致命性家族性失眠脑类器官中能量代谢改变与星形胶质增生和神经元功能障碍有关
西莫特·安娜·史密斯，本杰明·施瓦茨，埃里克·博恩森，凯瑟琳·博西奥，凯蒂·威廉姆斯，克里斯蒂娜·奥尔鲁，海莉·拉切瑙尔，布拉德利·格罗夫曼，凯瑟琳·海格
发布时间：2023 年 1 月 19 日
抽象
致死性家族性失眠症 （FFI） 是一种罕见的神经退行性疾病，由朊蛋白 （PrP） 内的显性遗传单氨基酸取代 （D178N） 引起。以前没有针对这种疾病的体外人脑组织模型。因此，这种突变如何对脑细胞产生破坏作用仍然未知。使用CRISPR-Cas9工程诱导多能干细胞，我们制造了D178N脑类器官，并将其与同种型对照类器官进行了比较。我们发现，在没有FFI的其他特征的情况下，D178N类器官表现出具有细胞氧化应激的星形胶质细胞增生症。PrP的异常翻译后处理很明显，但没有观察到组织沉积或错误折叠的PrP亚型的繁殖。神经元电生理功能受损，神经递质，特别是乙酰胆碱和GABA的水平改变。这些功能障碍的基础是细胞能量稳态的变化，糖酵解和克雷布斯循环中间体显着增加，线粒体活性增加。D178N类器官中能量需求的增加与线粒体自噬增加和脂滴消耗有关，进而导致细胞脂质组成的变化。使用双突变（178NN），我们可以确认大多数变化是由突变的存在引起的，而不是与缺乏突变的PrP分子相互作用。我们的数据强烈表明，由能源供需失衡引起的生物合成中间体和氧化应激的变化会导致 FFI 类器官中神经元活性受损的星形胶质增生质增生。他们进一步支持许多与疾病相关的变化是由于PrP功能的破坏，并且不需要PrP错误折叠的传播。
作者摘要
致命的家族性失眠是一种毁灭性的疾病，其特征是睡眠逐渐恶化，直到大脑和身体恶化导致死亡。脑细胞的退化与称为朊病毒的错误折叠蛋白质的积累有关。朊病毒的错误折叠是由编码朊病毒正常前体蛋白朊蛋白朊蛋白的基因中的单点突变D178N引起的。在这里，我们使用人脑模型来研究这种突变如何导致脑细胞损伤。我们的研究结果表明，突变会导致脑细胞功能障碍，而不需要错误地折叠成朊病毒。脑细胞功能障碍与压力和异常新陈代谢有关，以改变脑细胞正常运作所需的关键化合物。这些变化与觉醒增强有关，这可能导致睡眠障碍。我们的数据支持许多疾病相关的变化是由致命的家族性失眠D178N突变破坏朊蛋白功能引起的。
引文： Foliaki ST， Smith A， Schwarz B， Bohrnsen E， Bosio CM， Williams K， et al. （2023） 致命家族性失眠脑类器官的能量代谢改变与星形胶质增生和神经元功能障碍有关。公共科学图书馆基因19（1）： e1010565. https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010565
编辑 器： Scott M. Williams，凯斯西储大学医学院，美国
收到： 7月 5， 2022;接受： 12月 12， 2022;发表： 1月 19， 2023
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数据可用性： 所有相关数据都在手稿及其支持信息文件中。
资金： 这项研究由NIAID，NIH（CLH / CMB）的校内研究计划资助。STF是2019年CJD基金会研究资助的感激接受者。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。
竞争利益： 提交人声明不存在相互竞争的利益。
介绍
朊病毒疾病包括一系列罕见和无法治愈的神经退行性疾病。大约15%的朊病毒病病例是遗传性的;由编码朊蛋白 （PrP） 的 PRNP 基因内的常染色体显性突变引起。这些疾病包括遗传性克雅氏病 （CJD）、格斯特曼-斯特劳斯勒舍因克病 （GSS） 和致命家族性失眠症 （FFI）。FFI是由点突变引起的，该点突变在顺式PRNP基因的密码子178（D178N）处用天冬酰胺取代天冬氨酸，在密码子129多态位点处用蛋氨酸取代[1]。有趣的是，如果密码子129多态性是缬氨酸，D178N突变反而会导致遗传性CJD。FFI突变具有高外显率，因此携带者很可能患上该疾病[2]。发病年龄一般在45-50岁之间，疾病表型包括失眠恶化和肌功能异常导致死亡[1，3]。
与整个朊病毒病家族一样，FFI 的发病与检测错误折叠的 PrP 物种或朊病毒相关，后者是朊病毒病的特定生物标志物。朊病毒可以在一些FFI小鼠模型中检测到，但仅在临床疾病阶段[4-6]，导致朊病毒从正常折叠的PrP转变为错误折叠的朊病毒尚不清楚。朊病毒是不溶的，耐蛋白酶（PrPRes），并且具有传播性[4-6]。朊病毒的传播性意味着它们可以自我繁殖或播种将正常PrP转化为朊病毒。这种播种能力使疾病能够通过大脑传播，并且可以通过高灵敏度和特异性的测定来测量，例如实时震动诱导转换（RT-QuIC）和蛋白质错误折叠循环扩增（PMCA）[7-9]。D178N突变不会导致细胞培养模型中朊病毒的稳态产生;然而，它直接改变PrP的生化性质，产生高度糖基化的PrP[4-6]。这种变化在PrP中也很明显。Res来自终端FFI人脑[10]。
FFI改变了许多对生存至关重要的分子途径，使FFI如何特异性损害大脑的机制见解复杂化。终末FFI大脑已被证明对转录、RNA剪接、蛋白质合成和折叠、蛋白质转运、线粒体功能和氧化还原的调节发生了改变[11]。与年龄匹配的健康对照组相比，在终末FFI中多音丘脑的星形胶质细胞中发现线粒体亚基受损和氧化应激防御增强[12]。在疾病进展过程中，这些功能障碍的演变，是否在疾病发作之前开始，尚不清楚。
脑类器官已被用于模拟各种遗传性神经系统疾病，包括阿尔茨海默病、帕金森病、21三体综合征和遗传性CJD[13-17]。我们的小组还证实，终末期散发性CJD的朊病毒成功感染了CO[15]。当我们检查PRNP E200K CJD致突变时，我们发现与具有该突变的携带者分化的CO不会产生致病性朊病毒[16]，但随着类器官年龄的增长，会出现失调的表型。在健康的类器官中，大约5个月后，细胞群已经足够成熟，表现出复杂的神经振荡和网络通信，含有更少的干细胞，并且有更多的星形胶质细胞[18]。对于E200K遗传性CJD CO，神经元功能降低和神经网络振荡与突触组成和神经递质水平改变有关，表明突变导致神经元功能障碍[17]。
为了研究FFI D178N突变对人脑组织的影响，我们将人类COS与PRNP基因中的D178N突变与等基因对照CO进行了比较。我们发现突变不会导致自发性朊病毒产生。然而，存在星形胶质增殖质增生症，这似乎与氧化应激增加和CO内能量途径利用的实质性变化有关。 线粒体自噬增加是显而易见的，脂滴的脂质分解代谢作用更大与类器官脂质组成的全局变化相关。此外，我们的数据表明，能源供需的不平衡导致神经元活动受损。
结果
D178N 一氧化碳培养物的生成
PRNP D178N突变通过CRISPR-Cas9基因编辑被引入未知疾病iPSC系中，其中密码子178处的天冬氨酸（D）被天冬酰胺（N）取代（S1A图）。这产生了一个用于突变的杂合子（DN）的iPSC系和一个等基因对照系（DD）。从这些细胞中分化一氧化碳培养物并生长至5-6个月大 - 对应于发达的神经生理功能的时间点（[17];参见图1A中的示意图）。为了确保所有COS都经历正常的成熟过程，我们评估了SOX2的细胞水平，SOX2是3个月与5-6个月大的干细胞标志物。在两种CO系中，SOX2在5-6个月时相对于3个月减少（图1B），表明干细胞在5-6个月时耗尽。在4-5个月时，两条系均表达神经元标志物突触素和MAP2，它们与FOXG1共表达（图1C），FOXG1是大脑皮层模式化和分层所必需的转录因子[19]。这些结果表明，CO中大量填充着类似于人类大脑皮层的神经元。总体而言，具有D178N突变的CO经历了正常的成熟过程，与同基因对照CO没有观察到差异。 因此，本研究的其余部分将集中在成熟的类器官（5-6个月大）上。
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图1. 脑类器官和朊病毒病病理学的产生。
（A）D178N突变如何被引入由健康供体捐赠的iPSC的PRNP基因的示意图，PRNP基因（DD）的两个等位基因中具有178D和129M，以产生杂合突变系（DN）。大脑类器官由DD和DN iPSCs产生，我们在它们在~5-6个月大成熟时对其进行了研究。（B）用SOX2标记的~3和~6个月大的类器官的免疫荧光图像。（C）~5个月大的类器官的免疫荧光图像，用神经元标志物突触素和MAP2以及皮质标志物FOXG1标记。插图显示放大的图像。右图是这些标记的量化。（D、E）RT-QuIC 评估来自绝症 FFI 大脑和健康大脑的对照匀浆 （D） 以及 ~5-6 个月大的 DD 和 DN CO 裂解物 （E） 中的朊病毒播种活性。（F） 蛋白质印迹显示使用 3F4 朊病毒抗体（上图）和考马斯染色测定总蛋白（下图）的 DD 和 DN CO 裂解物中的 PrP。（G）标准化为总蛋白后PrP水平的定量。（H） 在 （-） 和处理后 （+） 使用 PNGaseF 和内切糖苷酶 H 处理 （+） 后 DD 和 DN 裂解物中的 SAF32、3F4 和 EP1802Y 抗体对 PrP 进行蛋白质印迹检测。 右侧列出的首字母缩略词表示 PrP 物种/片段，包括二糖基化 （Di）、全长 （FL） 和切割 C1/C2/C3 片段的片段。右图是PrP（N到C末端）的示意图，其中包含所用PrP抗体的结合位点以及产生C1和C2片段的切割位点。（I）s100β的蛋白质印迹（左上图）和总蛋白的考马斯染色（左下图）。（J）GFAP（左上图）和总蛋白考马斯染色（左下图）的蛋白质印迹检测。（K， L）标准化为总蛋白后定量s100β和GFAP水平。（F， H， I， J）。对于每个印迹分子量标记都在左侧。（中、广、基、中）每个点都是代表类器官的“n”。数据以平均值±SEM表示。 （G， K， L） 通过韦尔奇 t 检验进行统计比较。** p<0.01， ***p<0.001.
