海鞘胚胎神经诱导模型
罗萨娜·贝托尼，克莱尔·哈德森 ，热拉尔丁·威廉，凯茜·西鲁尔，瞳吉康雄，苏菲·德·布伊尔 ，吉纳维耶夫·杜邦
发布时间：3 年 2023 月
抽象
如何以可重复的方式控制细胞规格是发育生物学中的一个基本问题。在海鞘动物（一组无脊椎动物脊索动物）中，几何形状在实现这种控制方面起着关键作用。在这里，我们使用数学建模来证明几何形状决定了32细胞期鞘胚中的神经 - 表皮细胞命运选择，通过两步过程，首先是ERK信号传导的调节，其次是神经标记基因Otx的表达。该模型描述了由FGF刺激并由ephrin衰减的ERK途径的信号转导，以及ERK介导的Otx基因表达控制，其中涉及ETS家族转录因子的激活剂和抑制因子。考虑以表达FGF或肾上腺素的细胞接触的测量面积作为输入，模型的解再现了正常和扰动条件下不同细胞中ERK活化和Otx表达的实验观察结果。希尔系数的灵敏度分析和计算使我们能够量化由细胞表面积控制的规范机制的鲁棒性，并确定每个信号输入所发挥的各自作用。模拟还预测了在哪些条件下，激活剂和阻遏子对基因表达的双重控制都在ERK的控制下，可以诱导神经命运诱导的稳健ON/OFF控制。
作者摘要
由于细胞分裂和细胞规格的结合，单细胞受精卵发育成多细胞胚胎。后一个过程对应于胚胎细胞逐渐获得其最终的生理和功能特征，这些特征依赖于明确定义的信号控制遗传程序。电池规格的鲁棒性仍然知之甚少。在这里，我们在海鞘动物（海洋无脊椎动物）的胚胎神经命运诱导框架内解决了这个问题。在32细胞阶段，通过其在胚胎中的精确位置识别的四个细胞采用神经命运。在实验观察的基础上，我们开发了一个数学模型，该模型预测神经或表皮命运之间的选择由与两种拮抗信号FGF和ephrin接触的细胞的细胞表面积控制。我们的发现为胚胎几何形状在腹鞘发育过程中控制细胞谱系获取所起的主要作用提供了计算证实。
引文： 贝托尼 R， 哈德森 C， 威廉姆 G， 西鲁尔 C， 亚索 H， 德布伊尔 S， 等人. （2023） 海鞘胚胎神经诱导模型。公共科学图书馆计算生物学19（2）： e1010335. https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1010335
编辑 器： David M. Umulis，普渡大学，美国
收到： 29月 2022， 17;接受： 2023月 3， 2023;发表： <>月 <>， <>
版权： ? 2023 贝托尼等人。这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。
数据可用性： 代码可在 https://github.com/rossanabettoni/Model-of-neural-induction-in-the-ascidian-embryo 获得。
资金： RB得到了FRIA奖学金的支持。GD是比利时“国家科学研究基金会”（FRS-FNRS）的研究主任，并感谢由布鲁塞尔自由大学（ULB）资助的ARC项目“细胞命运规范基因调控网络的噪声敏感性”的财政支持。HY团队得到了国家科学研究中心（CNRS）、索邦大学、癌症研究基金会（PJA 20131200223）和国家研究机构（ANR-17-CE13-0003-01）的支持。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。
竞争利益： 提交人声明不存在相互竞争的利益。
介绍
胚胎发育是一个可重复的过程，在此期间，细胞以高时空精度采用不同的身份。这种精度依赖于细胞解释来自其环境的信号并激活特定遗传程序的能力。因此，需要准确描述信号传导和转录输出之间的相互作用，以获得胚胎发育中细胞命运决定的清晰机制知识。在这种情况下，数学模型提供了有用的工具来开发一个统一的框架来描述为研究信号传导和基因表达之间的关系而进行的各种类型的实验。模型还可以回答实验无法轻易研究的问题[1，2]。
海鞘是海洋无脊椎动物脊索动物，属于脊椎动物的姊妹群Tunicata亚门。虽然海鞘蝌蚪幼虫表现出基本的脊索动物身体计划，但这些胚胎比脊椎动物简单得多。此外，海鞘的胚胎发生以不变的细胞分裂模式进行，因此细胞配置和细胞周期进程是准不变的[3，4]。这允许精确识别具有已知发育结果的细胞。通过结合实验观察和计算建模，[4]预测信号发射和信号接收细胞之间的细胞接触面积在决定裂解和原肠胚期鞘胚期间的细胞命运方面起着主要作用。胚胎诱导的几何控制与其他系统中描述的形态原梯度的作用形成鲜明对比，在其他系统中，配体浓度决定细胞反应[1，5]。
在本研究中，我们专注于在32细胞阶段鞘胚的外胚层野内发生的神经 - 表皮二元命运选择。这种神经诱导的发作是通过Otx基因的表达来识别的。Otx被激活为对成纤维细胞生长因子（FGF）下游的细胞外信号调节激酶（ERK）途径的即时早期反应。ERK通过Ets1/2转录因子直接激活Otx表达[6]。虽然所有16个外胚层细胞都与表达FGF的间胚层细胞直接接触（图1B）并且能够对FGF做出反应，但只有四个特定细胞表现出足以诱导Otx表达的ERK活化水平，从而采用神经命运。这种反应的精度取决于外胚层细胞之间发生的ephrin/Eph信号传导[7]。我们最近表明，每个外胚层细胞表现出一定水平的ERK活化，与其与表达FGF的间胚层细胞的表面接触面积相关，而肾上腺素/Eph信号对于抑制所有外胚层细胞的ERK活化很重要[8]。与非洲爪蟾卵母细胞成熟中遇到的情况相反[9]，在海鞘神经诱导过程中，ERK激活不是一个全有或全无的过程，而是取决于细胞表面与表达FGF的细胞接触的面积，略带非线性。分级ERK激活反应被转换为Otx的双峰转录输出，仅限于神经前体。转录因子ERF2也在ERK活性的控制下，抑制低ERK细胞中的Otx表达。因此，ERK活性对Ets1/2介导的激活和ERF2介导的Otx表达抑制施加的双重控制似乎在ERK-Otx关系中产生超敏感性方面发挥了核心作用，这使得神经诱导成为ON或OFF过程[8]。
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图1. 模型演示。
（A）海鞘胚胎的A线外胚层细胞与表达FGF的间胚层细胞和表达麻黄素的外胚层细胞具有不同的细胞接触面。FGF结合激活FGF受体。激活的FGF受体（FGFR*）然后募集鸟嘌呤核苷酸交换因子SOS，其促进Ras-GDP向Ras-GTP的转换。同时，ephrin配体Efna.d的结合激活了Eph受体。活性Eph受体（Eph*）反过来招募p120RasGAP，促进Ras-GTP向Ras-GDP的转换。Ras-GTP也通过与ephrin无关的RasGAP转换为Ras-GDP。Ras-GTP通过包括Raf和MEK的激酶级联诱导细胞外信号调节激酶ERK的激活（双磷酸化：dp）。dpERK对ETS1/2转录因子的磷酸化增强了神经标记基因Otx的表达。同时，dpERK磷酸化Ets阻遏因子2（ERF2，图中表示为ERF），抑制Otx表达。图改编自[8]。（B）左：32细胞阶段鞘胚的方案。A线外胚层细胞以不同的颜色显示：洋红色的A6.5细胞，绿色的A6.6细胞，蓝色的A6.7细胞和灰色的A6.8细胞。间胚层细胞以黄色显示，b线外胚层细胞以浅灰色显示。虚线是用于右侧面板的矢状截面线。右：矢状面部分突出显示了外胚层和中胚层细胞之间的细胞表面接触以及模型中考虑的信号。图改编自[8]。（C）顶部：a线外胚层细胞示意图，以不同的颜色显示与表达FGF的细胞接触的每个细胞表面的面积（S1，左边）和表达麻黄素的细胞（S2，在右侧）。下图：与A线间胚层细胞接触的A线外胚层细胞表面的相对面积，S1和外胚层细胞，S2，对于面板 B 中指示的四种细胞类型。相对接触面积计算为表面接触/总细胞表面。每个点代表一个单元格。用线性函数（显示为黑色虚线）拟合实验数据，我们得到了 S 之间关系的表达式1和 S2： S2= -1.13*秒1+ 0.91 （R2= 0.9896）。图重绘自[8]。
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在我们之前的工作[8]中，我们使用数学建模来增强对数据的解释，并得出关于32细胞阶段鞘胚中神经诱导的分子机制的一些特定部分的结论。特别是，最小和非参数化建模允许研究细胞表面接触与配体浓度在ERK活化状态中的作用，以及控制Ras调节状态的拮抗酶SOS和p120RasGAP的各自作用，Ras是ERK信号级联的入口点。还对激活剂和阻遏剂在ERK活性控制下对Otx表达的双重控制进行了理论分析，以研究阻遏子对ERK-Otx关系的可能影响。在这里，我们结合了之前开发的不同数学模块，以提供对FGF的增强，完整的数学描述和32细胞期海鞘胚胎早期神经诱导期间Otx表达的ephrin信号控制。该模型由一组常微分方程组成，在稳态下求解。将其解决方案与主要来自我们先前工作的实验观察结果进行比较[8]。结果表明，使用一组参数，该模型可以充分解释与神经诱导相关的实验观察结果，当海鞘胚胎的细胞被认为仅通过其与表达FGF和ephrin的细胞的细胞表面接触而有所不同。同一组参数值可以解释对药理学或实验扰动胚胎进行的观察。灵敏度分析证实了模型的鲁棒性。最后，该模型用于通过探索尚未通过实验获得的关系来进行理论预测，例如在没有ERF2阻遏子的情况下，Otx表达对与信号分子接触的细胞表面积的依赖性。
