厦门论文发表 -轴促进周围和中枢神经系统的轴突再生
抽象
与未成熟的神经元和来自周围神经系统（PNS）的神经元不同，来自中枢神经系统（CNS）的成熟神经元在受伤后无法再生。在过去的15年中，在确定中枢神经系统损伤后神经保护和/或轴突再生所需的分子和途径方面取得了巨大进展。在大多数再生模型中，磷酸化的核糖体蛋白S6（p-RPS6）在神经元中上调，这通常与mTOR（哺乳动物雷帕霉素靶标）途径的激活有关。然而，这种核糖体蛋白的翻译后修饰在CNS再生中的确切贡献仍然难以捉摸。在这项研究中，我们证明了RPS6磷酸化对于小鼠的PNS和CNS再生至关重要。我们表明这种磷酸化是在背根神经节（DRG）神经元的预处理效应期间诱导的，并且它由p90S6激酶RSK2控制。我们的结果表明，RSK2控制预处理效果，RSK2-RPS6轴是该过程以及PNS再生的关键。最后，我们证明了RSK2促进背柱中的CNS再生，脊髓突触可塑性和靶神经支配，从而导致功能恢复。我们的数据确立了RSK6控制的RPS2磷酸化在CNS再生中的关键作用，并为创伤性病变后轴突生长和回路形成的机制提供了新的见解。
数字
Fig 7图1图2图3Fig 4Fig 5Fig 6Fig 7图1图2图3
引文： Decourt C， Schaeffer J， Blot B， Paccard A， Excoffier B， Pende M， et al. （2023） RSK2-RPS6轴促进外周和中枢神经系统的轴突再生。公共科学图书馆生物学21（4）： e3002044. https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002044
学术编辑： Cody J. Smith，圣母大学干细胞和再生医学中心，美国
收到： 八月 16， 2022;接受： 21月 2023， 17;发表： 2023月 <>， <>
版权： ? 2023 德库尔等人。这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。
数据可用性： 所有相关数据均在论文及其支持信息文件中。
资金： 这项工作得到了ANR对SB的资助（ANR-18-CE16-0007）。HN得到了NRJ基金会和欧洲研究委员会（ERC-St17-759089）的支持。这项工作得到了法国国家研究机构在“未来投资”计划（ANR-17-EURE-0003至CD）下的支持。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。
竞争利益： 提交人声明不存在相互竞争的利益。
缩写： 中枢神经系统， 中枢神经系统;CTB， 霍乱毒素B;DPI， 受伤后天数;DRG， 背根神经节;移动托， 哺乳动物雷帕霉素靶标;质检 预置;PNS， 周围神经系统;p-RPS6， 磷酸化核糖体蛋白S6;研资局， 视网膜神经节细胞;RPS6， 核糖体蛋白S6;vGAT， 囊泡γ氨基丁酸转运蛋白;Vglut1， 囊泡谷氨酸转运蛋白1
介绍
与发育中的神经元或来自周围神经系统（PNS）的神经元相反，来自中枢神经系统（CNS）的成熟神经元在受到侮辱（神经退行性疾病或创伤性病变）后无法再生其轴突。患者必须患有不可逆和永久性的运动、认知和/或感官障碍。全球范围内此类神经系统疾病的不断增加，以及缺乏有效的治疗方法，使轴突再生和功能恢复成为公共卫生的主要挑战。
CNS再生衰竭既有外在成分，也有神经元内在成分[1，2]。mTOR（哺乳动物雷帕霉素靶标）通路是控制轴突再生的关键神经元信号通路之一。事实上，已经表明，通过神经元中的PTEN（Phosphatase和TEN罪同源物）缺失激活mTOR通路，会触发视觉系统和皮质脊髓束中强大的轴突再生[3-7]。随后，组合/协同方法（通常包括mTOR通路激活）导致了长距离再生[8，9]。此外，对特定视网膜神经节细胞（RGC）亚群再生能力的分析显示，骨桥蛋白和IGF通过mTOR活化作为轴突再生的调节因子[10]。在PNS中，mTOR也被证明可以调节轴突再生。然而，它对这一进程的确切贡献仍不清楚。事实上，mTOR的一个靶标S6激酶1（S6K1）通过对mTOR的负反馈抑制轴突再生[11，12]。相反，TSC2基因缺失或PTEN抑制（mTOR通路的负调节因子）导致坐骨神经病变后轴突再生轻度增加[13-15]。此外，在培养的DRG（背根神经节）神经元中对mTOR的药理学抑制仅诱导轻度作用[16，17]。
mTOR活化的一个主要读数是核糖体蛋白S6（RPS6）的磷酸化[18]，它属于核糖体的小40S亚基，是蛋白质合成的功能单位。RPS6是一种RNA结合蛋白，通过与核糖体RNA相互作用来稳定核糖体[19]。在所有核糖体蛋白中，RPS6引起了最多的关注，因为它是第一个被证明具有诱导翻译后修饰的蛋白[20]。近40年来，人们一直在研究RPS6磷酸化，然而，关于其生理功能仍有许多未知数[21]。有趣的是，在视网膜中，对损伤最有弹性的RGC亚群具有较高的内源性RPS6磷酸化水平，这种水平在损伤后得以维持[10]。然而，这种磷酸化是否与mTOR活化直接相关仍然难以捉摸。此外，在某些情况下，损伤信号可能会触发特定事件，以启动神经元的促再生反应。脊髓背柱病变模型中对这一特征进行了优雅的描述[22]。作为中枢神经系统的一部分，由DRG神经元的中央分支形成的背柱在脊髓损伤后无法再生。然而，DRG外周支的既往病变（例如在腰椎水平形成坐骨神经）会启动DRG神经元以在中央支再生其轴突：这称为预处理效应[23，24]。有趣的是，坐骨神经损伤后DRG神经元的RPS6磷酸化水平升高[10，18]。
总之，RPS6的磷酸化状态对于促进轴突再生至关重要。然而，RPS6磷酸化的确切作用以及调节这种翻译后修饰在CNS再生过程中的机制仍然难以捉摸。令人惊讶的是，DRG培养物中的mTOR抑制不影响RPS6磷酸化[17]。这一结果表明，除了mTOR途径之外，其他信号通路可能正在控制RPS6磷酸化。
来自p90 S6激酶（RSK）家族的蛋白质也是已知的RPS6磷酸化调节因子[25]。RSK蛋白家族由4种亚型（RSK1-4）组成，具有高同源性（从80%到87%）[26]。RSK主要由细胞外信号调节激酶（ERK）激活，并调节细胞中的重要过程，如生长、存活、增殖和细胞周期进程[26]。有趣的是，Mao及其同事发现RSK1通过激活促再生蛋白有助于轴突再生[27]。然而，RSK-RPS6轴在CNS再生中的贡献尚未得到解决。
在这项研究中，我们专注于小鼠腰椎DRG作为中枢和周围神经系统再生的模型。我们分析了具有不可磷酸化RPS6的小鼠系，以破译其对再生的影响。我们表明，Ser 6-235残基上的RPS236磷酸化不仅对于PNS再生而且对于预处理效果都是必不可少的。在4个RSK中，RSK2由DRG强表达，其表达受轴突损伤调节。我们进一步表明，RSK2调节RPS6磷酸化以促进小鼠的脊髓再生，脊柱突触可塑性，靶点神经支配和功能恢复。总之，我们的结果提供了RSK2 / RPS6轴在神经系统再生中至关重要的证据。
结果
Ser 6–235 上的 RPS236 磷酸化控制预处理效果并有助于坐骨神经再生
核糖体蛋白RPS6的磷酸化常用作mTOR活化的读数[18]。然而，RPS6在再生过程中的确切贡献从未得到解决。事实上，RPS6是一种核心核糖体蛋白，携带5个可以磷酸化的丝氨酸残基（Ser235、Ser236、Ser240、Ser244和Ser 247）[19，21]（图1A）。为了了解RPS6在轴突再生中的作用，我们分析了其在坐骨神经损伤时的磷酸化动力学（图1B）。我们收集了6周龄野生型小鼠腰椎背根神经节（DRG-L3至L5），这些小鼠处于完整（幼稚）状态和坐骨神经损伤（dpi）后1、3和7天。使用特异性抗p-S6进行蛋白质印迹分析Ser235-236和抗 p-S6Ser240-244抗体显示，Ser6-235上的RPS236磷酸化在1 dpi时上调，在3 dpi时达到峰值，然后在7 dpi时降低（图1C和1D）。另一方面，Ser6-240上的RPS244磷酸化总体上保持稳定，尽管仅在3 dpi时略有增加（图1E）。RPS6的总水平在受伤后保持稳定（图1F）。同时，我们使用免疫荧光分析了DRG切片中磷酸化RPS6的水平。与蛋白质免疫印迹分析一致，我们观察到p-S6增加Ser235-236从 1 dpi 开始表达，峰值为 3 dpi。在 7 dpi 时，p-S6 的水平Ser235-236回到对照（未受伤）状态（图1G和1H）。相反，p-S6的水平Ser240-244没有随时间发生任何显著变化（图1I和1J）。总之，这些结果表明，在坐骨神经损伤时，Ser6-235上的RSP236磷酸化在DRG中上调。
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图1. Ser6-235上的特异性RPS236磷酸化是由坐骨神经损伤诱导的。
（A）RPS5线圈结构域上6个丝氨酸（Ser）磷酸化位点的示意图。（B）代表实验工作流程的示意图。（C） 代表性蛋白质印迹显示，在 6 和 235 dpi 时，Ser236-1 上的 RPS3 磷酸化增加，而总 RPS6 和 GAPDH 表达保持稳定。（D、E）图表显示Ser6-S235（D）上RPS236磷酸化在Ser240-244（E）上的定量标准化为总RPS6。（F）显示从C（平均±SEM，韦尔奇方差分析检验多重比较，每组N = 6只动物）在GAPDH上归一化的总RPS4的图表。（G） 用抗p-S6染色的DRG切片的代表性显微照片Ser235-236（洋红色）和抗Tuj1（灰色）在坐骨神经损伤时的完整和不同时间点。比例尺：50 μm。（H） 显示 G 定量的图表，确认蛋白质免疫印迹数据，p-S6 增加Ser235-236在 1 和 3 dpi（平均± SEM，Krukal-Wallis 检验多重比较，每组 N = 4 只动物）。（I）标有抗p-S6的DRG切片的代表性显微照片Ser240-244（洋红色）和抗Tuj1（灰色）在坐骨神经损伤时的完整和不同时间点。比例尺：50 μm。（J）显示I定量的图表（平均±SEM，Krukal-Wallis检验多重比较，每组N = 4只动物）。???p < 0.001， ??p < 0.01， ?p < 0.05， ns： 不显著。原始数据可在支持信息（S1 数据和 S1 原始映像）中找到。DPI，受伤后天数;DRG，背根神经节;RPS6，核糖体蛋白S6。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002044.g001
然后，我们询问RPS6磷酸化是否在DRG神经元亚群中受到差异调节。我们分析了p-S6Ser235-236DRG不同亚群的表达强度（S1A图）。在完好无损的情况下，我们发现所有分析的神经元亚群都具有p-S6的基础水平Ser235-236.这与中枢神经系统形成鲜明对比，中枢神经系统只有少数亚群维持p-S6Ser235-236在成熟神经元中的表达（例如，视网膜中的α RGC或固有光敏RGC[10]）。有趣的是，坐骨神经损伤后 3 天，p-S6Ser235-236在这些亚群中受到差异调节。这些人群中的大多数上调p-S6Ser235-236 (S1B和S1C图）：胰岛1/2和Advillin（大多数感觉神经元），TrkB（机械感受神经元）和Parv清蛋白（本体感受神经元）DRG神经元。对于其他一些，p-S6++++Ser235-236不受坐骨神经损伤的统计学调节：TrkA（伤害性神经元）、Calbindin（机械敏感神经元）和生长抑素（瘙痒感应神经元）神经元。然而，我们注意到p-S6的趋势+++Ser235-236TrkA和生长抑素DRG群体的磷酸化增加（S1B和S1C图）。++
为了评估这些亚群的再生能力，我们在坐骨神经挤压后用神经内注射Alexa-555结合霍乱毒素B（CTB）对再生DRG神经元进行逆向标记。神经元的所有亚群都会再生，因为我们在所有分析的亚群中发现了CTB神经元。再生DRG亚群比率对应于幼稚条件，除了TrkA和TrkB显示相反的比率（S1D图）。这些结果也与CNS报道的结果形成鲜明对比，CNS中只有少数亚群显示出生存和再生能力[10]。+++
然后，我们讨论了RPS6磷酸化对轴突再生的贡献。我们分析了内源性携带不可磷酸化RPS6版本的转基因小鼠系的再生反应[28]。在该小鼠系中，所有丝氨酸磷酸化位点（Ser235、236、240、244和247）均突变为丙氨酸（S2A图）。我们验证了RPS6不能在DRG切片上使用免疫染色进行磷酸化（S2B图）。然后，我们从完整蛋白中提取蛋白质，并从3周龄野生型（RPS6p+/p+）、杂合子（RPS6p+/p-）和纯合子（RPS6p-/p-） 同窝伴侣。使用抗p-S6进行蛋白质印迹分析Ser235-236和抗 p-S6Ser240-244抗体验证了 RPS6 在纯合突变小鼠的完整和 235 dpi DRG 中，无论是在 Ser236-240 上还是在 Ser244-3 位点上都没有磷酸化（RPS6p-/p-），与 RSP6 相反p+/p+和 RPS6p+/p-同窝（S2C-S2E图）。RPS6的总水平用作对照，在所有基因型之间没有差异。与p-S6的峰值表达一致Ser235-236在3 dpi（图1C和1D）下，我们观察到p-S6显着增加Ser235-236两者都在 RPS6 中p+/p+和 RPS6p+/p-3 dpi 的小鼠（S2D 图）。另一方面，p-S6的水平没有变化Ser240-2443 dpi 下的磷酸化（S2E 图）。
