录调节模块控制视网膜色素上皮分化，并揭示年龄相关性黄斑变性的遗传风险
马扎尔·科恩-古尔卡尔 ，阿胡维特·大卫 ，纳马·梅西卡-戈尔德 ，麦·埃舍尔，沙伊·奥瓦迪亚，尼塔伊·祖克巴尔，玛丽亚·艾德尔森，亚米特·科恩-塔亚尔，本杰明·鲁比诺夫，塔玛尔·齐夫，梅厄·沙迈，冉埃尔康 ，露丝·阿什里-巴丹
发布时间：2023 年 1 月 17 日
抽象
组织特异性转录因子（TFs）通过与非编码调控区（顺质体）的结合来控制转录组。确定决定特定细胞命运的TF组合，其特定的顺质体并检查它们参与复杂的人类特征仍然是一个重大挑战。在这里，我们专注于视网膜色素上皮（RPE），这是视网膜发育和功能的基本谱系，也是年龄相关性黄斑变性（AMD）中受影响的主要组织，这是失明的主要原因。通过结合干细胞衍生的人RPE的机制发现，小鼠体内功能研究以及全球转录组学和蛋白质组学分析，我们发现关键的发育TFs LHX2和OTX2在含有LDB1和SWI/SNF（BAF）的转录模块中共同发挥作用，以调节RPE转录组。重要的是，已鉴定的LHX2-OTX2顺质体与已发表的表达数量性状位点，来自人类RPE的ATAC-seq数据和AMD全基因组关联研究（GWAS）数据之间的交集，然后使用报告基因测定进行功能验证，揭示了一种因果遗传变异，该变异通过调节其启动子上的LHX2转录活性来改变RPE中的TRPM1表达，从而影响AMD风险。综上所述，报道的LHX2和OTX2顺质体，鉴定的下游基因和相互作用的辅助因子揭示了RPE转录模块，并揭示了多因素常见盲病AMD中单核苷酸多态性（SNP）的因果调节风险。
引文： 科恩-古尔卡尔 M， 大卫 A， 梅西卡-戈尔德 N， 埃谢尔 M， 奥瓦迪亚 S， 祖克-巴尔 N， 等人. （2023） LHX2-OTX2 转录调节模块控制视网膜色素上皮分化，并揭示年龄相关性黄斑变性的遗传风险。公共科学图书馆生物学21（1）： e3001924. https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001924
学术编辑： 王穗，斯坦福大学医学院，美国
收到： 四月 15， 2022;接受： 11月 16， 2022;发表： 1月 17， 2023
版权所有： ? 2023 科恩-古尔卡尔等人。这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。
数据可用性： 本研究中生成的RNA-seq和ChIP-seq数据集可从GEO获得，入藏号为GSE178166。所有其他相关数据均在论文及其支持信息文件中。
资金： RA-P实验室得到了以色列科学基金会（1128/20），两国科学基金会（2013016）和欧盟COST计划在COST Action CA-18116下的资助，ANIRIDIA-NET得到了以色列卫生部首席科学家办公室和特拉维夫大学癌症生物学研究中心的第317652号资助（部分）支持。RA-P和RE由以色列科学部（3-17557）支持。MC的博士奖学金得到了以色列特拉维夫大学萨克勒医学院克莱尔和阿梅迪马拉蒂埃失明和视觉障碍研究所的支持。R.E.是特拉维夫大学Edmond J. Safra生物信息学中心的教职研究员。ME部分得到了特拉维夫大学Edmond J. Safra生物信息学中心的奖学金支持。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。
竞争利益： 提交人声明不存在相互竞争的利益。
缩写： .AI 等位基因失衡;AMD， 年龄相关性黄斑变性;bHLH-LZ， 基本域螺旋-环-螺旋亮氨酸拉链;CRE，顺式调节元件;度 差异表达基因;DMEM， 杜尔贝克的改良鹰的媒介;ECM， 细胞外基质;eQTL， 表达-数量性状位点;罗斯福 错误发现率;全球气体保护协会， 基因集富集分析;全球气体系统， 全基因组关联研究;IDM 同源域;国家发展倡议 击 倒;摇头丸 连锁不平衡;米特夫， 小眼症相关性 TF;KSI 非沉默;体育 色素上皮;RPE， 视网膜色素上皮;嘟?? 短发夹核糖核酸;单核苷酸单核苷酸， 单核苷酸多态性;TF， 转录因子;TSS， 转录起始位点
介绍
