模块化CRISPR筛选可识别导致HIV-1潜伏期的个体和组合途径
谢婷婷,德里克·詹森斯,帕特里克·帕迪森,爱德华·布朗,史蒂夫·海尼科夫,莫莉·欧安勒,迈克尔·埃默曼
发布时间:27 年 2023 月
抽象
潜伏HIV-1前病毒的转录沉默需要复杂和重叠的机制,这对体内消除HIV-1构成了主要障碍。我们开发了一种新的潜伏期CRISPR筛选策略,称为潜伏期HIV-CRISPR,它使用将编码慢病毒载体基因组的引导RNA包装到出芽病毒粒子的上清液中,作为维持HIV-1潜伏期所涉及的因素的直接读数。我们开发了一个针对表观遗传调控基因的定制指南RNA文库,并将筛选与和不使用潜伏期逆转剂AZD5582(非规范NFκB通路的激活剂)配对,以检查控制HIV-1潜伏期的机制组合。H4组蛋白乙酰化(NuA4 HAT)复合物的核小体乙酰转移酶ING3的组分与AZD5582协同作用,激活J-Lat细胞系中的前病毒和HIV-4潜伏期的原代CD1 + T细胞模型。我们发现ING3的敲除降低了H4组蛋白尾部的乙酰化和HIV-4 LTR上的BRD1占有率。然而,ING3敲除的组合伴随着通过AZD5582激活的非规范NFκB途径,导致HIV-1前病毒上RNA聚合酶II的起始和延伸急剧增加,其方式在所有细胞启动子中几乎是独一无二的。
作者摘要
HIV-1建立了长寿命的潜伏宿主,为根除病毒和治愈HIV提供了屏障。减少潜伏库的一种方法是使用称为潜伏逆转剂(LRA)的小分子来触发免疫介导的病毒产生细胞清除。然而,这种方法受到当前LRA无法重新激活大多数潜伏前病毒和缺乏特异性的限制,突出表明需要更好地了解维持HIV-1潜伏期所涉及的机制的相互作用。我们在潜伏感染的T淋巴细胞(J-Lat)模型中开发了一种基于CRISPR的模块化筛选,称为HIV-CRISPR,以获得HIV-1潜伏期所涉及的途径的全面表示。由于HIV-1的潜在状态由多种平行机制控制,我们使用筛选来研究存在针对转录激活机制的LRA的表观遗传因子。筛选确定了在 HIV-1 潜伏期的 J-Lat 和原代 T 细胞模型中控制 HIV-1 潜伏期的新因素。
引文: Hsieh E, Janssens DH, Paddison PJ, Browne EP, Henikoff S, OhAinle M, et al. (2023) 模块化 CRISPR 筛选可识别导致 HIV-1 潜伏期的个体和组合途径。公共科学图书馆病理学19(1): e1011101. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011101
编辑 器: Welkin E. Johnson,波士顿学院,美国
收到: 28月 2022, 5;接受: 2023月 27, 2023;发表: <>月 <>, <>
版权所有: ? 2023 谢等人这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章,该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制,前提是注明原作者和来源。
数据可用性: CRISPR筛选的原始数据可在 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE213995 CUT&Tag实验的原始测序数据可在 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE215430 所有其他数据可在手稿的补充表格中找到。S8 表中所有实验的原始数据。S1、S2、S3、S5、S6 和 S7 表中的 CRISPR 筛选数据和引物信息
资金: 这项工作由NIH资助:DP1 DA051110(ME),UM1-AI164567(ME,EPB),T32 AI 083203(EH),DK 119270(PJP),DK106829(PJP),AI143381(EPB),DA047023(EPB)和AI147877(MO);NSF:DGE-1256082(EH)和DGE-176211(EH);哈特韦尔基金会博士后奖学金(DHJ);和霍华德休斯医学研究所(SH)。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。
竞争利益: 提交人声明不存在相互竞争的利益。
介绍
有效的抗逆转录病毒治疗可将HIV-1病毒载量推高至检测不到的水平[1]。然而,抗逆转录病毒治疗并不能消除HIV-1感染者的病毒。ART中断后,病毒复制会从长寿命潜伏库快速反弹,该储存库主要存在于记忆CD4+ T细胞和其他细胞类型中[2]。这种具有复制能力的HIV-1前病毒潜伏库是完全清除HIV-1的重大障碍[3],清除或管理该潜伏库对于实现功能性治愈至关重要。
潜伏的HIV-1储库通常转录沉默,但在T细胞活化时可产生传染性病毒[4]。HIV-1潜伏期中前病毒的转录沉默取决于整合位点[5,6]和限制HIV-1前病毒基因组转录起始和延伸的宿主因素的广度(综述于[7])。小分子抑制剂或激活剂,称为潜伏逆转剂(LRA),已被证明可以在HIV-1潜伏期的细胞系模型中激活HIV-1病毒转录[8]以及源自HIV-1患者的原代细胞培养物[9,10]。AZD5582是第二种线粒体衍生的半胱天冬酶激活剂(SMAC)模拟物,是LRA的一个例子,通过激活非规范NFκB通路为潜伏期逆转提供一定的特异性[11]。在HIV-1潜伏期模型中,许多LRA在重新激活潜伏性HIV-1方面取得了成功,但即使是最成熟的LRAs,在临床试验中也只有适度或没有效果[12]。这突出了维持HIV-1潜伏状态所涉及的机制的复杂性,以及确定控制HIV-1潜伏期的新型表观遗传因子和转录机制的必要性。
关于宿主表观遗传调控HIV-1转录的功能作用的研究(综述于[7,13,14])已经鉴定出一些参与维持HIV-1潜伏期的特定宿主表观遗传调控基因。例如,H5组蛋白乙酰化(NuA4 HAT)复合物的核小体乙酰转移酶的KAT4在HIV-4前病毒LTR发现的H4组蛋白尾部(H1Ac)上沉积了独特的高谱乙酰化赖氨酸残基[9]。这导致募集含溴结构域4(BRD4)基因的长亚型[9,15,16]。此外,体外实验中的长BRD4亚型可作为与HIV-1反式激活剂Tat结合的阳性转录延伸因子b(P-TEFb)的竞争者[16]。BRD4还编码一种短亚型,将阻抑性BAF复合物募集到HIV-1前病毒中[17]。另一组通过抑制HIV-1转录与HIV-1潜伏期有关的基因编码Polycomb抑制复合物2(PRC2)的成分[10,18,19]。PRC2催化组蛋白H3赖氨酸27的甲基化以维持基因的转录抑制,包括整个发育过程中。此外,表观遗传调控沉默机制也针对未整合的HIV-1DNA,如CHAF1A和CHAF1B[20]。
使用基因筛查可有效以单基因方式揭示HIV-1潜伏期的途径[10,21-28]。在这里,我们试图创建一个基于CRISPR的新型筛选平台,该平台能够对多种途径进行快速,并行的评估,这些途径有助于维持HIV-1潜伏期,无论是否存在额外的LRA。我们推断,通过将一种机制的LRA与针对不同机制的CRISPR筛选相结合,我们可以发现潜伏期逆转途径,提高HIV-1 LTR的效力和特异性。我们建立了一种新的基于HIV的潜伏期CRISPR筛选策略,该策略使用J-Lat细胞[29,30]结合我们最近开发的HIV-CRISPR筛选方法[31],以使用潜伏前病毒的重新激活作为筛选的报告基因。为了确定有和没有LRAs激活潜在前病毒的表观遗传途径,我们生成了一个针对表观遗传调控基因的定制CRISPR文库,并在不存在和存在低激活剂量的AZD5582的情况下进行了筛选。在没有AZD5582的情况下,我们发现CUL3是E3泛素连接酶的支架,在J-Lat细胞和HIV-1潜伏期的原代CD4 + T细胞模型中都是一种新的HIV-1潜伏期维持和建立因子。此外,我们发现NuA4 HAT复合物对HIV-1潜伏期很重要。特别是,敲除NuA3复合物的一个亚基生长家庭成员抑制剂3(ING4)与AZD5582治疗相结合,导致J-Lat细胞中的病毒再激活增强和HIV-4潜伏期的初级CD1 + T细胞模型。通过使用自动CUT&Tag来研究全基因组染色质占用[32],我们发现单独使用ING3敲除并与AZD5582治疗相结合可降低HIV-4 LTR的H4Ac和BRD1水平。然而,仅在ING5582敲除的背景下添加AZD3导致RNA聚合酶II丝氨酸5磷酸化(RNA-Pol2-S5p)在LTR上的占有率大幅增加,其方式在人类基因组中的所有启动子中几乎是独一无二的。同时,ING3敲除和AZD5582处理的组合导致前病毒体内RNA-Pol2-S5p和RNA-Pol2-S2p的增加,这表明转录起始和伸长增加,并与病毒再激活的增加相关。我们新颖的潜伏期HIV-CRISPR筛查方法为探索共同作用以促进HIV-1潜伏期的因素提供了一种途径。
结果
潜伏期HIV-CRISPR识别维持HIV-1潜伏期所涉及的新表观遗传因素
我们的目标是建立一种高通量CRISPR-Cas9敲除策略,用于研究HIV-1潜伏期表观遗传调控的复杂性。我们利用了先前描述的HIV-CRISPR载体[31],这是一种基于慢病毒的载体,具有两个完整的LTR,一个包装信号Cas9和一个单向导RNA(sgRNA)文库。HIV-CRISPR载体的独特之处在于,在存在具有复制能力的HIV-1的情况下,HIV-CRISPR载体的基因组被转录成RNA,并以反式包装成HIV-1病毒粒子。我们推断,在J-Lat细胞(一种体外T淋巴细胞HIV-1潜伏期模型,其携带近全长的HIV-1前病毒)中,任何在HIV-CRISPR基因组中编码的靶向候选HIV-1潜伏基因的sgRNA将被包装到重新激活的病毒颗粒中,分泌并在病毒上清液中富集(图1A).因此,来自HIV-CRISPR潜伏期筛选的病毒上清液的RNA可以进行下一代测序,以确定富含病毒颗粒的sgRNA,从而鉴定参与HIV-1潜伏期维持的候选基因。这导致基因敲除的直接读数,该基因敲除包含功能性再激活活性。
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图1. 潜伏期HIV-CRISPR屏幕。
(A)总结J-Lat细胞系中潜伏期HIV-CRISPR筛选的示意图,显示了潜在的整合前病毒和HIV-CRISPR载体,其传递Cas9和sgRNA并产生可包装的基因组RNA。红框代表靶向目的基因的基因或sgRNA;灰色框代表载体和前病毒两侧的功能性HIV-1 LTR;三角形代表sgRNA和Cas9转录的内部启动子。(B)人类表观基因组(HuEpi)sgRNA文库靶向基因的分类分布。(C)HuEpi sgRNA文库靶向基因的Metascape基因本体(GO)分析[44]。(D)从J-Lat HuEpi敲除细胞池的生成到病毒RNA(vRNA)库与基因组DNA(gDNA)库中发现的guideRNA丰度的测序和比较的工作流程摘要。相对于基因组DNA富集在病毒上清液RNA中的GuideRNA代表敲除后导致潜伏期逆转的基因。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011101.g001
