异。这表明我们在最小刺激下获得的数据与L2 / 3锥体细胞之间的单一突触连接一致。此外，我们没有观察到在相同的突触后神经元上EPSP振幅或配对脉冲比的任何聚类，如果以最小刺激映射的不同轴突不是彼此独立的，这是可以预期的。这表明我们主要记录了L2 / 3锥体神经元之间的单一和独立连接，并且最小刺激方法的局限性并没有严重污染我们的数据集。
桶状皮层L2/3的短期可塑性
虽然啮齿动物桶状皮层L2/3的轻度平均抑制与既往报道一致[4，8]，但其他研究发现，感觉区域的兴奋性L2/3突触平均有中度促进作用[9，10，32]。与后一项研究（使用约2 mM）相比，我们对平均短期抑郁症的发现可能受到细胞外溶液中钙浓度升高（5.2 mM）的影响。然而，这似乎不太可能，因为[4]和[8]也报告了使用相似浓度的2mM钙的轻度抑郁。
有趣的是，[9] 和 [10] 在第 2 层 （L2） 中使用了配对记录。虽然[32]在L2/3的整个厚度上进行了配对记录，但他们报告只有轻微的平均促进，整体异质性很大。我们主要记录了浅表L2/3的神经元体细胞，可能对应于[9]和[10]研究的层，但刺激了贯穿L2/3整个深度的轴突。因此，这些数据集之间的差异可能表明L2循环连接[9，10]和L3->L2通路之间的突触特性存在差异。这与越来越多的文献描述了L45和L46中神经元回路之间的结构[47]和功能[2，3]差异，并进一步支持了L2和L3（通常被认为是构成单个计算实体）实际上可能具有不同计算特性的观点[45，47]。
没有证据表明突触支配对L2/3神经元的统计偏倚
有趣的是，我们发现在L2/3中与相同的锥体神经元形成的突触强度或突触连接的短期可塑性没有统计学偏差。相反，我们的数据表明，由给定的L2 / 3神经元形成的突触输入没有显着相关，但它们的强度和短期可塑性反而遵循与整个神经枕上所有突触连接的分布相同的分布。这种统计偏差已被假设用于解释皮层中对数正态放电率分布[35]，并被提出为赋予神经元高通或低通滤波器特性的潜在机制，这可能是整合和差异激活的基础[14，38，48]。重要的是，通过证明在单细胞水平上不存在明显的系统偏差，我们的实验结果为这些特定计算如何在L2 / 3中产生的理论模型提供了生物学约束。
由于我们已经通过体细胞全细胞记录表征了突触强度和短期可塑性，因此我们不能排除一种有趣的可能性，即突触神经支配的统计偏差实际上可能存在于树突分支的水平上，在这种情况下，这种计算可以在亚细胞水平上实现[49-51]。需要进一步的实验来研究这种可能性。
对突触强度、短期可塑性和输入同步的相互作用进行建模
为了解决强连接的明显短期抑制的计算作用，并研究突触前尖峰序列中的突触强度、短期可塑性和时间特性如何塑造皮质神经元的放电特性，我们生成了一个 L2/3 锥体神经元的泄漏积分和发射模型，并在我们的模拟中系统地操纵了这些参数。模型神经元的突触输入受到从我们自己的体外记录中获得的生理数据和从文献中采用的体内数据的限制[6，25]。
在默认设置中，该模型设置为在5Hz左右产生稀疏放电，这与小鼠桶皮层中L2/3的平均峰值率一致[25]。其输出尖峰序列与强突触输入表现出最高的时间相关性[6]。此外，我们的模拟可以通过突触背景活动[52，53]和强突触的短期抑制[28，29]重现乘法增益调制的效果。
我们发现，通过弱突触携带的突触背景活动通过去极化V对强输入的信息传递做出了关键贡献m通过随机共振型效应[54]：虽然无法自行唤起尖峰，但弱输入使模型神经元能够在细胞对重合强输入变得敏感和响应的状态下运行[17，43，55-59]。即便如此，也需要高放电率和多个强突触的同步活动来唤起模型神经元中的尖峰[16-19，60]。值得注意的是，突触强度本身并不能决定哪些突触前细胞可以引起尖峰[7]。
短期可塑性和突触强度之间关系的计算作用尚未在皮质加工研究中详细解决。有趣的是，我们在体外观察到的突触连接的明显短期抑制被证明是必要的，以抵消持续刺激期间强输入的高放电率、高时间相关性和大 EPSP 振幅，并且对于维持突触后神经元对具有最高时间相关性的输入尖峰序列的响应至关重要。这表明短期抑制可能是防止复发性L2/3电路中失控激励的机制之一。
