《亲环素19B启动子区的短串联重复多态性驱动其转录上调并有助于疟疾寄生虫恶性疟原虫的耐药性》期刊简介
亲环素19B启动子区的短串联重复多态性驱动其转录上调并有助于疟疾寄生虫恶性疟原虫的耐药性
米哈尔·库查尔斯基 ，格林纳季·维里亚纳塔 ，苏拉夫·纳亚克 ，约瑟芬·博恩托罗，耶日·米哈尔·齐坎，克里斯蒂娜·阿西西，罗伯·范德普鲁伊姆，奥利沃·米奥托，莫淑贤，阿尔詹·唐多普，兹比内克·博兹德奇
发布时间：25 年 2023 月
抽象
人类疟疾寄生虫恶性疟原虫对青蒿素的耐药性现已在东南亚完全确立，并在撒哈拉以南非洲逐渐出现。尽管pfk13 Kelch重复螺旋桨（KREP）结构域中的非同义SNP与青蒿素耐药性明显相关，但它们的功能相关性需要与其他遗传因素/P的改变合作。恶性疟原虫基因组，统称为遗传背景。在这里，我们提供了实验证据，证明P.恶性嗜环素 19B （PfCYP19B） 可能代表这种遗传背景中的一个推定因素， 通过其表达增加促进青蒿素耐药性.我们表明，PfCYP19B在体外的过表达不仅对青蒿素而且对哌喹（青蒿素类联合疗法中的重要伙伴药物）产生有限但显着的耐药性。我们发现PfCYP19B通过调节磷酸化eIF2α（eIF2α-P）的水平作为综合应激反应（ISR）途径的负调节因子。奇怪的是，青蒿素和哌喹以相反的方向影响eIF2α-P，在这两种情况下都可以由PfCYP19B调节抗性。在这里，我们还提供了证据，证明耐药寄生虫中PfCYP19B的上调似乎是由基因启动子区域中的短串联重复（SRT）序列多态性维持的。这些结果支持一个模型，即青蒿素（和其他药物）耐药机制是由其启动子区域的遗传多态性驱动的多个基因的表达改变所促成的复杂遗传性状。
作者摘要
疟疾寄生虫是一种复杂的真核病原体，能够迅速对任何给定的药物治疗产生耐药性。通常，抗性机制不仅取决于一种遗传元素，还取决于同时保留在种群中的几种遗传元素的合作。这些相互作用目前仍然很少被现代疟疾研究所研究。在这里，我们更详细地探讨了假定的遗传背景元素之一 - 亲环素19B及其对疟疾寄生虫耐药性的影响。我们已经表明，过度表达这种蛋白质的寄生虫对两种重要的抗疟药物 - 双氢青蒿素和哌喹表现出更高的耐受性。这种耐受性可能涉及一种重要的真核应激反应和信号通路，称为综合应激反应。我们还揭示了亲环蛋白19B表达水平与位于其基因启动子区域的短串联重复AT富区域中的基因组DNA序列多态性之间的联系。本研究为进一步探索恶性疟原虫基因组中丰富的AT富元素的功能及其与差异基因表达、表型变异和最终耐药性选择的关系提供了重要框架。
引文： Kucharski M， Wirjanata G， Nayak S， Boentoro J， Dziekan JM， Assisi C， et al. （2023） 亲环素 19B 启动子区域的短串联重复多态性驱动其转录上调并有助于疟疾寄生虫恶性疟原虫的耐药性。公共科学图书馆病理学19（1）： e1011118. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011118
编辑 器： 美国康奈尔大学威尔医学院柯克·戴奇
收到： 26月 2022， 11;接受： 2023月 25， 2023;发表： <>月 <>， <>
版权所有： ? 2023 库查尔斯基等人。这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。
数据可用性： 所有相关数据都在手稿和补充文件中。扩增子测序的原始数据（图4）可通过BioProject获得，标识符为PRJNA871873（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA871873）。
资金： 这项研究得到了新加坡教育部（拨款#MOE2019-T3-1-007）和新加坡国家医学研究理事会（资助#OFIRG21nov-0014）对ZB的支持。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。
竞争利益： 提交人声明不存在相互竞争的利益。
介绍
在过去十年中，大湄公河次区域（GMS）报道了以青蒿素为基础的联合疗法（ACT）治疗恶性疟原虫引起的疟疾感染的疗效逐渐下降[1-3]。鉴于青蒿素综合疗法是整个疟疾流行世界的一线疟疾治疗药物，仅在600年就报告了超过000万例死亡和200亿多例病例，因此这非常令人担忧[2020]。这些ACT失败可以追溯到4-2005年间柬埔寨东部青蒿素耐药性的上升，以及随后十年在整个GMS的逐渐蔓延[2009，1，2]。青蒿素抗性表型与 P 中的非同义单核苷酸多态性 （nsSNP） 密切相关。恶性疟原虫PFK5基因，临床表现为ACT给药后寄生虫清除半衰期延长（PC13/1），导致寄生虫血症持续长达2-6日（易感感染为7-2日）[3，6]。这导致整个治疗过程中寄生虫负荷显着增加，这不仅促进了推定青蒿素耐药机制本身的进一步完善，而且还促进了对ACT伙伴药物耐药性的（重新）选择。这包括对MFQ的耐药，MFQ是青蒿琥酯/MFQACT中的关键伴侣药物，与pfmdr7拷贝数增加有关[1，8]。同样，基于DHA/PPQ的ACT选择的哌喹（PPQ）耐药[9-10]与血浆肽13/2位点拷贝数增加[3，14]和pfcrt基因中的几个SNP增加有关[15-16]。综上所述，GMS中目前正在发生的青蒿素综合疗法有效性的下降可能反映了P的基因组成的变化。恶性疟原虫种群由恒定的药物选择压力驱动[19，16]。
这种选择过程反映在过去十年中每个已知抗性等位基因出现和传播的进化模式中。最初，在30世纪的前十年，在整个GMS中独立出现了超过13个pfk21的nsSNP[1，6，20，21]。然而，在2010-2017年间，两个主要等位基因（C580Y和F446I）分别在GMS东部和缅甸西北部经历了强烈的选择性扫描[16]。虽然这些SNP在体外没有赋予最强的青蒿素抗性表型，但它们的选择性扫描可能在东部和西部GMS（分别为eGMS和wGMS）寄生虫种群的遗传背景背景下平衡适应性缺陷。鉴于青蒿素是整个GMS中应用的ACT的不变成分，pfk13 SNP选择性扫描很可能是药物在两个区域的选择性压力的直接结果。另一方面，在1-2000年间，在泰国西部边境检测到的MFQ单药治疗的原始耐药标志物pfmdr2011的扩增是由于8-2年间持续大量给予青蒿琥酯/MFQ ACT所致[3]。同样，eGMS中血浆肽14/15扩增和pfcrt SNP的高频也是由于PPQ作为该地区使用的主要ACT伴侣药物的部署所致[<>，<>]。这表明GMS P的遗传通量。恶性疟原虫种群受到给药化疗药物选择的强烈影响，使多种耐药等位基因平行地对青蒿素综合疗法的各个组成部分产生耐药性。
图1. PfCYP19B上调在调节抗疟药物反应中发挥作用。