结果
模型概述
该模型认为，每个细胞感知到与表达FGF的中胚层细胞接触面积成比例的FGF信号水平，以及与表达肾上腺素的外胚层细胞的细胞接触面积成比例的ephrin信号水平，如图1A所示。这些表面已被量化（图1C），用于确定与信号接触的受体数量。配体结合的FGF受体（FGFR）和麻黄素结合的Eph受体分别刺激SOS和p120RasGAP的活性。SOS将Ras-GDP转换为Ras-GTP。Ras-GTP通过p120RasGAP和细胞表面接触无关的GAP活性转换回Ras-GDP。Ras-GTP激活ERK信令级联[10，11]。ERK活性与Ras-GTP水平之间的关系由单个函数描述，该函数代表完整的Ras-Raf-MEK-ERK途径。活性ERK反过来磷酸化两种转录因子Ets1/2和ERF2。磷酸化的ETS1/2促进神经即时早期基因Otx的表达，而未磷酸化的ERF2抑制ERK靶标[6，12，13]。该模型由 5 个常微分方程和 13 个代数方程组成，使用 Michaelis-Menten 和 Hill 型动力学表达式描述上述现象。建模部分提供了模型的完整说明。
在 32 细胞期的鞘胚中，神经诱导发生在外胚层谱系（前 （a） 和后 （b） 线），并且依赖于与表达 FGF 的中胚层细胞（前 （A） 和后 （B） 线）的细胞间细胞接触。我们主要关注前外胚层的四对a线细胞，即a6.5，a6.6，a6.7和a6.8（见图1B;这四个细胞与表达FGF的A线中胚层细胞显示出不同的细胞表面接触相对面积，其中神经前体a8.6具有最大的细胞表面接触面积（图5C）。与表达FGF的细胞和表达肾上腺素的细胞表面接触区域呈负相关，使得与表达FGF的细胞接触最大的细胞表面与表达肾上腺素的外胚层细胞接触最少（图1C）。在下一节中，我们对这四个细胞中的ERK活化和Otx表达进行建模。
通过暴露于拮抗信号的细胞表面部分调节ERK活性
实验证据表明，在32细胞阶段的海鞘胚中，外胚层细胞中的ERK活化水平由细胞表面与表达FGF的中胚层细胞和表达肾上腺素的外胚层细胞接触的程度控制[8]。由于这两个接触面积是相关的，因此细胞表面与表达FGF的细胞接触的面积（指定为S1）也可用于定义细胞表面与表达麻黄素的细胞（指定为S）接触的面积2) (图 1C）。因此，在建模方面，唯一特定于细胞类型的参数是 S1.方程（1-13）的稳态溶液应对应于在不同细胞类型中测量的ERK活化水平，作为其细胞核中的抗dpERK免疫荧光（IF）信号。重要的是，假设所有细胞类型的细胞外FGF和肾上腺素浓度相同。如图2A所示，当考虑表1中列出的参数值并假设计算的归一化ERK活性（Erk*）与实验测量的dpERK IF信号之间存在线性关系时，四种细胞类型的观测和建模ERK活化水平之间可以获得良好的一致性（方程（14））。
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图2. 通过细胞接触表面控制ERK活化。
（A） 在 IF 实验中测量的 a6.5、a6.6、a6.7 和 a6.8 细胞类型中的核 dpERK 免疫荧光 （IF） 信号（左）并使用模型计算（右，Erkf值）。每个点代表一个单元，使用S的测量值计算建模结果1.均值和标准差以黑色显示。A = 1850 和 B = 155.11 在方程 （14） 中。（B）单个A线细胞中的核dpERK IF信号显示为实验和模型中细胞表面与A线细胞接触的相对面积的函数。实验数据以灰色（a6.8细胞类型）、绿色（a6.6细胞类型）、蓝色（a6.7细胞类型）、洋红色（a6.5细胞类型）显示，模型预测以黑色显示。通过使用希尔函数拟合模型预测获得的希尔系数：2.41。A = 3000 和 B = 324.52 在方程 （14） 中。灰色阴影区域表示模型预测的不确定性。（C）dnFGFR半注射胚胎（左）和Eph3ΔC半注射胚胎（右）中核dpERK信号的注射/控制比率。左列和右列显示实验性 dpERK IF 和计算的 Erkf分别是比率。通过考虑RT= 100 和 QT分别 = 10。A = 1850 和 B = 155.11 在方程 （14） 中。
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表 1. 参数的默认值。
表中报告的所有单位都是任意的。通过手动拟合获得参数值，以获得最佳与实验观察结果的吻合。模型的两个模块的参数值分别拟合。对于第一个模块（ERK活性模型），手动执行拟合以重现在麻黄素抑制胚胎中获得的实验数据（S1B和S1C图），以设置以下参数的值：Vs， K1， Ks， Kb， K尔克， Kd， [FGF]。然后对野生型胚胎中获得的实验数据（图2A和2B）进行拟合，以设置其余参数的值：VRG， K2， KRG， Ke，[以弗林]。最后，修复 Otx 表达式模型中参数的值 （k毫米3， K毫米3， v毫米4， K毫米4- J毫米1， K毫米1， v毫米2， K毫米2， vb， vo， K一个， K我，k）拟合是在图3D上完成的。
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在a0.0021、a0.0013、a0.0078和a0.0038细胞类型中，计算出的Erk*活动分别等于0.0551±0.0096、0.1787±0.0201、6.8、6.6±6.7和6.5±1.25（S<>A图）。每个值计算为表面接触面积（S1）通过实验测量。计算值再现了观察到的ERK活化与与表达FGF的中胚层细胞接触的细胞表面之间的中等非线性关系。S 之间的非线性关系1ERK活化也可以与在单个细胞水平上测量细胞表面和dpERK的实验进行比较（图2B，nH= 2.41）。该模型预测在最大激活的a0.1细胞中ERK激活水平适中，定义为6和5，~0.18（S1A图）。该值源于假设相对低浓度的细胞外FGF（KD/5）以及在较小程度上来自ephrin的存在（见下文）。
接下来，该模型面临的挑战是预测b线细胞中ERK活化水平。B系细胞既与表达均匀水平配体FGF9/16/20的A线系间胚层细胞接触，也与表达不同水平FGF9/16/20的B线系系中胚层细胞接触（S2A图）[8]。为了解释不同水平的FGF表达，方程考虑了两个不同的FGF受体群体的存在，如建模部分所述（参见'b系细胞中Erk活性模型'一节）。模型预测概括实验观察（S2B图），保持相同的参数值集。只有b6.5细胞显示出高水平的ERK活性，这主要是由于与A线间胚层细胞接触的大量FGF受体。
为了将计算值与实验值拟合，需要调整荧光背景（参见建模部分）。将 Erk* 与测量的 dpERK IF 信号进行比较时，大部分不确定性源于实验测量中荧光的背景水平。实验确定的值分散在计算值周围（图2）。目前尚不清楚每种细胞类型中测量的ERK水平的变化有多少是真实的系统或实验技术所固有的。实验值的离散度大于理论值，可能揭示模型中未考虑的细胞间异质性的存在，或者揭示由于分子波动引起的内在噪声（见讨论）。
FGF和ephrin在早期神经诱导期间控制ERK通路的激活，因此都可以控制神经细胞命运的出现。由于细胞表面与表达FGF的中胚层细胞的接触与表达肾上腺素的外胚层细胞的细胞接触之间存在反比关系（图1C），6细胞阶段鞘胚中ERK活化水平的a5.6>a7.6>a6.6>a8.32谱可以依赖于活性SOS的梯度降低或p120RasGAP活性梯度的增加。通过对两种途径的几种靶向操作和建模，通过实验研究了这些相反影响各自的贡献[8]。结果表明，即使在没有麻黄素信号的情况下，也可以通过FGF受体的逐渐激活来控制ERK激活的概况。麻黄素信号传导对于降低所有外胚层细胞的ERK活化水平很重要。建模预测，与p120RasGAP相比，SOS对ERK激活水平的影响更大。在下文中，我们通过模拟 [8] 中进行的各种实验来验证模型和参数值。
肾上腺素受体的药理学抑制剂NVP-BHG712（以下简称NVP）已被证明可抑制海鞘胚胎中的Eph信号[8，14]。当用 ephrin 的最小值 （0.001） 求解模型方程以模拟抑制剂的存在时，四种细胞类型中 Erk* 活化的 a6.5>a6.7>a6.6>a6.8 谱仍然存在（S1C 图），如实验观察到的那样。此外，该模型仍然表现出细胞表面与表达FGF的细胞接触面积与ERK活化水平之间的正相关，尽管依赖性更平滑（S1B 图，nH= 1.96）。通过将占主导地位的阴性形式的FGF受体（dnFGFR）注射到双细胞阶段胚胎的一个细胞中，通过实验研究了改变SOS途径的效果。在这些条件下，dnFGFR阻断胚胎一半中的FGF信号，而非注射侧代表对照情况。通过减少FGF受体的数量来模拟dnFGFR的作用（RT） 的系数为 20（即 RT= 100）。图2C显示了注入侧和控制侧之间观察到的dpERK IF信号比率。计算预测，FGF受体数量的减少导致a6.5和a6.7型细胞中ERK活化水平显着降低：Erk*现在的范围为~5 10?6在 A6.8 单元格中至 ~5 10?4在 A6.5 细胞中。因此，当FGFR被抑制时，ERK途径在所有细胞类型中几乎完全无活性。该模型以对称的方式再现了注射Eph3受体（Eph3ΔC）的主要阴性形式的效果（图2C）。当除以麻黄素/Eph受体的数量（QT） 到 200 （即 QT= 10）。类似地，通过考虑V 来模拟显性负p120RasGAP（RGΔGAP）的影响RG= 0.01 而不是 0.4（S1D 图）。