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010565.g001
D178N CO 不显示自发朊病毒传播，但显示星形胶质细胞增多症
为了确定DN COs是否会发展为自发性朊病毒感染，我们寻找了复制朊病毒的经典生化特征;不溶性和蛋白酶-K （PK） 抗性 PrP 和朊病毒播种活性。通过高灵敏度的RT-QuIC测定在DN CO中无法检测到朊病毒播种活性（图1D和1E）。该接种测定还证实DN COs没有积累与神经变性相关的其他蛋白质，包括错误折叠的Tau[20]或α-突触核蛋白[21]。此外，蛋白质印迹未观察到淀粉样蛋白-β的增加（S2C和S2D图），然而，相对于DD COs，淀粉样蛋白前体蛋白似乎在DN中的切割增加（S2E图）。相应地，DN COs不含不溶于萨科西或抗PK的PrP物种（S2图）。有趣的是，DN中总PrP的蛋白质水平明显高于DD（图1F和1G）。正如之前在FFI小鼠模型中报道的那样[4，5]，我们观察到DN COs中二糖基化PrP水平增加（图1F），表明突变改变了PrP的翻译后修饰。我们通过用内切糖苷酶H和PNGase F酶消化PrP来评估这一点，以分别去除ER（内切糖苷酶H敏感或未成熟PrP）和总聚糖中添加的聚糖。DD和DN均显示内切糖苷酶H抗性PrP物种（图1H），其大部分被PNGaseF去糖基化为FL PrP（图1H泳道2，4，6，8）。我们还观察到与DD CO相比，DN CO中的PrP碎片增加，包括C1和C2片段（图1H）。这些结果表明，DN中的大多数PrP物种是成熟的，没有致病性;DN COs确实概括了朊病毒病的一个标志，即星形胶质细胞增多症，显示出S100Beta和GFAP的显着水平（图1I-1L）。虽然我们在DN COs中没有发现致病性朊病毒，但PrP的蛋白质水平和片段化增加加上星形胶质增生表明它们正在经历细胞应激。
D178N改变神经元群体网络通信
FFI 与神经元放电和网络通信的进行性功能障碍有关。为了确定DN COs是否表现出这种表型，我们评估了多电极阵列（MEA）的同步神经元群放电和爆发，发现DN COs表现出更少的神经元尖峰（放电）和爆发，或比对照组更长的爆发周期（图2A-2D）。与DD CO相比，DN中伽马振荡的相对振荡功率显着降低，证实了这一点（图2E和2F）。δ和θ等较慢振荡的振荡功率没有改变（图2E和S3）。神经元网络通讯的变化与DN CO中一些小分子神经递质的水平改变有关，包括乙酰胆碱，GABA，谷氨酸，NAAG和丝氨酸（图2G），表明这些神经递质的合成因突变而改变。为了确定神经元功能降低是否是由于星形胶质细胞增多引起的细胞群转移，将前脑神经元培养物与DD和DN iPSCs进行了分化。这些单一培养物也获得了类似的结果，尽管只有爆发率而没有尖峰率显着降低，这表明DN神经元具有内在功能缺陷（图2H）。DD和DN神经元之间的MAP2和突触素水平没有差异，表明突变不会减少树突棘和突触（图2I）。然而，对这些神经元与体细胞分离的神经突的分析（图2J示意图）显示DN神经元神经突中的线粒体明显多于DD神经元（图2I和2J）。总之，这支持DN COs中神经元网络通信的改变可能是由需要线粒体的过程改变树突和突触末端的小分子神经递质的合成、包装和释放引起的[20]。
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图2. D178N突变对神经元群体网络通信的影响.