柱状和“盐胡椒”皮质中方向调整的观点
少数强突触输入决定皮质神经元反应特性的观点[6，61]最近受到雪貂V1中明显相互矛盾的发现的挑战[7]。在小鼠V1中，体内感受野特性最相似的神经元也形成了最强的突触连接，如体外评估[6]。相比之下，雪貂V1体内神经元的反应选择性被证明是由所有驱动突触的累积重量决定的 - 弱和强。有趣的是，仅通过强突触的调谐无法预测反应选择性[7]。当我们在仿真中对EPSP振幅进行洗牌时，我们确实发现具有最高点火率的相关输入仍然驱动输出尖峰序列，而不是那些具有最强突触的输入。然而，由于在这种情况下反应性大大降低，其他放大机制，例如[7]观察到的较小突触的树突聚类可以发挥重要的计算作用。
我们的观察可能提供一个框架来调和这些明显矛盾的发现。在食肉动物的柱状V1中[62]，简单视觉刺激的呈现激活了同一取向柱内相邻神经元的群体[63]。V1表层中锥体细胞的轴突在其自身的体细胞周围形成一簇主要的突触bouton[64]。因此，与啮齿动物不同，这些神经元被许多具有相同方向调整和眼优势的相邻神经元激发。因此，在高等哺乳动物的视觉区域发现的“柱状”方向图[65-68]可以为产生调谐反应所必需的“数字强度”提供基础[7]，而无需在共同调谐的神经元之间增加更强的突触。我们的发现是，强输入的高时间相关性和放电率，而不是它们较大的突触强度主要驱动尖峰，支持这一观点，并且与猫V1中的尖峰与局部场电位相锁的观察结果一致，这反映了局部神经元群内的同步性[60]。
相比之下，啮齿动物V1的“盐和胡椒”组织[69]意味着定向刺激激活空间扩散网络[63]。因此，神经元可能从类似调谐的细胞中接收较少的突触连接，并且仅靠时间相关性和放电率可能不足以实现方向调整。我们的观察结果是，将大EPSP振幅与相关的输入尖峰序列配对，可以进一步增强驱动输入传输信息的能力，这表明啮齿动物V1中预测的“数字强度不足”可以通过类似调谐的神经元之间更强的突触来补偿[6]。然而，这导致预测在小鼠V1中，来自类似调谐神经元的输入尖峰序列中的时间结构在体内产生方向调整中也起着关键作用，这一预测可以通过实验进行测试。
总之，我们的研究结果有助于建立一个细致入微的框架，即皮质神经元如何利用化学突触的生物物理特性、输入尖峰序列的时间结构和神经元网络中的“噪声”之间的相互作用进行有效计算。
方法
道德声明
动物实验是在Kevan A.C. Martin（苏黎世大学和苏黎世联邦理工学院神经信息学研究所，瑞士苏黎世）的许可下进行的。动物处理和实验方案由瑞士苏黎世州兽医局批准。
切片准备
从28只出生后6至57天的雄性B21 / C28小鼠中获得皮质切片。用异氟醚麻醉动物，将其斩首，并迅速取出大脑并浸入冰冷切片人工脑脊液中（ACSF，含有，以mM为单位：87 NaCl，75蔗糖，26 NaHCO3，10葡萄糖，7 MgSO4，2.5 KCl，1 NaH 2PO4和0.5 CaCl 2，连续氧合95%O 2，5%CO 2）。含有桶状皮层的冠状切片在振动切片机上以300μm的厚度切割，并转移到含有重新编码ACSF的腔室（以mM为单位：119 NaCl，26 NaHCO3，10葡萄糖，1.3 MgSO4，2.5 KCl，1.25 NaH 2PO4和2.5 CaCl 2，连续氧合95%O 2，5%CO 2）。切片保存在室温下的记录ACSF中，直到记录为止。
电生理学
使用P-5拉拔器（Sutter仪器）从硼硅酸盐玻璃中取出贴片移液器（移液器阻力：7-2MΩ，移液器吸头直径：97μm），并填充细胞内溶液（含有mM：105 K-葡萄糖酸，20 KCl，10 Na-磷酸肌酸，2 Mg-ATP，2 Na-ATP，0.3 GTP和10 HEPES，pH值用KOH设置为7.2）。将生物细胞素（0.5%）添加到细胞内溶液中以染色记录的神经元。在配备红外差分干涉对比光学元件和34倍和36倍水浸物镜的奥林巴斯BX2W3显微镜下，在61–1°C下从桶状皮层中目视识别的L10/60神经元获得全细胞膜片钳记录。使用Multiclamp 700A放大器（Axon Instruments）采集数据，以10 kHz采样，以3 kHz滤波（Digidata 1322A，Axon Instruments），并使用软件pClamp（分子设备）进行监测。我们没有在浴中加入GABA[41，70，71]或NMDA拮抗剂[41，70]，因为先前的研究没有报道将这些阻断剂纳入最小细胞外刺激实验对EPSP波形有任何明显的影响[40，72，73]。