（A）Pfcyp19b RNA-Seq表达值来源于TRACII研究期间在患者入院治疗时收集的样本（2015-2018）（n=173）[31]。表达值（每百万转录本，TPM）根据寄生虫的年龄（HPI）进行预测。随着寄生虫年龄的增长，可以看到pfcyp19b表达的稳定增加。耐药（PC1/2 > 5）和敏感（PC1/2 < 5）寄生虫分别以红色和绿色显示。散点图中的形状表示每个样本中 pfk13 突变的类型（C580Y 突变体 - 全点、野生型 （WT） – 空圆圈、未知突变类型或混合 WT/C580Y 群体 – 空方块）。根据pfcyp19b表达水平，可以观察到两组明显不同的寄生虫;第一组（上部蓝色矩形）表达较高水平的PFCYP19b转录本，无论寄生虫的年龄如何，第二组（下部橙色矩形）表达较低水平的PFCYP19b（p = 2.8E-72，未配对的双尾T检验）。如图所示，这两组之间的PC1/2（p = 1.7E-13，未配对的双尾t检验）也存在显着差异。橙色矩形内的寄生虫表现出较低的PC1 / 2值，并且大多数是野生型pfk13背景（B）在TRACII研究中按国家划分的Pfcyp19b表达水平（BD-孟加拉国，MM-缅甸，TH-泰国，KH-柬埔寨，VN-越南）。平均PC1 / 2显示在图表上方，显示平均pfcyp19b表达值（每个位点）和平均PC1 / 2（PCC = 0.9）之间的紧密正线性相关性。基于布朗-连翘方差分析检验，紫苇表示 p的Pfcyp19b-OE分别用于PPQ和DHA，与使用不使用pfcyp19b的相同转染载体转染的对照细胞系（空载体对照—EV）进行比较（图1D）。同样，IC 增加 1.4 倍 （p = 0.026） 和 1.6 倍 （p = 0.024）50分别在环期用PPQ和DHA处理细胞时检测Pfcyp19b-OE（图1D）。PfCYP19B的过表达并未介导滋养体阶段对PPQ和DHA的抗性增加（图1D）。虽然高于IC50有趣的是，PfCYP19B过表达系的测定显示药物敏感性改变，Pfcyp19b-OE在0-3 HPI之间的环生存测定（RSA）中没有显示出对青蒿素的耐药性增加，这是测量药物敏感性的黄金标准（S4图）。的确，虽然IC的增加50Pfcyp19b-OE的值表明该蛋白具有对DHA和PPQ产生抗性的能力，其抗性表型与通过RSA和哌喹存活测定测定的培养适应性田间菌株的抗性表型不同[38，41，42]。这可能是由于间染色体表达的 PfCYP19B 过渡谱与内源性等位基因不同。然而，环和裂殖阶段的耐药性增加仍然与pfcyp19b的转录谱一致，其mRNA峰水平在裂殖后期，其蛋白质产物通过分裂发生和侵袭持续到早期环期[36，37，43]。最重要的是，这些结果表明，PfCYP19B可以以高度相似的方式介导对青蒿素和PPQ的耐药性，这表明这两种药物共享其MOA，因此可以选择相同的耐药介质（如PfCYP19B）。事实上，GMS寄生虫中PfCYP19B的上调与20世纪第二个十年DHA/PPQ作为主要联合疗法的广泛使用相吻合[35，44]。
与高等真核生物相似，P.恶性疟原虫利用eIF2α的磷酸化作为综合应激反应（ISR）的关键信号因子，通过ISR，细胞对一系列细胞应激作出反应，包括蛋白毒性、ER应激、错误折叠蛋白的积累、饥饿、热休克或血红素剥夺[47-49]。在这一过程中，eIF2α（eIF2α-P）的磷酸化被认为一方面介导了整体蛋白质合成的下调，另一方面介导了特定基因的上调，以抵消应激效应[50，51]。亲环蛋白通过协助蛋白质折叠、防止其在ER中的聚集来参与ISR，从而减轻蛋白水毒性[52，53]。事实上，已知ACT成分（包括青蒿素和PPQ）的作用方式会引发（某种形式的）蛋白水毒性和细胞应激，如氧化损伤[34，35，54]。本文希望研究PfCYP19B在诱导PfeIF2α-P作为恶性疟原虫ISR和ER胁迫的推定调节元件中的作用[33]。为此，我们首先使用蛋白质印迹分析和P研究了一系列抗疟化合物对eIF2α-P水平的影响。恶性疟原虫3D7体外培养（图2A）。具体而言，将环期寄生虫（10 HPI）暴露于4μM的CsA和500 nM DHA中90分钟导致eIF2α-P水平升高;后者如前所述[47]。这种效应似乎对青蒿素衍生物和环孢菌素具有高度特异性，因为其他测试的抗疟药物如CQ，AQ，PYR和ATQ均不影响eIF2α-P水平（图2A）。令人惊讶的是，用90 nM PPQ处理500分钟产生了相反的效果，甚至消除了eIF2α-P的基线水平。PPQ还能够抑制DHA和CsA诱导的eIF2α-P，使其水平甚至低于基线（图2B）。这种抑制是高度有效和动态的，即使是5 nM的PPQ（不到其估计IC的五分之一50）可以显着降低eIF2α-P的水平（S7图）。此外，同时治疗P。尽管单独使用DHA具有很强的诱导作用，但恶性疟原虫与DHA/PPQ仍可显着抑制eIF2α-P（图2B和2C）。奇怪的是，MFQ也可以抑制eIF2α-P，尽管在较小程度上，而ATQ对eIF2α-P没有影响，既不是单一药物，也不是与DHA组合（图2C）。这些结果表明，PPQ和DHA的细胞毒性作用都涉及影响ISR关键成分eIF2α-P的细胞应激;尽管以相反的方式。这进一步支持了我们的观察，即这两种抗疟药具有共同的MOA，因此其抗性机制的组成部分包括PfCYP19B。
仅在KH和TH位点零星发现，在TRACII中，该等位基因在一定程度上扩散到所有次区域，包括孟加拉国（BD）和缅甸（MM）的wGMS区域（图4B-4D，右条形图）。然而，耐药性发生率较低的地点，如2011-2013年的孟加拉国和越南（TRACI）和2016-2018年的孟加拉国（TRACII），主要特征是野生型等位基因和/或“中间”剩余等位基因的频率很高。戴尔（2x-6xAT）。
重要的是，存在很强的统计学显着关联戴尔（7xAT）和pfcyp19b上调（p = 3.51E-06）与携带野生型（裁判TRACI样本集中的3D7）等位基因（图4B，左散点图）。这种关联戴尔（7xAT）和pfcyp19b过表达在TRACII研究中重现（WGS的p = 7.13E-05，AmpliSeq 的p = 2.57E-03），并且在AmpliSeq数据集中STR缺失长度与平均pfcyp19b表达水平之间的线性相关性也得到了支持（PCC = 0.69，由于样本数量非常少，插入已被排除在分析之外）（图4C和4D， 左散点图）。在TRACI研究中，较高水平的pfcyp19b表达也与较高的寄生虫PC1/2呈线性相关（PCC = 0.64）。因此，戴尔（7xAT）缺失随着PC1/2的增加而分离，而野生型等位基因主要存在于TRACI研究中发现的快速清除寄生虫中（图4B），但不存在于TRACII（图4C和4D）中。我们尚未检测到戴尔（8xAT） 和戴尔（9xAT）等位基因在TRACII研究中。基于这些结果，我们推测剩余的较短等位基因代表了实现最佳缺失的中间步骤，例如戴尔（7xAT），最终推动转录上调，因此导致青蒿素耐药性。
为了研究检测到的STR多态性是否可以改变pfcyp19b启动子的转录活性，我们进行了如前所述荧光素酶报告基因的体外瞬时转染测定[67，68]。为此，pfcyp1b起始密码子上游的~5.19Kb区域包括具有专门设计的STR长度（裁判3D7，戴尔（10倍AT），戴尔（7倍AT），戴尔（6xAT））在瞬时转染载体中荧光素酶基因上游克隆（图4A，参见材料和方法）。确实，发起人与戴尔与野生型等位基因相比，（7xAT）缺失的表达水平高82%裁判3D7 （p = 5.11E-03） （图4E）.此外戴尔（10xAT）（一种人工创建的STR，在自然感染中未检测到）也表现出更高的表达水平裁判3D7 （p = 7.16E-03）。有趣的是，戴尔与6D3参考文献（体内观察证实）相比，（7xAT）未能产生更高的表达，这表明STR多态性的长度需要非常微妙和特异性才能发挥表型差异（图4E）。
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表 2. TRACI和TRACII研究中检查的pfcyp19b位点的覆盖范围。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011118.t002
讨论
ISR途径内的PfCYP19B功能有助于耐药性
