营养响应性CDK Pho85为Sch9激酶的TORC1激活启动
玛丽-安妮·德普雷兹 ，马可·卡利加里斯 ，乔尔·罗西尔斯 ，畑山里子，鲁本·吉勒伯特，贝伦桑帕约-马克斯，凯瓦利亚·穆德霍尔卡，艾利亚·埃斯克斯，埃尔斯·梅尔特，克里斯蒂安·昂格曼，保拉·卢多维科，萨宾·罗斯珀特，克劳迪奥·德·维尔吉利奥 ，乔里斯·温德里克克斯
发布时间：15 年 2023
抽象
酵母细胞维持着复杂的营养信号通路网络，使它们能够整合有关不同营养素可用性的信息，并相应地调整其新陈代谢和生长。不再能够整合这些信息或无法进行必要适应的细胞将停止生长并最终死亡。在这里，我们研究了由蛋白激酶Sch9丢失引起的合成致死性的分子基础，Sch1是氨基酸信号传导的关键参与者和保守生长调节TORC85复合物的近端效应，当与细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）Pho81的丢失或其抑制剂Pho85的丢失相结合时，两者都在磷酸盐传感和细胞周期调节中具有关键作用。我们证明，当Sch80不存在时，CDK-cyclin对Pho85-Pho6或部分冗余的CDK-cyclin对Pho7-Pcl9 / Pcl3对于生长至关重要。有趣的是，各自的三个CDK-cyclin对调节磷脂酰肌醇-5磷酸1-激酶Fab3在内体和液泡上的活性和分布，在那里它产生磷脂酰肌醇-5，1二磷酸盐，用于募集TORC9及其底物Sch85。此外，Pho80-Pho9在Ser处直接磷酸化Sch<>726，在较小程度上在 Thr723，从而启动 Sch9 随后的磷酸化和被 TORC1 激活。因此，TORC1-Sch9 信令分支在不同级别上集成了 Pho85 介导的信息。在这种情况下，我们还发现转录因子Pho4的丢失挽救了由Pho85和Sch9丢失引起的合成致死性，表明两种信号通路也收敛在Pho4上，Pho84似乎连接到涉及高亲和力磷酸盐转运蛋白Pho9的反馈环路，该反馈环路微调Sch<>介导的反应。
作者摘要
细胞具有不同的信号通路，可以感知和发出营养物质可用性的信号。这些途径之间的串扰对于整合传入的信号并允许细胞进行适当的适应以维持其新陈代谢和增殖至关重要。在这项研究中，我们破译了酵母中两种众所周知的营养响应途径之间的串扰，即通过细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶 Pho85 发出磷酸盐可用性信号的 PHO 途径，以及通过其下游效应激酶 Sch1 传达游离氨基酸可用性信息的 TORC9 信号通路。我们表明Pho85通过两种不同的机制促进Sch1的TORC9依赖性激活。通过干扰脂质磷脂酰肌醇-3，5二磷酸盐的生物合成，Pho85控制液泡膜上Sch9的募集，从而使该效应器接近TORC1。此外，Pho85还直接磷酸化Sch9，为后者随后的磷酸化和被TORC1激活做好准备。相反，我们提供的证据表明，TORC1-Sch9轴通过抑制转录因子Pho4的核易位向PHO途径提供反馈，转录因子Pho<>控制编码维持磷酸盐稳态所需的蛋白质的基因的表达。
引文： Deprez M-A， Caligaris M， Rosseels J， Hatakeyama R， Ghillebert R， Sampaio-Marques B， et al. （2023） 营养响应性CDK Pho85启动Sch9激酶，使其被TORC1激活。公共科学图书馆基因19（2）： e1010641. https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010641
编辑 器： 杰拉尔丁·巴特勒，爱尔兰都柏林大学学院
收到： 15月 2022， 27;接受： 2023月 15， 2023;发表： <>月 <>， <>
版权所有： ? 2023 德普雷兹等人。这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。
数据可用性： 所有相关数据都在手稿及其支持信息文件中。所有数值数据都包含在补充表中：S4 表。
资金： 研究资金来自FWO-Vlaanderen（Fonds Wetenschappelijk Onderzoek）对RG和EE的奖学金，生物技术和生物科学研究委员会（BB / V016334 / 1）对RH的资助，德国研究基金会（DFG）通过项目ID 403222702，SFB 1381，TP B08到SR和RO 1028/5-2到SR，德国的卓越战略， （生物）EXC 949和CIBSS（EXC 2189）到SR，DFG项目UN111/10-2和SFB 1557，TP14到CU，瑞士国家科学基金会（310030_166474/184671）到CDV，FWO-Vlaanderen（G069413，G0C7222N）到JW，KU Leuven（C14/17/063，C14/21/095）到JW。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。
竞争利益： 提交人声明不存在相互竞争的利益。
介绍
在过去的几十年里，在解开酵母中动态和严格调节的营养反应方面取得了重大进展。这些反应由相互连接和保守的营养传感途径网络控制，这些途径允许细胞根据营养可用性调整其新陈代谢，从而确定细胞的生长潜力和存活。
酿酒酵母营养响应网络中的核心作用是蛋白激酶Sch9，它被认为结合了哺乳动物S6激酶（S6K）[1]和蛋白激酶B（PKB）/Akt [2]的功能。Sch9控制着几个过程，包括转录和翻译的调节[3-5]、细胞应激反应[6-9]、鞘脂代谢[10]、pH稳态[11]以及按时间顺序和复制寿命[12，13]。Sch9 接收来自多个上游参与者的输入。第一个输入由雷帕霉素复合物1（TORC1）的靶标提供，该靶标表示氮和氨基酸的可用性，并通过C末端至少9个残基的磷酸化来激活Sch5[1]。其次，为了获得全部活性，Sch9必须在激活环中被三种植物鞘氨醇依赖性激酶之一磷酸化，i。pkh1、pkh2或Pkh3，哺乳动物PDK1的酵母直系同源物[1，14，15]。第三，细胞能量传感器Snf1，酵母AMPK直系同源物，通过磷酸化残基来调节Sch9活性，这些残基不同于TORC1和Pkh1-3磷酸化的残基[16-19]。最后，Sch9的活性也通过其募集到空泡膜来控制，激酶与磷脂酰肌醇-3，5二磷酸结合（PI[3，5]P2），由磷脂酰肌醇-3-磷酸（PI3P）5-激酶Fab1产生，这是哺乳动物PIKfyve的直系同源物[20，21]。这种募集依赖于Sch9的N端结构域[22]，并且对于Sch1的TORC9依赖性激活至关重要[21，22]。有趣的是，Fab1是TORC1的底物，其依赖性的TORC1磷酸化似乎控制了Fab1在液泡和预囊内体亚群之间的分布和穿梭，称为信号内体[22-24]。在这些信号内体中，Fab1产生PI[3，5]P的主池2，随后输送至液泡[22，24]。
在之前的一项研究中，我们报道了sch9Δ的全基因组合成遗传阵列（SGA）分析。我们注意到，SCH9与细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂PHO81或CDK PHO85的联合缺失导致合成致死表型[11]。Pho81和Pho85是磷酸盐响应信号通路（称为PHO通路）的关键参与者，该通路调节维持适当磷酸盐稳态所需的基因表达。在该途径中，CDK抑制剂（CKI）Pho81在磷酸盐限制并抑制CDK-细胞周期蛋白对Pho85-Pho80的活性时变得活跃，从而使转录因子Pho4定位在细胞核中并诱导细胞外磷酸盐的觅食、进口和储存以及细胞内磷酸盐回收所需的基因的表达[25-27].值得注意的是，Pho81还控制Pho85-Pcl7 CDK-cyclin对的活性，鉴于其体外磷酸化Pho4的能力，该对也被认为参与磷酸盐传感[28，29]。我们对pho81Δ或pho85Δ和sch9Δ之间的合成致死率的观察表明，在没有Sch85活性的情况下，Pho9的过度激活和破坏都不利于细胞存活，并且与将磷酸盐传感与其他营养响应途径联系起来的多项观察结果一致[30]。因此，Pho85和TORC1-Sch9轴的活动需要关键平衡和协调。
Pho85参与细胞周期控制和环境信号传导的许多不同方面的调节[31-37]。它的缺失会导致许多缺陷，除了磷酸盐代谢改变外，还包括生长缓慢、无法在不可发酵的碳源上生长、细胞周期缺陷、细胞形态和细胞壁完整性异常、对几种压力的敏感性增强、脂质代谢改变、储备碳水化合物积累受损，以及自噬和寿命减少[31，38-44].这些缺陷中的每一种都可能与特异性Pho85-cyclins将Pho85激酶引导至特定底物的功能有关[45-48]。细胞周期蛋白根据其序列相似性分为两组：Pho80样亚科，除了Pho80和Pcl7外，还包括Pcl6、Pcl8和Pcl10，以及Pcl1，2样亚家族，包含Pcl1、Pcl2、Pcl5、Pcl9和Clg1[46]。Pho80样细胞周期蛋白和Pcl5参与响应环境变化的代谢调节，而Pcl1，2样细胞周期蛋白主要与细胞周期控制和形态发生有关[29，46，49]。有趣的是，Pho85-Pho80 CDK-cyclin复合物可以在高渗应激条件下磷酸化并提高Fab1的活性[50]，这表明Fab1可以作为与TORC1信号级联的可能收敛点。
在这项研究中，我们探讨了SCH9和PHO85或PHO81联合缺失引起的合成致死性。我们证明了这些合成致死性是由于Pho85，TORC1和Sch9之间的串扰信号冲突造成的。我们提供的证据表明，CDK-cyclin对Pho85-Pho80直接磷酸化Sch9以引发该激酶，以便随后通过TORC1磷酸化。此外，我们确认Pho85-Pho80影响Fab1活性，并提供证据表明Pho85-Pcl6和Pho85-Pcl7也可能参与细胞PI的调节[3，5]P2从Sch9的空泡招募中判断的水平。最后，我们表明转录因子Pho4不仅是Pho85信号传导的下游靶标，也是TORC1-Sch9信号传导的下游靶标。
结果
Pho85 和 TORC1-Sch9 轴之间的串扰涉及周期蛋白 Pho80、Pcl6 和 Pcl7
为了确认先前报道的Sch9，Pho81和Pho85之间的遗传相互作用，并确定哪些Pho85细胞周期蛋白有助于观察到的效果，我们将sch9Δ菌株与缺乏PHO81，PHO85或已知细胞周期蛋白之一的同基因菌株杂交，并进行系统的四分体分析。如图1A所示，sch9Δ pho81Δ和sch9Δ pho85Δ菌株的合成致死表型通过SCH9和PHO80的组合缺失来模拟。sch9Δ pho80Δ孢子仍能萌发，但表现出非常严重的合成生长缺陷。对于所有其他细胞周期蛋白，与SCH9联合删除产生的活孢子与sch9Δ菌株相比没有表现出显着的生长差异（S1图）。然而，由于细胞周期蛋白Pcl1和Pcl2、Pcl6和Pcl7或Pcl8和Pcl10具有部分冗余功能[28，47，51]，我们也测试了它们的组合缺失。虽然 sch1Δ 背景中 PCL2 和 PCL8 或 PCL10 和 PCL9 的组合缺失并没有进一步加剧 sch9Δ 突变体的缓慢生长表型，但在 PLC6 和 PLC7 组合缺失的情况下注意到明显的合成生长缺陷（图 1A、S1 图 ).因此，我们可以得出结论，Pho80的细胞周期蛋白功能的丧失以及Pcl6和Pcl7的组合有助于sch9Δ pho85Δ菌株的合成致死表型。
缩略图 下载：
.PPT幻灯片
.PNG大图
.TIFF原始图像
图1. Pho85和Sch9信号通路之间的遗传相互作用。
（A） 在 YPD 平板上对缺乏 Pho9、Pho81、Pho85 或 Pcl80 和 Pcl6 组合的 sch7Δ 突变体和突变菌株之间的杂交进行四分体分析。结合亲本突变菌株缺失并定义合成致死或合成病态表型的孢子由白色圆圈表示。解剖后3至5天拍摄照片。参见S1图，了解所有细胞周期蛋白突变体的完整基因型分析。（B）雷帕霉素对WT（BY4741）、pho85Δ、pho80Δ、pcl6Δ pcl7Δ和pho81Δ菌株的敏感性分析。将菌株在YPD培养基上生长至指数生长期，稀释至OD600纳米0.1和连续10倍稀释液点样在没有或不含50nM雷帕霉素（rap）的YPD板上，并在30°C下生长。 参见S2图，了解所有细胞周期蛋白突变体的雷帕霉素敏感性测试。（C） 用着丝粒质粒转化的 WT、pho85Δ、pho80Δ 和 pho81Δ 菌株的雷帕霉素敏感性分析，允许表达 Sch9 文晔， Sch92天3E，或 Sch95安，并通过缺乏尿嘧啶 （SD-ura） 的 SD 培养基上的生长进行评估，不含或使用 10 nM 雷帕霉素。（D） 磷酸标签免疫印迹分析，以评估从表达 HA-Sch9 的指数生长的 WT、sch9Δ 和 pho85Δ 细胞获得的蛋白质提取物中的 Sch9 磷酸化水平文晔或 HA-Sch95安.蛋白质提取物在磷酸标签凝胶上分离，随后通过抗HA抗体免疫印迹进行分析。（E） 使用抗 P-Sch85 对从指数生长的 WT、pho80Δ、pho81Δ 和 pho9Δ 细胞获得的蛋白质提取物进行免疫印迹分析 T737和抗Sch9抗体。定量显示磷酸化与总Sch9的比率与WT细胞获得的比率标准化。使用双尾学生T检验计算显著性（*，P < 0.1;**，P < 0.01;***，P < 0.001）。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010641.g001
由于Sch9活性依赖于TORC1的磷酸化[1]，因此在存在亚致死水平的雷帕霉素（TORC81的特异性抑制剂）的情况下，还监测了pho85Δ、pho1Δ和细胞周期蛋白缺失菌株的生长。 如图1B所示，pho85Δ和pho80Δ细胞均无法在补充有50nM雷帕霉素的富培养基上生长，这与先前的观察结果一致[40，43]。相比之下，野生型细胞（BY4741;WT）和其他携带单或双细胞周期蛋白缺失或PHO81缺失的菌株未显示雷帕霉素敏感生长（S2A和S2B图）。这是一个有趣的观察结果，因为它表明在这些亚致死条件下，仍然有足够的Sch9活性来维持pho81Δ和pcl6Δ pcl7Δ菌株的生长。
接下来，我们研究了雷帕霉素诱导的pho85Δ和pho80Δ菌株的生长缺陷是否可以通过用表达组成活性TORC1拟磷酸化剂Sch9的着丝粒质粒转化菌株来恢复。2天3E突变体 [1]。作为对照，菌株也用表达野生型Sch9的质粒转化文晔或 Sch95安无法被 TORC1 激活的突变体。如图1C所示，Sch9 的表达式文晔也不是施95安可恢复雷帕霉素诱导的菌株生长缺陷，同时过表达Sch92天3E在pho80Δ菌株的情况下，雷帕霉素存在下明显改善了生长，但在pho85Δ菌株的情况下没有。为了进行比较，我们还在本实验中包括了WT和pho81Δ菌株，正如预期的那样，Sch9的表达略微改善了它们在含雷帕霉素培养基上的生长。2天3E等位基因（图1C）。因此，观察到Sch92天3EPho80Δ菌株的雷帕霉素敏感性表明，Pho85-Pho80 CDK-cyclin对可能是TORC1介导的Sch9磷酸化和活化的特定需要。为了解决这种可能性，我们使用表达 Sch9 的 HA 标记构建体的 WT、sch85Δ 和 pho9Δ 细胞的蛋白质提取物进行了 Phos 标签迁移位移分析。文晔或 Sch95安作为对照的突变体（图1D）。这清楚地表明，Sch9的磷酸化在pho85Δ菌株中受到损害，因为仅在该菌株中，对应于完全磷酸化的Sch9的缓慢迁移带文晔不存在，导致 Sch9 的移动模式相似文晔正如在Sch9中看到的那样5安.始终如一地免疫检测天然 Sch9 及其在 TORC1 残基 Thr 处的磷酸化状态737（使用抗Sch9和抗磷酸化Sch9T737抗体）分别证明Sch9磷酸化在pho85Δ和pho80Δ菌株中显着降低，而在pho81Δ中增强（图1E和S2C）。
Pho85-Pho80 是 Fab1 和 Sch9 的液泡募集所必需的
先前的研究表明，Sch9在发酵生长过程中被募集到液泡膜中，在那里它与PI[3，5]P结合2通过其N端结构域，然后被TORC1磷酸化[1，21，22，52]。吡啉[3，5]P2由PIKfyve样激酶Fab3由PI1P产生，其活性受到分子内抑制相互作用和与Fab1形成复合物的不同调节蛋白的严格调控[53-57]。TORC1和Pho85-Pho80都对Fab1活性产生影响[22，50]。先前的研究表明，信号内体是PI[3，5]P的主要位点2生产[22]。这些信号内体含有EGO复合物和TORC1，其磷酸化靠近FYVE（Fab1，YOTB，Vac1和EEA1）结构域的N端半部的Fab1，从而增强Fab3的PI1P结合并促进PI[3，5]P2代。根据当前工作模型，PI[3，5]P2在信号内体与液泡融合后递送到液泡膜，EGO复合物TORC1和Fab1分散在液泡膜上。然后将Fab1循环回信号内体以重新启动PI[3，5]P2生产[22]。已知Pho85-Pho80通过在靠近催化激酶结构域的C末端区域磷酸化来增强Fab1的活性，从而增强PI[3，5]P2应激时产生[50]。此外，Pho85-Pho80还磷酸化Fab7的正调节因子Vac1[50]。因此，为了解决Pho85-Pho80通过调节Fab1间接影响Sch9的TORC1依赖性磷酸化的可能性，我们想知道Fab1的过度激活是否会恢复雷帕霉素诱导的pho85Δ和pho80Δ菌株的生长缺陷。为了与上述生长测定（图1C）进行比较，我们再次用编码Sch85的着丝粒质粒对WT，pho80Δ，pho81Δ和pho9Δ菌株进行了转化。文晔但这次与着丝粒质粒一起提供野生型Fab1或过度活跃的Fab1的额外拷贝VLA据报道，基础PI增加超过10倍的突变体[3，5]P2水平 [55]。如图 2A 所示，既不是野生型 Fab1，也不是 Fab1VLA突变体允许pho85Δ或pho80Δ菌株在补充有10nM雷帕霉素的培养基上生长。事实上，我们注意到Fab1VLA突变体甚至在WT和pho81Δ菌株中引起雷帕霉素敏感性。这两项观察结果都促使我们监测Fab1和Fab1的表达。VLA蛋白质更详细。由于目前没有可用的Fab1抗体，我们用着丝粒质粒转化了不同的菌株，允许在FAB1启动子的控制下将两种Fab1蛋白表达为C末端标记的GFP融合。当在10nM雷帕霉素存在下测定生长时，获得与以前相似的结果，i。e. 在表达 Fab85 时，pho80Δ 和 pho81Δ 菌株不会生长，并且对 WT 和 pho1Δ 菌株的灵敏度更高 VLA-GFP融合（图2B）。我们进一步注意到，当以较低水平（i.e. 85.80 nM）的雷帕霉素（图4B）。接下来，我们使用抗GFP抗体来估计Fab5-GFP和Fab2的表达水平。VLA-使用Adh2作为负载对照的不同菌株中的GFP融合。与WT细胞中基因组表达的Fab1-GFP水平相比，着丝粒质粒表达的Fab1-GFP水平在WT中似乎高出约5倍，在pho4Δ中高出81倍，在pho1Δ和pho5Δ细胞中高出85.80倍（图2C）。在WT和pho81Δ细胞中，质粒表达的Fab1VLA-GFP水平甚至略高于质粒表达的Fab1-GFP水平，但它们略低于pho1Δ和pho85Δ细胞中各自质粒表达的Fab80-GFP水平（图2C）。因此，即使pho85Δ和pho80Δ细胞表现出质粒表达的Fab1-/Fab1VLA-GFP水平与WT细胞中基因组表达的Fab1-GFP水平相当，与WT和pho81Δ细胞不同，它们似乎无法支持（质粒驱动）更高的Fab1-/ Fab1的表达VLA-GFP水平。然后，我们监测了Fab1-GFP和Fab1的细胞内定位VLA-不同WT和突变菌株中的GFP融合（图2D和2E）。与测量的表达水平一致，Fab1-GFP存在于所有菌株的液泡膜上，但与WT和pho85Δ细胞相比，pho80Δ和pho81Δ细胞的染色强度平均较低。此外，在pho85Δ细胞和pho80Δ细胞中，Fab1-GFP主要位于小液泡以及靠近或液泡膜的病灶中。这些病灶可能与先前报道的信号内体相对应[22，24]。如果得到证实，我们认为合理地假设缺乏Pho85或Pho80会阻碍这些周内体的融合，从而阻碍Fab1在液泡膜上的分布或稳定。正如预期的那样，与先前的观察结果一致[50，55]，表达过度活跃的Fab1的细胞VLA-GFP版本显示小而微小，几乎像囊泡状的液泡。有趣的是，Fab1VLA-GFP在很大程度上不在可辨别的液泡膜中，几乎只存在于病灶中，这与Pho85，Pho80或Pho81的存在与否无关。这种缺陷不太可能由GFP标签引起，因为野生型Fab1-GFP正确定位于液泡膜，并且因为GFP标记和未标记的Fab1VLA在所有研究的菌株中引起雷帕霉素敏感性的相似程度。然而，我们注意到Fab1VLA等位基因（E1822V、F1833L、T2250A;[55]）位于报告的潜在Pho85-Pho80靶基簇（T1569、T1583、T1594、T1691、S1924、T1953、T1963和S2166;因此，该Fab50变体中的突变可能模仿Pho1-Pho85的磷酸化，这阻止了Fab80在液泡膜上的稳定，导致连续循环回周围信号内体以产生更多的PI[1，3]P2，这一模型仍有待在未来的研究中解决。如果为真，那么Pho1-Pho85对Fab80的磷酸化不仅刺激信号内体与液泡的融合，而且还促进Fab1在周围信号内体的定位。这样的模型还可以优雅地解释为什么具有过度活跃的Pho85的细胞（例如，由于缺乏CKI Pho81）大多显示较小和碎片化的液泡（图2D和2E）。因此，我们的综合数据表明，如先前报道的那样，内体和液泡Fab1的平衡受到TORC1和Pho22-Pho85的严格控制[80]。