（A）在~6个月大的DD和DN类器官上记录的代表性神经元放电频率和光栅图。（乙-四）通过韦尔奇t检验比较DN中的尖峰（烧制）速率（B），爆破率（C）和爆破周期（D）与DD类器官。（E）嵌入DD和DN类器官的神经元群体电信号中的代表性δ，θ以及下伽马和上伽马振荡。（F） 由韦尔奇功率谱密度估计的下伽马振荡和上伽马振荡的相对振荡功率（顶部面板代表图），并通过韦尔奇 t 检验（下图）比较 CO 线。（G） 日志2DN 神经递质水平相对于 DD CO 的倍数变化，其统计显著性程度由多学生 t 检验确定（每组 n = 5 个类器官）。通过LCMS测量神经递质水平。原始数据位于 S1 数据集代谢组学源数据文件中。（H）DD和DN单层神经元的刺突率和突发刺突率，通过Welch's t检验在细胞系之间进行统计比较。（I）用TOMM20，突触素，MAP2和DAPI标记的DD（顶部图）和DN（下图）单层神经元的代表性免疫荧光（IF）图像。左图显示覆盖有所有染色剂的图像，中间图显示TOMM20和MAP2，右图是左图所示IF图像中MAP2和突触素的定量。（J）在归一化为Coomassie染色的总蛋白后，神经突TOMM20相对于整个神经元中总TOMM20水平的蛋白质印迹分析。通过曼-惠特尼检验比较DD和DN之间的平均TOMM20。左下角的示意图显示了神经突如何与体细胞分离（B-G） 每个点都是代表类器官的“n”。所有数据均来自5-6个月大的CO。 （H， I， J） 每个“n”代表一个神经元室。数据以平均值表示 ±SEM. * p<0.05， ** p<0.01。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010565.g002
D178N突变增强氧化应激
线粒体是细胞内活性氧（ROS）的主要生产者，星形胶质细胞增生表明DN COs可能正在经历氧化应激。为了证实这一点，我们通过流式细胞术评估了细胞的ROS水平，并表明DN CO产生的ROS水平明显高于DD COs（图3A）。抗氧化剂蛋白水平的评估表明，相对于DD，DN中的硫氧还蛋白，SOD1和SOD3显着增加（图3B和3D），表明DN细胞对胞质和细胞外氧化应激有反应。与DD CO相比，最初作为负荷对照包括的平滑肌肌动蛋白在DN中也显着增加。这可能是由于如前所述，星形胶质细胞增多症的表达增加[21]。SOD2未改变，而过氧化氢酶在DN CO中减少（图3B和3C），表明线粒体抗氧化活性的参与较少。DN中其中一些抗氧化剂的活性增加表明细胞正在补偿氧化应激以保持活力。DN COs中半胱天冬酶3活性（裂解的半胱天冬酶3水平）显着降低证实了这一点，可能是为了减少凋亡细胞死亡（图3E）。使用presto蓝检测的细胞代谢水平的未改变水平和DN中相对于DD COs的钙通量表明突变CO中的细胞活力相对正常（图3F和3G）。DN COs中稳态存活机制的激活，特别是通过改变胞质和细胞外区室中抗氧化酶的水平，似乎足以管理氧化应激并保持其活力。
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图3. 在D178N CO中观察到氧化应激。
（A）流式细胞术分析DD和DN COs以及用1mM KO处理的DD类器官中ROS阳性的细胞数量2和 12.5μM 米托百草枯 （MtPQ） 以增加 ROS（阳性对照）。左图是代表性图，右图是量化，表示为ROS阳性细胞的百分比。（B） 蛋白质印迹（左上图）用于抗氧化标志物，包括过氧化氢酶 （Cat）、SOD1 和硫氧还蛋白 （Th.），以及平滑肌肌动蛋白 （SMA）。考马斯污渍加载控件位于左下面板。归一化为总蛋白后的定量在右侧面板中。（C）SOD2的蛋白质印迹（左上图），总蛋白的考马斯染色（左下图），以及校正到总蛋白后SOD2水平的定量（右图）。（D）SOD3的蛋白质印迹（左上图），总蛋白质的考马斯染色（左下图），以及校正到总蛋白质后SOD3水平的定量（右图）。（E）半胱天冬酶原3（p）和裂解半胱天冬酶3（c;左上图）的蛋白质印迹，总蛋白的考马斯染色（左下图），以及校正到总蛋白后裂解/半胱天冬酶原酶3水平的定量（右图）。（F）~6个月大时类器官细胞代谢的Prestoblue分析。（G）~6个月大时类器官中的细胞内钙水平。（乙、丙、丁、东）分子量标记显示在印迹的左侧。（A-G）通过韦尔奇t检验将DN的平均蛋白质水平与DD进行比较。每个点代表一个类器官（“n”）。数据来自5-6个月大的CO，以平均值±SEM.* p<0.05，**p<0.01，*** p<0.001，****p<0.0001表示。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010565.g003
D178N突变改变生物能量学所必需的代谢物
胞质氧化应激可能与细胞生物能量改变有关。为了探索这一点，我们评估了CO代谢物的水平（图4）。我们发现，相对于DD COs，DN含有更多的糖酵解代谢物，包括果糖1，6-二磷酸（FBP），磷酸烯醇丙酮酸（PEP）和丙酮酸，这表明突变增加了对糖酵解的依赖。有趣的是，克雷布斯循环代谢物也增加了，支持DN细胞具有更高的能量需求，这导致它们变得高度代谢活跃。DN中的葡萄糖水平高于DD COs，这表明DN COs限制了葡萄糖的使用，并利用替代能源，例如β-氧化，或者，增加糖异生，可能在星形胶质细胞中，以产生更多的葡萄糖。这两种可能性都得到了一些必需非碳水化合物代谢物（包括grycerol-3P，谷氨酰胺和谷氨酸）水平降低的支持，这些代谢物是β-氧化和从头葡萄糖合成的底物。总体而言，该突变似乎上调了与糖酵解和Kreb循环相关的生物能量学，这主要是葡萄糖依赖性的，触发细胞试图维持足够的葡萄糖水平。
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图4. 改变的代谢物与D178突变有关。
（A）代谢物的Web图，表明它们在糖酵解，磷酸戊糖途径和克雷布斯循环中的作用，显示DN与DD相比的相对变化（日志）2[折叠变化];节点颜色）和更改的 -log（p 值）（节点大小）。原始数据位于 S1 数据集代谢组学源数据文件中（n = 5 个类器官）。（B） 显示日志的热图2（倍数变化）在DN中各种代谢物相对于DD COs的水平中，每列代表单个类器官“n”。该图中的所有数据均使用LCMS方法在5-6个月大的COS上测量。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010565.g004
D178N突变改变线粒体功能
克雷布斯循环的变化以及神经突处线粒体定位的增加表明，尽管缺乏线粒体抗氧化反应，但线粒体也可能在DN CO中受到损害。在这里，我们确定了突变是否影响线粒体。用MitoTracker标记活线粒体在DD和DN CO中均显示活跃的线粒体（图5A左图），DN含有更多的线粒体标记TOMM20（图5A右两个面板），表明突变CO中有更多的线粒体。在基线水平测量线粒体耗氧率（OCR），衡量氧化磷酸化的有效性，并在用寡霉素，FCCP和鱼藤酮/抗霉素A进行顺序处理后，通过抑制复合物5，破坏质子梯度并通过抑制复合物1和3关闭线粒体功能来修饰氧化磷酸化， 分别（图5B）。通过这些测量，可以计算出某些参数，包括基础线粒体呼吸，最大呼吸能力和ATP相关呼吸（图5B左图）。DN的线粒体比DD COs更活跃，基础呼吸和最大呼吸显着增加（图5C和5D）。虽然OCR未显示ATP相关的呼吸显着增加（图5E），但总体增加的OCR与线粒体复合物V活性显着增加一致，并且DN中的内膜比DD COs显着超极化（图5F和5G）。相对于DD，DN中的复合物I活性没有改变（S4B图），这表明突变不会平等地直接影响每个呼吸复合物。鉴于细胞通常通过自噬去除受损的线粒体，我们通过TEM评估线粒体自噬，发现DN中经历吞噬作用的线粒体比DD COs更多（图5H）。为了证实DN CO中这种视觉上增加的线粒体自噬，我们测量了LC3依赖性自噬，发现DN中的自噬明显高于DD COs（图5I）。这与DN CO中解偶联蛋白UCP2水平的降低一致（S4C图）。因此，DN CO中能量需求的增加似乎对线粒体功能施加了巨大的压力，可能导致线粒体自噬增加受损线粒体的损失，同时线粒体生物发生上调以维持活力。
