通过表达RNA沉默的弱抑制因子和诱导宿主RNASE THREE LIKE1来感染拟南芥

哈亚特·塞基，余婷婷，塔琳·埃尔马扬，埃尔韦·沃切雷特

发布时间：25 年 2023 月 <> 日

抽象

转录后基因沉默（PTGS）是一种防御机制，针对内源性（转座子）或外源性（病原体，转基因）来源的入侵核酸。在植物被病毒感染期间，病毒来源的初级siRNA靶向病毒RNA，导致单链病毒RNA的破坏（执行步骤）和二级siRNA的产生（扩增步骤），从而最大限度地提高植物防御能力。作为反防御，病毒表达称为RNA沉默病毒抑制因子（VSR）的蛋白质。一些病毒表达完全抑制PTGS的VSR，而其他病毒表达效果有限的VSR。在这里，我们表明萝卜黄花叶病毒（TYMV）的感染在拟南芥ago1，ago2和dcl4突变体中增强，这些突变体在PTGS的执行中受损，但在dcl2，rdr1和rdr6突变体中没有增强，它们在PTGS的扩增中受损。我们一致地表明，TYMV VSR P69定位在siRNA小体中，siRNA小体是次级siRNA的产生位点，并限制了PTGS扩增。此外，TYMV诱导宿主酶RNASE THREE-LIKE1（RTL1）的产生，以进一步减少siRNA积累。烟草响尾蛇病毒（TRV）感染，也编码限制PTGS扩增的VSR，诱导RTL1以及减少siRNA积累并促进感染。总之，这些结果表明，RTL1可以被认为是由病毒诱导的宿主易感基因，作为VSR不足时进一步限制植物PTGS防御的策略。

作者摘要

RNA沉默是一种针对各种真核王国中病毒的保守防御机制。作为反防御，病毒通常表达称为RNA沉默（VSR）病毒抑制因子的蛋白质，其通过抑制RNA沉默机制的一种或另一种成分来促进感染。到目前为止，大多数关于VSR的工作都集中在那些强烈抑制RNA沉默，导致严重感染和植物死亡的VSR上。然而，VSR仅部分抑制RNA沉默的情况可以被认为是对感染双方有利的，因为尽管病毒繁殖，受感染的植物仍存活，开花和产生种子。在这项研究中，我们发现萝卜黄花叶病毒（TYMV）编码弱VSR，P69，其部分抑制RNA沉默的扩增，但不抑制RNA沉默的执行。此外，TYMV诱导内源性酶RNASE THREE-LIKE1（RTL1）的表达，以进一步减少siRNA积累。同样，烟草摇铃病毒（TRV）也编码弱VSR，诱导RTL1减少siRNA积累并促进感染。我们认为，一些VSR对RNA沉默的有限作用以及相应病毒诱导宿主RTL1的能力导致病毒繁殖和植物发育之间的紧密平衡，允许病毒在不杀死宿主的情况下繁殖。根据这些结果，RTL1可以被认为是编码弱VSR的病毒诱导的易感基因。

引文： Sehki H， Yu A， Elmayan T， Vaucheret H （2023） TYMV 和 TRV 通过表达 RNA 沉默的弱抑制因子和诱导宿主 RNASE THREE LIKE1 感染拟南芥。公共科学图书馆病理学19（1）： e1010482. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1010482

编辑 器： 王贤兵，中国农业大学，中国

收到： 30月 2022， 10;接受： 2023月 25， 2023;发表： <>月 <>， <>

版权所有： ? 2023 Sehki 等人。这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。

数据可用性： 所有相关数据都在手稿及其支持信息文件中。

资金： 作者没有收到这项工作的具体资金。

竞争利益： 提交人声明他们没有竞争利益。

介绍

作为无柄生物，植物已经发展出适应机制，以快速应对波动环境中的生物（食草动物，病原体）或非生物（光，温度，营养，水等）压力。在病原体攻击的情况下，植物与它们的病原体共同进化，并建立了大量工具来对抗入侵者。这种复杂防御的一层涉及称为转录后基因沉默（PTGS）的过程[1-3]。

大多数植物病毒属于IV类，即它们的遗传物质由单链RNA（ssRNA）分子组成。这些病毒使用自己的RNA依赖性RNA聚合酶（RdRP）进行复制，形成双链RNA（dsRNA）中间体。在某些情况下，病毒dsRNA也可能由病毒ssRNA的部分折叠引起。病毒有时也会产生结构与内源性mRNA不同的ssRNA，缺乏帽或polyA尾巴。它们被认为是异常RNA（abRNA），它们应该被细胞RNA质量控制（RQC）途径降解。然而，它们的量对于RQC容量来说可能过高，允许它们通过细胞RNA依赖性RNA聚合酶（RDR）转化为dsRNA，特别是RDR6，其对这些类型的abRNA表现出高亲和力。无论如何，病毒dsRNA分子是植物RNase III型酶的完美底物，称为DICER-LIKE（DCL）。特别是，DCL4和DCL2分别将病毒dsRNA切割成21和22-nt的小干扰RNA（siRNA）双链体[4-6]。这些双链体在其突出的1'末端被HEN3甲基化，以保护其免受尿苷化和降解。病毒siRNA双链体加载到ARGONAUTE（AGO）家族的蛋白质上，主要是AGO1，但也包括AGO2、AGO5、AGO7和AGO10[7]。siRNA双链的乘客链被切割和消除，允许引导siRNA链与互补的病毒ssRNA分子退火，并且由于AGO蛋白的RNaseH活性而切割它们。在被AGO/siRNA复合物切割后，病毒ssRNA片段被外切酶降解。此外，AGO1/22-nt siRNA复合物靶向的RNA可以吸引PTGS扩增机制的组分，包括RDR6、SDE5和SGS3，允许它们转化为dsRNA，导致次级siRNA的产生并随后加载到AGO蛋白上，从而最大限度地消除植物细胞中的病毒RNA[8-10]。

虽然PTGS过程应该通过从病毒dsRNA中产生siRNA并将其返回病毒ssRNA来消除每种病毒，但实际从病毒感染中恢复的植物的例子很少[1]。事实上，大多数病毒都能成功感染植物，因为它们编码称为VSR的蛋白质，这些蛋白质具有在一步或另一步抑制PTGS的能力[2，3，11]。根据VSR针对的PTGS成分，PTGS或多或少受到抑制，导致病毒数量和症状在严重和轻度之间。例如，萝卜花叶病毒（TuMV，Potyviridae家族成员）产生的HC-Pro蛋白或番茄丛生特技病毒（TBSV，Tombusviridae家族成员）产生的P19蛋白螯合siRNA，从而阻止其加载到AGO蛋白上[2，3，11]。P38，由萝卜皱病毒（TCV，Tombusviridae家族的另一个成员）编码的VSR或2b，由黄瓜花叶病毒（CMV，溴病毒科的成员）编码的VSR，使AGO1活性失活[2，3，11]。因此，CMV，TBSV，TCV和TuMV会引起严重的症状，因为它们的VSR完全阻止PTGS的执行。PTGS受损的突变体与野生型植物一样对此类病毒感染敏感，因为PTGS在抵消这些病毒方面完全无效[10，12-14]。另一方面，一些病毒会引起轻微的症状，例如酪病毒科成员萝卜黄花叶病毒（TYMV）或处女病毒科成员烟草摇铃病毒（TRV），这表明PTGS对此类病毒具有活性。PTGS受损突变体比野生型植物积累更多的TRV或TYMV RNA[15，16]。PTGS对这些病毒有活性的事实可以通过其VSR无法完全抑制PTGS来解释。在TRV的情况下，其VSR（称为16K）被证明仅影响PTGS的扩增步骤[17]。然而，在TYMV的情况下，其VSR（称为P69）的影响尚不完全清楚。一份报告[18]显示，P69抑制由感觉转基因（S-PTGS）诱导的PTGS，但不抑制由倒置重复转基因（IR-PTGS）诱导的PTGS。这些作者还报告说，P69引起miRNA引导链和乘客链的积累，导致他们提出了一种基于miRNA引导的宿主基因表达抑制的病毒毒力机制。在这里，我们进一步研究了P69对PTGS的影响，发现P69定位在siRNA小体中，其中它部分抑制了二级siRNA的产生，从而限制了PTGS扩增。我们还表明，TYMV通过诱导内源性酶RNASE THREE-LIKE1（RTL1）的表达来加强PTGS扩增的局限性，RTL19降解siRNA的dsRNA前体[16]。同样，VSR 17K仅影响PTGS扩增步骤的TRV [1]诱导RTL1，这进一步有助于限制抗病毒siRNA的积累。因此，RTL<>可以被认为是由病毒诱导的易感基因，这些病毒对植物PTGS防御的作用有限。