缩略图 下载：
.PPT幻灯片
.PNG大图
.TIFF原始图像
图2. Pho85-Pho80参与将Fab1募集到液泡膜中。
（A）雷帕霉素对表达Sch85的WT、pho80Δ、pho81Δ和pho9Δ菌株的敏感性分析文晔和来自着丝粒质粒的 Fab1 等位基因。在不含或含10 nM雷帕霉素（rap）的选择性合成培养基上评估生长。（B） 雷帕霉素敏感性分析，在表达 GFP 标记的野生型 Fab4 或 GFP 标记的 Fab5 的 10.85 nM 或 80 nM 雷帕霉素的 WT、pho81Δ、pho1Δ 和 pho1Δ 菌株下进行分析 VLA如所示，来自着丝粒质粒的等位基因。（C） WT、pho85Δ、pho80Δ 和 pho81Δ 菌株的免疫印迹分析，以比较 Fab1-GFP 和 Fab1 的表达水平VLA-GFP融合当引入着丝粒质粒时，其表达水平为WT菌株中存在的基因组标记的Fab1-GFP。根据GFP和上样对照Adh2获得的比率计算表达水平。使用双尾学生T检验计算显著性（*，P < 0.1;**，P < 0.01;***，P < 0.001）。（D） Fab1-GFP和Fab1的显微分析VLA-GFP 定位在 WT、pho85Δ、pho80Δ 和 pho81Δ 菌株中。在选择性合成培养基上将菌株生长到对数中期。亲脂性染料FM4-64用于可视化液泡膜。Fab1图片中的缩进VLA-GFP表达pho81Δ细胞的放大倍数以阐明这种过度活跃的Fab1突变体在很大程度上无法染色液泡膜，并且主要位于靠近液泡或液泡的病灶中。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010641.g002
最后，在表达Fab1时观察到WT菌株的雷帕霉素敏感性增强VLA导致我们监控 Sch9T737磷酸化水平。我们发现这些在表达Fab1的细胞中略低VLA与具有空载体对照的细胞或表达Fab1的细胞相比，表明Fab1的过度激活与TORC1活性降低有关（S3A图）。先前在表达fab1的细胞中观察到类似但更明显的效果6D突变体也显示出增强的Fab1活性[22]。
符合我们关于 Fab1-GFP 定位的数据，以及 Pho85-Pho80 是 Fab1 的上游活化剂，可提高 PI[3，5]P 的模型一致2液泡膜的含量，从而决定了液泡的大小和形态[50，58，59]，我们注意到与WT或pho81Δ菌株相比，pho85Δ菌株，特别是pho80Δ菌株具有许多具有扩大的液泡的细胞。与显示小而碎片化的液泡的细胞相反，具有这些扩大液泡的细胞似乎阻碍了基因组标记的GFP-Sch9的液泡募集。文晔（图 3A 和 S3B）。同样，我们还发现，当从缺乏Pho9的细胞中分离出这些液泡膜时，液泡膜上的GFP-Sch85水平较低（S3C和S3D图）。鉴于Sch9通常需要结合PI[3，5]P2在液泡膜上，我们想知道Sch9强制锚定在液泡膜上是否足以纠正TORC9还原的Sch1磷酸化，如pho85Δ和pho80Δ菌株中所见，从而解决其雷帕霉素敏感性。为了解决这个问题，一个基因组标记的GFP-FYVE-Sch9文晔在WT，pho85Δ，pho80Δ和pho81Δ菌株中引入。如前所述，将哺乳动物EEA1的FYVE结构域融合到Sch9的N末端，人为地将激酶与酵母细胞液泡膜中的PI3P拴在一起[60]。因此，我们确实观察到GFP-FYVE-Sch9的强烈液泡富集文晔，即使在具有扩大液泡的pho85Δ和pho80Δ细胞中，现在在整个液泡膜上显示荧光（图3A和S3B）。人工系留伴随着GFP-FYVE-Sch9的磷酸化水平显着增强文晔在王座737在所有菌株中残基，但与WT菌株相比，pho80Δ和pho85Δ菌株的残余量仍然显着降低（图3B）。此外，尽管磷酸化增强，GFP-FYVE-Sch9文晔没有减轻pho85Δ和pho80Δ菌株的雷帕霉素敏感性（图3C），表明Pho85-Pho80 CDK-cyclin对除了Fab9外，还可以（直接或间接）靶向Sch1。我们初步观察到的TORC1拟磷酸化Sch9的表达进一步支持了这种可能性2天3E突变体挽救了pho80Δ菌株的雷帕霉素敏感性（图1C）。
缩略图 下载：
.PPT幻灯片
.PNG大图
.TIFF原始图像
图3. Pho85-Pho80是Sch9的液泡募集所必需的。
（A）表达基因组标记的GFP-Sch9或GFP-FYVE-Sch85融合蛋白的WT，pho80Δ，pho81Δ和pho9Δ菌株中Sch9定位的显微镜分析。菌株在完全合成培养基上生长至对数中期。亲脂性染料FM4-64用于可视化液泡膜，并使用ImageJ施加LUT火以显示GFP信号的水平。（B）免疫印迹分析，以比较表达GFP-Sch9或GFP-FYVE-Sch85的WT，pho80Δ和pho9Δ细胞中的Sch9磷酸化水平，当在完整的合成培养基上生长到对数中期时。施九-特尔737根据抗P-Sch9获得的信号的比率量化磷酸化水平T737和抗Sch9抗体并标准化为WT细胞。使用双尾学生T检验计算显著性（*，P < 0.1;**，P < 0.01;***，P < 0.001）。（C）雷帕霉素对表达基因组标记的GFP-Sch4741或GFP-FYVE-Sch85的WT（BY80），pho81Δ，pho9Δ和pho9Δ菌株的敏感性分析，通过在没有或含有10nM雷帕霉素（rap）的YPD平板上的生长进行评估。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010641.g003
Pho85-Pho80 引发 Sch9 在液泡膜上被 TORC1 磷酸化
为了进一步支持Sch9是Pho85-Pho80的底物，我们首先想排除在pho9Δ和pho85Δ菌株中观察到的Sch80磷酸化降低的可能性仅仅是由于液泡膜上的TORC1活性降低。如上所述，EGO复合体和TORC1主要存在于不同的池中。在预液泡内体中，两种复合物都被描述为装饰信号内体，HOPS介导的这些内体与液泡的融合决定了后者的池[22-24]。我们首先监测了基因组标记的GFP-Tor1在WT，pho85Δ和pho80Δ菌株中的细胞内定位。在WT细胞中，GFP-Tor1融合很好地染色了所有液泡的膜。然而，在pho85Δ和pho80Δ细胞中，染色更多地局限于小液泡，而在那些具有大液泡的细胞中，液泡膜上的信号仅微弱甚至不存在，染色仅限于预液泡内体，特别是在pho80Δ菌株中（图4A）。这再次表明，Pho85-Pho80 CDK-cyclin对是内体与液泡最佳融合所必需的。
thumbnail 下载：
.PPT幻灯片
.PNG大图
.TIFF原始图像
图4. Tor1定位和TORC1在WT，pho85Δ和pho80Δ菌株中的活性。
（A）表达基因组标记的GFP-Tor1融合的WT，pho85Δ和pho80Δ菌株中Tor1定位的显微镜分析。菌株在完全合成培养基上生长至对数中期。亲脂性染料FM4-64用于可视化液泡膜，并使用ImageJ施加LUT火以可视化GFP信号的水平。（乙、丙）免疫印迹分析，以比较表达基因组引入的 Atg13-HA 的 WT、pho9Δ 和 pho4Δ 细胞中的 Atg85 （B） 或 Sch80 和 Lst13 （C） 磷酸化水平3或在完整的合成培养基上生长到对数中期时进行Lst4-V5融合。Atg13-HA 中的点3印迹表示非特异叉反应条带，箭头“U”指向对应于磷酸化程度最高的 Atg13-HA 的条带3定量并用于计算相对于总HA信号的比率的亚型。对于Sch9和Lst4，根据抗P-Sch9获得的信号的比率量化磷酸化水平T737或抗 P-Lst4S523系列，以及抗 Sch9 或抗 V5 抗体，并分别归一化为 WT 细胞中的抗体。如图所示，atg13Δ 菌株、lst4Δ 菌株和 WT 菌株表达基因组 Atg13-HA3或Lst4-V5，但用200nM雷帕霉素（rap）处理30分钟，作为对照。使用双尾学生T检验计算显著性（*，P < 0.1;**，P < 0.01;***，P < 0.001，n.s.：不显著）。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010641.g004
接下来，我们评估了另外两个TORC1客户端的磷酸化，以将其与Sch9的磷酸化进行比较。第一个客户是Atg13，这是Atg1复合物的调节亚基，参与巨自噬，先前发现在Ser554TORC1定位于信号内体[61，62]。我们将Atg13基因组表达为C端三重HA标记融合，并量化了使用抗HA抗体时的磷酸化依赖性带移。这证明了Atg13-HA的磷酸化一致且显着降低3在pho85Δ和pho80Δ菌株中与WT菌株相比（图4B）。因此，与Sch9类似，Pho85-Pho80 CDK-cyclin对对Atg13磷酸化有直接或间接的影响，这可能不足为奇，因为Pho85-Pho80被证明有助于细胞遭受营养匮乏时自噬的复杂调节[44，63]。值得注意的是，Atg13被证明以磷酸依赖性方式将磷脂酰肌醇3激酶复合物亚基Atg14募集到自噬前结构中[64]，因此Atg13也可能为Fab1的募集设定条件。
测试的第二个额外的TORC1客户端是Lst4，它与Lst7复合体一起充当EGO复合体的Rag家族GTPase Gtr2的GAP[65]。在液泡中，Lst4 确保 TORC1 的快速氨基酸依赖性活化，但一旦激活，TORC1 反过来会在几个残基处磷酸化 Lst4，从而触发 Lst4 从液泡中置换。该反馈循环可防止TORC1的过度激活，并保护TORC1活性的动态调整以响应氨基酸的可用性[66]。我们在WT、pho4Δ和pho5Δ菌株中基因组表达Lst85为C端V80标记的融合，并监测Ser的TORC1依赖性磷酸化。523.然而，抗磷酸化-Lst4 的免疫检测均未S523系列抗体，以及使用抗V5抗体时观察到的带移，表明菌株之间的Lst4磷酸化存在显着差异（图4C）。因此，即使是pho85Δ和pho80Δ菌株也能保持足够的液泡TORC1活性以提供Lst4的稳态控制。因此，在这两种缺失菌株中看到的Sch9磷酸化减少不太可能仅仅是受阻的液泡TORC1募集的结果，这再次提出了Sch9可能是Pho85-Pho80 CDK-cyclin对的特定底物的可能性。
与哺乳动物CDK一样，Pho85是一种脯氨酸导向的Ser/Thr蛋白激酶[35，67]。先前报道的Sch1的TORC9磷酸化表位定位确定了两个Ser / Thr-Pro位点，i。e. Thr723和塞尔726疏水基序（HM;氨基酸733-738）的上游，有趣的是，这项研究表明Ser的磷酸化726为Thr启动激酶723磷酸化[1]。为了证实这一点并解决这种引发作用是否也会扩展到其他Sch9磷酸化物，我们再次转向Phos标签迁移位移测定，这次使用Flag标记的Sch9构建体，其中Thr723和塞尔726被阿拉取代，无论是单独还是组合。如图 5A 所示，仅当 Ser726被Ala取代，相应的Sch9突变体未能被TORC1完全磷酸化，产生与Sch9相当的迁移曲线文晔和施95安在pho85Δ应变中（图1D）。我们还测试了其他Sch9磷酸突变体，但只有Sch9S726A在随后的TORC1介导磷酸化启动时受到损害（S4A图）。为了证实这种启动效应，我们独立创建了基因组Sch9-Ser726-到阿拉和拟磷酸 Sch9-Ser726-to-Asp突变，然后测试表达的蛋白质（i.e. 施9S726A和施9S726D）的磷酸化Thr737 体内。与启动效果一致，Thr737Sch9 上的磷酸化显著降低S726A与Sch9上各自的磷酸化相比文晔 (图5B）。值得注意的是，Thr737在 Sch9 上也略有减少S726D，这表明拟磷酸 Ser726-to-Asp突变不能完全重现蛋白质磷酸化看到的变化。我们通过生长测定证实了这些数据，其中Sch9S726A-表达的细胞明显对雷帕霉素敏感，而Sch9S726D-表达细胞虽然对雷帕霉素的敏感性高于WT细胞，但雷帕霉素的应对效果仍然优于Sch9S726A-表达细胞（图5C）。当我们确定寿命时，也看到了类似的情况，这与Sch9活性呈负相关[68]。因此，在磷酸盐饥饿条件下，表达磷酸突变体Sch9S726A显示比表达Sch9的寿命更长文晔，细胞表达Sch9S726D展示的寿命介于Sch9之间文晔和施9S726A表达细胞（图5D）。当缺乏氮或碳时，这些细胞之间的寿命没有显着差异（S4D图），这是可以预期的，因为这两种条件都消除了Sch1的TORC9依赖性磷酸化[69]。
thumbnail 下载：
.PPT幻灯片
.PNG大图
.TIFF原始图像
图5. Pho85-Pho80介导的Ser磷酸化726启动Sch9，以便随后被TORC1激活。
（A） 从指数生长的 sch9Δ 细胞中获得的蛋白质提取物的磷酸标签免疫印迹分析，这些细胞与驱动 C 末端 FLAG 标记的 Sch9 表达的着丝粒质粒转化文晔， Sch9T723A， Sch9S726A，或 Sch9T723A/S726A如前所述。在磷酸标签凝胶上分离总蛋白提取物，随后通过抗FLAG抗体免疫印迹进行分析。（B）免疫印迹分析以评估Sch9-Thr737从表达内源性Sch4741的指数生长BY9细胞获得的蛋白质提取物中的磷酸化水平文晔或突变版本 Sch9S726A或施9S726D.王座737根据抗P-Sch9获得的信号的比率量化磷酸化水平T737和抗 Sch9 抗体，并标准化为为 Sch9 获得的比例文晔.（C）雷帕霉素对表达内源性Sch4741的BY9细胞的敏感性分析文晔或突变版本 Sch9S726A或施9S726D通过不含或含5nM雷帕霉素的完全合成培养基上的生长进行评估。（D）显示表达内源性Sch4741的BY9细胞存活率的时间顺序寿命测定文晔或突变版本 Sch9S726A或施9S726D当如指示饥饿磷酸盐数天时。条形图描绘了平均最大寿命。（东、女）Pho85-Pho80磷酸化物Ser726在Sch9 C终点站（CT）。纯化的重组体Sch9R650-I824-与Sch9对应的TAP片段文晔， Sch9T723A， Sch9S726A，或 Sch9T723A/S726A通过从酵母中纯化的Pho85-Pho80 CDK-cyclin对进行体外磷酸化。该测定使用野生型Pho85（WT）或激酶死Pho85进行E53A突变体（KD），作为对照包括在内。具有代表性的SYPRO红宝石染色（E）和放射自显影（32P）印迹（F）如图所示。（G） 蛋白质印迹分析以评估 Sch9 Thr737从表达内源性 Sch85 的指数生长的 WT、pho80Δ 或 pho9Δ 细胞获得的蛋白质提取物中的磷酸化水平文晔或突变版本Sch9S726A.王座737根据抗P-Sch9获得的信号的比率量化磷酸化水平T737和抗 Sch9 抗体，并标准化为为 Sch9 获得的比例文晔在WT菌株中。使用双尾学生T检验计算显著性（*，P < 0.1;**，P < 0.01;***，P < 0.001）。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010641.g005
为了测试Pho85-Pho80 CDK-cyclin对是否直接磷酸化Sch9，我们接下来进行了体外蛋白激酶测定。为此，HA-Pho85，激酶无活性的HA-Pho85E53A，并从覆盖Sch80末端的酵母裂解物和肽中纯化GST-Pho9文晔， Sch9T723A， Sch9S726A，或 Sch9T723A，S726A被用作基材。如图所示，磷酸化是用对应于Sch9文晔和施9T723A，但与 Sch9 对应的那些不同S726A或施9T723A，S726A，从而确认 Ser726确实是被Pho85-Pho80磷酸化的主要表位（图5E，5F和S4B）。当结合时，我们的数据因此证实了Sch9在Ser上的磷酸化726由Pho85-Pho80引发Sch9的TORC1磷酸化。
如上所示，Tor1和Sch9仍然存在于pho85Δ和pho80Δ菌株中出现的小液泡的膜上，但是随着液泡变大，特别是在pho80Δ菌株中，这种定位受到阻碍。因此，这些小液泡必须是TORC1介导的Sch9活化在两种缺失菌株中发生的主要位点。由于液泡大小与Fab1活性呈负相关[59]，我们的数据还推断出扩大液泡膜中的PI[3，5]P2含量较低，这与我们的观察结果一致，即Pho85-Pho80 CDK-cyclin对在将Fab1从信号内体适当地转移到液泡中发挥作用。估计对Sch9-Thr的相对贡献737通过 Fab1 介导的 TORC1 对照和 Pho85-Pho80 介导的 Sch9-Ser 进行磷酸化726启动磷酸化，我们首先试图排除Sch9在Ser726本身会影响Sch9的液泡募集。在之前的报告中已经显示 GFP-Sch95安和GFP-Sch92天3E突变体，都包括 Ser726突变，在WT细胞中表达时通常定位于液泡膜[1]。为了详细说明这一点，我们检查了GFP-Sch9的细胞内定位S726A和GFP-Sch9S726D并发现，正如预期的那样，两种融合蛋白也正常定位在液泡中（S4C图）。接下来，我们研究了Thr的磷酸化水平是否降低737在启动位点突变体Sch9726安将进一步减少Pho85或Pho80的损失。情况确实如此，因为部分受损的Sch9-Thr。737当与Sch85结合使用时，pho80Δ和pho50Δ细胞中的磷酸化水平进一步降低了约9%S726A突变（图5G）。这些数据结合起来不仅表明Sch9在Ser726和 Fab1 的适当调节对于 TORC9 对 Sch1 的最佳激活几乎同样重要，而且 Ser726也可以被其他激酶靶向。后者与最近的另一份报告非常吻合，其中Sch9-Ser726有人认为被CDK9同系物Bur1磷酸化[70]。