磨合后，接入电阻通常在15-30 MΩ范围内，接入电阻>30 MΩ的记录被丢弃。对电桥电位进行了补偿，而液结电位（估计为13.9 mV）未得到校正。磨合后的Vm范围为-85至-70 mV。如果Vm在记录过程中漂移，则注入保持电流（通常<50 pA）以保持膜处于其初始静息电位，这很少是必需的。不允许 Vm 漂移到 -85 至 -70 mV 的范围之外。因为Vm接近GABA的逆转潜力一个在所有实验中，我们期望我们记录的EPSP没有受到抑制连接的污染。
根据既定方案对单轴突进行最小刺激[40，41]，如下所示。在建立全细胞记录后，我们通过小心地将单极细胞外刺激电极（充满ACSF）以倾斜角度通过L2 / 3并传递重复的0.1 ms电流脉冲（10-12μA幅度）来识别突触前轴突与记录的细胞形成突触，直到在记录的神经元中检测到EPSP。当刺激电极距离记录细胞的体细胞360-20μm时，通常检测到突触连接。为了实现对突触到记录神经元上的假定单轴突纤维的刺激，我们随后降低刺激幅度，直到不再诱发EPSP，随后增加刺激幅度，直到在一小部分试验中以全有或全无的方式可靠地诱发最小的可观察到EPSP[400，40].最终刺激幅度设置为该水平（通常为41-5μA）。我们只记录了突触连接，这些突触连接在诱发EPSP的潜伏期从一个试验到另一个试验几乎没有变化。然后，我们在低频（16.20 Hz）下进行了0毫秒的配对脉冲刺激，至少进行了2次扫描。记录后，我们仔细评估了pClamp 30（分子器件）中的每次肉眼扫描，并仅将那些在细胞外刺激脉冲后诱发EPSP且其诱发的EPSP未被自发发生的EPSP污染的最终数据集中的扫描包括在内。作为确保我们刺激单轴突传代[9]并且突触连接在整个记录期间保持稳定的附加对照，我们仅包括当记录结束时的EPSP具有与第一个诱发的最小刺激EPSPs相同的平均振幅，潜伏期和形状时的突触连接。我们的最终数据集平均包含每个突触连接41.11±2次扫描（范围为5到6次扫描）。
按照最小刺激方案，我们小心地将细胞外刺激电极移动到L2 / 3神经枕的其他位置，以识别与相同记录的神经元形成突触的不同轴突纤维。为了尽量减少我们再次从同一突触前轴突记录的机会，我们非常小心地不要在同一位置多次刺激，并且仅当突触连接距离所有先前的刺激位置>50μm时，才包括突触连接，如记录期间的10倍概览图像所评估的那样。在每个实验结束时，我们将电流步进每个神经元，以将其放电模式表征为规则尖峰（即推定的兴奋性/锥体神经元）或快速尖峰（推定的抑制性/神经元间）。
如[42]中所述进行配对记录，并使用与我们的最小刺激实验相同的细胞内溶液和ACSF。
组织学
记录后，立即将切片固定在15%苦味酸，4%多聚甲醛和0.5%戊二醛的0.1 M磷酸盐缓冲液（PB）中过夜。然后将固定切片在PB中洗涤，在上升的蔗糖梯中孵育以进行冷冻保护，在液氮中快速冷冻，并在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中用3%过氧化氢和10%甲醇处理以淬灭内源性过氧化物酶。在PBS和三缓冲盐水（TBS）中洗涤后，在TBS中用VectatainABC试剂盒（载体实验室，目录#PK-6100，RRID：AB_2336819）在4°C下处理切片过夜。在TBS中洗涤后，使用镍二氨基联苯胺（Ni-DAB）四盐酸盐和过氧化氢处理观察生物细胞素，然后在PB中进行一系列洗涤以终止反应。然后将部分嵌入Mowiol（Sigma Aldrich）中，盖子滑落。在奥林巴斯BX61显微镜下对恢复神经元的Z堆栈进行成像，以用解剖学交叉检查先前确定的电生理细胞类型。锥体细胞根据其树突形态（例如，多刺树突）进行鉴定，并与先前记录的规则尖峰放电模式相对应。