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图5. 线粒体活性异常与糖尿病神经病变 CO 中的自噬/线粒体自噬增加有关。
（A）用MitoTracker和NucBlue标记的DD和DN CO的免疫荧光图像（左图）以及DD和DN CO中TOMM20的蛋白质印迹分析（右图;总蛋白是上样对照;汤姆）。（乙-E）海马分析用于评估线粒体应激，方法是在基线水平上测量DD和DN CO中的耗氧率（OCR），并在用1μM寡霉素和2μM FCCP连续处理后，0.5μM鱼藤酮/抗霉素A，n = 3（B）。（B左图）示意图（使用BioRender创建），显示了如何从Seahorse原始数据中提取线粒体压力测试的参数（B右面板）。这些参数包括基础呼吸（C;蓝色），最大呼吸（D;绿色）和ATP相关呼吸（E;洋红色）。（F）在DD和DN COs中测量的线粒体复合物V（ATPase）活性相对于阳性对照（牛心脏线粒体）中的最大活性和用10μM寡霉素处理的牛心脏线粒体中的最小活性。（G） DD 和 DN COS 中线粒体偏振的强度。 （H） 4 周龄 DD 和 DN 类器官的 TEM 图像，插图（右图）显示箭头指示的线粒体的更高放大倍率图像。（I）通过检测含有免疫标记LC3的细胞来检测DD和DN COs中自噬诱导的流式细胞术分析，左侧图显示代表性图谱（蓝色图示无自噬诱导对照，DD和DN自噬图谱后面的灰色表示红色），右图显示自噬诱导比。（C-G， I）通过韦尔奇的t检验将DN中的平均读数与DD进行比较。每个点都是代表类器官的“n”。除非另有说明，否则数据来自5-6个月大的CO，并以平均值±SEM.* p<0.05，**p<0.01表示。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010565.g005
D178N突变改变脂质稳态
脂质合成中的一个重要中间体是乙酰辅酶A，它在线粒体中产生并在DN CO中增加。由于神经退行性疾病与与氧化应激增加相关的脂质稳态改变有关[22，23]，我们通过靶向LCMS检查了D178N突变对细胞脂质谱的影响。观察到一氧化碳脂质组成的实质性变化，包括多个甘油磷脂和鞘脂类别的酰基链长度的实质性变化，这可能与DN CO中的细胞性，细胞形态或细胞应激反应的变化有关（图6A和6B）。此外，相对于DD COs，DN中的中性脂质显着降低（图6A-6C）。鉴于中性脂质被包装在脂滴（LDs）中以进一步用于β-氧化和糖异生[24，25]，我们评估了CO中的LDs，发现DN CO中的LDs相对于对照显着降低（图6D和6E）。鉴于在β氧化过程中，线粒体被募集到LD以促进中性脂质的使用[24]，我们通过TEM评估了星形胶质细胞中的线粒体和LD样区室定位。我们发现DD星形胶质细胞似乎比DN星形胶质细胞拥有更多的LD样隔室，并且两条系中的一些线粒体都位于LD样结构附近（S5图）。总体而言，该突变减少了总中性脂质和LD，可能是通过β氧化利用它们的能量。
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图6. DN CO 中的中性脂质水平、储存和代谢发生改变。
（A）热图显示了五个DD和DN CO中各种脂质的相对水平（z分数），每列代表一个单独的类器官“n”。（B）散点图显示了DN中各种中性脂质物种与DD COs相比的水平。 （C）DD和DN COs中中性脂质的总水平（Welch's t检验）。（D）用MAP2（用于神经元），尼罗红染色剂（用于脂滴，LDs）和DAPI标记的DD和DN CO切片的代表性荧光图像，显示神经元中的LD。（E）神经元内LD的定量。通过韦尔奇t检验分析平均LD荧光强度。每个点都是代表类器官的“n”。（一、二）由 LCMS 测量的原始数据位于 S2 数据集脂质组学源数据文件中。数据来自5-6个月大的CO，以平均值±SEM.* p<0.05，**p<0.001表示。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010565.g006
异常表型依赖于 N178 等位基因
最后，我们质疑DN COs的表型变化有多少与N178等位基因与等位基因之间的相互作用有关。为此，我们生成了携带两个N178等位基因（NN）的iPSC，并检查了与这些等位基因不同的CO，以确定与DN CO表现出的表型的相似或不同。与DD对照相比，我们在NN CO中观察到的异常表型与DN中的异常表型大多相似（图7）。与DD相比，NN COs没有朊病毒播种活性，没有不溶性致病性朊病毒，并且主要表达二糖基化PrP（图7A，7B，S2A和S2B）。然而，与DN CO不同，PrP蛋白水平并不显着高于对照DD CO（图7B）。NN COs也缺乏tau和α-突触核蛋白播种活性，并且比DD对照具有更多的淀粉样蛋白前体蛋白切割（S2C，S2D和S2E图）。与DN对应物一样，NN COs表现出与神经元网络通信减少（图7D和7E），高神经突线粒体（图7F和7G），神经递质改变（图7H）和氧化应激（图7I）相关的星形胶质增生（图7C）。脂质组成，包括中性脂质（图7J和S6F）和LD（图7K和7L）相应地改变。这种变化与NN星形胶质细胞向LD样结构募集线粒体一致，可能使用中性脂质进行β氧化（S6图）。与DN CO一样，NN COs在糖酵解和克雷布斯循环中间体方面表现出实质性变化（图7M）。在DN和NN CO之间观察到一个显着差异;虽然TEM分析显示DN CO中的线粒体自噬增加，但NN COs没有这种表型，因此揭示D等位基因可能有助于这种细胞反应（图7N）。这些数据表明，N 等位基因是 DN CO 中大多数观察到的表型的原因，但线粒体自噬增强除外，这似乎需要存在 D 等位基因。
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图 7. 异常表型取决于 N178 等位基因。
（A） 具有两个N178等位基因（NN）的COS的RT-QUIC分析。（B） 具有代表性的 PrP 蛋白质印迹（通过 3F4;上图），其中包含总蛋白的考马斯染色（下图）和 PrP 相对于总蛋白的定量（右图） （C） 通过蛋白质印迹检测的 GFAP 水平（印迹显示在 S6A 图中）。（D、E）DD与NN CO的尖峰或神经元放电率（D）和突发速率（E）.神经振荡的原始痕迹和其他数据在S6B图中。（F）用TOMM20，突触素，MAP2和DAPI标记的DD（顶部图）和NN（下图）单层神经元的代表性免疫荧光图像。左图显示所有污渍的图像，右图显示 TOMM20 和 MAP2。（G）神经突TOMM20水平相对于总TOMM20水平的蛋白质印迹分析，归一化为Coomassie染色的总蛋白后，印迹如上所示，定量如下。（H） 日志2NN 神经递质水平相对于 DD 的倍数变化，其统计显著性程度由多学生 t 检验确定，n = 5。原始数据位于 S1 数据集代谢组学源数据文件中。（I）通过流式细胞术测量的DD和NN CO中的ROS水平。代表性图在S6E图中。（J）DD与NN中性脂质的总水平。 其他脂质数据显示在S6F图中。（K） 用 MAP2（用于神经元）、尼罗红染色（用于脂滴、LD）和 DAPI 标记的 DD（左）和 NN（右）CO 的代表性荧光图像。（L）LDs的定量。 （M）代谢物的网络图，显示NN COs与DD相比的相对变化（日志）2倍数变化;节点颜色）和更改的 -log（p 值）（节点大小），n = 5。原始数据位于 S1 数据集代谢组学源数据文件中。（N）DD和NN COs中线粒体的TEM图像（C-E，G，I，J，L）通过Welch的t检验比较DD和NN之间的平均读数。每个点都是代表类器官的“n”。数据来自5-6个月大的CO，显示为±SEM。 * p<0.05， ** p<0.01， *** p<0.001， ****p<0.0001。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010565.g007
讨论
本文旨在研究人脑类器官模型中引起FFI的PRNP D178N突变。与先前在人类神经元组织背景中观察PRNP突变E200K和Y218N（分别负责遗传性CJD和GSS病例）的研究相似[16，26]，该突变不会自发引起朊病毒病。然而，COS概括了朊病毒病的一个标志，即星形胶质细胞病。星形胶质细胞的数量和活化增加与PrP检测和片段化增加有关，以及对氧化应激的胞质和细胞外反应。神经元网络通信功能障碍与神经递质生物合成改变以及线粒体水平和生理异常有关。这与线粒体受损的证据相关，线粒体似乎引发了线粒体自噬和自噬的增加。能量生产中间体的进一步变化很大，中性脂质和脂滴损失。