综上所述，描述FGF受体控制的SOS激活和ephrin / Eph控制的p120RasGAP激活对ERK信号通路调节的简单现象学方程可以定量解释32细胞期海鞘胚胎的实验观察。该模型的稳态解决方案证实，逐渐ERK活化水平由与FGF和表达麻黄素的细胞的不同细胞表面接触控制。这些表面与ERK活化水平之间的关系是适度非线性的。该模型预测，即使在最强激活的a32.6细胞类型中，ERK途径在海鞘胚胎的5细胞阶段也远未达到最大值（S1A图）。
ERK对Otx基因表达的双重控制
Otx基因是腹鞘神经诱导初始阶段ERK信号的直接靶标[6，15]。我们之前的结果[8]（在上一节中建模）表明，32细胞期鞘鞘胚胎中的ERK激活在响应接触依赖性暴露于FGF信号时表现出相对平滑的轮廓（图2A和2B以及S1B）。相比之下，即时早期基因Otx的转录是双峰的，ON反应仅限于神经前体。我们假设ON/OFF响应至少部分是由于Otx表达的双重控制[8]：ERK的Ets1/2磷酸化是其转录激活剂活性所必需的[16]，而dpERK对ERF2阻遏子的磷酸化促进了其核输出，从而阻止了其与DNA的结合[12，13，17]（图1A）。
为了进一步验证这一假设，我们扩展了上一节中研究的ERK活化模型，包括ERK活化，磷酸化的Ets1 / 2，未磷酸化的ERF2和Otx表达之间的关系。我们首先寻找一组参数值，以解释四种细胞类型中观察到的Otx表达水平。这种集合的存在将证实以下假设，即海鞘胚胎中神经细胞命运的出现是由与FGF和表达麻黄素的细胞的接触区域控制的。使用表1中列出的参数值使用方程（18-1）定义的模型计算的Otx smFISH斑点的稳态水平以及用于比较的实验数据（另见S3A图，了解线性转换为Otx smFISH斑点之前的O值）。当模拟FGF信号传导的抑制（RT= 100而不是2000），所有细胞类型的O值都降至几乎为零，这对应于在dnFGFR注射的半胚胎中观察到的Otx表达的缺失（图3B和S4A）。在模型中与实验一样，Otx表达通过抑制Eph信号传导而增强。这在麻黄素/Eph受体表达无效的模拟中被注意到（QT= 10 而不是 2000）或 p120RasGAP 酶 （VRG= 0.01而不是0.4），或通过模拟NVP对ephrin/Eph受体的抑制（[ephrin] = 0.001而不是5）（见图3B，3C和S4）。在所有情况下，这些处理在a6.7细胞中重现观察到的异位激活。这表明由于缺乏Eph信号传导（图2C右图和S1D）而导致ERK活化水平的适度增加对该细胞类型的Otx表达具有巨大影响。在Eph抑制的胚胎中，如果ERK信号传导通过另一种方式减少（通过增加K模拟的MEK的U0126抑制剂的低剂量尔克（0.6 而不是 0.5）），恢复类似于野生类型模式的 Otx 输出（图 3C，右列和 S4B）。
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图3. 通过 ERK 控制 Otx 表达。
（A） 通过单分子荧光原位杂交（smFISH，左）测量并使用模型计算的 a6.5、a6.6、a6.7 和 a6.8 细胞类型中的 Otx 表达水平（右，Otx 鳞鱼).每个点代表一个单元，使用S的测量值计算建模结果1.均值和标准差以黑色显示。C = 66 和 D = 2.75 在方程 （18） 中。（B）对照中的Otx表达，dnFGFR，Eph3ΔC和RGΔGAP注射胚胎的一半。左列和右列显示实验性 Otx smFISH 斑点和计算的 Otx 鳞鱼分别。四种单元格类型的结果显示在具有不同颜色的相同列中。每个点代表一个单元格。通过考虑R 对dnFGFR、Eph3ΔC和RGΔGAP的注入进行建模托特= 100， Q托特= 10 和 VRG分别 = 0.01。在方程（18）中，对照胚胎和dnFGFR注射胚胎的C = 92，Eph95ΔC注射胚胎的C = 3，RGΔGAP注射胚胎的C = 122。对照和dnFGFR注射胚胎的D = 1.5，Eph2ΔC的D = 71.3，RGΔGAP注射胚胎的D = 1.61。（C）ephrin/Eph抑制剂NVP对四种细胞类型Otx表达的影响。在左侧，控制;中间是NVP处理的胚胎;在右侧，用NVP和ERK抑制剂U0126 0.2 μM处理的胚胎。在这三种情况下，实验性Otx smFISH斑点显示在左侧，并计算出Otx鳞鱼右侧的值。四种单元格类型的结果以不同的颜色显示在同一列中。每个点代表一个单元格。通过考虑 [ephrin] = 0126.0 和 K 来模拟 NVP 和中度 U001 治疗尔克= 0.6 分别。在方程 （18） 中，C = 94，D = 1.2。对于B-C），为清楚起见，S4图中显示了单个细胞类型的数据。（D） Otx 表达作为四种细胞类型（彩色点和三角形）中 ERK 活化水平 （Erk*） 的函数，并使用模型计算 （Otx鳞鱼、黑点和三角形）。在这两种情况下，点表示对照，而三角形表示NVP处理的胚胎。实验数据通过希尔函数拟合，最佳拟合希尔系数 = 6.09。对于实验点，通过反演方程（14）获得每个单元格对应的Erk*值，其中A = 3200和B = 0。通过反演方程（18）得到每个细胞对应的O的实验值，其中C = 120，D = 0。使用实验测量的 Erk* 估计值作为输入来计算建模的 Otx 输出。（E）当未受精卵注射ERF6-吗啉诺以防止ERF5翻译时，a6.6，a6.7，a6.8和a2.2细胞类型中的Otx表达水平。该吗啉诺的注入是通过将I视为方程（0）中等于01.15的常数来建模的。C = 75 和 D = 73.4 在方程 （18） 中。对照胚胎的建模结果与图（A）相同。（F）Otx表达式（O）作为Erk*的函数，使用考虑I（抑制因子）的存在（蓝线，希尔系数= 6.3）或不存在（橙色线，希尔系数= 2.6）的模型计算。希尔系数使用关系（25）计算。垂直虚线表示每种细胞类型的 Erk* 平均值。
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事实上，在实验和模型中观察到Otx表达和ERK激活之间存在高度非线性的关系。在图3D中，对应于实验的Erk*和O的值分别通过Eq（14）和（18）的反演来推断。实验值（彩色点和三角形）与模型结果（黑点和三角形）非常吻合，可以通过尖锐希尔函数（希尔系数 = 6.09）拟合。对于每种细胞类型，通过注射Eph3ΔC抑制ephrin途径将代表点向右移动。虽然对于离阈值很远的a6.5，a6.6和a6.8细胞类型，这种转变对Otx表达的影响可以忽略不计，但它将a6.7从曲线的陡峭部分移动到平台。因此，a6.7 和 a6.5 细胞类型中的 Otx 表达变得相似。这种阈值样行为涉及Otx表达ERF2的抑制子[8]。这种转录抑制因子的关键作用在图3E-3F中可视化。使用在实验数据上校准的参数值（表1），将活性磷酸化Ets1/2激活剂（S3B图中的绿色曲线）和活性未磷酸化ERF2阻遏因子（S3B图中的红色曲线）的水平绘制为Erk*的函数。这些曲线很尖锐（nH= 6.3 对于两条曲线），尽管有 Michaelis-Menten 动力学函数，因为两个转录因子的磷酸化和去磷酸化反应离饱和不远（K毫米1= K毫米2= K毫米3= K毫米4= 0.05），这种情况接近零阶超灵敏度[18]，尽管在ERK和Otx之间引入超灵敏度的不同方法也与我们的数据兼容（S7和S8图，参见“模型预测”部分）。由于这两个相对尖锐的函数的组合，Otx表达和ERK活化之间的关系的特征在于希尔系数为6.3（图3F）。有趣的是，当模型中不考虑抑制子的影响（I = 0）时，曲线不仅因为活化剂的有效结合常数较小而向左移动，而且变得更加平滑（Hill系数= 2.6）。该理论结果与注射ERF2反义吗啉寡核苷酸的胚胎中Otx表达的总体增加和更平滑的行为一致（比较图3A和3E）。因此，我们得出结论，Otx基因的表达与ERK激活之间的尖锐关系是可能的，因为ERK途径既促进Otx的表达，又减轻了这种表达的抑制。
灵敏度分析
接下来，我们进行了敏感性分析，以评估模型的鲁棒性，并确定对模型行为影响最大的参数。图4A显示了在标准值±定义的范围内随机改变与FGF途径（左侧）或ephrin途径（图4A，中）相关的参数值时，不同细胞类型中ERK活化的预测水平。在第一种情况下获得的ERK激活水平的扩散远大于在第二种情况下获得的扩散，这表明与FGF途径相关的参数比与ephrin途径相关的参数对ERK激活水平的影响更大。但是，每个单元格中的平均值实际上保持不变。同样，将所有参数± 20% 更改，可以得到 Otx 表达式的稳健轮廓（图 20A，左和 S4F）。
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图4. 敏感性分析。