为了专门研究参与维持HIV-1潜伏期的宿主表观遗传调控因子,我们生成了一个定制的人类表观基因组特异性sgRNA CRISPR文库(HuEpi)。该文库包含靶向表观基因组因子的sgRNA,例如组蛋白、组蛋白结合剂(例如组蛋白读取器和伴侣)、组蛋白修饰剂(例如组蛋白写入器和橡皮擦)和一般染色质相关因子(例如,RNA和DNA修饰剂)(图1B和1C)。该文库中的大多数靶向基因都来自EpiFactor数据库[33]。我们还添加了组蛋白和其他手工选择的基因调控复合物。整个文库包含5,309个sgRNA,靶向841个基因(每个基因6个sgRNA,少数例外)和252个非靶向对照(NTC)[34](S1表)。相对于全基因组筛选,文库的小尺寸提高了整个CRISPR筛选过程中所有sgRNA高覆盖的可能性。
来自HuEpi文库的sgRNA序列被批量克隆到HIV-CRISPR载体中,随后将慢病毒文库以低MOI(MOI = 0.4)转导到J-Lat细胞中(图1D-1)。我们转导了两个独立的J-Lat细胞系,J-Lat 10.6 [29]和J-Lat 5A8 [30]细胞,每个细胞都有不同的前病毒整合位点。与其他细胞系模型相比,J-Lat 5A8细胞对LRA的反应更类似于原代CD4+ T细胞HIV-1潜伏期模型[35]。此外,由于ZAP介导的HIV-CRISPR载体抑制,宿主限制因子锌抗病毒蛋白(ZAP)的敲除已被证明可以提高筛选性能[31],因此我们在克隆ZAP敲除J-Lat 10.6和J-Lat 5A8细胞中生成并进行了筛选。然后将转导的细胞进行10-14天的嘌呤霉素选择,然后收获细胞和病毒上清液并通过sgRNA的下一代测序进行处理,以鉴定候选的HIV-1潜伏基因(图1D-3)。从细胞沉淀中提取基因组DNA,以确定转导的sgRNA文库中每个sgRNA的基线表示。从浓缩的病毒上清液中提取病毒RNA,以鉴定促进潜伏HIV-1前病毒转录再激活的sgRNA群体(图1D-4)。使用MAGeCK管道[36],我们通过选择病毒RNA的sgRNA计数与基因组DNA中的sgRNA计数相比富集的基因,确定了候选的HIV-1潜伏期维持因子。病毒RNA中sgRNA计数增加的基因,相当于倍数变化的增加,预计将在维持HIV-1潜伏期中发挥作用。
总体而言,与NTC相比,J-Lat 10.6和J-Lat 5A8细胞系的潜伏期HIV-CRISPR筛选结果表明,特异性sgRNA的富集显着增加。我们比较了NTCs的对数倍数变化(LFC)与靶向sgRNA的基因的分布。虽然大多数靶向sgRNA的基因的LFC聚集在NTC的中位数LFC周围,但我们观察到,与基于Welcht检验的NTC群体的平均值相比,靶向sgRNA的基因子集显着不同(图2A)。我们的重点是高度富集的异常值sgRNA,因为这些是靶向潜在HIV-1潜伏期维持因子基因的目标sgRNA。
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图2. GuideRNA水平富集在潜伏期HIV-CRISPR筛选中感兴趣的已知和新基因。
(A)指南RNA富集(日志)2与非靶向对照(NTC)指南相比,HuEpi sgRNA文库靶向基因的两个J-Lat细胞系中的倍数变化。为了进行统计分析,将HuEpi基因sgRNA与NTC对照进行比较。韦尔奇 t 检验,p 值< 0.0001。(B)在潜伏期HIV-CRISPR筛选中已知的HIV-1潜伏期维持因子BRD4,KAT5和PRC2复合物成员(EZH2,SUZ12和EED)的GuideRNA水平富集。对于统计分析,将所有条件与NTC对照进行比较。每个点代表一个靶向指示基因的单个guideRNA。韦尔奇 t 检验,p 值 = <0.05 = *,= <0.01 = **,= <0.001 = ****。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011101.g002
To determine top candidate genes from the Latency HIV-CRISPR screen, we ranked the genes by MAGeCK gene score. For both J-Lat cell lines, we observed that many genes were significantly enriched compared to the NTCs. We identified eight epigenetic HIV-1 latency maintenance genes as our top hits as defined by a false discovery rate (FDR) of less than 10% (FDR < 10%) in both J-Lat 10.6 and J-Lat 5A8 cell lines (Fig 3A). BRD4 and KAT5 are two host factors previously reported to silence HIV-1 transcription ([16, 17, 37] and [9], respectively), and in our screen, the sgRNAs targeting BRD4 and KAT5 are significantly enriched compared to the non-targeting sgRNAs in both J-Lat cell lines (Fig 2B and S2 Table). In addition to individual genes, the Latency HIV-CRISPR screen also identified genes encoding subunits of protein complexes important to HIV-1 latency. PRC2 has also been previously reported to silence HIV-1 transcription [8, 10] and members of the complex including EZH2, the catalytic component, and SUZ12 and EED showed a trend of enrichment in our screen (Fig 2B and S2 Table). Thus, our Latency HIV-CRISPR screen system identifies bona fide HIV-1 latency maintenance factors.
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图3. J-Lat 10.6和J-Lat 5A8细胞中的潜伏期HIV-CRISPR筛选识别出一组相互的,新颖的命中。
(A) 日志10计算并显示HuEpi sgRNA文库靶向的每个基因的MAGeCK分数(黑色圆圈和红色三角形)和NTC(灰色方块)。基因名称被标记为在两种 J-Lat 细胞系中具有 <10% 错误发现率 (FDR) 的命中((B) 中的维恩图中心);红色三角形代表NuA4 HAT复合体和SRCAP复合体的成员。NTC是通过NTC sgRNA序列的迭代分箱设计的人工NTC基因(参见方法)。基因在x轴上随机化,但右面板和左面板使用相同的顺序。y 轴是逆对数10的 MAGeCK 分数。(B)每个J-Lat细胞系共有和独特的顶级命中基因(<10%FDR)按显著性和FDR排序,列表顶部具有最高显着性和最低FDR。(C)该基因的Metascape GO分析[44]在每个J-Lat细胞系中具有<10%的FDR。(D) 对数分析10与NTCs相比,NuA4 HAT和SRCAP复合物重叠且独特的基因的MAGeCK评分。数字越大,命中的统计显著性就越高。红色字体表示得分高于平均NTC评分的基因。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011101.g003
潜伏期HIV-CRISPR筛选可识别NuA4复合体和CUL3的多个成员
为了确定最佳候选HIV-1潜伏基因,我们使用MAGeCK分析将guideRNA数据整合到基因水平[36](图3A和S3表)。由于我们主要对独立于整合位点的命中感兴趣,我们认为顶级基因命中率是FDR<10%并且在J-Lat 10.6和J-Lat 5A8细胞系之间共享的命中率(图3B,维恩图中间)。我们发现,一部分基因以前曾与HIV-1潜伏期有关,而据我们所知,其他顶级基因以前并未在HIV-1潜伏期的背景下进行研究(S4表)。
我们观察到H4核小体乙酰转移酶(NuA4)复合物的多个成员在筛选中得分很高(图3A)。NuA4复合物在真核生物[38]和乙酰化组蛋白H4[39]中高度保守,并且与许多基因组过程有关,包括DNA损伤修复和转录[40]。作为NuA4复合物一部分的许多蛋白质也与SNF2相关CBP激活蛋白(SRCAP)复合物重叠,后者将规范核小体的H2A与H2A交换。Z变体[41-43]。顶级基因命中率(FDR<每个J-Lat细胞系为44%)的基因本体(GO)富集分析[10]表明,SRCAP相关的染色质重塑复合物在两种J-Lat细胞系中都高度富集(图3C),并且与总HuEpi文库的整体GO分布不同(图1C),证明了针对特定途径特异性富集的筛选。根据MAGeCK基因评分,编码NuA8 HAT和SRCAP复合物之间重叠蛋白质的七个基因中的六个(BRD1,DMAP2,RUVBL6,ACTL72A,VPS4和YEATS4)得分高于NTC的MAGeCK得分中位数(图3D)。唯一的例外是J-Lat 1.10屏幕中的RUVBL6,其得分低于NTC中位数MAGeCK分数(RUVBL1 = 0.318 vs NTC中位数= 0.518)。此外,每种复合物特有的大多数基因在两种细胞系中的MAGeCK评分也高于NTC中位数。NuA4 HAT复合物特有的基因包括TRRAP、EP400、EPC2、KAT5、ING3、MORF4L1、MORF4L2、MEAF6和MBTD1,SRCAP复合物特有的基因包括SRCAP和ZNHIT1(图3D ).该分析表明,潜伏期HIV-CRISPR筛选策略可以超越识别感兴趣的单个基因,扩展到编码相关复合物的基因组,这可以进一步阐明维持HIV-1潜伏期所涉及的机制。