年龄相关性黄斑变性（AMD）是老年人不可逆视力损害的主要原因，约占西方国家法定失明的50%。AMD易感性取决于遗传因素和环境因素的共同作用[1，2]。几项全基因组关联研究（GWAS）已应用于AMD，从而确定了大约50个与该疾病风险增加显着相关的位点。这些 AMD 相关位点包含 1，000 多个候选风险单核苷酸多态性 （SNP）。对于大多数这些AMD位点，致病变异，其作用方式和受影响的靶基因是未知的。这主要是由于我们对非编码基因组变异的功能意义的理解有限。因此，破译复杂疾病（如AMD）中基因组变异的功能意义，需要识别和研究控制疾病病理学中涉及的谱系的分化和维持的调节区域。
AMD的发生涉及几种组织类型之间的相互作用，主要作用归因于视网膜色素上皮（RPE）细胞，RPE是位于绒毛细血管和感光器之间的偏振色素上皮的单层屏障，对视网膜光感受器和脉络膜的发育、健康、存活和功能至关重要[3，4].在 AMD 中，RPE 功能障碍导致 RPE 基底膜上沉积物（称为玻璃膜疣）进行性积累，最终导致缺氧和脉络膜新生血管形成和/或 RPE 和感光细胞的进行性丧失。组织特异性基因表达（包括RPE的表达）的获取和维持是通过DNA结合转录因子（TFs）和表观遗传因子的组合活性完成的，这些活性共同将转录活性限制在携带增强子功能的基因组的约2%。绘制RPE的组织特异性顺式调控元件（CREs）和负责这些调控元件选择的TF对于理解控制细胞特异性转录程序的获取和维持的机制以及解决CRE对复杂疾病（如AMD）的贡献至关重要。
RPE 起源于视囊泡的双电位神经外胚层。按照规范和形态发生，神经外胚层细胞变成双层视杯，由色素上皮（PE）祖细胞的外层和视网膜祖细胞的内层填充。RPE在胚胎发生和出生后阶段逐渐获得其细胞特异性表型，包括形成选择性视网膜-血液屏障，通过色素颗粒保护免受光诱导的氧化毒性，表达视网膜细胞循环所需的视觉周期基因，以及通过脱落盘的昼夜节律吞噬作用更新外段（综述于[5-7]）。
据报道，基于突变小鼠的表型分析，几种TF在RPE分化和维持中发挥作用。其中，Otx2是配对型HDTF，对于前神经板的模式化以及随后前脑、中脑和早期眼原基的形成至关重要，并且在后期发展中也需要RPE分化[8-12]。Otx2在成人RPE中也维持，这是表达多个RPE基因所必需的[13-16]。Otx2在RPE中的活性归因于其对小眼症相关TF（Mitf）的调节和相互作用，Mitf是黑色素细胞和眼色素细胞的规范和分化所必需的基本结构域螺旋-环-螺旋亮氨酸拉链（bHLH-LZ）TF[15-19]。
另一个重要的早期眼睛决定因素是Lim HD TF Lhx2，这是苍蝇Apterous（ap）基因的同源物。Lhx2是视囊泡形成所必需的[20]，这一功能归因于其对PE和视网膜TF、Mitf和Vsx2的调节，以及通过限制中线结构的命运在神经原基模式化中的作用[21-24]。在发育过程中，视网膜Lhx2及其强制性辅助因子LIM结构域结合蛋白LDB1/2（苍蝇中的dLDB/Chip）在调节视网膜祖细胞增殖和能力方面发挥作用[25-28]。到目前为止，Lhx2在指定视杯祖细胞的RPE分化中的作用尚未直接解决。然而，LHX2在人类RPE分化中的重要性与其在9个RPE核心基因中的鉴定有关，其中包括OTX2和MITF，当错误表达时，它们有可能诱导人成纤维细胞直接转分化为人RPE样细胞[29]。然而，目前尚不清楚这些因素如何在RPE分化中共同发挥作用，包括转录复合物的组成，相关的顺式调控位点，表观遗传重塑因子的参与以及与视网膜疾病机制的相关性。在这里，我们研究了Lhx2 / LHX2在开发由干细胞产生的小鼠和人类RPE（hES-RPE）中的应用。通过功能和基因组分析，我们发现LHX2在调节靶基因的共享基因组区域（顺质体）上与OTX2一起在上游起作用。通过该前馈调节模块LHX2-OTX2控制RPE转录程序。蛋白质组学分析进一步揭示了LHX2和OTX2的辅助因子，这些辅助因子可能介导组织特异性基因调控，包括LDB1和SWI / SNF染色质重塑复合物。最后，将LHX2-OTX2结合顺质体的图谱与AMD上发表的基因组数据相交，揭示了一种因果非编码风险-SNP，其作用是通过调节LHX2与其启动子的结合来改变RPE中的TRPM1表达。该研究举例说明了组织特异性转录调节因子，其顺质体和下游基因调节网络的描述如何为复杂疾病的病理学提供见解。