接下来，我们询问预处理效果是否需要RPS6磷酸化。为此，我们在RPS6上单方面进行了坐骨神经损伤。p+/p+和 RPS6p-/p-小 鼠。三天后，我们从完整（幼稚）侧和受伤（预处理）侧分离L3至L5 DRG神经元，并培养16小时（图2A）。在幼稚状态下，来自RPS6的神经元p+/p+和 RPS6p-/p-小鼠具有短而高度分支的神经突（S2F图）。事实上，我们发现RPS6之间的最长神经突长度和分支间距没有显着差异。p+/p+和 RPS6p-/p-幼稚的DRG神经元（S2F-S2I图）。正如预期的那样，在预处理培养物（坐骨神经损伤后）中，来自RPS6的DRG神经元p+/p+小鼠具有预处理神经元的典型表型，具有长神经突和很少的分支（图2B）。引人注目的是，在RPS6中p-/p-预处理的DRG神经元，神经突短且高度分支。它们呈现与先前没有坐骨神经损伤的幼稚DRG神经元相同的表型（图2B-2E）。综上所述，本实验表明RPS6磷酸化是预处理效果所必需的。
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图2. Ser 6–235上的RPS236磷酸化是轴突再生的关键。
（A）预处理和坐骨神经再生范式中不可磷酸化RPS6小鼠系分析的工作流程。（B）来自WT的成熟DRG神经元预处理培养物的代表性显微照片（RPS6p+/p+）和纯合子（RPS6p-/p-）RPS6磷酸化缺陷的小鼠，表明预处理效应在RPS6中受到抑制p-/p小 鼠。比例尺：250 μm。（中-东）显示B.（C）每个神经元最长神经突长度的图表，接种后16小时（平均±SEM，未配对t检验，3个独立的DRG培养物，每个培养物每个条件计数约50个细胞）。（D） 最长神经突的 2 个分支之间的距离（平均 ± SEM，未配对的 t 检验，3 个独立的 DRG 培养物，每个培养物每个条件计数约 50 个细胞）。（E）铺板后16小时生长神经突的神经元的百分比（平均±SEM，未配对t检验，每个培养物每个条件量化10个随机显微镜场）。（F） WT 损伤后 3 天坐骨神经切片的代表性共聚焦图像 （RPS6p+/p+）和纯合子（RPS6p-/p-） 小鼠。再生轴突用抗SCG10抗体（白色）标记。红色虚线表示受伤部位。比例尺：500毫米。 （G）从F定量再生轴突3 dpi（平均±SEM，未配对的多重t检验，N = 每组7-8只动物）;（H）F的3 dpi再生指数（平均±SEM，未配对t检验，每个条件至少5只动物）。（I）来自RPS6的成熟DRG神经元预处理培养物的代表性显微照片p-/p-小鼠过表达RPS6Ser235D-236D或 RPS6Ser240D-244D-247D.仅 RPS6Ser235D-236D过表达恢复预处理效应表型。比例尺：250 μm。（J–L）显示I.（J）每个神经元最长的神经突长度，电镀后16小时（平均±SEM，普通单因子方差分析，3个独立的DRG培养物，每个培养物每个条件计数约50个细胞）。（K） 最长神经突的 2 个分支之间的距离（平均 ± SEM、普通单向方差分析、3 个独立的 DRG 培养物、每个培养物每个条件计数约 50 个细胞）。（L）铺板后16小时生长神经突的神经元百分比（平均±SEM，双向方差分析，每个培养物每个条件量化10个随机显微镜场）。（M） RPS6的代表性共聚焦图像p-/p-受伤后 3 天的坐骨神经切片 AAV8-Ctrl、AAV8-RPS6Ser235D-236D或 AAV8-RPS6Ser240D-244D-247D过度表达。再生轴突用抗SCG10抗体（白色）标记。红色虚线表示受伤部位。比例尺：500毫米。 （N） 再生轴突的定量 3 dpi 从 M 开始（平均± SEM，双向方差分析多重比较，N = 每组至少 3 只动物）（?、??、???：AAV8-Ctrl 和 AAV8-RPS6 组之间的比较Ser235D-236D;#, ##;###：AAV8-Ctrl 组和 AAV8-RPS6 组之间的比较Ser240D-244D-247D），和（O）3 dpi再生指数（平均±SEM，普通单因子方差分析，每种条件至少5只动物）。???p < 0.001， ??p < 0.01， ?p < 0.05.###p < 0.001， ##p < 0.01， #p < 0.05.NS：不重要。原始数据可在支持信息（S1 数据）中找到。DPI，受伤后天数;DRG，背根神经节;RPS6，核糖体蛋白S6。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002044.g002
然后，我们询问RPS6磷酸化是否参与PNS再生。为此，我们对6周大的RPS6进行了坐骨神经损伤p+/p+和 RPS6p-/p-小鼠并通过坐骨神经切片上的SCG3免疫染色分析了10 dpi下的再生程度。有趣的是，虽然RPS6p+/p+和 RPS6p-/p-小鼠在坐骨神经中再生的轴突数量相同，我们发现来自RPS6的轴突p-/p-生长明显减少（图2F-2H）。这一结果表明，RPS6磷酸化参与了再生PNS轴突的长距离生长。
为了更好地评估p-S6的贡献Ser235-236和 p-S6Ser240-244-247在预处理效应和坐骨神经再生中，我们产生了特定的磷结构。在RPS6中Ser235D-236D构建体Ser240，Ser244和Ser247已被丙氨酸（不可磷酸化）取代，Ser235-Ser236被天冬氨酸（D）取代，以模拟组成性磷酸化。对于 RPS6Ser240D-244D-247D、Ser235 和 Ser236 已被丙氨酸（不可磷酸化）取代，Ser240、Ser244 和 Ser247 被天冬氨酸 （D） 取代，以模拟组成型磷酸化。我们通过从转染这些质粒的N2A细胞中进行细胞质核糖体纯化来验证它们在核糖体中的掺入（S3A和S3B图）。两种构建体均表达并掺入核糖体中。
我们从这些构建体中生成AAV8病毒，并将其鞘内注射到WT小鼠中（S3C-S3F图）。我们发现 RPS6Ser240D-244D-2447D对幼稚DRG神经元的形态没有影响。相反，RPS6的过表达Ser235D-236D模拟预处理效应，神经元呈现长神经突和很少的分支（S3C-S3F图）。同时，我们测试了它们对WT小鼠坐骨神经再生的影响。虽然 p-S6Ser240D-244D-2447D仅表现出轻微的效果，RPS6Ser235D-236D显著增强远距离轴突再生（S3G和S3H图）。然而，对于再生指数（RI50），我们没有看到任何统计学上的显着差异（S3I图）。
我们在RPS6上进行了相同的实验。p-/p-小鼠（图2I-2O和S3J-S3M）。RPS6Ser240D-244D-247D无法拯救 RPS6p-/p-表现型。相比之下，RPS6Ser235D-236D拯救RPS6p-/p-通过恢复预处理效果表型的表型（图2I-2L）。此外，RPS6的过表达Ser235D-236D增强坐骨神经再生 RPS6p-/p-小鼠（图2M-2O）。
总之，我们的结果表明，RPS6在Ser235-236上的磷酸化是预处理效应和轴突再生的主要效应。Ser240-244磷酸化可能在这些神经元的生理学中发挥作用，并对轴突再生过程有适度的贡献。
RPS6磷酸化和预处理效应不受mTOR途径控制
RPS6磷酸化通常用作mTOR通路激活的读数，特别是在神经系统再生期间[3，8]。由于RPS6磷酸化是预处理效应和坐骨神经再生的关键，我们询问哪种信号通路控制其在DRG中的磷酸化。为此，我们使用了药理学方法。我们对野生型小鼠进行了单侧坐骨神经挤压，3天后，我们分离了DRG神经元以将其放入培养物中。我们使用环己酰亚胺作为翻译的全局抑制剂，雷帕霉素和Torin1作为mTOR抑制剂，PF-4708671作为S6激酶抑制剂，BRD7389作为p90 RSK抑制剂（S4A图），DMSO作为对照[29]。铺板后16小时，我们用感兴趣的药物处理培养物，然后在3小时后评估神经突生长。我们发现环己胺介导的全局翻译抑制完全阻断神经突生长，无论是在幼稚还是在预处理的DRG培养物中（图3A-4C和S4B-S<>D）。这一结果表明，蛋白质翻译是幼稚和预处理培养物中神经突生长的关键。
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图3. RSK控制成熟DRG神经元的预处理效应。
（A）用DMSO（对照），翻译抑制剂（环己胺，2nM），mTOR抑制剂（Torin1，5nM或雷帕霉素，0.1nM），S6K1抑制剂（PF-4708671-8uM）处理的成熟DRG神经元预处理培养物的代表性显微照片。比例尺：250 μm。（B）铺板后16小时每个神经元最长神经突长度的定量（平均±SEM，双向方差分析，3-4个独立的DRG培养物，每个培养物每个条件计数约50-100个细胞（环己胺除外））。（C）电镀后16小时生长神经突的神经元的百分比（平均±SEM，双向方差分析，每个条件量化的10个随机显微镜场）。（D）用DMSO（对照）或RSK抑制剂（BRD-7389（3μm））处理的成熟DRG神经元的幼稚和预处理培养物的代表性显微照片。比例尺：250 μm。（E）在幼稚条件下铺板后16小时量化每个神经元最长的神经突长度（平均±SEM，双向方差分析，3个独立的DRG培养物，每个培养条件在DMSO条件下每个培养物计数约50-100个细胞;在BRD7389条件下定量所有发现的神经元）。（F）在用DMSO或BRD16处理的朴素DRG中接种7389小时后生长神经突的神经元百分比（平均±SEM，配对t检验，每个条件量化10个随机显微镜场）。（G）在用DMSO或BRD16处理的PC DRG中铺板后7389小时最长的神经突长度的定量（平均±SEM，双向方差分析，DMSO条件每个培养物每个条件约50-100个细胞;所有生长神经突的神经元在BRD7389条件下定量）。（H）. 在用DMSO或BRD16处理的朴素DRG中接种7389小时后生长神经突的神经元百分比（平均± SEM，配对t检验，5个独立的DRG培养物，10个随机显微镜场按条件量化）。???p < 0.001， ??p < 0.01， ?p < 0.05.原始数据可在支持信息（S1 数据）中找到。DRG，背根神经节;mTOR，哺乳动物雷帕霉素靶标;PC，预先确定。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002044.g003
Interestingly, in naive conditions, inhibition of mTOR or S1 kinase did not prevent neurite outgrowth (S4B–S4D Fig). We found no difference in the length of the longest neurite nor in the total number of neurons that grow a neurite between control and mTOR inhibition (Torin1, Rapamycin) treatments (S4C and S4D Fig). Inhibition of S6K with PF-4708671 caused a slight increase of the number of neurons that grow a neurite (6.7% ± 1.6% for DMSO versus 9.0% ± 1.2% for PF-4708671) (S4C and S4D Fig). In preconditioned DRG cultures, mTOR inhibition via Torin1 has a mild effect on the extent of growth (691 ± 58 μm for DMSO versus 594 ± 4 μm for Torin1) (Fig 3A–3C). Unlike Torin1, Rapamycin-treated DRG have fewer growing neurites (35.6% ± 2.6% for DMSO versus 25.8% ± 1.9% for Rapamycin) (Fig 3A–3C). When preconditioned neurons are treated with S6K inhibitor, a slight increase of the longest neurite length is observed (610 μm ± 15 for DMSO versus 694 μm ± 13 for PF-4708671) but the total number of neurons growing a neurite is unchanged (Fig 3A–3C). Altogether, our results show that mTOR nor its downstream effector S6K1 are the main actors of the preconditioning effect.