在这里，我们表明PfCYP19B的过表达给出了P。恶性疟原虫对两种关键抗疟药物，即DHA（可能还有其他青蒿素衍生物）和PPQ（图1D）具有有限但显着的抗性/恢复力。这可能是由蛋白质折叠中的PfCYP19B肽基-脯氨酰异构酶活性介导的，参与ISR，同时对抗两种药物对蛋白质和其他细胞内结构的损害。这类似于其他真核系统，其中PfCYP19B直系同源物与蛋白水毒性和氧化损伤反应有关[53，62]。PfCYP19B在大鼠中的哺乳动物直系同源物的过表达既往已被证明可以抑制由ER应激引起的细胞凋亡，这是由于错误折叠蛋白的长期积累引起的，其抑制使细胞更容易受到ER应激的影响[62]。因此，亲环素B的耗竭导致内质网中氧化还原稳态失调[69]。事实上，已知青蒿素衍生物可引起错误折叠的蛋白质聚集、严重的ER应激和UPR诱导，所有这些都是对药物诱导的蛋白毒性休克的反应[35，47]。对于PPQ，最近的一项研究表明，敲除P中的G蛋白偶联受体（GPCR）样PfSR25。恶性疟原虫使寄生虫更容易受到氧化应激和PPQ的影响，支持PPQ MOA可能与氧化应激和/或蛋白水毒性有关的观点[70]。因此，P.恶性疟原虫具有减轻药物诱导的蛋白毒性损伤的直接潜力，至少在一定程度上使寄生虫具有生存优势。
事实上，P的暴露。DHA和PPQ的恶性疟原虫似乎都会影响eIF2α-P的水平，在大多数真核细胞中，eIF51α-P是ISR的中心信号蛋白[2]。eIF51α-P介导ISR诱导，使真核细胞在热休克、血红素剥夺、饥饿、过度氧化或错误折叠蛋白积累等应激因素后恢复稳态平衡[2]。eIF2α-P也被证明在P的应激反应中起作用。恶性疟原虫，其中PfeIF48α-P升高导致发育停滞和蛋白水合成抑制[71，2]。青蒿素对本研究所示PfeIF2α-P水平的影响（图48）已在先前得到证实[19]。至关重要的是，我们在这里表明，PfCYP2B的过表达可以将DHA诱导的eIF33α-P抑制到显着较低的水平。这种抑制可以减少寄生虫对药物刺激的蛋白毒性休克的感知，从而减轻假定的下游细胞凋亡样事件的影响。该模型与先前的一项研究一致，表明青蒿素耐药寄生虫可以降低细胞中青蒿素的活化水平，从而降低蛋白毒性并提高存活率[<>]。
有点令人惊讶的是，PPQ似乎也影响eIF2α-P，尽管方向相反。这是非常出乎意料的，因为PPQ MOA和耐药机制主要与DV中的血红蛋白降解有关，与其他喹啉相似[54，72]。然而，先前有证据表明，PPQ和DHA在几种恶性疟原虫细胞系中存在拮抗作用[30]。在这里，我们表明PPQ MOA以拮抗方式与CsA细胞毒性活性相关，可以通过PfCYP19B的水平进行调节（图1E）。因此，可以推测，与青蒿素类似，PPQ MOA也涉及某种形式的诱导ISR的蛋白毒性/氧化损伤，并且PfCYP19B的过表达有可能促进P。恶性疟原虫对两种药物的抗性/恢复机制（同时）。在这两种情况下，PfCYP19B都充当ISR传感的负调节因子（通过PfeIF2α-P），因此可能允许寄生虫通过IDC进展，避免由DHA和PPQ诱导的假定凋亡样事件。事实上，在Zhang等人的两项广泛研究中，作者发现，与野生型菌株相比，携带C2Y突变的Dd580寄生虫具有令人惊讶的更高的磷酸化PfeIF2α基础（无药物治疗）水平[47，48]。这表明突变寄生虫会减少整体蛋白质翻译，并且处于某种形式的持续ER应激下。有趣的是，在DHA处理（90分钟，500nM）后，pfk2突变体中的PfeIF13α-P水平几乎保持不变。相反，野生型寄生虫中PfeIF2α-P水平显著升高[47]。此外，抑制PK4激酶（PfeIF2α特异性激酶）可降低青蒿素耐药性并消除复发。综上所述，这些结果与PPQ处理在某种程度上“表观”pfk13 SNPs对PfeIF2α-P的影响的模型一致，并且在青蒿素治疗等细胞应激下与DHA相反。
青蒿素/疟疾寄生虫的多重耐药性是一种复杂的遗传性状
尽管PfK13 KELCH结构域中的非同义SNP是目前最可靠的标志物，但越来越清楚的是，青蒿素耐药性是一种复杂的遗传性状，由多种遗传改变组成[73]。这些改变可能为疟疾寄生虫创造了一种合适的生理状态，使其能够在PfK13依赖的生理相关药物暴露下存活，但也有可能以独立的方式存活[14]。目前对这种遗传背景的机制知之甚少，然而，一些群体转录组学分析表明，至少有一部分可以通过广泛但明确的基因集的表达水平改变来介导[5，31，35]。最近，我们确定了由156个基因组成的青蒿素耐药相关转录谱（ARTP），其中大多数与生物学功能有关，这些生物学功能具有很高的潜力，有助于青蒿素耐药性，如许多体外研究所示[32-34，74-76]。ARTP与最近使用PiggyBac转座子诱变[77]和pfk13 SNP转基因细胞系的组学研究[37]对青蒿素耐药性的两项系统生物学探索的结果特别相关。在这两项研究中， 青蒿素耐药性被证明主要是由途径的改变驱动的， 如蛋白质折叠， ER 应激， 和 ISR 途径的各种组成部分.至少有四项独立的体外研究报告PfCYP19B在转录本或蛋白质水平上调。在3个独立生成的pfk13突变体（R539T、N458Y和C580Y）中，作者发现pfcyp19b转录本显著增加[78，79]。最近，通过比较质谱分析显示，两种突变体（Cam3.II R539T和Cam3.II C580Y）的PfCYP19B肽水平升高（S2图）[37]。此外，长期青蒿素治疗产生的青蒿素耐药性3D7-11R系，且不携带任何pfk13非同义突变，也发现pfcyp19b的转录本水平升高[40]。这两项大规模的探索，以及上述几项体外研究，都支持PfCYP19B直接或间接在青蒿素耐药性中的作用。在该模型中，PfCYP19B的上调本身可以驱动有限但显着的耐药性水平（如图所示），但当与多方面青蒿素耐药机制的其他遗传变异相结合时，可能会导致更强的效果[73]。此外，与PfK13一样，PfCYP19B可以与GMS中与青蒿素耐药性相关的几种现有外显子突变以及非洲新出现的突变共同发挥作用。这些包括主要血红蛋白酶的突变，例如恶性蛋白酶2a / b和3，其基因是pfcyp19b最近的基因组邻居（S9图）。通过正向和反向遗传学研究显示，恶性蛋白酶基因（或其遗传改变）可驱动体外青蒿素耐药性[40，80]。此外，它们的外显子突变和表达改变也与阿尔乔姆有关。临床分离株中的伊西素耐药[31，81]。推测PfCYP19B上调可以与镰刀蛋白酶基因的遗传改变（SNP和/或转录本上调）以表达数量性状位点（eQTL）样方式共选，使其具有更强的选择优势。在未来的研究中，研究pfcyp19b eQTL与恶性蛋白酶以及其他基因（如冠冕素）的联系将是有趣的，这些基因目前正在成为青蒿素耐药性的新标志物[81]。
STR序列长度多态性调节转录调控
针对PfCYP19B上调的可能遗传碱基，我们在其启动子区域中鉴定了短串联重复（STR）序列元件的序列长度多态性。与戴尔（7xAT）缺失和pfcyp19b转录上调在体内（图4B-4D），以及通过双荧光素酶报告基因测定证明的体外（图4E）。事实上，众所周知，富含AT的可疑交易报告占整个P的10%以上。恶性疟原虫基因组在基因转录起始位点（TSS）侧翼区域具有特定的过度代表性[82]。此外，STR序列的插入/缺失多态性（Indel）被证明占P的相当一部分。体外培养寄生虫中的恶性疟原虫多态性，来源于遗传杂交[83]。探索参考疟疾基因全球P.恶性疟原虫数据集， Han et al.最近证明，STR多态性可以区分不同的全球寄生虫种群，类似于外显子SNPs，这表明它们的动态进化[84]。在这里，我们首次证明了STR序列多态性与转录调控之间的关联，可能对疟疾寄生虫的转录调控产生直接影响，并且由于pfcyp19b表达增加，对至关重要的耐药表型有直接影响。这与包括人类在内的高等真核生物的新证据一致，其中STR序列多态性逐渐与广泛的遗传性状有关，作为转录变异的效应因子[85，86]。
