《科学与技术》杂志范文-3种STR试剂盒在二联体亲权鉴定中的效能评价
【摘要】：MicroreaderTM 21 Direct ID System试剂盒（21D）采用多重扩增检测20个STR基因座和1个性别位点，可以用亲缘关系检测。在二联体亲权鉴定过程中，发现了一些达不到亲权判定标准的案例，需要使用MicroreaderTM 23sp-D ID System试剂盒（23sp-D）加测位点才能作出结论。MicroreaderTM 28A ID System试剂盒（28A）可以检测28个位点。本研究利用21D、23sp-D和28A试剂盒分别对收集到的10个21D无法判定亲权关系的案例血卡样本进行检测，结果表明，单独使用28A试剂盒能替代21D和23sp-D联合使用进行二联体亲权关系鉴定。更加符合司法鉴定的需求。
【关键词】：短串联重复 ；亲权鉴定
短串联重复序列（STR）因其多态性高，个体识别能力强，检测简便快捷，目前已经广泛应用于亲权鉴定方面【1】。但研究和应用发现STR基因座突变率较高，经常会出现不符合孟德尔遗传规律的矛盾基因座【2】。根据我国现行的亲权鉴定技术规范（GB/T 37223-2018）的要求，不应根据一个遗传标记不符合遗传规律就作出排除亲权关系的意见，需要增加检验的STR基因座数量【3】。
二联体鉴定由于缺少了一方亲代的遗传信息会降低其亲子关系相对机会 (RCP) 值和非父排除率 (PE)【4】，且鉴定时可能存在STR基因座突变现象，严重影响亲子鉴定结果的准确判定，因而对试剂盒检测效能的要求更高。有研究表明，二联体亲子鉴定要达到亲子鉴定判断标准CPI ≥ 10000，累计非父排除率CPE > 0.9999的条件下至少需要检测18个STR基因座，若发现1个矛盾基因座，需增加检测基因座至29个或以上【5】。当检测基因座数量较少时，也会出现无矛盾基因座但累计亲权指数（CPI）小于10000的情况，根据规范要求，在CPI值大于10000才可做出“不排除亲生关系”或“支持存在亲生关系”的结论，此时也需要增加检测的STR基因座数量【3】。
应用21D进行二联体亲权鉴定时，发现10个案例CPI低于10000，无法判定其亲子关系。其中8个案例是由STR基因座突变导致的，另外2个是因为试剂盒检测效能不足。因此，需要使用23sp-D增加检测位点，作为亲权鉴定的补充依据。而28A可以同时检测28个位点，鉴别能力更强。本研究旨在利用21D、23sp-D和28A试剂盒分别对收集到的10个21D无法判定亲权关系的案例样本进行检测分析，研究这3个试剂盒重合基因座分型结果的一致性及28A应用于二联体亲权鉴定的优越性。
1 材料与方法
1.1样本
20张FTA血卡样本（10个亲子对），来源于天津市津实司法鉴定中心。
1.2主要试剂与仪器
MicroreaderTM 28A ID System试剂盒（苏州阅微基因技术有限公司，中国）；MicroreaderTM 21 ID System试剂盒和MicroreaderTM 23sp-D ID System试剂盒（苏州阅微基因技术有限公司，中国）；Harris 1.2 mm手动打孔器（GE公司，美国）；ProFlex PCR System(ABI公司，美国)；ABI 3500XL遗传分析仪（AB公司，美国）；GeneMapper ID-X（AB公司，美国）。
1.3实验步骤
利用手动打孔器打取血卡样本， 根据检测试剂盒说明书配制10 μL扩增体系，根据产品说明书上的程序在ProFlexPCR仪上进行PCR扩增。根据说明书使用ABI 3500XL遗传分析仪对PCR扩增产物进行样品检测，上样电压为3 KV，上样时间为8 s。
使用GeneMapper ID-X软件对这些样本的STR基因座进行等位基因分型判断。根据亲权鉴定技术规范的要求，采用试剂盒提供的 STR基因频率，突变率μ为平均突变率0.002，母源性突变以μ/3.5计算，在CPE > 0.9999和单个案例CPI ≥ 10000作出亲权判断。
2 结果
2.1试剂盒重叠位点一致性验证
图1：21D、23sp-D和28A试剂盒重叠位点
本次实验所用的试剂盒均为直扩试剂盒，使用28A， 23sp-D和21D扩增FTA血卡样本的成功率均为100%，通过ABI 3500XL遗传分析仪检测PCR产物，GeneMapper ID-X软件分析，均获得完整分型，各基因座扩增均衡性良好，阴性和阳性对照中均未发现超过50RFU的非特异性增峰。对于试剂盒中共有的基因座进行平行检测的结果也完全一致，3个试剂盒在样本中均未检测到STR基因座丢失的情况。
2.2样本案例中突变情况分析
检测结果表明，21D无法判定其亲子关系的10个案例中有8个是由于单个STR基因座突变导致的，这些突变都是一步突变；其中7个案例突变来源于父亲，只有案例P7基因座D5S818的等位基因突变来源于母亲，其基因分型由12突变为13。另外，案例P4，P5和P10由于缺乏另外一个亲本的基因分型信息，无法判定哪种分型在遗传过程中发生了突变，需要考虑所有可能的情况。例如，案例P5的D3S1358基因座亲代基因型为16，18；子代基因型为15，17；分型16可能突变为15或17，分型18也可能突变为17。案例中的突变详细情况（表1）。