为了验证顶部屏幕命中率,偏向于以前未与HIV-1潜伏期有关的那些(S4表),我们为每个基因生成了四个单独的J-Lat 10.6和5A8敲除细胞系(每个基因两个sgRNA)。由于转导的细胞被检测为基因敲除池,因此我们使用CRISPR编辑推断(ICE)程序同时测量了批量CRISPR编辑效率[45]。我们产生的异质细胞系的敲除效率在32%至83%之间变化(图4A)。最近的一项研究表明,中位敲除率为35%的效率较低,但仍具有有意义的效果[45]。作为阳性对照,我们使用了两种靶向NFκBIA的sgRNA,一种NFκB抑制剂,以及一个未包含在HuEpi文库中的基因。在J-Lat细胞中敲除NFκBIA后,我们预计HIV-1转录活性会增加,从而导致病毒产生。作为阴性对照,我们使用了两种不靶向人类基因座的NTC sgRNA。为了评估J-Lat细胞的潜伏期逆转,我们测量了上清液中的HIV-1逆转录酶活性,这是病毒转录,翻译和出芽步骤发生后病毒产生的读数。该定量是在基因敲除后10-14天进行的,由于J-Lat细胞中的前病毒在HIV-1 env中具有缺失,因此重新激活的病毒颗粒不会在培养物中扩散。此外,与J-Lat 5.8细胞系的前病毒相比,J-Lat 10A6细胞系的前病毒更难重新激活,这与J-Lat 5A8细胞系产生的再激活谱更类似于HIV-4潜伏期的原代CD1+ T细胞模型一致[35]。
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图4. 验证来自Latency HIV-CRISPR筛选的热门点击。
(A)通过用两种不同的引导RNA单独敲除每个J-Lat细胞系并通过量化病毒上清液的HIV-9逆转录酶活性来测量病毒再激活,从而验证潜伏期HIV-CRISPR筛选的前1个基因命中。NFκBIA敲除是一种阳性对照。来自释放病毒粒子的逆转录酶活性被标准化为NTC sgRNA转导的基础活性。对于每个敲除细胞系,进行ICE分析,平均敲除显示在饼图中。多个未配对 t 检验,p 值 = <0.05 = *。(B)CUL3敲除导致使用来自四个健康供体的细胞在HIV-4潜伏期的初级CD1 + T细胞模型中显着的病毒再激活。通过流式细胞术测量病毒再激活,并归一化为AAVS1敲除细胞。配对 t 检验,p 值 = <0.05 = *,= <0.01 = **。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011101.g004
与用NTC sgRNA转导的细胞系相比,我们发现单独敲除所有八个新的候选基因命中会导致我们测试的至少一个J-Lat细胞系的显着潜伏期逆转(图4A)。事实上,基因敲除细胞系的一些逆转录酶测量结果与NFκBIA的阳性对照敲除相当。此外,我们证实,敲除我们筛选中得分最高的基因KAT5,先前报道的HIV-1潜伏期维持因子[9],导致两种J-Lat细胞系中的病毒再激活(图4A)。此外,编码上述NuA4 HAT和SRCAP复合物蛋白质成分的基因ACTL6A,DMAP1,VPS72和YEATS4也都验证为J-Lat细胞中的潜伏期维持因子(图4A)。ACTL6A敲除导致特别高水平的HIV-1再激活,这可能是ACTL6A编码一种蛋白质的结果,该蛋白质是NuA4 HAT和SRCAP复合物的亚基(图3D)。在这项功能研究中验证的其他基因包括DMAP1,它编码一种蛋白质,该蛋白质与DNMT1形成复合物以介导转录抑制[46],并且在一些研究中已被描述为在HIV-1潜伏期中发挥作用[14]和TAF5,其在支架形成中起作用,并且是一般转录因子TFIID的关键亚基。
由于CUL3是J-Lat 10.6和J-Lat 5A8细胞系中潜伏期HIV-CRISPR筛选中命中的顶级基因,并被验证为J-Lat细胞的潜伏期维持因子,因此我们在原代CD3 + T细胞HIV-4潜伏期模型系统的背景下进一步表征了CUL1。CUL3是cullin家族的一部分,是Cullin-RING E3连接酶复合物的支架,其泛素化蛋白质[47]。对于我们的原代细胞HIV-1潜伏期模型系统,我们使用了源自先前建立的系统双HIV-1报告病毒(pNL4-3-Δ6-dreGFP-CD90)[48,49]。在这里,报告病毒已被修改为编码不稳定的eGFP基因和小鼠Thy1.2(CD90.2)基因,它们由IRES分离,并且两个报告基因都受到HIV-1 LTR的控制[50]。由于小鼠Thy1.2报告基因的半衰期长且翻转缓慢,因此它可以作为确定被报告病毒(Thy1.2+)感染的细胞的标记。在受感染的细胞(Thy1.2+)中,半衰期短的eGFP报告基因可作为标记物,以确定主动转录或主动感染的细胞(Thy1.2+,GFP+)与最小转录或潜伏感染的细胞(Thy1.2+,GFP-)。我们使用Cas3-gRNA核糖核蛋白(RNP)和4种不同的sgRNA在原代CD1 + T细胞HIV-9潜伏期模型中敲除CUL3。作为阴性对照,AAVS1基因被靶向敲除,该基因处于“安全港”位点,该基因的破坏不会对细胞产生不利影响[51]。
我们预计,如果CUL3在HIV-1潜伏期建立中发挥作用,那么与阴性对照(AAVS3)敲除细胞相比,CUL1敲除细胞中的再激活群体将更高。我们从四个健康供体那里获得了CD4 + T细胞,并用双重报告病毒感染细胞。事实上,在进行所描述的CRISPR / Cas9介导的敲除并测量报告病毒的功能输出时,我们观察到与AAVS3敲除相比,所有四个供体的CUL1敲除都导致HIV-1重新激活并随后减少潜伏群体(图4B和S1A).这表明CUL3对底物的翻译后泛素修饰可能有助于HIV-1潜伏期的建立和维持。此外,这些数据表明,潜伏期HIV-CRISPR筛选策略可有效识别已在多个系统中验证的新型表观遗传HIV-1潜伏期维持基因。
LRA 潜伏期 HIV-CRISPR 筛查揭示了在 HIV-1 潜伏期再激活期间共同起作用的监管变化
这种潜伏期HIV-CRISPR筛选方法的一个关键扩展是能够结合表观遗传调控因子检查其他转录机制。因此,为了将HIV-1潜伏期作为一种多种并行机制的状态来解决,我们通过用低激活剂量的LRA处理人类表观基因组(HuEpi)敲除细胞库来修改筛选。目标是确定基因敲除和LRA之间的组合实例,导致病毒再激活显着增加(即筛选中的最高点击率)。作为原理证明,我们使用了最近发现的LRA,AZD5582,它是一种SMAC模拟和非规范的NFκB通路激活剂[11]。我们首先通过使用两种J-Lat细胞系进行HIV-10病毒再激活剂量曲线(S5582A图)来确定1nM AZD2作为LRA的低活化剂量。将图3中描述的潜伏期HIV-CRISPR筛选中使用的相同HuEpi敲除细胞池用24nM的AZD10并行处理5582小时(图1D-2)。这允许鉴定表观遗传调控基因,这些基因在敲除时与AZD5582靶向的转录起始途径相结合,导致病毒再激活的显着增加。
在两种J-Lat细胞系中,AZD5582 LRA潜伏期HIV-CRISPR筛选最突出的命中是生长家庭成员抑制剂3(ING3),这是一种新型HIV-1潜伏因子(图5A和S5和S6表)。我们将LRA潜伏期HIV-CRISPR筛查结果与没有LRA的潜伏期HIV-CRISPR筛查结果进行了比较。总体而言,在存在和不存在AZD5582的情况下,潜伏期HIV-CRISPR筛选之间的许多基因命中重叠(图5B)。例如,先前鉴定的KAT5基因和我们在图4中验证的基因,包括DNMT1,YEATS4和ACTL6A,NuA4复合物的所有亚基,仍然是顶级基因命中,这表明这些基因在HIV-1潜伏期维持中广泛发挥作用,无论非规范NFκB途径的激活如何。我们还观察到,在没有AZD3的情况下,屏幕特有的最高命中CUL5582在存在AZD5582的屏幕中相对耗尽(图5B)。这表明在HIV-5582潜伏期逆转的背景下,AZD3非规范NFκB函数和CUL1函数之间可能存在重叠。然而,由于ING3是在AZD5582存在下筛选特有的顶级基因,我们试图对该基因进行额外的验证。
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图5. LRA潜伏期HIV-CRISPR筛选将ING3与AZD5582组合识别为HIV-1潜伏期维持因子。
(A)ING3是LRA潜伏期HIV-CRISPR筛选的热门产品。潜伏期HIV-CRISPR筛选的HuEpi敲除细胞用低活化剂量(10nM)的AZD5582处理。日志10计算并显示HuEpi sgRNA文库靶向的每个基因的MAGeCK评分(在y轴上)(黑色圆圈)和NTC(灰色方块)。基因名称被标记为在每个 J-Lat 细胞系中具有 <10% 错误发现率 (FDR) 的命中。NTC是通过NTC sgRNA序列的迭代分箱设计的人工NTC基因(参见方法)。基因在x轴上随机化,但右面板和左面板使用相同的顺序。(B)在存在(y轴)和不存在AZD5582(x轴)的情况下,通过MAGeCK评分与HuEpi基因(圆圈)和NTC(灰色方块)进行比较。没有LRA(x轴)的屏幕数据来自图3,因为这两个屏幕是并行执行的。每个屏幕特有的基因最接近相应的轴,两个屏幕共有的基因位于中心。ING3 以长春花突出显示,CUL3 以绿色突出显示。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011101.g005
为了验证ING3,即AZD5582 LRA潜伏期HIV-CRISPR筛选中富集的顶级命中,我们在J-Lat 3.10和6A5细胞中生成了ING8敲除细胞系。同时,用NTC sgRNA转导的细胞系作为阴性对照产生。用或不用低再激活剂量(10nM)的AZD5582处理敲除细胞池24小时,然后通过HIV-1逆转录酶活性测量病毒再激活。根据筛选结果,我们假设与NTC sgRNA的转导相比,单独敲除ING3会导致一定程度的病毒再激活,但是在用低再激活剂量的AZD5582治疗后,病毒再激活将变得更加明显。与我们的假设一致,我们观察到在两种J-Lat细胞系中,用NTC sgRNA转导的细胞系的低再激活剂量AZD5582处理导致最小的病毒再激活,但ING3敲除细胞系的处理导致显着的,增加的病毒再激活(图6A)。这些结果表明,在HIV-3转录的再激活过程中,ING5582抑制和AZD1治疗之间存在机制相互作用。此外,我们在前面描述的原代CD4 + T细胞HIV-1潜伏期模型中观察到类似的趋势。在建立潜伏期模型的三个健康供体的CD4 + T细胞中,我们进行了独立的AAVS1和ING3敲除,然后进行了1μM AZD5582处理,并在ING3敲除和AZD5582处理的组合条件下观察到显着的病毒再激活(图6B和6C)。两种潜伏期模型中病毒再激活的增强表明,ING3的功能与AZD5582靶向的非规范NFκB通路之间可能存在相互作用,无论是在细胞系中还是在原代CD4 + T细胞中。
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Fig 6. Validation of ING3 in combination with AZD5582 as a HIV-1 latency maintenance factor.