结果
LHX2 是维持体内和分化人 RPE 中 RPE 基因表达所必需的
为了直接检查Lhx2在体内特定RPE祖细胞中的作用，我们使用Lhx2洛克斯·行[30]和Dct-Cre（以前称为Tyrp2-Cre [31]）。Dct-Cre在视杯的特定PE祖细胞中具有活性，从胚胎第10天（E10）左右开始RPE分化开始[31-33]。分析是在Lhx2loxP/loxP;Dct-Cre（称为Lhx2-PE-cKO）小鼠和对照不携带Dct-Cre的同窝伴侣。在出生后第0.5天（P0.5），对照小鼠中的PE形成单层RPE（图1A）。相反，Lhx2-PE-cKO小鼠的PE是无色素和多层的（图1B）。位于外周视杯中的PE祖细胞通常分化为虹膜和睫状体的色素层[34]。这些前部结构，包括玻璃体，在Lhx2-PE-cKO小鼠中无法形成，进一步导致严重的先天性小眼症（图1A和1B）。
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图1. Lhx2是维持小鼠RPE命运所必需的。
Lhx2loxP/loxP控制（A、C、E、G、I、K）和 Lhx2loxP/loxP;D通过苏木精和伊红（HE）在P0（A，B）和E12.5通过抗体标记分析的RPE（B，D，F，H，J，L）中的ct-Cre条件突变，以检测（C，D）Cdh3（绿色）和Lhx2（红色）;（东、女）手套（绿色），Pax6（红色）;（G， H）Cdh1（绿色），Otx2（红色）和E16.5处通过抗体标记检测（I，J）Cdh1（绿色），Otx2（红色）;（K， L）Sox9（绿色），Lhx2（红色）。用DAPI（蓝色）复染。下面的插图是 RPE 的更高放大倍率，表示合并和单独的通道。比例尺在A、B中为100μm，插图均为10μm。比例尺 C–L 为 50 μm，下部插图为 10 μm。CB，睫状体;HE，苏木精和伊红;L，镜头;NR，神经视网膜;RPE，视网膜色素上皮;V，玻璃体。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001924.g001
在Lhx2-PE-cKO的胚胎视杯中也明显地发生了明显的形态和分子变化。虽然E12.5处对照小鼠的PE组织在表达Lhx2和P-钙粘蛋白的单个上皮层中（P-cad / Cdh3，图1C），但在Lhx2-PE-cKO胚胎的PE中未检测到Lhx2蛋白，并且PE杂乱无章，未能表达Cdh3（图1D）。TFs Pax6，Mitf和Otx2以及细胞粘附分子E-钙粘蛋白（E-cad / Cdh1）通常在此阶段和后期表达（图1E，1G和1I），在Lhx2-PE-cKO RPE中均表现出降低的水平（图1F和1H）。Otx2和Cdh1的缺失在后期Lhx2-PE-cKO多层结构中持续存在（E16.5，图1J）。与上述TF相反，Sox9表达在Lhx2-PE-cKO RPE中保持不变，表明其表达与Lhx2活性无关（图1K和1L）。我们进一步研究了Lhx2突变RPE是否经历了细胞命运向神经组织的变化，如之前报道的Otx2或Mitf突变小鼠[12，17]。然而，我们没有检测到Lhx2-PE-cKO PE中Vsx2，Tubb3 / Tuj1或NF-165的错误表达（S1图）。因此，我们得出结论，Lhx2是维持PE的色素和神经能力所必需的。
为了研究LHX2在分化人类RPE中的作用，我们利用了由人类胚胎干细胞（hES-RPE）产生的人类RPE。这些细胞作为来自诱导多能干细胞的RPE，先前有报道称，基于动物模型中视网膜变性的挽救，这些细胞具有终末分化特性，包括形态、基因表达和功能，目前已用于细胞替代疗法的临床试验[4，35，36].hES-RPE在分裂时脱离后部分去分化，但在分化条件下生长14天（d14）时，它们确实恢复了分化特征。从去分化到分化表型的转变从细胞大小的减小和多边形形状、色素沉着和细胞极性的获得中很明显（S2A 和 S2B 图）。与d14上细胞中末端分化特性的出现一致，比较d5和d14 hES-RPE表达谱的基因集富集分析（GSEA）（S2C图，S1表，[33]）表明，在d14上调的基因对RPE特征基因具有很强的富集性，先前被确定为在人类RPE中高度表达[37].这进一步表明，hES-RPE为研究人类RPE中的组织特异性基因调控程序提供了一种有效的细胞模型。
