HBZ上调肌友林表达以促进HTLV-1感染
尼古拉斯·波拉科夫斯基，阿布·考萨尔·萨克尔，金森晃，乔治娜·博阿滕，阿曼达·韦斯利·肯德尔，克劳丁·皮克，帕特里克·格林，阿曼达·潘菲尔，伊莎贝尔·莱马森
发布时间：24 年 2023 月
抽象
复杂的逆转录病毒，人类T细胞白血病病毒1型（HTLV-1），主要在体内感染CD4 T细胞。该细胞群内的感染性传播需要病毒感染细胞和靶细胞之间的直接接触。HTLV-1辅助蛋白HBZ最近被证明通过激活细胞内粘附分子1（ICAM-1）表达来增强HTLV-1感染，该分子促进感染细胞与靶细胞的结合并促进病毒学突触的形成。在这项研究中，我们发现HBZ通过激活肌软蛋白（MyoF）的表达来增强HTLV-1感染，肌软蛋白在膜融合和修复以及囊泡转运中起作用。ChIP 测定和定量逆转录酶 PCR 的结果表明，HBZ 在 MYOF 基因内的两个增强子位点与 c-Jun 或 JunB 形成复合物，并通过募集共激活剂 p300/CBP 激活转录。在HTLV-1感染的T细胞中，使用该药物WJ460或shRNA介导的MyoF敲低特异性抑制MyoF会降低感染效率。这种效应与细胞粘附的降低和HTLV-1包膜（Env）表面单位（SU）和跨膜结构域（TM）丰度的细胞内降低有关。溶酶体蛋白酶抑制剂部分恢复了WJ460处理细胞中的SU水平，并且通过MyoF敲低增加了SU在LAMP-2位点的定位，这表明MyoF将SU转运限制在溶酶体中进行降解。与这些效应一致，较少的SU与无细胞病毒颗粒相关。总之，这些数据表明，MyoF通过调节Env运输和细胞粘附来促进HTLV-1感染。+
作者摘要
人类T细胞白血病病毒1型（HTLV-1）感染可引起进行性神经炎症性疾病和致命的白血病，并且还与其他炎症性病理有关。这些临床表现部分源于宿主CD4 T细胞群内的病毒传播。一旦感染HTLV-1，T细胞就会采用一种新的基因表达程序，使其能够感染其他T细胞。这种重编程事件依赖于特定HTLV-1蛋白的功能。在这里，我们表明病毒蛋白HBZ诱导肌软蛋白（MyoF）表达对HTLV-1感染很重要。我们的数据支持一种模型，其中HBZ通过在基因内的两个位点与c-Jun或JunB相关联并募集细胞共激活剂p300 / CBP到这些位点来激活MYOF基因的转录。我们发现，与其在囊泡运输中的已知作用有关，MyoF减少了HTLV-1包膜（Env）蛋白向溶酶体的转移以进行降解，导致更多的Env掺入病毒粒子中。此外，我们发现MyoF增强了HTLV-1感染的T细胞的粘附特性，这很重要，因为细胞间的接触对于病毒感染至关重要。我们的研究为HTLV-1感染所需的事件提供了新的见解。+
引文： Polakowski N， Sarker MAK， Hoang K， Boateng G， Rushshing AW， Kendle W， et al. （2023） HBZ上调肌友林表达以促进HTLV-1感染。公共科学图书馆病理学19（2）： e1011202. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011202
编辑 器： Charles R. M. Bangham，英国伦敦帝国理工学院
收到： 16月 2022， 10;接受： 2023年24月2023日;发表： <>月 <>， <>
版权所有： ? 2023 波拉科夫斯基等人。这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。
数据可用性： 所有相关数据都在手稿及其支持信息文件中。
资金： 美国国立卫生研究院通过向IL拨款R21AI166077和R15AI133412以及向PLG提供P01CA100730提供资金。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。
竞争利益： 提交人声明不存在相互竞争的利益。
介绍
据估计，全世界约有5万-10万人感染了复杂的逆转录病毒，即人类T细胞白血病病毒1型（HTLV-1）[1]。该人群中的一小部分最终会出现与病毒感染相关的临床表现。具体而言，HTLV-1是致命性恶性肿瘤ATL的致病因素，另外是进行性神经退行性疾病HTLV-1相关脊髓病/热带痉挛性下肢轻瘫[2-5]。此外，HTLV-1感染与葡萄膜炎、感染性皮炎有关，并与其他炎症介导的疾病有关[6-8]。
在体内，HTLV-1主要感染CD4 T细胞[9]，该细胞群内的感染性传播需要病毒感染的T细胞与靶T细胞之间的接触[10-12]。这些接触的启动和稳定似乎主要是通过感染细胞上的细胞间粘附分子1（ICAM-1）与其受体白细胞功能相关抗原-1（LFA-1）在靶细胞上的相互作用而发生的[13]。然后，病毒颗粒通过病毒学突触（VS）[14]，或从粘性细胞外生物膜样病毒组件[15]或通过细胞导管[16]转移到靶细胞。除了介导细胞粘附外，ICAM-1在感染细胞表面的结合对于VS的形成至关重要[17，18]。+
HTLV-1包膜蛋白（Env）存在于病毒颗粒表面，对病毒感染至关重要。Env的成熟形式由外表面单元SU（也称为gp46）组成，该单元与跨膜亚基TM（gp21）键合的二硫键[19]。病毒颗粒最初通过SU与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的相互作用与靶细胞对接，然后在SU结合神经皮林-1时建立稳定的细胞接触[20，21]。随后SU与葡萄糖转运蛋白1结合被认为可诱导TM的构象变化，从而激活病毒包膜与质膜的融合[22，23]，导致病毒进入。HTLV-1 Env具有高度梭原性，因此质膜处高水平的Env会导致接触细胞形成合胞体[24-26]。这种效应由快速网格蛋白介导的Env内吞作用调节，其主要通过TM（CD-TM）细胞质结构域中的YXXΦ基序与衔接蛋白2（AP-2）之间的相互作用发生[27，28]。有趣的是，YXXΦ基序也可能促进Env的溶酶体降解，这一过程似乎被CD-TM中单独的PDZ结合基序所抵消[29]。后一个结构域最初是根据与含有PDZ结构域的支架蛋白hDLG1的相互作用确定的，该结构域有助于Env和Gag积累到质膜附近的离散位点[30]。
最近显示，病毒蛋白HBZ通过激活ICAM-1表达来增强HTLV-1感染[31]。HBZ调节许多其他细胞基因的转录以及HTLV-1前病毒的转录[32]。在其C末端，HBZ具有亮氨酸拉链（ZIP）结构域，该结构域与几种细胞碱性亮氨酸拉链（bZIP）转录因子二聚。在某些情况下，这些相互作用允许HBZ直接或间接地与DNA结合。生化证据表明，HBZ与小MAF（肌肉腱膜纤维肉瘤蛋白）之间形成的异二聚体可结合MAF识别元件[33，34]。JunD能够通过与HBZ同时形成异二聚体并与DNA结合的Sp1相互作用，将HBZ桥接到DNA的发现表明了与DNA的间接关联[35，36]。HBZ的N末端区域包含一个活化结构域，该激活域与副同源细胞共激活因子p300和CBP（单称p300/CBP）形成高亲和力相互作用[37，38]。这些蛋白可作为募集其他转录调节因子的支架，并具有改变组蛋白和转录调节因子的赖氨酸乙酰转移酶（KAT）活性[39]。因此，当与DNA相关时，HBZ可以通过募集p300 / CBP激活转录。
在这项研究中，我们发现HBZ通过直接激活MYOF基因的表达为HTLV-1感染过程提供了额外的贡献。该基因编码肌软蛋白（MyoF），参与膜融合和修复以及囊泡转运[40]。HBZ与Jun家族成员一起，在位于转录起始位点（TSS）下游约19和103 kb的MYOF基因内的两个位点富集。我们提供的证据证明HBZ将p300 / CBP募集到这些位点，并且共激活剂KAT活性对MYOF转录很重要。最近开发的MyoF特异性抑制剂WJ460[41]减少了HTLV-1感染，这与成熟Env细胞内水平的降低相关。这些效应被shRNA介导的MyoF敲低所证实。结合MyoF敲低细胞中Env的丰度较低，较少的Env被掺入这些细胞产生的病毒颗粒中。MyoF的一个作用是调节内体运输[42-45]。我们提供的证据表明，该功能控制成熟Env的丰度，特别是通过将Env的运输限制为溶酶体进行降解。
结果
肌呋呋呤在HTLV-1感染细胞中表达
为了更清楚地了解HBZ如何增强HTLV-1感染，我们交叉引用了由HBZ激活并表达可能与感染过程相关的功能的蛋白质的基因。我们之前进行了基因表达微阵列分析，比较了表达HBZ或携带空表达载体的克隆HeLa细胞系[46，47]。编码蛋白质myoferlin（MyoF）的MYOF是在HBZ存在下表达较高的基因之一。虽然MyoF在肌母细胞融合中起着至关重要的作用[42]，但也有报道称它在内体循环中起作用[42-45，48]，这一过程经常被逆转录病毒和其他病毒剥夺[49-51]。使用定量逆转录酶PCR（qRT-PCR）和蛋白质印迹分析，我们验证了在HBZ存在下MYOF表达上调（图1A和1B）。与HBZ相反，HTLV-1编码的蛋白质Tax也充当转录调节因子，在HeLa细胞中表达时不影响MyoF表达（S1图）。
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图1. MyoF在表达HBZ的细胞和HTLV-1感染的T细胞中表达。