引人注目的是，BRD7389对RSK家族的抑制完全阻断了神经突生长，无论是在幼稚的DRG培养物中还是在预处理的DRG培养物中（图3D-3H）。我们验证了这种效应不是由于药物毒性，因为DMSO和BRD1治疗之间的Tuj7389阳性细胞数量相似。这一结果表明，RSK是参与预处理效应的激酶家族。
RSK2 表达受坐骨神经损伤调节并控制 DRG 神经元中的 RPS6 磷酸化
由于BRD7389治疗显示出对神经元生长的显着影响，我们接下来评估了RSK家族成员在成人DRG中的表达。在小鼠中，RSK家族由4种具有高同源性的亚型组成，特别是在2个激酶结构域（S5A和S5B图）。因此，我们设计了针对每种亚型（RSK1至4）的独特和特定区域的特定RNA探针（S5C图和S1表）。我们验证了这些mRNA探针在成人脑切片上的RSK1至3的特异性，我们在海马体中发现了预期的标记[30]。由于RSK4在成人组织中的表达较弱，我们对E12，5胚胎的矢状切片进行了原位杂交。我们发现RSK4在肋原基中特异性表达，如[31]（S5D图）所述。我们对6周龄野生型小鼠的成年DRG冷冻切片进行了原位杂交（S5E图）。我们发现RSK 2和3在完整条件下富含DRG，而RSK1表达低且RSK4不表达（S5F图）。
然后，我们研究了RSK1-4的表达是否受到轴突损伤的调节。为此，我们在坐骨神经挤压后的不同时间点收集了DRG（S5E图）。我们发现RSK4即使在受伤后也不会在DRG中表达（S5F图）。正如Mao及其同事所报道的那样，RSK1在少数神经元中略有上调[27]。RSK3 mRNA表达不受损伤调节（S5F图）。相比之下，RSK2 在 1 dpi 和 3 dpi 时被坐骨神经损伤特异性上调，然后在 7 dpi 时降低到对照（完整）水平。因此，我们将其余的研究重点放在RSK2上。
然后，我们试图确定坐骨神经损伤时DRG中RSK2蛋白表达的动力学（图4A）。通过蛋白质印迹（图4B和4C）和免疫染色（图4D和4E），使用特异性抗RSK2抗体，我们发现RSK2表达在1 dpi和3 dpi下显着增加。在 7 dpi 时，其表达减少回控制（完整）水平。重要的是，RSK2表达动力学（图4B-4E）与坐骨神经损伤时磷酸化的RPS6动力学相匹配（图1C-1D和1G-1H）。该结果支持了RSK2参与RPS6磷酸化和控制预处理效应的假设。
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图4. RSK2调节成熟DRG中的RPS6 Ser235-236磷酸化。
（一）实验工作流程。（B）蛋白质印迹显示坐骨神经损伤时RSK2表达的上调。（C）B的定量（平均±SEM，单样本t检验，每组N = 5只动物）。（D） 来自完整、1 dpi、3 dpi 或 7 dpi 条件下的 DRG 切片的代表性图像，标有反 RSK2（洋红色）和反 Tuj1（灰色）。比例尺：50 μm。（E）D的定量（单因子方差分析，邓恩多重比较检验，每组N = 5只动物）。（F）研究体内RSK2在RPS6磷酸化中的作用的实验程序时间表。（G）通过shCtrl或shRSK2标记有反RSK2（绿色）和反RFP（洋红色）的受感染DRG的代表性图像。比例尺：50 μm。（H）G的定量（平均±SEM，未配对t检验，每组N = 3-4只动物）。（I）蛋白质印迹显示，在幼稚DRG中RSK2的体内过表达诱导Ser6-235上的RPS236磷酸化，而不会造成坐骨神经损伤。（J）I的定量（平均±SEM，单样本t检验，每组N = 3-4只动物）。（K）蛋白质印迹显示，坐骨神经损伤后2天，在预处理DRG中体内抑制RSK3，抑制Ser6-235上的RPS236磷酸化。（L）K的定量（平均±SEM，单样本t检验，每组N = 3-4只动物）。???p < 0.001， ??p < 0.01， ?p < 0.05， ns： 不显著。原始数据可在支持信息（S1 数据和 S1 原始映像）中找到。DPI，受伤后天数;DRG，背根神经节;RPS6，核糖体蛋白S6。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002044.g004
为了研究RSK6对RPS2磷酸化的调节，我们生成了AAV病毒载体，其（i）过表达RSK2;或（ii）使用基于shRNA的沉默方法（shRSK2）敲低RSK2表达（S6A图）。我们通过在2周龄野生型小鼠中鞘内注射AAV8-shRSK2或AAV8-RSK2来调节DRG体内RSK4表达（图4F-4H和S6F和S6G）。DRG中RSK2的体内过表达显著增强p-S6Ser235-236在幼稚条件下（图4I和4J），在6 dpi下观察到的RPS3磷酸化水平相同（图1）。
对于沉默方法，我们首先通过将其与N2A细胞中过表达RSK1，RSK2，RSK3或RSK4的质粒共转染来验证shRSK2的特异性（S6B-S6E图）。蛋白质印迹分析证实shRSK2仅抑制RSK2表达（S6B–S6E图）。鞘内注射AAV8-shRSK2三周后，95%的DRG感染了病毒（S6F和S6G图），RSK2表达降低了50%（图4G和4H）。引人注目的是，RSK2敲低阻断了Ser6-235上RPS236的磷酸化，通常由坐骨神经损伤诱导（图4K和4L）。总之，我们的研究结果强调RSK2是控制坐骨神经损伤时DRG中Ser6-235上RPS236磷酸化的主要激酶。
RSK2控制预处理效果和坐骨神经再生
接下来，我们询问RSK2是否参与了预处理效应。为此，我们通过鞘内注射AAV2载体调节RSK8在体内的表达，并分析了培养物中幼稚和预处理DRG的神经突生长（S7A图）。引人注目的是，RSK2在体内的过表达导致幼稚DRG生长明显更长的神经突，分支更少，这种表型与预处理效应相同（图5A-5D）。我们发现这种效应是RSK2特有的，因为RSK3在朴素DRG中的过表达不能模仿预处理效应（S7B-S7E图）。相反，RSK2在体内表达的抑制导致坐骨神经损伤侧DRG预处理作用的丧失。事实上，在没有RSK2的情况下，预处理的DRG神经元类似于幼稚的神经元，具有更短，高度分支的神经突（图5H-5K）。
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Fig 5. RSK2 controls the preconditioning effect and axon regeneration in the PNS.