结果

识别加重 TYMV 感染症状的 PTGS 突变

先前的一项研究表明，与野生型植物相比，感染TYMV的dcl4突变体表现出加重的症状，积累的病毒RNA是其两倍，这表明PTGS靶向TYMV RNA[16]。考虑到先前的分析显示，dcl2 dcl4双突变体而不是dcl2或dcl4单突变体更容易受到VSR缺陷CMV和TuMV的影响，这一结果有点令人惊讶[1-4]。此外，在ago1 ago2和rdr1 rdr6双突变体中也观察到症状加重和病毒RNA水平升高，但在感染VSR缺陷型CMV和TuMV的相应单一突变体中未观察到[1-4]。因此，为了进一步破译哪些PTGS成分在抗TYMV PTGS中起作用，一系列突变体被TYMV感染。起初，感染了ago1，ago2，dcl2，dcl4，rdr1和rdr6单突变体。 AGO1，AGO2和DCL4，但没有DCL2，RDR1和RDR6表现出加重症状，i。e.与感染的Col相比，生长减少和叶片变黄（图1）。然后，感染ago1 ago2，dcl2 dcl4和rdr1 rdr6双突变体。与ago1和ago2相比，ago1 ago2的症状加重，但dcl2 dcl4与dcl4相比，rdr1 rdr6的症状没有变化（图1）。病毒RNA的定量证实AGO6，AGO1和DCL1有助于限制病毒RNA水平（S2图）。鉴于AGO4，AGO1和DCL1足以使用原代siRNA执行PTGS，而DCL2，RDR4和RDR2对于PTGS的扩增是必需的，这些结果表明TYMV感染受到加载到AGO1和AGO6上以执行PTGS的DCL4依赖性初级siRNA的作用的限制。该假设的推论是，TYMV最终成功感染植物，因为它抑制了PTGS的扩增步骤，使得初级siRNA的作用不足以完全预防感染。

缩略图 下载：

.PPT幻灯片

.PNG大图

.TIFF原始图像

图1. 植物PTGS防御通过AGO1，AGO2和DCL4的作用限制TYMV感染。

感染TYMV三周后指定基因型的模拟和TYMV感染植物的图片。植物在短日照条件下生长。生长曲线显示了模拟和TYMV感染的植物从接种前一周到接种后三周的莲座面积的时间变化（4株植物的平均值，+/-SE）。DPG：发芽后几天。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1010482.g001

TYMV抑制PTGS的扩增步骤

为了进一步挑战TYMV抑制PTGS扩增步骤的假设，几个转基因品系被TYMV感染。L1和6b4系携带相同的p35S：GUS-tRbcS转基因。L1系自发地经历一种称为S-PTGS的PTGS形式，用于感觉转基因诱导的PTGS。另一方面，6b4行稳定表达GUS mRNA。然而，6b4位点容易触发S-PTGS。事实上，6b4 ski3、6b4 xrn4和6b4 vcs系触发S-PTGS[20-22]。这表明，在野生型背景下，由6b4位点产生的异常RNA被RQC降解，但是当RQC不主动降解它们时，这些异常RNA可以转化为dsRNA。当35b6位点被带到携带p4S：hpG转基因的6位点存在时，也可以实现4b306位点携带的p35S：GUS-tRbcS转基因的沉默。306位点[23]产生一个发夹RNA，由GUS序列的5'，然后是GUS序列的3'末端，其本身是相反方向的GUS序列的5'（图2A）。306位点直接产生dsRNA，该dsRNA由DCL2和DCL4转化为siRNA，无需任何RDR，导致35b6位点的p4S：GUS-tRbcS转基因产生的GUS mRNA被破坏。这种形式的PTGS被称为IR-PTGS，用于倒置重复诱导的PTGS。在野生型植物中，扩增也通过RDR6活性发生，导致从GUS序列的231 bp片段产生二级siRNA，该片段存在于6b4位点中，但不存在于306位点中。在rdr6突变体中，通过PTGS扩增产生这些二级siRNA被消除，但这不会影响6b4位点的有效IR-PTGS，因为从306位点产生足够的初级siRNA[23，24]。

缩略图 下载：

.PPT幻灯片

.PNG大图

.TIFF原始图像

图2. TYMV抑制S-PTGS，但不抑制IR-PTGS。

A）p35S：GUS和p35S：hpG在6b4和6b4-306转基因系中的方案。指示用于北方印迹揭示的探针。B）和C）感染TYMV的转基因拟南芥系中的GUS活性。植物在漫长的日照条件下生长。在感染后三周测量GUS活性，并以荧光/蛋白质ug/分钟的任意单位表示。3 星表示模拟植物和受感染植物之间的学生测试水平显着<0.01。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1010482.g002

静音线路L1，6b4 ski3，6b4 xrn4，6b4 VCS和6b4-306感染TYMV，以确定TYMV对S-PTGS和IR-PTGS的影响。 在L1、6b4 ski3、6b4 xrn4和6b4 VCS中观察到GUS活性，但在6b4-306植株中未观察到（图2B和2C），表明TYMV抑制S-PTGS（扩增依赖性），但IR-PTGS则不抑制扩增依赖性，证实了先前使用不同报告基因获得的结果[18]。

鉴于L1感染植物的GUS活性低于6b4 ski3-，6b4 xrn4或6b4 VCS感染的植物，我们询问当RQC被废除时，TYMV诱导的S-PTGS抑制是否更有效。为了验证这一假设，在RQC缺陷突变背景（ski1和vcs）中携带L3位点的植物感染了TYMV。GUS活性在感染的L1，L1 ski3和L1 VCS中相似（图2C），表明TYMV诱导的S-PTGS抑制独立于RQC发生。因此，与L6相比，在4b3 ski6，4b4 xrn6，4b1 vcs中观察到的TYMV抑制作用更强，更有可能是由于S-PTGS在6b4 ski3，6b4 xrn4和6b4 vcs中的效率低于L1[20，22]（Moreno等人，2013），因此更容易抑制。

TYMV VSR P69抑制PTGS的扩增步骤

TYMV基因组编码四种蛋白质，其中P69似乎是病毒细胞间运动所必需的[25]和抑制p35S：GUS S-PTGS [18]。然而，最初由Chen等人在2004年进行的实验是使用p35S：P69结构进行的，该结构可能产生高于TYMV感染植物中存在的水平的P69。因此，6b4 ski3、6b4 xrn4 和 6b4-306 行用 p35S：P69 或 pUBQ10：P69 构造进行了变换。6b4-306/p35S：P69或6b4-306/pUBQ10：P69植物均未表现出GUS活性（图3）。相比之下，在大多数6b4 ski3/p35S：P69、6b4 ski3/pUBQ10：P69、6b4 xrn4/p35S：P69和6b4 xrn4/pUBQ10：P69植物中观察到GUS活性，表明P69抑制S-PTGS。 为了确认P69对IR-PTGS没有影响，选择表达最多P10的pUBQ69：P35和p69S：P69转化体，被选为表现出最高GUS活性的6b4 ski3 / pUBQ10：P69和6b4 xrn4 / p35S：P69转化体，要么自交到6b4-306，并在F1植物中测量GUS活性。在自化6b4 ski3/pUBQ10：P69和6b4 xrn4/p35S：P69植株中观察到GUS活性，但在6b4-306 x 6b4 ski3/pUBQ10：P69和6b4-306 x 6b4 xrn4/p35S：P69植株中未观察到GUS活性，证实P69抑制扩增依赖性S-PTGS，但不能抑制扩增依赖性IR-PTGS。