（A）所示HeLa细胞系中的相对MYOF mRNA水平。该图显示了来自四个独立实验的qRT-PCR结果的平均值，每个重复的值归一化为空载体克隆pcDNA（设置为1）的值。误差线显示标准偏差;** p<0.01， *** p<0.001.（B）空载体（pcDNA）和HBZ-HeLa克隆中的MyoF表达。使用针对MyoF，HBZ（50xHis）和β-肌动蛋白的抗体通过蛋白质印迹分析全细胞提取物（6μg）。（C）静息和活化的原代CD4 T细胞以及T细胞系中的相对MYOF mRNA水平。该图显示了两个独立实验的qRT-PCR结果的平均值，其中值归一化为静息CD4 T细胞的值（设置为1），误差条显示标准偏差。条形上方的数字表示相对于静息CD4 T细胞的表达水平。HTLV-1阴性系是T细胞急性淋巴细胞白血病系（CEM，HSB-2，Jurkat，Molt-4和SupT1）和皮肤T细胞白血病系（HUT-78和Myla）;体外转化的HTLV-1阳性细胞为1185，C10 / MJ，MT-2，MT-4和SLB-1;ATL衍生的细胞系是ATL-2，HUT-102，SP，MT-1和TL-Om1。aCD4+是活化的CD4 T细胞。BXPC3是一种胰腺癌细胞系。（D）T细胞系中的MyoF表达。使用针对MyoF，Tax，β-肌动蛋白和HBZ的抗体通过蛋白质印迹分析全细胞提取物（45μg）。内源性HBZ通过使用GST-KIX（丽春红S染色）的亲和沉淀富集。（E） Tukey 箱线图（显示按健康供体 （HD）、无症状携带者 （AC）、HTLV-1 相关脊髓病 （HAM） 和 （F） 成人 T 细胞白血病 （ATL） 从已发表的微阵列数据划分的 MYOF 转录本水平：（E） 和 （F） 的 GEO 加入号分别为 GSE29312 [103] 和 GSE14317 [104]; 每个晶须的箱线图末端设置为第三个四分位数以上和第一个四分位数以下的四分位数间距的 1.5 倍; **p<0.01， *** p<0.001.++++
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011202.g001
为了确定HTLV-1感染的T细胞是否表达MYOF，我们首先对一组T细胞系进行了qRT-PCR分析。我们发现，与未感染的T细胞系相比，HTLV-1感染的T细胞系中的MYOF mRNA水平更高;后一组含有几乎检测不到水平的MYOF mRNA（图1C）。在该分析中，BxPC3胰腺癌细胞作为阳性对照，因为这些细胞显示出高MYOF表达[52]。我们还分析了HTLV-1感染的T细胞系中一组RNA中的hbz mRNA拷贝数（S2A图），但没有观察到hbz mRNA拷贝数与相对MYOF mRNA之间的显着相关性（S2B图）。令人惊讶的是，税收mRNA拷贝数与相对MYOF mRNA的比较显示出负相关（S2C和S2D图）。这些长期建立的细胞系可能含有异质突变集，这些突变组独立于病毒转录因子影响MYOF转录。使用HTLV-1感染细胞系的亚群，我们验证了MyoF蛋白的表达（图1D）。与我们的qRT-PCR结果一致，对来自基因表达综合（GEO）存储库的微阵列数据集的分析显示，与未感染的健康供体（HD）相比，无症状HTLV-4携带者（AC）和HAM/TSP患者（HAM）的CD1 T细胞中的MYOF表达显着更高，并且与HD相比，ATL患者的CD4 T细胞中的MYOF表达显着更高（图1E和1F）。++
HBZ激活肌呋喃林表达
除了检查空载体和表达HBZ的HeLa细胞中的MYOF mRNA水平外，我们还检查了表达HBZ的HeLa细胞系中的转录本水平，其起始密码子（HBZ-ΔATG）及其两个主要转录调控域：N端激活域（HBZ-mutAD）和C端亮氨酸拉链结构域（HBZ-MutZIP）。突变HBZ起始密码子消除了MYOF诱导，证明HBZ蛋白而不是转录本激活MYOF表达（图1A）。此外，另外两个突变的作用表明HBZ的两个转录调控结构域都是激活所必需的。支持仅HBZ在HTLV-1感染的T细胞中激活MYOF表达中的作用，我们发现mRNA和MyoF蛋白的表达存在于TL-Om1细胞中（图1C和1D）。这些细胞表达HBZ，但由于前病毒的甲基化模式，不表达其他HTLV-1蛋白[53-55]。我们还分析了来自ATL细胞系（KK1和ST1）的GEO微阵列数据集，这些数据集经过CRISPR/Cas9修饰以敲除hbz[56]。成功靶向hbz的两种引导RNA导致两种细胞系中MYOF mRNA的减少（图2A）。
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图2. HBZ的表达与MyoF的表达相关。
（A）ST1和KK1 ATL细胞中HBZ的缺失会降低MYOF表达。该图是根据已发布的微阵列数据（GEO加入号GSE94409 [56]）生成的，显示了在诱导CRISPR / Cas9介导的敲除ATL细胞系ST1和KK1后七天，与引导RNA对照相比，使用两种不同的引导RNA（sgHBZ #1和#2）进行MYOF转录本水平降低的百分比。使用GEO2R获得数据，并根据三个阵列特征的平均值进行计算，探测MyoF转录本的不同区域;** p<0.01， *** p<0.001.（B）最近从外周血淋巴细胞（PBL）建立的HTLV-1永生化人T细胞克隆中的相对MYOF mRNA水平。该图显示qRT-PCR结果如下：C3，一次RNA提取的值;ΔHBZ克隆，两次提取的平均值;所有其他值均为三次提取的平均值。将值归一化为静息CD4 T细胞的值（设置为1）。深灰色条表示来自不同PBL供体的克隆，用HTLV-1-wt（CJ2，CJ4，C13，C15）永生化。阴影条显示来自不同PBL供体的克隆，这些克隆用HTLV-1-ΔHBZ（C9-1和C13-1）永生化。黑条显示用来自同一PBL供体（C1，C1，C2，C3-6和C2）的HTLV-11-wt或HTLV-12-ΔHBZ永生化的克隆。浅灰色条显示了图1C中也分析的细胞子集以进行比较。（C）最近从PBL建立的HTLV-1永生化人T细胞克隆中的相对税收和hbz mRNA水平。该图显示了在（B）中分析的同一组RNA标本的平均值的qRT-PCR结果，其中值归一化为SLB-1 T细胞的值（设置为1）。+
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011202.g002
为了证实HBZ参与MYOF表达，我们分析了最近从人外周血淋巴细胞（PBL）中建立的HTLV-1永生化克隆中的MYOF mRNA水平。克隆是使用携带野生型（wt）HTLV-729分子克隆ACH的1.HTLV-1细胞或使用729.HTLV-1ΔHBZ细胞建立的，其中ACH中的点突变产生终止密码子终止翻译的HBZ主要剪接变体在氨基酸8处[57]。在所有克隆中检测到MYOF mRNA，尽管水平不同，这可能与使用来自不同供体的PBL建立这些克隆有关（图2B，深灰色条）。与携带野生型病毒的四个克隆相比，具有ΔHBZ病毒的两个克隆显示出较低水平的MYOF mRNA（图2B，阴影条）。在从同一供体建立的克隆中，这种趋势更加一致（图2B，黑条）。还确定了每个克隆相对于SLB-1细胞中的税收和hbz mRNA水平（图2C）。有趣的是，携带ΔHBZ病毒的克隆中hbz mRNA水平较低，这可能是由于HBZ蛋白在其自身启动子上缺乏正反馈回路[35]。在比较相对hbz和MYOF mRNA水平时，我们观察到显着的相关性;然而，税收与MYOF mRNA水平之间没有相关性（S3图），证实了MYOF诱导不涉及税收。这些结果支持HBZ在调节MYOF转录中的作用，也支持MYOF表达源于病毒感染而不是长期建立的HTLV-1感染T细胞系的进化的前提。
HBZ与细胞AP-1转录因子结合MYOF基因
为了确定HBZ如何激活MYOF表达，我们首先分析了来自Nakagawa等人的GEO ChIP-seq数据集。使用异位表达的生物素标记HBZ沉淀染色质的研究[56]。MYOF基因内存在两个HBZ富集峰：一个在靠近启动子的基因5'区域[~19 kb来自转录起始位点（TSS）;近端峰]，另一个在基因下游（~103 kb来自TSS;远端峰;图3A）。鉴于这一观察结果，我们进行了ChIP测定，比较了空载体和表达HBZ的HeLa细胞系，并使用HBZ上的C末端6xHis表位标签进行免疫沉淀[46]。在近端峰区观察到HBZ的显著富集，但在远端峰区没有观察到（图3B）。由于染色质环境在HeLa细胞和HTLV-1感染的T细胞之间可能有所不同，因此我们使用表达HBZ的转导SLB-1细胞进行了额外的ChIP测定，并带有C末端6xHis标签进行免疫沉淀。与阴性对照脱靶位点相比，在近端和远端峰均观察到HBZ富集增加两倍（图3C）。该结果与计算机分析一致。
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图3. HBZ将MYOF基因与c-Jun和JunB结合。
（A）HBZ与ATL细胞系KK1中MYOF基因内的两个位点结合。HBZ、表观遗传标记、H3K27ac 和 KK1 细胞中 MYOF 位点的对照 （IgG） 富集峰显示在 IGV 浏览器中。基因组坐标基于NCBI36 / hg18组件。数据来自已公布的ChIP-Seq数据集（GEO加入号GSE94732 [56]）。（B）HBZ与HeLa细胞中的近端峰结合。该图显示了使用空载体 （pcDNA） 和 HBZ（6x His C 末端标签）表达 HeLa 细胞的三种独立 ChIP 测定的平均值。图中显示了脱靶位点（距基因末端 1，796 bp）以及远端和近端峰相对于 TSS 的 HBZ 富集水平;* 第<0.05页。（C）HBZ结合SLB-1细胞的远端和近端峰。该图显示了相对于脱靶位点（设置为 1）的倍数富集，这些富集来自三个独立的 ChIP 测定，使用 SLB-1 细胞转导以表达具有 C 末端 6x His 标签的 HBZ;* p<0.05， *** p<0.001.（D）和（E）JunB和c-Jun富集在ATL-2细胞的远端和近端峰。（F）和（G）JunD和MafG在HBZ结合峰处未富集。图表显示了使用 ATL-2 细胞的五个（D 和 E）到三个（F 和 G）独立 ChIP 测定的平均值;* p<0.05， *** p<0.001， n.S：不重要。在脱靶位点、远端和近端MYOF峰以及WEE1启动子（WEE1-AP1）的AP1位点分析因子富集。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011202.g003