综上所述，我们的观察提供了一个合理的假设，即P的启动子区域中高度多态性的STR序列。恶性疟原虫基因可以调节它们的表达，使寄生虫有可能对单个基因的转录水平进行高度动态的微调。鉴于富含AT的恶性疟原虫基因组的高流动性，许多STR序列多态性在无性生长阶段的DNA复制过程中以微卫星样方式出现，可能是聚合酶滑移机制。这可以产生高度动态的转录变异性，为寄生虫提供有效的方法来应对选择压力。鉴于这些发现，未来的研究调查STR驱动的转录变异性的全部范围及其与寄生虫表型可塑性（包括耐药性）的外显子多态性的相互作用是必要的。
材料和方法
道德声明
用于本研究的所有样本均在患者或其法定监护人的书面知情同意下收集。所有协议均由牛津热带研究伦理委员会批准。
研究中使用的寄生虫
恶性疟原虫TRACI和TRACII临床分离株在患者入院时收集（第0小时）（RNA-Seq和WGS）：图1A，1B和4B-4D以及S1。
恶性疟原虫 3D7 实验室菌株：图 1C–1E、2A–2E、3A–3C 和 4E、S1 和 S4–S8 和表 1。
恶性疟原虫 Dd2 实验室菌株：S2 图
恶性疟原虫Cam3.II同基因柬埔寨菌株：S2 图。
体内样本采集
本研究中使用的所有样本均来自参与追踪青蒿素耐药性合作（TRAC）I和II的患者，这是一项在2011-2013年（TRACI）和2015-2018年（TRACII）之间进行的多点临床试验。有关样本采集、研究中心位置、纳入标准、寄生虫血症评估和治疗的所有细节均已发表于先前[1，3]。
体内转录组和基因组样本数据集
本研究中分析的所有转录组均来自GEO库（TRACI微阵列：GSE59099;特雷西微阵列芯片：GSE149735;TRACII RNASeq： GSE169520） [35，87]。所有RNA表达水平均代表入院治疗时采血时的寄生虫转录组状态 - “小时0”。
本研究中分析的所有基因组均来自先前发表的研究[88，89]。本出版物使用威康信托基金会桑格研究所生成的数据，作为疟疾GEN恶性疟原虫群落项目和Pf3k项目的一部分，如Miotto，Amato等人，Nature Genetics，2015（doi：10.1038 / ng.3189）[88]和Jacob CG，Thuy-Nhien N，Mayxay M等人，eLife，2021（doi：10.7554 / eLife.62997）中所述[89]。
gDNA提取
用于研究pfcyp19b启动子区体内STR多态性所需的基因组DNA提取的所有样品均来自患者入院时收集的TRACIII临床试验样本。用于TRAC2扩增子测序的gDNA是在去除总RNA后从TRIzol（Invitrogen）级分中提取的。简而言之，将含有4M硫氰酸胍（Sigma）、50mM柠檬酸钠（Sigma）和1M Tris（BioRad）的缓冲液与有机TRIzol级分（底部苯酚相）混合，并在室温下连续搅拌孵育10分钟，随后以10000×g离心。将含有溶解基因组DNA的水相从顶部部分等分，并用RNAse A（Qiagen）和蛋白酶K（Qiagen）处理。加入100%乙醇，随后将混合物转移到QIAamp DNA血柱（Qiagen）上，并按照制造商的方案提取gDNA。洗脱的基因组DNA在室温下真空干燥并重悬于无核酸酶水中。使用Qubit DNA高灵敏度试剂盒（Invitrogen）定量DNA样品，并储存在-20°C。
用于体外转染验证和qPCR分析的gDNA按照制造商的说明使用快速DNA试剂盒（ZYMO）提取。
体外培养
恶性疟原虫 3D7 MR4 菌株（野生型）在补充有蛋白 I （Gibco） （1640.0%）、次黄嘌呤 （Sigma） （25.0 mM）、碳酸氢钠 （Sigma） （1 g/L） 和庆大霉素 （Gibco） （2 μg/L） 的 RPMI 50 培养基 （Gibco） 中维持纯化的人 pRBC 中。培养物保持在37°C，CO 5%2， 3% O2和 92% N2.培养基每24小时补充一次。必要时将刚洗过的pRBC（州际血库）添加到培养物中。通过显微镜检查用吉姆萨（Sigma）染色的血涂片来评估寄生虫血症和寄生虫形态。
寄生虫同步
为了使寄生虫紧密同步，我们采用了Percoll和山梨糖醇同步方法的组合，如前所述[38]。简而言之，在测定之前，寄生虫培养物常规与5%（w / v）山梨糖醇同步几个周期，以保持紧凑的发育窗口以进行裂殖富集。在大约5-10%的寄生虫血症成熟分割裂殖物中，使用75%Percoll（Sigma）溶液富集，并在15g下离心1000分钟。收集分段裂殖质层并用培养基洗涤一次。将新洗的pRBC加入10%血细胞比容中，并在搅拌下将细胞孵育3小时，以实现红细胞中的单次侵袭。3小时后，寄生虫培养与5%（w / v）山梨糖醇同步，并调整至所需的寄生虫血症和血细胞比容以进行进一步测定。
质粒构建生成和游离体过表达系统
肽基-脯氨酰顺反异构酶过表达系统（Pfcyp19b-OE）的设计如前所述[40]。简而言之，全长pfcyp19b（PF3D7_1156000）cDNA来源于P。恶性疟原虫3D7菌株与引物5'-ATCGGGATCCATGAATAAATTAGTGTCAATCATT-3'和5'-ATCGGCTAGCCAATGGCAATTCTCCTGATTC-3'。在正向引物的5'端添加NheI限制性位点和反向引物5'端的BamHI限制性位点，以允许单向克隆到多克隆位点（MCS）。随后将片段插入pBcamR_3xHA三重血凝素（HA）序列上游MCS上的BamHI / NheI位点的载体中，以获得HA标记的蛋白质产物。然后将质粒转染到3D7寄生虫菌株中，并通过杀稻瘟菌素（BSD，Sigma）（初始10μg/mL，然后5μg/ mL，在药物治疗测定期间无BSD）进行阳性选择来维持。通过用空pBcamR_3xHA质粒转染7D3寄生虫，另外产生对照寄生虫系（空载体对照），并与过表达寄生虫系一起在等浓度的BSD中生长。为了生成GFP/FKBP标记的PfCYP19B质粒，从P中PCR扩增PfCYP19B开放阅读框。恶性疟原虫 3D7 基因组 DNA，引物 5'- TAAGCAGCGGCCGCTAATGTGTTTATATATATA-3' 和 5'- TGCTTACCTAGGCAATGGCAATTCTCCTGA-3'，并使用 2xFKBP-GFP-2xFKBP-NeoR 的编码序列克隆到 pSLI-Sandwich 的 NotI/AvrII 位点。如前所述，首次尝试使用靶向基因破坏和选择相关整合来完成敲除[90]。截短的基因将包含前129个氨基酸，然后是带有GFP，跳跃肽和药物选择标记的C末端标记。同源区对应于使用引物5'-TGCTTAACGGTCATTGATAATAATCCTCTTTTAC-3'和5'-TAAGCAGCGGCCGCTAACTATCGATGACAAGCCACAC-3'克隆到质粒中的区域。这些被克隆到 NotI/MluI 站点中。转染该质粒的寄生虫的游离体选择失败，表明质粒的寄生虫摄取不成功。对于转染，如前所述，使用GenePulser（Bio-Rad）用50μg纯化的质粒DNA（Qiagen）转染环期寄生虫[90]。用 4 nM WR99210 和 0.4 mg/mL G418 选择转染品系（对于 GFP/FKBP 标记的菌株;西格玛）。代表上述每个质粒的质粒图在S10图中描述。
体外药物敏感性测定