(A)用1nM AZD3或等量体积的DMSO处理的J-Lat 10.6和5A8中NTC sgRNA转导或ING10敲除的病毒上清液的HIV-5582逆转录酶活性(y轴)。J-Lat 5A8 ING3 敲除细胞系的 ICE 敲除得分为 72,J-Lat 10.6 ING3 敲除细胞的 ICE 敲除得分为 66。ING3敲除和AZD5582治疗相结合,导致病毒再激活显着增加。配对 t 检验,p 值 = <0.05 = *,= <0.01 = **。(B) 用 DMSO 或 4 μM AZD1 处理的 AAVS1 或 ING3 敲除原代 CD1+ T 细胞 HIV-5582 潜伏期模型细胞的代表性流式细胞术图。Thy1.2-,GFP-细胞(象限4)未感染;Thy1.2+,GFP-(象限3)细胞感染双重报告HIV-1病毒并潜伏;Thy1.2+,GFP+细胞(象限2)被感染并重新激活。(C)在三个健康供体中对原代CD1 + T细胞HIV-3潜伏期模型细胞中的AAVS4和ING1进行独立敲除,每个敲除细胞池用DMSO或1μM AZD5582处理。再活化倍数变化基于Thy1.2+,GFP +细胞的百分比计算。然后将每种条件(敲除AAVS1或ING2和DMSO或1μM AZD3处理)的量化百分比Thy1.5582+,GFP +细胞标准化为AAVS1敲除DMSO治疗(阴性对照)条件。与敲除AAVS3相比,ING5582和AZD1治疗的敲除联合导致显着的再激活。配对 t 检验,p 值 = <0.05 = *。(D)在处理52nM AZD3后,在对照和ING10敲除J-Lat 6.5和8A10细胞系中检测到显示相似p5582水平的蛋白质印迹。非规范NFκB(NFκB2)途径的激活以p100的减少和p52的裂解产物的增加为标志。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011101.g006
由于AZD5582激活非规范NFκB通路,ING3敲除有可能增强这种活性,或者在HIV-1病毒再激活的背景下通过独立通路起作用。为了区分这两种可能性,我们测量了NFκB2产物的蛋白质水平,其中包括p100(细胞质NFκB2蛋白)和p52(易位到细胞核的切割和活性亚基)。正如预期的那样,在AZD5582处理时激活非规范NFκB途径导致裂解的p52产物增加,对照(NTC)细胞中p100产物减少(图6D)。我们发现对照和ING52敲除J-Lat细胞系中的p3水平相似(图6D),这表明除了非规范NFκB之外的另一种途径是导致HIV-1重新激活的主要驱动因素。我们还注意到,与J-Lat 100A5对照细胞相比,J-Lat 8A3 ING5敲除细胞中的p8条带非常微弱且减少(图6D)。总的来说,LRA潜伏期HIV-CRISPR筛查展示了同时检查多种机制的强大潜力,以更全面地了解支撑HIV-1潜伏期的机制,并进一步改善现有的LRA。
ING3敲除和AZD5582治疗的结合独特地导致HIV-2前病毒的RNA-Pol5-S1p水平显着增加
为了更好地了解AZD5582治疗和ING3敲除如何共同作用以促进潜伏HIV-1前病毒的再激活,我们通过执行自动CUT&Tag检查了HIV-1前病毒的染色质相关变化[32]。具体来说,我们在四种不同的条件下对J-Lat 10.6细胞系进行了全基因组分析:(i)NTC sgRNA与DMSO(NTC + DMSO)处理的NTC sgRNA转导,阴性对照(ii)NTC sgRNA的转导与10 nM AZD5582(NTC + AZD5582)处理(iii)ING3敲除与DMSO处理(ING3 KO + DMSO)(iv)ING3敲除与10 nM AZD5582(ING3 KO + AZD5582)处理。
ING3是NuA4 HAT复合物的已知成员,其功能是乙酰化组蛋白H4尾部[52]。BRD4与乙酰化的H4相互作用[9],已知BRD4的两种亚型都负调节HIV-1转录[16,17]。因此,我们的假设是,仅在ING3敲除和AZD5582治疗组合中鉴定的显着病毒再激活将与整合前病毒的H4乙酰化,BRD4和活性RNA聚合酶水平的变化相关。因此,我们使用识别乙酰化组蛋白H4(pan-H4Ac),BRD4,RNA-Pol2-S5p,RNA-Pol2-S2p以及非特异性IgG阴性对照的抗体在HIV-1前病毒基因组和全球人类基因组中进行了自动CUT&Tag。
在4 nM AZD1处理后,我们观察到泛H10Ac信号在HIV-5582 LTR上没有变化,但与ING3的已知功能一致,在ING3敲除时,在HIV-4 LTR处的泛H1Ac信号显着降低(p = 0.0061)(图7A和7B)。此外,ING3敲除与AZD5582治疗相结合,导致HIV-4 LTR处的泛H1Ac信号显着降低(p = 0.0415)(图7A和7B)。值得注意的是,仅在ING3敲除条件下,我们观察到HIV-4 LTR的U3区域(p = 1.0)的泛H0070Ac信号显着降低,以及包含HIV-4前病毒转录起始位点的HIV-5 LTR(p = 1.0)的R和U0126区域的泛H1Ac信号显着降低(图7A和7B)。当ING3敲除与AZD5582治疗相结合时,HIV-5 LTR的R和U1区域仅显着降低(p = 0.0016)(图7A和7B)。因此,在存在和不存在AZD3的情况下,ING4敲除似乎是HIV-1 LTR上泛H5582Ac水平变化的主要驱动因素。我们还发现,我们在ING4敲除条件下观察到的HIV-1 LTR泛H3Ac水平的降低与BRD4招募的减少有关。事实上,与NTC + DMSO相比,单独使用AZD5582治疗并不影响BRD4水平超过HIV-1 LTR;然而,在单独进行ING4敲除和与AZD3治疗联合使用的情况下,BRD5582水平均比LTR显着降低(分别为p = 0.0235,p = 0.0349)(图7C和7D)。在没有AZD5582的情况下,ING3敲除导致BRD4仅在LTR的U3区域上的占用率显着降低(p = 0.0219),而在AZD5582与ING3敲除联合存在的情况下,BRD4水平的降低仅在HIV-5 LTR的R和U1区域显着(p = 0.0159)(图7C和7D ).总之,我们的CUT&Tag结果表明,在ING4敲除有和没有AZD4治疗的情况下,泛H1Ac和BRD3水平在HIV-5582 LTR处相关。
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图 7. ING3敲除降低泛H4Ac和BRD4水平,并在加入AZD1后刺激HIV-5582转录起始和伸长。
(A)以HIV-1 LTR为中心的基因组浏览器轨迹显示,泛H4Ac信号在单独ING3敲除中以及与AZD5582条件相结合时降低。y 轴表示读取计数。由于 1' LTR 和 5' LTR 之间的 HIV-3 LTR 序列相同,因此 CUT&Tag 读数被组合到一个 LTR 上。LTR细分为三个区域:U3,R(包含转录起始位点)和U5。作为质量控制,我们从CUT&Tag数据中确定了pan-H4Ac的信号水平,并确认抗体的重复在pan-H4Ac重复中相关性最高(S3A图)。(B) 箱形图显示了在整个 LTR 上量化的泛 H4Ac 水平,包括 U3 区域和包含转录起始位点的 R+U5 区域。y轴是泛H4Ac碱基对覆盖率,归一化为整个基因组的总碱基对覆盖率。蓝色代表NTC sgRNA与DMSO治疗的转导;黄色代表NTC sgRNA的转导,处理10nM AZD5582;橙色代表治疗DMSO的ING3敲除;红色代表ING3敲除,处理10nM AZD5582。IgG n = 18 和泛 H4Ac n = 24 的重复。对于统计分析,将所有条件与NTC敲除和DMSO治疗对照进行比较。P 值 <0.05 = *,<0.005 = **。(C)基因组浏览器跟踪显示BRD4水平在单独ING3敲除中降低,并与AZD5582条件相结合。作为质量控制,我们从CUT&Tag数据中确定了BRD4的信号水平,并确认抗体的重复在BRD4重复中相关性最高(S3A图)。(D)与(B)相同,但量化BRD4水平。BRD4 n = 16 的重复。(E)基因组浏览器轨迹显示RNA-Pol2-S5p水平在HIV-1 LTR处增加,以及5' LTR下游的前病毒体(“前病毒体”),以及ING3敲除和AZD3处理组合后整合前病毒5582' LTR下游(“下游”)的宿主基因组区域。作为质量控制,我们从CUT&Tag数据中确定了RNA-Pol2-S5p的信号水平,并确认抗体的重复在RNA-Pol2-S5p重复中高度相关(S3B图)。(F)箱形图显示了HIV-2 LTR,前病毒体以及前病毒下游宿主基因组区域的RNA-Pol5-S1p CUT&Tag信号的定量。y轴是RNA-Pol2-S5p碱基对覆盖率,归一化为整个基因组的总碱基对覆盖率。蓝色代表NTC sgRNA与DMSO治疗的转导;黄色代表NTC sgRNA的转导,处理10nM AZD5582;橙色代表治疗DMSO的ING3敲除;红色代表ING3敲除,处理10nM AZD5582。RNA-pol2-S5p n = 13的重复。对于统计分析,将所有条件与NTC敲除和DMSO治疗对照进行比较。P 值 <0.05 = *, <0.005 = **, <0.0005 = ***。(G)基因组浏览器轨迹显示,在ING2敲除和AZD2治疗相结合后,HIV-1前病毒体以及前病毒下游宿主基因组的RNA-Pol3-S5582p水平增加。作为质量控制,我们从CUT&Tag数据中确定了RNA-Pol2-S2p的信号水平,并确认抗体的重复在RNA-Pol2-S2p重复中高度相关(S3B图)。(H)与(F)相同,但量化RNA-Pol2-S2p水平。RNA-Pol2-S2p n = 17的重复。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011101.g007
与独立于LRA治疗的HIV-4 LTR中泛H4Ac和BRD1 CUT&Tag水平的变化相反,我们发现转录起始和伸长标记物的显着差异,这是由Rpb1(分别为RNA-Pol2-S5p和RNA-Pol2-S2p)的RNA聚合酶II C末端结构域的磷酸化介导的[53]仅在ING3敲除与通过AZD5582处理的非规范NFκB途径的激活相结合的情况下(图 7E–7H)。具体来说,我们发现在HIV-2 LTR(p = 5.1E-4),前病毒体(“前病毒体”)(p = 2827.5E-8)和整合HIV-943前病毒下游区域(“下游”)(p = 5.1E-2)的RNA-Pol03-S5p信号显着增加,仅在ING3敲除细胞额外用AZD5582处理的情况下(图7E和7F)。相反,对于RNA-Pol2-S2p信号,在ING3敲除和AZD5582处理组合的细胞中,我们观察到前病毒体(p = 2.2)和下游区域(p = 0.0458E-3)中的RNA-Pol89-S5p信号显着增加,但没有超过LTR(图7G和7H)。有趣的是,在仅ING3敲除的中间条件下,RNA-Pol2-S2p的信号在HIV-1 LTR(p = 0.00583)处显着降低(图7G和7H)。RNA-Pol2-S2p信号的这种减少可能部分是由于我们在ING4敲除条件下在HIV-1 LTR处看到的泛H3Ac信号的伴随减少。在组合条件下,HIV-1逆转录酶活性的显着增加与我们的CUT&Tag结果一致,并表明ING3的敲除与AZD5582对非规范NFκB途径的刺激相结合,以促进HIV-2前病毒基因组上RNA-Pol5-S2p和RNA-Pol2-S1p的有效增加。