发现对应于近端和远端峰的DNA序列包含全部或部分AP-1结合位点（S4图中的序列）。已知HBZ与AP-1成员相互作用，例如c-Jun，JunB和JunD [33，58，59]。然而，当与HBZ相关时，这些因子通常被抑制与AP-1位点结合和激活转录[32]。相反，由HBZ和小Mafs形成的复合物结合母马，母马含有核心AP-1结合位点序列并激活转录[34]。为了确定这些细胞bZIP因子中的任何一个是否与两个HBZ结合峰中的任何一个相关，我们在ATL-2细胞中进行了ChIP测定。有趣的是，我们在远端和近端峰观察到JunB和c-Jun的显着富集（分别为图3D和3E）。尽管这些位点的JunD富集水平似乎高于脱靶位点，但数值并不显著（图3F）。该结果可能受到抗体效率的影响;JunD抗体产生的阳性对照信号（WEE1-AP1）低于其他抗体。在远端或近端峰均未观察到可检测到的MafG富集（图3G）。这些结果表明，HBZ与至少c-Jun或JunB在MYOF基因上一起招募或合作。
HBZ通过招募p300 / CBP激活MYOF转录
对来自Nakagawa研究的GEO ChIP-seq数据集的分析还显示，组蛋白H3赖氨酸27乙酰化（H3K27ac）的富集峰与近端和远端HBZ结合峰重叠[56]（图3A）。H3K27被p300/CBP乙酰化[60，61]，与HBZ形成高亲和力相互作用[37，38]。鉴于这些信息，我们比较了表达HBZ的HeLa细胞与携带空表达载体的细胞中的共激活剂富集。与这些细胞近端峰处HBZ的富集一致，ChIP测定显示，在HBZ存在下，p300和CBP在该位点均富集（分别为图4A和4B）。这些结果表明，HBZ将p300 / CBP募集到MYOF基因中。
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图4. HBZ通过招募p300 / CBP激活MYOF转录。
p300 （A） 和 CBP （B） 结合表达 HBZ 的 HeLa 细胞中的近端 MYOF 峰。图表显示了使用空载体 （pcDNA） 和表达 HBZ 的 HeLa 细胞的三种独立 ChIP 测定的平均值。图中显示了脱靶位点以及远端和近端峰处的p300和CBP富集水平;* 第<0.05页。（C）siRNA介导的p300和CBP耗竭。用靶向p300和CBP（p300 / CBP）或脱靶siRNA（CT）的siRNA转染HeLa细胞。使用针对p50，CBP和β-肌动蛋白的抗体通过蛋白质印迹分析全细胞提取物（300μg）。（D）p300和CBP的耗竭降低了HBZ介导的MYOF表达。该图显示了来自四个独立实验的平均值的qRT-PCR结果，其值归一化为转染siRNA CT的空载体克隆（pcDNA）（设置为1）;** 第<0.01页。（E）抑制p300 / CBP KAT活性消除了HBZ介导的MYOF转录激活。表达HBZ或携带空载体（pcDNA）的HeLa细胞用A485（10μM）或载体（DMSO）处理3小时。该图显示了来自四个独立实验的 qRT-PCR 结果的平均值，其值归一化为用 DMSO 处理的空载体克隆 （pcDNA）（设置为 1）;* 第<0.05页，**<0.01页。抑制p300 / CBP KAT活性可降低（F）HTLV-1感染的T细胞系（TL-Om1，ATL-2和SLB-1）和（G）HTLV-1永生化原代人T细胞克隆（CJ4和C6）中的MYOF转录。用A485（10μM）或载体（DMSO）处理指定的细胞系/克隆3小时。图表显示三个 （F） 和两个 （G） 独立实验的 qRT-PCR 结果平均，每个细胞系/克隆的 A485 值归一化为 DMSO（设置为 1）的值;* p<0.05， *** p<0.001.
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011202.g004
为了测试p300 / CBP在HBZ转录激活MYOF中的作用，我们用靶向p300和CBP的siRNA混合物处理空载体和表达HBZ的HeLa细胞（图4C）。敲低共激活剂显着降低了表达HBZ的细胞中的MYOF mRNA水平，同时对空载体细胞中的转录本水平没有显着影响（图4D）。为了评估p300 / CBP KAT活性对转录激活的贡献，我们用A-485处理表达HBZ和空载体HeLa细胞。该化合物是p300/CBP KAT活性的特异性抑制剂[62]。在敲低共激活剂的同时，A-485处理显着降低了表达HBZ的细胞中的MYOF mRNA水平，而不影响空载体细胞中的转录水平（图4E）。A-485治疗还降低了HTLV-1感染的T细胞系以及最近永生化的HTLV-1感染T细胞克隆中的MYOF mRNA水平（分别为图4F和4G）。总之，这些结果表明HBZ通过募集p300 / CBP激活MYOF转录。
肌磷增强HTLV-1感染
对于包膜病毒，内体运输是将病毒包膜和/或刺突蛋白结合到病毒粒子组装中的重要过程[49，50]。囊泡运输也可能通过病毒学突触参与感染[63]，这是HTLV-1使用的一种机制[12]。这些前提促使我们测试MyoF是否有助于HTLV-1感染性。我们使用了最近设计的MyoF抑制剂WJ460，它破坏了MyoF与细胞内囊泡的正常关联[41]。在分析病毒感染性之前，我们确定HTLV-24感染的T细胞暴露于1.0-2μM的WJ1的460小时没有细胞毒性（S5图）。由于HTLV-1的T细胞感染主要通过直接的细胞间接触发生[12]，我们将DMSO（载体对照）和WJ460处理的HTLV-1感染的T细胞与靶向报告细胞共培养（图5A）。使用的两种报告细胞系是CHOK1-Luc和Jurkat pminLUC-vCRE，它们都含有驱动荧光素酶基因转录的启动子，这些基因转录被HTLV-1 Tax蛋白反式激活（仅在转移的病毒粒子整合后表达;[31，64]）。对于Jurkat pminLUC-vCRE报告细胞，24h共培养时间在荧光素酶活性峰值范围内（S6A图）。在使用CHOK1-Luc靶细胞和ATL-2或SLB-1效应细胞的测定中，与DMSO处理相比，WJ460处理导致报告细胞荧光素酶活性显着降低（分别为图5B和S6B）。当与WJ1处理的SLB-460或ATL-1效应细胞共培养时，用Jurkat pminLUC-vCRE T细胞替换CHOK2-Luc靶细胞也导致荧光素酶活性显着降低（分别为图5C和S6C）。重要的是，HTLV-1感染的C8166/45细胞表达Tax但不产生病毒粒子[65]，没有激活靶细胞中的荧光素酶转录（图5D），证实了荧光素酶活性是由HTLV-1感染诱导的。除了分析这些长期建立的HTLV-1感染T细胞系作为效应细胞外，我们还测试了最近被HTLV-1永生化的原代人T细胞[66]。使用这些最近建立的效应细胞，WJ460的处理在与Jurkat pminLUC-vCRE细胞共培养时也导致荧光素酶活性显着降低（图5E和S6D）。
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图5. MyoF增强HTLV-1感染。
（A）流程图显示了使用CHOK1-Luc或Jurkat-pminLUC-vCRE细胞作为靶细胞的共培养/感染测定程序。（B）抑制MyoF可减少HTLV-1感染。ATL-2细胞在与CHOK460-Luc细胞共培养之前用DMSO或WJ200（1nM或1μM）处理。（C）SLB-1细胞在与Jurkat-pminLUC-vCRE细胞共培养之前用DMSO或1μM WJ460处理。（D）C8166/45和SLB-1细胞（均为高Tax表达）和TL-Om1细胞（无Tax表达）与Jurkat-pminLUC-vCRE细胞共培养。（E）HTLV-1永生化的原代人T细胞克隆（C13）在与Jurkat-pminLUC-vCRE细胞共培养之前，用DMSO或1μM WJ460处理。图（B），（C）和（D）显示了单个实验的每个条件下至少三次重复的平均荧光素酶测定结果，并且代表三个独立实验;* p<0.05， *** p<0.001.图（E）显示了单个实验的每个条件下三次重复的荧光素酶测定结果平均值，代表两个独立实验;** 第<0.01页。（F）敲低MyoF表达可减少HTLV-1感染。控制中的MyoF表达（GFP）和MyoF敲低ATL-2和SLB-1细胞。使用针对MyoF和β-肌动蛋白的抗体通过蛋白质印迹分析全细胞提取物（50μg）。（G）稳定表达靶向GFP（阴性对照）或MYOF mRNA的shRNA的SLB-1细胞与CHOK1-Luc细胞共培养。（H）稳定表达靶向GFP（阴性对照）或MYOF mRNA的shRNA的SLB-1细胞与Jurkat-pminLUC-vCRE细胞共培养。（I）稳定表达靶向GFP（阴性对照）或MYOF mRNA的shRNA的ATL-2细胞与Jurkat-pminLUC-vCRE细胞共培养。图表显示荧光素酶测定结果平均来自单个实验的每个感染条件的至少三个重复，并且代表至少三个独立实验;** p<0.01， *** p<0.001.