在人脑组织尸检和朊病毒病的动物模型中，包括FFI，氧化应激增加通常都有报道[12，27，28]。观察到的影响PrP本身的变化也表明细胞应激。PrP表达增加和切割增加，尤其是C2切割，与氧化应激反应有关[29-33]。在CJD和小鼠朊病毒病模型中，星形胶质细胞增多症与星形胶质细胞中的氧化应激和脂质过氧化产物积累有关[34]。氧化损伤与阿尔茨海默病和朊病毒病的葡萄糖代谢中断有关[35，36]。氧化应激增强和糖代谢改变常伴有线粒体功能障碍[37]。能源需求和副产品产量的增加可能导致持续的细胞压力。
FFI患者的PET成像显示葡萄糖利用率降低，特别是在被认为疾病开始的丘脑内[38，39]。代谢减退的严重程度受密码子 129 基因型的影响，杂合子 129MV（M 始终是顺式，178N 突变）表现出更广泛的代谢减退，但疾病持续时间显着更长（35 +/- 11 个月，而 129MM 患者为 8.5 +/- 1 个月;[40]）。 在sCJD患者的大脑中，皮质区域的葡萄糖代谢降低，但基底神经节或丘脑（受累的大脑区域更多;[[41]）。 这可能与当前研究中观察到的能量转移有关，因为尽管糖酵解和戊糖磷酸途径中间体增加，但葡萄糖本身仍然很高。这可能表明细胞正试图通过切换到其他能量途径来限制葡萄糖的使用。能量通路的这些变化，以及FFI患者中代谢减退的更广泛分散，可能代表了经历最多应激的细胞的细胞补偿。事实上，星形胶质细胞网络已被证明有能力在毫米的距离内将资源从无应激组织重新分配到应激组织[42]。
伴随星形胶质细胞增多症的类器官代谢的转变是合乎逻辑的，因为星形胶质细胞和神经元优先利用不同的代谢途径。神经元表现出更高的氧化代谢，并且几乎没有使用糖酵解的能力[43，44]。相反，神经元葡萄糖通过磷酸戊糖途径代谢，这有助于通过产生NADPH来维持抗氧化平衡[43]。星形胶质细胞具有高度糖酵解性，优先于产生乳酸而不是丙酮酸进入克雷布斯循环。然后，这种乳酸可以被神经元释放出来吸收，并用作完全绕过糖酵解的能量底物。在代谢物谱中观察到的变化表明星形胶质细胞可能有助于增加糖酵解和乳酸，但对磷酸戊糖途径和克雷布周期的依赖性大幅增加也可能表明神经元代谢的变化。需要进一步检查细胞亚群，以确定这些变化是否确实发生，因为我们关于整个类器官的数据无法区分细胞贡献。
星形胶质细胞也严重参与谷氨酸和GABA的平衡[45]。能量中间体的代谢组学分析显示谷氨酸和谷氨酰胺减少，可能导致通过阻断合成观察到GABA减少。由于GABA和谷氨酸的平衡大量涉及星形胶质细胞的摄取，Krebs循环和谷氨酸池的补充需要丙酮酸羧化酶，丙酮酸羧化酶是一种主要在星形胶质细胞中表达的酶[46，47]，这可能表明FFI朊病毒病中的星形胶质增生与谷氨酸和GABA系统内的功能失调稳态有关。同样，乙酰辅酶A（乙酰胆碱的前体）的增加可能与后者检出率的增加有关，因为乙酰胆碱合成的速率不仅取决于胆碱乙酰转移酶的活性，还取决于其底物的浓度[48]。这些是FFI背景下的有趣观察结果，因为前脑胆碱能神经元有助于觉醒;它们在清醒时和快速眼动（REM）睡眠期间活跃，但在非快速眼动睡眠期间不活跃[49，50]。GABA能神经元亚群在非REM睡眠中被激活，被认为在皮质失活中起作用[50]。因此，这两个系统相互平衡。如果在FFI GABA能功能随着胆碱能功能的增加而降低，那么这可能会导致推动持续清醒的状态，从而导致睡眠模式紊乱。在早期FFI中，维持这些系统平衡的药理学维持可能被用作延缓症状发作或缓解某些症状的策略，因此可能需要进一步研究。
鉴于可用代谢物和线粒体功能的变化，脂质谱的变化也是相当预期的。观察到的甘油脂和鞘脂酰链长度的变化可能是对抗高ROS和一般细胞应激的神经保护机制[51]。此外，由于DN CO中的葡萄糖水平仍然高于DD对照，脂质的变化表明它们可能构成独立于葡萄糖的替代能量来源，导致脂滴的分解代谢增加。这表明细胞可能正在切换其能量来源以在压力下保持其活力。
先前已通过EM在FFI小鼠脑组织中观察到自噬体和自噬溶酶体增加[5]。该模型和另一种FFI小鼠模型（由敲入人PrP表位（3F4）和小鼠突变（D177N）而开发，已证明睡眠周期异常，与人类疾病一致[4]。两种模型均显示非糖基化PrP较少，类似于类器官模型和终末期FFI脑组织中的PrP条带谱[10]。这与含有增加的UDP-葡萄糖和UDP-GlcNAc水平的DN COs一致，UDP-葡萄糖和UDP-GlcNAc是蛋白质糖基化的主要前体，表明糖基化途径在突变体中上调。两种小鼠模型也产生了生化异常的PrP;然而，只有3F4敲入模型产生的PrP可传播给携带正常3F4表位的小鼠，但不能传播给野生型小鼠。PrP的这些致病特性在我们的FFI类器官模型中不存在。总之，FFI小鼠和类器官模型的发现表明，至少一些FFI病理变化不依赖于PrP传播到其错误折叠的顺应体或传播物种的能力。
衰老相关的神经变性可能不会在COS中表现出来的一个原因是，与成人相比，COS更类似于新生儿大脑皮层的固有局限性[52]。尽管缺乏疾病病理学，但观察到的异常表型表明，突变早在生命的新生儿阶段就影响大脑皮层。然而，没有关于后来被确定为D178N携带者的新生儿有任何临床异常的报告，这意味着我们观察到的异常分子和细胞表型不足以表现出任何临床表型。因此，我们推测观察到的变化与导致疾病在以后的生活中发作的慢性功能障碍有关。这与关于遗传性神经系统疾病的脑类器官模型的各种报道一致，这些模型显示一些可能导致疾病发作的神经生理缺陷[13，17，53]。 未来的研究将旨在确定当在D178N CO中建立感染时，观察到的异常表型是否发生变化或变得更加有害。
虽然据我们所知，D178N突变纯合子从未被报道过，因此，我们承认这种CO结构在生理上无关，但它确实提供了关于N等位基因对观察到的表型的贡献量的额外信息。我们观察到DN（杂合子）和NN（纯合子）CO之间存在一些差异，NN中的一些变化似乎比DN温和，这表明等位基因PrP产物之间的相互作用可能会加剧表型。由于我们只能获得NN基因型的一个克隆，因此还必须考虑到这种影响可能是由于克隆漂移降低了表型的严重程度。然而，大多数观察到的变化都存在于NN CO中，暗示该等位基因是主要原因，而没有剂量效应。
结论
在这里，我们证明了FFI的大脑类器官模型没有复制性朊病毒病。尽管缺乏活动性疾病，但突变增强了与各种异常表型相关的氧化应激，包括;星形胶质增殖质增生、神经元网络通讯受损、生物能量改变、线粒体活动功能障碍、线粒体自噬和自噬增加以及脂质代谢改变。这些异常可能是可能导致该疾病的无症状 FFI 的特征。
方法
人类伦理声明
本研究中使用的人体样本是从商业来源（应用干细胞）获得的。因此，NIH人类受试者研究保护办公室（OHSRP）已确定这些样本免于美国国立卫生研究院（NIH）机构审查委员会（IRB）的审查。
iPSC 克隆。
来自没有遗传性神经系统疾病病史的个体的诱导多能干细胞（iPSC）来自应用干细胞（ASE-9209）。两个PRNP等位基因在密码子178处含有天冬氨酸（D），在密码子129处含有蛋氨酸（M）。应用干细胞设计了CRISPR-Cas9克隆策略，进行了克隆、选择和质量控制，并为每个基因型提供了两个克隆（NN除外，其中只获得了一个克隆）。确定了七个潜在的脱靶结合位点;所有这些都位于具有3个碱基对错配的非编码区域，因此被认为不太可能影响细胞表型（S1图）。NN iPSC直接从DD细胞克隆（而不是使用DN iPSCs的顺序克隆）。
脑类器官生成和培养
在上述条件下，IPSCs常规在mTeSR1或mTeSR Plus培养基（干细胞技术）中的低生长因子基质胶（罗氏）上培养[15]。类器官分化是使用脑类器官分化试剂盒（干细胞技术）进行的，该试剂盒基于Lancaster和Knoblich开发的原始方案[54]。分化后，将培养物保持在完全维持培养基（1 × 谷氨酰胺 [赛默飞世尔]、1 × 青霉素-链霉素溶液 [赛默飞世尔]、0.5 ×非必需氨基酸 [Sigma Alrich]、0.5% [v/v] N2 [赛默飞世尔]、1% （v/v） B12 与维甲酸 [赛默飞世尔]、0.025% （v/v） 胰岛素 [西格玛奥德里奇]和 0.00035% （v/v） 2-溴化乙醇 [西格玛奥德里奇] 在 1：1 神经基础：DME-F12 培养基 [赛默飞世尔]）， 在标准培养箱条件下（5% CO2，37°C，加湿）。对于DD和DN分化，两个克隆都用于产生培养物。虽然并非所有测定都对两个克隆进行，但在使用两者的情况下，它们已合并在同一分析中。本文使用来自至少3个独立分化的类器官进行研究，并且同时开始分化来自每个基因型的类器官，以避免培养基或培养箱漂移。