缩略图 下载：

.PPT幻灯片

.PNG大图

.TIFF原始图像

图3. TYMV蛋白P69抑制S-PTGS，但不抑制IR-PTGS。

用pUBQ10：P69或p35S：P69构建体转化的对照或转基因系中的GUS活性。GUS活性以任意单位的荧光/μg蛋白质/分钟表示，3星表示WT和转化植物之间的学生测试具有显着水平<0.01和2星<0.05。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1010482.g003

TYMV VSR P69可能抑制dsRNA的产生，而不是其切割

S-PTGS扩增不仅需要RDR的作用来产生dsRNA，还取决于DCL2的作用。事实上，DCL2依赖性的22-nt siRNA，而不是DCL4依赖性的21-nt siRNA，促进RDR6将靶向ssRNA转化为dsRNA，并产生二级siRNA[8，9，26]。dcl2和rdr6并不比Col更容易受到TYMV的影响，这一事实表明扩增步骤是P69的目标，但是它没有说明是dsRNA的产生还是DCL2的切割受到P69的影响。为了解决这个问题，我们研究了内源性siRNA的积累，这些siRNA依赖于DCL2或RDR6的产生。首先，我们检查了积累的TAS3 ta-siRNA，它依赖于RDR6而不是DCL2来产生，因为它不是由DCL2依赖性的22-nt siRNA介导的切割引发的，而是由称为miR390的miRNA引发的。因此，rdr6而不是dcl2突变体表现出叶缘向下卷曲[27]。pUBQ10：P69植株的叶缘也表现出向下卷曲（图4A），北方印迹分析证实，与野生型植株相比，TAS3 ta-siRNA在pUBQ10：P69植株中的积累水平较低，而miR390水平保持不变（图4B）。然后，我们检查了内源性IR71 22-nt siRNA的积累。它们的生产需要DCL2而不是RDR6，因为IR71 dsRNA是通过长ssRNA的内部折叠制成的。IR71 22-nt siRNA在pUBQ10：P69和野生型植物中以相似的水平积累（图4B），表明DCL2作用不受P69的损害。

thumbnail 下载：

.PPT幻灯片

.PNG大图

.TIFF原始图像

图4. TYMV蛋白P69抑制PTGS次级siRNA的产生。

A）携带pUBQ10：P69构建体的野生型植物和转基因系的表型。向下卷曲的叶子是缺乏TAS3 siRNA的典型特征。B）miR390，TAS3和IR71内源性siRNA以及GUS一级和二级siRNA（分别使用5'GUS和中央GUS探针，见图2A）在对照或用pUBQ10：P69构建体转化的转基因植物中的积累。EtBr染色显示为上样对照。C）GUS一级和二级siRNA在对照或用35S：P69构建体转化的转基因植物中的积累。EtBr染色显示为上样对照。siRNA积累恢复为用ImageJ测量的条带强度，并在EtBr染色时归一化为总RNA条带强度。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1010482.g004

为了确认P69抑制RDR6依赖性扩增步骤，我们利用了6b4-306线。在该系中，从存在于231b6位点而不是4位点的GUS序列的306 bp片段产生二级siRNA取决于RDR2[6]。在23b6-4/pUBQ306：P10和69b6-4/p306S：P35植物中，由于69位点产生的初级siRNA的作用，IR-PTGS并未被废除（图306B），但在pUBQ2：P10植株中二级siRNA的产生减少（图69B），在p4S：P35植株中被废除（图69C），确认 S-PTGS 的扩增（而非执行）受到 P4 的损害。

TYMV VSR P69定位在siRNA扩增参与者所在的siRNA小体中

RDR6和SGS3是S-PTGS扩增的两个主要组成部分，位于称为siRNA小体（SB）的细胞质病灶中。这些病灶非常小，在正常条件下几乎不可能检测到。然而，在热应激或渗透应激后，较大的病灶开始出现[21，28–31]。这些较大的SB类似于应激颗粒（SG），SG由核糖核蛋白复合物组成，其中mRNA在应激期间储存[32]。应激后，RDR6和SGS3与典型的SG标志物PAB2共定位，提示SG来源于SB，或SB在应激期间融合至SG[2，21]。

为了进一步了解P69如何抑制S-PTGS扩增，研究了P69亚细胞定位。为此，产生pUBQ10：P69-GFP和pUBQ10：GFP-P69结构，并通过农业渗透引入烟叶。观察到双胞质和细胞核定位（图5A），证实了先前通过将p35S：P69-GFP构建体引入原生质体获得的结果[33]。然后，生产携带pUBQ10：P69-GFP的稳定拟南芥转化体。根的共聚焦分析显示，这些转化体表现出弥漫性细胞质GFP信号，但没有明确的核信号（图5B）。应力后，在类似于SB和SG的病灶中观察到GFP信号（图5B）。

thumbnail 下载：

.PPT幻灯片

.PNG大图

.TIFF原始图像

图5. TYMV 蛋白 P69 在拟南芥的应激条件下与 SB 和/或 SG 共定位。

A）本氏烟草叶用pUBQ10：P69-GFP或pUBQ10：GFP-P69结构进行农业渗透。在农业浸润后2天通过共聚焦显微镜分析GFP（绿色）和叶绿素自发荧光（蓝色）信号。叠加对应于两个信号之间的合并。通道显示在每列上方，比例尺 （50 μm） 显示在叠加层上。DIC：微分干涉对比。B） 在 1 天龄转基因拟南芥系 pUBQ37：P5-GFP 与 p10S：SGS69-mCherry 或 pPAB35：PAB3-RFP 系杂交之前和之后在 2°C 下热应激 2 小时之前和之后测定的 GFP、RFP 和 mCherry 的亚细胞定位。叠加对应于 GFP 和 RFP 或 mCherry 信号之间的合并。通道显示在每列上方，比例尺 （5 μm） 显示在叠加层上。DIC：微分干涉对比。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1010482.g005

为了确定P69是否在SB和/或SG中定位，将pUBQ10：P69-GFP植物与p35S：SGS3-mCherry和pPAB2：PAB2-RFP植物杂交。未经处理的根的共聚焦分析显示弥漫性细胞质GFP，mCherry和RFP信号。然而，在热应激后，GFP和mCherry信号在pUBQ10：P69-GFP x p35S：SGS3-mCherry植物的大病灶中共定位，GFP和RFP信号共定位在pUBQ10：P69-GFP x pPAB2：PAB2-RFP植物的大病灶中（图5B），强烈表明P69存在于SB和/或SG中，它以某种方式限制了PTGS扩增。