电生理数据分析
我们使用Stimfit[74]单独分析了配对脉冲刺激引起的每个突触后电位，并测量了其峰值幅度，变异系数，开始潜伏期（即，从细胞外刺激伪影开始到诱发突触后电位开始的时间）和10%-90%的上升时间。然后，我们对所有扫描的这些各自测量值进行了平均。EPSP被定义为由配对脉冲范式的第一个脉冲引起的突触后电位，即在短期可塑性发生之前。配对脉冲比定义为第二个诱发突触后电位的峰值幅度除以第一个诱发突触后电位（即EPSP）的峰值幅度。进一步的统计分析是在MATLAB（MathWorks）和Prism（GraphPad）中进行的。通过配对记录实验获得的EPSP幅度和配对脉冲比以类似的方式测量。
为了获得给定实验的无偏群体分布，我们排除了该实验中与突触后神经元形成的所有传入突触连接，但不包括常规尖峰神经元中记录的所有其他连接。给定实验的细胞分布包括该实验中与突触后神经元形成的所有传入突触连接。将细胞分布与MATLAB（柯尔莫哥罗夫-斯米尔诺夫检验）中具有kstest2函数的群体分布进行比较。
我们进行了事后蒙特卡洛功率分析，以估计根据数据集中的样本量可以检测到哪些效应大小（即，平均EPSP振幅或细胞分布和群体分布之间的平均配对脉冲比之间的系统差异）。我们为每个实验单独执行此操作，方法是使用系统不同的方法引导新的细胞分布，然后针对群体分布进行Kolmogorov-Smirnov检验。
具体来说，对于配对脉冲比的功效分析，我们首先将每个实验的配对脉冲比群体分布形式化为正态分布，其平均值和标准差与该实验观察到的配对脉冲比总体分布相同。为了测试哪些效应大小是可检测到的，然后我们通过以±0.1个单位的步长改变群体分布的平均值，为该实验的配对脉冲比细胞分布形式化了一系列可能的基础生成器分布。通过这样做，我们设计了一系列用于配对脉冲比单元分布的发生器分布，具有系统不同的方法。对于这些细胞发生器分布中的每一个，我们然后抽取实验观察细胞分布中存在的相同数量的随机样本（即，在5到8之间），并对从形式化群体分布中抽取的随机样本运行Kolmogorov-Smirnov测试（包含与该实验的群体分布相同数量的条目）。我们选择以这种方式从生成器分布中用“替换采样”来近似我们的实验，因为我们只能从由L2/3锥体神经元形成的数千个突触输入中的一小部分进行实验记录。在这些条件下，与神经元形成的突触总数应该可以忽略不计。
对于每个细胞发生器分布，该分析重复10，000次，并且检测一定大小效应（即，基础细胞发生器分布和群体分布之间均值的系统差异）的统计功效定义为产生显着p值（α = 0.05）的试验比例，参见 结果.根据我们的结果，EPSP幅度的功率分析以类似的方式进行，唯一的例外是使用对数正态分布而不是正态分布。
由于我们的数据集包含 8 个实验，其中至少映射了 5 个传入连接，因此在我们的实验系列中，有 8 次机会检测到细胞与群体分布之间的显着差异。因此，一个简单的二项式模型可以用来问：在这8个实验中的至少一个实验中，应该观察到95%显著性水平的配对脉冲比的哪些系统差异？为了回答这个问题，我们计算了概率密度函数，以获得零作为简单二项式函数的实现（即，在 8 个实验中的任何一个中观察到无显着差异的可能性），其中 N = 8（即，我们的独立实验的数量）和 P = 在单个实验中观察到给定效应大小的平均概率（如上所述， 请参阅结果）。然后，我们以类似的方式对EPSP振幅分布重复这些分析。
建模方法
我们基于体外记录的被动生物物理特性生成了L2 / 3锥体神经元的泄漏整合和发射模型，并发表了体内数据。该模型接收来自270个突触连接的输入，其尖峰时间，突触权重和短期可塑性参数设置如下节所述。简而言之，我们首先构建了270个尖峰列车，其成对相关系数和发射速率再现了啮齿动物L2 / 3的体内观察结果（见结果）。然后，我们分配了这些尖峰序列EPSP幅度和相应的配对脉冲比，以重现我们的体外数据。然后调整突触强度，使模型神经元中的EPSP振幅与我们在体外测量的体细胞EPSP振幅完全匹配（见下文）。