前脑神经元分化和培养
使用干细胞技术单细胞传代方案将iPSC分化为前脑神经元。最初的生长是在STEMdiff SMADi神经诱导试剂盒培养基（干细胞技术）中，直到第3代，然后根据制造商的说明将培养基更改为STEMdiff前脑神经元分化，随后将培养基更改为STEMdiff前脑神经元成熟试剂盒（干细胞技术）。前脑神经元维持在成熟培养基中直至测定。对于电生理功能测定，前脑神经元以1 ×10的密度接种4细胞/孔 （~3 ×104细胞/厘米2）在低生长因子基质胶中涂有PEDOT电极的24孔MEA板（多通道系统）在进入成熟培养基时。成熟4周后进行读数。
星形胶质细胞分化和培养
神经祖细胞（NPC）使用STEMdiff SMADi神经诱导培养基（干细胞技术）与iPSCs区分开来。然后使用星形胶质细胞培养基（ScienCell）从Tcw及其同事[55]描述的NPC中分化星形胶质细胞。在第4代，在星形胶质细胞培养基中培养约4周，根据制造商的说明，使用MACS人/小鼠GLAST磁珠（Miltenyi）对培养物进行磁性分选以去除剩余的GLAST阴性细胞。细胞用于GLAST分选的两个传代内的实验。
神经突起培养与分析
诱导神经突和轴突通过孔插入膜生长（体细胞留在另一侧;图2J），在0.4 μm孔的24孔插入物（Millipore）的底面涂有低生长因子基质胶。将分化的神经元以1×10的密度接种到孔插入物中5细胞/插入神经元成熟培养基（STEMdiff前脑神经元成熟试剂盒）中，孵育7天，每3天更换一次培养基。为了分析神经突内容物，用100%（v / v）冰冷甲醇固定在插入物上培养的神经元10分钟，并用1×PBS洗涤。神经元体细胞从插入物的顶部刮掉，只留下附着在插入物底部的神经突。将含有神经突的插入物置于50μL液滴的RIPA缓冲液（Sigma;含有1×蛋白酶抑制剂）上30分钟以裂解神经突。收集裂解物，通过蛋白质印迹分析神经突线粒体。
神经电生理学
如前所述[17]，我们在带有集成放大器（多通道系统）的MEA2100系统中使用多电极阵列（MEA;嵌入60个钛铂微电极）来记录CO的神经电生理学。记录是在32°C的BrainPhys培养基（干细胞技术）中进行的。 COS通过竖琴切片网格（多通道系统）牢固地固定在电极上。在使用McRack软件（多通道系统）用高通滤波器（300-2500 Hz）过滤后，神经元群体放电（峰值）被检测为大于平均值的4个标准差（在前30秒内计算）。使用MEAnlyzer（MATLAB工具箱）通过自相关计算群体神经元爆发（>4个尖峰/100ms）及其周期性[56]。如前所述，使用MATLAB信号处理和小波工具箱计算相对振荡功率[17]。原始信号通过FIR滤波器滤波，从25，000到1000 Hz向下采样，通过连续小波转换为时频域，并通过逆小波分解为窄带频率范围（δ：< 4 Hz，θ：5-8 Hz，alpha：9-13 Hz，β：14-32 Hz，低伽马33-80 Hz，上伽马：100-200 Hz）。通过韦尔奇方法估计每个窄带的相对振荡功率，窗口长度为2000 ms，重叠为1000 ms。
对于接种在多孔电极中的单层神经元（在上文前脑神经元分化和培养方案中描述），以20，000 Hz采样原始数据，并使用高通滤波器（300 Hz; 2德·订购巴特沃斯）和一个低通滤波器（3500 Hz;4千订购巴特沃斯），使用多孔筛网软件（多通道系统）。群体神经元放电（峰值）被检测为大于平均值的4个标准差（在前10秒内计算）。神经元群体爆发在100毫秒内至少包括4个峰值。
活性氧 （ROS） 测定
该测定按照缪斯氧化应激试剂盒（Luminex）中的描述进行。使用accutase解离类器官，通过5分钟300×g离心沉淀，并重悬于1×测定缓冲液中至~1×106细胞/毫升。对于每个读数，将 10 μL 细胞样品加入 190 μL 氧化应激工作溶液中（通过将 Muse 氧化应激试剂与 1× 测定缓冲液以 1：100 稀释，并用 1× 测定缓冲液进一步稀释 1：80 制备）并在 37°C 下孵育 30 分钟，然后使用番石榴 Muse 细胞分析仪 （Luminex） 进行分析。相对于未用Muse氧化应激工作溶液（无氧化应激）处理的阴性对照，细胞被门控为M1 - 细胞负ROS或M2 - ROS阳性细胞。
丝弘电位测定
该测定按照Muse Mito电位试剂盒（Luminex）中的描述进行。使用accutase解离类器官，通过5分钟300×g离心沉淀，并重悬于1×测定缓冲液中至~1×106细胞/毫升。对于每个样品，将 100μL 重悬细胞加入 95μL Muse MitoPotential工作溶液（通过用 1× 测定缓冲液稀释 MitoPotential 染料 1：1000 制备）中，充分混合，并在 37°C CO 2 培养箱中孵育 20 分钟。在加入 5 μL Muse MitoPotenital 7-AAD 后，使用番石榴缪斯细胞分析仪测量 MitoPotential强度。
线粒体复合物1活性测定
复合物 1 活性测定使用复合物 1 酶活性微孔板检测试剂盒（比色法）（Abcam cat. ab109721）进行。将CO在洗涤剂中裂解（通过将洗涤剂原液与1×PBS）以1：10稀释到~10%（w / v）裂解物中制备。蛋白质浓度通过BCA测定法测定并在样品之间校正。将裂解物（200μL/样品/孔）加入微孔板中，并在室温下孵育3小时。每个孔用1×洗涤缓冲液（300μL/洗涤）洗涤3次，并填充200μL测定溶液（含有1×稀释缓冲液，1×NADH和1×染料）。在 ClarioStar 读板器 （BMG） 中以 450 nm 波长以 30 秒的间隔测量复合物 1 活性 30 分钟（在室温下），读数之间摇晃。
线粒体复合物5活性测定
复合物 5 活性测定使用 MitoTox 复合物 V OXPHOS 活性测定试剂盒（Abcam cat. ab109907）进行。阳性对照是试剂盒提供的牛心脏线粒体（BHM;显示最大复合物5活性），阴性对照是用20μM寡霉素处理的BHM（显示最小活性）。将CO裂解成20%（w / v 1×PBS），每个样品的40μL用于方案中描述的测定。在 ClarioStar 读板器 （BMG） 中以 350 nm 波长在 30°C 避光下测量复合物 5 活性 2 小时。
自噬测定
该测定是根据缪斯自噬测定试剂盒（Luminex;cat。CF2000930）。简而言之，将CO在试剂A（1：10，000稀释）中在37°C CO中孵育6小时2诱导自噬的培养箱，使用Accutase解离，并用抗LC3 AlexaFluor 555抗体标记30分钟，然后使用番石榴Muse细胞分析仪计数LC3阳性细胞。阴性对照CO未用试剂A处理。
普雷斯托蓝（细胞代谢）
通过PrestoBlue细胞活力试剂（Invitrogen Cat）测量细胞代谢。A13262），如前所述[15]。将CO在PrestoBlue溶液中孵育（在完全维持培养基中以1：10稀释）在CO中孵育15分钟2孵化器。在ClarioStar读板器（BMG）中以590 nm处测量PrestoBlue溶液的荧光。
钙通量测定
通过Fluo-4直接钙试剂盒（赛默飞世尔;F10471），如前所述[17]。将 CO 在 50%（v/v，在 A+ 培养基中）2× Fluo-4 直接钙试剂在 37°C 下孵育，不含一氧化碳21小时（在ClarioStar读板器BMG中），同时以每分钟494 nm激发和516 nm发射以圆形模式读取试剂的荧光。
海马检测
按照制造商方案中所述，使用 SeaHorse XFp 分析仪（安捷伦）和丝粒体检测试剂盒评估线粒体功能。海马 DMEM 培养基（安捷伦）自始至终均符合以下规格;25 mM 葡萄糖、1 mM 丙酮酸、2 mM 谷氨酰胺（安捷伦）。进行FCCP校准，适合COs的最佳浓度为2 μM。使用Accutase解离CO，并通过Matrigel粘附在海马板的底部。在海马测定后对细胞进行BCA测定，并将线粒体功能标准化为总蛋白。使用安捷伦的 Wave 软件分析结果。