如上所述，偶发性过表达PfCYP19Bx3HA（Pfcyp19b-OE）和空载体对照的寄生虫系同步。然后将4 HPI，20 HPI和35 HPI的高度同步寄生虫分配到含有96种连续稀释浓度的DHA或PPQ（Sigma-Aldrich）的12孔板中，以产生最终的1%血细胞比容和1%寄生虫血症。PPQ中使用的化合物的最高浓度为1，000 nM，DHA为200 nM，然后是2倍连续稀释和无药物对照。将4 hpi，20 hpi和35 hpi寄生虫分别与药物一起孵育72，56和41小时，以使所有寄生虫入侵并进入下一个周期。对于补充或不补充80 nM CsA的体外药物敏感性测定（图1D），使用Pfcyp12b-OE和载体对照菌株的中环阶段（约19 HPI）。PPQ、MFQ、AQ、CQ 和 PYR 的最高化合物浓度为 1，000 nM，DHA 为 100 nM，ATQ 为 20 nM。通过流式细胞术定量随后复制周期中每个孔中新的活寄生虫的数量。在 50°C 下使用 8 μL 33342 μM Hoechst 7 在 PBS （pH 2.15） 中染色细胞 37 分钟，然后加入冰冷的 200 μL PBS。使用LSR Fortessa X-20流式细胞仪（BD Biosciences）使用紫外激光（355nm）对细胞进行定量，并使用FACS Diva软件（BD Biosciences）分析结果。剂量-反应曲线和 IC50使用GraphPad Prism 8四参数剂量反应曲线方程（GraphPad Software Inc.）获得估计值。所有测定均以生物一式三份进行，另外每剂技术重复进行。在同一生成周期中具有空载体的相应菌株并联用作对照。采用双尾异方差t检验（按指示配对/未配对）计算显著性。
环状生存测定
环存活测定（RSA）基于先前发表的方案进行[38]。简而言之，将具有0%寄生虫血症和3%血细胞比容培养物的双同步早期环期（1-2 hpi）寄生虫（见上文）在含有24nM双氢青蒿素（DHA）的700孔板中孵育。二甲基亚砜（DMSO）（西格玛）用作对照。在治疗6小时后，用完整的RPMI培养基洗涤DMSO和DHA处理的寄生虫三次，再培养72小时。处理结束时的寄生虫用Hoechst 33342（赛默飞世尔）和MitoTracker深红色FM（赛默飞世尔）双重染色，并使用流式细胞术和显微镜定量活寄生虫。当对照寄生虫生长速率（实验后DMSO处理的寄生虫血症/实验前DMSO处理的寄生虫血症）高于1.5时，RSA结果有效。存活百分比（%）=DHA治疗的寄生虫血症/对照寄生虫血症x 100%。
等值图测定
如前所述进行细胞毒性药物互补性评估[91]。简而言之，使用200μLPfcyp12b-OE和载体对照寄生虫菌株的寄生虫培养物（环约1HPI，1%血细胞比容和19%寄生虫血症）。转染剂在5μM BSD压力下生长，在进行等排线图的循环中除去该压力。在测定开始之前，如上所述同步寄生虫。所用化合物的最高浓度为PPQ为500 nM，CsA为4 μM，DHA为500 nM，然后是2次<>倍系列稀释和无药对照（DMSO）。集成电路50单独对每种药物和以固定体积比对药物组合进行测量（药物A：药物B = 5：0，4：1，3：2，2：3，1：4，0：5）。所有测定总共进行了72小时的孵育时间。孵育后，除去上清液，并在 50°C 下用 8 μL 33342 μM Hoechst 7 在 PBS （pH 2.15） 中染色 iRBC 37 分钟，然后加入冰冷的 200 μL PBS。使用LSR Fortessa X-20流式细胞仪（BD Biosciences）使用紫外激光（355nm）对细胞进行定量，并使用FACS Diva软件（BD Biosciences）分析结果。原始FACS数据使用FACS DIVA软件进行门控和分析。剂量-反应曲线和 IC 的线性回归分析50随后使用GraphPad Prism进行测定。根据Loewe添加剂模型进行等代谢图分析[92]，其中两种抑制剂组合的分数抑制浓度（ΣFIC50）之和表示相加性、协同作用或拮抗作用。与ΣFIC50>1的组合被认为是拮抗性的，<1协同的，如果等于1添加剂。ΣFIC50使用以下公式计算：总和FIC （ΣFIC） = 混合物中的 A 的 IC 50 / 单独 A 的 IC 50 + 混合物中 B 的 IC 50 / 单独 B 的 IC50。
eIF2α磷酸化测定
用不同的抗疟药物——DHA（3 nM）（西格玛）、PPQ（7 nM）（西格玛）、CSA（4μM）（西格玛）、AQ（19 nM）（西格玛）、AQ（10 nM）（BEI 资源）、PYR（10 nM）（BEI 资源）、CQ （90 μM）（BEI 资源）、ATQ （500 μM）（BEI 资源）治疗约 500HPI（4D500 MR800、Pfcyp1b-OE 和媒介对照）2 分钟， MFQ （2 mM） （BEI Resources）。已选择浓度以适应生理浓度范围。DMSO已被用作溶剂对照。在额外存在500 nM PPQ的情况下进行联合处理。治疗后，寄生虫立即从红细胞中释放出来，提取0.1%皂苷和总蛋白（见下文）。使用Pierce BCA蛋白质检测试剂盒（赛默飞世尔科技）对蛋白质进行定量。对样品进行归一化，将相同体积的相同蛋白质量上样到凝胶上并如下所述进行处理。封闭膜与一抗（兔）（4：1，在500%（w/v）BSA（西格玛）中溶解在5%TBS-T（西格玛）中）孵育1小时（室温）后，识别先前发表的Ser2（细胞信号传导）处的疟原虫eIF51α磷酸化[34]。PfBiP兔抗体（1：10000）（和1：2000（Sigma）的β-肌动蛋白小鼠抗体）用作上样对照。使用大鼠抗HA抗体（19：1）（罗氏）检测HA标记的PfCYP1000B蛋白。用二级高度交叉吸收的抗兔Alexa Fluor 488（1：2000）（杰克逊抗体）和高交叉吸收的抗大鼠Alexa Fluor 594（1：4000）（赛默飞世尔）探测一抗。用1%TBS-T和1xPBS彻底洗涤膜，并在ChemiDoc MP（BioRad）上可视化。使用ImageJ（NIH）分析荧光信号。定量反映了归一化为泳道负载对照（PfBiP）的每个蛋白质条带的相对量，其中已提取所有条带的倒置像素密度（256灰度）并减去背景。蛋白质印迹膜的完整未裁剪图像可在S1图像中找到。
蛋白质提取
对于特定阶段的下拉分析，在环期（约12HPI），滋养体（约24HPI）和裂殖体（约36HPI）收获寄生虫，并使用10体积的0.1%（w / v）皂苷（Sigma）在冰冷的1 x PBS（1圣基数）5分钟。用1 x PBS洗涤寄生虫沉淀三次，并用RIPA缓冲液（150mM氯化钠（默克）;1%Triton X-100（BioRad）;0.5%脱氧胆酸钠（Sigma）;0.1%十二烷基硫酸钠（BioRad）;和50mM Tris（BioRad）pH8.0）裂解沉淀（大多数测定，包括1%（v / v）蛋白酶抑制剂混合物（Nacalai Tesque）和1%（v / v）磷酸酶抑制剂混合物（Thermo Fisher）。将样品在30°C下温育4分钟，轻轻搅拌。对于非变性下拉测定，用Pierce IP裂解缓冲液（赛默飞世尔）和1%（v/v）蛋白酶抑制剂混合物（Nacalai Tesque）和1%（v/v）磷酸酶抑制剂混合物（赛默飞世尔）代替RIPA缓冲液。通过离心（在15°C下4分钟）除去蛋白质裂解物碎片，并使用Pierce BCA蛋白质测定试剂盒（赛默飞世尔科技）定量上清液中的蛋白质浓度。样品用液氮冷冻并储存在-80°C。
蛋白质印迹分析