根据体内数据生成具有时间相关性的输入尖峰序列
我们生成了270个输入尖峰序列，其成对相关系数与[6]报告的体内数据相匹配，即少数（强）输入尖峰序列表现出高成对相关系数，而其余大多数（弱）输入尖峰序列的相关性逐渐降低。我们首先生成了一个持续时间为10 s的模板尖峰序列，通过使用非均匀泊松更新过程，并在1 ms时间步长下从伽马分布（形状k = 1.40，尖峰间间隔平均值为1 ms）采样尖峰间间隔持续时间，从而生成了持续时间为25 s的模板尖峰序列，该序列表现出稀疏和不规则的时间结构，导致平均发射率为<> Hz。我们将模板尖峰列车与不同标准差的高斯包络（σ高斯），以生成一组 270 个具有精确定义的相关统计量的新尖峰列车 [75]。我们将 270 个输入分为强输入（n = 35，即输入的 13%）和弱输入（n = 235，即输入的 87%），基于我们在体外发现的 EPSP 振幅与短期可塑性之间的关系（即 EPSP 振幅> 2 mV（10 / 74 突触连接，即 13.5%）完全压抑，而 EPSP 振幅< 2 mV 的突触显示出整个范围的短期可塑性）。为了使用相应的时间相关统计量设置这两个输入尖峰列车群体，我们对σ高斯从两个均匀分布为强（σ高斯在 5 到 10 毫秒之间，n = 35）和弱突触输入（σ高斯在10-100 ms之间，n = 235）[75]。由此产生的 270 σ高斯对值进行排序并将其分配给 270 个输入尖峰序列。对于 270 个输入尖峰序列中的每一个，我们用高斯包络对模板尖峰序列的尖峰时间进行卷积，其标准偏差由每个尖峰序列各自的σ设置高斯.通过这样做，对于每个尖峰序列，我们获得了一个 10 秒的时间过程，该时程由代表随时间变化的相应尖峰概率的高斯分布总和组成。由于σ迭代增加高斯，具有递增指数的尖峰列车的尖峰概率分布相对于模板尖峰列车不断扩大和扁平化。然后，我们使用非齐次泊松过程从这些时间相关的尖峰概率分布中绘制尖峰时间，从而为每个输入尖峰序列生成离散尖峰时间。得到的270个尖峰列车与模板尖峰列车的成对相关系数持续降低。
最后，我们考虑了这样一个事实，即在体内的桶状皮层中，相关的突触输入倾向于以较高的频率触发，而不相关的输入以较低的速率触发[6，25]。我们参数化了小鼠体内枪筒皮层L25/2中[3]测量的对数正态放电速率分布（平均± s.d.：4.16 ± 8.33 Hz），并从中随机抽取270个“目标发射速率”。对这些值进行排序并分配给 270 个输入尖峰序列，使得与模板尖峰序列具有更高成对相关性的尖峰序列也显示出更高的目标发射速率。然后，我们从每个输入尖峰序列中随机删除单个尖峰，使每个尖峰序列的平均发射速率与相应的目标发射速率相匹配。
在以这种方式生成270个输入尖峰序列后，我们验证了它们的成对相关系数[6]和放电率[25]与啮齿动物L2 / 3体内获得的实验数据相匹配（参见结果，图4和S3）。此过程重复 100 次，以生成要在模型中运行的 100 组不同的尖峰列车。
生成 EPSP 幅度和相应的配对脉冲比分布
为了将真实的 EPSP 振幅分配给 270 个模型输入，我们用对数正态分布（图 1D，见结果）对体外测量的 EPSP 振幅分布进行了参数化，并从中随机抽取 270 个 EPSP 振幅值。然后，我们通过参数化第二个脉冲（EPSP2）和我们在体外记录的具有指数衰减函数的配对脉冲刺激范式的第一个脉冲（即EPSP幅度）（图1C）。至关重要的是，实验记录的EPSP的抖动2该拟合曲线周围的值与以零为中心的高斯分布（非参数柯尔莫哥洛夫斯米尔诺夫检验，p 值为 0.48）没有显著差异，标准差为 ± 0.192。此标准差捕获 EPSP 比率的自然方差2到EPSP振幅，随后用于生成我们的建模数据。对于选定的 270 个 EPSP 振幅中的每一个，我们首先分配了一个相应的 EPSP2通过使用给定 EPSP 振幅的拟合指数衰减函数预测的值。然后，我们将方差作为从随机高斯过程中提取的数字添加到所选值中，平均值为 0，标准差为 0.192。最后，我们验证了所得的EPSP分布、配对脉冲比分布及其映射与我们的体外记录数据相对应（见结果）。