当我们观察到ING2敲除和AZD5联合治疗条件下最显着的RNA-Pol3-S5582p水平变化时,我们接下来询问增加的RNA-Pol2-S5p水平是否特定于HIV-1前病毒,或者这是否发生在全基因组范围内。我们将用AZD2处理的组合ING5敲除细胞中的RNA-Pol3-S5582p信号与对照(NTC + DMSO)条件进行了比较。我们发现HIV-2 LTR、前病毒体和下游区域的RNA-Pol5-S1p峰是RNA-Pol2-S5p信号增加最显着的峰之一(图8A)。然后,我们按对数对所有RNA-Pol2-S5p峰进行排序2-倍数变化发现,在2,547个总RNA-Pol2-S5p峰中,从最高到最低倍数变化排列的前三个峰是HIV-1前病毒体,HIV-1整合位点下游区域和HIV-1 LTR(图8B)。信号显著增加的两个RNA-Pol2-S5p峰和次高的倍数变化重叠HCG27(一种长非编码RNA)和HIST2H4A –HIST2H4B(人类基因组中组蛋白簇2的一部分)。用AZD2处理的ING5敲除细胞中RNA-Pol2-S5p信号减少最强的RNA-Pol3-S5582p峰与PCGF3重叠,PCGF1是Polycomb基团PRC8样复合物的一部分(图1B)。总体而言,这表明由ING3敲除与AZD5582治疗联合引起的HIV-2前病毒转录的增加,与RNA-Pol5-S10p标记相关,在人类基因组中具有高度特异性和几乎是独一无二的。因此,J-Lat 6.3细胞中的CUT&Tag数据显示,ING4敲除导致H4Ac和BRD1水平低于HIV-3 LTR,并且ING5582敲除与AZD1治疗相结合,显着增加HIV-<>前病毒的转录起始和转录延长,从而导致潜伏期逆转。
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图8. ING2敲除结合AZD5治疗后RNA-Pol3-S5582p水平的变化几乎是HIV-1前病毒独有的。
(A)比较NTC KO + DMSO(阴性对照)和ING2 KO + AZD5条件之间RNA-Pol3-S5582p峰的火山图。HIV-1 LTR(黄色圆圈)、前病毒体(绿色圆圈)和HIV-1前病毒下游区域(蓝色圆圈)上突出显示的峰是RNA-Pol2-S5p倍数变化最高的区域,并且非常显着。具有绝对日志的其他区域2倍数变化大于 1 和 -log10调整后的 p 值> 2 以粉色突出显示。(B)散点图显示所有RNA-Pol2-S5p峰排名按倍数变化排序。峰的颜色如(A)所示。前三个区域是HIV-1 LTR,HIV-1前病毒的身体和HIV-1前病毒的下游区域。接下来的两个区域重叠HCG27和跨越HIST2H2A-HIST4H2B的组蛋白簇4。RNA-Pol2-S5p信号减少最大的区域与PCGF3重叠。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011101.g008
讨论
这项工作的基础假设是,调节控制HIV-1 LTR驱动转录的多种重叠机制将增加HIV-1潜伏期再激活的效力和特异性。也就是说,目标是找到靶向潜伏HIV-1前病毒的有效转录激活的途径,而全球影响最小。我们设计并验证了一种模块化的CRISPR筛选方法,该方法使用将编码sgRNA的HIV-CRISPR基因组整合到出芽病毒粒子中,作为潜在前病毒激活的直接读数。潜伏期HIV-CRISPR筛选使用表观遗传调控基因的sgRNA文库,并与和不与LRA配对,AZD5582,以鉴定独立作用并与AZD1结合的HIV-5582潜伏因子。我们将ING3确定为仅在存在AZD5582的情况下敲除导致病毒再激活增加的基因。使用自动CUT&Tag,我们观察到这种增强与活性转录标记有关,如HIV-2基因组中RNA-Pol5-Ser2p和RNA-Pol2-Ser1p水平的增加所证明的那样,并且在机械上可能直接或间接依赖于组蛋白H4乙酰化和BRD4对HIV-1 LTR的占用减少。我们还验证了CUL3和NuA4 HAT复合体的多个成员作为HIV-1潜伏期维持因子。
具有特异性的途径组合以激活HIV-1转录
我们发现两种独立的机制 - ING3敲除和治疗低激活剂量的AZD5582 - 当它们结合起来时,对HIV-1 LTR具有独特的特异性影响。这些机制共同发挥作用,通过增加LTR和HIV-1前病毒体内启动和延长RNA-Pol2的存在来有效地激活HIV-1转录(图7)。在我们研究中使用的这些条件下,在整个基因组中倍数变化最高的RNA-Pol2-S5p峰位于HIV-1 LTR和前病毒体(图8)。通过CUT&Tag,RNA-Pol2-S5p似乎是J-Lat 1.10细胞系中HIV-6转录的主要标志物,这可能是HIV-1转录的主要伸长因子P-TEFb的结果,是一种CTD激酶,可以单独磷酸化Ser5和Ser2,但不能同时磷酸化[54]。我们的模型表明,HIV-4 LTR中NuA4乙酰化和BRD1依赖性占用的减少与响应ING3敲除和非规范NFκB途径激活的增强转录有关。
我们观察到组蛋白乙酰化和BRD4募集到HIV-1 LTR的减少,仅在ING2敲除和AZD3处理的组合下伴随RNA-Pol5582的启动和伸长增强。这表明HIV-1前病毒可能受到意想不到的转录控制。在大多数由RNA-Pol2驱动的哺乳动物转录单位中,NuA4 HAT主要定位于活性基因的启动子,特别是在转录起始位点周围[55-57]。NuA4 HAT优先乙酰化组蛋白H4[58],这种活性通常通过激活转录来影响基因表达的调节。此外,BRD4与乙酰化染色质结合[59],在有丝分裂过程中保持染色质结合[60,61],并通过与P-TEFb相互作用积极调节哺乳动物转录伸长[37,62]。 先前的工作已经表明,将其他HAT复合物(如p300/CBP和P/CAF)募集到HIV-1 LTR中,随后乙酰化与HIV-1转录的刺激而非沉默有关[63-69]。此外,在Tat非依赖性系统中使用体外核小体组装模板,NuA4 HAT激活HIV-1转录[70]。此外,在Tat存在的情况下,NuA4 HAT复合物与HIV-1转录的沉默有关。例如,在原代CD4+T细胞模型和ART治疗的HIV-1感染者的细胞中,由于H5乙酰化和BRD4长亚型占有率降低,以及HIV-1 LTR处超伸长复合物(SEC)成员水平升高,KAT4(NuA4 HAT复合物复合物)的催化成分的缺失促进了HIV-1转录的激活[9].此外,在HeLa细胞中存在Tat的情况下,BRD4已被证明不需要HIV-1转录[37],并且有可能与Tat竞争与P-TEFb结合[16,37]。 也许竞争模型可以解释为什么我们在ING4敲除和AZD3治疗中观察到的乙酰化和BRD5582水平降低与HIV-1转录的增加有关。重要的是,BRD4的缺失与P-TEFb的一个亚基CDK9结合的任何变化无关[71],因此BRD4水平的降低不太可能直接影响P-TEFb结合。相反,我们提出了一个模型,其中ING3的敲除导致H4乙酰化和BRD4的减少,由于染色质结合的空间机会增加,这增强了P-TEFb向TAR的Tat募集。此外,低活化剂量的AZD5582的治疗导致在HIV-2 LTR处募集蓄势待发的活性RNA-Pol1。因此,在ING3敲除和AZD5582治疗的独特组合中,我们观察到病毒转录的有效且几乎特异性的增加。
我们观察到响应ING4敲除,整个HIV-1 LTR的H3乙酰化减少,但在AZD5582的存在下,我们看到R和U4区域(包括HIV-4转录起始位点)的H5Ac信号和BRD1占用率最显着的降低。这一观察结果表明,当ING1敲除与AZD3治疗相结合时,HIV-5582转录起始位点的可及性增加可能会促进转录起始和伸长,最终导致我们在J-Lat细胞和原代CD4 + T细胞HIV-1潜伏期模型中观察到的增强的病毒再激活。此外,使用的AZD5582剂量为低再激活剂量,这表明通过并行抑制NuA4复合物,可以有效地激活HIV-1转录,同时对主机系统造成最小的破坏。HIV-1受到复杂的转录调控,这些结果强调了同时检查多种机制的重要性,以确定特异性刺激潜伏HIV-1前病毒转录的机会。这些结果在概念上与最近的一项研究相似,该研究发现AZD5582和I-BET151的组合在Jurkat潜伏期模型中独特地激活了HIV-1转录[72]。
为了支持这些机制几乎是HIV-1 LTR独有的假设,当ING2敲除与AZD5的低活化剂量治疗相结合时,宿主基因组中相对较少的位点显示RNA-Pol3-S5582p占用显着增加。其中一个区域位于J-Lat 1.10细胞中HIV-6前病毒整合位点的下游,也是SEC16A基因的一部分(图8)。由于整合前病毒的主动转录,人类基因在整合前病毒附近或处被激活是一种可能的情况,因为HIV-1优先整合到高度转录的基因中[73],并且将是用于根除潜伏性HIV-1宿主的任何再激活策略的不可避免的结果。在ING3敲除和AZD5582处理的组合条件下,另外两个位点,一个跨越HIST2H2A –HIST4H2B的组蛋白簇4区域和一个与长非编码RNA重叠的区域HCG27,也显示出RNA-Pol2-S5p水平的统计学显着,大倍变化,但这些变化并不像在HIV-1前病毒上观察到的变化那样突出(图8).此外,我们观察到基因PCGF3显着降低了RNA-Pol2-S5p的占有率,这可能有助于潜伏期逆转,因为它是具有沉默功能的非规范Polycomb组RING finger 3/5-PRC1复合物的一部分[74],并且参与了PRC1和PRC2的募集,这些基因已被证明有助于HIV-1前病毒沉默[8, 10,75]。
在没有LRA的情况下,来自潜伏期HIV-CRISPR筛查的其他HIV-1潜伏期维持因素
在没有LRA治疗的情况下,我们的潜伏期HIV-CRISPR筛选中点击最多的是CUL3,我们也在原代HIV-1潜伏期CD4 + T细胞模型中验证了CUL3。我们的数据与之前的工作一致,因为CUL1已被证明在生产性感染期间直接或间接通过NFκB途径负调节HIV-76转录,因为LTR处的NFκB/NFAT结合位点对于调节病毒转录至关重要[5582]。此外,当我们比较在存在和不存在AZD3的情况下进行的潜伏期HIV-CRISPR筛选的基因命中时,我们观察到CUL5582作为在AZD1存在下被击中的基因优先降低,这表明途径冗余。或者,泛素化已被证明参与HIV-1转录伸长的许多方面,例如HEXIM-7的泛素化以释放77SK的pTEFb[1],PJA2对HIV-78 Tat蛋白的泛素化以激活转录[1],因子的泛素化(HCF2/2)以稳定ELL79,ELL3是刺激转录伸长的超伸长复合物的一个亚基[<>].CUL<>可以在一种或多种这些底物的泛素化中发挥新的作用。