（A）左图：当随机改变与FGF途径相关的参数值时，用模型计算的a6.5，a6.6，a6.7和a6.8细胞类型中的Erk活化（Erk*）水平（[FGF]，Kd， K1， Ks/ 5s， RT） 在区间内：标准值± 20%。中：当随机改变与 ephrin 途径相关的参数值时获得的不同细胞类型中的 Erk* 水平（[ephrin]，Ke， K2， KRG/ 5RG， QT） 在区间内：标准值± 20%。右图：使用完整模型随机改变与FGF和ephrin途径相关的参数值计算的Otx水平，如上所述，以及其他参数（面板D加K中的所有参数b和 K尔克).（B） 一次将一个参数的值改变 20% ±时计算的 Erk* 值。图中显示了计算值与使用表1所示参数的默认值获得的值之间的比率。影响SOS通路的参数以蓝色表示，而影响RasGAP通路的参数以红色表示。S 以上结果1和 S2通过考虑 S 获得1和 S2作为单独的输入，因此忽略了等式 （12）。这些变化也可以被视为受体密度的变化（见方程（6）和等式（10））。S 的结果2（S1）通过将方程（12）中的斜率值增加/减少±20%，然后调整截距以与实验数据最拟合而获得。（C） 一次将一个参数的值改变 ±20% 时计算的 O 值。结果的获得方式与图（B）相同。（D） O 值一次改变一个参数的值 ± 20% 时计算。所有面板都显示计算值与使用表 1 中指示的参数默认值获得的值之间的比率。灰色阴影区域表示通过更改模型参数值获得的ERK活性/Otx表达水平的20%和40%变化。
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为了更详细地研究模型对单个参数变化的敏感性，图20B和4C显示了将每个参数的值改变±4%对四种细胞类型中ERK活性（Erk*）和Otx表达（O）的稳定状态的影响（每个参数的定义另见表1）。很明显，ERK激活（图4B）和Otx激活（图4C）对影响SOS通路的参数值的变化（以蓝色表示）比p120RasGAP激活（以红色表示）更敏感。这证实并扩展了我们之前的结论，即FGF受体途径施加的控制力强于ephrin/Eph施加的控制力[8]。该模型对K的值也非常敏感尔克这代表导致ERK途径半最大激活的Ras-GTP的比例。鉴于该参数控制整个ERK通路，该通路由单个Hill函数方程（1）建模，因此直观地预期其值强烈影响Erk*的最终值。当促进ERK活化的参数被修改时，Otx在a6.7细胞类型的表达受到显着影响（图4C），与该细胞在上一节讨论的（Erk*，O）曲线上的位置一致。在全球范围内，该模型对描述 Erk* 和 O 之间关系的参数值的变化非常稳健（图 4D），但 a6.7 细胞除外。对于这种细胞类型，O的值受到磷酸化速率（k毫米3）和去磷酸化（V毫米4） 的 Ets1/2 活化剂。然而，应该注意的是，这种灵敏度分析没有探讨Erk*和Otx表达之间的关系不是超灵敏的情况，因为20%在标准K周围变化。唰??值 （0.05） 仍对应于零阶制度。最重要的是，ERK活化和Otx表达的整体a6.5>a6.7>a6.6>a6.8在所有测试参数范围内都保持不变（例如图4A）。因此，由细胞接触面积控制的神经诱导机制对参数值的变化是鲁棒的。
模型预测
麻黄素-埃弗信号传导的影响。
在本节中，我们使用已在实验数据上校准的模型，并显示其对参数值变化的鲁棒性，以进行理论预测。我们研究了ERK活化水平对暴露于配体的细胞表面区域的变化以及在不同条件下（存在或不存在ephrin）配体构思变化的敏感性。由于具有较大陡度的曲线表示高度敏感的输入输出关系，因此我们使用曲线的希尔系数（有关定义，请参阅建模部分）来测量灵敏度。该过程示意性地表示在图5A中。在我们之前的研究[8]中，我们发现ERK信号传导对细胞表面接触表达FGF的细胞（S1）比FGF浓度。根据希尔系数之间的差异，该陈述的量化如图5B所示，保持每个细胞表面与表达FGF的细胞（S1）和表达麻黄素的细胞（S2）在胚胎中观察到（图1C）。对于每一列，我们使用所有参数的默认值（表 1），除了指示的参数。在同一行中，我们现在研究ERK信号传导是否对细胞表面与表达麻黄素的细胞（S2） 而不是以弗林浓度本身。为此，我们计算了 Erk* 与 S 的希尔系数2关系和 Erk* vs [ephrin]。如图5C所示，ERK活化水平对细胞表面接触表达麻黄素的细胞比对麻黄素浓度更敏感。
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图5. 与影响 Erk 活动的因素相关的模型预测。
（A）数字程序的图形说明。我们考虑两条通用曲线 A 和 B，希尔系数为 n一个和 nB分别。两条曲线的形状取决于参数 p 的值，该值的范围为 0 到 1。在左侧，当参数 p 的值等于 0.1 时，将显示曲线 A 和 B。在此条件下，两个希尔系数n的差值B-n一个很大。在中间，当参数 p 的值等于 0.9 时，将显示曲线 A 和 B。在此条件下，两个希尔系数n的差值B-n一个更小。右面板是热图，显示了曲线 A 和 B 的希尔系数之间的差异 （nB-n一个） 针对 0 到 1 之间的 p 的所有值计算。（B） Erk* 值对 S 更敏感1而不是 [FGF]。热图显示了曲线 Erk*（S 的希尔系数之间的差异）1） 和曲线 Erk*（[FGF]） 的希尔系数。使用参数默认值获得的希尔系数对于 Erk*（[FGF]） 为 1.47，对于 Erk*（S 为 2.39）1).为了计算 Erk*（[FGF]），我们固定了 S 的值1= 0.3。在两个面板中，S1和 S2由方程（12）相关，其分别反映了暴露于FGF和Ephrin的细胞表面部分之间的关系。（C） Erk* 值对 S 更敏感2而不是[以弗林]。热图显示了曲线 Erk*（S 的希尔系数之间的差异）2） 和曲线 Erk*（[ephrin]）的希尔系数。使用参数默认值获得的希尔系数对于 Erk*（[ephrin]） 为 1.17，对于 Erk*（S 为 1.57）2).为了计算 Erk*（[ephrin]），我们固定了 S 的值1= 0.3。在两个面板中，S1和 S2由方程（12）相关，其分别反映了暴露于FGF和Ephrin的细胞表面部分之间的关系。（D）以弗林的存在增加了Erk*和S之间关系的陡度1.热图显示了曲线 Erk*（S 的希尔系数之间的差异）1） 在存在 ephrin 和曲线 Erk*（S 的希尔系数）的情况下计算1）在没有以弗林（[以弗林] = 0.001）的情况下计算。使用Erk*（S1）在没有以弗林的情况下是1.85。（E）以弗林的存在增加了Erk*和[FGF]之间关系的陡峭程度。热图显示了在存在 ephrin 的情况下计算的曲线 Erk*（[FGF]） 的希尔系数与在没有 ephrin 的情况下计算的曲线 Erk*（[FGF]） 的希尔系数之间的差异（[ephrin] = 0.001）。在没有 ephrin 的情况下，使用 Erk*（[FGF]） 参数的标准值获得的希尔系数为 1.42。为了计算 Erk*（[FGF]），我们固定了 S 的值1= 0.3。对于所有面板，计算希尔系数时，参数值从 0 到 1 （Kb， K1， K2/ 5s/ 5RG;左图）或从 0 到 2000 （Ks， KRG， Kd， Ke;右面板）。希尔系数的值是通过曲线拟合获得的。参数的标准值（表1）用黑框突出显示。
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该模型还可用于更深入地了解ephrin的作用，肾上腺素已被证明可以通过将ERK活性降低到该细胞类型的阈值水平以下来防止a6.7细胞中Otx的异位表达。模拟表明，ephrin 的存在也增加了 Erk* 与表达 FGF 的细胞 S 的细胞表面接触关系的陡峭程度1 (图 5D）。有趣的是，Erk*和[FGF]之间关系的陡峭程度也因ephrin的存在而增加，尽管这种影响不太明显（图5E）。在这两种情况下，Erk* （[FGF]） （或 Erk*（S ） 的陡度增加1）） 在没有 ephrin 非依赖性 RasGAP 活性的情况下，由于 ephrin 的存在而产生的关系最大 （Kb= 0）。然而，在K的低值下没有观察到Erk*（[FGF]）关系的陡度增加RG，它定义了p120RasGAP对麻黄素结合受体的敏感性（图5E右）。对于 K 的小值RG，p120RasGAP激活实际上对ephrin不敏感，这使得计算在生理上毫无意义。因此，结果表明，ephrin 信号传导增强了细胞对细胞表面与 FGF 发射细胞接触变化的敏感性。
FGF>FGFR >SOS和ephrin>Eph>RasGAP信号之间的比较。
如前所述[8]和上文（图4）的定性讨论，该模型预测（图6A）ERK信号传导对表达FGF的细胞表面接触的变化更敏感（S1）比细胞表面接触表达麻黄素的细胞（S2） 将这两个曲面视为独立参数时。
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图6. 模型预测。