蛋白质印迹按照 Abcam 方案（可在制造商网站上找到）进行，并进行了一些修改。寄生的红细胞级分最初在PBS（第一碱基）（0x）中用冰冷皂苷（西格玛）（1.1%）裂解，并用冰冷的1 x PBS洗涤三次。游离寄生虫沉淀在补充有1：1（v / v）的RIPA缓冲液中裂解，补充有不含EDTA的蛋白酶抑制剂（Nacalai Tesque）和100%（v / v）磷酸酶抑制剂混合物（赛默飞世尔）。旋转裂解物，并使用Pierce BCA蛋白质测定试剂盒（赛默飞世尔科技）测量蛋白质协调。将相同量的总蛋白（1–10 μg，取决于测定）在 RIPA 或 Pierce IP 缓冲液中与补充有 20-巯基乙醇 （4%） （Sigma） 的荧光兼容样品缓冲液 （2X）（赛默飞世尔科技）混合，并在 10°C 下煮沸 100 分钟。使用预制的Mini-Protean TGX预制5%天然SDS-PAGE凝胶（Bio-Rad）分离相同体积的蛋白质裂解物中的相同量。使用使用制造商原装试剂（BioRad）的Trans-blot涡轮转印系统在硝酸纤维素膜（BioRad）上转印蛋白质，每块凝胶在12.3A恒流下转印2分钟。用5%（w / v）牛血清白蛋白（BSA）（西格玛）溶液封闭膜。对于 CYP5Bx19HA 游离体表达验证，使用 3：1 大鼠抗 HA 抗体 （Roche） 和 1000：1 山羊抗大鼠 （HRP） 偶联抗体 （Abcam） 检测 HA 标记蛋白。肌动蛋白用作上样对照，并用5000：1抗β肌动蛋白小鼠单克隆抗体（Sigma）探测，然后用2000：1山羊抗小鼠（HRP）偶联抗体（Abcam）探测。对于总PfCYP5000B检测，使用19：1兔多克隆抗PfCYP2000B（Genscript）抗体和19：1兔抗PfBiP（BEI资源）作为上样对照。使用Immunocruz蛋白质印迹鲁米诺试剂（圣克鲁斯生物技术）作为HRP的底物，并使用发光图像分析仪LAS5000系统（富士胶片）或ChemiDoc MP（用于荧光抗体）（BioRad）获取所得化学发光信号，并使用ImageJ（NIH）进行分析。蛋白质印迹膜的完整未裁剪图像可在S4000图像中找到。
活细胞免疫荧光成像
对于活细胞成像，用1 x PBS洗涤感染的红细胞（1圣碱），并在室温下用10nM Hoechst4（西格玛奥德里奇）染色33342分钟。然后将染色的细胞与载玻片上的1 x PBS液滴混合。图像是用配备Axiocam 1的蔡司Axio Observer Z503拍摄的，使用100x/1.40平原复消色差油DIC M27物镜观看。图像以禅蓝（蔡司）叠加和处理。
固定组织间接免疫荧光测定 （IFA）
使用多聚甲醛（Sigma）（19%）和戊二醛（Sigma）（4.0%）在0075xPBS（1圣碱）15分钟，在Triton X-100（西格玛）（0.1%）中透化10分钟，然后用牛血清白蛋白（BSA，西格玛）（3%）与甘氨酸补充剂（第一碱）（1.22mg / ml）在PBS-T中封闭52小时。随后，将它们与1：1大鼠单克隆抗HA抗体（罗氏）和200：1兔多克隆抗PfBiP（BEI资源）一起孵育，然后与200：30 Alexa Fluor 1山羊高度交叉吸收的抗大鼠（杰克逊免疫研究）和2000：594 Alexa Fluor 1山羊高度交叉吸收的抗兔二抗（杰克逊免疫研究）。用DAPI（赛默飞世尔科技）（2000ng / μl）进行核复染488分钟。所有步骤均在室温下进行。载玻片安装有ProLong黄金防淬灭（赛默飞世尔科技）。使用配备Airyscan探测器的蔡司LSM1共聚焦显微镜使用Plan-Afuchromat 10x/710.100油状物镜捕获图像，并使用Zen（蓝色版）成像软件（蔡司）进行处理。使用ImageJ分析图像。所有抗体均经过交叉反应性测试，并在同一代和发育阶段并联使用相应的空载体对照菌株作为阴性对照。
下拉检测
将 100 μl Pierce IP 裂解缓冲液（见上文）中的 400 μg 总蛋白裂解物与 0.1 mg Pierce 抗 HA 磁珠（赛默飞世尔科技）混合，并在 2°C 下轻轻搅拌孵育 4 小时。根据制造商的方案处理样品，只需进行少量修改，即可去除残留的洗涤剂以进行质谱分析。简而言之，使用 3 x TBS （1圣基）在推荐的用TBS-T（1x TBS，0.1%吐温20）洗涤后加入。对于蛋白质印迹分析，使用酸性条件（0.1M甘氨酸（BioRad），pH 2.0）从磁珠中释放蛋白质，并用1M Tris（pH 8.5）（1圣基）。
质谱样品制备和分析
将来自下拉测定法（见上文）的HA标记磁珠用3 mL TBS洗涤1次（1圣碱），在 100mM Tris pH 8.50 中重悬于 8 μL 0M 尿素 （BioRad） 中，然后用 20mM 三（2-羧乙基）盐酸膦（赛默飞世尔科技）在 25°C 下还原 20 分钟，在室温下用 55mM 氯乙酰胺 （Sigma） 在黑暗中烷基化 30 分钟。然后用100mM TEAB稀释样品至<2M尿素，并用4AU赖氨酰内肽酶（Lys-C）（富士胶片和光纯化学株式会社）和25.1μg胰蛋白酶（Promega）（摇匀，18°C）消化（0小时，25°C，振荡）25小时。淬灭反应样品用三氟乙酸酸化至终浓度为1%，并进一步用2倍体积的0.5%乙酸稀释。将肽上样到活化的Oasis HLB柱（Waters）上，用2mL的0.5%乙酸洗涤两次，并用1 mL的50%乙腈在0.5%乙酸中洗脱。使用Pierce定量荧光肽测定法（赛默飞世尔科技）定量肽浓度，并在Speedvac（Eppendorf）中干燥样品，重新溶解至1μg/μl，并通过纳米LC-MS/MS（Q-EXACTIVE HF，赛默飞世尔科技）在流动相A（1.60%甲酸）和流动相B（乙腈， 0.1%甲酸）。在蛋白质组发现者0.1（赛默飞世尔科技）中使用无标记定量算法对原始数据进行分析，以定量母离子。SEQUEST数据库用于针对人（Uniprot）和恶性疟原虫（PlasmoDB）组合蛋白数据库搜索MS/MS谱图。数据分析设置包括多达 2 个遗漏的胰蛋白酶裂解、作为静态修饰的氨基甲甲基化 （C） 和作为动态修饰的氧化 （M）、脱氨 （N，Q）、乙酰化（N 末端）。母离子和碎片质量数公差分别为5ppm和3.20Da。使用总肽量在样品中进一步归一化定量数据。对每种蛋白质的丰度进行缩放，其中每个发育阶段（环、滋养体和裂殖体）的所有样品的总任意值为 0，并根据每个重复中蛋白质的信号在所有样品（05x PfCYP600B-OE 和 3x 空载体对照）之间相应地划分。不存在蛋白质的样品被分配值19以避免除以3。计算空矢量控制信号（背景）与Pfcyp1b-OE信号的比值。因此，比率为0意味着在背景对照重复中未检测到蛋白质的痕量。根据比例>19和肽谱匹配数（PSM）>200选择表1中的结合候选物。
荧光素酶构建体的生成
使用先前发表的方法进行双荧光素酶测定，对方案略有修改[67，68]。简而言之，由四个构建体组成的面板涵盖了PfCYP19B和PfFP2A之间的整个基因间区域，由Bio-basic Asia（新加坡）重新合成。每个构建体都包含本研究中分析的缺失之一，位于起始密码子上游426bp。删除被标记为戴尔（10倍AT），戴尔（7倍AT），戴尔（6xAT），野生型 3D7 参考 （裁判3D7）序列（无删除）并在图4A中可视化。构建体两侧是Ncol Xhol限制性位点，克隆到E中。大肠杆菌，扩增，并通过毛细管测序验证 Bio-Basic Asia（新加坡）。随后将正确的构建体连接到先前设计的pPf86质粒骨架中[68]。最初位于荧光素酶基因（FL）上游的Pfhps86启动子被NcoI和XhoI限制性内切酶（新英格兰生物实验室）去除，并替换为合成的构建体（Bio-basic Asia，新加坡）。将具有正确序列的质粒转化为DH5α E。将大肠杆菌感受态细胞和菌落在LB琼脂（+氨苄西林）上生长24小时。从每个构建体中选择一个菌落，并在Terrific Soupth（BD）中进一步生长24小时。使用Giga Prep质粒试剂盒（QIAGEN）提取质粒，以产生足够的质粒材料用于所有后续测定。在此步骤中，使用Sanger测序对所有构建体进行了额外验证，以控制细菌中可能发生的任何DNA复制错误。在Qubit dsDNA BR测定法上测量质粒浓度，并在样品之间标准化其浓度。最终浓度已通过额外的Qubit dsDNA BR测定和qPCR进行了验证。