Pho85-Pcl6和Pho85-Pcl7对Sch9磷酸化的影响不同
观察表明Sch9的游离体表达2天3E部分减轻了pho80Δ菌株的雷帕霉素敏感性，但不能减轻pho85Δ菌株的雷帕霉素敏感性，这表明额外的细胞周期蛋白参与介导TORC9对Sch1的正常激活。做出这种贡献的最佳候选者是Pcl6和Pcl7，因为当两种蛋白质的损失与Sch9的损失相结合时，会导致严重的合成生长缺陷（图1A和S1）。众所周知，Pho85-Pcl6和Pho85-Pcl7都通过控制其调节亚基Glc1来调节7型蛋白磷酸酶Glc8，但是，虽然Pho85-Pcl7是体外表现最好的激酶，但Pho85-Pcl6是体内主要的Glc8激酶[71]。我们研究了Glc7通过监测Sch9-Thr来去磷酸化Sch9的可能性737pcl6Δ、pcl7Δ 和 pcl6Δ pcl7Δ 菌株在指数生长过程中的磷酸化。 我们注意到，与WT菌株相比，pcl9Δ菌株的Sch6磷酸化水平不受影响，但在pcl7Δ菌株中降低（S5A图）。此外，我们还检查了缺乏Glc8或其他非必需Glc7相互作用蛋白的菌株，使用先前描述的方法将Glc7-Shp1鉴定为Rps6的蛋白磷酸酶[72]。尽管我们观察到菌株之间存在一些差异，但在雷帕霉素处理后，它们都没有保持显着的Sch9磷酸化水平（S5B图），这表明Glc7磷酸酶在测试条件下控制Sch9磷酸化状态中没有起主要作用。
这导致我们使用另一种策略，并将PHO80缺失与PCL6和PCL7缺失的组合相结合。我们还创建了五元组pho80Δ pcl6Δ pcl7Δ pcl8Δ pcl10Δ缺失突变体，该突变体缺乏所有Pho80样细胞周期蛋白亚家族成员作为额外的对照。再次测试菌株在表达Sch9时的雷帕霉素敏感性文晔或施92天3E从着丝粒质粒中，这揭示了细胞周期蛋白之间错综复杂的相互作用。事实上，与pho80Δ菌株相比，PCL6的额外缺失阻止了Sch92天3E从挽救雷帕霉素诱导的生长缺陷，而PCL7的缺失改善了Sch9的生长文晔和施92天3E转化体和条件下添加或不添加雷帕霉素。然而，在pho6Δ pcl80Δ菌株中引入PCL7缺失足以消除其改善的生长（图6A）。五元组对照菌株的行为类似于pho80Δ pcl6Δ和pho80Δ pcl6Δ pcl7Δ菌株，证实了Pcl8和Pcl10对观察到的表型没有贡献。在监测GFP标记的Sch9的液泡大小和液泡膜募集时，也观察到了类似的现象。文晔.与Pcl6的损失相反，Pcl7的损失阻止了具有减少Sch9装饰的扩大液泡的形成，这是pho80Δ菌株的典型代表，但是当pho80Δ菌株同时缺乏Pcl6和Pcl7时，这种表型再次恢复（图6B和S5C）。此外，我们观察到Sch9-Thr显着增加737pho80Δ pcl7Δ菌株中的磷酸化与单个pho80Δ菌株和WT菌株的磷酸化比较。然而，在pho80Δ pcl6Δ pcl7Δ和对照应变中Sch9-Thr的程度737磷酸化再次显著降低（图6C）。这表明Pho85-Pcl6和Pho85-Pcl7可能对Fab1复合物的活性产生相反的影响，无论是对Fab1本身还是其调节亚基之一，i。e. 图4、Vac14、Vac7或Atg18[20]。
thumbnail 下载：
.PPT幻灯片
.PNG大图
.TIFF原始图像
图6. Pho85-cyclins Pcl6和Pcl7有助于调节Fab1和Sch9的液泡募集。
（A）雷帕霉素对表达Sch80的pho80Δ、pho6Δ pcl80Δ、pho7Δ pcl80Δ、pho6Δ pcl7Δ pcl80Δ和pho6Δ pcl7Δ pcl8Δ pcl10Δ pcl9Δ菌株的敏感性分析 文晔或施92天3E来自着丝粒质粒。在不含10nM雷帕霉素的选择性合成培养基上发现菌株。（B）对（A）中提到的但表达GFP-Sch9的菌株进行显微镜分析文晔.在选择性合成培养基上将菌株生长到对数中期。亲脂性染料FM4-64用于可视化液泡膜。（C）对（A）中提到的菌株的蛋白质提取物进行免疫印迹分析，并在完整的合成培养基上呈指数生长，以评估Sch9磷酸化的变化。施九-特尔737-基于抗P-Sch9的比例量化磷酸化水平T737和抗Sch9信号，并归一化为WT细胞获得的比率。使用双尾学生T检验计算显著性（*，P < 0.1;**，P < 0.01;***，P < 0.001）。（D）Fab1-GFP在pho80Δ，pcl7Δ和pho80Δ pcl7Δ菌株中的定位的显微镜分析。 在选择性合成培养基上将菌株生长到对数中期。亲脂性染料FM4-64用于可视化液泡膜。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010641.g006
由于Sch9的液泡大小和液泡募集都与PI[3，5]P有关2鉴于液泡募集是TORC9磷酸化Sch1的先决条件，我们想知道Fab1是否会在pho80Δ pcl7Δ菌株的液泡膜上再次定位。为此，我们用上述着丝粒FAB7-GFP或fab80转化了pcl7Δ和pho1Δ pcl1Δ菌株。VLA-GFP质粒，并将两种融合蛋白的表达水平和定位与pho80Δ菌株中的表达水平和定位进行比较。pho7Δ细胞中PCL80的额外缺失部分恢复了两种融合的表达水平（S5D图）。此外，Fab1-GFP在pcl7Δ菌株和pho80Δ pcl7Δ菌株中很好地染色了液泡膜，表明pho7Δ菌株中PCL80的额外缺失也恢复了Fab1从内体到空泡膜的转移（图6D）。晶圆厂1VLA然而，GFP表达伴随着微小的囊泡样液泡，并且与所有其他测试菌株相似（图2E），Fab1VLA-GFP仍然位于pcl7Δ和pho80Δ pcl7Δ细胞的周围病灶中，我们认为它们对应于内体（S5E图）。因此，这些数据表明，即使在pho80Δ pcl7Δ菌株中，过度活跃的Fab1突变体本身也未能从内体正确转移到液泡并喂养液泡膜生物发生。
值得注意的是，在pho80Δ pcl7Δ菌株中观察到的表型与上述针对pho81Δ突变体观察到的表型最相似（图1B，1E，2D和2E））。这并不奇怪，因为Pcl7和Pho80是Pho80样细胞周期蛋白家族中唯一已知的与Pho81发生物理相互作用的成员[25，28，29，73]。此外，与pho81Δ菌株类似（图1A），四分体分析证实，在pho80Δ pcl7Δ菌株的情况下，Sch9的存在对于维持生长至关重要（S1图）。
鉴定Pho4作为Pho85和TORC1-Sch9串扰的效应器
为了进一步阐明Pho85信号功能障碍导致sch9Δ背景中合成致死的机制，我们接下来测试了Pho85-Pho80 CDK-cyclin对的三个已知下游靶标的贡献，i。蛋白激酶Rim15和转录因子Crz1和Pho4[31，34，43，67，74]。为此，我们将RIM15，CRZ1或PHO4缺失交叉到pho85Δ和pho80Δ菌株中，然后将其与sch9Δ菌株配对。Tetrad分析表明，PHO4的缺失，而不是RIM15或CRZ1的缺失，允许三重缺失孢子生长，但是，虽然Pho4的丢失减轻了SCH9和PHO80联合缺失的合成致死性，但萌发的sch9Δ pho85Δ pho4Δ孢子仍然病得很严重，因为菌株生长非常差，并且在储存后失去了活力（图7A和S6A， S6B）。有趣的是，Pho4的缺失也挽救了雷帕霉素诱导的pho80Δ突变体的生长抑制（图7B）。这些数据表明，当通过Pho4-Pho85发出信号并且TORC80-Sch1轴失调时，不适当的Pho9介导的转录可能是观察到的合成致死性的原因。
thumbnail 下载：
.PPT幻灯片
.PNG大图
.TIFF原始图像
图 7. 转录因子Pho4是共同靶标Pho85和Sch9。
（A）四分体分析表明，PHO4的额外缺失挽救了pho85Δ sch9Δ和pho80Δ sch9Δ菌株的合成致死率（分别参见绿色和红色表示的基因型）。（B） 雷帕霉素敏感性分析在 YPD 平板上点缀的 WT、pho80Δ、pho4Δ 和 pho80Δ pho4Δ 菌株，不含 50 nM 雷帕霉素 （rap）。 （C）Pho4-GFP在WT，sch9Δ和pho81Δ细胞中定位的显微镜分析。将细胞在选择性合成培养基中生长至对数中期。如图所示，然后将部分WT和pho81Δ培养物洗涤并转移到磷酸盐饥饿培养基中或进行200nM雷帕霉素处理2小时。用DAPI对细胞进行染色以可视化细胞核。（D）北方印迹分析，以监测在用84nM雷帕霉素处理之前或之后WT，pho4Δ，sch1Δ，sch4 pho9Δ，pho9Δ，pho4Δ pho80Δ和sch80Δ pho4Δ pho9Δ菌株中PHO80，GCN4或ACT200对照的表达指示时间。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010641.g007
Pho4控制基因的转录以响应磷酸盐饥饿，但在富含磷酸盐的培养基中，它被Pho85-Pho80磷酸化并从细胞核中排除[67，75]（图7C）。我们分析了TORC1和Sch9是否会影响Pho4的细胞内定位，通过表达C末端标记的Pho4-GFP版本。如图所示，Pho4-GFP融合蛋白定位在指数生长的WT细胞的细胞质中，但是当WT细胞遭受磷酸盐饥饿时，它易位到细胞核中。有趣的是，当用雷帕霉素处理WT细胞以及指数生长的sch4Δ细胞时，Pho9-GFP也位于细胞核中，这表明TORC1-Sch9轴控制转录因子的核输入。然而，Pho4-GFP在雷帕霉素处理的pho81Δ细胞中保持细胞质，表明雷帕霉素处理并未推翻Pho4-Pho85对Pho80的调节（图7C）。此外，我们还进行了北方印迹分析以监测编码高亲和力磷酸转运蛋白的PHO84的表达。正如预期的那样，PHO84的转录在pho80Δ菌株中以Pho4依赖性方式明显上调，但尽管雷帕霉素处理后Pho4的核易位或SCH9的缺失，在这些条件下没有观察到PHO84的诱导（图7D）。相反，雷帕霉素的加入触发了PHO84抑制，瞬时恢复长达60分钟，而SCH9的缺失导致PHO84的组成型低基础表达。当我们使用RT-PCR监测PHO5的表达时，也获得了类似的结果，PHO4是另一种编码酸性磷酸酶的Pho6依赖性基因（S4C图）。因此，即使Pho9存在于雷帕霉素处理的WT和sch84Δ细胞的细胞核中，PHO5和PHO4都没有被诱导。这是否是由于Pho76的失调或PHO调节子表达所需的辅助转录因子之一[1]，仍有待澄清。另一个应考虑的过程是染色质重塑，因为已知该过程由TORC9-Sch80轴通过Ino5控制，并且是打开包括PHO77在内的几种代谢基因的促子处的染色质所必需的[78，<>]。
由于Pho4已被证明可以微调对氨基酸饥饿也有反应的双氧后基因的及时转录[79]，因此我们另外监测了已知Sch9靶标i的表达。e.GCN4编码的一般氨基酸控制途径的转录激活因子[5]。我们之所以选择GCN4，是因为它控制着大量的氨基酸生物合成和氮响应基因[80]，并且因为该转录因子在氨基酸饥饿条件下的稳定性受到严格控制的Pho85信号传导[29]，从而为TORC1-Sch9信号传导提供了一个有趣的串扰点。与我们之前发表的数据一致[5]，sch9Δ菌株在指数生长期间已经显示出GCN4的增强表达，并且在雷帕霉素治疗期间保持了这一水平（图7D）。在pho4Δ菌株中也观察到增强的GCN80表达，鉴于Pho85-Pho80磷酸化引发Sch9的完全TORC1介导的激活，这是预期的。然而，虽然sch9Δ突变体中的去抑制似乎是Pho4独立的，但pho80Δ突变体的去抑制明显由Pho4介导，因为pho4Δ pho80Δ菌株中的GCN4表达谱与WT菌株的表达谱更相似。然而，pho9Δ pho80Δ菌株中SCH4的额外缺失使GCN4再次与Pho4无关（图7D）。这些数据表明，Sch9的缺失推翻了Pho4的要求，从而将Sch9定义为GCN4表达的直接调节因子，并表明Pho4的作用仅限于通过PHO途径进行微调。因此，分析GCN4的这种Pho4依赖性微调是否由Pho84的增强表达和通过Pho81的信号传导介导将是有趣的。
讨论
在本文中，我们旨在了解两种不同的激酶Pho85和TORC1如何控制营养信号传导[11，43]。Pho85或其抑制剂Pho81的缺失在与Sch9缺失相结合时都会导致合成生长缺陷，这不仅表明与磷酸盐传感密切相关，而且表明生长取决于Pho85和TORC1-Sch9信号之间的紧密平衡。我们发现Pho85和TORC1-Sch9在支持生长方面的这种关系是多方面的，涉及Pho80和部分冗余的循环蛋白Pcl6和Pcl7。
在液泡和信号内体发生的事件
众所周知，TORC1磷酸化并激活液泡膜上的Sch9[1，22，52]。我们现在提供的证据证明Pho85-Pho80在Ser处直接磷酸化Sch9726并且这启动了Sch9，以便由TORC1进一步激活。磷酸化Ser的引发作用726之前曾因附近的表位Thr而引起注意723在研究 TORC1 依赖性 Sch9 磷酸化时 [1]，但现在我们通过显示 Ser726被Pho85-Pho80靶向，其启动作用也适用于其他依赖TORC1的表位，例如Thr737.耐人寻味的是，塞尔·726紧邻C端疏水基序（HM;包含Thr737），并且已经描述了哺乳动物S1K6后续mTORC1介导的HM磷酸化的类似引物位点（图8A）。在这种情况下，S6K1-Ser371，就像施9-Ser726，之后还有脯氨酸，并被脯氨酸定向激酶（包括Cdc2-cyclin B和GSK-3）磷酸化[81-84]。值得注意的是，Ser371-亲-372S6K1中的基序被创造出来，称为TM，它发生在一些AGC激酶中，当激酶在Ser位置磷酸化时，它会稳定激酶和/或促进HM基序内的磷酸化状态[85，86]。基于S6K1-Ser的功能类比和结构相似的定位371和施9-塞尔726因此，在HM的上游，我们推断Ser726-亲727Sch9中的基序对应于TM，TM引物位点代表进化保守原理，允许S6K1和Sch9整合其他信号（图8A）。
thumbnail 下载：
.PPT幻灯片
.PNG大图
.TIFF原始图像
图8. PHO通路与TORC1-Sch9信号之间的串扰以及转弯基序启动原理的守恒。
（A）酵母Sch9和哺乳动物S6K1的示意图，以突出TM启动原理的进化守恒性。指示的是 T 环内的磷酸化位点，其由 Sch1 中的 Pkh2/9 和 S1K6 中的 PDK1 靶向，以及 Sch85 中的 Pho80-Pho9 和 S3K2 中的 GSK6 和 Cdc1-CycB 靶向的转弯基序 （TM） 内，以及 C 端疏水基序中的磷酸化位点，该基序由 Sch1 中的 TORC9 和 S1K6 中的 mTORC1 靶向。（B）显示的是基于我们当前研究中先前报告的数据和观察结果的假设模型，以描述PHO途径和TORC1-Sch9轴之间相互作用的可能不同连接。在内体，TORC1和Pho85-Pho80磷酸化并刺激Fab1脂质激酶亚基将PI3P转化为PI[3，5]P2（灰色箭头）[22，50]。Pho85-Pho80还磷酸化Vac7（白色亚基）[50]，从而可能增强内体融合。Pho85-Pcl6可作用于Vac14-图4亚复合物，诱导图4（粉红色亚基）的蛋白磷酸酶活性，以缓解Fab1亚基的抑制性自磷酸化[87]。在液泡处，Sch9通过结合PI[3，5]P招募2它被Pho85-Pho80磷酸化，Pho9为Sch1随后的磷酸化和TORC1激活启动。在Fab85复合物中，Pho7-Pcl14可能作用于Vac4-FIG4亚复合物以控制图3的脂质磷酸酶活性，从而允许从PI中回收PI3P[5，<>]P2（粉色箭头）[57，58]活性Sch9阻止Pho4转录因子进入核，而Pho4-Pho85对Pho80的磷酸化触发其从细胞核输出[34，67]，从而阻止编码高亲和力磷酸转运蛋白的PHO84的转录[88]。Pho84对磷酸盐的摄取抑制Pho81，而Pho85又作为Pho80-Pho85和Pho7-Pcl28的抑制剂[73，<>]。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010641.g008
Pho85-Pho80磷酸化Ser的事实726这意味着Sch9的完全活化需要通过CDK抑制剂Pho81进行磷酸盐摄取和磷酸盐传感，这与在pho9Δ菌株中观察到的Sch81磷酸化增加一致。这也与观察结果一致，特别是在磷酸盐饥饿条件下，表达磷酸突变体Sch9S726A与表达拟磷酸变体Sch9的细胞相比，显示出更长的寿命S726D或 Sch9文晔等位基因。我们并不是第一个注意到与磷酸盐信号传导有关的人。最近的一项研究表明，通过高亲和力转运蛋白Pho84获得磷酸盐与通过Sch1磷酸化测定的TORC9活性之间存在联系[89]。作者提出EGO复合物的Gtr1 Rag-GTP酶作为TORC1上游的主要磷酸盐信号接收器，从而与Pho85-Pho80并行作用。鉴于Sch9是PKB/Akt1的直系同源物，值得注意的是，在高磷酸盐饮食激活Akt-mTORC1-S6K途径从而加速衰老的小鼠中，磷酸盐也发现了类似的作用[90]。