（A） Erk* 值对 S 更敏感1比到 S2.热图显示了曲线 Erk*（S 的希尔系数之间的差异）1） 和曲线 Erk*（S 的希尔系数）2).Erk*（S1） 是通过固定 S 的值获得的2= S* （S* = 0.3） 并设 S1在 0 和 1-S* 之间变化。相同的过程用于计算 Erk*（S2).对于 Erk*（S ），使用参数标准值获得的希尔系数分别为 1.99 和 1.041） 和 Erk*（S2），分别。（B）Erk*值对[FGF]比对[ephrin]更敏感。热图显示了曲线 Erk*（[FGF]） 的希尔系数与曲线 Erk*（[ephrin]） 的希尔系数之间的差异。为了计算 Erk*（[FGF]） 和 Erk*（[ephrin]），我们固定了 S 的值1= 0.3。参数的标准值用黑框突出显示。（C） ERK活化水平（Erk*）显示为FGF浓度（红色）或麻黄素浓度（橙色）的函数。所用参数的值：Vs= VRG= 1， K1= K2= 0.5， KRG= Ks= 1200， [FGF] 或 [ephrin] = 5， Kd= Ke= 25， RT= QT= 2000， S1= S2= 0.5， Kb= 10?6.希尔系数的值是通过曲线拟合获得的。（D） 上面板：改变k的效果毫米3在方程（16）中磷酸化激活剂的分数之间的关系，Ap和活跃的 ERK，Erk*。下图：热图显示了更改 k 值时 Otx 和 Erk* 之间关系的希尔系数唰??在等式（16-17）中。（E）模型预测的Otx表达水平与与表达FGF的中胚层细胞接触的细胞表面之间的关系（S1）在抑制因子I的存在（蓝色曲线，希尔系数= 14.2）或不存在（橙色曲线，希尔系数= 5.7）的情况下。 垂直虚线表示S的平均值1对于每种细胞类型。希尔系数使用关系（26）计算。
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图6B所示的模拟表明，根据这一特性，Erk*对[FGF]比对[ephrin]更敏感。因此，很明显，FGF>FGFR>SOS和ephrin>Eph>RasGAP通路在控制神经命运的可能结果方面各自的影响是不对称的。简单地说，其中一条途径的上调并不等同于另一条途径的下调。有趣的是，即使没有不依赖 ephrin 的 RasGAP 活性（Kb），Erk* 与 [FGF] 曲线比 Erk* 与 [ephrin] 曲线略陡峭。实际上，图6C显示了Erk*与[FGF]和Erk*与[ephrin]关系的希尔系数分别为2.13和1.80。对于这些曲线，FGF 和 ephrin 途径的所有参数值都相同，Kb~0 和 S1和 S2都等于 0.5。即使在这些完全对称的条件下，当改变FGF或ephrin浓度时，Ras-GTP（T）分数所覆盖的值域也不同（S5图）。因此，Erk* 在增加 [ephrin] 时永远不会达到零，而在增加 [FGF] 时永远不会达到 1，这稍微改变了曲线的陡度（图 6C）。
改变Otx表达调控动力学的影响。
最后，我们探讨了Otx表达调节因子动力学对其开关状行为的影响。它对激活剂和阻遏剂的磷酸化/去磷酸化循环的陡峭度高度敏感，通过 K 的值测量唰?? (S6 图）。这些Michaelis-Menten常数的较小值需要获得Otx表达和ERK激活之间关系中的大希尔系数。这些小值可实现零阶超灵敏度[18]。然而，两个调节器的效果并不对称，因为如果只有阻遏子磷酸化循环对ERK活性有陡峭的依赖性（K值低），则无法获得开关状行为毫米1和 K毫米2) (S6 图）。关于磷酸化速率，当阻遏剂的磷酸化速率略高于激活剂时，开关状行为得到优化（图6D）。激活剂和阻遏剂对Otx表达影响的协同性可能与零阶动力学类似（S7图）。Otx基因的最小增强子称为a元件，在海鞘神经诱导期间介导FGF反应性，并同时包含两个ETS结合位点，每个位点都是外胚层谱系中神经特异性表达所必需的[6]。当我们考虑 Ets1/2 结合中的协同性时（参见“Otx 激活中的协同性”一节），该模型甚至对于 K 的值也重现了实验观察结果唰??对应于非零阶制度（S7图）。在这些条件下，当阻遏因子的磷酸化速率较高时，Otx的开关状行为得到优化，如上所述。在这种情况下，两个稳压器对Otx响应陡度的影响是对称的（S8图）。
Otx表达（O）与与表达FGF的中胚层细胞（S1） 计算的模型如图 6E 所示。抑制子存在（14.2）和不存在（5.7）的希尔系数大约是表征O和Erk*之间关系的希尔系数的两倍（分别为6.3和2.6，见图3F）。因此，Erk* 和 S 之间的中等非线性关系之间的组合1 (图2B）并且O对Erk*（图3D）的陡峭依赖性，由于ERF2阻遏子的存在，允许Otx表达水平对细胞表面接触的准全有或全无依赖性。Otx 表达式与 S 的关系1这很难通过实验获得，也有助于可视化a6.7细胞细胞表面接触值的微小变化（最有可能发生在某些胚胎中）如何使它们偶尔表达Otx，这与实验观察结果一致[7]。除了细胞表面接触的微小变化外，从一个胚胎到另一个胚胎的参数值的细胞-细胞异质性也可能导致在a6.7细胞中观察到的Otx表达水平的变异性增加（图4A，4C，4D和S7F）。简而言之，与其他细胞相比，a6.7 细胞在响应曲线斜率上的位置使其更容易出现 Otx 表达的变化。
讨论
建模在发育生物学中被广泛用于揭示驱动细胞规格的分子机制（例如参见：[19，20]）。本研究中开发的模型支持先前提出的假设，即细胞表面接触面积是海鞘胚胎发生的关键决定因素[4]。这种情况与其他模型系统中广泛使用的配体浓度梯度的作用形成鲜明对比[1]。在腹鞘神经诱导的特定情况下，从FGF和ephrin受体的激活到Otx表达的分子机制的完整数学描述，在正常和扰动条件下都与体内观察结果具有良好的定量一致性。这些结果在参数值方面显示出很强的鲁棒性，证实了在与两个信号分子的细胞表面接触区域编码了足够的信息，以确定海鞘32细胞阶段胚胎中的表皮与神经命运诱导。此外，该模型还表明，这两个信号并不起对称作用。虽然 FGFR 是每个细胞中 ERK 活化的主要决定因素，但差异的 ephrin/Eph 受体激活增加了对 FGF 信号传导的敏感性。ephrin/Eph信号传导的次要作用是由于存在不依赖ephrin的RasGAP活性。然而，即使没有肾上腺素非依赖性RasGAP活性，Ras-GTP产生和还原酶的各自影响也存在内在的不对称性，如图6C所示。最后，FGFR在控制ERK活性方面比ephrin/Eph受体发挥的作用更大，这也是由于模型预测的Ras-GTP/Ras-GDP比率较小。因此，SOS具有更多的可用底物，这使得其活性水平的变化对ERK活化水平的影响大于p120RasGAPs。除了增加对FGF信号的反应灵敏度外，ephrin / Eph信号还抑制了所有细胞中的ERK活化水平。这在ERK活化水平接近Otx表达阈值的a6.7细胞中至关重要。
建模和实验结果之间的最佳一致性是获得参数值，导致预测外胚层细胞中ERK活化水平的适度水平。如此适度的激活水平是由于细胞外[FGF]远低于KdFGF与其受体结合，这意味着假设受体远未饱和（[FGF] = Kd/5，见表1）。特别是，假设a6.5细胞在正常条件下建模的ERK活化水平低于其最大活化水平的25%（S1A图）。这一预测与以下观察结果一致：在a6.5细胞中检测到的核dpERK IF信号水平在肾上腺素抑制胚胎的a2.6细胞中可以增加~5倍，在用高浓度外源性FGF处理的外胚层外植体的最大反应细胞中可以增加~5倍[8]。因此，实验观察支持模型预测，即单个细胞中的ERK激活水平远非最大值。
实验观察和建模预测之间的一致性是通过ERK激活的惊人简单的数学描述获得的，其形式是Ras-GTP（T）分数的希尔函数。观察进一步验证了该描述的充分性，即该模型还考虑了B线外胚层细胞中ERK活化的测量水平，同时考虑了它们与A线和B线中胚层细胞的细胞表面接触值。模拟结果与ERK活化仅限于b6.5细胞（S2图）一致，因此也预测了Otx在这些细胞中的高表达水平[15]。我们对ERK途径的简化描述的充分性也得到了以下事实的证实：使用Hill函数获得的模拟结果可以使用ERK激活途径的经典详细模型[21]使用合理的生理范围（未显示）的参数值进行恢复。
在该模型中，次最大ERK激活源于32细胞期鞘胚中FGF浓度小于KDFGF与其受体的结合。这适用于所有前外胚层细胞，因为假设每个细胞的FGF浓度相同。相反，细胞之间的信号传导水平差异是由于与分泌FGF的中胚层细胞接触的细胞表面的不同区域。假设FGF受体分布均匀，受受体数量调节的信号传导似乎比基于配体浓度调节的信号传导更敏感（图5B;[8]）。 在其他情况下，已经观察到可能可激活的受体的数量，而不是激动剂浓度，在信号通路中起主要作用。例如，Ca的存在和频率2+表达5型谷氨酸代谢受体（mGluR5）的细胞中的振荡由受刺激细胞质膜中这些受体的密度控制，而不是由谷氨酸浓度控制[22]。此外，在早期果蝇胚胎的细胞化过程中，腹侧外胚层ERK响应EGFR配体Spitz的激活也可以作为可用受体数量的传感器，因为EGFR数量减半会导致ERK活化水平降低约一半[23]。在无一例外地切割早期鞘胚中，通过表面积确定的受体数量的控制，结合二元诱导输出，足以控制早期胚胎的规格，而无需额外的调节层[4]。