TYMV 感染期间的 RTL1 诱导增强了 P69 的作用

上述结果表明，TYMV VSR P69具有抑制抗病毒PTGS扩增步骤的能力。然而，感染期间P69的生理水平似乎不足以完全抑制这一步，这只有在P69从转基因（比较图2B和3）和高水平（比较图4B和4C）形成型表达时才有可能。鉴于TYMV成功感染拟南芥，我们询问TYMV是否可以利用内源性RNASE-THREE-LIKE1（RTL1）来实现其感染。事实上，我们之前报道过，当感染TYMV时，与野生型植物相比，组成型表达RTL1（p35S：RTL1）的植物表现出加重的症状并积累更多的病毒RNA[19]。RTL1是一种RNaseIII酶，可切割内源性或外源性完美配对的dsRNA，从而阻止siRNA的产生，包括RDR6依赖性siRNA[5]。内源性RTL1基因在拟南芥营养组织中不表达，但由各种类型的病毒诱导，提示RTL1诱导是对病毒感染的一般反应。但是，大多数病毒编码抑制 RTL1 活性的 VSR。TYMV之所以与众不同，是因为其VSR P69不抑制RTL1活性[5]。为了解决TYMV感染期间RTL1诱导是否会增强P69对PTGS扩增的影响，分析了RTL1突变体对TYMV感染的敏感性。一种称为rtl1-1的T-DNA突变体在SAIL集合中被鉴定出来。该突变体在RNaseIII结构域的中间携带插入物（图6A和S2），从而消除了RTL1活性。第二个突变体称为rtl1-2，是使用CRISPR-Cas9技术获得的。ATG之后27碱基的单碱基缺失导致移码并产生仅11个氨基酸的截短蛋白，该蛋白同时缺乏RNaseIII和DRB结构域（图6A和S2）。将这两个突变体反向杂交到Col六次以确保消除未连接的突变，并且在自我后鉴定出纯合RTL1 / RTL1和rtl1 / rtl1兄弟姐妹。然后，WT植物，rtl1突变体和p35S：RTL1系被TYMV机械感染。与Col和rtl35突变体相比，p1S：RTL1系表现出更多的症状（图6B）。与Col植物相比，rtl1突变体表现出更高水平的TYMV siRNA和较低水平的TYMV基因组RNA（gRNA），而p35S：RTL1植物表现出较低水平的TYMV siRNA和较高水平的TYMV gRNA（图6C和6D）。总之，这些结果表明，RTL1不仅在使用p35S：RTL1转基因在高水平上人工表达时，而且在WT植物感染期间在生理水平上表达时，都有利于TYMV感染。他们还表明，由于P69和RTL1对PTGS的双重作用，TYMV感染是成功的。

thumbnail 下载：

.PPT幻灯片

.PNG大图

.TIFF原始图像

图6. RTL1 通过抵消抗病毒 PTGS 来有利于 TYMV 感染。

A） RTL1基因及其在4号染色体上的坐标的方案。指出了 rtl1-1 突变（T-DNA 插入 SAILseq_337_F04.1）和 rtl1-2 突变（CRISPR 诱导的单碱基缺失）的位置。TSS：转录起始位点，TTS：转录终止位点。B）感染TYMV三周后野生型，rtl1-1和rtl1-2突变体以及p35S：RTL1植株的图片。植物在短日照条件下生长。生长曲线显示了模拟和TYMV感染的植物从接种前一周到接种后三周的莲座面积的时间变化（1株植物的平均值，+/-SE）。DPG：发芽后几天。C） TYMV 全长基因组 RNA （gRNA） 在拟南芥野生型、rtl1-1 和 rtl2-35 突变体以及 p1S：RTL16 植株感染 TYMV 后四周的积累。从每个基因型的1种感染植物池中提取总RNA，运行到琼脂糖凝胶上并与TYMV探针杂交。数据归一化为上校D）TYMV siRNA在拟南芥野生型，rtl1-1和rtl2-35突变体以及感染TYMV后四周的p1S：RTL16植株中的积累。从每个基因型的1种感染植物池中提取总RNA，运行到丙烯酰胺凝胶上并与TYMV探针杂交。数据标准化为 Col. E） TYMV siRNA 在拟南芥野生型和感染 TYMV 的 rtl1-8 突变体的无症状与有症状后代中的积累。从每种类型的<>株植物池中提取总RNA，运行到丙烯酰胺凝胶上并与TYMV探针杂交。数据被规范化为受感染的上校。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1010482.g006

由于在感染TYMV的拟南芥植株上收获的种子中有一小部分传播病毒并出现与机械感染后观察到的症状相似的症状[34]，我们研究了rtl1突变是否会影响TYMV通过种子传播的频率。在土壤上播种了396颗在Col感染植物上收获的种子和在RTL396-1感染的植物上收获的1颗种子，并对出现TYMV症状的植物数量进行了评分。Col和rtl1-1之间在感染植物的频率上没有观察到差异（每种情况下为18%），表明RTL1对病毒通过种子传播没有影响。在出现TYMV症状的Col和rtl1-1植物中也监测了TYMV siRNA的量。与在机械感染植物中观察到的情况类似（图6D），与通过种子传播病毒的Col植物相比，通过种子传播病毒的rtl1-1植物中观察到更高水平的TYMV siRNA（图6E），证实RTL1实际上限制了营养组织中抗病毒siRNA的产生。

通过RTL1诱导抵消PTGS防御是TRV也使用的一种策略

为了确定TYMV用于促进感染的RTL1诱导策略是否可以推广到编码VSR的其他病毒，这些病毒不能阻止PTGS执行，检查了TRV，PTGS和RTL1之间的关系。之所以选择 TRV，是因为与 TYMV 一样，TRV 在拟南芥上引起轻微症状，这表明 PTGS 可有效限制 TRV 感染。支持这一假设的是，TRV蛋白16K先前被确定为对PTGS扩增具有有限活性的VSR[17]。TRV蛋白29K也被提议作为VSR，但其活性甚至低于16K[17，35]。

为了确定RTL1是否在TRV感染中起作用，我们首先检查了RTL1是否在TRV感染期间被诱导。结果表明，与其他病毒一样，TRV诱导RTL1表达（图7A）。然后，野生型植物，rtl1突变体和p35S：RTL1植物受到TRV的挑战。dcl2 dcl4双突变体被用作对照，因为它先前被证明对TRV感染高度敏感（Donaire等人，2008）[15]。与dcl2 dcl4双突变体类似，p35S：RTL1植株表现出加重症状（图7B），这与较高的病毒gRNA水平（图7C）和缺乏21-22-nt病毒siRNA相关（图7D）。这些结果证实，PTGS实际上强烈限制了TRV感染，并表明当过度表达RTL1时，PTGS的作用可以被消除。与p35S：RTL1植物相比，rtl1突变体比野生型植物积累了更多的病毒siRNA（图7D），这表明在TRV感染期间诱导内源性RTL1（图7A）实际上限制了PTGS的活性。rtl1突变体中病毒siRNA水平的增加与病毒gRNA水平略有降低相关（图7C）。

thumbnail 下载：

.PPT幻灯片

.PNG大图

.TIFF原始图像

图 7. RTL1 通过抵消抗病毒 PTGS 来有利于 TRV 感染。

A） 与 TYMV 相比，TRV 诱导 RTL1。在感染后三周通过qRT-PCR分析WT植株上的RTL1表达。GAPDH表达用作内部对照，数据标准化为未感染（模拟）植物。B）拟南芥野生型，RTL1-1和dcl2 dcl4突变体以及感染TRV后三周的p35S：RTL1植株的图片。植物在短日照条件下生长。C） TRV 基因组 RNA （gRNA） 在拟南芥野生型、rtl1-1 和 dcl2 dcl4 突变体和 p35S：RTL1 植株中积累 TRV 感染 TRV 后四周。从每个基因型的16种感染植物中提取总RNA，并与TRV探针杂交。数据归一化为Col.D）TRV siRNA在拟南芥野生型，RTL1-1和dcl2 dcl4突变体以及感染TYMV后35周的p1S：RTL16植株中的积累。从每个基因型的21种感染植物中提取总RNA，并与TRV探针杂交。数据归一化为上校。 对于siRNA定量，仅考虑22和<>-nt条带。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1010482.g007

讨论

病毒感染的结果取决于病毒攻击、宿主防御和病毒反防御之间的平衡。在植物中，PTGS充当针对病毒的序列特异性防御机制。PTGS被病毒复制的dsRNA中间体和/或折叠的病毒RNA激活，导致产生靶向病毒ssRNA的初级siRNA，以破坏和产生次级siRNA，从而最大限度地提高植物防御能力。然而，大多数病毒已经进化出基于称为VSR的病毒蛋白的反防御，其抑制PTGS的一个或另一个步骤，从而影响植物PTGS防御。针对PTGS执行基本步骤的VSR，例如通过隔离siRNA或抑制AGO引导的病毒RNA切割，会引起非常严重的症状，因为植物PTGS防御完全被抑制。因此，PTGS缺陷突变体和野生型植物同样被相应的病毒感染，只有使用VSR缺陷病毒才能揭示PTGS实际消除这些病毒RNA分子的能力[10，12-14]。然而，并非每种病毒都编码能够完全抑制PTGS的VSR。因此，几种病毒只在野生型植物上引起轻微症状，因为PTGS仍然能够减少病毒RNA的数量。