Pho85信号还引发了第二个重要效应，同样有助于TORC1-Sch9信号轴的调节。就像TORC1[22]一样，Pho85信号传导也控制Fab1在内体和液泡膜之间的分布。因此，Pho85及其细胞周期蛋白对PI[3，5]P的影响2液泡膜中的含量，而液泡膜又是Sch9募集所必需的，并且对其TORC1依赖性磷酸化至关重要[21]。我们表明，主要是Pho80和Pcl7循环蛋白在这里发挥作用。尽管控制了PI[3，5]P2Pho85信号合成已被描述为应激反应[50]，很明显，还需要保持最佳PI[3，5]P2在非应激条件下的合成，观察证明pho85Δ和pho80Δ细胞的显着部分显示出扩大的液泡，而pho81Δ和pcl7Δ细胞在指数增长期间似乎具有更多碎片化的小液泡。因此，问题是Pho85信号传导如何干扰Fab1的内体和液泡分布。我们关于 Fab1-GFP 和 Fab1 的数据VLA-GFP表明，除了控制Fab1本身的活性[50]外，Pho85-Pho80还确保了信号内体的最佳融合和Fab1从液泡膜的最佳回收。要理解这些动作，必须查看 Fab1 复合体。除了其N端FYVE结构域和C端脂质激酶结构域外，Fab1亚基的中心区域还包含两个额外的保守结构域，i。e. 与“含伴侣蛋白的TCP-1”伴侣蛋白和富含半胱氨酸的结构域共享同源性的CCT样结构域。这些结构域允许Fab1与Vac14和图4亚基结合。Vac14是一个协调Fab1和图4活动的支架，后者是PI[3，5]P2-5-磷酸酶，此外还具有蛋白磷酸酶活性，可抵消Fab1激酶活化环中的抑制性自磷酸化[20，87]。支架Vac14还与调节亚基Atg18和Vac7相互作用。这两个亚单位都特别重要。Atg18，也称为Svp1，在自噬前结构和内体处结合PI3P，但PI[3，5]P2在液泡中，它在从液泡到晚期内体的膜循环中起重要作用[20，56，91，92]。一致地，我们之前通过使用荧光PI[3，5]P显示2-记者认为，ATG18的缺失使该报告基因从信号内体转移到液泡，这确实表明Atg18参与了Fab1复合物从液泡到信号内体的回收[22]。Atg18需要Vac7在空泡膜募集[20，56]。Vac7是一种跨膜蛋白，是被Pho1-Pho85磷酸化的Fab80复合物的阳性调节因子[20，50]。最近，研究表明，Vac7与Tag2共享一个晚期胚胎发生丰度-1（LEA）结构域，Tag7是一种以其终止自噬的作用命名的蛋白质，这预测Vac1和Tag93对脂质转移都很重要[7]。这提出了Pho85-Pho80对Vac3进行磷酸化的可能性，以促进内体融合，将PI[5，2]P1和Fab8复合物递送到液泡中，如图85B所示。关于Pho7-Pcl3的作用，我们的数据表明它主要影响液泡PI[5，<>]P2内容和液泡裂变。因此，一种可能的情况是Pho85-Pcl7降低PI[3，5]P2通过将图1复合物置于有利于图4脂质磷酸酶活性的配置中来转换PI[3，5]P2回到液泡处的PI3P[57，58]。因此，Pho85-Pcl7要么针对图4，要么靶向Vac14，因为图4不仅需要被Vac14招募到Fab1复合体中，而且还必须与Vac14支架相互作用才能激活[57，87]。最后，我们的数据还强烈表明，Pho85-Pcl6 CDK-cyclin对反对Pho85-Pcl7在控制Fab1复合物中的作用。这一点通过观察到Pcl7的损失不再阻止pho80Δ pcl6Δ突变体中扩大的液泡的形成而变得最明显，而在pho80Δ菌株中很容易出现这种情况。此外，PCL6的额外删除也阻碍了Sch92天3E以挽救pho80Δ菌株在含雷帕霉素培养基上的生长，这可能是由于PI[3，5]P的进一步降低2水平和Sch9的空泡招募2天3E在pho80Δ pcl6Δ菌株中。因此，很可能Pho85-Pcl6也会影响Vac14-FIG 4亚复合物，例如，增强图4的蛋白质磷酸酶活性，以抵消Fab1在Ser处的自磷酸化。48和塞尔2053，抑制Fab1亚基的基础活性[87]。虽然目前这只是推测性的，但重要的是要认识到Pcl6和Pcl7的相反作用仅在pho80Δ背景中观察到，其中Fab1激酶及其调节因子Vac7的磷酸化受到损害[50]。重要的是，还有许多其他参与者参与液泡裂变/融合，例如Env7 [94]，HOPS亚基Vps41 [95]或I-BAR特征蛋白Ivy1，它似乎控制PI3P在信号内体中对Fab1的可用性[24，96]。因此，需要进一步的研究来充分了解Pho85和上述细胞周期蛋白在控制内体-液泡动力学中的作用。
Pcl7的损失抵消了Pho80在控制液泡PI方面的损失[3，5]P2内容和Sch9的招募很有趣，因为它们是与CDK抑制剂Pho81相互作用的两种细胞周期蛋白。表明Pho81通过调节细胞PI[3，5]P发挥平衡作用2含量与磷酸盐可用性的关系。至少对于Pho85-Pho80，Pho81的抑制作用取决于肌醇庚磷酸盐或IP7[25]，强调了肌醇多磷酸信号传导对维持PI适当平衡的重要性[3，5]P2水平和磷酸盐可用性。Kcs1是酵母中主要的IP6激酶，毫不奇怪，当与Sch9丢失相结合时，其缺失是合成致死的[11]。与此一致，我们观察到PI[3，5]P的适当平衡2水平不仅对Pho85信号传导至关重要，而且对TORC1信号传导也至关重要，并且Fab1和Sch9的活性必须保持一致才能支持雷帕霉素的生长。这与先前的观察结果一致，即菌株含有 FAB1 或 TORC1 拟磷酸晶圆厂缺失16D等位基因均以 Sch9 磷酸化减少为特征，对雷帕霉素更敏感，这与表达磷酸突变体 Fab1 的菌株相反6安其中Sch9磷酸化水平与WT细胞相似[22]。
另一个有趣的方面是，Pcl7的表达是细胞周期依赖性的，并且在S期达到峰值，而Pcl6的表达是本构性的[28]。这使得Pcl7成为控制PI[3，5]P的主要候选者2细胞周期过程中的水平。事实上，PI[3，5]P2介导的液泡裂变和融合过程不仅允许在环境变化时调整液泡表面体积比和从液泡到高尔基体的逆行交通，而且在细胞周期中，液泡膜裂变对于细胞器传递到生长的子细胞很重要[97]。显然，Pho85-Pho80和TORC1也在协调空泡裂变/聚变平衡和细胞周期中发挥作用[22，31，50，51，97-99]。关于Sch9，研究表明，这种激酶仅在成熟过程的后期被招募到新形成的液泡中，并且Sch1的TORC9依赖性磷酸化随后向细胞周期机制发出液泡成熟的信号，从而决定细胞周期进程[52]。最近，液泡成熟与细胞周期进程之间的这种联系进一步加强，表明不仅TORC1在起作用，而且同时Sch9被CDK9同系物Bur1磷酸化。基于质谱，作者鉴定了1个Bur1敏感表位，包括Pkh2/<>磷酸表位Thr570以及规范的CDK站点723和塞尔726，后者是我们与Pho85-Pho80引发相关的残基[70]。Bur1，也称为Sgv1，是一种必需蛋白，被认为与G1细胞周期蛋白Cln3在同一途径中起作用[100]。它主要（但不完全）位于细胞核中，与细胞周期蛋白Bur2一起作用，修饰组蛋白、控制转录和调节端粒长度[101]。后者特别令人感兴趣，因为已知端粒长度也受到Pho85-Pho80、Gtr1或PI34激酶的催化（Vps15）和调节（Vps3）亚基缺失的影响[102]。因此，人们很容易推测，特别是端粒长度可能作为额外的检查点，通过Sch9的磷酸化向细胞周期机制发出信号。一个问题可能是Bur1/Bur2的核定位。但是，请注意，Pho80可以将其他蛋白质拖入细胞核，如Pho81和Fab1所示[50，103]。Sch9是否也是如此目前尚不清楚，因为我们在研究中没有观察到GFP-Sch9的核积累，但至少在高渗休克下，诱导细胞周期进程暂时停止，据报道Sch9是核的，并作为应激反应基因的染色质相关转录激活剂[104，105]。
最后，Pho85信号在同时控制PI[3，5]P中的作用2合成和引发Sch9以被TORC1激活可能在高等真核生物中概念上是保守的。因此，在神经元细胞中，Pho85-Pho80直系同源CDK5-p35复合物直接磷酸化S6K1在Ser411位于自身抑制结构域内，从而控制树突棘形态发生，在这一过程中，磷酸肌醇的代谢周转和区室化起重要作用，CDK5-p39复合物控制内体衔接蛋白WD重复和含FYVE结构域1（WDFY1）[106-108]。有趣的是，这里还有Ser411磷酸化引发S6K1随后雷帕霉素敏感的Thr磷酸化389和激活[109]。在胰岛素刺激的脂肪细胞中，Cdk5依赖性磷酸化不仅适用于Ser411但对于塞尔424和塞尔429此外，后者似乎决定了S6K1底物对参与脂质代谢的酶的特异性改变[110]。此外，CDK5–p35还磷酸化哺乳动物Fab1/PIKfyve以正向调节PI[3，5]P2产生[50]和脂肪细胞增强的PI[3，5]P2水平与mTORC1介导的S6K1刺激有关[111]。最后，CDK5在前列腺癌细胞增殖中也显示出与PI3K-Akt级联反应的显着串扰，因为CDK5似乎与Akt发生物理相互作用以控制Akt膜隔离和雄激素受体介导的激活[112]。
细胞核中发生的事件
除了在液泡中发生的过程外，我们还表明，由不平衡的Pho85和TORC1信号引起的合成致死性也与Pho4有关。当细胞在富含磷酸盐的营养丰富的培养基中生长时，该转录因子被Pho85-Pho80磷酸化，因此从细胞核中排除[34，113]。我们现在表明，如果Sch4是活跃的，Pho9被保留在细胞质中，并且在雷帕霉素治疗或Sch9丢失时它易位到细胞核。这种核胞质调控让人联想到Rim15的控制，Rim85也通过Pho80-Pho14磷酸化从细胞核中排除，当被TORC3-Sch3磷酸化时，它锚定在细胞质中的1-9-31蛋白上[43，14]。有趣的是，之前的一项研究报道，3-3-1编码基因BMH2或BMH4的缺失导致Pho114调控基因表达的异质性[4]。然而，由Sch9活性丧失触发的Pho84的核定位不足以诱导PHO5和PHO9的转录，两者都是PHO调节子的典型代表。根据酵母基因组数据库Sch4和Pho4的物理相互作用，并基于雷帕霉素敏感的磷酸化蛋白质组的综合质谱分析，Pho9具有Sch62介导的磷酸化的完美RRxS*共识位点[9]。因此，Sch4很可能直接靶向Pho4来控制其活性。众所周知，Pho67在不同的残基上磷酸化，这些残基控制着核进出口并决定其转录活性[113，115，116，4]。Pho5的输出需要Msn117[9]，有趣的是，根据我们之前报道的SGA分析判断，SCH5和MSN11的组合缺失可能导致合成的病态表型[4]。或者，或者同时，雷帕霉素处理的WT和sch9Δ细胞中缺乏核定位Pho4的转录诱导可能是由于不相容的染色质结构阻止Pho84获得PHO5和PHO1的促进子。已知TORC9-Sch80轴通过Ino5在许多靶基因上发出染色质重塑信号，这似乎至少包括PHO77[78，<>]。
对于GCN4的表达，我们的数据证实了先前报道的Sch9损失后指数增长期间其去抑制的结果。 与 Pho85-Pho80 引发随后 TORC1 介导的 Sch9 活化一致，在 pho80Δ 菌株中观察到类似的去抑制，但与 sch9Δ 菌株相反，GCN4 在 pho80Δ 中的去抑制 依赖于 Pho4。即便如此，Pho4的要求被pho9Δ pho80Δ菌株中SCH4的额外缺失所推翻，这表明Sch9是直接控制GCN4表达的下游靶点，并将Pho4的作用限制在通过PHO途径进行微调。鉴于 Pho4 介导 pho84 高亲和力磷酸转运蛋白在 pho80Δ 菌株中的大量表达，我们相信这种微调可以通过一个模型来解释，其中 Pho84 磷酸摄取抑制 pho81Δ 细胞中的 Pho80，导致活性 Pho85-Pcl7 激酶复合物，进而降低 PI[3，5]P 2水平，从而减少Sch9的液泡募集和活化（图8B）。如果为真，那么Pho4的缺失挽救了SCH9和PHO80联合缺失时看到的合成致死性的原因是防止Pho84的异常表达，否则会导致无法调整PI[3，5]P2TORC1-Sch9 输出函数中的电平。这意味着磷酸盐的摄取通常严格校准为其他营养来源的可用性，包括氨基酸和氮。Gcn4在这里起着重要作用，因为Pho85-Pcl5触发其核降解，而Pho81和Pho85-Pcl7需要维持其稳定性，因此这种短寿命转录因子的稳定性也受到磷酸盐传感机制的严格控制[29]。磷酸盐摄取的校准显然也与可发酵碳源的可用性有关，因为Pho84被证明是向PKA发出信号的转录受体[118]，并且因为增强的PKA会影响质膜Pho84的下调和内化[119]。Pho84的重要作用也以另一种方式反映出来。它是将逆行反应与复制寿命延长联系起来的主要参与者[120]，后者同样依赖于PKA，Pho85-Pho80，TORC1和Sch9[121，122]，显然，也由端粒长度决定[123]。此外，研究表明，PHO4的额外缺失部分恢复了pho85Δ和pho80Δ菌株的短暂表型[122]，这与我们的数据一致。
结语
这项研究从观察SCH9和PHO85或PHO81缺失组合时的合成致死性开始[11]。我们的数据现在提供了营养信号中这些关键参与者之间的串扰的第一瞥，表明这种串扰是一个复杂但巧妙的问题，致力于通过不同水平的过程相互作用来校准各种营养信号触发的反应。我们的数据证明了磷脂酰肌醇代谢在液泡膜上决定Sch9募集的重要性，Pho9的Sch85磷酸化导致随后的磷酸化和TORC9激活Sch1的结果，以及Pho85和TORC1-Sch9信号传导的合作以与之前描述的Rim4类似的方式控制Pho15的核细胞质易位[31，因此，很明显，Sch43 充当中央积分器，允许对齐不同的输入信号并实现响应的准确性。鉴于Sch9也是植物鞘氨醇依赖性激酶Pkh9、Pkh1和Pkh2[3，1，14]和细胞能量传感器Snf15[1-16]的底物，阐明这些输入如何干扰上述Pho18依赖性过程将是一件有趣的事情。
材料和方法
酵母菌株、质粒和生长条件
本研究用于表型分析的酿酒酵母菌株列在S1表中。如前所述，为本研究创建的缺失菌株是使用基于聚合酶链反应的破碎盒[124]或相反交配类型的单倍体缺失菌株的交配产生的，然后进行孢子形成和四联体分析。在随后的实验中仅使用具有BY4741基因型（his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0）的缺失突变体。Sch9的菌株S726A和施9S726D点突变是通过CRISPR/Cas9获得的[125]。为了创建Cas9质粒（pMC019;参见S2表），使用了“SCH9-S726 Proto F”和“SCH9-S726 Proto R”引物（S3表）。我们与质粒和相应的单链DNA供体序列模板（S3表）共同转化，以实现同源定向修复。QuikChange 试剂盒（安捷伦，巴塞尔，瑞士）使用质粒 pMC9 作为模板和寡核苷酸“SCH027 mut T028A”、“SCH029 mut S014A”和“SCH9 mut T723A-S9A”（S726 表），引入质粒 pMC9、pMC723 和 pMC726 中的 SCH3 点突变。酵母细胞使用Gietz方法转化[126]。将酵母细胞在YPD培养基中生长过夜，然后稀释至0.1OD600纳米在上午。将细胞生长至指数期，用无菌水洗涤，然后用1mL的0.1M LiAc洗涤。相应的 μL 10 OD600纳米的细胞用于转化。转化混合物含有 240 μL 50% PEG、36 μL 1M LiAc、2 μL pRCC-K 和 20 μL 供体序列。将细胞在42°C下孵育40分钟。转化后，将细胞重新悬浮在YPD中并在30°C下生长3小时，然后接种到含有G418的YPD板上。为了鉴定在感兴趣的SCH9区域中含有正确突变的克隆，对克隆进行了测序。
本研究中使用的许多质粒是来自其他研究小组的慷慨礼物（S2表）。着丝粒质粒 pRS413-Fab1 和 pRS413-Fab1VLA质粒从pRS416-FAB1和pRS416-fab1-14亚克隆（由L. Weisman提供，[55]）。Fab1表达的质粒VLA-GFP在其自己的发起人的控制下由PCR创建。从表达Fab1-GFP的质粒开始，通过PCR扩增pRS416质粒的骨架、FAB1启动子、GFP和FAB1终止子。使用单独的PCR，使用pRS1-fab416-1（由L. Weisman提供，[14]）作为模板扩增FAB55-VLA。将两种PCR产物与Gibson组装预混液（美国伊普斯威奇新英格兰生物实验室）连接[127]。连接产物用于E.通过测序确认大肠杆菌转化和质粒。构建 Sch9 （Sch9-FLAG） 的 C 终端 FLAG-tagged （DYKDDDDK） 版本，包括 Sch9文晔， Sch9T723A， Sch9S726A， Sch9T723A/S726A，施9T737A， Sch9S758A和 Sch9S765A以及克隆到着丝粒质粒pYCPlac33已有前文描述[18]。
酵母细胞在含有2%杆菌蛋白胨，1%酵母提取物和2%葡萄糖（YPD）的标准富培养基中或在含有0.5%（NH4)2所以4，1.9 g/l 酵母氮基质，不含氨基酸（Formedium，诺福克，英国），根据需要补充合成选择性脱落混合物 （SD） 或完全合成混合物 （SC）（Formedium，诺福克，英国），以及 2% 葡萄糖。固体培养基含有额外的1.5%琼脂。对于磷酸盐饥饿，将细胞在SC培养基上生长到对数中期，然后转移到含有硫酸铵的酵母氮碱中，不含磷酸盐（Formedium，诺福克，英国），补充有0.5%硫酸铵，完整的合成氨基酸混合物和4%葡萄糖。对于氮饥饿，将细胞转移到不含氨基酸和不含硫酸铵的酵母氮碱（Formedium，诺福克，英国）中，补充有4%葡萄糖。对于碳源饥饿，将细胞转移到不含葡萄糖的SC培养基中。
雷帕霉素敏感性分析
将细胞在YPD，SD或SC培养基中生长至对数中期，稀释至光密度600nm（OD600纳米） 的 0.1。并在 YPD、SD 或 SC 平板上点样连续稀释 （1：10），有或没有不同浓度的雷帕霉素，如图所示，并在 3°C 下生长 5 至 30 天后成像。
四联体分析
评估Sch9与Pho85-cyclins遗传相互作用的二倍体是通过将sch9：：HIS3（BY4741，JW 01 306）或sch9：：LEU2（BY4741，JW 01 307）与单个细胞周期蛋白缺失突变体杂交而成的，形成酵母敲除收集（YKO;EUROSCARF，BY4742）。同样，从YKO收集（EUROSCARF，BY85）获得被确定为Pho1和TORC9-Sch4742可能共同靶标的基因缺失菌株，并与pho85：：KANMX4（BY4741，JW 03 595）或pho80：：HIS3（BY4741，JW 03 721）杂交。通过在含有1%乙酸钾，0.1%KHCO的孢子培养板上点样和孵育二倍体细胞来诱导孢子形成3，pH 6.0 在 5°C 下保存 6-25 天。 在室温下用0.02mg / ml裂解酶处理四分体10分钟，并使用显微操纵器（辛格仪器）在YPD板上解剖。3-5天后，通过将发芽孢子接种在特定选择性培养基上和/或通过PCR分析进行基因分型。至少分析了6个四分体，图中显示了代表性的孢子。
磷酸标签和蛋白质印迹分析
为了分析Sch9与磷酸标签SDS-PAGE的差异磷酸化，表达HA-Sch9或Sch9-FLAG的细胞在合成培养基至中对数期上生长。对于HA标记的Sch9实验，收集细胞并用冰冷的PBS洗涤，随后在液氮中快速冷冻。使用Triton-Deoxy胆酸盐缓冲液（50 mM HEPES pH7.4;13.5 mM NaCl;1% Triton X-100;0.05%脱氧胆酸钠）进行蛋白质提取，并辅以蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物（赛默飞世尔科技，比利时梅雷尔贝克）。通过随后的几个离心步骤清除细胞裂解物。使用Bradford方法（Bio-Rad，Temse，比利时）测量蛋白质浓度，并将样品稀释至补充有Laemmli上样缓冲液的裂解缓冲液中的相同蛋白质浓度。样品在含有6μM磷酸标签的5.25%SDS-PAGE凝胶上运行（富士胶片和光化学，德国诺伊斯）。使用抗HA抗体（罗氏，默克，Hoeilaart，比利时）检测全长HA-Sch9。对于FLAG标记的Sch9实验，细胞在收集前被热灭活，蛋白质提取物的制备遵循前面描述的方案[18]。检测使用抗FLAG抗体（安捷伦，巴塞尔，瑞士）完成。两种方法都产生了相当的结果。