该模型的一些假设仍需要进一步研究。在实验中，核dpERK IF信号和Otx smFISH斑点的色散远大于模型预测的色散。在该模型中，假设点的离散具有两个性质不同的原点。首先，对于每种细胞类型，ERK信号传导从一个细胞到另一个细胞略有不同，因为细胞与表达FGF的细胞接触的细胞表面积略有不同（S1）和表达麻黄素的细胞（S2) (图 1C）。其次，为了比较用模型计算的ERK活化水平的归一化值与实验获得的核dpERK IF信号，我们考虑了信号的背景水平。因此，还必须考虑该信号的变化，我们将其等同于响应较小的a6.8细胞中ERK激活水平的变化（参见下面的“不确定性估计”部分）。这就解释了为什么核dpERK IF信号和核Otx smFISH点的模拟值的误差线会超过各个点的色散。然而，在实验测量中，如果我们将 ERK 活化水平的 a6.8 水平视为背景，并将每个胚胎剩余细胞中的 dpERK IF 测量值标准化为同一侧 a6.8 值，则点数的巨大变化仍然存在（未显示）。因此，我们的实验值的变化不仅仅是由荧光的背景水平不同引起的。实验测量值的较大离散度表明存在细胞间差异（例如细胞体积和速率常数），而不是模型中未考虑的相对细胞表面积。同样，有趣的是，当将模型输出拟合到抑制ERF2功能后的实验中时，需要比平常更大的背景减法，表明Otx表达的基础水平大于预测水平，即使在ERK活性低的细胞中，当通过ERF2的抑制解除时。因此，Otx的激活可能涉及ERF2 / Ets1 / 2以外的因素，Gata.a [6，24，25]是目前正在研究的主要候选者。当前模型中不考虑其他因素的存在。
该模型的另一个假设与ERK和Otx表达之间超敏感关系的起源有关。虽然我们已经证明ERF2阻遏子的存在进一步增加了关系的陡度，但ERK和Otx表达之间已经非线性的关系（nH= 2.6，见图3F）被假定是由于Ets1/2和ERK*之间的关系中存在零阶超灵敏度[18]。实际上，在Otx表达的调控中没有这种现象的实验证据，尽管据报道其他发育相关过程就是这种情况[26]。其他可能性，例如效应子的协同结合（如S7图所示），可能涉及并从机制角度发挥与零阶超灵敏度相同的作用，而不会改变从本研究中得出的一般结论。进一步研究分级ERK信号在鞘翅神经诱导过程中转化为即时早期基因的双峰转录输出的机制，将提高我们对众多ERK依赖过程的输入 - 输出关系的一般知识。
型
我们开发了一个计算模型来描述在鞘翅神经诱导过程中FGF和ephrin调节的ERK通路对Otx表达的调节。该模型是我们之前工作中开发的三个独立模块的组合和参数化的结果，以帮助理解一方面如何集成信号输入以激活ERK信号，另一方面ERK信号如何调节Otx表达[8]。在这里，我们组合这些模块并校准参数的值，以将完整模型的结果与实验结果进行比较。
ERK 激活模型
我们假设FGF和ephrin作为短程配体，ephrins是膜系系配体，并且中胚层和外胚层细胞之间的细胞外FGF（[FGF]）浓度是均匀的。这一假设的动机是观察到所有A线外胚层细胞都与表达均匀水平FGF的A线间胚层细胞接触（见图S1A的[8]）。同样，我们假设细胞外ephrin（[ephrin]）的浓度是恒定的。根据实验观察[8]，我们认为外胚层细胞质膜上FGF受体的密度是均匀的。在没有实验数据的情况下，我们同样认为外胚层细胞质膜上Eph受体的密度是均匀的。因此，与配体接触的受体数量对于每个外胚层细胞是不同的，因为它与与表达FGF或肾上腺素的细胞接触的细胞表面面积成正比。
细胞外信号调节激酶ERK的激活（磷酸化）是由Ras-GTP（见图1A）通过一系列未明确考虑的磷酸化诱导的。假设Ras-GDP和Ras-GTP的总量是守恒的，我们将活性的，双磷酸化的ERK（Erk*）的分数与与GTP（T）结合的Ras部分之间的关系描述为希尔函数，即：
(1)
尔克.max是 ERK 激活的最大级别（Erk一个），n 是希尔系数，K尔克是导致一半最大 ERK 激活的 Ras-GTP 的比例。
Ras-GTP分数的演化方程为（见图1A）：
(2)
其中 V求救([FGF]）是从 Ras-GDP 到 Ras-GTP 的转换率（由依赖 FGF 的 SOS 活动介导），Vp120拉斯盖普([以弗林]）是从Ras-GTP到Ras-GDP的转换率（由依赖ephrin的p120RasGAP活动介导），并且是由与ephrin无关的RasGAP活动介导的从Ras-GTP到Ras-GDP的转换率。我们现在将描述这三个过程。
SOS介导的从Ras-GDP到Ras-GTP的转换。
Ras-GDP由SOS按照Michaelian动力学转化为Ras-GTP。因此，转化率V求救可以写成：
(3)
其中 V1是 SOS 和 K 将 Ras-GDP 转换为 Ras-GTP 的归一化最大比率1是SOS对其底物Ras-GDP的归一化半饱和常数。为了考虑配体结合的FGF受体的细胞接触依赖性数量，我们认为SOS必须处于其活性状态SOS*（即膜募集）以促进Ras-GTP的形成。激活SOS的反应取决于FGF结合受体的数量，Rb.因此，我们重写速率V1奥斯特
(4)
其中 VS是 SOS 激活的最大速率和 KS是导致最大 SOS 活性一半的 FGF 结合受体的数量。我们没有明确模拟SOS激活之前结合的FGF受体的硫酸乙酰肝依赖性二聚化。Rb由以下人员给出：
(5)
其中[FGF]是FGF的细胞外浓度，R是可能与FGF接触的受体数量，Kd是FGF与其受体的结合常数。由于我们假设外胚层细胞膜上FGF受体的密度是恒定的，因此与FGF接触的受体数量可以写为：
(6)
其中 RT是细胞上存在的FGF受体的总数，并且S1是暴露于FGF的细胞表面的比例。在没有鞘翅目胚胎实验数据的情况下，我们选择RT= 2000，与哺乳动物细胞报道的值一致[27]。
Ephrin 依赖 RasGAP 介导的从 Ras-GTP 到 Ras-GDP 的转换。
Ras-GTP到Ras-GDP的转换是由p120RasGAP遵循Michaelian动力学介导的。因此，转化率V拉斯-间隙可以写成：
(7)
其中 V2是 p120RasGAP 和 K 将 Ras-GTP 转换为 Ras-GDP 的归一化最大比率2是p120RasGAP对其基底Ras-GTP的归一化半饱和常数。
为了考虑Eph受体的细胞依赖性数量，我们认为p120RasGAP必须处于活性状态p120RasGAP*（膜募集）才能促进Ras-GDP的形成。
p120RasGAP的激活取决于与ephrin结合的受体数量（Qb).因此，我们重写转换率V2奥斯特
(8)
(9)
VRG是p120RasGAP活化的最大速率，KRG是导致最大p120RasGAP激活的一半与肾上腺素结合的Eph受体的数量。Q是与麻黄素接触的Eph受体的数量，[ephrin]是麻黄素浓度和Ke是麻黄素与其受体的结合常数。
由于我们假设外胚层细胞膜上Eph受体的密度是恒定的，因此与ephrin接触的受体数量可以写为：
(10)
其中 QT是细胞上存在的Eph受体的总数，并且S2是暴露于麻黄素的细胞表面的比例。
Ephrin 独立 RasGAP 介导的从 Ras-GTP 到 Ras-GDP 的转换。
由于转录组数据集[28]表明早期鞘翅目胚胎中至少存在三种RasGAPs（IQGAP1/2/3、神经纤维蛋白和RASA2/3），因此考虑了基础GAP活性的存在。由于接触面无关的RasGAP活性，从Ras-GTP到Ras-GDP的转换由线性反应速率Kb.因此，转换率可以写为：
(11)
与FGF和麻黄素接触的细胞表面部分之间的经验关系。
为了解释暴露于ephrin的Eph受体数量与暴露于FGF的FGF受体数量一起变化的事实，即与FGF接触的FGF受体数量最多的细胞（R）也与ephrin接触的Eph受体数量最少（Q），我们使用图1C的实验数据。绘图 S2作为 S 的函数1并将实验数据与线性函数拟合，我们得到了 S 之间的以下关系1和 S2:
(12)
综上所述，T（方程（2））的演化方程变为：
(13)
我们求解了平衡时 T 的方程，得到 T 作为 [FGF] 的函数或 S 的函数1.然后，我们使用方程（1）计算活动ERK的比例。
通常，实验测量的量是抗dpERK IF信号的水平。因此，为了将模拟结果与实验进行比较，我们认为ERK荧光水平（Erkf） 是 ERK 激活水平 （Erk*） 的线性函数：
(14)
其中A是最大ERK抗dpERK IF信号，B是背景dpERK IF信号。考虑到用模型计算的Erk*在a6.8细胞类型中接近于零，我们在每次实验中选择B作为a6.8细胞类型的荧光平均值。A是根据经验定义的，以获得对数据的最佳拟合。
我们已经验证（未显示）当使用详细模型描述ERK途径的激活时，我们的理论预测保持不变[21]。
Otx 表达式模型
Otx表达由dpERK调节（图1A）。Otx基因的最小增强子称为Otx a元件，含有26个GATA和1个ETS（E2转化特异性）结合位点，这些位点是通过Gata.a和Ets6/24转录因子在外胚层谱系中进行神经特异性表达所必需的[<>，<>]。
Ets2阻遏因子2（ERF2）[29]识别与转录激活因子Ets1/2相同的结合位点，其活性通过核输出受到ERK的负控制[12，13，17]。因此，我们认为Otx表达通过刺激激活剂（A;例如Ets1/2）而增强，并被抑制因子（I;例如ERF2）抑制。激活剂和阻遏剂的磷酸化由ERK控制。因此，我们使用以下演化方程对Otx表达式进行了建模：
(15)
其中 vb是基础 Otx 表达率，（vb+vo） 是最大 Otx 表达速率，k 是 Otx 的降解速率。K一个是活化剂 A 的半饱和常数p而 K我是阻遏因子的解离常数。在方程（15）中，认为ERF2（I）是Ets1/2（A）的竞争性抑制剂。因此，存在一个有效的半饱和常数，该常数取决于I的浓度，该浓度等于。当I很大时，这个有效常数远大于K一个而且，当I小时，这个有效常数接近K一个.