在这里，我们检查了一种这样的病毒，TYMV的情况。拟南芥dcl4突变体中TYMV RNA水平的增加揭示了PTGS对TYMV的有效作用[16]，表明PTGS对TYMV起作用。然而，野生型植物不能从TYMV感染中完全恢复的事实表明PTGS不能消除所有病毒RNA，这表明至少有一个PTGS步骤被TYMV抑制。对感染TYMV的各种PTGS突变体的行为进行研究显示，与野生型植物相比，dcl4、ago1和ago2表现出增强的症状，而dcl2、rdr1和rdr6表现出与野生型植物相似的症状（图1）。由于AGO1，AGO2和DCL4参与PTGS的执行，而DCL2，RDR1和RDR6对于PTGS执行是可有可无的，并且仅有助于PTGS扩增，这些结果表明，在TYMV感染期间，只有PTGS的扩增步骤受损。这一假设通过感染携带报告转基因的拟南芥系得到证实，这些基因被S-PTGS沉默，需要PTGS扩增组件，或IR-PTGS，不需要PTGS扩增成分。TYMV感染抑制S-PTGS，但不能抑制IR-PTGS（图2），这种抑制可以通过仅表达TYMV VSR P69来概括（图3）。此外，在表达TYMV VSR P6的植物中，内源性ta-siRNA的积累受到影响，而内源性内源性ta-siRNA的积累（生产需要DCL2而不是RDR69）在表达TYMV VSR P2的植物中没有受到影响（图6）。最后，P69被证明定位在RDR4所在的siRNA小体和PTGS扩增发生的地方（图69），表明P6限制了siRNA小体中发生的PTGS扩增步骤，从而减少了二级siRNA的产生。因此，P5可以添加到抑制PTGS扩增的VSR列表中，其中包括：i）由DNA病毒番茄黄叶卷曲病毒（TYLCV）编码的VSR蛋白V69，它与拟南芥RDR69辅因子SGS2的番茄同系物竞争与dsRNA结合[6，3]，ii）由车前草花叶病毒编码的VSR蛋白TGBp29 （PlAMV），与SGS31和RDR1相互作用，并与SGS3/RDR6小体聚集[3]，iii）由水稻黄特技病毒（RYSV）编码的VSR蛋白P6，它与RDR36相互作用，从而阻断二次siRNA合成[6]，iv）番茄黄叶卷曲中国病毒（TYLCCNV）DNA卫星编码的VSR蛋白βC6，其与N中沉默钙调蛋白样蛋白（rgs-CAM）的内源性抑制因子相互作用。本氏菌抑制RDR37表达和次级siRNA产生[1]，v）由稻矮植物病毒（RDV）编码的VSR蛋白Pns6，其下调RDR38[10]，以及vi）由烟草响尾蛇病毒（TRV）编码的VSR蛋白6K，这在某种程度上限制了PTGS扩增[39]。

表达VSR的病毒的感染能力仅部分抑制PTGS的扩增步骤，这表明此类病毒可以使用其他策略来抵消植物PTGS防御。这促使我们研究RTL1是否有助于减少抗病毒siRNA的数量。RTL1 自然不会在野生型拟南芥植物中表达，而是在病毒感染后诱导，这表明 RTL1 诱导可能是病毒在表达 VSR 之外用来抵消植物 PTGS 防御的替代方法，尽管不是排他性方式，特别是当表达仅部分抑制 PTGS 的 VSR 时。支持这一假设的是，p35S：RTL1拟南芥植株在高水平下持续表达RTL1缺乏TYMV siRNA，积累了高水平的TYMV gRNA，并且在感染TYMV时表现出严重的症状[19]。在这里，我们表明TRV也是如此（图7），表明至少在拟南芥中，RTL1实际上能够防止siRNA介导的TRV和TYMV RNA的降解。然而，p35S：RTL1植物累积的RTL1高于在野生型感染植物中观察到的水平[19]，RTL1的作用的证明有待RTL1突变体的分析。在这里，我们表明TRV和TYMV感染的rtl1突变体比野生型植物积累更多的TRV或TYMV siRNA，以及更少的TRV或TYMV gRNA（图6和7）。总之，这些结果提出了一个模型，其中病毒引起轻微症状，例如。g. TRV或TYMV，i）产生VSR，16K或P69，其部分抑制二级siRNA的产生，以及ii）诱导RTL1的表达以进一步减少二级siRNA的产生，从而加强VSR的作用。

总之，我们的研究强化了这样一种观点，即抑制PTGS扩增而不是PTGS执行是病毒常用的一种策略，用于限制植物PTGS防御并在不杀死宿主的情况下繁殖。事实上，至少在TRV或TYMV感染的情况下，由于初级siRNAs引起的剩余PTGS活性使受感染的植物能够存活，开花和产生种子，从而传播病毒。在TYMV的情况下，拟南芥感染植物的一小部分种子传播病毒[34]，因此作为新感染的植物传播到原始感染部位周围，并成为TYMV传播到其他寄主植物的新来源。因此，人们很容易推测P69和RTL1对PTGS的双重作用导致病毒繁殖和植物发育之间的紧密平衡。根据这些结果，人们可以将拟南芥-TYMV相互作用视为植物-病毒共同进化的优雅模型。

材料和方法

植物材料

本研究中使用的野生型植物、转基因品系和功能丧失突变体属于哥伦比亚拟南芥 （Col-0） 生态型，或由至少六次反向杂交到 Col-0 的结果。

6b4系携带稳定表达的p35S：GUS转基因[23]。由于RQC功能失调，6b4 ski3、6b4 xrn4和6b4 vcs系表现出S-PTGS[20-22]。6b4-306系表现出由p35S：hpG构建体诱导的IR-PTGS，表达由GUS序列前半部分组成的发夹[23]。

ago1-27、dcl2-1（SALK_064627）、dcl4-2（GABI_160G05）、dcl2-1 dcl4-2、rdr1-1（SAIL_672F1）、rdr6（sgs2-1）和rdr1-1 rdr6单双突变体已有描述[14，24，40-44]。RIKEN收藏的ago2-3（RATM15_3703）是从ABRC获得的。在这项研究中，最初在诺森（No-2）生态型中的ago3-0被反向交叉到Col-0六次。ago1-27 ago2-3双突变体由标准杂交产生，使用ago2-3反向杂交到Col-0。

来自先正达拟南芥插入文库馆藏的 T-DNA 插入突变体 rtl1-1 （SAILseq_337_F04.1） 是从 NASC 获得的。CRISPR-Cas9技术用于产生rtl1-2突变体。使用CRISPOR网站（http://crispor.tefor.net）获得了靶向RTL5（At1g4）编码序列15417'末端的向导RNA，由IDT（https://eu.idtdna.com）合成并克隆到pDE-Cas9-GentR载体（Gateway Technology-Invitrogen/Thermo Fisher Scientific）中。引导RNA和rtl1-2突变序列在S2图中描述。p35S：RTL1植物已有先前的报道[19]。

pPAB2：PAB2-RFP系列已在前面描述过[32]。表达p35S：P69的转基因系是使用前面描述的p35S：P69构建体获得的[18]。表达p35S：SGS3-mCherry、pUBQ10：P69、pUBQ10：P69-GFP、pUBQ10：GFP-P69或pUBQ10：16K的转基因品系如下所述。

克隆和转化

为了生成pUBQ10：P69，pUBQ10：P69-GFP，pUBQ10：GFP-P69构建体，使用attb侧翼引物从pTY [2]质粒中PCR扩增TYMV ORF69（P45）序列。通过PCR在TYMV ORF2中引入C-to-T突变，在9千核苷酸破坏TYMV ORF1起始密码子。然后将序列克隆到pDONR207载体（网关技术-Invitrogen/赛默飞世尔科技）中，并使用pUB-Des载体[46]进行LR反应以生成pUBQ10：P69。对于P69亚细胞定位研究，使用pUBC-GFP-Des和pUBN-GFP-Des载体进行了LR反应[46]。用于克隆的引物列在S1表中。