（A）DRG解离培养物的代表性显微照片显示RSK2在幼稚培养物中的过表达表型预处理效应。比例尺：250 μm。（B–D）A.（B）电镀后16小时每个神经元的最长神经突长度（平均±SEM，普通单因素方差分析，3个独立的DRG培养物，每个培养物每个条件计数约50-100个细胞）。（C） 2 个分支之间的平均距离（平均 ± SEM、普通单因子方差分析、3 个独立的 DRG 培养物、每个培养物每个条件计数约 50 个细胞）和 （D） 接种后 16 小时生长神经突的神经元百分比（平均 ± SEM，双向方差分析 Tukey 多重比较测试，每个培养物每个条件量化 10 个随机显微镜场）。（E）小鼠鞘内注射AAV3-PLAP（对照）或AAV8-RSK8的小鼠损伤后2天坐骨神经切片的代表性图像。再生轴突用抗SCG10抗体（白色）标记。红色虚线表示受伤部位。比例尺：500 μm。（F）E再生轴突的定量（平均±SEM，多次t检验，每种条件至少6只动物）。（G）3 dpi下的再生指数（平均±SEM，未配对t检验，每个条件至少5只动物）。（H）DRG解离培养物的代表性显微照片显示，预处理培养物中的RSK2抑制表型为幼稚条件。比例尺：250 μm。（I-K）G.（I）铺板后16小时每个神经元的最长神经突长度（平均±SEM，普通单向方差分析，3个独立的DRG培养物，每个培养物每个条件计数约50-100个细胞）。（J） 2 个分支之间的平均距离（平均 ± SEM、普通单因子方差分析、3 个独立的 DRG 培养物、每个培养物每个条件计数约 50 个细胞）和 （K） 铺板后 16 小时生长神经突的神经元百分比（平均 ± SEM，双向方差分析 Tukey 多重比较测试，每个条件量化 10 个随机显微镜场）。（L）受伤后3天用AAV-Sh-Scrambled或AAV-Sh-RSK2注射小鼠的坐骨神经切片的代表性图像。再生轴突用抗SCG10抗体（白色）标记。红色虚线表示受伤部位。（M）L再生轴突的定量（平均±SEM，多次t检验，每种条件至少6只动物）。（N）3 dpi下的再生指数（平均±SEM，未配对t检验，每种条件至少6只动物）。（O）DRG解离培养物的代表性显微照片显示PTEN中的RSK2抑制删除了预处理培养物的表型。比例尺：250 μm。（P–R）O.（P）电镀后16小时每个神经元的最长神经突长度的定量（平均±SEM，普通单向方差分析，3个独立的DRG培养物，每个培养物每个条件计数约50-100个细胞）。（Q） 2 个分支之间的平均距离（平均 ± SEM、普通单因子方差分析、3 个独立的 DRG 培养物、每个培养物每个条件约 50 个计数细胞）和 （R） 电镀后 16 小时生长神经突的神经元百分比（平均 ± SEM，双向方差分析 Tukey 多重比较测试，每个条件量化 10 个随机显微镜场）。（S）PTEN中鞘内注射AAV3-Sh-Scrambled或AAV8-Sh-RSK8和AAV2-CRE的小鼠受伤后8天坐骨神经切片的代表性图像佛罗里达州/佛罗里达州小 鼠。再生轴突用抗SCG10抗体（白色）标记。红色虚线表示受伤部位。（T）S再生轴突的定量（平均±SEM，多次t检验，每种条件至少6只动物）。（U）3 dpi下的再生指数（平均± SEM，未配对t检验，每个条件至少5只动物）。???p < 0.001， ??p < 0.01， ?p < 0.05， ns： 不显著。原始数据可在支持信息（S1 数据）中找到。DRG，背根神经节;PNS，周围神经系统。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002044.g005
同时，我们分析了体内坐骨神经的再生。我们在2周龄的动物中鞘内注射AAV-RSK2，AAV-shRNA-RSK4或相应的对照，并在3周后进行单侧坐骨神经挤压（S7A图）。通过10 dpi的SCG3免疫染色分析轴突再生的程度。与对DRG培养的影响类似，我们发现RSK2过表达增强了坐骨神经再生（图5E-5G），轴突从病变部位延伸至5毫米。这种效应是RSK2特有的，因为RSK3的过表达不影响坐骨神经再生（S7F-S7H图）。相反，RSK2抑制阻断坐骨神经中的轴突再生（图5L-5N）。总之，我们的结果表明RSK2对周围神经再生至关重要。
为了证明mTOR和RSK2对预处理效应独立起作用，我们通过在PTEN中鞘内注射AAV-Cre来激活mTOR途径楼/楼小鼠删除PTEN[3]。我们通过在报告小鼠系STOP-tdTomato中鞘内注射AAV8-Cre和AAV-GFP的混合物来验证多种AAV感染和AAV8-Cre诱导重组的效率楼/楼 (S7I 和 S7J 图）。我们发现几乎100%的神经元在注射后2周表达tdTomato，并且这些DRG中有94%同时感染了AAV-Cre和AAV-GFP（S7I和S7J图）。正如预期的那样，幼稚DRG神经元中的mTOR激活不会诱导预处理效应（图5O-5R）。然后，我们分析了RSK2抑制和mTOR激活在预处理DRG神经元中的轴突生长结果。我们观察到mTOR激活不会改变预条件效应。相反，抑制PTEN缺失神经元中的RSK2会阻断预处理效应：神经元生长较短且高度分支的神经突，就像在没有预处理的对照条件下一样（图5O-5R）。同时，我们分析了这些小鼠坐骨神经的轴突再生。我们发现PTEN缺失并不能显着改善坐骨神经再生，即使观察到再生指数的趋势（S7K-S7M图）。当AAV8-Sh-RSK2和AAV-Cre被注射到PTEN中时楼/楼小鼠，我们发现mTOR途径激活不能抵消RSK2敲低诱导的轴突再生抑制（图5S-5U）。
总之，我们的结果表明，RSK2独立于mTOR控制预处理效果和PNS再生。
RSK2 通过 RPS6 磷酸化控制预处理效果
结果表明，RSK2调控RPS6磷酸化。此外，RSK2和p-RPS6对于预处理效果都是不可或缺的（图2和5）。因此，我们询问RSK2是否通过RPS6磷酸化调节预处理效果。为此，我们通过鞘内注射AAV2-RSK6或在RPS1中对照，在不可磷酸化的RPS8突变小鼠系（S2A图）的DRG中过表达RSK6p+/p+和 RPS6p-/p-4周龄小鼠。三周后，我们进行了单侧坐骨神经损伤。我们首先分析了3 dpi的DRG培养物。正如预期的那样，在天真的RPS6中p+/p+DRG条件下，RSK2过表达诱导预处理效应样表型（图6A-6D）。相反，朴素 RPS2 中的 RSK6 过表达p-/p-DRG不会导致预处理效应：神经突短且高度分支，作为幼稚对照培养物（图6A-6D）。非常有趣的是，在预处理的RPS6p-/p-DRG培养，RSK2过表达对神经元没有影响，因为它们保持其幼稚表型（图6A-6D）。结果表明，RSK2介导的预处理效应控制取决于RPS6磷酸化。同时，对受伤坐骨神经再生的分析表明，与RPS6p+/p+小鼠，RSK2在RPS6中的过表达p-/p-小鼠完全关闭轴突再生（图6E-6G）。总之，我们的结果表明，RSK2-RPS6轴对预处理效果和周围神经系统再生至关重要。
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图6. RSK2需要可磷酸化的RPS6来诱导PNS中的预处理效应和轴突再生。
（A） DRG 解离培养物的代表性显微照片显示 RSK2 过表达表型复制了 RPS6 幼稚培养物中的预处理效应p+/p+小鼠，但不是来自RPS6p-/p-文化。比例尺：250 μm。（B–D）A.（B）电镀后16小时每个神经元的最长神经突长度（平均±SEM，普通单因子方差分析，3个独立的DRG培养物，每个培养物每个条件约50个计数细胞）。（C）2个分支之间的平均距离（平均±SEM，普通单因子方差分析，3个独立的DRG培养物，每个培养物每个条件计数约50个细胞）。（D）电镀后16小时生长神经突的神经元百分比（平均±SEM，单因子方差分析，每个条件量化的10个随机显微镜场）。（E） RPS3 损伤后 6 天坐骨神经切片的代表性共聚焦图像p+/p+或 RPS6p-/p-小鼠鞘内注射AAV8-RSK2。再生轴突用抗SCG10抗体（白色）标记。红色虚线表示受伤部位。比例尺：500毫米。 （F） E再生轴突的定量（平均±SEM，多次t检验，每种条件至少3只动物）（?，??，???：RPS8中AAV6-Ctrl组之间的比较p+/p+小鼠和AAV8-RSK2 RPS6p+/p+小 鼠;#, ##;###：RPS8中AAV2-RSK6组之间的比较p+/p+RPS8中的小鼠和AAV2-RSK6p-/p-小鼠）。（G）3 dpi下的再生指数（平均±SEM，未配对t检验，每种条件至少3只动物）。???p < 0.001， ??p < 0.01， ?p < 0.05;###p < 0.001， ##p < 0.01;#p < 0.05，ns：不显著。原始数据可在支持信息（S1 数据）中找到。DRG，背根神经节;PNS，周围神经系统;RPS6，核糖体蛋白S6。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002044.g006
RSK2控制脊髓再生和功能恢复
由于RSK2 / RPS6轴控制预处理效果，然后我们询问它是否也控制CNS再生。为了解决这个问题，我们专注于形成脊髓背柱的感觉轴突。此捆绑包包含 DRG 的中央分支。与所有CNS轴突一样，这些中枢神经系统轴突在脊髓损伤后无法自发再生[22，23]。有趣的是，坐骨神经的既往病变（预处理范式）促进了脊髓轴突再生[22]。由于RSK2通过RPS6磷酸化控制预处理效应，我们询问RSK2过表达是否足以诱导脊髓轴突再生。因此，我们在8周龄野生型小鼠中鞘内注射AAV2-RSK8或AAV4对照。两周后，我们进行了背柱挤压伤（S8A图）。对于每个样本，宫颈切片分析证实病变是完整的（S8B图）。在对照条件下，轴突到达病变边界，在损伤部位观察到的轴突很少。没有发现轴突穿过病变区域（图7A-7C）。当RSK2在DRG中过度表达时（没有预处理范式），轴突不仅进入病变部位，而且还穿过它并生长到损伤部位之外。这种表型在损伤后6周观察到，并在损伤后8周加剧（图7B-7D）。
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图 7. RSK2诱导背柱再生，并伴有功能性感觉恢复。
（A）用AAV-Ctrl或AAV-RSK6注射鞘内注射的小鼠背柱挤压后2周胸椎脊髓矢状面切片的代表性共聚焦图像。再生轴突用抗CTB抗体（白色）标记。橙色箭头表示轴突再生的方向。（B）用AAV8-Ctrl或AAV8-RSK8注射的小鼠背柱挤压后2周胸脊髓矢状面的代表性共聚焦图像。再生轴突用抗CTB抗体（白色）标记。橙色箭头表示轴突再生的方向。（C）从A的挤压部位尾部的轴突再生和枯死的定量（平均±SEM，曼-惠特尼检验，N = 每种条件至少6只动物）。（D）B压碎部位尾部结核轴突再生和枯死的量化（平均±SEM，曼-惠特尼检验，N = 每种条件至少4只动物）。（东、女）鞘内注射AAV8-Ctrl或AAV8-RSK2的小鼠的胶带接触和去除试验，背柱挤压前2周和后6周（平均± SEM，双向方差分析，N = 每组至少11只动物，NS =不显着）。（G）Von Frey实验，以测试在背柱挤压前8周和背柱压碎后8周鞘内注射AAV2-Ctrl或AAV2-RSK6的小鼠的伤害感受;刺激强度以克为单位显示（平均±SEM，多次t检验，N = 每组至少11只动物;每个爪子被独立考虑）。（H）坐骨神经损伤后15天小鼠无毛皮肤的矢状截面。与对照组相比，RSK2的过表达强烈增加表皮内神经丝的密度。（I）每毫米表皮内神经丝染色的定量（比例尺：100μm）。再生纤维用白色的抗PGP 9.5（神经丝）抗体标记，用蓝色的DAPI标记细胞核（平均±SEM，未配对t检验，4只动物）。（J） 多荧光正交 3D 共聚焦图像，显示背柱损伤后 1 周脊髓矢状面损伤部位下方 （L1-4） 的 vGlut6 阳性体神经元（绿色）和 ChAT 阳性运动神经元（洋红色）之间的并置。比例尺：10 μm。（K）J的定量（平均±SEM，未配对t检验，4只动物至少10个运动神经元定量）。（L） 多荧光正交 3D 共聚焦图像显示背柱损伤后 1 周脊髓矢状面损伤部位下方 vGat1 阳性 bouton（绿色）和 ChAT 阳性运动神经元（洋红色）（L4-6）之间的并置。比例尺：10 μm。（M）L的定量（平均±SEM，未配对t检验，4只动物至少有10个运动神经元定量）。（N） RPS6 坐骨神经损伤和背柱挤压后 6 周胸椎矢状面的代表性共聚焦图像p+/p+ or RPS6p-/p- mice. Regenerative axons are labeled with anti-CTB antibody (white). In RPS6p-/p mice, the preconditioning effect is inhibited in the spinal cord. (O) Representative confocal images of thoracic spinal cord sagittal sections 6 weeks after dorsal column crush from RPS6p+/p+ or RPS6p-/p- mice intrathecally injected with AAV-RSK2. In RPS6p-/p- mice, RSK2 overexpression fails to induce dorsal column regeneration in contrast to RPS6p+/p+ mice. (P) Quantification of axon regeneration and dieback from caudal marge of crush site from N (mean ± SEM, Mann–Whitney test, N = at least 4 animals per condition). (Q) Quantification of axon regeneration and dieback from caudal marge of crush site from O (mean ± SEM, Mann–Whitney test, N = at least 4 animals per condition). Raw data can be found in Supporting information (S1 Data). CTB, cholera toxin B; RPS6, ribosomal protein S6; vGAT, vesicular gamma aminobutyric acid transporter; Vglut1, vesicular glutamate transporter 1.