为了在全球范围内鉴定终末分化人类RPE中LHX2调控的基因，我们使用慢端介导的短发夹RNA（shRNA）在hES-RPE（d14）中进行了LHX2的敲低（KD）。慢病毒载体包括用于检测转导细胞的GFP（图2A-2F，绿色）。LHX2、CDH1和OTX2在用非沉默（NS）shRNA转导的hES-RPE中检测到（图2A-2C和S2为单独的通道），但它们的所有水平在LHX2-shRNA转导细胞中均降低（图2D-2F和S2为单独的通道），与Lhx2-PE-cKO胚胎小鼠突变体的结果一致。 为了鉴定LHX2-KD和对照hES-RPE之间基因表达的全局变化，我们对LHX2-KD和对照hES-RPE细胞进行了RNA-seq。该分析确定了262个差异表达基因（DEG）：LHX2-KD细胞中195个下调基因和67个上调基因（|折叠变化|> 1.5，调整后<0.05;图2G;S2A 表）。
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图2. LHX2 是维持 hES-RPE 中 RPE 命运所必需的。
（A–F）分化的hES-RPE（d14）的慢病毒转导与对照NS-shRNA （A-C）或LHX2-shRNA （D-F）。GFP（绿色），由转导细胞中的病毒载体表达。NS-shRNA （A-C） 或 LHX2-shRNA （D-F） 转导细胞与 GFP 和 LHX2 （A， D）、CDH1 （B， E）、OTX2 （C， F） 抗体共标记。A–F 中的条形为 10 μm。（G）比较LHX2-KD细胞和NS-shRNA hES-RPE对照分化（d14）hES-RPE细胞的差异表达分析的火山图（差异基因显示|FC|>1.5和罗斯福<5%）。（H）LHX2 KD分化（d14）hES-RPE细胞中下调和上调基因的GO项富集（与非特异性shRNA转染的对照分化hES-RPE细胞相比）。（I）GSEA分析表明，分化的hES-RPE细胞中LHX2 KD下调的基因在RPE特征基因和ECM基因中显着富集。（J）应用于LHX2 ChIP-seq检测到的1，278个峰的从头基序分析发现LHX2和OTX2结合基序的富集非常显着。（K）由ChIP-seq定义的一组假定的LHX2直接靶基因显示，对于LHX2敲低的hES-RPE细胞中的表达显着下调。ECM，细胞外基质;罗斯福，错误发现率;GSEA，基因集富集分析;NS，非沉默;RPE，视网膜色素上皮;shRNA，短发夹RNA。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001924.g002
LHX2 KD后下调基因的患病率高于上调基因，这支持LHX2作为转录激活因子的作用，这与LHX2在其他谱系（包括视网膜祖细胞和毛囊干细胞）中的作用方式一致[38，39]。GO富集分析表明，下调基因在与细胞粘附相关的生物过程中显著富集（p = 3.86 × 10?10）、细胞外基质（ECM）组织（p = 3.38×10?10）和眼睛发育（p = 5.64 × 10?10) (图 2H，S3 表）。LHX2-KD和对照细胞的比较GSEA进一步证明，下调基因富集了RPE标记[37]和ECM基因（图2I）。在LHX2-KD细胞中下调的关键RPE基因包括RPE65（FC = -10.3），TYR （FC = -11.4），BEST1（FC = -8.5），CDH1（FC = -4.6），TRPM1（FC = -18.4），TRPM3（FC = -6.2），MITF 和OTX2（FC = -1.7）。综上所述，在人和小鼠RPE中，LHX2是维持RPE命运的关键，因为它调节主要的RPE基因以及对RPE的上皮形态很重要的粘附和ECM蛋白。
人类RPE中LHX2结合增强子和靶基因的鉴定和表征