在突触前尖峰训练期间动态模拟短期可塑性
配对脉冲比以刻板的时间间隔捕获突触对两个后续释放事件的短期可塑性反应。为了动态模拟短期可塑性，以便在具有可变尖峰间隔的棘突列车期间持续激活，我们利用广泛使用的扩展Tsodyks-Markram模型将突触的短期可塑性特性形式化为一般形式[76，77]：
(1)
(2)
简而言之，短期抑郁（方程 1）被建模为可用于释放 R（t） 的突触囊泡池的耗竭，u（t）?R（t） 在时间 t 的先前释放事件之后sp，由时间常数τ的囊泡池恢复抵消娱乐.短期促进（方程 2）建模为释放概率 u（t） 的增加，f（1?u（t）） 跟随在 t 处的前一个峰值sp，衰减到时间常数 τ 的基线释放概率 U便利设施.因此，可以通过指定参数集的值来模拟突触抑制到促进的连续统一体[34，78]。
为此，我们推导出270个模型突触中的每一个的Θ作为其配对脉冲比的函数，如下所示。方程 （1） 和 （2） 的计算优化形式由 [34] 通过时间 Δtn 的尖峰 n 和 n+1 之间的积分推导出n分开：
(3)
(4)
尖峰n处的EPSP振幅可以计算为：
(5)
[76]，其中A是一个可调权重参数，涉及现象学上的几个生理强度参数，例如释放位点的数量，数量大小和电缆过滤特性。配对脉冲比 PPR 是尖峰 n+1 处的 EPSP 和尖峰 n 处的 EPSP 之比：
(6)
在时间 t = 0 时，当没有出现前一个尖峰时，R 的稳态值n= 1 和 un = U和等式（6）可以简化为：
(7)
通过插入 R 的方程 （3） 和 （4）N+1和你N+1，我们可以将等式 （7） 重写为
(8)
至关重要的是，小反刍兽疫0在方程 （8） 中，在 Δtnn= 20 ms（即，）准确地描述了我们的实验配对脉冲刺激方案。这使我们能够获得每个突触的参数集 Θ 作为其 20 ms 配对脉冲比的函数。
定义每个突触的短期可塑性参数集 Θ
为此，我们根据[34]（表1）在从强抑郁到强促进的连续统一体上改变Θ，这导致了一个包含唯一定义Θs和相应值的大型数据集。对于我们的270个模型突触中的每一个，我们然后选择参数集Θ，其结果值与我们之前分配给该突触的配对脉冲比最接近（见上文）。通过为每个突触获得唯一的参数集 Θ，我们可以计算其 RN+1和你N+1在连续尖峰列车期间，分别使用 Eqs （3） 和 （4）。启动模拟的每个新运行时，RN+1和你N+1已初始化为 Rn和你n，使得短期塑性参数分别重置为其初始“朴素”值。
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表 1. 强烈抑制和强烈促进突触的参数集 Θ，采用自 [34]。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011046.t001
对 EPSP 幅度和配对脉冲比进行建模
接下来，我们将每个输入尖峰序列的离散尖峰时间转换为连续的突触电导时间过程。为此，每个尖峰都与一个 alpha 函数复杂化，该函数由相应输入的指定突触强度和动态短期可塑性属性缩放：
(9)
峰值电导率g.max适合每个输入突触，使得当该突触从模型中的静止激活时（g泄漏= 0.01 毫秒;τm= 20 毫秒;如体外测量，见下文），它唤起了所需的EPSP振幅。突触时间常数t峰设置为 1 毫秒。拟合 g 后.max有了这组参数，EPSP上升时间与我们的体外记录非常吻合。对于输入尖峰序列中的每个尖峰n，我们动态调整电导比例因子PPRn根据方程（6），这是该突触的短期塑性参数集Θ及其先前的尖峰历史的函数。将生成的270条电导迹线汇总为包含模型所有突触输入的单个电导迹线，然后将其用作神经元模型的输入（见下文）。
L2/3神经元的泄漏积分与火模型
我们在Python 3中实现了欧拉方法。7.数值模拟dV电压变化m使用等式的模型：
(10)