代谢物和脂质样品制备
对于所有LCMS方法，均使用LCMS级溶剂。将一氧化碳样品收集在 0.5 mL 冰冷的甲醇中。对样品进行均质化，回收匀浆。向每个样品中加入0.5 mL水和0.5 mL氯仿。将样品在4°C下搅拌20分钟，随后以16，000×g离心20分钟以诱导分层。收集400 μL的顶层（水性）和底部（有机）层。将水层在1∶1甲醇：LCMS注射用水中稀释5倍。将有机层在Savant SpeedVac SPD130（赛默飞世尔科技）中干燥，并重悬于1 mL的5 μg/mL丁基化羟基甲苯在6：1异丙醇：甲醇中。将有机级分在同一溶剂中进一步稀释5倍，制备进样。
液相色谱串联质谱
三丁胺和所有合成分子参考均购自密理博西格玛。LCMS级水，甲醇，异丙醇和乙酸通过费希尔科学购买。
使用先前建立的离子对方法分析水代谢物，并添加先前建立的神经递质特征进行修饰[17，57，58]。 使用 Sciex ExionLC AC 系统分离水性馏分样品，并使用 Sciex 5500 QTRAP 质谱仪进行测量。定期进样质控样品以监测信号稳定性。使用沃特世Atlantis T3色谱柱（100 ?、3 μm、3 mm X 100 mm）在15分钟内使用5 mM三丁胺、5 mM乙酸的2%异丙醇溶液、5%甲醇、93%水（v/v）至100%异丙醇的二元梯度分离峰。使用至少两个不同的多反应监测（MRM）信号和确定的保留时间鉴定每种代谢物。
如前所述分析了块状脂质[58]。使用岛津Nexera LC-20ADXR进行色谱分析。使用具有12分钟二元梯度的水XBridge酰胺柱（3.5 μm，3 mm X 100 mm），从100%5 mM乙酸铵，5%乙腈表观pH 8.4至95%5 mM乙酸铵，50%乙腈表观pH 8.0的水来分离有机级分样品。使用具有极性翻转功能的Sciex 6500+ QTRAP质谱仪检测脂质。使用计划的MRM检测脂质。
所有信号均使用MultiQuant软件3.0.3进行积分。缺失值大于50%的信号被丢弃，剩余的缺失值被替换为最低的注册信号值。丢弃所有QC方差系数大于30%的信号。具有多个MRM的代谢物使用较高的信噪比MRM进行定量。过滤后的数据集在分析前进行归一化。在MarkerView软件1.3.1中执行单变量和多变量分析。所有单变量比较均按Benjamini-Hochberg临界值进行错误发现，如图所示。
透射电子显微镜
将COS和单层培养物（在Thermanox盖玻片上培养）在4°C下用2.5%戊二醛/ 2%多聚甲醛在0.1M二甲胂酸钠缓冲液中固定，pH 7.4。使用含有0.5%四氧化锇/0.8%铁氰化钾的溶液对CO进行后固定1小时，单层培养45分钟。将标本在1%单宁酸中染色1小时。在0.1M二甲胂酸钠缓冲液中的2%四氧化锇中真空下再次将COS后固定，并在1%乙酸铀酰中真空染色1小时。将标本在75%乙醇中脱水过夜，然后在第二天进行分级乙醇系列，并嵌入Spurr的树脂中。用RMC MT-7000超薄切片机切割70-90 nm之间的薄切片，并在Hitachi 7800透射电子显微镜上以80 kV观察并获取数字图像。
朊病毒RT-QuIC检测
RT-QuIC测定与先前报道的相似[25]。简而言之，RT-QuIC 反应混合物含有终浓度为 10 mM 磷酸盐缓冲液 （pH 7.4）、300 mM NaCl、0.1 mg/mL 银行田鼠重组 PrP23–230 M109I [7]、10 μM 硫黄素 T （ThT） 和 1 mM 乙二胺四乙酸四钠盐 （EDTA）。将COS在PBS中通过电动杵均质至10%（w / v），并以2000×g 2分钟离心清除。CO匀浆在SDS / PBS / N 2溶液中连续稀释，使用0.05%（v / v）SDS使反应混合物中的最终SDS浓度为0.001%（w / v）。将体积为 98 μL 的反应混合物加载到具有透明底部 （Nunc） 的黑色 96 孔板中，并将反应混合物接种 2 μL 103 倍稀释的 CO 匀浆，最终反应体积为 100 μL。每个样品的反应一式四份。将板密封（Nalgene Nunc International sealer），并在BMG FLUOstar Omega读板器中以42°C孵育40小时，振荡60秒（700rpm，双轨道）和60秒的整个孵育周期。每45分钟进行一次ThT荧光测量（激发，450±10nm;发射，480±10nm[底部读数]）。
α-突触核蛋白RT-QuIC分析
纯化K23Q α-突触核蛋白底物，并如前所述进行测定[17，59]。将脑和类器官在PBS中匀浆至10%，并通过短暂的2000×g离心2分钟清除。将 2 μL 指定的类器官稀释液加入到 98 μL 反应混合物中，该混合物含有终浓度为 40 mM 磷酸盐缓冲液 （pH 8.0）、170 mM NaCl、0.1 mg/ml K23Q α-突触核蛋白底物和 10 μM ThT。在96孔光学透明底板（NUNC）中一式四份评估每个类器官稀释液。每个孔都预装了六个玻璃珠（直径0.8毫米，OPS诊断）。将板密封，置于42°C的Omega FLUOStar读板器中，并以400rpm进行1分钟的双轨道振荡循环，休息1分钟40小时。每45分钟进行一次ThT荧光读数（450次激发，480次发射）。如果在40小时之前，如果>25%重复孔的荧光信号超过板上最大值的10%，则认为样品的接种活性呈阳性。使用Graphpad Prism绘制数据。
Tau RT-QuIC 分析
纯化K12CFh底物，如前所述进行测定[17，60]。简而言之，将脑和类器官匀浆（PBS中的10%w / v）在含有0.53%无tau小鼠脑匀浆（KO;来自杰克逊实验室的tauGFP）和10mM HEPES中的1×N2补充剂（Gibco）的稀释缓冲液中以十倍步骤连续稀释。将2微升指定的类器官稀释液加入到含有0.1mg/ml K12CFh底物、40 mM HEPES（pH 7.4）、400 mM NaF（缓冲于10 mM HEPES，pH 7.4）、40 μM肝素和10 μM硫黄素T的反应混合物中。在384孔光学透明底板（NUNC）中一式四份评估每个类器官稀释液。将板密封，置于42°C的Omega FLUOStar读板器中，并以500rpm进行1分钟的轨道振荡循环，休息1分钟50小时。每15分钟进行一次ThT荧光读数（450次激发，480次发射）。使用Graphpad Prism绘制数据。
萨科糖基不溶性测定
如前所述[16]，裂解物（20μL的10%w / v在RIPA裂解缓冲液中）在室温下用300μL 10%（w / v）sarkosyl处理1小时，以1400rpm恒定搅拌，用2680μLH缓冲液稀释，并在4°C下以100，000×g离心1小时。 将沉淀重悬于1×样品缓冲液中，用于蛋白质印迹分析。
蛋白酶-K （PK） 消化物
如前所述[17]，将含有1%（v/v）沙可草基的10%（w/v）裂解物在37°C下用10ug/ml PK酶解1小时，并在含有6%（v/v）2-巯基乙醇的1x样品缓冲液（Invitrogen）中煮沸5分钟，使蛋白质变性并灭活PK。 通过蛋白质印迹分析样品的PrP水平。
PNGaseF和EndoH消化物
PNGaseF消化物使用New England BioLabs PNGaseF试剂盒（P0704S）进行，Endo H消化物使用Promega（Cat.V4875）。通过在1×变性缓冲液中煮沸10分钟（通过加入1μl10×变性缓冲液）使约9μl裂解物（20%w / v在1×PBS中变性）。根据消化方案，将反应的其他组分添加到变性样品中。对于PNGaseF消化物，加入2 μL糖缓冲液2 （10×）、2 μL 10%NP-40、5 μL dH 2 O和1 μL PNGase F （500K U/ml），使总反应体积为20 μL。对于 Endo H 消化物，加入 2 μL 10× Endo H 反应缓冲液、3 μL Endo H（50K 单位）和 5 μL dH 2 O 以形成 20 μL 反应体积。将PNGaseF和EndoH反应在37°C下孵育18小时，然后在1×样品缓冲液中煮沸5分钟，用于蛋白质印迹分析。
免疫荧光