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011202.g005
为了验证靶细胞荧光素酶活性的降低是由于抑制MyoF，我们在SLB-1和ATL-2细胞中建立了靶向MYOF转录本（shMYOF）的shRNA的稳定表达，或者作为对照，靶向GFP（shGFP）的shRNA（图5F）。与WJ460处理一致，SLB-1细胞中MyoF的敲低导致CHOK1-Luc和Jurkat pminLUC-vCRE靶细胞中荧光素酶活性显着降低（图5G和5H）。类似地，ATL-2细胞中MyoF的敲低降低了Jurkat-pminLUC-vCRE和CHOK1-Luc靶细胞中的荧光素酶活性（图5I和S6E图）。对于这些测定，我们验证了shMYOF和shGFP细胞在共培养时间段内在增殖方面没有显着差异，并且在共培养之前照射效应细胞以损害增殖时获得了类似的结果（S6F和S6G图）。总体而言，这些数据表明MyoF对HTLV-1感染有积极贡献。
MyoF调节Env的细胞内丰度
MyoF在内体循环中的作用以及伴随调节受体稳定性[42，45，67，68]意味着它可能会影响组成病毒粒子的某些HTLV-1蛋白的稳定性和细胞内运输。我们首先开始使用WJ460来抑制MyoF，开始研究这种可能性。在用WJ2处理的ATL-460细胞中，SU的水平降低，而检查的其他病毒蛋白的水平保持相对稳定，包括Env前体（Pr），gp62的水平（图6A和6C）。WJ460对SU的影响在SLB-1细胞中重现（图6B和6C）。WJ460处理没有增加gp62水平的观察表明，SU的降低不是由于抑制弗林介导的前体裂解。证实这些结果，MyoF的敲低也导致SU的降低（图6D和6E）。
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图6. MyoF调节HTLV-1 Env的细胞内丰度。
（A）抑制MyoF降低SU水平（gp46）。用DMSO或WJ2（460nM或200μM）处理ATL-1细胞24小时。使用抗MyoF，β-肌动蛋白和病毒蛋白Tax，Gag p50，Gag p55和SU / Pr的抗体通过蛋白质印迹分析来自未感染CEM和处理过的细胞的全细胞提取物（19μg）。 全细胞提取物（税2μg;其他1μg）使用针对β-肌动蛋白和病毒蛋白Tax和SU / Pr的抗体通过蛋白质印迹进行分析。 （C）该图显示了Pr（gp1）和SU（gp460）的条带强度的定量，标准化为ATL-24和SLB-100细胞的三个和四个独立实验中平均的β-肌动蛋白的带强度， 分别。误差线显示标准偏差;* 下午<50.62， ** 下午<46.2.（D）敲低MyoF表达会降低SU（gp1）的水平。从稳定表达靶向GFP（阴性对照）或MYOF mRNA的shRNA的SLB-0细胞制备全细胞提取物，并使用针对MyoF，β-肌动蛋白和病毒蛋白Tax，Gag p05和SU / Pr的抗体通过蛋白质印迹分析每个细胞系的0μg。 （E）该图显示了Pr（gp01）和SU（gp46）的条带强度的定量，标准化为来自三个独立实验的β-肌动蛋白的平均带强度。误差线显示标准偏差;** 第<1.50页。（F）HEK19T细胞中MyoF与Env的异位共表达增加了SU（gp62）丰度。单元格 （46 x 06）转染pcDNA-GFP-HA-MyoF（3μg）和pCMV-HTLV-1-Env（1μg）。Env与来自879 μg全细胞提取物（WCE）的琼脂糖凝集素与琼脂糖珠（P-凝集素）结合，并与50 μgWCE一起使用MyoF抗体和SU / Pr进行蛋白质印迹分析。 （G）抑制HEK293T细胞中与Env异位共表达的MyoF会降低SU / gp46丰度。单元格 （1 x 106）转染pcDNA-GFP-HA-MyoF（3μg）和pCMV-HTLV-1-Env-Flag-Myc（3μg）表达载体，并用DMSO或WJ460（1μM）处理24小时。Env与来自768 μg全细胞提取物（WCE）的琼脂糖珠（P-凝集素）结合的晶状体凝集素共沉淀，并使用针对Env的MyoF、β-肌动蛋白和Flag表位标签的抗体通过蛋白质印迹法与50 μgWCE一起进行分析。（H）HEK293T细胞中MyoF与Env的异位共表达增加了TM（gp21）丰度。单元格 （1 x 106）转染pcDNA-GFP-HA-MyoF（3μg）和pCMV-HTLV-1-Env-Flag-Myc（3μg）。Env与来自1190 μg全细胞提取物（WCE）的琼脂糖珠（P-凝集素）结合的晶状体凝集素共沉淀，并使用MyoF抗体通过蛋白质印迹法与50 μgWCE一起进行分析，以及Env的Flag和Myc表位标签。
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为了进一步分析MyoF对Env丰度的影响，我们使用了不表达MyoF的HEK293T细胞。仅用Env表达载体转染这些细胞会导致SU的蛋白质印迹信号较弱，通过共转染MyoF表达载体而显着增加（图6F）。在这些实验中，SU通过与凝集素-琼脂糖珠结合而富集，因为已知未感染细胞中成熟形式的Env（SU-TM）的异位表达较低[26]。与使用HTLV-1 T细胞系的结果一致，WJ460降低了与Env和MyoF表达载体共转染的HEK293T细胞中的SU水平（图6G）。鉴于没有可用的TM抗体，我们还通过在细胞质结构域内插入Myc标签来检查MyoF对TM丰度的影响[29]。与SU一样，在MyoF存在下TM水平升高（图6H）。总之，这些结果支持MyoF在调节成熟形式的Env丰度方面的作用。
MyoF限制Env的溶酶体降解
MyoF和SU不是从全细胞提取物中共免疫沉淀的，这表明它们不相互作用。因此，我们研究了MyoF对内体区室的一般影响影响Env细胞内运输的可能性。为了验证这一假设，我们首先探测了内体区室各种标志物的变化，因为一些标志物的水平似乎受到其他细胞类型中MyoF的调节[48，52，69]。我们发现WJ460对MyoF的抑制没有显着影响所检查的任何标志物（图7A）。然而，稳定的shRNA介导的MyoF敲低导致洞穴蛋白-1水平降低（Cav1;图7B）。这一观察结果与先前显示MyoF对Cav1水平有正向调节的研究一致[48，69]。Cav1是洞穴的必需结构蛋白，洞穴是可发生内吞作用的质膜内陷[70]。虽然Env的内吞作用被认为是通过网格蛋白依赖性机制发生的[27]，但该过程可能单独涉及受MyoF影响的洞穴蛋白依赖性机制。为了评估MyoF是否影响Env的内吞作用，我们使用流式细胞术比较了SLB-1 shMYOF和shGFP细胞表面的SU水平。令人惊讶的是，我们没有观察到表面SU水平的显着差异（图7C;识别SU不同表位的单独抗体产生了相同的结果）。同样，我们没有检测到DMSO与WJ460-teated SLB-1细胞表面的SU差异。这些结果表明，MyoF不影响Env的内吞作用。
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图 7. MyoF限制Env的溶酶体降解。
（A）WJ1治疗后HTLV-460感染细胞中内体蛋白的水平。SLB-1细胞用DMSO或1μM WJ460处理24小时。使用针对指定蛋白质的抗体通过蛋白质印迹分析全细胞提取物（25至50 μg）。（B）敲低MyoF表达降低洞穴蛋白-1（Cav1）的水平。从稳定表达靶向GFP（阴性对照）或MYOF mRNA的shRNA的SLB-25细胞制备全细胞提取物（50至1μg），并使用针对指定蛋白质的抗体通过蛋白质印迹进行分析。（C）MyoF表达的敲低不影响细胞表面的SU（gp46）水平。稳定表达靶向GFP（阴性对照）或MYOF mRNA的shRNA的SLB-1细胞用抗SU / Pr的一抗标记，然后用APC偶联的二抗标记，固定并通过流式细胞术进行分析。直方图代表两个独立实验，显示相对细胞表面标记如下：单独二抗（CT）和SU标记的shGFP细胞，分别为浅灰色和浅蓝色;单独二抗（CT）和SU标记的shMYOF细胞，分别为深灰色和深蓝色。（D）溶酶体蛋白酶的抑制部分恢复用WJ46处理的HTLV-1感染细胞中SU（gp460）的细胞内水平。SLB-1细胞用DMSO或1μM WJ460处理，有或没有5mg / mL亮肽素（L）和25μM E64D（E）24小时。使用针对β-肌动蛋白和SU / Pr的抗体通过蛋白质印迹分析全细胞提取物（50 μg）。 （E）敲低MyoF表达增加SU（gp46）与溶酶体的关联。将稳定表达靶向GFP（阴性对照）或MYOF mRNA的shRNA的SLB-1细胞固定，透化，分别用Alexa Fluor 488-和Alexa Fluor 594偶联抗体标记SU / Pr和LAMP-2，并通过共聚焦显微镜进行分析。图像显示了由3.0μm光学切片组成的z堆栈构建的57D投影。该图显示了SU重叠LAMP-2比例的曼德斯共定位系数（MCC）;** 第<0.01页。（F）抑制内体运输可减少HTLV-1感染。SLB-1细胞用DMSO，10μM EGA，10μM真空蛋白-1（Vac-1）或1μM阿匹莫德（Api）处理4小时，然后与CHOK1-Luc细胞共培养。该图显示了单个实验的每个条件下三次重复的平均荧光素酶测定结果，代表三个独立实验;** 第<0.01页。