我们设置泄漏电导率g泄漏至 0.01 mS（对应于输入电阻 R输入100 MΩ） 和 τm至20毫秒，这是我们最小刺激实验中体外记录的锥体神经元的中位数。当 Vm超过-50 mV，Vm被重置为 V休息持续时间为10毫秒，以考虑神经元的动作潜在时间过程和不应期。静息膜电位V休息根据体内记录，设置为-70 mV，输出放电率为5.7 Hz[25]。模型单元I的突触输入电流合成使用公式从输入电导迹线（见上文）动态计算每个仿真时间步长：
(11)
反转电位E合成设置为0 mV，即AMPA突触的逆转电位。
模拟突触前尖峰序列中突触强度、短期可塑性和时间相关性的相互作用
以这种方式建立模型后，我们模拟了模型单元在激活270个输入突触后与相应的突触前尖峰序列的电压响应。我们使用指数滤波器 （τ = 270ms） [10] 将模型神经元的输出尖峰序列和 79 个输入尖峰序列中的每一个的离散尖峰时间复杂化为连续函数，并计算每个输入尖峰序列和输出尖峰序列之间的成对 Pearson 相关系数。此外，我们将模型神经元的输入-输出关系量化为峰值生成的概率，作为输出峰值之前20毫秒时间窗口中重合输入数量的函数。如结果中所述，然后我们在模拟中操纵了活动突触的相应群体及其突触参数，以研究突触前尖峰列车中突触强度、短期可塑性和时间相关性的相互作用。我们通过重复 100 组尖峰列车的每个模拟设置来计算平均相关系数、输入输出曲线和相应的标准差（见上文）。
模型参数的鲁棒性分析
我们评估了我们的建模结果在体外和体内报告的L2 / 3锥体神经元的一系列不同生物物理参数中是否成立。在我们的初始设置中，R输入和 τm根据我们自己的体外测量（见上文）和g.max适合每个突触，以便在这些条件下产生所需的EPSP振幅。我们保留了原来的g.max每个固定突触的值（适合 R输入= 100 MΩ） 并更改 （1） R输入至80 MΩ，与桶状皮层L2/3锥体细胞中的体内记录一致[80]，（2）不应期至20 ms，以及（3）τm至10ms，与桶状皮层L2/3锥体细胞的体内记录一致[80]。在后一种设置中，V休息设置为-65 mV（而不是-70 mV），使得模型神经元在其默认设置中以>2 Hz的频率触发，以启用相关和增益分析。最后，我们将所有参数设置为体内报告的值：τm至 10 毫秒，R输入至 60 MΩ 和 V休息至-60 mV [9，13，80]。对于型号 （3） 和 （4），g.max适合 R输入= 100 MΩ， τm= 10 毫秒。
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在最小刺激下测量的EPSP振幅和配对脉冲比与动物年龄无关。
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一个B202224262830012345EPSP 振幅 （mV）2022242628300.00.51.01.52.0动物年龄（天）配对脉冲比p = 0.52n = 74p = 0.73n = 74动物年龄（天）
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S1 图 在最小刺激下测量的EPSP振幅和配对脉冲比与动物年龄无关。
EPSP振幅是实验时动物年龄的函数。B 20 ms配对脉冲比作为实验时动物年龄的函数。标明了皮尔逊相关系数。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011046.s001
（英文）
S2 图 配对记录表明，在持续刺激期间，短期可塑性保持稳定。
突触后对突触前神经元中以 20 毫秒的尖峰间隔（即 50 Hz;指示刺激脉冲）发射的四个动作电位的序列的突触后反应轨迹。迹线是平均值，通过降低 EPSP 幅度（即响应 1圣脉冲）并对应于B中的相同颜色。 B所有记录的突触（n = 9）在突触前神经元中发射的四个动作电位列车的持续刺激期间继续压抑。通过减小 EPSP 振幅对数据进行排序和颜色编码。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011046.s002
（英文）
S3 图 输入尖峰序列中突触强度、短期可塑性和相关性之间的映射。