除CUL3外,还使用包括ACTL1A和SRCAP在内的两种J-Lat模型验证了其他几种HIV-6潜伏期维持基因(图4A)。J-Lat 6A5和8.10细胞中的ACTL6A敲除产生了最高水平的病毒再激活,这是通过HIV-1逆转录酶活性测量的(图4A)。ACTL6A,也称为BAF53A,是NuA4 HAT复合物的一个亚基,我们的筛选表明它完全负调节HIV-1转录(图3A)。ACTL6A也是BAF复合物的一个亚基,已被证明可以重新定位核小体-1,导致HIV-1 LTR的DNA可及性降低,这可能有助于维持抑制状态[80]。此外,ACTL6A 是 SRCAP 复合物的一个亚基,其功能是将组蛋白 H2A 与组蛋白变体 H2A 交换。Z [81] 和 NuA4 HAT 复合物可增强废料活性 [82]。有趣的是,我们的屏幕还识别了SRCAP复合体独有的命中,如SRCAP(图3D)。我们假设ACTL6A在两个相关复合物中的作用可能是响应ACTL1A敲除的高水平HIV-6再激活的原因。这些结果表明,SRCAP复合物和乙酰化组蛋白修饰的相互作用对于HIV-1潜伏期至关重要。
HIV-1潜伏期模型的差异
潜伏期HIV-CRISPR筛选是在体外J-Lat细胞系模型中建立的,因为它在遗传上易于处理,并且是用于进行遗传筛选的强大工具。然而,由于这些细胞系在其病毒整合位点是克隆的,并且来源于具有改变的转录和活化谱的白血病细胞,因此细胞环境与HIV-4潜伏期的初级CD1 + T细胞模型不同。因此,这可以解释在比较ING5582敲除细胞中的DMSO和AZD3处理时结果的差异,这构成了J-Lat细胞中显着的病毒再激活(图6A),但在HIV-4潜伏期的主要CD1 + T细胞模型中则不然(图6B和6C)。此外,原代CD5582 + T细胞中AZD3和ING4敲除水平组合中的病毒再激活程度(图6B和6C)并不像在两个J-Lat细胞中那样惊人(图6A)。然而,每个模型中病毒再激活的测量是不同的,因为J-Lat细胞模型包括几乎全长的前病毒,这使我们能够根据病毒上清液中产生的病毒颗粒的HIV-1逆转录酶活性来测量病毒再激活。相比之下,该原代细胞模型使用修饰的报告病毒载体,在大多数HIV-1基因中具有过早终止密码子,以提高HIV-1潜伏期建立的效率[49],因此病毒再激活的测量基于细胞内报告基因表达。因此,我们的结果与体内HIV-1潜伏期再激活的相关性仍有待测试,但仍然是通往“休克和杀死”策略的更有效和具体途径的入口。总体而言,每个模型都有不同的优势,因此我们不希望对观察到的趋势进行全面概括。
与其他HIV潜伏期筛查的比较
我们的潜伏期HIV-CRISPR筛查策略是一种独特的方法来识别HIV-1潜伏期所涉及的因素。然而,以前的筛查也通过使用基因敲除、敲低或沉默进行筛查来探索HIV-1潜伏期因素[10,21-28]。通常,这些先前的筛选使用全基因组sgRNA文库,这使得它们对特定途径无偏倚,但这也限制了确定基因命中的统计能力。尽管如此,这些先前的筛选已经揭示了从mTOR途径[1]到蛋白酶体相关基因[21,24]到非规范NFκB途径[26]的令人兴奋的HIV-28潜伏期因子。由于表观遗传学在HIV-1潜伏期中起着重要作用,并且仍在研究中,因此我们使用小型定制设计的sgRNA文库,将潜伏期HIV-CRISPR筛选集中在表观遗传调控因子中。此外,较小的库可以增加屏幕的动态范围[83]。我们的筛选还依赖于HIV-CRISPR载体[31]来执行高通量筛选,该筛选使用HIV-1复制而不是另一个报告基因作为屏幕的直接读数。与其他屏幕(包括具有表观遗传命中的屏幕)的读数差异[10,23,27]可能导致不同的基因命中被突出显示。研究HIV-1潜伏期机制的另一个挑战是复杂机制的并行相互作用,为了使用CRISPR筛选方法解决这个问题,我们将筛选与低激活剂量的LRA治疗相结合。通过将我们的sgRNA文库集中在表观遗传调节因子上,并在有和没有AZD5582处理的情况下进行筛选,我们确定了协同作用以刺激HIV-1转录起始和延伸的独特修饰组合。
在准备本手稿时发表的一篇论文使用了类似的CRISPR筛选策略,在存在低激活剂量的LRA的情况下,但使用全基因组指南RNA文库[84]。Dai等人发现BRD2敲除与AZD5582协同作用[84],这可能属于我们研究中确定的相同途径。事实上,在我们的筛选结果中,BRD2 在 AZD6682 存在下也是一个高排名的基因(在 J-Lat 19A5 细胞筛选中排名 #8,在 J-Lat 55.10 细胞筛选中排名 #6)(S6 表)。因此,通过探索低激活剂量的LRA与基于CRISPR的筛选的组合,该领域可以确定导致新型LRA特异性和效力改善的途径,并朝着根除HIV-1潜伏池的治疗策略迈进。
材料和方法
道德声明
根据美国国立卫生研究院(NIH)指南(http://grants.nih.gov/grants/policy/hs/faqs_aps_definitions.htm),所有原始细胞数据均来自匿名献血者,并被弗雷德哈钦森癌症中心机构审查委员会归类为“人类受试者豁免”研究。没有做任何动物工作。
J-Lat 野生型、克隆敲除和混合敲除细胞
HIV-1潜伏期细胞系J-Lat 5A8 [30]和J-Lat 10.6 [29]在补充有1640%胎牛血清(FBS),青霉素 - 链霉素(Pen / Strep)和10 mM HEPES的RPMI-10培养基(赛默飞世尔科技)中生长。为了使用这些细胞进行HIV-CRISPR筛选,我们通过电穿孔J-Lat 9.31和10A6细胞对J-Lat 5.8和2A2细胞进行了CRISPR / Cas1介导的敲除,用于ZAP(Synthego,红木城,加利福尼亚州)与20μL 9μM Cas5-NLS复合(加州大学伯克利分校宏观实验室)。电穿孔后96天,将细胞单细胞分选到900孔U底板(Sony MA5多应用细胞分选仪-Fred Hutch流式细胞术共享资源)中,并将具有ZAP双等位基因敲除的单个克隆用于随后的潜伏期HIV-CRISPR筛选。通过慢病毒转导和随后的3.6μg/mL嘌呤霉素选择72-1天产生具有靶向NFKBIA,KAT1,CUL4,ACTL7A,VPS0,DNMT4,DMAP10,SRCAP,YEATS14和两个非靶向对照(S9表)的HIV-CRISPR KO池的J-Lat细胞。为了生成CRISPR / Cas<>编辑的敲除池,选择了在潜伏期HIV-CRISPR筛选的病毒上清液(最高组合p值)中代表性最高的sgRNA。通过Fred Hutch标本处理/研究细胞库共享资源确定细胞系为无支原体。
质 粒
HIV-CRISPR质粒已有先前的报道[31]。HIV-CRISPR构建体通过退火互补寡核苷酸(S7表)进行克隆,这些寡核苷酸具有突出部分,允许使用BsmBI限制性位点定向克隆到HIV-CRISPR。pMD2.G和psPAX2质粒是Didier Trono(分别为Addgene #12259和#12260)的礼物。pMD2.Cocal质粒是Hans-Peter Kiem的礼物[85]。lentiCRISPRv2质粒是张峰(Addgene #52961)的礼物。pNL4-3-Δ6-dreGFP-CD90已在先前报道[50]。
人类表观基因组CRISPR/Cas9 sgRNA文库构建
人类表观基因组(HuEpi)sgRNA文库由841个基因组成,其中778个基因来自数据库Epifactor[33],63个基因是手工挑选的。对于大多数基因,使用GUIDES(DNA编辑屏幕的图形用户界面)生成了六个sgRNA序列[86]。两个基因(HEATR1和MCM2)有十四个向导,一个基因(UBE2N)有一个向导。还纳入了来自GeCKO v252.2文库[0]的34个非靶向sgRNA,从而生成了总共5,309个指南的文库。HuEpi sgRNA被合成(Twist Biosciences,San Francisco,CA)并克隆到HIV-CRISPR中。使用Phusion高保真DNA聚合酶(NEB)结合1 ng混合寡核苷酸模板,引物ArrayF和ArrayR(ArrayF引物:TAACTTGAAAGTATTTCGATTTTTTTTTTTTTTATATCTTTATATCTTGTGGAAAAGGACGAAACACACCG和ArrayR引物:ACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCT AGCTCTAAAAC),退火温度为59°C,延长时间为20秒,循环25次。PCR扩增后,将140 bp扩增子凝胶纯化并克隆到BsmBI(NEB;R0580)使用Gibson Assembly(NEB;E2611S)。每个吉布森反应在50°C下进行60分钟。根据制造商的方案,使用VS型密理孔膜(VSWP 02500)对每个Gibson反应进行滴透析。根据制造商的方案,使用基因脉冲发生器(BioRad)使用5μl反应转化25μlEndura电感受态细胞(Lucigen; 60242-2)。为了确保充分的代表性,进行了足够的平行转化,并以每个文库寡核苷酸总数的245倍接种到含有LB琼脂糖245 mm x 300 mm的羧苄青霉素平板(赛默飞世尔)上。在 37°C 下过夜生长后,刮掉菌落,沉淀,并使用内毒素无核键质粒 Midiprep 试剂盒 (Takara Bio; 740422.10) 用于质粒 DNA 制备。HuEpi文库经过测序,包含合成中包含的所有5,309个sgRNA(GSE215430)。
慢病毒生产
293T细胞(ATCC;在补充有 3216% FBS 和 PenStrep 的 DMEM(赛默飞世尔科技)中培养的 CRL-10)在转染前一天以 2 mL 的 5 mL 在 2 孔板中接种 6E1 个细胞/mL。转染使用TransIT-LT2300试剂(Mirus Bio LLC;MIR3),每μgDNA含有293 uL转染试剂。对于慢病毒制备,用667 ng慢病毒质粒、500 ng psPAX2和333 ng pMD2.G转染0T。转染后一天,更换培养基。转染后两三天,通过2.720μm过滤器过滤病毒上清液(Thermo Scientific; 1320–293)。对于HuEpi文库慢病毒制备,对6Ts进行相同的转染,并通过超速离心合并30个326823孔板的上清液并浓缩。将约20mL上清液等分到聚丙烯管(贝克曼库尔特;20)中,并用无菌过滤的1%蔗糖(20%蔗糖,100mM EDTA,28mM HEPES,23mM NaCl,蒸馏水)覆盖。将每个聚丙烯管放置在一个水平桶中,并在贝克曼库尔特 Optima L-000K 超速离心机中以 1,4 rpm 的速度在 SW 90 转子中以 4°C 旋转 80 小时。倾析上清液,并将沉淀在 DMEM 或 RPMI 中重悬数小时,在 20°C 下。 立即使用浓缩慢病毒或等分试样并储存在-9885°C。 所有慢病毒转导均在存在4 μg/mL DEAE-葡聚糖(Sigma-Alrdich;D3)。为了生成pNL6-90-Δ293-dreGFP-CD900储备液,该过程与慢病毒制备相同,只是用450 ng慢病毒质粒、2 ng psPAX150和2 ng pMD<>.Cocal转染<>T。
LRA和无LRA潜伏期HIV-CRISPR筛查