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Env的细胞质暴露区域缺乏通过泛素-蛋白小体途径降解所需的赖氨酸残基，表明Env周转是通过溶酶体降解发生的。事实上，在溶酶体中已经发现了逆转录病毒Env蛋白[71，72]。这些观察结果使我们假设MyoF通过将Env运输限制在溶酶体来调节Env丰度。已有报道称MyoF依赖性凌乱-2和胰岛素样生长因子1受体的运输存在类似机制[43，45]。为了验证我们的假设，我们用溶酶体蛋白酶抑制剂亮肽素和E-460补充了WJ1处理的SLB-64细胞，发现蛋白酶抑制剂部分恢复了SU的水平（图7D）。使用ATL-2细胞获得类似的结果（S7图）。与这些数据一致，在SLB-2 shMYOF细胞中，Env与溶酶体标志物LAMP-1的重叠程度高于shGFP细胞（图7E）。虽然所使用的抗体可识别gp62和SU，但与LAMP-2相关的Env预计主要代表SU。这一前提与MyoF敲低或功能抑制对gp62前体水平没有显着影响是一致的。因此，这些总体结果表明MyoF减少了SU向溶酶体的运输以进行降解。
然后，我们分析了晚期内体运输抑制剂对病毒感染的影响。SLB-1细胞用单个抑制剂处理，洗涤，然后与CHOK1-Luc靶细胞共培养。细胞靶标目前未知的抑制剂EGA影响包括低pH囊泡（如内溶酶体和溶酶体）的运输[73]。抑制剂阿匹莫德和空泡素-1靶向磷酸肌醇激酶PIKfyve[74，75]，对内体运输产生更广泛的影响，并延伸至包括MVBs的运输[76，77]。虽然已知MVB将货物引导至溶酶体，但也将货物引导至反式高尔基体网络和内吞回收室[78]。我们发现，与用DMSO处理的细胞相比，用EGA处理的SLB-1细胞在感染方面没有显着差异;然而，用vauolin-1或apilimod处理的细胞显示出感染性的显着降低（图7F）。这些数据表明，通过效应细胞中的MVB进行内体运输对HTLV-1感染很重要。
MyoF 增强 HTLV-1 感染的 T 细胞粘附
HTLV-1感染主要通过效应T细胞和靶细胞之间的接触发生，可诱导病毒学突触的形成，病毒粒子通过该突触转移[12]。诱导病毒学突触需要效应细胞上的ICAM-1与靶细胞上的LFA-1结合[13]。由于已知MyoF调节受体回收，我们测试了它是否影响HTLV-1感染T细胞表面ICAM-1的丰度。表面标记细胞的流式细胞术分析未显示SLB-1 shGFP和shMYOF细胞之间的ICAM-1水平存在显着差异（图8A）。
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图8. MyoF增强HTLV-1感染的T细胞粘附，而不影响ICAM-1的细胞表面丰度。
（A）MyoF表达的敲低不影响细胞表面ICAM-1的水平。稳定表达靶向GFP（阴性对照）或MYOF mRNA的shRNA的SLB-1细胞用抗ICAM-1抗体标记，然后用FITC偶联的二抗标记，固定并通过流式细胞术进行分析。直方图显示相对细胞表面标记如下：单独二抗（CT）和ICAM-1标记的shGFP细胞，分别为浅灰色和浅蓝色;单独二抗（CT）和ICAM-1标记的shMYOF细胞，分别为深灰色和深蓝色。（B）敲低或抑制MyoF会降低与LFA-1表达无关的CHO细胞的粘附。流程图显示了使用 CHO 或 CHO-LFA-1 贴壁细胞的共培养/粘附测定程序。（C）稳定表达shGFP或shMyoF的HTLV-1感染细胞对贴壁细胞的粘附测定。该图显示了用DMSO或1μM WJ1预处理的SLB-460细胞或稳定表达靶向GFP（阴性对照）或MYOF mRNA的shRNA的SLB-1细胞与CHO（灰色）或CHO-LFA1（黑色）细胞的结合。值是一个实验中三个重复的平均值，代表三个独立实验;* <0.05， ** <0.01， *** p<0.001.
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011202.g008
另外，我们研究了MyoF是否有助于HTLV-1感染的T细胞的一般粘附特性。在这些实验中，将用荧光标记物（钙黄绿素AM）标记的SLB-1细胞添加到贴壁CHO或CHO-LFA-1细胞上。后者是通过稳定共转染整合素β2（CD18）和αL（CD11a）的表达载体建立的，这些载体形成LFA-1异二聚体[31]。共培养后，通过洗涤去除未结合的T细胞，裂解剩余细胞并分析荧光（图8B）。令人惊讶的是，我们发现MyoF的抑制或敲低显着损害了细胞粘附，而与靶细胞上的LFA-1表达无关（图8C）。总之，这些结果表明MyoF在细胞粘附中起积极作用，但该功能不涉及通过ICAM-1 / LFA-1的粘附。
MyoF增加细胞外和病毒粒子相关环境水平
鉴于MyoF对Env运输和Env细胞内丰度的影响，我们测试了MyoF敲低是否影响Env掺入组装病毒粒子中。这种效应将反映在与MyoF敲低后产生的无细胞病毒粒子相关的SU水平的变化上。然而，在分析病毒粒子之前，我们首先测试了SLB-1 shGFP和shMYOF细胞培养基中SU总丰度的差异。来自过滤培养物上清液的TCA沉淀蛋白的蛋白质印迹分析显示，shMYOF沉淀物中的SU低于shGFP沉淀物（图9A）。然后，我们比较了通过超速离心敲低细胞过滤培养上清液获得的SU水平相关的无细胞病毒粒子。与培养基的一般分析平行，shMYOF标本中的SU水平较低，而Gag p19的水平相对保持不变（图9B）。通过ELISA定量Gag p19显示，在SLB-1 shGFP和shMYOF细胞的培养基中，以及在用DMSO和WJ1处理的SLB-460细胞的培养基中，该蛋白的水平相似（图9C）。这些结果表明，敲低或抑制MyoF导致与游离病毒相关的Env减少。
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图 9. MyoF增加总细胞外和病毒粒子相关SU（gp46）的水平。
（A）MyoF表达的敲低降低了HTLV-1细胞培养基中SU的总体水平。将来自稳定转染以 GFP 或 MYOF mRNA 的 shRNA 的 SLB-1 细胞培养基中的 TCA 沉淀蛋白分成相等的组分，并使用抗 SU/Pr 抗体通过蛋白质印迹分析（上图），并分别通过 SDS-PAGE 后的考马斯蓝染色进行分析（下图）。SLB-1细胞的全细胞提取物作为阳性对照。（B）敲低MyoF表达会降低无细胞HTLV-1病毒粒子中SU的水平。使用针对SU / gp1和Gag p46的抗体过滤，超速离心并通过蛋白质印迹分析来自稳定表达靶向GFP或MYOF mRNA的shRNA的SLB-19细胞培养基;* 表示来自血清的非特异性条带。（C）MyoF的敲低或抑制不影响细胞释放的病毒水平。通过ELISA分析来自稳定表达靶向GFP或MYOF mRNA的shRNA的SLB-1细胞的澄清培养基，以及用DMSO或1μM WJ2处理1小时的SLB-460和ATL-24细胞，以量化Gag p19的水平。该图显示了三个重复的平均值。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011202.g009
讨论
病毒蛋白HBZ作为转录因子调节HTLV-1前病毒的转录以及细胞基因的表达[32]。我们之前报道过HBZ增加HTLV-1感染细胞中ICAM-1的表达以提高感染效率[31]。ICAM-1是细胞接触介导的病毒感染机制的核心，因为它促进效应细胞和靶细胞之间的粘附，并促进病毒学突触的形成[13，18]。在目前的研究中，我们提供了HBZ诱导MyoF表达的证据，这也有助于感染。这种效应与MyoF在调节内体运输中的作用相关，这影响HTLV-1 Env的细胞内丰度和与病毒颗粒相关的Env水平。
HBZ增加了HTLV-1感染的T细胞和稳定表达HBZ的HeLa细胞中的MyoF表达。我们的数据表明，HBZ通过与基因内的一个或两个位点（细胞类型依赖性）结合来激活MYOF转录。两个HBZ结合位点都远离转录起始位点（TTS）：一个~19 kb下游（近端峰）和另一个~103 kb下游（远端峰）的MYOF亚型a和b的TSS。两个峰的DNA序列均含有全部或部分TPA响应元件（TRE），这些元件被AP-1二聚体识别，在本研究中，与JunB和c-Jun作为HBZ潜在伴侣的鉴定相关[33，58]。事实上，已知HBZ与Jun蛋白形成异二聚体，其中还包括JunD，JunD在HBZ结合峰内没有显着富集[32]。我们使用的抗JunD抗体虽然被指定为与ChIP兼容，但可能不适合与HTLV-1感染的T细胞一起使用，也不适合我们的ChIP工作流程。
c-Jun和JunB与HBZ在MYOF基因上的共富集很有趣，因为到目前为止，HBZ与Jun蛋白的相互作用通常被认为会抑制TRE的转录[58]。事实上，HBZ的基本区域缺乏负责TRE结合的经典氨基酸基序。特殊情况下，HBZ和JunD形成的复合物可以与Sp1结合以激活转录[59]。在这种复合物中，Sp1与DNA结合，HBZ和JunD通过蛋白质-蛋白质相互作用而不是与DNA的相互作用结合[35，36]。来自UCSC基因组浏览器的数据（http://genome.ucsc.edu;[79]）在HBZ结合峰序列中未显示Sp1富集或Sp1结合位点（GC盒），表明MYOF基因转录的激活不是通过由Sp1（Jun成员）和HBZ组成的复合物发生的。
与HBZ和Jun蛋白之间形成的异二聚体不同，HBZ和小Maf之间形成的异二聚体已被证明可以结合DNA[33]。事实上，我们之前证明HBZ通过在位于HMOX1启动子内的MARE上与小MafMaf形成复合物来激活HMOX1转录[34]。有趣的是，母马的核心序列对应于 TRE。因此，TRE中的特定排列以及TRE周围的特定序列可能有利于由HBZ和Jun蛋白之一组成的异二聚体的结合。与这一假设一致，最近的一项计算机分析显示，TRE样序列是在ATL细胞基因组中富含HBZ的区域中发现的主要（已知）基序[80]。此外，HBZ主要富集在远端增强子区域，大多数富集位点位于TSS的10至100 Kb之间[80]，这些距离与MYOF基因内的HBZ富集一致。确定由HBZ和Jun蛋白之一组成的异二聚体是否能够结合特定的DNA元件将是有趣的。在解决这个问题时，对应于MYOF基因的HBZ结合位点的序列可能是有用的。