如前所述[17]，将COS在室温下固定在10%（v / v）福尔马林中24小时，用1×PBS洗涤，在室温下在10-20%蔗糖中孵育24小时，涂有蓝色染料，包埋在OCT中，并在20°C下冷冻1-2小时，并使用低温恒温器（徕卡CM 3050 S）切片成10μm厚的切片。将切片在室温下在含有0.3M甘氨酸（福尔马林淬灭溶液）、0.1%Triton X-100（透化溶液）和5%（w / v）BSA（封闭溶液）的封闭溶液中孵育1小时，以淬灭福尔马林，透化细胞并阻断非特异性结合。用一抗（在封闭溶液中）标记目标蛋白，方法是在4°C下孵育过夜，并通过在室温下孵育1小时来标记适当的二抗（抗体信息参见S1表）。通过在室温下在299nM DAPI中孵育5分钟来标记细胞核。使用EVOS-FL自动光学显微镜（Invitrogen）或共聚焦显微镜（由ZEN v.2.3软件驱动的蔡司激光扫描LSM 880显微镜）拍摄图像。对于活细胞成像，线粒体通过在含有5%CO的37°C培养箱中在200nM MitoTracker溶液（ThermoFischer Scientific;酚红阴性DMEM）中孵育45分钟来标记线粒体2，细胞核在室温下用Nucblue染色剂（Invitrogen）标记5分钟。在共聚焦显微镜中洗涤染色的活CO并以10×放大倍率成像。对于固定在10%福尔马林中的单层神经元（15分钟），用1×PBS洗涤细胞，用200mM甘氨酸处理5分钟（以淬灭福尔马林），用0.1%（v / v）Triton-X-100透化10分钟，用1×PBS洗涤，并用10%（v / v）胎牛血清和0.5%（w / v）牛血清白蛋白封闭。然后用1×PBS洗涤细胞，在1%（v / v）胎牛血清和0.5%（w / v）牛血清白蛋白中与一抗（S1表）在4°C孵育过夜，用1×PBS反复洗涤，在室温下在适当的二抗中孵育1小时，用含有290nM DAPI的1×PBS洗涤，并在成像前用ProLong-Gold抗淬灭封片剂（Invitrogen）在室温下固化24小时。
蛋白质印迹
裂解物通过在含有~6（v / v）β-巯基乙醇的1×样品缓冲液中煮沸5分钟而变性。变性裂解物在Bolt 4–12%Bis-Tris凝胶（Invitrogen）中分离（~27 μL裂解物/孔），并转移到PVDF膜（密理博）中。标记物是SeeBlue或Novex Sharp预染色蛋白标准品（Life Technologies）。用EveryBlot封闭缓冲液（Biorad）封闭膜10分钟，并在一抗中孵育（室温下孵育1小时或在4°C下孵育过夜），在室温下在适当的二抗中孵育1小时（抗体信息和稀释液参见S1表）。使用ECL Select（Amersham），SuperSignal West Femto最大灵敏度底物或SuperSignal West Atto终极灵敏度化学发光底物（Thermo Scientific）可视化蛋白质条带，并通过iBright成像系统（Invitrogen）成像。全印迹图像如S1图所示。
数据分析
使用ImageJ进行蛋白质印迹定量。所有统计分析均使用GraphPad Prism 8进行。对于类器官和单层神经元的实验，每个“n”代表一个生物重复，分别是单个类器官或神经元室。点图上的每个点都是一个单独的“n”。用于每种分析的统计分析方法列在图例中。
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选定的gRNA和脱靶谱。
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S1 图 选定的gRNA和脱靶谱。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010565.s001
（提夫）
S2 图 神经退行性疾病相关蛋白朊病毒、α-突触核蛋白和tau在突变CO中检测不到。
（A） DD、DN 和 NN CO 以及感染 22L 搔痒症的小鼠脑匀浆中 PrP 的蛋白质印迹分析 （PrP锰）用蛋白酶-K（PK）消化后。（B） DD、DN 和 NN CO 以及感染 PrP 的小鼠脑匀浆中 PrP 的蛋白质印迹分析锰用沙科西溶解后。（中、丁）没有证据表明α-突触核蛋白或Tau相关的疾病积累。RT-QuIC 分析错误折叠的α-突触核蛋白 （C） 或 tau（D）。显示每次稀释的阳性重复孔百分比（参见方法）。稀释表示为初始脑或类器官组织的对数稀释。脑组织对照显示为正方形，而类器官样品显示为圆形。彩色标记表示稀释。A 中的虚线表示 25% 阳性阈值，样本需要高于该阈值才能被视为阳性。路易体 DLB = 痴呆，CBD = 皮质基底节变性，CVD = 脑血管痴呆，sAD = 散发性阿尔茨海默病，KO = Tau敲除小鼠。（E）使用6E10抗体对淀粉样蛋白前体蛋白和β淀粉样蛋白进行蛋白质印迹分析。中间面板是较长的印迹曝光时间，以最大限度地提高β淀粉样蛋白的可见度。下图是总蛋白的考马斯染色剂。分子量标记物（KDa）列在左侧。数据来自5-6个月大的CO。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010565.s002
（提夫）
S3 图 δ振荡和θ振荡的相对振荡功率。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010565.s003
（提夫）
S4 图 线粒体功能。
（A）DD和DN CO中线粒体复合物1活性的分析（详见方法）。左侧面板显示完整的 30 分钟录制。右侧面板显示过去 5 分钟的平均值。（B）DD和DN类器官中UCP2的蛋白质印迹（左上图），总蛋白的考马斯染色（左下图），以及校正到总蛋白后UCP2水平的定量（右图）。（一、二）通过韦尔奇t检验比较CO线之间的平均读数。数据以±SEM表示。 * p<0.05 数据来自5-6个月大的CO，并以±SEM表示。 * p<0.05。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010565.s004
（提夫）
S5 图 脂滴 （LD） 样微室的 TEM 分析及其与 DD、DN 和 NN 星形胶质细胞中线粒体的定位。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010565.s005
（提夫）
S6 图 关于 NN 和 DD CO 之间比较的其他数据。
（A） DD、DN 和 NN CO 中 GFAP 水平的蛋白质印迹分析。 （B） ~5-6 个月大的 DD 和 NN CO 的光栅图（底图）和神经元放电频率图（上图）。 （C） DD 和 NN CO 神经元电信号的增量、θ 和 γ 振荡的代表性迹线。 （D） DD 和 NN CO 中下伽马（左图）和上伽马（右图）振荡的相对振荡功率。通过韦尔奇t检验比较组间的平均振荡功率。每个点都是代表类器官的“n”。（E）通过流式细胞术分析DD（上图）和NN（下图）中ROS的代表性图。（F） 热图显示了五个 DD 和五个 NN CO 中各种脂质的水平。 原始数据位于 S2 数据集脂质组学源数据文件中。数据来自5-6个月大的CO。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010565.s006
（提夫）
S1 表。 用于蛋白质印迹 （WB） 和免疫荧光 （IF） 分析的抗体信息。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010565.s007
（提夫）
S1 数据集。 代谢组学源数据。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010565.s008
（三十）
S2 数据集。 脂质组学源数据。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010565.s009
（三十）
S3 数据集。 数字中包含的数字数据。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010565.s010
（三十）
确认
我们感谢Clayton Winkler博士和James Striebel博士对手稿的批判性阅读。
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