参数分布之间的关系反映了我们的体外数据和从[6]中采用的体内数据。从我们的体外记录生成的 270 个输入的 EPSP 分布。B 20 ms配对脉冲比分布，用于我们的体外记录产生的270个输入。C 根据 [270] 采用的体内数据生成的 6 个输入的成对相关系数。D 20 个输入的 EPSP 幅度与 270 ms 配对脉冲比之间的关系散点图。E 270 个输入的 EPSP 幅度与成对相关系数之间关系的散点图。F 20 个输入的 270 ms 配对脉冲比与成对相关系数之间的关系散点图。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011046.s003
（英文）
S4 图 我们的计算结果对于不同的模型参数组合是可重复的。
我们更改了泄漏积分和火灾模型的单个（A，B）或生物物理参数组合（C，D），并重复了结果部分中显示的所有分析。面板布局对应于图 5–7 底行中的面板。在 C、D、V 所示的模拟中休息去极化以在默认设置中将模型单元的输出放电率提高> 2 Hz，以便可以运行相关和增益分析。除非另有说明，否则模型的实验扰动与中心面板（顶部和底部）中显示的默认设置之间的所有成对比较都具有统计学意义（p < 0.05，非参数柯尔莫哥罗夫-斯米尔诺夫检验）。为清楚起见，省略了带阴影的标准差带，左侧面板中的默认仿真结果除外。A 使用 R 的模型的结果输入80 MΩ（而不是100 MΩ），与体内桶状皮层L2/3神经元的记录一致[80];所有其他参数保持不变;注意模型神经元的输出放电率下降（中下图）。B 每个尖峰事件后“非生理”长不应期为 20 毫秒（而不是 10 毫秒）的模型的结果。C τ 模型的结果m10 ms（而不是20 ms），与体内桶状皮层L2/3神经元的记录一致[80];所有其他参数保持不变;V休息去极化5 mV [9]，以允许足够高的输出放电率。D 具有 R 的“体内样”模型的结果输入60 MΩ（而不是 100 MΩ），τm10 毫秒（而不是 20 毫秒），V休息-60mV，与体内桶状皮层L2/3神经元的记录一致[9，13，80]。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011046.s004
（英文）
S1 数据。 图 1 的源数据。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011046.s005
（三十）
S2 数据。 图 2 的源数据。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011046.s006
（三十）
S3 数据。 图 3 的源数据。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011046.s007
（三十）
S4 数据。 图 4 的源数据。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011046.s008
（三十）
S5 数据。 图 5 的源数据。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011046.s009
（三十）
S6 数据。 图 6 的源数据。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011046.s010
（三十）
S7 数据。 图 7 的源数据。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011046.s011
（三十）
确认
我们要感谢Kevan A.C. Martin的灵感，支持，对手稿的评论和资助。我们要感谢Qendresa Parduzzi帮助开发模型。作为神经信息学研究所的成员，作者是《巴塞尔宣言》的签署者。
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