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002044.g007
We next assessed whether this regeneration can sustain functional recovery. To this end, we performed 2 behavioral assays to study sensitive function recovery: the tape contact and removal test (where first contact and total time for removal sticky paper was measured) and the Von Frey filament test. In the tape contact and removal test, we did not see any difference between control and RSK2 overexpression groups (Fig 7E and 7F). Interestingly, the Von Frey test revealed that mice overexpressing RSK2 have better functional recovery (Fig 7G). Indeed, immediately after dorsal column injury, we observed a loss of sensitivity in both groups. While this loss of sensory function was maintained in the control group throughout the whole experiment, the RSK2 overexpression group recovered sensitivity from 28 days after injury (Fig 7G). Together, our histological and behavioral analyses show that the RSK2 up-regulation induces CNS axon regeneration and functional recovery. We then addressed the underlying mechanisms of this functional recovery. We analyzed hindlimb paw skin innervation in control and upon RSK2 overexpression, 2 weeks after sciatic nerve injury (Fig 7H and 7I) as described in [32]. We found that overexpression of RSK2 promotes significantly skin innervation compared to control. Moreover, we found that RSK2 overexpression increases the number of vesicular glutamate transporter 1 (Vglut1) and vesicular gamma aminobutyric acid transporter (vGAT) positive boutons, respectively, excitatory and putative inhibitory synapses apposed to motoneurons labeled with ChAT (choline acetyl transferase) on the lumber spinal cord (Fig 7J–7M). These results suggest spinal circuit reorganization and synaptic plasticity between motoneurons and the propriospinal neurons. These results are in accordance with previously described mechanisms [33,34]. Altogether, our results show that RSK2 promotes functional recovery through enhanced axon regeneration and spinal cord plasticity.
To confirm these findings, we tested the effect of RSK2 inhibition on CNS regeneration after preconditioning. In this experiment, 4-week-old wild-type animals received an intrathecal injection of AAV8-ShRSK2 or control. Two weeks later, we performed unilateral sciatic nerve injury and the next day, we performed dorsal column crush injury. One week before sacrifice, we injected Alexa555-conjugated CTB into the sciatic nerve, upstream to the injury site (medial to the spinal cord), in order to assess dorsal column regeneration (S8A Fig). For each sample, analysis of cervical sections confirmed that the lesion was complete (S8B Fig). In control mice, regenerating axons reach the lesion site and some axons are able to cross it, as previously reported [22] (S8C and S8D Fig). When RSK2 is knocked down in DRG, despite the preconditioning paradigm, we observed a massive retraction of the axon bundle from the lesion site. No axon could reach the injury site (S8C and S8D Fig). In order to assess the effect of RSK2 inhibition on sensory functional recovery, we performed the same behavioral tests as described above. In both Von Frey test and the tape contact and removal test, inhibition of RSK2 significantly impairs functional recovery induced by the preconditioning (S8E and S8F Fig).
最后，我们评估了不可磷酸化的RPS6突变小鼠系和6周龄RPS6p+/p+和 RPS6p-/p-小鼠接受单侧坐骨神经损伤和1天后，背柱挤压损伤。在处死前一周，我们将Alexa555结合的CTB注射到坐骨神经中，以评估背柱再生。仅分析具有完整病变的动物，如在宫颈水平上验证的那样（S8B图）。在脊髓损伤后6周分析再生。正如预期的那样，在 RPS6 中p+/p+小鼠，坐骨神经的预处理病变诱导背柱再生。在 RPS6 中p-/p-另一方面，小鼠的这种再生效应被完全消除（图7N-7P）。这进一步证实了RPS6磷酸化对于触发背柱轴突再生至关重要。如图7A-7C所示，RSK2过表达足以诱导背柱再生，而无需先前的坐骨神经损伤。为了解决RSK2-RPS6轴对CNS再生的贡献，我们在RPS2中过度表达了RSK6p+/p+和 RPS6p-/p-小 鼠。我们执行了与图7A相同的实验工作流程。结果表明，RSK2过表达的再生效应在RPS6中被阻断p-/p-小鼠（图7O和7Q）。
总之，我们的结果表明，RSK2 / RSP6轴是脊髓中感觉轴突再生，突触可塑性和靶神经支配所必需的，从而导致功能恢复。
讨论
目前缺乏针对中枢神经系统再生的有效疗法仍然是一个重大挑战。尽管过去15年在调节内在再生能力方面取得了显著进展[1，8，9，35]，但尚未实现完全功能恢复。mTOR迅速成为触发CNS再生的关键途径[3，4]。然而，不仅mTOR导致轴突再生的确切机制仍然难以捉摸，而且其主要效应物之一磷酸化RPS6的确切贡献也是未知的。此外，在PNS再生和预处理效应期间，mTOR的贡献不大，这也取决于用于评估其功能的实验设计[13，16，17]。这些观察结果表明，这些过程中可能涉及其他途径。
在我们的研究中，我们证明了RPS6磷酸化，特别是丝氨酸235-236上的磷酸化对于PNS和CNS再生至关重要。我们表明RPS6磷酸化是由坐骨神经损伤诱导的，并且是预处理效果所必需的。此外，我们证明这种磷酸化不是由mTOR控制，而是由p90S6激酶RSK2控制。此外，RSK2促进脊髓中DRG轴突中枢分支的再生，皮肤神经支配，突触可塑性和相关的功能恢复。总之，我们的工作阐明了RPS6磷酸化的关键作用以及RSK2翻译后调控的重要性。
RPS6磷酸化增加与CNS和PNS再生能力增强相关[3，36]。值得注意的是，RPS6在发育和衰老过程中神经元磷酸化减少，这与再生能力下降有关[3，32]。在属于CNS的成熟视网膜中，高水平的内源性RPS6磷酸化与更好的恢复力和再生潜力有关[10，37]。其他神经元如DRG神经元表达内源性磷酸化的RPS6，在坐骨神经损伤时进一步增加。我们的结果表明，即使在DRG中，神经元亚群也调节差异性的RPS6磷酸化。对于某些神经元，例如 TrkB 机械敏感神经元，轴突病变会导致 RPS6 磷酸化增加，但在其他神经元（例如瘙痒感应 Somatotstatin 神经元）中则不然。有趣的是，所有这些亚群在受伤后都会再生他们的轴突。这些结果表明，磷酸化RPS6的基础内源水平是轴突再生阳性结果的指标。令人惊讶的是，很少有研究解决RPS6翻译后修饰（特别是磷酸化）在轴突再生中的作用。++
RPS6 is a ribosomal protein (RP) that belongs to the 40S subunit of the ribosome. It is one of the best studied RPs. Indeed RPS6 is the first RP for which inducible posttranslational modification has been reported upon liver injury [20]. The role of RPs during regulation of protein synthesis is still under debate. If we long thought that RPs were mostly required to ensure the structural integrity of the ribosome, several pieces of evidence tend to demonstrate that RPs directly control protein synthesis. Indeed, RPS6 phosphorylation has been proposed to regulate global protein synthesis, with a direct impact on translation initiation and elongation [28,38,39].
Interestingly, RPS6 phosphorylation has been shown to be important for ribosome biogenesis [40]. In particular, RPS6 is involved in the transcriptional regulation of Ribosome Biogenesis (RiBi) factors involved in pre-rRNA synthesis, cleavage, posttranscriptional modifications, ribosome assembly, and export. Therefore, one can hypothesize that increase of RPS6 phosphorylation promotes ribosome biogenesis and subsequent enrichment of the pool of ribosomes in cells. Axon regeneration requires extensive protein synthesis to generate all the building blocks to sustain axon growth, as illustrated by the level of global protein synthesis that is decreased in neurons upon axon injury [3]. Thus, increasing the number of ribosomes may help to sustain high levels of protein synthesis to support axon regeneration.