表1：案例中的突变情况分析
案例 二联体类型 21D突变位点 23sp-D突变位点 28A突变位点 基因型 突变类型
亲代 子代
P1 父-女 vWA vWA 14,20 16,19 20-19
P2 父-女 Penta E Penta E 12,19 17,20 19-20
P3 父-女 Penta D Penta D 14,15 12,16 15-16
P4 父-子 D12S391 D12S391 D12S391 18,21 19,22 18-19或21-22
P5 父-子 D3S1358 D3S1358 16,18 15,17 16-15，16-17或18-17
P6 父-子 CSF1PO CSF1PO 11,14 9,13 14-13
P7 母-子 D5S818 D5S818 12,12 10,13 12-13
P8 父-女 - -
P9 父-子 - -
P10 父-子 D12S391 D12S391 D12S391 19,25 20,24 19-20或25-24
2.3亲权鉴定分析
根据21D基因分型判读结果，发现有2个案例（P8和P9）检测的STR基因座都符合遗传规律，但是计算其CPI分别为5827.7767和4201.3367，不满足二联体亲权判定的标准，表明试剂盒检测效能不足。利用23sp-D加测STR位点，发现在23sp-D相对于21D增加的19个基因座均无突变，与21D重叠的4个STR位点基因分型完全一致。应用28A试剂盒检测案例样本，其与21D相同的基因座，分型完全一致，新增的7个基因座均无突变。
按照亲权鉴定技术规范中二联体亲权鉴定CPI计算公式分别计算这10个案例的CPI（表2）。10个案例用21D试剂盒检测时CPI值在126.7927到8737.5990之间，加做23sp-D后其CPI在312569863.3847-16247486036006.3000，所有案例均满足CPE > 0.9999和单个案例CPI ≥ 10000，符合二联体亲权鉴定标准。单独使用28A对案例样本进行检测时，其CPI在5408.5026- 34521980.8481，除案例P1的CPI为5408.5026，小于10000，不符合判定标准，需要加测基因座外，其余案例CPI都大于10000，符合二联体亲权鉴定的判断标准（表2）。
表2：案例中CPI值
案例 21D 21D+23sp-D 28A
P1 126.7927 32491591892.5944 5408.5026
P2 2596.2380 286416246969.9510 250070.6462
P3 8737.5990 379545487633.4150 19785.8135
P4 8411.8657 653745420.8476 7696838.4802
P5 3055.2449 41795663571.5060 384583.7880
P6 350.7734 312569863.3847 198701.5771
P7 1651.1797 92823626834.5791 6957608.4876
P8 5827.7727 20145256932.3247 34521980.8481
P9 4201.3367 16247486036006.3000 4950163.5417
P10 5372.2795 520013429.6240 2726711.9726
3 讨论
STR具有高度多态性，在基因遗传过程中遵循孟德尔遗传规律，目前已经在法医学亲子鉴定、个体识别方面获得了广泛的应用。二联体亲子鉴定由于缺少亲代一方的遗传信息，会降低其亲子关系相对机会 (RCP) 值和非父排除率 (PE)，对试剂盒的效能要求更高。本研究显示，在运用21D体系的21个STR基因座进行二联体亲子鉴定过程中发现10案例未达到亲子鉴定的判断标准，其中有8个案例检测到单个STR基因座的突变，另外两个案例所有基因座均符合遗传规律但CPI小于10000。这一结果表明，对某些案例而言，检测21个基因座的试剂盒效能不足以进行二联体亲权判定。此外，STR基因座突变在人类群体中普遍存在，因而需要检测更多的基因座。在实际使用21D试剂盒进行二联体亲子鉴定时经常需要使用23sp-D增加检测的基因座数量以得出可靠的鉴定意见。
本研究及前期研究表明，应用28A进行二联体亲权鉴定更加高效，在案例中存在单个STR位点突变时可以代替21D和23sp-D联合使用，变两次检测为一次，即节省样本量，又减少人力，节约时间，具有明显的优越性。
参考文献
1.赖力, 薛士杰, 金静君,等. 二联体亲子鉴定STR基因座突变分析[J]. 福建医药杂志, 2011, 33(5):3.
2.蔡颖, 周广彪, 赵书民,等. 中国人群亲权鉴定常用STR基因座平均突变率的估计[J]. 中国司法鉴定, 2010(5):4.
3.GB/T 37223-2018, 亲权鉴定技术规范[S].
4.朱远雁, 邹洁, 强文,等. 39个STR基因座在二联体亲子鉴定突变案例中的应用[J]. 中国法医学杂志, 2016(3):3.
5.伍新尧, 童大跃, 朱运良,等. 用STR分型技术作亲权鉴定时判断标准的研究[J]. 中山大学学报：医学科学版, 2010, 31(1):6.