为了生成p35S：SGS3-mCherry构建体，使用pDONR140载体中的SGS3克隆对pMDC207-mCherry载体进行了LR反应[28]。将p35S：SGS3-mCherry构建体引入sgs3-1突变体中，并保留显示sgs3突变互补的系用于共聚焦分析。

表达载体通过电穿孔或三亲交配从大肠杆菌DH58B或DH1α细菌（赛默飞世尔科技）转移到根癌农杆菌C90C10（pMP5）中，拟南芥植株使用浸润溶液（5%蔗糖，10mM MgCl2,0.015% SilwetL-77），农杆菌携带最终外径的目标构建体600的1[47]。在补充有相应抗生素的培养基上选择稳定的转化体。

对于农业渗透实验，N.如[48]所述，使用农业渗透溶液（pH 5.2，10mM MgCl2，10mM MES，150mM乙酰丁香酮），农杆菌携带最终OD的目标构建体600的 1.用于该测定的p35S：hpG和p35S：GFP构建体先前已有描述[19，23]。在农业渗透后3天收获叶片进行分析。

生长条件和病毒接种

将表面灭菌的种子体外播种在Bouturage培养基（pH 5.9，1.3%S-培养基S0262.0010，1%植物琼脂P1003，Duchefa Biochimie）上，在4°C下春化48小时，并在标准长日照条件下转移（16小时光照，8小时黑暗，22°C和65%相对湿度）。对于亚细胞定位测定，将种子播种在垂直平板上，并在发芽后5天分析根部。对于GUS分析，将两周龄的幼苗转移到温室中的土壤中，具有标准的长日照条件（白天16小时，在~8°C和22-45%相对湿度下黑暗60小时）。

对于病毒感染测定，植物在标准的短日照条件下（8小时的光照，16°C和21%相对湿度下65小时的黑暗）直接生长在受控生长室的土壤上。

对于萝卜黄花叶病毒的感染，四周龄的植物通过用碳化硅粉和先前感染的TYMV感染的A的接种物机械摩擦。在5mM钠中研磨的南芥叶2高原油45毫米氢氧化钠2采购订单4缓冲区。对于烟草响尾蛇病毒感染，在最终OD中用携带pTRV1（YL192）和pTRV2-MCS（YL156）载体的农杆菌混合物[49]对四周龄的植物进行农业渗透。600的 1.接种后16至2周收获4株植物的玫瑰花结进行分析。

病毒症状的量化

每个基因型的每个条件用 ImageJ 测量每株植物的投影莲座面积（手动测量）。使用图像>调整>颜色阈值（色彩空间：实验室，深色背景，a*值的调整）对玫瑰花结进行分割。使用Process>Binary>Make binary获得玫瑰花结的二进制图像。使用魔杖追踪工具选择玫瑰花结区域，并使用分析>测量进行测量。计算平均像素面积和标准偏差（误差线）。

GUS 检测

如前所述测定GUS活性[48]。简而言之，叶子在磷酸盐缓冲液（pH 7.2，50 mM Na 2 HPO）中研磨4， 50 mM NaH2采购订单4，10 mM EDTA）在20°C和4rpm下离心3000分钟。使用BSA范围进行Bradford蛋白质测定（蛋白质测定染料试剂500–0006，BioRad），并使用ELx808酶标仪（Biotek）定量蛋白质浓度。酶活性是通过4-MUG底物（M1404，Duchefa）与Fluoroskan Ascent II（赛默飞世尔科技）产生的衍生产物来测量的。GUS活性以任意单位表示为每分钟荧光数据与蛋白质浓度之间的比率。

核糖核酸分析

RNA提取和杂交如前所述[50]。简而言之，将冷冻叶在液氮中研磨，加入NaCl提取缓冲液（0.1M NaCl，2%SDS，50 mM Tris / HCl pH 9，10 mM EDTA pH 8，20 mM β-巯基乙醇）中，并使用标准苯酚 - 氯仿程序提取总RNA。在 -3°C 的 100v 1% EtOH 和 10/3v 5M NaOAc （pH 2.80） 缓冲液中回收 RNA 1 小时。经过一系列离心后，将RNA沉淀重悬于无菌水中，并用NanoDrop 2000C（Ozyme）定量。对于低分子量（LMW）北方印迹，将5至30ug的RNA在85°C下变性5分钟，在15%聚丙烯酰胺，7.5M尿素和1X TBE凝胶上分离，并转移到Hybond NX膜（Amersham）上。对于高分子量 （HMW） 北方印迹，将 5 ug RNA 在 85°C 下变性 5 分钟，在 0.8% 至 1.5% 琼脂糖、0.7% 甲醛、20 mM HEPES 和 1 mM EDTA pH 7.8 凝胶上分离，并在 Genescreen Plus 膜（NEF-976、NEN/杜邦）上转印。PCR探针使用S1表中列出的引物生产，用NucleoSpin Gel & PCR净化试剂盒（Machery-Nagel）纯化，并放射性标记dCTP-P32与Prime-a-gene标记系统试剂盒（U1100，Promega）结合。从GenoScreen订购寡核苷酸探针并放射性标记dATP-P32与 T4 多核苷酸激酶试剂盒（T4 PNK EK0031，赛默飞世尔科技）结合。用鲑鱼精子印迹饱和后，在PerfectHyb缓冲液（H7033，西格玛奥德里奇）中在37°C（dCTP-P）下杂交过夜32标记探针）或 50°C （dATP-P32标记探针），用于LMW北部印迹和教会缓冲液（7%SDS，250 mM Na2高原油4，2mM EDTA 200 μg/mL 肝素）在 65°C 下过夜，用于 HMW 北方印迹。在BAS-MP 2040P成像板（富士胶片）上曝光后，用台风FLA9500磷酸成像仪（Ge-Healthcare）揭示了杂交信号。用ImageJ在不饱和图像上测量RNA条带强度。将数据归一化为加载对照的带强度。

对于TYMV定量RT-PCR分析，遵循前面描述的定量方法[51]来估计病毒在TYMV感染组织中的积累。pTY质粒[45]在独特的HindIII限制性位点线性化，并使用阿伏伽德罗常数估计质粒拷贝数。对 3 倍 2 点稀释系列进行 qRT-PCR，进行 073 次技术重复，以计算标准曲线公式 y = -7.4178x + 1.2。如上所述，对感染TYMV的叶片进行qRT-PCR，除了使用随机引物代替寡核苷酸dT进行cDNA合成，并使用标准曲线分析数据以估计TYMV数量。引物列在S<>表中，qRT-PCR循环条件列在S<>表中。

亚细胞定位实验

N表皮上的GFP，mCherry和RFP信号。本氏本氏菌农业渗透到五日龄A的叶子或根部。在5°C热应激之前和/或之后，使用徕卡TSC SP37共聚焦和水浸物镜分析南芥幼苗<>小时。使用ImageJ分析图像。

支持信息

植物PTGS防御通过AGO1，AGO2和DCL4的作用限制TYMV感染。

显示 1/4： ppat.1010482.s001.tiff

跳到无花果共享导航

https://ndownloader.figstatic.com/files/38951512/preview/38951512/preview.jpg

1 / 4

下载

无花果分享

S1 图 植物PTGS防御通过AGO1，AGO2和DCL4的作用限制TYMV感染。

感染TYMV四周后，拟南芥野生型和PTGS突变植株中的病毒gRNA积累。从每个基因型的16种感染植物中提取总RNA。使用位于TYMV ORF2 P69上的引物通过qRT-PCR定量TYMV gRNA的量。GAPDH被用作实习生对照。数据被规范化为上校。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1010482.s001