我们的结果表明，HBZ将p300和/或CBP募集到MYOF基因中对于转录激活至关重要。鉴于HBZ在HTLV-1感染的T细胞中的组成性表达，我们仅限于通过比较稳定表达HBZ的细胞与携带空载体的细胞来评估HeLa细胞中的p300 / CBP募集。与HBZ一样，p300和CBP仅在表达HBZ的HeLa细胞的近端峰富集。然而，HBZ很可能将共激活剂募集到HTLV-1感染T细胞的近端和远端峰。该前提是基于组蛋白H3 K27乙酰化峰与两个HBZ结合峰重叠的观察结果。H3K27ac由p300/CBP KAT活性特异性建立，并标记转录活性增强子[60，61]。此外，p300和CBP在其KAT活性中可作为招募其他转录调节因子的支架[39]。在p300 / CBP的这两个一般特性中，KAT活性似乎为激活MYOF转录提供了主要贡献。事实上，在HeLa细胞中，p300 / CBP KAT活性的选择性抑制剂A-485几乎完全消除了HBZ对MYOF转录的影响，而在HTLV-1感染的T细胞中，A-485显着降低了MYOF mRNA水平。与这些观察结果一致，基于增强子的p300/CBP乙酰化组蛋白和转录调节因子对于RNA聚合酶II（RNAPII）预引发复合物的形成以及克服RNAPII的启动子近端停顿至关重要[61，81]。
除MYOF外，其他影响病毒复制周期或影响病毒发病机制的细胞基因很可能通过招募p300 / CBP被HBZ激活。迄今为止，这些基因包括有助于建立ATL细胞基因表达谱的BATF3[56]、增加细胞迁移的CCR4，目前在治疗ATL患者的临床试验中靶向[82]，DKK1，促进ATL相关高钙血症和骨病变形成[46，83]，以及维持HTLV-3感染细胞T-reg样表型的FOXP1[84].我们认为，靶向p300 / CBP和HBZ之间的相互作用将是防止这些基因表达失调的有效策略，从而减少HTLV-1的细胞间传播和与感染相关的致病作用。
在HTLV-1感染的T细胞中，MyoF的功能抑制或敲低降低了感染性。这种效应与细胞内Env和与病毒颗粒相关的Env水平的降低有关，但令人惊讶的是，它并没有影响细胞表面的Env水平。流式细胞术在完整细胞表面检测到的Env可能主要由无病毒的Env组成，而不是掺入病毒颗粒中的Env。事实上，对于HTLV-1，病毒颗粒仍然与细胞外蛋白/碳水化合物基质中的细胞相关[15]，这可能会阻碍抗体结合[85]。细胞表面的无病毒Env对应于蛋白质成熟形式的同源三聚体。该Env池经历快速内吞作用[28]，这可能代表一种免疫逃避策略或避免HTLV-1 Env的高度梭生能力引起的合胞体形成的机制。与大多数逆转录病毒一样，HTLV-1 Env的跨膜亚基（TM）的细胞质部分含有YXXΦ基序（氨基酸479-482），参与运输和内吞作用[27，86]。Φ表示具有块状疏水侧链的氨基酸，对于HTLV-1 Env，它是一种异亮氨酸。这个图案，以及 Y476，介导与衔接蛋白2结合以形成网格蛋白依赖性内吞作用[27]。虽然MyoF在内吞作用中起作用，但它主要参与洞穴蛋白依赖过程48]。因此，预计MyoF不会对细胞表面无病毒Env的稳态水平产生深远影响。
预计MyoF也不会影响Env的初始处理。HTLV-1 env mRNA被翻译成gp62多肽前体，在通过反式高尔基体网络运输过程中经过蛋白水解切割以产生SU和TM[19]。当MyoF在功能上受到抑制或敲低时，MyoF对Env成熟的任何影响都应反映为gp62水平的变化，而本研究并非如此。
我们的结果表明，MyoF限制了Env的溶酶体降解，但不是通过与病毒蛋白的相互作用。我们假设MyoF通过其对内体隔室的一般影响来调节Env运输。MyoF包含一个用于插入细胞内膜的短C端跨膜结构域和一个大的细胞质区域，其中包含七个C2结构域，指定为C2A至C2G（按N至C端定位排序）等结构域[40]。C2结构域存在于多种蛋白质中，包括Ferlin家族的其他成员，并且通常参与磷脂和/或蛋白质结合[87]。与本研究相关的是，MyoF的C2B结构域与Epsin15同源结构域蛋白1和2（EHD1和EHD2）相互作用[42，88]。这些蛋白质在细胞内膜重塑中起作用，在货物运输所需的膜网络中囊泡的切割中起重要作用[89]。有趣的是，通过内吞再循环室发生的受体缓慢循环受到敲低MyoF或EHD1中MyoF结合结构域缺失的阻碍[42，90]。MyoF对Env稳定性影响的一种可能的解释是，在内吞作用并掺入早期内体后，Env进入内吞回收室（ERC）。然后从ERC Env经历缓慢的回收到病毒组装的景象。考虑到这一过程，MyoF的丧失或功能抑制会损害Env向内体回收室的运输或损害Env从该室的缓慢回收。这种效应可能导致Env被重定向到溶酶体进行降解。
总之，我们提出了一个暂定模型，绘制了HBZ如何通过激活MyoF表达来增强HTLV-1感染（图10）。我们推测，当其表达被HBZ激活时，MyoF将Env从溶酶体降解途径转移到缓慢的内体循环途径，这可能促进Env结合到组装病毒粒子中。需要进一步的工作来测试这个模型。
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图 10. MyoF介导的HTLV-1感染T细胞中Env运输的拟议模型。
通过其激活域（AD），HBZ将p300 / CBP招募到MYOF基因增强子中以激活转录。Env通过反式高尔基体网络（TGN）被加工成成熟形式，并掺入质膜中。Env中的YXXΦ基序介导网格蛋白依赖性内吞作用和Env向溶酶体的运输。然而，MyoF的存在导致Env被重定向到内体回收室，Env从该室输送到病毒粒子组装的部位。除MyoF外，ESSL结构域单独减少了溶酶体介导的Env降解。该图的一个组成部分是使用施维雅医学艺术公司的图片绘制的，该图片根据知识共享署名3.0未移植许可证（https://smart.servier.com）进行许可。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011202.g010
材料和方法
质 粒
pMDLg/pRRE、pRSV-Rev和pMD2.G是Didier Trono（Addgene plasmid # 12251， 12253， 12259）的礼物[91]。靶向GFP（SHC202）和MYOF（TRCN0000320396）的任务shRNA质粒来自默克西格玛。pCMV-HTLV-1-Env和pSG-Tax-He已有报道[92，93]。pcDNA-GFP-HA-MyoF是Rikinari Hanayama的礼物[94]。pCMV-HTLV-1-Env-Flag-Myc是通过在pCMV-HTLV-25-Env的PvuII位点插入丝氨酸26和半胱氨酸1之间的Flag序列，以及在YXXΦ和PDZ结合基序之间插入Myc序列来构建的，如所述[29]使用合成片段（GeneArt Gene Synthesis，Thermo Fisher Scientific）包含取代NsiI和SacII片段的Myc序列。pLJM1-EGFP是David Sabatini（Addgene plasmid # 19319）的礼物[95]。为了制造pLJM1-EGFP-HBZ-Myc-His，使用Gibson组装克隆试剂盒（新英格兰生物实验室）将pcDNA3.1-Myc-His HBZ SP1 [96]的HBZ-Myc-His序列克隆到pLJM1-EGFP的EcoRI位点。
细胞培养和细胞系的产生
Jurkat，Jurkat pminLUC-病毒CRE [31]，CEM，MOLT-4，Hut-78，ATL-2s，C10 / MJ，MT-2，MT-4和SLB-1细胞在Iscove的修饰Dulbecco培养基（IMDM）中培养。原代CD4淋巴细胞，HTLV-1永生化淋巴细胞克隆，HSB-2，Sup-T1，Myla，1185，MT-1，SP，Hut-102，TL-Om1和BxPC3细胞在罗斯威尔公园纪念研究所（RPMI）培养基中培养。HeLa克隆[46]，HEK293T，CHO，CHO-LFA-1[31]和CHOK1-Luc [64]细胞在Dulbecco的改良鹰培养基（DMEM）中培养。所有细胞均补充有10%FBS或10%胎儿动物血清（Gemini Bio-Products）和2 mM l-谷氨酰胺，100 U / ml青霉素和50μg / ml链霉素。Jurkat pminLUC-病毒CRE细胞补充1.5mg / ml G418。HeLa克隆，CHO-LFA-1和CHOK1-Luc细胞补充0.5mg / ml G418。原代淋巴细胞、淋巴细胞克隆、SP、1185和Hut-102细胞用IL-2培养。HTLV-1永生化淋巴细胞克隆如图所述[66]。原代人CD4淋巴细胞从人血沉棕黄层或白细胞还原系统锥体（分别为ZenBio或STEMCELL Technologies）中获得，并通过Ficoll-Paque PLUS培养基（GE医疗）离心纯化，然后根据制造商的说明使用CD4 T细胞分离试剂盒（干细胞技术）。分离的CD4 +淋巴细胞的一部分在涂有抗CD3和抗CD28抗体的培养孔中被激活。通过慢病毒转导建立SLB-1和ATL-2 shGFP和shMYOF细胞，具体如下。HEK293T电池（5 x 10+++6）接种在10cm培养皿中，培养过夜，然后使用磷酸钙用17μgpMDLg/pRRE、8μgpRSV-Rev、11μgpMD2.G和34μgshRNA MISSION质粒（MilliporeSigma）转染。转染后24小时用6mL补充的IMDM替换培养基，细胞再培养24小时。然后将培养基（病毒上清液）通过0.4μm聚醚砜（PES）过滤器;通过添加回293mL新鲜补充的IMDM将转染的HEK6T细胞保持在培养物中，使细胞暴露于第二轮病毒中。沉淀的SLB-1和ATL-2细胞（3 x 106）用12 ug/mL聚苯重悬于过滤的病毒上清液中。重复转导过程。将细胞培养48小时，然后补充6μg/mL（SLB-1细胞）或0.5μg/mL（ATL-2细胞）嘌呤霉素。HBZ-6x His在SLB-1细胞中的瞬时表达是通过类似的转导方法实现的，但使用44μg的pLJM1-EGFP-HBZ代替shRNA质粒。