此外，Bohlen及其同事已经证明，RPS6磷酸化水平根据其编码序列（CDS）的长度差异地影响mRNA翻译[41]。当核糖体翻译mRNA时，RPS6逐渐去磷酸化。因此，具有短CDS的mRNA被磷酸化的RPS6积极翻译。有趣的是，许多参与轴突再生的基因具有短CDS，可以优先由具有磷酸化RPS6的核糖体翻译[41]，例如ATF3[42]（ATF3_MOUSE 181 aa），KLF家族[43]（KLF7_MOUSE 301 aa），Rheb [35]（RHEB_MOUSE 184 aa），或与线粒体功能有关的基因[44（PPARG_MOUSE 505AA、UCP2_MOUSE 309 AA、ARMX1_MOUSE 456 AA）。基于这些观察结果，RPS6磷酸化可能通过促进促再生mRNA的翻译来引发神经元再生。
我们表明RSK2控制RPS6磷酸化，进而控制CNS和PNS中的预处理效应和轴突再生。RSK 在 MAPK 通路下游起作用，因为它被 ERK1/2 激活。RSK 家族与 MSK（丝裂原和应激激活激酶 - MSK1 和 2）家族密切相关。然而，它们的生理功能是不同的[45]。RSK 有 2 个激酶结构域。N端激酶结构域是一种AGC家族激酶，与S57K6激酶结构域共享1%的氨基酸。C端激酶结构域与CAM-K激酶家族有关。因此，尽管可能与S6K1共享底物，但RSK可能具有特定的靶标。RSK促进Ser6-235上RPS236的磷酸化，进而促进翻译复合物的组装。这一过程与CAP依赖性翻译的增加相关，与mTOR途径无关[46]。我们的结果表明，RSK2 / RPS6磷酸化控制再生独立于mTOR活化。事实上，这表明mTOR和RSK2将具有不同的再生结果，可能取决于神经元亚群。重要的是，在DRG中，mTOR和RSK通路不是冗余的，它们不会相互补偿。
在这项研究中，我们专注于RSK-RPS6轴，但已知RSK会磷酸化其他几种可能参与轴突再生的底物。例如，RSK2控制c-fos[47]和CREB[48]的转录调控，它们都参与轴突再生[49]。RSK2在细胞生长过程中也很重要，基于其对GSK3β磷酸化的调节，已被描述为促进CNS再生[50，51]。最后，RSK2正向调节细胞存活[52]。由于神经元存活是损伤反应结果的关键，RSK2 可能与坐骨神经损伤后观察到的神经保护有关。总之，对DRG神经元和CNS神经元中RSK2的不同磷酸化靶标进行更大规模的分析，将使我们能够更深入地了解RSK2依赖性再生的精确机制。
有趣的是，Mao及其同事的一项研究也发现RSK家族是PNS和CNS再生的关键效应物[27]。他们发现RSK1有助于坐骨神经再生。从机制上讲，作者描述了伸长因子eEF2的过表达挽救了RSK1抑制在体外和体内的作用。他们表明，eEF2控制促再生mRNA的翻译，如BDNF或IGF，这些mRNA在很大程度上被描述为调节轴突再生和神经保护[10，53]。这两种分子在体外都部分挽救了RSK1的缺失。有趣的是，根据他们和我们的研究，RSK1和RSK2似乎在PNS中具有类似的促再生作用。然而，虽然这两种作用机制都基于平移控制，但模式和效应是不同的。eEF2因子是与翻译伸长率调节有关的典型平移因子。RSK1介导的eEF2激酶磷酸化促进再生所必需的翻译。Mao及其同事的工作以及我们的工作都表明，RSK家族批判性地调节翻译复合物组分的翻译后修饰，从而控制蛋白质合成和轴突再生。需要注意的是，RSK2可以磷酸化eEF2K，RSK1也可以磷酸化RPS6。破译RSK1和2是否共表达协同作用以进一步增强轴突再生将是有趣的。
Mao及其同事还通过使用视觉系统解决了RSK1在CNS再生中的作用。他们表明RGC中的RSK1过表达对再生或神经保护没有影响。这与我们的数据显示RSK2促进背柱中枢神经系统再生形成鲜明对比。有两种假设可以解释这种差异。首先，即使RSK1和2具有共同的靶标，并且通常涉及相同的生物学功能[26]，但它们也有自己特定的底物，导致每种亚型的作用特异性。其次，RSK家族功能可能存在细胞类型特异性。即使不同的CNS和PNS神经元群体之间共享大谱的神经保护和再生分子途径，神经元也具有细胞类型和亚群特异性损伤反应。对单个RGC的sc-RNAseq分析揭示了RGC固有的弹性亚群，从而说明了这一特征[54，55]。这表明每个神经元亚群都有一个内在的特定机制，影响其对压力的反应。在我们的案例中，RSK2在其他CNS再生模型中的再生效果仍有待确定。尽管如此，我们可以提出，与RGC相比，DRG对RSK活动的响应更加迅速。有趣的是，PTEN缺失诱导的mTOR激活与RSK1过表达相结合，对视神经再生产生协同作用，轴突到达视神经远端[27]。在DRG中，我们发现RSK2介导的RPS6磷酸化与mTOR无关，而在RGC中，可能需要mTOR来磷酸化RPS6，以及RSK1介导的eEF2活性控制。总之，mTOR-RSK相互作用可能完全取决于神经元类型，以控制RPS6磷酸化。
总而言之，我们的工作表明RPS6磷酸化是PNS和CNS再生过程中的关键。独立于mTOR的RSK2调控突出了该途径在再生中的作用，并为理解轴突再生和功能恢复的分子机制开辟了新的途径。
材料和方法
外科 手术
动物护理和程序根据法国格勒诺布尔神经科学研究所（法国研究部指南）和欧洲指南（指令86/609和2010/63）（APAFIS #38155-202205021448189 v5）进行。
对于鞘内注射和背柱挤压，用氯胺酮（100mg / kg）和甲苯噻嗪（10mg / kg）的混合物麻醉小鼠。坐骨神经挤压手术在3%诱导，2%维持异氟醚下进行。对于镇痛，在手术前4天和手术后1天在饮用水（2mg / ml）中给予扑热息痛。丁丙诺啡（0.05mg/kg）在背柱损伤前6 h皮下注射给药，术后每6 h给药一次，持续3 d。
动物
具有混合背景的小鼠被用作野生型动物，无论其性别如何。磷酸化死RPS6小鼠系已被描述[28]，并在混合背景下维持。将动物保持在12小时的光照/黑暗循环中，在恒定的温度和湿度（21°C;10%湿度）下随意提供食物和水。在所有实验中，显示任何后肢麻痹或任何不适迹象的小鼠从进一步的实验中去除。
AAV8病毒注射液
如前所述，将3至4周龄小鼠鞘内注射[56]，使用含有30μl以下病毒的10G针头：AAV8-PLAP（胎盘碱性磷酸酶;作为对照），AAV8-GFP（作为对照），AAV8-CRE，AAV8-RSK2，AAV8-RSK3，AAV8-shScrambleed，AAV8-shRSK2，AAV8-RPS6235D-236D或 AAV8- RPS6240D-244D-247D.病毒滴度约为 1 × 10^14 个颗粒/毫升。
对于合并感染，注射10μl病毒混合物。
坐骨神经挤压
将左坐骨神经暴露并用镊子（精细科学工具，杜蒙SS镊子）以15°角压碎45秒。坐骨神经在同一位置再次压碎5秒，以确保所有轴突均已切开。
背柱损伤
5至6周龄小鼠在暴露脊髓的T7椎骨水平上进行了椎板切除术。使用改良的细镊子（精细科学工具;杜蒙#5SF镊子;最大振幅为1毫米，用橡胶调节），将背柱以3μm的深度压碎10×700秒。
背柱逆行标记
暴露受伤的坐骨神经后，用玻璃微量移液管将3μlCTB（霍乱毒素亚基B，Alexa Fluor 555结合物-1mg / ml-赛默飞世尔）注射到病变部位的坐骨神经上部，以分析脊髓背柱再生的延伸。
成人 DRG 神经元培养、药物治疗和免疫染色
DRG培养如前所述[57]。收集来自WT的DRG或8周前接受鞘内注射AAV3的动物。简而言之，腰椎DRG（L3-L4和L5）被解剖出来并收集在冰冷的汉克平衡盐溶液（HBSS;吉布科）。将DRG组织在5%胶原酶A（罗氏）中于37°C孵育70分钟，在0.25%胰蛋白酶（Gibco）中孵育5分钟。在10%牛血清白蛋白（Sigma Aldrich）垫上纯化神经元，并接种在补充有10%B-0补充剂（Gibco）和5%L-谷氨酰胺（Gibco）的神经基础A培养基（Gibco）中的聚-L-赖氨酸（2mg / ml，Sigma Aldrich）包被的盖玻片上。将培养物保持在27°C空气中1%CO 5的加湿气氛中。
在药物治疗的情况下，用RSK抑制剂BRD1 7389μm（圣克鲁斯），mTOR抑制剂Torin3 1nM（圣克鲁斯）或雷帕霉素5.0nM（Sigma Aldrich），S1K6抑制剂PF-1 4708671μm（Sigma Aldrich）和翻译抑制剂环己酰亚胺8nM（Sigma Aldrich）处理神经元2小时。所有稀释液均在DMSO中进行。对于用药物治疗的每组，各自的对照组接受DMSO治疗。
培养16小时后，将神经元固定在PBS中的PFA 4%/蔗糖1.5%中，在0.5%Triton（Sigma Aldrich）中透化，并用一抗，抗Tuj1（1/500，Biolegend），抗pS6标记Ser235-236（Ser 235–236;1/500-Cell 信号传导技术），抗 pS6Ser240-244（Ser 240–244;1/500 细胞信号传导技术）、抗 RSK（1/500，RSK123 细胞信号传导技术）、抗 HIS （1/500;ProteinTech），抗标志（1/500，Sigma），抗V5（1/200，ProteinTech），抗PGP9.5（1/500，Proteintech），抗NeuN（1/500，Abcam），抗α-微管蛋白（1/500，赛默飞世尔）在室温和二抗Alexa-2，Alexa-488和Alexa-647（568/1-Thermo Fisher）下800小时，室温下1小时。盖玻片使用氟卡口-G封片剂和DAPI（Invitrogen）安装。
细胞转染和蛋白质提取
使用PEI（2mg / ml;阿法埃莎赛默飞世尔）具有3μg以下质粒：pAAV-vsvg-RSK3，pAAV-flag-RSK1，pAAV-v2-RSK5，pAAV-his-RSK3，pAAV-PLAP，pAAV-CMV-mCherry-U4-sgRNA_shRSK6（2′ GGACCAACTACCACAATACCA 5′），pAAV-CMV-mCherry-U3-sgRNA_shCtrl（6′GCAACAACGCCACCATAAACT 5′）。这些质粒是通过克隆pAAV-MCS表达载体和pAAV-RPS3中从小鼠小脑中提取的cDNA获得的。235D-236D;AAV8-RPS6240D-244D-247D.这些质粒是通过克隆从RPS6的大脑中提取的cDNA获得的p-/p-通过靶向诱变进行pAAV-MCS表达载体与融合克隆系统（Takara）中的小鼠和特异性点突变。转染后约96小时，使用补充有蛋白酶（罗氏）和磷酸酶抑制剂（罗氏）的RIPA（Triton 1%）缓冲液提取蛋白质。