为了分析Sch9磷酸化水平，表达GFP-Sch9，GFP-FYVE-Sch9或仅内源性Sch9的细胞在合成培养基上生长到对数中期。如前所述，在尿素裂解缓冲液中使用磁珠跳动进行细胞裂解物制备[61]。磷酸化特异性抗Sch9-P-Thr737和抗Sch9抗体[61，128]，以及抗GFP抗体（罗氏，默克，Hoeilaart，比利时）分别用于检测磷酸化，内源性Sch9和GFP-Sch9在SDS-PAGE凝胶上运行样品后。使用ImageJ进行密度测量以量化磷酸化水平。抗GFP抗体还用于测定Fab1-GFP和Fab1的表达水平VLA-GFP构建体与上样对照Adh2（抗Adh2抗体，密理博，默克，Hoeilaart，比利时）相比。为了检测Atg13和Lst4磷酸化水平，用表达标记构建体Atg13-HA的质粒转化菌株3或 Lst4-V5。样品制备，使用抗 HA 或抗 Lst4-P-Ser 进行检测523抗体和定量均如前所述[62，66]。
蛋白质纯化
医 管 局2-Pho85， HA2-河粉85E53A（激酶-死）和Pho80-GST根据[31]中的描述纯化。用质粒pVW85、pVW883和p884转化pho946Δ菌株（S2表）。将细胞在SD-Ura液体培养基中生长过夜。早晨将细胞稀释至0.2OD600纳米在 2 L SD -Ura。为了诱导Pho80-GST表达，用500μM铜SO处理细胞41小时，在收获细胞之前。通过过滤收集细胞，在液氮中冷冻，并在酸洗玻璃珠存在下，在10 mL裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 7.5，150 mM NaCl，0.5 mM EDTA，0.1%NP-40，10%甘油，1 mM PMSF，1 mM DTT，400 mM Pefabloc，罗氏完全蛋白酶抑制剂不含EDTA）中使用Precellys均质器进行低温破碎。将清除的裂解物与抗HA磁珠（瑞士巴塞尔费希尔科学公司）在2°C下孵育4小时用于HA2-Pho85 和 HA2-河粉85E53A纯化和谷胱甘肽磁性琼脂糖珠（费雪科学股份公司，瑞士巴塞尔）用于Pho80-GST纯化。用裂解缓冲液洗涤5次后，HA珠与Pho85或Pho85偶联E53A重悬于250 μL洗脱缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 7.5，150 mM NaCl）中，并在加入80%甘油后储存在10°C。将GST偶联珠与Pho80在室温下在250 μL洗脱缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 7.5，150 mM NaCl，10 mM L-谷胱甘肽还原）中洗脱2小时。
携带Sch9质粒的酵母细胞R650-I824-TAP表达在补充有0.01%蔗糖的SRaffinose-Ura中生长过夜。第二天，在0.2 OD600纳米，向细胞中加入2%终半乳糖6小时，以诱导Sch9R650-I824-点击表达式。通过过滤收集细胞，在液氮中冷冻，并使用Precellys均质器在10mL裂解缓冲液（50mM Tris-HCl pH 7.5，150mM NaCl，0.5mM EDTA，0.1%NP-40，10%甘油，400mMPefabloc，罗氏完全蛋白酶抑制剂不含EDTA）中进行低温破碎。将清除的裂解物与IgG偶联的Dynabeads M-270（赛默飞世尔科技，瑞士巴塞尔）在2°C下孵育4小时。 用裂解缓冲液洗涤5次后，Sch9R650-I824用 150% TEV 蛋白酶在 50 μL TEV 缓冲液（7mM Tris-HCl pH 5.0，5.2mM EDTA）中洗脱，加入 80% 甘油后储存在 10°C。纯化的蛋白质通过SDS-PAGE分离，并用Sypro Ruby（Invitrogen，赛默飞世尔科技，瑞士巴塞尔）染色以进行定量。
激酶测定
用HA进行激酶测定2-磷85- 和 HA2- 河粉85E53A-结合磁珠，如[31]中所述。反应在激酶缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 7.5，20 mM MgCl2，1 毫米多密度）。用50ng激酶和Pho80和40ng底物进行反应。通过加入ATP混合物（反应中的最终浓度：1mM ATP，10μCi γ-[32P]-ATP）开始反应并在30°C下进行30分钟。 通过加入2X SDS-PAGE样品缓冲液，停止反应。将样品在65°C下变性10分钟，用SDS-PAGE分离蛋白质，用Sypro Ruby（Invitrogen，赛默飞世尔科技，瑞士巴塞尔）染色以评估负载，并使用磷酸化成像仪（台风FLA 9500;GE Healthcare，瑞士Opfikon），如[22]中所述。
荧光显微镜
Sch9的定位是在从质粒[9]表达GFP-Sch1的细胞中或通过基因组学确定的。基因组标记的pho85Δ，pho80Δ和pho81Δ菌株是通过将SCH9：：GFP-SCH9和SCH9：：GFP-FYVE-SCH9菌株（由松浦A. Matsuura慷慨提供）与各自的缺失菌株杂交而产生的。在含有p PHO4pr-PHO4-GFP质粒的细胞中监测Pho4定位[129]。为了评估液泡形态，用脂质相互作用染料FM4-64（Invitrogen，赛默飞世尔科技，比利时梅雷尔贝克）染色细胞1小时。对于所有这些测定，细胞生长到对数期中期（OD600纳米1-2）在含葡萄糖的合成培养基中。如果包括葡萄糖饥饿条件，则洗涤细胞两次并在缺乏葡萄糖的培养基上饥饿1小时。
大多数图像是使用配备徕卡DFC8相机的徕卡DMi9000 S平台荧光显微镜或配备徕卡DFC 4000G相机的徕卡DM 300B荧光显微镜（徕卡显微系统公司，比利时迪海姆）生成的。使用ImageJ施加LUT火来比较GFP信号的强度。当指示的图片使用惠更斯软件（版本 18.10;科学体积成像公司，荷兰希尔弗瑟姆）。Fab1-GFP 和 Fab1 的共聚焦图像VLA-GFP结构是用倒置转盘共聚焦显微镜（尼康Ti-E倒置显微镜，VisiScope CSU-W1，荷兰阿姆斯特尔芬）捕获的，该显微镜配备了PCO.edge 4.2 sCMOS相机和100x 1.3 NA油浸尼康CFI系列物镜。
RNA提取、RT-PCR和北方分析
如前所述进行北方印迹分析[5]。简而言之，酵母培养物在YPD上过夜生长。然后将培养物稀释并使其生长至OD600纳米的 1.5。然后取对照样品（-30和-15分钟）。接下来，加入雷帕霉素至终浓度为200 nM，并在15、30、60和120分钟后取样。 如前所述进行RNA提取和北方印迹[43]。过滤器与32P-dCTP标记的探针，使用High Prime试剂盒（罗氏，默克，Hoeilaart，比利时）生成。用于生成探针的引物列在 S3 表中。清洗后，过滤器暴露于X射线胶片（AGFA，Mortsel，比利时）。
对于用于 PHO5 表达分析的 RT-PCR，使用第一链 cDNA 合成试剂盒（Nzytech，葡萄牙利萨邦）对总 RNA 的 300 ng 进行逆转录。NZYSpeedy qPCR绿色预混液 SYBR绿色预混液（Nzytech，利萨邦，葡萄牙）用于在应用生物系统7500快速qPCR系统（默克生命科学，葡萄牙阿尔热斯）中进行定量PCR。使用Δ2CT方法分析数据，并标准化为同一样品中ACT1，PDA1和TDH2基因的表达。使用的引物对列在 S3 表中。
在分离液泡下进行GFP-Sch9定量
如前所述分离表达WT、pho9Δ和fab85Δ细胞的GFP-Sch1的液泡[130]，除了一些微小的变化。酵母培养物在YPD中生长至约OD600纳米1.收获细胞，洗涤一次，并重悬于含有0mM DTT的03，8M Tris-HCl pH 9，10中。在10°C孵育30分钟后，将细胞在30°C下在球状缓冲液（YP 0.2%葡萄糖;0.6M山梨糖醇;50mM KP我;0.1毫米培法布洛;6U酶解酶/OD600纳米单位）至少30分钟。将收集的球状体重悬于15%Ficoll缓冲液（15%ficoll;10mM管/ KOH pH 6.8;0.2M山梨糖醇;0.1mM培法布洛，0.1μg/ ml亮肽素，10μg/ ml o-phenantrolin，0.5μg/ ml胃抑素A），其中每50OD加入0μl4.100mg / ml二乙氨基乙基（DEAE）葡聚糖600纳米单元格的单位。在冰上孵育2分钟后，然后在2°C下孵育30分钟，将球状体悬浮液转移到透明的SW41管中（贝克曼库尔特，苏亚莱，比利时）。将8%Ficoll缓冲液，4%Ficoll缓冲液和0%Ficoll缓冲液小心地移液到顶部，以产生不连续的ficoll梯度。将样品在SW90转子中以30'000rpm离心41分钟，温度为4°C（贝克曼库尔特，苏亚莱，比利时）。从0%-4%的丝状界面收集液泡级分后，通过在10mM管/ KOH pH 6.8中稀释10/5200并在4g，1°C下离心6分钟来进一步浓缩液泡。 通过蛋白质分析监测分离的液泡囊泡的纯度，使用抗Vph1（Abcam，剑桥，英国），抗ATP1V1A（Abcam，剑桥，英国），抗porin（Invitrogen，Thermo Fisher Scientific，Merelbeke，比利时），抗Pma0（由B. André提供），抗Dpm1（Invitrogen，Thermo Fisher Scientific，Merelbeke，比利时）。用布拉德福德方法测量总蛋白质浓度（Bio-Rad，Temse，比利时）。将获得的液泡囊泡在10mM管/ KOH pH 6.8中稀释至8.4μg/μl，并用64μM FM4-64染色（Invitrogen，赛默飞世尔科技，比利时梅雷尔贝克）。GFP 和 FM485-518 信号强度分别使用 530/645 滤光片对和 4/64 滤光片对使用 Fluoroskan Ascent FL 微孔板荧光计（赛默飞世尔科技，比利时梅雷尔贝克）测量。确定GFP相对于每个样品中的FM9-<>或蛋白质含量的比率，作为液泡膜上GFP-Sch<>丰度的量度。
支持信息
SCH9与Pho85信号通路不同参与者的遗传相互作用。
显示 1/10： pgen.1010641.s001.tif
跳到无花果共享导航
https://ndownloader.figstatic.com/files/39273135/preview/39273135/preview.jpg
1 / 10
下载
无花果分享
S1 图 SCH9与Pho85信号通路不同参与者的遗传相互作用。
通过将单倍体SCH9缺失菌株与携带PHO85，PHO81，单细胞周期蛋白缺失或双细胞周期蛋白缺失的单倍体菌株杂交产生二倍体。四分体分析仅显示SCH9与PHO85，PHO81，PHO80，PCL6 PCL7和PHO80 PCL7之间的遗传相互作用，如红色所示。将解剖的孢子生长在YPD平板上，并在3°C下5至30天后拍照。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010641.s001
（提夫）
S2 图 TORC1-和Pho85信号通路之间的相互作用。
（一、二）缺乏Pho85，Pho80，Pho81，单个细胞周期蛋白（A）或两个部分冗余细胞周期蛋白（B）的WT菌株或突变菌株在YPD上呈指数增长，稀释至OD600纳米在不使用或含0 nM雷帕霉素的YPD平板上点样1.50和2倍连续稀释液。菌株在4°C下生长30至85天。 （C） 表达GFP-Sch80的指数生长WT，pho81Δ，pho9Δ和pho<>Δ细胞的免疫印迹分析 文晔来自内源性Sch9之外的游离质粒。施九-特尔737基于抗P-Sch9的密度测定，定量了GFP-Sch9和内源性Sch9的磷酸化水平T737和抗Sch9信号，并归一化为WT细胞。数据表示为平均值±标准差。配对双尾学生T检验用于计算显著性（*，P < 0.1; **，P < 0.01; ***，P < 0.001）。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010641.s002
（提夫）
S3 图 GFP-Sch9在细胞中的磷酸化，在液泡膜上具有增强的Fab1活性和GFP-Sch9丰度。
（A） 表达 Fab1 或 Fab1 的指数生长 WT 细胞的免疫印迹分析VLA来自着丝粒质粒。施九-特尔737基于抗P-Sch9的密度测定法对磷酸化进行定量T737和抗Sch9信号，并归一化为用空载体转化的WT细胞。（B）表达基因组标记的GFP-Sch9或GFP-FYVE-Sch85融合蛋白的WT，pho80Δ，pho81Δ和pho9Δ菌株中Sch9定位的显微镜分析。菌株在完全合成培养基上生长至对数中期。亲脂性染料FM4-64用于可视化液泡膜。使用惠更斯软件（版本18.10）对图片进行解卷积。使用ImageJ施加LUT火，以显示GFP信号的电平。（C）蛋白质印迹分析以评估分离的液泡囊泡的纯度。使用密度梯度离心方法从球状细胞中纯化液泡，如材料和方法部分所述。与全细胞蛋白提取物（= Input）相比，分离的液泡级分中2种典型液泡膜蛋白（Vma1和Vph1）的高丰度证实了该级分中空泡蛋白的强富集。另一方面，ER（Dpm1），线粒体（Por1）和质膜（Pma1）标志物的存在在分离的液泡部分中非常低。（D）GFP-Sch9纯化液泡的荧光显微图像文晔-表达细胞，确认在纯化的液泡膜上存在GFP-Sch9。用亲脂性FM4-64染料染色可确认分离的液泡囊泡的完整性。GFP信号的强度用Fluoroskan酶标仪量化，如材料和方法部分所述，并相对于FM4-64信号以及总蛋白质含量表示。数据表示为平均值±标准差。配对双尾学生T检验用于计算显著性（*，P < 0.1; **，P < 0.01; ***，P < 0.001）。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010641.s003
（提夫）
S4 图 Pho85-Pho80介导的Ser磷酸化726启动Sch9，以便随后被TORC1激活。
（A） 从指数生长的 sch9Δ 细胞中获得的蛋白质提取物的磷酸标签免疫印迹分析，这些细胞用着丝粒质粒转化，允许表达 C 末端 FLAG 标记的 Sch9T723A， Sch9S726A， Sch9T737A， Sch9S758A， Sch9S765A，或 Sch9文晔（WT）如前所述。在磷酸标签凝胶上分离总蛋白提取物，随后通过抗FLAG抗体免疫印迹进行分析。（B）体外激酶测定的设置，以证明Pho9-Pho85对Sch80的磷酸化。纯化的HA标记的Pho85或激酶死（KD）Pho85的各种混合物E53A突变体，GST标记的Pho80，以及与Sch9（Arg）的C末端（CT）相对应的TAP标签纯化片段650到伊尔824）的使用。SYPRO 红宝石染色和32显示P放射自显影。（C）表达基因组标记的GFP-Sch4741的WT（BY9）细胞的显微镜分析文晔或突变版本 GFP-Sch9S726A或 GFP-Sch9S726D显示野生型Sch9以及两种Sch9变体的液泡膜处的募集。菌株在完全合成培养基上生长至对数中期。亲脂性染料FM4-64用于可视化液泡膜。（D）表达SCH9的细胞的存活曲线文晔， Sch9S726A或施9S726D当在完全合成培养基上保持或缺乏碳 （C）、氮 （N） 或磷酸盐 （P） 时。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010641.s004
（提夫）
S5 图 Pho85-cyclins Pcl6和Pcl7有助于调节Sch9。
（A） 对来自 WT、pcl6Δ、pcl7Δ 和 pcl6Δ pcl7Δ 菌株在完整合成培养基上呈指数生长的蛋白质提取物进行免疫印迹分析，以评估 Sch9 磷酸化的变化。 施九-特尔737根据抗P-Sch9的比率定量磷酸化水平T737和抗Sch9信号，并归一化为WT细胞获得的比率。配对双尾学生T检验用于计算显著性（*，P < 0.1; **，P < 0.01; ***，P < 0.001）。（B）WT菌株的蛋白质提取物和缺乏非必需Glc7相互作用蛋白的菌株的免疫印迹分析。将菌株生长到对数中期，然后用200nM雷帕霉素处理。在雷帕霉素治疗前后采集样品1小时。反Sch9和反P-Sch9T737抗体用于检测。显示了用抗 Sch9 抗体检测到的磷酸化 （P-Sch9） 和非磷酸化 （Sch9） 亚型的迁移率差异。（C）液泡膜的FM4-64染色，以显示WT细胞与缺乏Pho81，Pho85或不同组合的Pho85细胞周期蛋白的细胞之间的液泡大小差异。菌株在含有2%葡萄糖的完整合成培养基上生长至对数中期。（D） WT、pho80Δ、pcl7Δ 和 pho80Δ pcl7Δ 菌株的免疫印迹分析，以比较 Fab1-GFP 和 Fab1 的表达水平 VLA-基于抗GFP和抗Adh2信号的比例在着丝粒质粒上引入GFP融合。（E） 晶圆厂1的显微分析VLA-GFP 定位在 WT、pho80Δ、pcl7Δ 和 pho80Δ pcl7Δ 菌株中。 菌株在选择性合成培养基上生长至对数中期。亲脂性染料FM4-64用于可视化液泡膜。缩进是放大倍数，显示 Fab1VLA主要位于小新兴液泡外围的病灶中。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010641.s005
（提夫）
S6 图 分析下游 Pho85 效应器与 TORC1 信号的相互作用。
（A）通过将单倍体sch9Δ菌株与pho85Δ边缘15Δ或pho85Δ crz1Δ菌株杂交，然后对解剖的发芽孢子进行基因型分析，产生二倍体。（B） 雷帕霉素敏感性分析在 WT、pho15Δ 或 pho1Δ 背景中缺乏 Rim85 或 Crz80 的细胞，通过在不使用或含 50 nM 雷帕霉素的 YPD 平板上进行斑点测定确定。（C） 通过 RT-PCR 测定的 PHO5 在携带空载体的 WT、pho85Δ、pho80Δ 和 sch9Δ 细胞或用编码 Sch9 的着丝粒质粒转化的 sch9Δ 细胞中的表达文晔当在用200nM雷帕霉素处理30分钟之前或之后在SD-Ura培养基中生长至对数中期时。数据表示为平均值±标准差。配对双尾学生T检验用于计算显著性（*，P < 0.1; **，P < 0.01; ***，P < 0.001）。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010641.s006
（提夫）
S1 表。 本研究中使用的酿酒酵母菌株。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010641.s007
（文档）
S2 表。 本研究中使用的质粒。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010641.s008
（文档）
S3 表。 本研究中使用的寡核苷酸。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010641.s009
（文档）
S4 表。 数据统计。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010641.s010
（三十）
确认
我们感谢R. Loewith，L. Weisman，J. Heitman，M. Cardenas，E. Boles，A. Matsuura，M. Peter和B. André提供质粒，菌株或抗体。我们还要感谢Marie-Pierre Péli-Gulli和Ladislav Doklàdal的显微镜指导。