描述Ets1/2和ERF2磷酸化和去磷酸化的进化方程是：
(16)
(17)
其中 Ap表示活性磷酸化激活剂的比例;（1?Ap）无活性，未磷酸化激活剂的比例;I是活性的，未磷酸化的阻遏剂的分数和（1?I）无活性的磷酸化阻遏剂的比例。对于两个磷酸化反应，速率常数k毫米3和 k毫米1A和I磷酸化乘以双磷酸化ERK（Erk*）的分数。v毫米4和 v毫米2是 A 的最大速率p和我p去磷酸化。K毫米3和 K毫米1分别是 A 和 I 磷酸化的米歇尔-门滕常数，以及 K毫米2和 K毫米4是 I 去磷酸化的米氏-门滕常数p和 Ap分别。K毫米3和 K毫米4相对于总活化剂浓度进行归一化，而K毫米2和 K毫米1相对于总抑制物浓度进行归一化。
由于实验测量的数量是smFISH Otx斑点的计数，为了将模拟结果与实验进行比较，我们认为smFISH Otx斑点的计数水平（Otx鳞鱼） 是 Otx 表达式 （O） 水平的线性函数：
(18)
其中C是smFISH Otx斑点的最大数量，D是基础smFISH Otx斑点计数。考虑到用模型计算的O值在a6.8细胞类型中接近于零，我们在每次实验中选择D作为a6.8细胞类型中的Otx smFISH计数。C是根据经验定义的，以获得与数据的最佳拟合。
获取 Otx 表达式（O 和 Otx ）的表达式鳞鱼） 作为信令级联输入的函数 （S1），我们结合了前面几节中介绍的ERK活性和Otx表达模型。我们使用方程（1）计算ERK活动，并将其用作输入（Erk*）来计算活动Ets1/2（Ap）和使用方程（2）和（16）的活性ERF17（I）。然后我们通过求解方程（15）来计算Otx表达的水平。所有方程均在稳态求解。
方程在稳态下解析求解，并使用 Python 编写的代码评估所有研究的参数值集的解。所有代码和实验数据均可在 https://github.com/rossanabettoni/Model-of-neural-induction-in-the-ascidian-embryo 获得。
B线细胞中ERK活化的模型
B系外胚层细胞既与表达均匀水平FGF的A线间胚层细胞接触，也与表达不同水平FGF的B线间胚层细胞（B6.1、B6.2、B6.3和B6.4）接触（S2图）[8]。因此，方程（5）和（6）不能恰当地描述这些细胞中FGF途径的激活。为了模拟b系细胞中ERK途径的激活，我们考虑了两个不同的FGF受体群体。第一个群体包括位于表面上与B系细胞接触的受体。对于每个b线细胞，与细胞B6.i界面处的FGF结合受体的数量（i范围为1至4）由下式给出：
(19)
其中 S1B6.我是与细胞 B6.i 和 [FGF 接触的 B 线细胞表面的面积]乙6.i是该界面处细胞外 FGF 浓度的建模水平。
FGF受体的第二个群体包括那些位于与A线间胚层细胞接触的表面部分的受体。在该表面部分，FGF结合受体的数量由方程（5）给出。因此，给定b系细胞的结合FGF受体总数为：
(20)
S 的值1和 S1B6.我在GitHub上给出（见上文）。根据实验测量的FGF9/16/20配体的基因表达水平估计每个界面的细胞外[FGF]水平（参见[1]中的S8A）。由于这些数据仅允许比较 [FGF] 等于 5 的 A 线系中胚层细胞感知的 FGF 浓度（表 1），因此我们认为 [FGF]B6，1= 5， [FGF]B6，2= 0.7， [FGF]B6，3= 0.08 和 [FGF]B6，4= 0.7。对于此分析，我们忽略了方程（12）并输入了S1和 S2作为自变量的测量值。S 的实验测量1和 S1B6.我和 S2在 S2A 图中表示。
Otx 激活中的协同性
依赖于Ets1/2的Otx激活中的协同性也有助于Otx对ERK激活响应的超灵敏度。事实上，Otx a元件包含两个ETS结合位点[6]。
我们模拟了 Ets1/2 结合中的协同性，在 Otx 的演化方程中引入了等于 2 的希尔系数：
(21)
方程 （21） 和以下参数 （K毫米1= K毫米2= K毫米3= K毫米4= 0.3， k毫米1= k毫米3= 14）用于获得S7图中所示的结果。该图说明方程（16）和（17）中的零阶超灵敏度可以用方程（15）中的协同性代替。
实验方法
除了在b线细胞中获得的数据外，所有实验结果都取自我们以前的工作[8]。如前所述，对b线细胞中的细胞表面接触和dpERK IF水平进行了实验测量[8]。
不确定性的估计
抗dpERK免疫荧光。
给定一组完整的参数值，包括 S1和 S2，ERK 活性 （Erk*） 的确定性建模值没有不确定性。然而，为了与实验数据进行比较，我们计算了 Erk* （Erk ） 的 25 个值的平均值M），对应 25 对 （S1/ 02） 单个单元格的值。该计算的平均活动（ΔErkM） 是标准差。
通过实验，ERK活化水平通过免疫荧光（IF）信号进行量化。如上所述（方程（14）），我们假设IF信号是Erk*的线性函数：其中B是IF信号的背景值。
在没有其他信息的情况下，我们假设B（ΔB）的不确定性与在a6.8细胞中测量的dpERK IF信号实验值的标准差相同。尽管ERK活化水平的真实值与测量的荧光强度在斜率方面不太可能存在零变异性，但我们没有办法测量或估计这一点。因此，我们认为A没有不确定性。
因此，不确定性Δ Erkf等于每个单元格的 ΔB，即对于每对 （S1/ 02） 值。在图2A、S1C和S2B中，不确定性Δ Erkf为了清楚起见，未显示单个单元格。给定细胞类型的平均ERK荧光计算如下： 具有相应的不确定性：
(22)
这种不确定性在图形面板上表示为模型误差线。
处理和未处理细胞中抗dpERK免疫荧光水平之间的比率（图2C和S1C）
胚胎注射侧的dpERK IF信号水平与胚胎对照侧（对于单个细胞）的dpERK IF信号水平之间的比率为：
具有不确定性：其中 和 等于 ΔB。在图2C和S1D中，未显示单个细胞的不确定性Δr。
每种细胞类型的比率平均值计算如下：
具有相应的不确定性：
(23)
其中 ΔErkMf(印）和 ΔErkMf(控制）由方程 （22） 给出。
这种不确定性在图形面板上表示为模型误差线。
Otx smFISH 斑点计数
给定一组完整的参数值，包括 S1和 S2，Otx表达式（O）的确定性建模值没有不确定性。然而，为了与实验数据进行比较，我们计算了25个O（OM），对应 25 对 （S1/ 02） 值。该计算的平均活动（ΔOM） 是标准差。
在实验上，Otx表达通过Otx smFISH斑点计数进行量化。如上所述（方程（18）），我们假设荧光斑点的数量是O的线性函数：其中D是Otx smFISH斑点计数的基础值。
在没有其他信息的情况下，我们假设D（ΔD）的不确定性与在a6.8细胞中测量的Otx smFISH斑点计数实验值的标准偏差相同。我们认为C没有不确定性。
因此，不确定性 ΔOtx鳞鱼等于每个单元格的 ΔD，即对于每对 （S1/ 02） 值。在图3A、3B、3C、3E、S4A、S4B、S7A和S7C中，不确定性ΔOtx鳞鱼为了清楚起见，未显示单个单元格。
给定细胞类型的平均 Otx smFISH 斑点计数计算如下： 具有相应的不确定性：
(24)
这种不确定性在图形面板上表示为模型误差线。
希尔系数的估计
如果未明确提及，则希尔系数是通过将曲线与希尔函数拟合而获得的。
由于在没有抑制因子的情况下，曲线Otx表达（O）作为Erk*的函数的拟合很差（图3F），我们使用希尔系数可以用效力计算的事实作为：
(25)
其中 Erk*90和尔克*10分别是产生 90% 和 10% 的最大 Otx 表达所需的 ERK 活性水平。
类似地，我们计算了Otx表达式（O）和S之间的希尔系数。1在图6E中为：
(26)
其中 S190和 S110是与FGF接触的细胞表面部分，分别产生90%和10%的最大Otx表达。
支持信息
通过细胞接触表面控制ERK活性。
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B一个C单元格 a6.5单元格 a6.6单元格 a6.7单元格 a6.8实验数据：模型预测NVP-处理过的胚胎DRG?差距单元格 a6.5单元格 a6.6单元格 a6.7单元格 a6.8S1无花果.控制之厄克活动由细胞联系表面.A)厄克活动在这一个6.5,一个6.6,一个6.7和一个6.8细胞类型计算跟这型显示如尔克*值（左）或如尔克f值（右），跟这关系之间这二鉴于由情 商(14)跟A=1850和B=155.11.结果是相同自那些显示在无花果2一个哪里只这值之尔克f是表明.（二）核dpERK如果信号在个人一个-线细胞之NVP-治疗胚胎是显示如一个功能之这相对面积之细胞表面联系跟一个-线细胞在实验和在这型.实验的数据是显示在灰色（一6.8细胞类型），绿（一6.6细胞类型），蓝（一6.7细胞类型），品红（一6.5细胞类型），预测之这型在黑.自考虑这存在之NVP，[艾弗林]=0.001在这型.山系数获得由拟 合这型预测跟一个山功能:1.96.A=2500和B=256.3在情 商(14).这面积阴影在灰色代表这不确定性上这型预测.(C)核dpERK信号在这一个6.5,一个6.6,一个6.7和一个6.8细胞类型在NVP-治疗胚胎如量过的在如果实验（左）和计算跟这型（右，尔克f值）.每点代表一个单细胞和建 模结果是计算用这量过的值之S1.自考虑这存在之NVP，[艾弗林]=0.001在这型.方法和标准偏差是显示在黑.A=2280和B=196.5在情 商(14).（四）注入/控制比率之核dpERK信号在格迪加普注入半胚胎.左和右列显示比率之活动之实验的dpERK和计算尔克f,分别.注射之p120拉斯迪加普是建 模由考虑到VRG=0.01.A=1850和B=155.11在情 商(14).