（蒂夫）

S2 图 RTL1-2 突变体的描述。

按照材料和方法中所述合成了靶向RTL1（AT4G15417）序列（黄色表示）的向导RNA。对鉴定的突变进行Sanger测序，并使用SerialCloner进行BLAST分析。在 27千位置（红色箭头）在 PAM 站点之前 3-nt（以蓝色表示）。过早的终止密码子出现在8千插入处的氨基酸和第二个TasI限制性位点，允许用绿色表示的引物进行基因分型。Cas9盒分离后进行PCR和抗生素耐药性丧失。在分析之前，rtl1-2 被反向交叉六次到 Col。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1010482.s002

（蒂夫）

S1 表。 用于新描述突变体的基因分型、探针合成和杂交的引物。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1010482.s003

（三十）

S2 表。 qRT-PCR 程序。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1010482.s004

（三十）

确认

我们感谢Cécile Antonelli提供的pPAB2：PAB2-RFP系，Shou-Wei Ding提供p35S：P69质粒，Isabelle Jupin提供TYMV质粒。这项工作得益于IJPB植物观测站技术平台的支持。IJPB受益于Saclay Plant Sciences-SPS（ANR-17-EUR-0007）的支持。这项工作得益于法国国家研究机构根据未来投资计划（参考ANR-17- IDEX-0007-11）管理的法国国家赠款（萨克雷植物科学，参考号ANR-0003-EUR-02，EUR SPS-GSR）。

引用

1.Baulcombe D. RNA在植物中的沉默。自然界。2004;431(7006):356–63.噗：15372043。

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

2.Ding SW， Voinnet O. 由小RNA指导的抗病毒免疫。细胞。2007;130(3):413–26.pmid：17693253

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

3.Pumplin N， Voinnet O. 植物病原体的RNA沉默抑制：防御，反防御和反防御。国家微生物学。2013;11(11):745–60.Epub 2013/10/17.普米德：24129510。

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

4.布切 N， 劳雷塞格斯 D， 加西奥利 V， 沃切雷特 H.拟南芥DCL2的拮抗功能正在开发中，DCL4在产生病毒siRNA中的新功能。恩博杂志 2006;25（14）：3347–56.PMID：16810317。

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

5.Deleris A， Gallego-Bartolome J， Bao J， Kasschau KD， Carrington JC， Voinnet O. 植物二核蛋白在抗病毒防御中的分层作用和抑制。科学。2006. pmid：16741077.

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

6.Fusaro AF， Matthew L， Smith NA， Curtin SJ， Dedic-Hagan J， Ellacott GA， et al. 植物中的RNA干扰诱导发夹RNA通过病毒防御途径起作用。EMBO Rep. 2006;7（11）：1168–75.Epub 2006/10/14.PMID：17039251。

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

7.卡博内尔A，卡灵顿JC。植物阿尔戈英雄的抗病毒作用。植物生物学. 2015;27：111–7.Epub 2015/07/21.pmid：26190744。

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

8.Chen HM， Chen LT， Patel K， Li YH， Baulcombe DC， Wu SH. 22-核苷酸RNA触发植物中的次级siRNA生物发生。美国国家科学院院刊， 2010;107（34）：15269–74.Epub 2010/07/21.pmid：20643946。

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

9.库珀鲁斯 JT， 卡博内尔 A， 法尔格伦 N， 加西亚-鲁伊斯 H， 伯克 RT， 武田 A， 等.22-nt miRNA在拟南芥靶转录本触发RDR6依赖性siRNA生物发生方面的独特功能。分子生物学. 2010;17（8）：997–1003.Epub 2010/06/22.pmid：20562854。

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

10.王晓波， 乔维尔， 乌多姆蓬， 王茹， 吴琪， 李文兴， 等.21-核苷酸，但不是22-核苷酸，病毒二级小干扰RNA直接由拟南芥中的两个合作阿尔戈英雄进行有效的抗病毒防御。植物细胞。2011;23(4):1625–38.Epub 2011/04/07.PMID：21467580。

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

11.Csorba T，Kontra L，Burgyan J.病毒沉默抑制因子：用于微调宿主 - 病原体共存的工具。病毒学。2015;479–480:85–103.Epub 2015/03/15.pmid：25766638。

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

12.Garcia-Ruiz H， Carbonell A， Hoyer JS， Fahlgren N， Gilbert KB， Takeda A， et al.拟南芥ARGONAUTE蛋白在萝卜花叶病毒感染中的作用和编程。公共科学图书馆病理学。2015;11（3）：e1004755.Epub 2015/03/26.pmid：25806948。

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

13.加西亚-鲁伊斯 H， 武田 A， 查普曼 EJ， 沙利文 CM， 法尔格伦 N， 布雷姆佩利斯 KJ， 等.拟南芥RNA依赖性RNA聚合酶和切丁样蛋白在萝卜花叶病毒感染期间的抗病毒防御和小干扰RNA生物发生。植物细胞。2010;22(2):481–96.Epub 2010/03/02.普米德：20190077。

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

14.王晓波， 吴琪， 伊藤涛， 西洛 F， 李伟兴， 陈晓， 等. RNAi介导的病毒免疫需要扩增拟南芥中的病毒来源siRNA。美国国家科学院院刊， 2010;107（1）：484–9.Epub 2009/12/08.pmid：19966292。

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

15.Donaire L，Barajas D，Martinez-Garcia B，Martinez-Priego L，Pagan I，Llave C.烟草拨浪鼓病毒衍生的小干扰RNA的生物发生的结构和遗传要求。J 维罗尔。2008;82(11):5167–77.Epub 2008/03/21.PMID：18353962。

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

16.雅库别克， 杨伟， 蔡新.拟南芥DRB4蛋白在抗萝卜黄花叶病毒感染中的抗病毒防御。植物学报 2012;69（1）：14–25.Epub 2011/09/03.噗：21883552。

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

17.Martinez-Priego L，Donaire L，Barajas D，Llave C.沉默烟草拨浪鼓病毒编码的16-kDa蛋白的抑制活性并干扰内源性小RNA引导的调节途径。病毒学。2008;376(2):346–56.Epub 2008/05/06.pmid：18456303。

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

18.病毒毒力蛋白抑制RNA沉默介导的防御，但上调microRNA在宿主基因表达中的作用。植物细胞。2004;16:1302–13.密码：15100397

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

19.沙曼迪 N， 齐特尼基 M， 夏博内尔 C， 埃尔维拉-马特洛特 E， 博赫纳基安 A， 科梅拉 P， 等.植物编码由病毒诱导和抑制的通用siRNA抑制子。公共科学图书馆生物学. 2015;13（12）：e1002326.密码：26696443

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

20.Gy I， Gasciolli V， Lauressergues D， Morel JB， Gombert J， Proux F， et al.拟南芥FIERY1，XRN2和XRN3是内源性RNA沉默抑制因子。植物细胞。2007;19(11):3451–61.密码：17993620

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

21.莫雷诺AB，马丁内斯德阿尔巴AE，巴尔杜F，克雷斯皮医学博士，沃切雷特H，麦泽尔A等。单链RNA的细胞质和核质量控制和周转调节植物转录后基因沉默。核酸研究 2013;41（8）：4699–708.Epub 2013/03/14.PMID：23482394。

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

22.Yu A， Saudemont B， Bouteiller N， Elvira-Matelot E， Lepere G， Parent JS， et al. 亚态性argonaute1等位基因的第二位点诱变将SUPERKILLER3鉴定为转基因转录后基因沉默的内源性抑制因子。植物生理学. 2015;169（2）：1266–74.Epub 2015/08/20.普米德：26286717。

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

23.贝克林 C， 布特 S， 沃特豪斯 P， 沃切雷特 H.植物中转基因诱导RNA沉默的分支途径。当代生物学. 2002;12（8）：684–8.密码：11967158

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

24.Mlotshwa S， Pruss GJ， Peragine A， Endres MW， Li J， Chen X， et al. DICER-LIKE2在拟南芥转基因的传递沉默中起主要作用。公共图书馆一号。2008;3（3）：e1755.Epub 2008/03/13.pmid：18335032。