HuEpi文库慢病毒制备通过TZM-bl细胞中的集落形成测定进行滴定(NIH艾滋病试剂计划;ARP-8129),用于以10.6的MOI转导J-Lat 5.8和J-Lat 0A4细胞。对于转导,使用每次重复3E6细胞(HuEpi文库的>500倍覆盖率),并在1100μg/ mL DEAE-葡聚糖存在下以30xg进行20分钟。在嘌呤霉素(0.4μg/mL)中选择细胞10-14天。为了准备LRA筛选,将AZD5582二盐酸盐(Tocris; 5141)重悬于DMSO中至1 mM储备液。随后的稀释在RPMI中进行并立即使用。选择完成后,对于LRA筛选,每个细胞系每个重复的3E6细胞用10nM AZD5582处理24小时。细胞和上清液在选择后或处理后收集。用DPBS(Gibco; 14190144)洗涤细胞一次,并将细胞沉淀储存在-20°C。 使用QIAamp DNA血液中型试剂盒(Qiagen; 51183)从细胞沉淀中提取基因组DNA,并在蒸馏水中洗脱基因组DNA。将病毒上清液以1100xg旋转以除去细胞碎片,通过0.22μm过滤器(Millipore Sigma,SE1M179M6)过滤,覆盖在20%蔗糖垫上,并在28°C下在SW 1转子中浓缩4小时。 将沉淀重悬于RPMI中并储存在-80°C。 使用QIAamp病毒RNA迷你试剂盒(Qiagen,52904)从浓缩病毒中提取病毒RNA。基因组DNA和病毒RNA样品中发现的sgRNA序列分别使用HIV-CRISPR特异性引物通过PCR(Agilent;600677)和RT-PCR(Invitrogen;18064014)扩增。进行第二轮PCR以条形码并准备用于Illumina测序的文库(S7表)。每个扩增子都使用双面磁珠净化(贝克曼库尔特;A63880),用Qubit dsDNA HS检测试剂盒(Invitrogen;Q32854),并为每个文库汇集到 10 nM。图书馆池在快速运行模式下在Illumina HiSeq 2500的单通道上排序(Fred Hutch Genomics和Bioinformatic共享资源)。
屏幕分析
原始测序数据以GEO数据集(GSE215430)的形式提供。文库池被解复用,读取被分配给相应的样本,修剪,并通过 Bowtie [87] 对齐到 HuEpi 库。通过迭代分箱NTC sgRNA序列,生成了与HuEpi文库大小相同的人工NTC sgRNA基因集。使用MAGeCK统计包对筛选进行分析以确定sgRNA和基因的相对富集或消耗[36]。
蛋白质印迹
收获细胞并用冰冷的磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤一次,并通过离心(300×g,3分钟)沉淀。首先用补充有完全蛋白酶抑制剂混合物(罗氏;87787)的Pierce IP裂解缓冲液(赛默飞世尔科技;11697498001)重悬细胞沉淀,在冰上提取全细胞裂解物。然后将样品在冰上孵育10分钟,每2-3分钟短暂涡旋一次,然后在16°C下以000,20×g离心4分钟。 要制备样品,请添加 4x NuPAGE LDS 样品缓冲液(赛默飞世尔科技;NP0008)含有5%2-巯基乙醇(密理博西格玛;M3148),并将样品在95°C下煮沸5分钟。裂解物在NuPAGE 4–12%Bis-Tris预制凝胶上分离(赛默飞世尔科技;NP0336)并转移到硝酸纤维素膜(Biorad; 1620115)。在室温下使用添加到Tris缓冲盐水(TBS)(pH 1.5时为0mM Tris碱和1mM NaCl)的20%牛奶/ 20.150%吐温-7进行封闭6小时。使用一抗CUL3(细胞信号传导;2759)在1:1000,NFkB2(细胞信号传导;4882)在1:1000和葡萄菌素(Santa Cruz;sc-25336)在1:5000进行免疫印迹。用TBST洗涤膜6次,每次5分钟。以下二抗以1:5000稀释度使用:山羊抗兔IgG-HRP(R&D Systems;HAF008)和山羊抗小鼠IgG-HRP(研发系统;HAF007)。膜采用SuperSignal West Femto最大灵敏度基质(Thermo Fisher; 34095)开发,并在BioRad Chemidoc MP成像系统上可视化。
基因组编辑分析
收获敲除细胞并使用QIAamp DNA血液迷你试剂盒(Qiagen; 51104)提取DNA。来自每个靶位点(S7表)的引物用于扩增编辑的位点,并使用铂Taq DNA聚合酶高保真(赛默飞世尔科技;11304011)或Q5高保真DNA聚合酶(NEB;M0491S)。使用测序引物(S7表)对PCR扩增子(Fred Hutch Genomics共享资源)进行Sanger测序,并通过CRISPR编辑推断(ICE)[45]分析结果以确定基因编辑结果。
病毒释放(RT 检测)
收获澄清的病毒上清液,并使用HIV-1逆转录酶(RT)活性测定法测定逆转录酶活性,如前所述[88,89]。使用滴定的HIV-1储备液为所有测定生成标准曲线来等分并储存在-80°C。
原发性 CD4+ T 细胞潜伏期模型和敲除
从Bloodworks Northwest获得来自健康供体的用过的白细胞过滤器,并通过Ficoll(Millipore Sigma;GE17-1440-02)。使用磁负选择分离CD4 + T细胞(干细胞技术; 17952),并立即使用或冷冻以储存在液氮中。使用抗 CD4、CD2 和 CD3 磁珠(Miltenyi Biotec; 28-130-091)激活 CD441+ T 细胞 2 天,并在补充有 1640% 胎牛血清 (FBS)、青霉素-链霉素 (Pen/Strep)、10x GlutaMAX (赛默飞世尔科技; 1)、35050061 mM HEPES、10 U/mL 人白细胞介素-100(Millipore Sigma;2)、11011456001 ng/mL 人白细胞介素-2 (Peptrotech; 7–200), 和 07 ng/mL 人白细胞介素-2 (Peprotech; 15–200)。然后通过磁分离去除磁珠,并用HIV-GFP-Thy15.1(pNL2-4-Δ3-dreGFP-CD6)和90 ug / mL聚溴乙烯(Millipore Sigma;TR-8-G) 在 1003 x 2 x g 下持续 1100 小时。然后将脊髓细胞重悬于含有IL-2,IL-7和IL-15的新鲜培养基中,并在通过磁阳性选择分离主动感染细胞(Thy3.1 +)之前孵育2天(干细胞技术; 18951)。在使用 Synthego 的 GKOv1 试剂盒敲除 AAVS2、CUL2 和 ING1 之前,将感染的细胞 (Thy3.3+) 维持 2 天。如前面敲除细胞克隆和池部分所述,每个目的基因的crRNPs均生成,但补充的P3缓冲液(Lonza;使用 V4SP-3096) 代替 SE 缓冲区。对于每次电穿孔,通过在1°C下以5×g离心6分钟沉淀100.10E25细胞,用PBS洗涤一次,通过离心再次沉淀,除去PBS,并用crRNP复合物重悬。重悬的细胞立即转移到P3原代细胞核试剂盒(龙沙;V4SP-3096),并使用龙沙100D核苷传感器上的代码EH-4电穿孔。加入 80 μL 预热的补充 RPMI 培养基,加入 IL-2、IL-7 和 IL-15,让细胞在 10°C 培养箱中恢复 37 分钟。加入 300 μL 新鲜培养基,将细胞转移到 96 孔板中。200 天后加入 2 μL 额外的补充培养基。敲除细胞维持在 1E6 细胞/mL,补充有 IL-2、IL-7 和 IL-15 的新鲜培养基。在感染后 14 天,将细胞与 H80 饲养层细胞共培养,并在补充有 2 U/mL IL-6 的培养基中维持在 20E2 细胞/mL。如果AZD5582处理适用,则细胞处理1uM AZD5582培养基24小时。在感染后19天,用Thy1.2抗体(Biolegend; 140323)染色细胞,用4%PFA固定,并进行流式细胞术分析(CD FACS Celesta-Fred Hutch流式细胞术共享资源)。
自动切割和标签分析
我们在四种条件下制备了J-Lat 10.6细胞的细胞核:(i)NTC敲除与DMSO处理(阴性对照)(ii)NTC敲除与10 nM AZD5582处理(iii)ING3敲除与DMSO处理(iv)ING3敲除与10 nM AZD5582处理。在以10×g旋转1分钟的5.300mL微量离心管中沉淀多达10万个细胞。然后将细胞重悬于1mL冰冷的NE1缓冲液(20mM HEPES-KOH pH 7.9,10mM KCl,0.5mM亚精胺,0.1%TritonX-100,20%甘油,用罗氏完全无EDTA蛋白酶抑制剂片剂),并在冰上孵育10分钟。然后将细胞核在4°C下以1,300×g离心4分钟。然后将细胞核重悬于1 mL洗涤缓冲液(20 mM HEPES pH7.5,150 mM NaCl,0.5 mM亚精胺,补充有罗氏完全无EDTA蛋白酶抑制剂片剂)中。使用 10 μL 测定天然 J-Lat 10.6 细胞核的浓度,将细胞核稀释至 1 万个细胞核/900 μL 洗涤缓冲液的浓度,并将 900 μL 等分试样将该悬浮液与 100 μL DMSO 在冷冻管中混合,然后将其密封并置于 Mr. Frosty 异丙醇腔室中,在 -80°C 下缓慢冷冻。 然后将细胞核储存在-80°C直至使用。对于自动CUT&Tag处理,细胞核在室温下解冻,在洗涤缓冲液中洗涤,并与concanvalin-A(ConA)顺磁珠结合(Bangs Laboratories;BP531),用于磁分离,如 protocols.io 网站 (https://doi.org/10.17504/protocols.io.bgztjx6n) 中所述。然后将样品悬浮在抗体结合缓冲液中,并与针对panH4Ac(活性基序;39925)、BRD4(细胞信号传导;13440)、RNA-Pol2-S5p(细胞信号传导;13523)、RNA-Pol2-S2p(细胞信号传导;13499)和IgG对照(Abcam;172730)的特异性抗体一起分裂孵育过夜。根据 protocols.io 网站(https://doi.org/96.100/protocols.io.bgztjx10n)提供的AutoCUT&Tag协议,在贝克曼库尔特Biomek液体处理机器人上使用17504K Con-A结合的细胞核在6孔板中进行样品处理,并进行了前面描述[32](Fred Hutch Genomics共享资源)。
CUT&Tag 测序数据处理和分析
对于 AutoCUT&Tag 样品池和测序,使用 Agilent 4200 TapeStation 测定文库的大小分布和摩尔浓度,并以大约等摩尔浓度汇集多达 96 个条形码 CUT&Tag 文库以进行测序。Fred Hutchinson癌症研究中心基因组学共享资源在NextSeq 2平台上进行了配对末端50×2000 bp测序。这产生了每个抗体5-10万次读数。首先使用带有参数的 cutadapt 3.2 的适配器裁剪工具删除扩展到 9' 适配器的序列:
-j 8—nextseq-trim 20 -m 20 -a AGATCGGAAGAGCACGTCTGAACTCCAGTCA -A AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT -Z.