对于DRG，使用10 mM Tris-HCl（pH 7.5）提取蛋白质;150毫米氯化钠;0.5毫米乙二胺四乙酸;1%NP-40与蛋白酶和磷酸酶抑制剂（罗氏）。DRG通过超声处理（振动细胞，VWR）进一步裂解5次，10 s。
按照制造商的说明（Pierce-Thermo Fisher）用BCA对蛋白质进行定量。
核糖体纯化
如前所述，从N2A细胞进行核糖体纯化[58]。简而言之，将细胞在含有0.7%NP-40的适当低渗缓冲液中裂解。以750g离心后，除去核部分。将细胞质级分以12，500g离心以除去线粒体级分。然后将线粒体后部分的KCl浓度调节至0.5M。最后，使用蔗糖垫以240，000g超速离心纯化核糖体。重悬核糖体沉淀，用DO估计核糖体浓度260纳米滴读数器上的RNA吸光度。
蛋白质印迹
将来自N20A细胞的约2μg蛋白质或来自DRG的10μg蛋白质加载到4%至15%SDS-聚丙烯酰胺预制凝胶（Biorad）中并转移到硝酸纤维素膜中。用丽春红染色膜以验证转印质量。然后将膜在含有5.1%吐温-0（TBST）的Tris缓冲盐水中封闭05小时，并在20°C下孵育过夜，在封闭溶液中稀释以下抗体：抗RSK1（4/2，1，细胞信号传导技术），抗RPS1（000/6，1，细胞信号技术），抗磷酸化RPS1 ser000/6（235/236，1，细胞信号传导技术）， 抗磷酸化RPS1 ser000/6（240/244，1，细胞信号技术），抗旗（1/000，1，Sigma Aldrich），Anti-HIS（2/000，1，Proteintech），反RFP（5/000，1，Abcam），抗GFP（1/000，1，Abcam），抗GAPDH（1/000，1，Proteintech），抗TOMM5（000/40，Proteintech）和抗H1（500/3，1，细胞信号技术）。然后将膜在室温下与HRP偶联的二抗（抗兔HRP，Proteintech;抗小鼠HRP，赛默飞世尔科技，抗鸡HRP Thermo Fisher Scientific）在封闭溶液中从2/000，2稀释至1/1，000）孵育1小时。使用化学（ChemiDoc MP，Biorad）使用ECL（10.000mM鲁米诺，1.5mM香豆酸，0mM Tris HCl，225.100mM过氧化氢在毫Q水中）开发膜。
组织学程序
用冰冷的PFA-4%对小鼠进行心内灌注后，将组织解剖出来，并在4°C下在2%PFA中固定坐骨神经和DRG24小时，脊髓4小时。 在30%蔗糖中冷冻保存后，使用低温恒温器切片组织：DRG和坐骨神经在12μm处切片，脊髓在20μm处切片。对于皮肤后爪，首先去除小鼠毛发，然后用冰冷的PBS在心内灌注小鼠。将后爪皮肤解剖出来，并在PBS中的PFA 24%中固定4小时。将皮肤在5%H 2 O 2 / PBS溶液中漂白过夜。在30%蔗糖中冷冻保存后，进行20μm矢状面皮肤冷冻切片。
免疫组化
将切片在封闭溶液（5%BSA，1%驴血清和0.5%Triton在DPBS中）中在室温下孵育至少1小时。然后将切片在4°C下孵育过夜，一抗稀释在封闭溶液中：抗Tuj1（1/500，Biolegend），抗RSK2（1/100，细胞信号传导技术），抗RPS6（1/100，细胞信号传导技术），抗p-RPS6Ser235-236（1/100，细胞信号传导技术），抗p-RPS6Ser240-244（1/500，细胞信号传导技术）、抗 RFP（1/500，Abcam）、抗 SCG10 （1/1、 000，Novus），抗CTB（1/500，Abcam），抗vGlut1（1/1，000，突触系统），抗vGat（1/500，突触系统），抗ChAT（1/100，默克），抗胰岛1-2（5μg/ml，DSHB），抗Advillin（1/500，Proteintech），抗TrkA（1/500，Bio-techne），抗Parvalbumine（1/200，Swant），抗TrkB（1/500，Bio-techne），抗Calbindin（1/100，Swant），抗生长抑素（1/500，Invitrogen）和抗PGP 9.5（1/500，Proteintech）。然后，将组织与适当的二抗（Alexa-Fluor偶联 - 杰克逊实验室）一起孵育，在室温下以1/500在封闭溶液中稀释2小时。载玻片使用氟安装-G封片剂和DAPI封片剂（Invitrogen）进行安装。
原位杂交
实验如Nawabi及其同事所述进行[59]。探针在从小脑中提取的cDNA的pGEMT载体中克隆：pGEM-T_RNAprobeRSK1;pGEM-T_RNAprobeRSK2;pGEM-T_RNAprobeRSK3;用于探针的pGEM-T_RNAprobeRSK4序列在S1表中进行了描述。
图像分析和量化
DRG培养物，DRG切片和坐骨神经切片使用具有2×，4×和10×物镜的尼康Ti20 Eclipse落射荧光显微镜成像。脊髓切片和后爪切片使用蜻蜓转盘显微镜（Andor Technologies）以20×或63×物镜成像。部分使用Fusion软件进行缝合，瓷砖之间有10%的重叠。用共聚焦LSM710 / Airyscan（蔡司）对运动神经元的突触接触进行成像，物镜为63×。使用Zen 3.3软件进行了多荧光正交2D图像分析和可视化。
神经突生长、分支和存活分析
使用 ImageJ 软件手动测量 DRG 神经元的神经突生长、分支和存活率。每种条件（BRD50和环己酰亚胺条件除外）至少7389个神经元的平均神经突生长被量化至少3个独立的生物学重复。分析来自至少 30 个独立生物学重复的每个条件至少 3 个神经元的神经突分支。DRG神经元存活率从至少10个独立生物学重复的每个条件下的3个随机显微镜场中量化。
坐骨神经再生分析
在每只小鼠的3至5个矢状切片上量化轴突再生。用ImageJ软件在10 μm区域内量化SCG500强度，减去背景强度，并将残余强度与破碎区域（SCG10的最大强度）进行比较。再生指数是通过测量从破碎部位到SCG10强度是破碎部位强度一半的位置的距离来确定的。
皮肤再神经支配分析
坐骨神经挤压后约15天，对小鼠进行麻醉，并用乳膏脱毛其后爪。用冷冰PBS心内灌注小鼠，并从骨骼中轻轻去除无毛的皮肤。处理后，在每只动物3至4毫米的无毛皮肤后爪中量化皮肤再神经支配。用ImageJ软件量化表皮中的纤维数量。
背柱再生分析
在每只小鼠的2至4个切片上定量轴突再生。用ImageJ软件每50 μm定量CTB强度，减去背景强度，并将残余强度与最大强度进行比较。再生/死亡的起源（距离“0”）是由胶质细胞疤痕边界定义的挤压部位的尾部。
vGlut1和VGAT突触体的分析
VGlut1和VGAT突触bouton用共聚焦LSM710 / Airyscan（蔡司）成像。Z-stack图像的平均厚度为18 μm，步长为0.2 μm。使用Zen 3.3软件进行了多荧光正交2D图像分析和可视化。通过分析每个样本至少1个运动神经元来计算与L1-4脊柱部分的运动神经元相反的vGlut10或VGAT体的平均数量。
DRG细胞荧光强度分析
用于荧光强度的定量分析（p-S6Ser235-236;P-S6Ser240-244、RSK2、Isl1/2、Advillin、TrkA、Parv清蛋白、TrkB、Calbindin和生长抑素）、DRG神经元和细胞核在ImageJ软件中手动概述，仅量化细胞质像素强度。对于每个标记，所有采集的设置都是固定的。
shRNA对RSK2表达的影响分析
对于RSK2荧光强度的定量分析，在ImageJ软件中手动勾勒出DRG神经元和细胞核，仅量化细胞质像素强度。为了分析shRNA-RSK2的影响，对RSK2的表达进行了定量，并在同一切片的mCherry阳性DRG（感染神经元）和mCherry阴性DRG神经元（未感染的神经元）中进行了比较。这些数据与sh-Scrambled效应进行了比较，也报告了RFP蛋白的强度。对于每个实验，所有采集的成像设置都是固定的。
行为测试
对于行为测试，我们使用混合背景，来自混合窝的雄性和雌性小鼠。在第一次手术（鞘内注射）之前，小鼠每天处理一次，具有柔软和强烈的争吵，头腹部和足部接触。第一次手术后，对于冯弗雷细丝，将小鼠在10天内每天7分钟放置在直径为10厘米的玻璃ramekin中，位于离地板60厘米的非锐度网格上。为了去除粘性纸，将小鼠放在单独的笼子上，并在活跃期训练7天，粘性纸卡在两个爪子中，直到它们能够去除贴纸。训练后，所有实验每周进行一次，背柱损伤前2周，背柱损伤后6周。
胶带接触和胶带去除测试
对于该测试，在行为测试前至少1h将小鼠置于实验室中，并且在小鼠的活动期间（夜间）仅用红光进行实验。将小鼠放置在透明的“类似”家庭笼子中。适应环境至少5分钟后，将直径为8毫米的胶垫粘在每个后爪上。量化了小鼠鼻子与粘纸之间的首次接触时间及其去除所需的时间。该实验每次进行5次，最长给定时间为33min以去除两个垫[2]。用1080个摄像头（罗技HD 60p / <> fps）记录小鼠活动以进行进一步分析。
冯·弗雷灯丝测试
对于该测试，在行为测定前至少1小时将每只动物放置在实验室中。在测试前10分钟将每只小鼠分别放置在直径10厘米的无底盒中。盒子被放置在离地板60厘米的非锐度网格上。该试验中使用的方法是如前所述[60]的向上和向下方法。简而言之，一旦小鼠平静下来，用爪子中心的参考细丝测试它们 3 秒。在反应的情况下，下一次测试是用较小的细丝（更敏感）进行的。如果小鼠没有反应，则用较厚的细丝（不太敏感）进行下一次测试。为了确定小鼠的敏感性，它们必须对同一细丝做出3次反应。这个实验是独立地对两只爪子进行的。用相机（罗技HD 1080p / 60 fps）记录小鼠活动以进行进一步分析。
统计分析
所有使用的动物都是来自合并窝的雄性和雌性，并且在任何治疗或实验操作之前被随机分配到组中。所有分析都是在对同时实现的控制测试不知情的情况下进行的。使用GraphPad Prism 9.4进行统计分析，使用单样本t检验，单因子方差分析，双向方差分析，Kruskal-Wallis检验，配对t检验，未配对t检验。使用的每个测试都以图例表示。误差线表示平均值的标准误差 （SEM）。p 值 p < 0.05 被认为具有统计显著性，差异由星表示：???p < 0.001、??p < 0.01、?p < 0.05。NS：不重要。
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DRG神经元不同亚群的RPS6磷酸化水平及其再生能力.
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S1 图 DRG神经元不同亚群的RPS6磷酸化水平及其再生能力.