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S1 图 通过细胞接触表面控制ERK活性。
A） 使用模型计算的 a6.5、a6.6、a6.7 和 a6.8 细胞类型中的 ERK 活性，显示为 Erk* 值（左）或 Erkf值（右），两者之间的关系由方程 （14） 给出，A = 1850 和 B = 155.11。结果与图 2A 中显示的结果相同，其中只有 Erk 的值f被指示。（B）NVP处理胚胎的单个A线细胞中的核dpERK IF信号在实验和模型中显示为细胞表面与A线细胞接触的相对面积的函数。实验数据以灰色（a6.8细胞类型）、绿色（a6.6细胞类型）、蓝色（a6.7细胞类型）、洋红色（a6.5细胞类型）显示，模型预测以黑色显示。要考虑 NVP 的存在，模型中的 [ephrin] = 0.001。通过使用希尔函数拟合模型预测获得的希尔系数：1.96。A = 2500 和 B = 256.3 在方程 （14） 中。（C） 在 IF 实验中测量的 NVP 处理胚胎中 a6.5、a6.6、a6.7 和 a6.8 细胞类型中的核 dpERK 信号（左）并使用模型计算（右，Erkf值）。每个点代表一个单元，使用S的测量值计算建模结果1.要考虑 NVP 的存在，模型中的 [ephrin] = 0.001。均值和标准差以黑色显示。A = 2280 和 B = 196.5 在方程 （14） 中。（D）RGΔGAP注射半胚胎中核dpERK信号的注射/控制比例。左列和右列显示了实验dpERK和计算Erk的活动比率f分别。p120RasΔGAP的进样通过考虑V进行建模RG= 0.01。A = 1850 和 B = 155.11 在方程 （14） 中。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1010335.s001
（英文）
S2 图 B线细胞的实验数据和预测。
（A）左：32细胞阶段胚胎图，顶部动物侧视图，底部植物侧视图。外胚层细胞用绿色虚线（顶部）包围，A线和B线中胚层细胞之间的边界用绿色虚线（底部）标记。B线外胚层细胞按照指示的颜色代码着色，a线外胚层细胞为白色。B线中胚层细胞用灰度热图着色，描绘模型中使用的FGF水平（A = B6.1 = 5;B6.2 = B6.4 = 0.7;B6.3 = 0.08）。中图显示了每个具有A线间胚层的b线细胞和每个B线中胚层细胞的细胞表面接触的相对面积，点用灰度FGF热图着色。右图显示了表达肾上腺素的每个外胚层细胞的细胞表面接触的相对面积。在图表中，每个点代表一个单元格，n = 26 每种单元格类型。（B）在IF实验中测量的b6.5，b6.6，b6.7和b6.8细胞类型中的核dpERK信号（左，每种细胞类型n = 100）并使用模型计算（右，参见“b线细胞中的Erk活性模型”部分）。每个点代表一个单元，使用S的测量值计算建模结果1和 S2来自面板 （A）。均值和标准差以黑色显示。A = 1500 和 B = 144.9 在方程 （14） 中。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1010335.s002
（英文）
S3 图 通过拮抗转录因子对Otx表达进行双重控制。
（A） 使用模型计算的 a6.5、a6.6、a6.7 和 a6.8 细胞类型的 Otx 表达水平，显示为 O 值（左）或 Otx 鳞鱼值（右），两者之间的关系由方程 （18） 给出，C = 66 和 D = 2.75。结果与图3A中显示的结果相同，其中只有Otx的值鳞鱼被指示。（B）Otx表达的活性活化剂浓度之间的关系（Ap，磷酸化的Ets1 / 2）和模型中Otx表达（I，未磷酸化的ERF2）和ERK活性（Erk*）的活性阻遏因子。曲线的希尔系数使用关系（25）计算。当与 Otx 表达式的方程 （15） 结合使用时，O 和 Erk* 之间的关系采用图 3F 所示曲线的形式。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1010335.s003
（英文）
S4 图 图3B和3C所示数据的扩展表示。
（A）在dnFGFR（左上），Eph3ΔC（右上）和RGΔGAP（左下）注射胚胎中的Otx表达。在每个图中，左右列显示实验性 Otx smFISH 斑点和计算的 Otx 鳞鱼分别。通过考虑R 对dnFGFR、Eph3ΔC和RGΔGAP的注入进行建模托特= 100， Q托特= 10 和 VRG分别 = 0.01。在方程（18）中，对照胚胎和dnFGFR注射胚胎的C = 92，Eph95ΔC注射胚胎的C = 3，RGΔGAP注射胚胎的C = 122。对照和dnFGFR注射胚胎的D = 1.5，Eph2ΔC的D = 71.3，RGΔGAP注射胚胎的D = 1.61。（B）麻黄素/Eph抑制剂NVP对四种细胞类型Otx表达的影响。左边是NVP处理的胚胎;在右侧，用NVP和ERK抑制剂U0126 0.2 μM处理的胚胎。在这两种情况下，实验性Otx smFISH斑点显示在左侧，并计算出Otx 鳞鱼右侧的值。每个点代表一个单元格。通过考虑 [ephrin] = 0126.0 和 K 来模拟 NVP 和中度 U001 治疗尔克= 0.6 分别。在方程 （18） 中，C = 94，D = 1.2。显示的数据与图3B和3C中的数据相同。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1010335.s004
（英文）
S5 图 Ras-GTP部分对SOS（FGF）和RasGAP（ephrin）途径的不对称依赖性。
由于当FGF或ephrin变化时，T可以达到的边界不同，因此ERK活性在相同的极限之间不会变化。因此，Erk* 和 [FGF] 或 [ephrin] 之间的关系在这两种情况下是不同的，如图 6C 所示。所用参数的值：Vs= VRG= 1， K1= K2= 0.5， KRG= Ks= 1200， [FGF] 或 [ephrin] = 5， Kd= Ke= 25， RT= QT= 2000， S1= S2= 0.5， Kb= 10?6.
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1010335.s005
（英文）
S6 图 左：更改 K 的效果唰??在方程（16）中磷酸化激活剂的分数之间的关系，Ap和活跃的 ERK，Erk*。
右图：热图显示了更改 K 值时 Otx 和 Erk* 之间关系的希尔系数唰??在等式（16-17）中。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1010335.s006
（英文）
S7 图 Otx 激活中的协同性。
计算Otx表达水平时考虑了Otx活化中的协同性（参见“Otx活化中的协同性”一节） 表1中的标准参数值或：K毫米1= K毫米2= K毫米3= K毫米4= 0.3， k毫米3= k毫米1= 14。（A） 通过单分子荧光原位杂交（smFISH，左）测量并使用模型计算的 a6.5、a6.6、a6.7 和 a6.8 细胞类型中的 Otx 表达水平（右，Otx 鳞鱼).每个点代表一个单元，使用S的测量值计算建模结果1.均值和标准差以黑色显示。C = 60 和 D = 2.75 在方程 （18） 中。（B）Otx表达作为四种细胞类型（彩色点和三角形）中ERK活性（Erk*）的函数，并使用模型（Otx）计算鳞鱼，黑点和三角形），考虑 Otx 激活中的协同性（参见“Otx 激活中的协同性”一节）。在这两种情况下，点表示对照，而三角形表示NVP处理的胚胎。实验数据通过希尔函数拟合，最佳拟合希尔系数 = 6.09。对于实验点，通过反演方程（14）获得每个单元格对应的Erk*值，其中A = 3200和B = 0。通过反演方程（18）获得对应于每个细胞的O的实验值，C = 110和D = 0。使用实验测量的 Erk* 估计值作为输入来计算建模的 Otx 输出。（C）注射ERF2-吗啉基以抑制ERF2翻译的卵子胚胎中的Otx表达水平，并以I = 0.01（方程（15））建模。C = 73。4 和 D = 65 在方程 （18） 中。（D）合作性模型中活性活化剂（Ap，磷酸化Ets1/2）和活性阻遏剂（I，未磷酸化ERF2）浓度与ERK活性之间的关系。曲线的希尔系数使用关系（25）计算。（E） Otx 表达式 （O） 作为 Erk* 的函数，使用考虑 I （ERF4） 的存在（蓝线，希尔系数 = 4.2）或不存在（橙色线，希尔系数 = 6.2）的协同性模型计算。希尔系数使用关系（25）计算。垂直虚线表示每种细胞类型的 Erk* 平均值。（F） 左图：随机选择与 FGF 受体通路 （[FGF]， K 相关的参数值时，使用模型计算的 a6.5、a6.6、a6.7 和 a6.8 细胞类型中的 Otx 表达 （Otx） 水平d， K1， Ks/ 5s， RT） 在区间内：标准值± 20%。中间：随机选择与 ephrin 受体途径（[ephrin]，K 相关的参数值时获得的不同细胞类型中的 Otx 表达水平e， K2， KRG/ 5RG， QT） 在区间内：标准值± 20%。右侧：随机选择范围内所有参数的值时获得的不同细胞类型的Otx表达水平：标准值±20%。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1010335.s007
（英文）
S8 图 热图显示了更改 k 值时 Otx 和 Erk* 之间关系的希尔系数唰??在方程（16-17）中，然后是合作性模型（方程（21））。
热图显示更改 K 值时 Otx 和 Erk* 之间关系的希尔系数唰??在方程（16-17）中使用协同性模型（方程（21））。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1010335.s008
（英文）
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