P. 恶性疟原虫和双荧光素酶报告基因测定
如前所述，将5 0μg先前设计的荧光素酶构建体（上图）在Pfcyp19b上游基因间区（图4）中含有各种AT缺失，转染到6个独立生长的不同步3D7 MR4寄生虫群中，寄生虫血症率为15%[67，68]。所有寄生虫样品也同时转染50 μg表达肾素荧光素酶（RL）的质粒，该质粒用作标准化萤火虫荧光素酶（FL）活性的参考（每次转染总共100μg质粒）。使用含有Pfhps86启动子的原始pPf86质粒作为阳性对照。使用无质粒的转染作为背景发光的阴性对照。电穿孔寄生后，我们放入预热的RPMI培养基中。将烧瓶放气并在培养物中保持4小时，之后更换RPMI培养基，寄生虫再生长24小时，直到收获。如上所述，寄生虫用0.1%皂苷从红细胞中解放出来。如制造商所述，使用双荧光素酶报告检测系统（Promega）来确定萤火虫（靶标表达）和肾（参考表达）荧光素酶活性。阴性对照（无质粒）的荧光素酶读数用于确定背景自发光水平。在Infinite 10 Pro多模读板仪（TECAN）上以相对光单位（RLU）测量萤火虫荧光素酶和肾萤光素酶活性（发光）200秒。标准化荧光素酶活性通过以下公式计算：“FLuc规范化= （FLuc–FlucBG）/（RLuc–RlucBG）“其中FLuc是萤火虫荧光素酶，RLuc是肾素荧光素酶，bg代表背景。所有转染实验均在6个独立生长的生物学重复中进行。
实时荧光定量聚合酶链反应
通过qPCR估计每个样品中质粒DNA物质的水平。如前所述，使用比较CT方法计算-ΔΔCt值，并将精氨酸酶tRNA作为内参对照基因，一式三份进行实时PCR和基因表达的相对定量[93]。
亲环蛋白位点扩增和扩增子测序
为了研究Pfcyp19b基因位点邻近性的遗传变异，我们设计了一对引物（F/GGTTCCAGAACCTGATAAAGAACCTGAATG，R/GCAACCAACCTAGTAATAATGGTCCAGTAAG）来捕获和扩增Pfcyp18b区域两侧的7.19Kb基因组区域与相邻基因（FP2B，FP3，Api-AP2，FP2A，PF3D7_1115800位置：PF3D7_11。578，385..597，119）（S9图）。引物在计算机和体外测试对人和P的特异性。恶性疟原虫gDNA材料。片段使用0.63U（0.5ul）非常高保真超远程DNA聚合酶PrimeSTAR GLX（Takara）扩增。从 2 个 TRAC144 临床样品（见上文）中提取的 2 ng 纯化的 gDNA 在以下条件下进行 30 个循环的 PCR：98°C/10 秒;66°C/20分钟（1分钟/kb）;4°C/保持，每个引物在0μl总反应体积中2.25μM。为了防止由于退火时间过长而导致蒸发，板用高粘性透明密封件（赛默飞世尔）牢固密封，并在带有柔性硅加热盖（Eppendorf）的热循环仪中放大。PCR产物使用0.6体积（v / v）的AMPure XP磁珠（贝克曼库尔特）纯化。使用Nextera XT文库制备试剂盒（Illumina）处理所得扩增子，以根据制造商说明进行微小修改即可获得短序列读数。简而言之。使用缩小规模的文库制备方案标记和扩增0.25 ng扩增子DNA，并使用1/4体积的推荐试剂。PCR扩增周期从12个增加到15个循环。按照制造商的说明，使用0.6体积（v / v）的AMPure XP磁珠纯化PCR反应。将样品在17μl10 mM Tris-Cl，pH 8.5（Qiagen）中洗脱，并在生物分析仪高灵敏度芯片（安捷伦）上估计平均文库大小。使用qPCR评估文库摩尔浓度，并在Novaseq HiSeq平台（Illumina）的一个泳道上汇集和测序文库，具有配对端150bp长读长协议，生成约20 GB的数据（Novogene Co.，新加坡）。
扩增子测序分析
读取是使用修剪丰富的修剪修剪的！包装 [94] 在由 BWA [95] 对齐之前。此外，使用Picard工具[96]去除PCR重复项，并通过GATK BQSR重新校准碱基[97]。目标区域的短变体用GATK单倍型调用器[97]。变体由指定参数的 GATK 硬过滤器过滤：“MQ <60 或 FS >60 或 QD <2.0”。双等位基因SNP和插入缺失以二进制（存在/不存在）重新编码，而多等位基因插入/缺失变异被重新编码为碱基的丢失或获得，并通过线性回归与Pfcyp19b基因表达相关。接下来，从TRACI和TRACII研究数据库中以BAM格式下载基因组序列，其中转录组数据重叠[5，87]。使用上述方法鉴定和过滤短变异。扩增子测序原始数据以fastq格式提供，提交给BioProject PRJNA871873下的NCBI序列读取档案（可从以下网址获得：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA871873)
统计分析
使用GraphPad Prism v8.4.2（GraphPad Software Inc.，美国）和/或Microsoft Excel 365（Microsoft Co.，USA）或按照Amplicon测序分析部分所述进行统计分析。
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基于微阵列的pfcyp19b表达水平为来自TRACI和TRACII的PC1 / 2。
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S1 图 基于微阵列的pfcyp19b表达水平为来自TRACI和TRACII的PC1 / 2。
A）散点图显示TRACI研究期间（19-2）收集的寄生虫样本中基于微阵列的pfcyp1b表达水平（与参考菌株的比率，log2）与PC2011 / 2013的关系[35] B）散点图显示TRACII研究期间（19-2）收集的寄生虫样品中基于微阵列的pfcyp1b表达水平（与参考菌株的比率，log2）与PC2015 / 2018的关系[31].两个散点图都显示pfcyp19b的转录本水平与寄生虫清除半衰期之间存在正线性相关性（TRACI：PCC = 0.21，TRACII：PCC = 0.11）。Pfcyp19b在P中出现转录上调。从缓慢清除感染中收集的恶性疟原虫（PC1/2 > 5 小时，TRACI p = 6.36E-08 和 TRACII p = 0.004，未配对的双尾 t 检验）。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011118.s001
（提夫）
S2 图 寄生虫IDC中pfk19突变体的体外pfcyp13b表达值。