为了构建反映HIV-1整合到J-Lat细胞中的参考,我们从Illumina iGenomes集合(https://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/igenome.html)中的UCSC hg38人类参考序列开始。整合HIV-1基因组的序列,包括侧翼人序列,是从加入MN989412.1获得的[90]。考虑到侧翼的人类序列,我们从参考法斯塔文件中切除了chr9:136468439–136468594,并在其位置插入了MN989412.1。我们还重写了整合位点下游的基因和外显子注释,将相关GTF文件中的所有特征移动了10206bp,以解释新插入的HIV-1序列。Bowtie2 v2.4.1 [91] 和 STAR v2.7.7a [92] 的索引是使用这些修改后的 Fasta 和 GTF 文件构建的。HIV-1插入由一对LTR限制,因为它们包含相同的序列,因此某些对齐程序难以解释。为了避免在需要时出现这些困难,准备了另一个版本的参考序列,其中LTR序列(634bp)的第二个拷贝被“N”掩盖。
Fastq文件与自定义hg38基因组对齐,使用Bowtie1版本9.2.2将HIV-4基因组插入2号染色体,参数如下:-非常敏感-局部-软剪辑-未映射-tlen-燕尾-无混合-无不一致-q—phred33 -I 10 -X 1000。原始测序数据以GEO数据集(GSE215430)的形式提供。由于PCR重复的读取深度和分数在重复之间差异很大,因此我们从Bed文件中删除了所有重复读数。使用SEACR版本4.4对所有重复和所有条件的合并读数对BRD2、pan-H5ac、RNA-Pol2-S2p和RNA-Pol1-S3p数据集进行峰调用[93]。我们使用两种设置来称呼峰,(1)使用严格设置的IgG对照数据,(2)使用FDR为0.01,然后使用与IgG峰重叠的FDR 0.01峰作为最终峰集。对于重复之间的相关性分析,将BRD4峰集与泛H4ac峰集合并,将RNA-Pol2-S5p峰集与RNA-Pol2-S2p峰集合并。对于图7所示的统计比较,我们量化了泛H4ac或BRD4在LTR,U3区域或R + U5区域上的碱基对覆盖率,并将这些值归一化为每次重复的基因组总碱基对覆盖率。同样,为了比较RNA-Pol2-S5p数据和RNA-Pol2-S2p数据,我们量化了HIV前病毒的LTR,前病毒体和下游区域的碱基对覆盖率,这些值被标准化为每次重复的基因组总碱基对覆盖率。对于图 7 中的比较,p 值是使用 Python 中的 SciPy.stats.ttest_ind() 函数的双样本 t 检验(双侧)计算的;多重假设检验的P值未校正。为了对NTC + DMSO条件和ING KO + AZD2条件之间的RNA-Pol5-S5582p数据进行全局比较,如图8所示,每次重复计数重叠的RNA-Pol2-S5p峰,并使用Wald检验使用DESeq2版本2.1.32计算对数0倍变化和调整后的p值。调整后的p值以与RNA-Pol2-S5p峰数成比例的方式进行多重假设检验校正。DESeq2分配了数据极其稀疏的峰,并分配了NaN的调整p值,并将这些峰排除在下游分析之外。
所有图表中使用的数值数据都包含在S8表中或GEO数据集(GSE215430)中可用。
支持信息
HuEpi文库的sgRNA的GuideRNA序列。
显示 1/11: ppat.1011101.s001.xlsx
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一个 B C
1 指南编号 基因 序列
2 GUIDES_sg0001 A1CF AAATCCGGGGATGGATTGAG
3 GUIDES_sg0002 A1CF CTGTGCGCTGGACCAGTGCG
4 GUIDES_sg0003 A1CF GCAGAGTGCAGCTGGTACAC
5 GUIDES_sg0004 A1CF AGTGCCGCTCAATCCATCCC
6 GUIDES_sg0005 A1CF GGATTCTGGCTGGCTAGAGC
7 GUIDES_sg0006 A1CF GTCCAATAGCAGAGTGCAGC
8 GUIDES_sg0007 ACAT1 CAAAAAGTGAATCAATGG
9 GUIDES_sg0008 ACAT1 AAAAAGAAGATATTGCAATG
10 GUIDES_sg0009 ACAT1 ATACCAGAAGTAAAGCAGCA
11 GUIDES_sg0010 ACAT1 TGCTAGTACAACCAGACTAA
12 GUIDES_sg0011 ACAT1 CCTTTTACTGTAACTGTGAC
13 GUIDES_sg0012 ACAT1 GCAGCATATACAGGAGCAAT
14 GUIDES_sg0013 亚洲联合行动银行 AGTGTGGGTGACCCCGTCAC
15 GUIDES_sg0014 亚洲联合行动银行 GAAGCCGGCCTTGCACATGC
16 GUIDES_sg0015 亚洲联合行动银行 CCCCACGATGGAGGGGAAGA
17 GUIDES_sg0016 亚洲联合行动银行 GCCGCGCTCGTCGTCGACAA
18 GUIDES_sg0017 亚洲联合行动银行 ATCGTGATGGACTCCGGTGA
19 GUIDES_sg0018 亚洲联合行动银行 GGAAATCGTGCGTGACATTA
20 GUIDES_sg0019 ACTL6A TGCCAAGACCTCGTAACCTG
21 GUIDES_sg0020 ACTL6A AGAAGTTGCCTCAGGTTACG
22 GUIDES_sg0021 ACTL6A ATCACACATCCACACTTG
23 GUIDES_sg0022 ACTL6A GAGCGGCTAAAGATTCCAGAa
24 GUIDES_sg0023 ACTL6A GGCAGTGTAATAGTGGCAGG
25 GUIDES_sg0024 ACTL6A GTTCATTATGAATTCCCCAA
26 GUIDES_sg0025 行动6B CCTCCCCAGCGTACCCAGCG
27 GUIDES_sg0026 行动6B CGCGGCCAGCAGCCCCACTG
28 GUIDES_sg0027 行动6B ATGACCTCCGCTCCATCCCG
29 GUIDES_sg0028 行动6B AGGTGTGATCCAGGATGGCT
30 GUIDES_sg0029 行动6B AGACTTGACGTTTTTGCTGT
31 GUIDES_sg0030 行动6B GCACGTGCCTCGGGATGGAG
32 GUIDES_sg0031 行动3B AGGCTCAGCGAGGAGCTCAG
33 GUIDES_sg0032 行动3B TGCTAGGCTGAGGCTCAGCG
34 GUIDES_sg0033 行动3B TCCGAAATCCCTGAACATGG
35 GUIDES_sg0034 行动3B ACATGCAGCGCTACGCCGTG
36 GUIDES_sg0035 行动3B CCAAGTATGATGTGGATCCC
37 GUIDES_sg0036 行动3B CGCTACGCCGTGTGGTGTTCGG
38 GUIDES_sg0037 演员5 ACATCGTGTTGCCGCCAGTG
39 GUIDES_sg0038 演员5 CAGAACGTTTTCCTCACTGG
40 GUIDES_sg0039 演员5 AGAGACTCTTCAGTACATTC
41 GUIDES_sg0040 演员5 TCCTGGCATGAAAGCCAGAA
42 GUIDES_sg0041 演员5 CTTCTCCTATGAGAGATGGC
43 GUIDES_sg0042 演员5 TGTTCTTCTCCTATGAGAGA
44 GUIDES_sg0043 演员6 AGGGAAGAGATGGTGTTGAG
45 GUIDES_sg0044 演员6 ACAATGTTCTTAAAAAAATG
46 GUIDES_sg0045 演员6 AAGAACATTGTCTTGACAGG
47 GUIDES_sg0046 演员6 TCTTGAATGCCTATATCAGA
48 GUIDES_sg0047 演员6 TTTTTAATTGTACTGAAGTC
49 GUIDES_sg0048 演员6 ACAGAAACATATATCTGT
50 GUIDES_sg0049 演员8 AGAAAGACTCCATTCCCAGG
HuEpi sgRNA
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S1 表。 HuEpi文库的sgRNA的GuideRNA序列。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011101.s001
(三十)
S2 表。 通过sgRNA输出的MAGeCK分析,用于潜伏期HIV-CRISPR筛选。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011101.s002
(三十)
S3 表。 按基因或NTC输出的MAGeCK分析,用于潜伏期HIV-CRISPR筛选。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011101.s003
(三十)
S4 表。 对来自潜伏期HIV-CRISPR筛选(在图3B中列出)中命中率最高的基因的文献分析,以检查每个基因在HIV-1潜伏期背景下的已知功能。包括补充参考资料。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011101.s004
(文档)
S5 表。 通过 sgRNA 输出的 MAGeCK 分析输出,用于 AZD5582 LRA 潜伏期 HIV-CRISPR 筛选。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011101.s005
(三十)
S6 表。 按基因或NTC输出的MAGeCK分析输出,用于AZD5582 LRA潜伏期HIV-CRISPR筛选。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011101.s006
(三十)
S7 表。 引物序列、sgRNA 序列和下一代测序条形码。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011101.s007
(三十)
S8 表。 包含相应图形面板的基础数字数据的电子表格。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011101.s008
(三十)
S1 图 验证原代CD4 + T细胞中潜伏期HIV-CRISPR筛选的最高命中率。
(A)基因敲除AAVS4和CUL4后野生型原代CD1 + T细胞和HIV-1潜伏期细胞原代CD3 + T细胞模型中病毒再激活水平的代表性流式细胞术图。Thy1.2-,GFP-细胞(象限4)未感染;Thy1.2+,GFP-(象限3)细胞感染双重报告HIV-1病毒并潜伏;Thy1.2+,GFP+细胞(象限2)被感染并重新激活。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011101.s009
(英文)
S2 图 J-Lat 细胞中的 AZD5582 剂量曲线。
(A)在J-Lat 5582.10和6A5细胞系上进行AZD8剂量曲线以确定病毒再激活水平。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011101.s010
(英文)
S3 图 自动CUT&Tag复制的全基因组信号高度相关。
(A) 根据合并的泛 H4Ac、BRD4 和 IgG 阴性对照样品在合并的泛 H4Ac 和 BRD4 峰集中的成对皮尔逊相关性着色的相关矩阵。所有泛 H4Ac 样本都通过分层聚类分组在一起,所有 BRD4 样本也是如此。(B)与(A)相同,但显示了RNA-Pol2-S5p和RNA-Pol2-S2p在这些标记的合并峰集上的成对皮尔逊相关性。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011101.s011
(英文)
确认
我们感谢Carley Gray和Terry Hafer对这份手稿的重要反馈,感谢Jessie Kulsuptrakul的技术援助,感谢Emerman实验室成员的有用建议。我们感谢Steve Hahn,Daphne Avgousti和B. Matija Peterlin的有益讨论。我们感谢Gladstone病毒学和免疫学研究所的Warner Greene和美国加利福尼亚州旧金山分校的Warner Greene分享J-Lat 5A8细胞,并感谢美国北卡罗来纳州达勒姆杜克大学的Darell Bigner分享H80细胞。我们感谢Lucas Carter协助组装HuEpi图书馆,Jackson Peterson讨论原代细胞HIV-1潜伏期模型,Daryl Humes和Hannah Itell讨论原代细胞协议,以及FHCC的Jorja Henikoff,Matt Fitzgibbon和Pritha Chanana提供生物信息学支持。HuEpi图书馆的建设得到了Fred Hutchinson癌症中心病原体相关恶性肿瘤综合研究中心奖的支持。这项研究得到了Fred Hutch/华盛顿大学癌症联盟(P022606 CA30)的基因组学,生物信息学和流式细胞术共享资源RRID:SCR_015704的支持。
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