RNA 提取、cDNA 合成和定量实时荧光定量 PCR
使用TRIzol试剂（Thermo Fisher Scientific）从细胞中提取RNA，并使用制造商描述的Revert Aid试剂盒（Thermo Fisher Scientific）或IScript（BioRad）合成cDNA。随机六聚体引物用于MYOF cDNA合成;寡核苷酸（dT）引物对MYOF效率低下，因为扩增子的近端位置远离mRNA的poly-A尾巴5'。除拷贝数测定外，寡核苷酸（dT）引物用于hbz cDNA合成，以试图反映注定要翻译的hbz mRNA，而不是保留在细胞核中的部分[97]。HBZ-S1和UBE2D2 PCR引物已有报道[46]。按所述确定hbz和税mRNA拷贝数[46]。对于每个UBE2D2 mRNA拷贝的hbz mRNA拷贝，基因特异性引物用于cDNA合成（HBZ，GCAACCACATCGCCTCCA;UBE2D2，CGTGGGCTCATAGAAAGCAGTCAA）和泛HBZ引物集用于实时荧光定量PCR[CATCGCCTCCAGCCCCCCCT（正向），GAGCAGGAGCGCCGTGAGCGCAAG（反向）]。这种方法是必需的，因为拷贝数是使用pSG-THU作为标准品[46]确定的，该标准品包含Tax、UBE2D2和pan-HBZ引物组的扩增子序列，但不包含HBZ-S1引物组的扩增子序列。对于每个UBE2D2 mRNA拷贝的税收mRNA拷贝，使用寡核苷酸（dT）引物进行税收和UBE2D2 cDNA合成。MYOF的引物是CAAGCTGATCTCCCTGCTAAA（正向）和ACCTGTCTTCATCACCTTCATC（反向）。使用iTaq通用超级混合物（Bio-Rad）和CFX Connect实时荧光定量PCR检测系统（Bio-Rad）进行实时PCR，并按所述测定相对mRNA水平[46]。使用适当实验样品的连续稀释液生成PCR板上所有引物组的标准曲线。根据所有引物和所有PCR板（分析）的所有标准曲线的汇编，包括ChIP PCR板，扩增效率范围为89–126%，相关系数范围为0.942–0.999。
细胞处理、转染和蛋白质印迹
WJ460（DMSO）购自Glixx Laboratories Inc.或MedChem Express;A-485（DMSO），vacuolin-1（DMSO）和apilimod（DMSO）是从MedChem Express购买的;EGA（DMSO），亮肽素（H2O）和胃抑素A（DMSO）是从默克购买的;E64D（DMSO）购自开曼化学。化合物以溶液形式购买或重组，并按照制造商的建议等分并储存在-20°C或-80°C。根据制造商的说明，使用alamarBlue（Bio-Rad）评估WJ460处理后的活力。根据制造商的说明使用Turbofect（赛默飞世尔科技）转染细胞，并在24小时后收获。制备全细胞提取物，并按照所述进行蛋白质印迹[98]。使用GST-KIX对HBZ的亲和富集如下所述[34]。使用的抗体如下：抗HTLV-1 Env（ARP-1578）和抗税（杂交瘤168B17-46-92）来自NIH艾滋病研究和试剂计划;已有报道抗HBZ[99];反 6x His （ab9108） 购自 Abcam;抗MyoF（HPA014245）和抗Myc（06-340）是从默克购买的;抗HTLV-1 Env gp46（1C11，sc-53890; 65/6C2.2.34，sc-57865），抗Gag p19（TP7，sc-57870）和抗β-肌动蛋白（C4，sc-47778）是从Santa-Cruz购买的;抗网格蛋白（D3C6，#4796），抗洞穴蛋白-1（D46G3，#3267），抗EEA1（C45B10，#3288），抗Rab5a（E6N8S，#46449），抗Rab7（D95F2，#9367），抗Rab11（D4F5，#5589），抗LAMP-1（D2D11，#9091）从Cell Signaling购买;抗EHD2（PA5-80576）购自赛默飞世尔科技。所有印迹均使用Pierce ECL 2（赛默飞世尔科技）进行显影，并使用台风RGB成像仪（Cytiva）进行扫描。免疫印迹定量使用ImageQuant TL v8.1（Cytiva）进行。为了在HEK46T细胞中瞬时表达时富集Env SU / gp293，用与琼脂糖珠结合的Lens Culinary 凝集素凝集素免疫沉淀全细胞提取物（载体实验室）[26]，并将磁珠重悬于SDS加载染料中。
粘附检测
将CHO和CHO-LFA1细胞以24x3接种在10孔板中5细胞/孔并培养过夜。SLB-1细胞和SLB-1 shMYOF和shGFP细胞标准化为1x106细胞/毫升;SLB-1细胞用WJ460或DMSO处理。将感染的细胞培养过夜，然后离心并重悬于PBS中至1 x 106细胞/毫升。将钙黄绿素-AM（赛默飞世尔科技）添加到感染细胞中至终浓度为2.5μM，并将细胞在37°C下孵育20m。在钙黄绿素-AM染色期间和之后，操作是在黑暗中进行的。将细胞离心并重悬于新鲜、预热、补充的 IMDM 中至 1 x 106细胞/mL，并在 37°C 下孵育 10m。然后将染色的细胞以1.6×4加入CHO和CHO-LFA-10细胞中5细胞/孔和共培养物在37°C下孵育1h。取出未附着的细胞，用PBS在37°C下摇摆5m洗涤孔三次。抽吸最终洗涤后，向每个孔中加入150 μL被动裂解缓冲液（Promega）。将细胞在机械振荡器上裂解10m。然后将裂解物转移到96孔板中，并使用Varioskan LUX及其相关的SkanIt 488.520软件（赛默飞世尔科技）在6/1nm处扫描。
小核糖核酸干扰
siGENOME SMART池M-003486-04-0005和M-003477-02-0005分别用于敲低p300和CBP，而siGENOME非靶向siRNA池#1 D-001206-13-05用作对照（Dharmacon）。在转染当天接种细胞以达到~50%汇合。根据制造商的说明，使用DharmaFECT 25 siRNA转染试剂（Dharmacon）用1 nM的siRNA转染细胞。转染后24小时更换培养基，细胞再培养48小时，然后收集总RNA和细胞。
染色质免疫沉淀 （ChIP） 测定
ChIP 测定是根据制造商的说明使用 Zymo-Spin ChIP 试剂盒（Zymo 研究）进行的，但进行了某些修改。对于p300和CBP免疫沉淀，染色质使用10 mM二琥珀酰亚胺戊二酸酯（赛默飞世尔科技）交联45m，然后与甲醛交联;对于所有其他免疫沉淀，仅使用甲醛。交联染色质使用Misonix超声仪4000进行超声处理（脉冲开启20s，脉冲关闭30s，振幅40，处理时间5m）。每个免疫沉淀反应含有5μg抗体和200μg交联超声染色质。使用的抗体如下：来自圣克鲁斯生物技术公司的抗p300（C-20，sc-585）;来自细胞信号传导技术的抗CBP（D6C5，#7389），抗JunB（C37F9，#3753）和抗c-Jun（60A8，#9165）;来自赛默飞世尔科技的抗JunD （PA1-834）;来自 Abcam 的反 MafG （ab154318）。HBZ使用抗6x His抗体（Abcam，ab6）通过其C末端9108x His标签免疫沉淀。纯化的 ChIP DNA 使用 CFX Connect 实时荧光定量 PCR 检测系统 （Bio-Rad） 在 iTaq 通用超级混合物 （Bio-Rad） 中扩增。引物序列如下：MYOF 远端-F，5'-GAGAAACTTACCAGCCGTTCT;MYOF Disatri-R， 5'- AACTACTATTATTACTTGCCTTGGG;MYOF 近端-F， 5'- CTGGCTCCTGCGTCTAATTT;MYOF 近端-R， 5'- AATGTCCTGAAGAACGACTTGA;MYOF脱靶-F，5'-加加加卡特加加加加塔;MYOF 脱靶-R， 5'-GCTCTATTCAAACGGCAACAC;WEE1-AP1-F， 5'- CCAATCGGCTTATCGGCTTAT;WEE1-AP1-R， 5'- ACAGGAGCGTGTTTAGGTATTG.使用来自 ChIP 程序的每个输入 DNA 的 5 倍连续稀释液为引物组生成标准曲线，并将其包含在每个实验板上。富集值相对于输入进行量化，如所述[100，101]。对于 6x His ChIP，MYOF 近端和远端扩增子的值归一化为脱靶扩增子的值，设置为 1。
感染检测
感染细胞（1x105）与Jurkat pminLUC病毒CRE细胞（2x105） 24 小时。在使用WJ460的实验中，用WJ460或DMSO预处理感染细胞少于24小时，然后在共培养之前用培养基洗涤两次。在使用CHOK1-Luc细胞作为靶细胞的实验中，1 x 105将细胞每孔接种在24孔板中，培养24小时，然后暴露于5 x 105感染细胞/孔1.5小时。然后用PBS洗涤孔四次以除去效应细胞，并将剩余的CHOK1-Luc细胞在补充的DMEM中再培养24小时。对于某些实验，在与靶细胞孵育之前，使用MultiRad 77 X射线辐照器照射感染细胞（350 Gy）。用 100 μL 细胞培养裂解试剂或被动裂解缓冲液 （Promega） 裂解细胞，根据总蛋白对样品进行归一化，并使用荧光素酶测定系统 （Promega） 和 GloMax 20/20 光度计 （Promega） 测量荧光素酶活性。
免疫荧光显微镜