引用
1.Urban J， Soulard A， Huber A， Lippman S， Mukhopadhyay D， Deloche O， et al.Sch9是酿酒酵母中TORC1的主要靶标。摩尔细胞。2007;26(5):663–74.沃斯：000247378000006。pmid：17560372
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
2.Geyskens I，Kumara SHMC，Donaton MCV，Bergsma JCT，Thevelein JM，Wera S.哺乳动物PKB的表达部分补充酵母蛋白激酶Sch9的缺失。 Nato Sci S a Lif Sci. 2000;316：117–26.WOS：000167298000016。
查看文章谷歌学术搜索
3.约根森 P， 鲁佩斯 I， 沙罗姆 JR， 施内珀 L， 布罗奇 JR， 泰尔斯 M.动态转录网络将生长潜力传达给核糖体合成和关键细胞大小。基因开发 2004;18（20）：2491–505.pmid：15466158;PubMed Central PMCID：PMC529537。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
4.Huber A， Bodenmiller B， Uotila A， Stahl M， Wanka S， Gerrits B， et al.雷帕霉素敏感磷酸化蛋白质组的表征表明，Sch9是蛋白质合成的中枢协调体。基因开发 2009;23（16）：1929–43.pmid：19684113;PubMed Central PMCID：PMC2725941。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
5.Smets B， De Snijder P， Engelen K， Joossens E， Ghillebert R， Thevissen K， et al.全基因组表达分析揭示了Sch1的TORC9依赖性和独立性功能。 FEMS 酵母研究 2008;8（8):1276–88.Epub 2008/09/02.[PII] pmid：18759743。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
6.Pedruzzi I， Burckert N， Egger P， De Virgilio C. 酿酒酵母 Ras/cAMP 途径通过锌指蛋白 Gis1 控制双氧转移后元素依赖性转录。EMBO J. 2000;19（11）：2569–79.pmid：10835355;PubMed Central PMCID：PMC212766。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
7.卡梅罗尼 E， 胡洛 N， 鲁森 J， 温德里克克斯 J， 德维尔吉利奥 C.新型酵母PAS激酶Rim 15协调G0相关的抗氧化防御机制。细胞周期。2004;3(4):462–8.pmid：15300954。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
8.博纳维茨，查特奈-拉普安特，潘Y，沙德尔GS。减少TOR信号通过增加呼吸和上调线粒体基因表达来延长实际寿命。细胞代谢表。2007;5(4):265–77.pmid：17403371;PubMed Central PMCID：PMC3460550。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
9.潘Y，沙德尔GS。通过减少TOR信号延长实际寿命需要下调Sch9p，并涉及增加线粒体OXPHOS复合物密度。老龄化（纽约州奥尔巴尼）。2009;1(1):131–45.pmid：20157595;PubMed Central PMCID：PMC2815770。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
10.Swinnen E， Wilms T， Idkowiak-Baldys J， Smets B， De Snijder P， Accardo S， et al.蛋白激酶Sch9是酿酒酵母中鞘脂代谢的关键调节因子。分子生物细胞。2014;25(1):196–211.pmid：24196832;PubMed Central PMCID：PMC3873890。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
11.Wilms T， Swinnen E， Eskes E， Dolz-Edo L， Uwineza A， Van Essche R， et al.酵母蛋白激酶Sch9调整V-ATP酶组装/拆卸以控制pH稳态和寿命，以响应葡萄糖的可用性。公共科学图书馆遗传学。2017;13（6）：e1006835.密码：28604780
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
12.法布里齐奥 P， 波扎 F， 普莱彻 SD， 詹德隆 CM， 隆戈 VD.通过Sch9调节酵母中的寿命和抗逆性。科学。2001;292(5515):288–90.pmid：11292860。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
13.Kaeberlein M，Kirkland KT，Fields S，Kennedy BK.在长寿命遗传背景下决定酵母复制寿命的基因。机械老化开发 2005;126（4）：491–504.pmid：15722108。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
14.刘珂， 张旭， 莱斯特， 迪克森.鞘样长链碱植物鞘氨醇激活酿酒酵母中的AGC型蛋白激酶，包括Ypk1，Ypk2和Sch9。 生物学杂志 2005;280（24）：22679–87.pmid：15840588。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
15.Roelants FM，Torrance PD，Thorner J.酵母AGC激酶Ypk1，Pkc2和Sch1中PDK1-和PDK9磷酸化位点的差异作用。 微生物学。2004;150（Pt 10）：3289–304.PMID：15470109。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
16.卢建英， 林玉莹， 佘建强， 吴建通， 李福杰， 陈莹， 等.酵母的乙酰化AMPK控制内在衰老，独立于热量限制。细胞。2011;146(6):969–79.pmid：21906795;PubMed Central PMCID：PMC3176974。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
17.Braun KA， Vaga S， Dombek KM， Fang F， Palmisano S， Aebersell R， et al.磷酸化蛋白质组学分析将参与转录偶联mRNA衰变的蛋白质鉴定为Snf1信号传导的靶标。科学信号。2014;7（333）：ra64.pmid：25005228。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
18.穆德霍尔卡 K， 菲茨克 E， 普林茨 C， 梅耶议员， 罗斯珀特 S.Hsp70同系物Ssb通过TORC1-Sch9信号通路影响核糖体生物发生。纳特公社。2017;8(1):937.pmid：29038496;PubMed Central PMCID：PMC5643326。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
19.Voordeckers K， Kimpe M， Haesendonckx S， Louwet W， Versele M， Thevelein JM.酵母 3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶-1 （PDK1） 直系同源物 pkh1-3 差异调节蛋白激酶 A （PKA） 和蛋白激酶 B （PKB）/S6K 直系同源物 Sch9 的磷酸化。 生物学杂志. 2011;286（25）：22017–27.沃斯：000291719900008。pmid：21531713
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
20.何西，阿尔加姆迪，博特略·磷脂酰肌醇-3，5-二磷酸：不再是PIP2的差。交通。2012;13(1):1–8.PMID：21736686。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
21.金N， 毛K， 金Y， Tevzadze G， Kauffman EJ， Park S， et al.PI（3，5）P-2在通过TORC1进行营养传感中的作用。分子生物细胞。2014;25(7):1171–85.沃斯：000339629900016。
查看文章谷歌学术搜索
22.Chen Z， Malia PC， Hatakeyama R， Nicastro R， Hu Z， Peli-Gulli MP， et al. TORC1 在信号内体和液泡处测定 Fab1 脂质激酶功能。当代生物学. 2021.pmid：33157024。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
23.畑山 R， 德维尔吉利奥·在空间和功能上不同的TORC1池定义了酵母中的信号内体。自 噬。2019;15(5):915–6.pmid：30732525;PubMed Central PMCID：PMC6526828。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
24.高J， 尼斯特罗 R， 佩利-古利议员， 格齐瓦 S， 陈 Z， 库尔雷 R， 等.HOPS栓系复合物需要维持信号内体身份和TORC1活性。细胞生物学杂志. 2022;221（5）.pmid：35404387;PubMed Central PMCID：PMC9011323。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
25.李YS，穆卢古S，约克JD，奥谢EK。肌醇焦磷酸盐调节细胞周期蛋白-CDK-CDK抑制剂复合物。科学。2007;316(5821):109–12.pmid：17412959;PubMed Central PMCID：PMC2211727。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
26.Lenburg ME O'Shea EK.发出磷酸盐饥饿的信号。趋势生物化学科学 1996;21（10）：383–7.pmid：8918192。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
27.穆永、佩尔松·酿酒酵母磷酸盐传感和信号传导的新方面。FEMS 酵母研究 2006;6（2）：171–6.PMID：16487340。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
28.Lee M O'Regan S， Moreau JL， Johnson AL， Johnston LH， Goding CR. Pho7对Pcl85-Pho81细胞周期蛋白-cdk复合物的调节。分子微生物。2000;38(2):411–22.pmid：11069666。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
29.Bomeke K， Pries R， Korte V， Scholz E， Herzog B， Schulze F， et al. 酵母 Gcn4p 稳定是由核 Pho85p/Pcl5p 复合物的解离引发的。分子生物细胞。2006;17(7):2952–62.pmid：16611745;PubMed Central PMCID：PMC1483032。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
30.Eskes E， Deprez MA， Wilms T， Winderickx J. 酵母中的pH稳态;磷酸盐视角。柯尔热内。2018;64(1):155–61.pmid：28856407;PubMed Central PMCID：PMC5778149。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
31.Wanke V， Pedruzzi I， Cameroni E， Dubouloz F， De Virgilio C. Pho0-Pho80 cyclin-CDK 复合物对 G85 进入的调节。EMBO J. 2005;24（24）：4271–8.pmid：16308562;PubMed Central PMCID：PMC1356330。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
32.西泽·酵母PHO系统的调节因子参与碱性胁迫条件下G1细胞周期蛋白的转录调控。酵母。2015;32(3):367–78.pmid：25582350。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
33.西泽 M， 谷川 M， 林 M， 前田 T， 矢崎 Y， 佐伯 Y， 等.Pho85激酶是一种细胞周期蛋白依赖性激酶，调节酿酒酵母应激反应中Rim101转录因子的核积累。真核细胞。2010;9(6):943–51.pmid：20382759;PubMed Central PMCID：PMC2901641。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
34.卡夫曼 A， 赫斯科维茨 I， 吉安 R， 奥谢 EK.转录因子PHO4通过细胞周期蛋白-CDK复合物PHO80-PHO85磷酸化。科学。1994;263(5150):1153–6.噗：8108735。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
35.梅诺约S，里科N，布鲁S，埃尔南德斯-奥尔特加S，埃斯科特X，阿尔迪亚M等。磷酸盐激活的细胞周期蛋白依赖性激酶稳定G1细胞周期蛋白以触发细胞周期进入。分子细胞生物学. 2013;33（7）：1273–84.pmid：23339867;PubMed Central PMCID：PMC3624280。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
36.Shemer R，Meimoun A，Holtzman T，Kornitzer D.通过Pho4细胞周期蛋白PCL85调节转录因子Gcn5。分子细胞生物学. 2002;22（15）：5395–404.pmid：12101234;PubMed Central PMCID：PMC133946。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
37.Ghillebert R，Swinnen E，De Snijder P，Smets B，Winderickx J.酿酒酵母中低亲和力磷酸转运蛋白Pho87和Pho90的差异作用。生物化学杂志 2011;434（2）：243–51.pmid：21143198。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
38.蒂姆布林BK，塔切尔K，伯格曼LW。编码细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶Pho85的基因缺失会改变酿酒酵母中的糖原代谢。遗传学。1996;143(1):57–66.pmid：8722762;PubMed Central PMCID： PMC1207288.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
39.Uesono Y，Tanaka K，Toh-e A.酿酒酵母中PHO系统的负调节剂：PHO85的分离和结构表征。核酸研究 1987;15（24）：10299–309.pmid：3320965;PubMed Central PMCID：PMC339945。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
40.Huang D，Moffat J，Andrews B.通过功能基因组学解剖复杂表型揭示了酵母细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶Pho85在应激适应和细胞完整性中的作用。分子细胞生物学. 2002;22（14）：5076–88.pmid：12077337;PubMed Central PMCID：PMC139770。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
41.Lee J， Colwill K， Aneliunas V， Tennyson C， Moore L， Ho Y， et al.酵母Rvs167和Pho85细胞周期蛋白依赖性激酶复合物的相互作用可能将细胞周期与肌动蛋白细胞骨架联系起来。当代生物学. 1998;8（24):1310–21.普米德：9843683。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
42.普列托 JA， 埃斯特鲁赫 F， 科科尔斯-赛斯 I， 德尔波塔 M， 里格 R， 斯坦泽尔一世， 等.Pho85和PI（4，5）P2调节不同的脂质代谢途径以应对寒冷。生物化学生物物理学学报分子细胞生物脂质。2020;1865(2):158557.;PubMed Central PMCID：PMC7254492。
查看文章谷歌学术搜索
43.斯文嫩 E， 罗西尔斯 J， 温德里克克斯 J.Pho81的最小结构域不足以控制参与磷酸盐饥饿诱导的应激反应的Pho85-Rim15效应分支。柯尔热内。2005;48(1):18–33.PMID：15926040。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