为了研究pfk13突变与pfcyp19b表达之间的潜在联系，我们从先前发表的体外研究中提取了数据，这些研究显示了几种pfk19突变株中整个IDC中的pfcyp13b表达水平 - 在常用的Dd2系和现场来源的柬埔寨同基因Cam3.II系的背景下[37 ].值得注意的是，Dd2菌株在1980年代已经适应实验室培养，早在ACT作为抗疟疾疗法引入东南亚之前，而Cam3.II系在ACT引入近十年后进行了培养适应。（A-C）在Cam19.II系（A）和Dd13（B-C）的不同遗传背景下产生的pfk580突变体（C539Y，R3T）中的平均pfcyp2b表达值。Pfcyp19b峰表达值在裂殖阶段下降。Pfk13 表达值以灰色显示，其表达在裂殖/环转变时间 （48/0 HPI） 达到峰值。我们的分析显示，与Cam2.II野生型相比，同基因Cam19.II R48T柬埔寨菌株在晚期裂殖到早期环过渡阶段（0 HPI / 3 HPI）的pfcyp539b上调近3倍（2HPI = 0.0，85HPI = 48.0时平均log98表达增加）。这种特定的早期上调与我们之前对体内野外寄生虫的观察一致（见图1A）。有趣的是，DD2突变体（C580Y和R539T）没有显示出任何显着的pfcyp19b上调，这表明这可能是背景特异性的。奇怪的是，当针对pfk13的表达（灰线）进行预测时，pfcyp19b似乎是相互排斥的，并且Cam19.II R3T中pfcyp539b的上调仅限于pfk13峰值表达的阶段。所有值均来自微阵列检测，并以与微阵列参考池表达 （log2） 的比率显示。误差线显示标准偏差。X 轴显示估计的寄生虫年龄。（D）与环期两个独立实验的野生型对照相比，pfk19 Cam13.II突变体的PfCYP3B蛋白倍数变化中位数增加。PfCYP19B蛋白水平存在显着差异，Cam3.II C580Y和R539T系均明显较高。当将 pfk2 突变体与其同基因野生型对应物进行比较时，基于对 log13 归一化肽谱强度的双尾异方差 t 检验，Asterix 表示统计学显著性;* p < 0.05， ** p < 0.01， *** p < 0.001， **** p < 0，0001。 误差线表示标准偏差。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011118.s002
（提夫）
S3 图 连续PfCYP19B过表达的蛋白质印迹验证。
上图：蛋白质印迹图像显示PfCYP19B-3xHA蛋白在寄生虫的整个IDC中连续游离过表达。下图：蛋白质印迹图像显示，在所有三个不同的寄生虫IDC阶段，总PfCYP19B蛋白的表达增加。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011118.s003
（提夫）
S4 图 在Pfcyp19b-OE上进行环生存测定。
对Pfcyp19b-OE和阴性空载体对照进行的环存活测定。显著性基于从五个独立的生物学重复和具有Holm-Sidak校正的未配对双尾异方差t检验中获得的结果。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011118.s004
（提夫）
S5 图 在存在CsA的情况下进行药物敏感性测定。
在没有（黑色）或存在（灰色）19 nM环孢菌素A（CsA）的情况下，Pfcyp80b-OE（左）和空载体对照（右）菌株对各种抗疟化合物的药敏测定。误差线表示IC的标准偏差50在每次处理中进行3个独立的生物学重复。紫翼表示基于配对双尾异方差 t 检验的统计学显著性，其中：* p < 0.05，** p < 0.01。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011118.s005
（提夫）
S6 图 pfcyp19b过表达对CsA敏感性的影响。
Pfcyp19b-OE 和空载体对照菌株的环孢素 A （CsA） 药物敏感性测定。误差线表示IC的标准偏差50在每次处理中进行3个独立的生物学重复。以上数字显示平均IC50值。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011118.s006
（提夫）
S7 图 渐进式PPQ处理后的PfeIF2α-P水平。
在环形寄生虫中2 nM DHA胁迫下PfeIF500α-P水平的蛋白质印迹分析与逐渐降低的PPQ浓度（n = 1）同时处理。寄生虫仅用500nM DHA或DHA和PPQ的组合以10倍稀释梯度处理。图（左）显示了DHA/PPQ处理的寄生虫和单独DHA处理之间的PfeIF2α-P水平倍数变化。所有值均已标准化为 PfBiP 内部负载控制。凝胶图像显示在右侧。DMSO已被用作阴性对照，以指示PfeIF2α-P基线水平。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011118.s007
（提夫）
S8 图 CsA处理对PfCYP2B过表达寄生虫PfeIF19-α磷酸化水平的影响。
蛋白质印迹分析显示，在19分钟19μM CsA处理诱导的ER胁迫后，PfCYP2B过表达（Pfcyp90b-OE）对PfeIF4α-P水平的缓解作用。该实验是在环期寄生虫中游离过表达PfCYP19B（Pfcyp19b-OE）和空载体对照线（n = 1）上进行的。所有值均归一化为PfBiP内部负载控制。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011118.s008
（提夫）
S9 图 用于扩增子测序的pfcyp19b位点区域的图示。
图11所示的用于TRACII样品扩增子测序的4号染色体基因组DNA片段的图形表示。两条蓝色垂直虚线之间的整个区域已在Illumina NovaSeq平台上放大和排序。426 eSTR 在位置 591054 的位置已用黑色箭头表示。距离的近似比例仅用于说明目的。PF3D7_1115300—半胱氨酸蛋白酶恶性蛋白酶 2b、PF3D7_1115400—半胱氨酸蛋白酶恶性蛋白酶 3、PF3D7_1115500—AP2 结构域转录因子、PF3D7_1115600—肽基-脯氨酰顺反异构酶、PF3D7_1115700—半胱氨酸蛋白酶恶性蛋白酶 2a
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011118.s009
（提夫）
S10 图 本研究中使用的质粒。
用于生成 Pfcyp19b-OE（顶部）、空载体对照（中）和 GFP/FKBP 标记的 PfCYP19B 菌株（底部）的质粒示意图。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011118.s010
（提夫）
S1 数据。 PfCyp19b-OE 下拉结果。
未处理的结果显示来自HA标记的PfCYP19B下拉测定的质谱命中。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011118.s011
（三十）
S2 数据。 短串联重复基因分型结果。
所有短串联重复多态性变体，这些变体来自TRACI WGS，TRACII WGS和TRACII AmpliSeq数据集的亲环蛋白位点。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011118.s012
（三十）
S3 数据。 源数据。
用于生成本研究中所有数字的源数据
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011118.s013
（三十）
S1 映像。 蛋白质印迹图像。
研究中使用的完整未处理的蛋白质印迹图像。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011118.s014
（英文）
确认
我们要感谢青蒿素追踪耐药性合作组织的所有成员提供本研究中使用的临床样本，以及所有同意参加TRACI和TRACII临床试验的患者。我们还要感谢Frances Rocamora提供寄生虫转染系，Lai Soak Kuan协助高分辨率荧光成像，Elyza Zulkifli协助实验室培养和药物测定。
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