用胃抑素A（15μg/ mL）和亮肽素（25μg/ mL）处理细胞4小时，然后洗涤并悬浮在未补充的RPMI中，并以7.2x10接种5用聚-L-赖氨酸包被的8孔μ载玻片（同上）中的细胞/腔室。蛋白酶抑制剂用于限制溶酶体中的Env降解，从而增强这些细胞器中的Env检测。将细胞在37°C下孵育15m，然后用冷PBS（137mM NaCl，2.7mM KCl，3mM Na2高原油4和 1.5 mM KH2采购订单4）/4%多聚甲醛在冰上30m。用PBS洗涤细胞，透化并在室温下用PBS / 0.1%皂苷/ 5%山羊血清封闭1h。然后用Alexa Fluor 1偶联抗LAMP-50（H594B2，Santa Cruz Biotechnology，sc-4 AF4）和Alexa Fluor 18822偶联HTLV-594 gp488（1C46，Santa Cruz Biotechnology，sc-1 AF1）的53890：488抗体稀释液在PBS / 0.1%皂苷/ 1%BSA中在4°C下过夜。 然后用PBS洗涤细胞并用ibidi封片剂覆盖。使用LSM 700显微镜（蔡司）通过共聚焦显微镜获取荧光图像，并使用斐济分析图像（ImageJ，版本1.53t）。具体来说，掩模用于将细胞定义为感兴趣区域（ROI）并显示细胞寄宿者。掩模是通过两个通道对最大强度求和的阈值调整Z投影建立的。使用JaCoP插件[102]分析共定位。在共定位分析之前，ROI会受到背景减法和反卷积的影响。对每个ROI的单个切片进行共定位，该切片包含高比例的像素，每个通道的背景荧光以上显示，优先放置在gp46通道上。
流式细胞术
将细胞均衡至5 x 105细胞/mL并在分析前培养24小时。共 5 x 10 个5通过在800°C下以3×g离心4分钟收集细胞/标记反应，在2mL冷PBS/0.2%BSA（FACS缓冲液）中洗涤一次，然后悬浮在50μL冷FACS缓冲液中，其中加入2μg一抗。使用的抗体如下：抗ICAM-1（P2A4，密理博公司）和抗HTLV-1 gp46（1C11，sc-53890，圣克鲁斯生物技术）。将细胞在冰上标记1小时，然后用2mL FACS缓冲液洗涤。对于ICAM-1标记，将细胞沉淀悬浮在50μLFACS缓冲液中，其中加入0.25μg异硫氰酸荧光素（FITC）山羊抗小鼠Ig（南方生物技术）。对于gp46标记，使用0.25μg别藻蓝蛋白（APC）山羊抗小鼠Ig（南方生物技术）。将细胞在冰上标记30 m，用2 mL FACS缓冲液洗涤，并用2%多聚甲醛（PFA）在4°C下固定至少30 m。将细胞悬浮在500 μL FACS缓冲液中，并使用Cytek Aurora流式细胞仪（Cytek Biosciences）进行分析。使用FlowLogic软件分析数据。
检测培养基中的环境SU/gp46、病毒粒子和Gag p19 ELISA
为了从培养基中沉淀蛋白质，在无血清IMDM中洗涤细胞，以2.5x10接种6细胞/mL 在无血清 IMDM 中并培养 24 小时。通过以1000×g离心3m沉淀细胞，上清液通过0.45μm PES过滤器。加入冰冷的100%三氯乙酸（TCA）至终浓度为20%，涡旋样品，并在冰上冷却过夜。通过10，000 x g / 4°C离心5m沉淀沉淀的蛋白质。蛋白质沉淀用冰冷的10 mM HCl / 90%丙酮洗涤三次，然后重悬于SDS上样染料中。为了浓缩无细胞病毒颗粒，将细胞接种在1.5x106补充IMDM中的细胞/ mL并培养24小时。然后如上所述澄清培养基，并在SW 40 Ti转子（贝克曼库尔特）中以20，000rpm / 4°C离心2小时。除去上清液，将病毒悬浮在250uL的STE（0.1M NaCl，10mM Tris，1mM EDTA，pH 7.5）中。将病毒热灭活并储存在-80°C直至蛋白质印迹分析。对于ELISA检测，在一些实验中，将HTLV-1感染细胞洗涤两次，用WJ460处理，并在无血清IMDM中孵育24小时（试点实验验证WJ460在此条件下产生相同的效果）。收集上清液，通过0.45μm PES过滤器，并根据制造商的说明（ZeptoMetrix公司）通过ELISA测量Gag p19水平。使用accuSkan FC（费舍尔科学）检测吸光度。
计算机分析和统计分析
本研究中使用的微阵列数据集可在NCBI基因表达综合（GEO）获得：入藏号GSE29312 [103];GSE14317 [104] 和 GSE94409 [56]。对于每个样品，鉴定对应于MYOF转录本的探针，并使用GEO2R获得表达值。使用人类94732年56月（NCBI2006 / hg36）组件和IGV浏览器[18]分析了来自GEO入藏号GSE105 [0]的ChIP-Seq数据集。采用双尾学生t检验进行两组比较，在p < 05.<>时建立显著性。
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税收不会影响HeLa细胞中MyoF表达的水平。
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S1 图 税收不会影响HeLa细胞中MyoF表达的水平。
（A） HeLa细胞中的MyoF表达（2.5 x 105细胞）瞬时转染4μgpSG5或使用TurboFect的pSG-Tax-His。50小时后，使用针对MyoF，Tax（48xHis）和β-肌动蛋白的抗体通过蛋白质印迹分析全细胞提取物（6μg）。（B）该图显示了来自四个独立实验的MyoF条带强度的量化，标准化为β-肌动蛋白的带强度平均值。误差线显示标准偏差。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011202.s001
（提夫）
S2 图 hbz 和税收 mRNA 拷贝数与 HTLV-1 感染 T 细胞系中的相对 MYOF mRNA 水平相比。
在HTLV-2感染的T细胞系中，（A）和（C）分别根据UBE2D1 mRNA拷贝（管家基因）的hbz mRNA和税收mRNA拷贝。（B）和（D）相对MYOF mRNA与hbz mRNA拷贝和税收mRNA拷贝的线性回归分析。将MYOF mRNA值标准化为SLB-1细胞的值（设置为1）。基于数据的非正态分布使用斯皮尔曼相关检验。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011202.s002
（提夫）
S3 图 相对hbz和税收mRNA水平与最近建立的HTLV-1永生化克隆中的相对MYOF mRNA水平相比。
MYOF，hbz和税收mRNA水平标准化为克隆C15的水平（设置为1）。基于数据的非正态分布使用斯皮尔曼相关检验。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011202.s003
（提夫）
S4 图 对应于MYOF基因内HBZ富集的远端和近端峰的DNA序列。
使用UCSC基因组浏览器（http://genome.ucsc.edu;[79]），其峰值坐标随后外推到当前的基因组组装。粗体序列表示完全或部分AP-1结合位点。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011202.s004
（提夫）
S5 图 用WJ460处理后的细胞活力。
（A）ATL-2细胞用DMSO或WJ460（200nM和1μM）处理24小时。 （B）ATL-2和SLB-1细胞用DMSO或1μM WJ460处理24小时。图表显示了八次（A）和六次（B）重复的平均细胞活力。将值标准化为每个实验/细胞系的单个DMSO处理重复。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011202.s005
（提夫）
S6 图 靶向 MyoF 可减少 HTLV-1 感染。
（A）SLB-1细胞与Jurkat-pminLUC-vCRE细胞共培养，收获并在指定时间分析荧光素酶活性。该图显示了每个时间点三次重复的荧光素酶测定结果平均值，代表了两个独立实验。（B）SLB-1细胞在与CHOK1-Luc细胞共培养之前用DMSO或460μM WJ1处理。（C）ATL-2在与Jurkat-pminLUC-vCRE共培养之前用DMSO或1μM WJ460处理。（D）HTLV-1永生化的原代人T细胞克隆CJ4在与Jurkat-pminLUC-vCRE细胞共培养之前用DMSO或1μM WJ460处理。（E）稳定表达靶向GFP或MYOF mRNA的shRNA的ATL-2细胞与CHOK1-Luc细胞共培养。（F）SLB-1细胞用DMSO或1μM WJ460处理，然后在与Jurkat-pminLUC-vCRE细胞共培养之前照射（77Gy）。（G）稳定表达靶向GFP或MYOF mRNA的shRNA的ATL-2细胞在与Jurkat-pminLUC-vCRE细胞共培养之前被照射（77 Gy）。图表显示了单个实验的每个条件下三次重复的平均荧光素酶测定结果;**p<0.01， ***p<0.001.图（B）和（C）代表至少三个独立实验。图（A）、（D）、（E）、（F）和（G）代表了两个独立实验。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011202.s006
（提夫）
S7 图 溶酶体蛋白酶的抑制部分恢复用WJ46处理的HTLV-1感染细胞中SU（gp460）的细胞内水平。
用DMSO或2μM WJ1处理ATL-460细胞，含或不联合5mg / mL亮肽素（L）和5mg / ml胃抑素A（P）或25μM E64D（E）24小时。使用针对β-肌动蛋白和SU / Pr的抗体通过蛋白质印迹分析全细胞提取物（50 μg）。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011202.s007
（提夫）
确认
我们要感谢Rikinari Hanayama提供肌呋呋林质粒。
引用
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