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

25.博扎斯CS，魏兰德JJ，德雷尔·萝卜黄花叶病毒ORF-69的表达是病毒在植物中传播所必需的。病毒学。1992;187(1):124–30.Epub 1992/03/01.pmid：1736523。

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

26.Taochy C， Gursanscky NR， Cao J， Fletcher SJ， Dressel U， Mitter N， et al.受损系统RNAi的遗传筛选突出了DICER-LIKE 2的关键作用。植物生理学. 2017;175（3）：1424–37.Epub 2017/09/21.pmid：28928141。

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

27.Adenot X， Elmayan T， Lauressergues D， Boutet S， Bouche N， Gasciolli V， et al. DRB4依赖性TAS3反式作用siRNA通过AGO7控制叶片形态。当代生物学. 2006;16（9）：927–32.噗：16682354。

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

28.埃尔马扬 T， 阿德诺特 X， 吉索 L， 劳雷塞格斯 D， Gy I， 沃切雷特 H.稳定miRNA切割产物的新形态sgs3等位基因揭示了SGS3作为同源二聚体。2009 年 276 月杂志;3（835）：44–2009.Epub 01/16/19143842.pmid：<>。

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

29.Glick E， Zrachya A， Levy Y， Mett A， Gidoni D， Belausov E， et al.与宿主SGS3的相互作用是抑制番茄黄叶卷曲病毒V2蛋白RNA沉默所必需的。美国国家科学院院刊， 2008;105（1）：157–61.Epub 2008/01/01.PMID：18165314。

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

30.Jouannet V，Moreno AB，Elmayan T，Vaucheret H，Crespi MD，Maizel A.细胞质拟南芥AGO7积累在膜相关的siRNA小体中，是ta-siRNA生物发生所必需的。EMBO J. 2012;31（7）：1704–13.Epub 2012/02/14.pmid：22327216。

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

31.Kumakura N，Takeda A，Fujioka Y，Motose H，Takano R，Watanabe Y.SGS3和RDR6在细胞质SGS3 / RDR6小体中相互作用和共定位。2009;583（8）：1261–6.Epub 2009/04/01.PMID：19332064。

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

32.Weber C，Nover L，Fauth M.植物胁迫颗粒和mRNA加工体与热应激颗粒不同。植物学报 2008;56（4）：517–30.Epub 2008/07/23.pmid：18643965。

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

33.倪芳， 吴林， 王琪， 洪军， 齐轩， 周旭. 萝卜黄花叶病毒P69与GLK转录因子相互作用并抑制，引起拟南芥淡绿色症状。摩尔植物。2017;10(5):764–6.Epub 2016/12/15.PMID：27964999。

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

34.德阿西斯菲略FM，舍伍德JL。萝卜黄花叶病毒和烟草花叶病毒在拟南芥种子传播的评价.植物病理学。2000;90(11):1233–8.Epub 2008/10/24.pmid：18944425。

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

35.邓 X， 凯洛涅米 J， 海科宁 T， 沃里宁 AL， 埃洛玛 P， 泰里 TH， 等.烟草摇铃病毒RNA1作为VIGS载体的修饰表明，29K运动蛋白是病毒的RNA沉默抑制因子。摩尔植物微生物相互作用。2013;26(5):503–14.Epub 2013/01/31.pmid：23360458。

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

36.冈野Y， 千树H， 桥本M， 奈谷Y， 根津O， 港N， et al.在植物中，通过Potexvirus RNA沉默抑制因子识别双链RNA合成蛋白复合物。植物细胞。2014;26(5):2168–83.Epub 2014/06/01.普米德：24879427。

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

37.郭华， 宋鑫， 谢玲， 霍莹， 张芳， 陈旭， 等.水稻黄特技横纹病毒蛋白 6 通过阻断 RDR6 介导的二级 siRNA 合成来抑制系统性 RNA 沉默。摩尔植物微生物相互作用。2013;26(8):927–36.Epub 2013/05/03.PMID：23634838。

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

38.植物DNA病毒卫星抑制RNA沉默需要宿主钙调蛋白样蛋白来抑制RDR6表达。公共科学图书馆病理学。2014;10（2）：e1003921.Epub 2014/02/12.PMID：24516387。

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

39.任斌， 郭毅， 高峰， 周萍， 吴峰， 孟志， 等.水稻矮植物病毒Pns10抑制系统RNA沉默的多种功能。J 维罗尔。2010;84(24):12914–23.Epub 2010/10/12.普米德：20926568。

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

40.莫雷尔 JB， 戈登 C， 莫兰 P， 贝克林 C， 布特 S， 费尔巴哈 F， 等.可育的亚态性ARGONAUTE（ago1）突变体在转录后基因沉默和病毒抗性中受损。植物细胞。2002;14(3):629–39.噗嗤：11910010。

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

41.Mourrain P， Beclin C， Elmayan T， Feuerbach F， Godon C， Morel JB， et al.拟南芥SGS2和SGS3基因是转录后基因沉默和天然病毒抗性所必需的。细胞。2000;101(5):533–42.密码：10850495

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

42.中泽Y， 平栗A， 森山H， 福原T.dsRNA结合蛋白DRB4在体内与Dicer样蛋白DCL4相互作用，并在反式作用siRNA途径中发挥作用。植物分子生物学. 2007;63（6）：777–85.PMID：17221360。

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

43.谢 Z， 艾伦 E， 威尔肯 A， 卡灵顿 JC.DICER-LIKE 4在拟南芥反式作用的小干扰RNA生物发生和营养相变中起作用。美国国家科学院院刊， 2005;102（36）：12984–9.PMID：16129836。

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

44.谢 Z， 约翰森 LK， 古斯塔夫森 AM， 卡肖 KD， 莱利斯 AD， 齐尔伯曼 D， 等.植物中小RNA途径的遗传和功能多样化。公共科学图书馆生物学. 2004;2：642–52.pmid：15024409

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

45.Pflieger S， Blanchet S， Camborde L， Drugeon G， Rousseau A， Noizet M， et al.使用“一步法”TYMV衍生载体在拟南芥中进行有效的病毒诱导基因沉默。植物学报 2008;56（4）：678–90.Epub 2008/07/23.pmid：18643968。

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

46.格雷芬 C， 唐纳德 N， 桥本 K， 库德拉 J， 舒马赫 K， 布拉特 MR.基于泛素-10启动子的荧光蛋白标记载体集有助于瞬时和稳定表达研究中的时间稳定性和天然蛋白分布。植物学报 2010;64（2）：355–65.Epub 2010/08/26.pmid：20735773。

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

47.克拉夫SJ，弯曲的AF。花蘸：农杆菌介导拟南芥转化的简化方法。植物学报 1998;16（6）：735–43.pmid：10069079。

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

48.埃尔维拉-马特洛特 E， 哈歇特 M， 沙曼迪 N， 科梅拉 P， 赛斯-巴斯克斯 J， 齐特尼基 M， 等.拟南芥RNASE THREE LIKE2通过24核苷酸小干扰RNA定向DNA甲基化调节蛋白质编码基因的表达。植物细胞。2016;28(2):406–25.Epub 2016/01/15.PMID：26764378。

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

49.傅大庆， 朱斌忠， 朱海， 蒋伟， 罗玉波.病毒诱导的番茄果实基因沉默。植物学报 2005;43（2）：299–308.Epub 2005/07/07.PMID：15998315。

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

50.马洛里AC，欣泽A，塔克MR，布切N，加西奥利V，埃尔马扬T等。ARGONAUTE蛋白AGO1和ZLL在发育和小RNA定向基因沉默中的冗余和特异性作用。公共科学图书馆热内特。2009;5（9）：e1000646.pmid：19763164。

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

51.Shirima RR， Maeda DG， Kanju E， Ceasar G， Tibazarwa FI， Legg JP.通过实时qPCR对木薯褐条纹病毒mRNA进行绝对定量。J 病毒方法。2017;245:5–13.Epub 2017/03/21.pmid：28315718。

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索