44.易卜拉希米 M， 哈伯尼格 L， 布罗斯坎普 F， Aufschnaiter A， Diessl J， Atienza I， et al. 磷酸盐限制通过激活自噬和多泡体通路促进长寿。细胞。2021;10(11).pmid：34831384;PubMed Central PMCID：PMC8620443。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
45.威尔逊华盛顿，马伦霍尔茨AM，罗奇PJ。细胞周期蛋白Pcl85p对酵母细胞周期蛋白依赖性激酶Pho10p的底物靶向。 分子细胞生物学. 1999;19（10）：7020–30.pmid：10490639;PubMed Central PMCID：PMC84697。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
46.Measday V， Moore L， Retnakaran R， Lee J， Donoviel M， Neiman AM， et al.与 Pho85 细胞周期蛋白依赖性激酶相互作用的细胞周期蛋白样蛋白家族。分子细胞生物学. 1997;17（3）：1212–23.pmid：9032248;PubMed Central PMCID：PMC231846。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
47.黄D， 莫法特 J， 威尔逊 WA， 摩尔 L， 程 C， 罗奇 PJ， 等.细胞周期蛋白合作伙伴在体外和体内确定 Pho85 蛋白激酶底物特异性：通过 Pcl8 和 Pcl10 控制糖原生物合成。 分子细胞生物学. 1998;18（6）：3289–99.pmid：9584169;PubMed Central PMCID： PMC108910.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
48.Ptacek J， Devgan G， Michaud G， Zhu H， Zhu X， Fasolo J， et al.酵母中蛋白质磷酸化的整体分析。自然界。2005;438(7068):679–84.pmid：16319894。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
49.卡罗尔·阿斯，奥谢·Pho85和信号环境条件。趋势生物化学科学 2002;27（2）：87–93.噗：11852246。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
50.金妮， 金萍， 魏斯曼.由液泡/溶酶体的CDK依赖性PI3，5P2信号介导的应激的早期保护。细胞生物学杂志. 2017;216（7）：2075–90.pmid：28637746;PubMed Central PMCID：PMC5496620。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
51.Huang D，Friesen H，Andrews B. Pho85，出芽酵母中的多功能细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶。分子微生物。2007;66(2):303–14.pmid：17850263。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
52.金胤， 魏斯曼.液泡/溶酶体是细胞周期进程所必需的。生活。2015;4.pmid：26322385;PubMed Central PMCID：PMC4586482。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
53.郎 MJ， 斯特里克 BS， 阿扎德 N， 彼得森 JL， 魏斯曼 LS.脂质激酶Fab1内的分子内相互作用调节细胞磷脂酰肌醇3，5-二磷酸脂质水平。分子生物细胞。2017;28(7):858–64.pmid：28148651;PubMed Central PMCID：PMC5385934。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
54.阿尔加姆迪 TA， 何 CY， 姆拉科维奇 A， 泰勒 D， 毛 D， 博特略 RJ.Vac14 蛋白多聚化是 Fab1 蛋白复合物组装和功能的先决条件步骤。生物化学杂志 2013;288（13）：9363–72.pmid：23389034;PubMed Central PMCID： PMC3611006.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
55.杜克斯， 唐芳， 魏斯曼.Vac14p-Fig 4p复合物独立于Vac7p，并将PI3，5P2合成和周转耦合。细胞生物学杂志. 2006;172（5）：693–704.pmid：16492811;PubMed Central PMCID：PMC2063702。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
56.Atg18调节细胞器形态和Fab1激酶活性，独立于磷脂酰肌醇3，5-二磷酸的膜募集。分子生物细胞。2007;18(11):4232–44.pmid：17699591;PubMed Central PMCID：PMC2043547。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
57.液泡大小控制：液泡相关的 Vac3-FIG 5 复合物 PtdIns（2，14）P4 水平的调节，这是一种 PtdIns（3，5）P2 特异性磷酸酶。分子生物细胞。2004;15(1):24–36.pmid：14528018;PubMed Central PMCID：PMC307524。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
58.Gary JD， Sato TK， Stefan CJ， Bonangelino CJ， Weisman LS， Emr SD. 通过 Vac1 蛋白和图3（聚磷酸肌醇磷酸酶家族成员）调节 Fab5 磷脂酰肌醇 7-磷酸肌醇 4-激酶途径。分子生物细胞。2002;13(4):1238–51.pmid：11950935;PubMed Central PMCID：PMC102265。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
59.Gary JD， Wurmser AE， Bonangelino CJ， Weisman LS， Emr SD. Fab1p对于PtdIns（3）P 5激酶活性以及维持液泡大小和膜稳态至关重要。细胞生物学杂志. 1998;143（1）：65–79.pmid：9763421;PubMed Central PMCID：PMC2132800。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
60.武田 E， 金 N， 板仓 E， 基拉 S， 镰田 Y， 魏斯曼 LS， 等.氧化应激后液泡介导的TORC1-Sch9信号传导的选择性调节。分子生物细胞。2018;29(4):510–22.pmid：29237820;PubMed Central PMCID：PMC6014174。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
61.Hatakeyama R， Peli-Gulli MP， Hu Z， Jaquenoud M， Garcia Osuna GM， Sardu A， et al. TORC1平衡蛋白稳态的空间不同池。摩尔细胞。2019;73（2）：325–38 e8.PMID：30527664。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
62.Hu Z， Raucci S， Jaquenoud M， Hatakeyama R， Stumpe M， Rohr R， et al. 通过 TORC1 和 Atg1 对蛋白质周转的多层控制。细胞代表 2019;28（13）：3486–96 e6.PMID：31553916。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
63.杨志， 耿杰， 颜文林， 王珂， 克里昂斯基 DJ.不同细胞周期蛋白依赖性激酶Pho85-cyclin复合物的阳性或阴性作用协调酿酒酵母中自噬的诱导。摩尔细胞。2010;38(2):250–64.pmid：20417603;PubMed Central PMCID：PMC2861662。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
64.饶CC，拉古萨MJ，斯坦利RE，赫尔利JH。Atg13中的HORMA结构域介导自噬中的PI 3激酶募集。美国国家科学院院刊， 2013;110（14）：5486–91.pmid：23509291;PubMed Central PMCID：PMC3619307。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
65.Peli-Gulli MP， Sardu A， Panchaud N， Raucci S， de Virgilio C. 氨基酸通过 Lst1-LST4 刺激 TORC7，这是一种用于 rag 家族 GTPase Gtr2 的 GTP 酶激活蛋白复合物。 细胞代表 2015;13（1）：1–7.pmid：26387955。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
66.Peli-Gulli MP， Raucci S， Hu Z， Dengjel J， De Virgilio C. Rag GTPase GAP 复合物 Lst4-Lst7 的反馈抑制可保护 TORC1 免受氨基酸信号的过度激活。细胞代表 2017;20（2）：281–8.pmid：28700931。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
67.奥尼尔，卡夫曼，乔利ER，奥谢埃克。通过PHO4-PHO80细胞周期蛋白-CDK复合物调节PHO85核定位。科学。1996;271(5246):209–12.pmid：8539622。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
68.Longo VD，Shadel GS，Kaeberlein M，Kennedy B.酿酒酵母的复制和时间顺序老化。细胞代谢表。2012;16(1):18–31.pmid：22768836;PubMed Central PMCID：PMC3392685。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
69.德普雷兹马，埃斯克斯E，温德里克克斯J，威尔姆斯T。TORC1-Sch9途径作为酿酒酵母中按时间顺序排列寿命的关键介质。FEMS 酵母研究 2018;18（5）.PMID：29788208。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
70.金 Y， Jin N， Oikawa Y， Benyair R， Koizumi M， Wilson TE， et al.Bur1与TORC1一起用于液泡介导的细胞周期进程。EMBO 代表 2022;23（4）：e53477。pmid：35166010;PubMed Central PMCID： PMC8982600.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
71.谭YS，莫尔科斯PA，坎农JF。Pho85在体内磷酸化Glc7蛋白磷酸酶调节因子Glc8。生物学杂志 2003;278（1）：147–53.pmid：12407105。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
72.Yerlikaya S， Meusburger M， Kumari R， Huber A， Anrather D， Costanzo M， et al. TORC1和TORC2共同调节酿酒酵母中的核糖体蛋白S6磷酸化。分子生物细胞。2016;27(2):397–409.pmid：26582391;PubMed Central PMCID：PMC4713140。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
73.施耐德 KR， 史密斯 RL， 奥谢 EK.CDK抑制剂PHO80对激酶PHO85-PHO81的磷酸盐调节失活。科学。1994;266(5182):122–6.pmid：7939631。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
74.Sopko R， Huang D， Preston N， Chua G， Papp B， Kafadar K， et al.通过系统基因过表达绘制途径和表型。摩尔细胞。2006;21(3):319–30.PMID：16455487。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
75.小川N，德里西J，布朗PO。通过基因组表达分析揭示了酿酒酵母中磷酸盐积累和多磷酸盐代谢系统的新成分。分子生物细胞。2000;11(12):4309–21.pmid：11102525;PubMed Central PMCID：PMC15074。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
76.Persson BL， Lagerstedt JO， Pratt JR， Pattison-Granberg J， Lundh K， Shokrollahzadeh S， et al.酿酒酵母磷酸盐获取的调节。柯尔热内。2003;43(4):225–44.pmid：12740714。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
77.Barbaric S， Luckenbach T， Schmid A， Blaschke D， Horz W， Korber P. 用于诱导体内酵母 PHO5 启动子的染色质重塑途径的冗余。生物学杂志 2007;282（38）：27610–21.pmid：17631505。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
78.莫里森·染色质重塑将代谢信号与基因表达联系起来。摩尔梅塔布。2020;38:100973.pmid：32251664;PubMed Central PMCID：PMC7300377。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
79.Nishizawa M， Komai T， Morohashi N， Shimizu M， Toh-e A. Pho4转录因子的转录抑制控制SNZ1表达的时间。真核细胞。2008;7(6):949–57.pmid：18408055;PubMed Central PMCID： PMC2446651.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
80.Staschke KA， Dey S， Zaborske JM， Palam LR， McClintick JN， Pan T， et al.酵母氮同化中一般氨基酸对照和雷帕霉素（TOR）调控途径靶点的整合.生物学杂志 2010;285（22）：16893–911.pmid：20233714;PubMed Central PMCID：PMC2878067。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
81.Moser BA， Dennis PB， Pullen N， Pearson RB， Williamson NA， Wettenhall RE， et al.p70s6k 中新鉴定的磷酸化位点的双重要求。分子细胞生物学. 1997;17（9）：5648–55.pmid：9271440;PubMed Central PMCID：PMC232413。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
82.Saitoh M，Pullen N，Brennan P，Cantrell D，Dennis PB，Thomas G.活化的S6激酶1变体的调节揭示了雷帕霉素磷酸化位点的新型哺乳动物靶标。生物学杂志 2002;277（22）：20104–12.pmid：11914378。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
83.Shah OJ，Ghosh S，Hunter T.核糖体S6激酶1的有丝分裂调节涉及Ser / Thr，Cdc2对共识和非共识位点的促磷酸化。 生物学杂志 2003;278（18）：16433–42.pmid：12586835。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
84.申 S， 沃尔加莫特 L， 于伊， 布莱尼斯 J， 尹索.糖原合酶激酶（GSK）-3促进p70核糖体蛋白S6激酶（p70S6K）活性和细胞增殖。美国国家科学院院刊， 2011;108（47）：E1204–13.pmid：22065737;PubMed Central PMCID：PMC3223461。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
85.牛顿AC.蛋白激酶C：通过磷酸化，辅因子和大分子相互作用进行结构和空间调节。化学修订版 2001;101（8）：2353–64.pmid：11749377。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
86.皮尔斯，科曼德，阿莱西博士。AGC蛋白激酶的具体细节。分子细胞生物学杂志， 2010;11（1）：9–22.PMID：20027184。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