（A）成人DRG中感觉神经元亚型的示意图，基于其功能和它们表达的标志物：TrkA，TrkB，Calbindin，生长抑素和小白蛋白。（B）用抗p-S6染色的DRG切片的代表性显微照片Ser235-236（洋红色）、CTB（灰色，仅在 3dpi 下）以及完整和 3dpc 中的不同 DRG 亚群标记（绿色）。比例尺：50 μm。（C） 显示 p-S6 差异上调下 B 定量的图表Ser235-236不同DRG亚群的3-dpi（平均±SEM;未配对t检验;N = 每组3只动物;每个标记物至少计数50个阳性神经元）。（D）显示完整DRG中CTB逆向标记亚群比例及其比例3 dpi的图表（卡方检验;每个标记至少计数37个阳性神经元）。原始数据可在支持信息（S1 数据）中找到。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002044.s001
（提夫）
S2 图 磷酸化死RSP6小鼠系的表征。
（A）描述不可磷酸化RSP6小鼠系的示意图。（B） RPS6 中 DRG 切片的代表性显微照片p+/p+， RPS6p+/p-和 RPS6p-/p-用抗RPS6、抗p-S6染色Ser235-236，或抗 p-S6Ser240-244（洋红色）和反图吉 1（灰色）。比例尺：25 μm。（C） 蛋白质印迹显示 RPS6 在 RPS6 中未磷酸化p-/p-DRG 与 RPS6 的比较p+/p+和 RPS6p-/p+DRG.（D、E）C（平均±SEM）的定量;普通单向方差分析;N = 每组 3 只动物）。（F）来自WT（RPS6p+/p+）和纯合子（RPS6p-/p-）对RPS6磷酸化有缺陷的小鼠系没有差异。比例尺：250 μm。（G-I）显示F.（G）每个神经元的最长神经突长度的图表在接种后16小时（平均±SEM，未配对t检验，3个独立的DRG培养物，每个培养物每个条件计数约50个细胞）。（H） 最长神经突中 2 个分支之间的距离（平均 ± SEM，未配对 t 检验，3 个独立的 DRG 培养物，每个培养物每个条件分析约 50 个细胞）。（I）电镀后16小时生长神经突的神经元百分比（平均±SEM，未配对t检验，每个条件量化10个随机显微镜场，ns：不显着）。原始数据可在支持信息（S1 数据和 S1 原始映像）中找到。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002044.s002
（提夫）
S3 图 磷酸 RPS6 的过表达235D-236D诱导幼稚DRG的预处理作用，并对WT小鼠的坐骨神经再生有适度作用。
（一、二）核糖体纯化的蛋白质印迹显示拟磷酸药RPS6构建体的良好整合（A） RPS6240D-244D-247D或 （B） RPS6235D-236D在N2A细胞的核糖体中。（C）鞘内注射AAV21-Ctrl后8天WT小鼠成熟DRG神经元幼稚培养物的代表性显微照片;AAV8-RPS6240D-244D-247D或 AAV8-RPS6235D-236D表明仅过表达AAV8-RPS6235D-236D诱导预处理效果。比例尺：250 μm。（D、E）显示C.（D）电镀后16小时每个神经元最长的神经突长度的图表（平均±SEM，单因子方差分析，3个独立的DRG培养物，每个培养物每个条件计数约50个细胞）。（E）最长神经突中2个分支之间的距离（平均± SEM;单向方差分析，3个独立的DRG培养物，每个培养物每个条件分析约50个细胞）。（F）电镀后16小时生长神经突的神经元百分比（平均±SEM，双向方差分析，每个条件量化10个随机显微镜场）。（G） WT小鼠鞘内注射AAV3-PLAP（对照组），AAV8-RPS8损伤后6天坐骨神经切片的代表性共聚焦图像240D-244D-247D或 AAV8-RPS6235D-236D.再生轴突用抗SCG10抗体（白色）标记。红色虚线表示受伤部位。比例尺：500 μm。（H）G再生轴突的定量（平均±SEM，双向方差分析，每组至少5只动物）。（I）3 dpi下的再生指数（平均± SEM，单因子方差分析，每组至少5只动物）。（J） 来自RPS6的成熟幼稚DRG神经元培养物的代表性显微照片p-/p-小鼠，鞘内注射AAV21-Ctrl后8天;AAV8- RPS6240D-244D-247D或 AAV8-RPS6235D-236D表明仅过表达磷酸AAV8-RPS6235D-236D诱导预处理效果。比例尺：250 μm。（K-M）显示J.（K）每个神经元的最长神经突长度的定量图表 电镀后16小时（平均± SEM，单向方差分析，3个独立的DRG培养物，每个培养物每个条件计数约50个细胞）。（L） 最长神经突中 2 个分支之间的距离（平均 ± SEM、单因子方差分析、3 个独立的 DRG 培养物，每个培养物每个条件分析约 50 个细胞）。（M）电镀后16小时生长神经突的神经元的百分比（平均±SEM，双向方差分析，每个条件量化的10个随机显微镜场）。???p < 0.001， ??p < 0.01， ?p < 0.05， ns： 不显著。原始数据可在支持信息（S1 数据和 S1 原始映像）中找到。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002044.s003
（提夫）
S4 图 表征不同信号通路对幼稚DRG培养的影响。
（A）本研究中使用的核糖体S6激酶示意图信号通路和抑制剂（红色）。（B）用DMSO（对照）处理的幼稚DRG神经元培养物的代表性显微照片，DMSO是一种全球蛋白质翻译抑制剂（环己酰亚胺（5nM））;mTOR抑制剂（Torin1（5nM）或雷帕霉素（0.1nM））;和S6K1抑制剂（PF-4708671（8μm））。比例尺：250 μm。（C）定量B（平均±SEM，双向方差分析，3-4个独立的DRG培养物，每个培养物每个条件计数约50-100个细胞（环己胺除外））。（D）从A电镀16小时后生长神经突的神经元的百分比（平均值，双向方差分析，3-4个独立的DRG培养物，每个条件量化10个随机显微镜场）。???p < 0.001， ??p < 0.01， ?p < 0.05， ns： 不显著。原始数据可在支持信息（S1 数据）中找到。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002044.s004
（提夫）
S5 图 成熟DRG中RSK家族表达的表征。
（A）显示小鼠中表达的4个RSK中氨基酸序列的同源性的图表。（B） 总结 RSK1、2、3 和 4 之间的同源性和恒等性的表格。（C）用于通过原位杂交研究RSK1，2，3和4特异性表达的探针示意图。（D） 显微照片显示与成人脑冠状切片上 RSK1、RSK2、RSK3 和胚胎 E4.12 矢状切片上 RSK5 的义和反义 RNA 探针的原位杂交，显示这些探针的特异性。（五）实验工作流程。（F） 显微照片显示 RSK1、RSK2、RSK3 和 RSK4 在成人腰椎 DRG 切片上原位杂交，在受伤后 1、3 和 7 天坐骨神经损伤 （dpi） 完好无损。只有RSK2和RSK3在小鼠腰椎DRG中高表达，RSK2表达受轴突损伤调节。比例尺：50 μm。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002044.s005
（提夫）
S6 图 ShRNA-RSK2的表征。
（A）用于过表达RSK1-VSVG，RSK2-Flag，RSK3-V5，RSK4-His，PLAP或shRNA（sh-Scrambled或sh-RSK2）的质粒构建体示意图。（B–E）蛋白质印迹显示共转染后2小时N2A细胞中的shRNA-RSK96特异性（平均±SEM，单样品t检验，每组N = 3次转染）。（F）鞘内注射AAV1-shCtrl（共同表达RFP）21天后，用抗RFP（洋红色）和抗Tuj 8（灰色）抗体染色的DRG切片的代表性显微照片。比例尺：25 μm。（G）H的定量（平均±SEM，3只动物，每只动物计数5个DRG切片）。???p < 0.001， ??p < 0.01， ?p < 0.05.原始数据可在支持信息（S1 数据和 S1 原始映像）中找到。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002044.s006
（提夫）
S7 图 RSK3不参与预处理效应，但PTEN缺失导致坐骨神经再生的适度增强。
（一）实验工作流程。（B）WT DRG解离培养物的代表性显微照片显示RSK3在幼稚培养物中的过表达不会表型预处理效应。比例尺：250 μm。（中-东）B.（C）电镀后16小时每个神经元最长的神经突长度（平均±SEM，单因素方差分析，至少3个独立的DRG培养物，每个培养物每个条件计数约50-100个细胞）。（D） 2 个分支之间的平均距离（平均 ± SEM、单因子方差分析、至少 3 个独立的 DRG 培养物、每个培养物每个条件分析约 50 个细胞）和 （E） 铺板后 16 小时生长神经突的神经元百分比（平均 ± SEM，双向方差分析，每个培养物每个条件量化 10 个随机显微镜场）。（F）受伤后3天用AAV8-Ctrl（对照）或AAV8-RSK3注射小鼠的坐骨神经切片的代表性共聚焦图像。再生轴突用抗SCG10抗体（白色）标记。红色虚线表示受伤部位。比例尺：500 μm。（G， H）F再生轴突的定量（平均± SEM，多个未配对t检验，每组至少3只动物）。（H）3 dpi下的再生指数（平均±SEM，未配对t检验，每组至少3只动物）。（一）具有代表性的番茄显微照片佛罗里达州/佛罗里达州DRG切片在鞘内共注射AAV1-GFP（Ctrl）和AAV21-CRE后8天用抗GFP（绿色）和抗Tuj 8（灰色）抗体染色。td番茄是洋红色的。比例尺：25 μm。（J）I的定量（平均±SEM，3只动物，每只动物计数5个DRG切片）。（K）用AAV3-Ctrl（对照）和AAV8-shCtrl（对照）或AAV8-CRE和AAV8-shCtrl（对照）共同注射的小鼠受伤后8天坐骨神经切片的代表性共聚焦图像。再生轴突用抗SCG10抗体（白色）标记。红色虚线表示受伤部位。比例尺：500 μm。（L， M）K再生轴突的定量（平均± SEM，多个未配对t检验，每组至少5只动物）。（M）3 dpi下的再生指数（平均±SEM，未配对t检验，每组至少5只动物）。???p < 0.001， ??p < 0.01， ?p < 0.05， ns： 不显著。原始数据可在支持信息（S1 数据和 S1 原始映像）中找到。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002044.s007
（提夫）
S8 图 RSK2 是预处理条件下背柱再生所必需的。
（A）实验的工作流程。（B）背柱示意图，带有胸部T6水平背柱挤压后7周，CTB-Alexa-1神经内注射后555周小鼠颈，胸和腰冠截面的代表性图像。（C） 坐骨神经挤压和背柱挤压后 6 周胸椎脊髓矢状面的代表性共聚焦图像，来自鞘内注射 AAV8-sh-Scrambled 或 AAV8-sh-RSK2 的小鼠。再生轴突用抗CTB抗体（白色）标记。橙色箭头表示轴突再生的方向。（D）C（平均±SEM，曼-惠特尼检验，N = 每组至少8只动物）挤压部位尾部轴突再生和死亡的定量。（E）Von Frey实验测试鞘内注射AAV8-shScrambled或AAV8-shRSK2的小鼠的伤害感受，在坐骨神经损伤和背柱挤压前2周和之后6周，刺激强度以克为单位显示（平均±SEM，多次t检验，每组至少11-12只动物，仅考虑受伤的爪子）。（F， G）在左坐骨神经损伤和背柱挤压前8周和后8周鞘内注射AAV2-shScrambled或AAV2-shRSK6的小鼠的胶带接触和去除试验（平均±SEM，双向方差分析，每组至少11只动物）。???p < 0.001， ??p < 0.01， ?p < 0.05.原始数据可在支持信息（S1 数据和 S1 原始映像）中找到。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002044.s008
（提夫）
S1 表。 用于原位杂交的cDNA列表。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002044.s009
（三十）
S2 表。 抗体列表。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002044.s010
（三十）
S1 数据。 图1D、1E、1F、1H、2C、2D、2E、2G、2H、2J、2K、2L、2N、2O、3B、3C、3D、3E、3G、3H、4C、4E、4H、4J、4L、5B、5C、5D、5F、5G、5I、5J、5K、5M、5N、5P、5Q、5R、5T、5U、6B、6C、6D、6F、6G、7D、7F、7H、7J、7L、7G、7H、7J、7L、 1N、1Q、2R 和 S1C、S2D、S2D、S2E、S3G、S3H、S3I、S3D、S3E、S3F、S3H、S3I、S4K、S4L、S6M、S6C、S6D、S7B、S7C、S7D、S7C、S7D、S7E、S7G、S8H、S8L、S8M、S8D、S8E、S<>F、S<>F 和 S<>G。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002044.s011
（三十）
S1 原始映像。 图1C、4B、4I、4K、S2C、S3A、S3B和S6B–S6E的原始印迹图像。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002044.s012
（英文）
确认
我们要感谢E.Plissonier，T.-N.Nguyen，N. Fayad和A. Lapierre的实验室帮助和讨论。我们感谢S. Carnicella，M. Bartolomucci和由格勒诺布尔神经变性卓越中心（GREEN）支持的GIN行为设施。这项工作得到了格勒诺布尔神经科学研究所光子成像中心（Univ Grenoble Alpes-Inserm U1216）的支持，该中心是ISdV核心设施的一部分，并通过了IBiSA标签的认证。
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