87.Lees JA， Li P， Kumar N， Weisman LS， Reinisch KM. 从 PIKfyve 脂质激酶复合物的结构生化分析中对溶酶体 PI（3，5）P2 稳态的见解.摩尔细胞。2020;80（4）：736–43 e4.pmid：33098764;PubMed Central PMCID：PMC7962480。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
88.文也 M， 西村 M， 原岛 S， 大岛 Y.酿酒酵母的PHO84基因编码无机磷酸转运蛋白。分子细胞生物学. 1991;11（6）：3229–38.pmid：2038328;PubMed Central PMCID：PMC360175。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
89.刘淑娴， 弗拉纳根， 曾杰， 贾尼， 卡德纳斯， 莫兰， 等.磷酸盐是白色念珠菌中TOR监测的第三种营养素，为真菌特异性间接TOR抑制提供了靶标。美国国家科学院院刊， 2017;114（24）：6346–51.pmid：28566496;PubMed Central PMCID：PMC5474788。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
90.Kawai M，Kinoshita S，Ozono K，Michigami T.无机磷酸盐激活AKT / mTORC1途径并缩短αKlotho缺陷模型的寿命。J Am Soc Nephrol。2016;27(9):2810–24.pmid：26872488;PubMed Central PMCID：PMC5004643。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
91.Dove SK， Piper RC， McEwen RK， Yu JW， King MC， Hughes DC， et al.Svp1p定义了磷脂酰肌醇3，5-二磷酸效应子家族。EMBO J. 2004;23（9）：1922–33.pmid：15103325;PubMed Central PMCID：PMC404323。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
92.巴斯卡兰 S， 拉古萨 MJ， 布拉 E， 赫尔利 JH.自噬中 PROPPIN 对磷脂酰肌醇 3-磷酸的双位点识别。摩尔细胞。2012;47(3):339–48.pmid：22704557;PubMed Central PMCID：PMC3595537。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
93.人类中的TMEM106B和酵母中的Vac7和Tag1被预测为脂质转移蛋白。蛋白质。2022;90(1):164–75.pmid：34347309。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
94.马南达尔SP，西迪卡IM，科卡SM，加拉卡尼亚E。酵母溶酶体液泡上的激酶级联调节其膜动力学：保守激酶Env7被酪蛋白激酶Yck3磷酸化。生物化学学报 2020;295（34）：12262–78.pmid：32647006;PubMed Central PMCID：PMC7443493。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
95.拉格拉萨、昂格曼·液泡激酶Yck3通过调节HOPS栓系复合物来维持细胞器碎裂。细胞生物学杂志. 2005;168（3）：401–14.pmid：15684030;PubMed Central PMCID：PMC2171739。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
96.Malia PC，Numrich J，Nishimura T，Gonzalez Montoro A，Stefan CJ，Ungermann C.通过常驻PI-3，5激酶抑制剂控制液泡膜稳态。美国国家科学院院刊， 2018;115（18）：4684–9.pmid：29674454;PubMed Central PMCID：PMC5939101。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
97.魏斯曼·酵母液泡遗传和动力学。安努·雷夫·热内。2003;37:435–60.PMID：14616069。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
98.尼科尔森 TA， 魏斯曼 LS， 佩恩 GS， 威克纳 WT.Pho80细胞周期蛋白的截短形式重定向Pho85激酶以破坏酿酒酵母的液泡遗传。细胞生物学杂志. 1995;130（4）：835–45.pmid：7642701;PubMed Central PMCID： PMC2199970.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
99.Stauffer B，Powers T.雷帕霉素信号传导的靶标介导酿酒酵母内质网应激引起的空泡裂变。分子生物细胞。2015;26(25):4618–30.pmid：26466677;PubMed Central PMCID： PMC4678019.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
100.Irie K，Nomoto S，Miyajima I，Matsumoto K.SGV1编码Gα亚基介导的对酿酒酵母信息素的适应性反应所需的CDC28 / cdc2相关激酶。细胞。1991;65(5):785–95.pmid：1828190。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
101.康纳利CJ，维达尔-卡德纳斯S，戈德史密斯S，格雷德CW。Bur1细胞周期蛋白依赖性激酶调节酿酒酵母的端粒长度。酵母。2022;39(3):177–92.噗嗤：34781413。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
102.Askree SH， Yehuda T， Smolikov S， Gurevich R， Hawk J， Coker C， et al.影响端粒长度的酿酒酵母缺失突变体的全基因组筛选。美国国家科学院院刊， 2004;101（23）：8658–63.pmid：15161972;PubMed Central PMCID：PMC423251。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
103.黄S， 杰弗里达， 安东尼医学博士， 奥谢 EK.细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂 Pho81 的功能分析确定了一种新的抑制结构域。分子细胞生物学. 2001;21（19）：6695–705.pmid：11533256;PubMed Central PMCID：PMC99814。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
104.Pascual-Ahuir A，Proft M.通过Sch9蛋白激酶控制应激调节的基因表达和寿命。细胞周期。2007;6(20):2445–7.pmid：17726371。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
105.帕斯夸尔-阿惠尔 A， 普罗特·Sch9激酶是渗透应激反应基因的染色质相关转录激活剂。EMBO J. 2007;26（13）：3098–108.pmid：17568771;PubMed Central PMCID：PMC1914104。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
106.高丽， 梁志， 费娥， 黄海， 叶玲.细胞周期蛋白依赖性激酶 5 （Cdk5） 依赖性 p70 核糖体 S6 激酶 1 （S6K） 的磷酸化是树突状脊柱形态发生所必需的。生物学杂志 2015;290（23）：14637–46.pmid：25903132;PubMed Central PMCID：PMC4505530。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
107.Dotti CG， Esteban JA， Ledesma MD.树突棘的脂质动力学。前神经。2014;8:76.pmid：25152717;PubMed Central PMCID：PMC4126552。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
108.欧阳L， 陈 Y， 王 Y， 陈 Y， 傅 AKY， 傅 WY， 等. p39 相关的 Cdk5 活性调控树枝状形态发生。科学代表 2020;10（1）：18746.pmid：33127972;PubMed Central PMCID：PMC7603351。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
109.侯孜， 何玲， 齐祁玲.通过 ser-6 磷酸化调节 s1 激酶 411 活化。生物学杂志 2007;282（10）：6922–8.pmid：17220300。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
110.Arif A， Jia J， Willard B， Li X， Fox PL. S6K1的多位点磷酸化指导决定底物选择的激酶磷酸化代码。摩尔细胞。2019;73（3）：446–57 e6.pmid：30612880;PubMed Central PMCID：PMC6415305。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
111.Bridges D， Ma JT， Park S， Inoki K， Weisman LS， Saltiel AR. 磷脂酰肌醇 3，5-二磷酸在雷帕霉素 1 的机制靶标的活化和亚细胞定位中起作用。分子生物细胞。2012;23(15):2955–62.pmid：22696681;PubMed Central PMCID：PMC3408421。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
112.Lindqvist J， Imanishi SY， Torvaldson E， Malinen M， Remes M， Orn F， et al.细胞周期蛋白依赖性激酶 5 是 AKT 依赖性增殖的关键决定因素，并调节前列腺癌细胞中雄激素受体的差异基因表达。分子生物细胞。2015;26(11):1971–84.pmid：25851605;PubMed Central PMCID： PMC4472009.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
113.科梅利A，奥谢·磷酸化位点在调节转录因子Pho4活性中的作用。科学。1999;284(5416):977–80.pmid：10320381。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
114.Teunissen JHM， Crooijmans ME， Teunisse PPP， van Heusden GPH.酿酒酵母中缺乏 14-3-3 蛋白导致 Pho4 调节基因 SPL2 和 PHO84 表达的细胞间异质性。BMC 基因组学。2017;18(1):701.密码：28877665
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
115.杰弗里·达，斯普林格·细胞周期蛋白-CDK Pho4-Pho80对Pho85的多位点磷酸化是半加工的，具有位点偏好。分子生物学杂志. 2001;306（5）：997–1010.pmid：11237614。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
116.斯普林格 M， 维科夫 DD， 米勒 N， 奥谢 EK.部分磷酸化的Pho4激活磷酸盐反应基因亚群的转录。公共科学图书馆生物学. 2003;1（2）：E28.pmid：14624238;PubMed Central PMCID：PMC261874。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
117.卡夫曼A，兰克NM，奥尼尔EM，黄LS，奥谢EK。受体Msn5将磷酸化的转录因子Pho4从细胞核中输出出来。自然界。1998;396(6710):482–6.PMID：9853758。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
118.Samyn DR， Ruiz-Pavon L， Andersson MR， Popova Y， Thevelein JM， Persson BL. 酿酒酵母 Pho84 磷酸盐：H（+） 受体中推定磷酸盐和质子结合位点的突变分析及其对 PKA 和 PHO 途径信号传导的影响.生物化学杂志 2012;445（3）：413–22.噗嗤：22587366。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
119.Lundh F， Mouillon JM， Samyn D， Stadler K， Popova Y， Lagerstedt JO， et al.控制磷酸盐诱导的酵母Pho84磷酸转运蛋白下调的分子机制。生物化学。2009;48(21):4497–505.pmid：19348508。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
120.Jiang JC， Stumpferl SW， Tiwari A， Qin Q， Rodriguez-Quinones JF， Jazwinski SM. 确定介导酿酒酵母复制寿命延长的逆行反应的目标。遗传学。2016;204(2):659–73.pmid：27474729;PubMed Central PMCID：PMC5068853。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
121.Wasko BM，Kaeberlein M.酵母复制老化：定义保守长寿干预的范式。FEMS 酵母研究 2014;14（1）：148–59.pmid：24119093;PubMed Central PMCID：PMC4134429。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
122.Nakajima T，Maruhashi T，Morimatsu T，Mukai Y.细胞周期蛋白依赖性激酶Pho85p及其细胞周期蛋白通过酵母中的多种途径参与复制寿命。二月 2020;594（7）：1166–75.PMID：31797348。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
123.Kupiec M.端粒生物学：出芽酵母的教训。FEMS 微生物学修订版 2014;38（2）：144–71.pmid：24754043。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
124.Brachmann CB， Davies A， Cost GJ， Caputo E， Li J， Hieter P， et al.源自酿酒酵母S288C的设计缺失菌株：一组有用的菌株和质粒，用于PCR介导的基因破坏和其他应用。酵母。1998;14(2):115–32.Epub 1998/03/04.噗嗤：9483801。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
125.Generoso WC，Gottardi M，Oreb M，Boles E.简化的CRISPR-Cas基因组编辑用于酿酒酵母。J微生物学方法。2016;127:203–5.PMID：27327211。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
126.吉茨RD，Schiestl RH，Willems AR，Woods RA。通过LiAc/SS-DNA/PEG程序研究完整酵母细胞的转化。酵母。1995;11(4):355–60.Epub 1995/04/15.PMID：7785336。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
127.Gibson DG， Young L， Chuang RY， Venter JC， Hutchison CA 3rd， Smith HO. DNA分子的酶促组装高达几百千碱基。纳特方法。2009;6(5):343–5.pmid：19363495。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
128.金斯伯里 JM， 森 ND， 前田 T， 海特曼 J， 卡德纳斯 我.内溶酶体膜运输复合物驱动营养依赖性 TORC1 信号传导以控制酿酒酵母中的细胞生长。遗传学。2014;196(4):1077–89.pmid：24514902;PubMed Central PMCID：PMC3982701。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
129.卡夫曼A，兰克NM，奥谢EK。磷酸化调节转录因子Pho4与其进口受体Pse1 / Kap121的结合。基因开发 1998;12（17）：2673–83.pmid：9732266;PubMed Central PMCID：PMC317126。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
130.康拉德特 B， 肖 J， 维达 T， 埃姆尔 S， 威克纳 W.酿酒酵母液泡遗传的体外反应。细胞生物学杂志. 1992;119（6）：1469–79.pmid：1334958;PubMed Central PMCID：PMC2289757。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索