在 LHX2 KD 后在 hES-RPE 或 Lhx2-PE-cKO 小鼠 RPE 中表达的基因可能是 LHX2 的直接靶标或受发育调节因子影响的间接靶标，而发育调节因子本身就是 LHX2 的直接靶标。为了鉴定LHX2的直接靶标并描绘其在RPE中的基因调控网络，我们使用LHX2抗体进行了染色质免疫沉淀，然后进行了测序（ChIP-seq），以系统地绘制d14 hES-RPE细胞中内源性LHX2结合的基因组区域。该 ChIP-seq 分析确定了 1，278 个峰，这些峰根据它们与最近转录起始位点 （TSS） 的距离映射到 984 个基因（S4 表）。正如预期的那样，使用Homer [40]的从头基序分析表明，检测到的峰对于已知的LHX2结合基序高度富集（84%的LHX2峰含有LHX2结合基序，p = 1 × 10?174; 图2J）。值得注意的是，第二个得分最高的基序是OTX2结合基序，在73%的LHX2峰中检测到（p = 1×10?76; 图2J，见下文），表明这两个TF在调节RPE转录组方面的潜在功能合作。
接下来，我们将LHX2-KD RNA-seq和LHX2 ChIP-seq数据集链接，将每个峰与其最近的基因TSS联系起来。在定位于LHX2峰的984个基因中，基于RNA-seq的分化hES-RPE细胞中检测到741个。值得注意的是，作为一个群体，这741个推定的LHX2靶基因的表达水平在LHX2 KD上显着下调（Wilcoxon测试p = 2.5×10?85; 图 2K）。在分化的hES-RPE细胞中，LHX2 KD上显着下调的推定直接靶标包括与RPE命运，形态和生理学的重要功能类别相关的基因，包括细胞粘附，ECM分子和离子通道（钙粘蛋白：CDH1，PCDH7;胶原蛋白：COL8A1，COL4A3;整合素：ITGB8;层粘连蛋白：LAMA2和离子通道TRPM1 / 3 ）和关键转录调节因子（MITF、OTX2、SOX5、SOX8; S2A 表）。这些结果强烈表明，LHX2是细胞命运，形态和功能不同方面所需的多个RPE基因的直接调节因子。
LHX2和OTX2在人类RPE中的共同直接靶标
OTX2是被确定为LHX2推定直接转录靶标的基因之一。这是基于其在 hES-RPE 和条件突变小鼠中 LHX2 KD 后的表达减少（图 1 和 2），以及检测与 OTX2 基因相关的 2 个 CRE 中的 LHX2 结合位点（S4 表，峰 355 和 356）。
既往报道，RPE规范需要OTX2，它在成熟RPE的光感受器存活中发挥作用[12，14，29]。因此，在hES-RPE和小鼠RPE中分别在LHX2 KD/cKO之后下调OTX2表明，它可能是LHX2功能调节RPE基因的关键介质。事实上，先前在成人RPE和视网膜细胞中使用Otx2条件突变鉴定的OTX2靶基因集[14]在LHX2-KD RPE细胞中显着下调（图3A，S2B表）。
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图3. LHX2和OTX2在人类RPE中的共同直接靶标。
（A）先前通过Otx2消融小鼠视网膜中的表达分析鉴定的一组假定的Otx2靶基因在LHX2 KD上的RPE中显着下调。Otx2消融视网膜的表达分析检测到一组52个下调基因[14]。我们能够将这些基因中的41个映射到一个独特的人类直系同源基因。其中，在我们对RPE细胞的RNA-seq分析中检测到28个基因。与对照细胞相比，这组28个基因显示，与对照细胞相比，LHX2敲低的RPE细胞的基因表达显着降低（使用Wilcoxon检验计算的p值）。（B）通过OTX2 ChIP-seq峰上的从头基序分析检测到的顶部富集基序对应于已知的OTX2结合基序。（C）LHX2和OTX2结合位点相对于其最近的TSS的位置分布。两个TF都显示出广泛的分布，其中50%的峰位于距离其最近的基因>40 kbp。（D）观察到的LHX2和OTX2结合位点（864个重叠位点）之间的重叠非常显着，如1，000个排列测试所示，其中平均重叠为105个位点。KD，击倒;RPE，视网膜色素上皮;TF，转录因子;TSS，转录起始位点。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001924.g003
重要的是，如上所述，基序分析检测到OTX2结合位点是LHX2 ChIP-seq鉴定的峰中得分第二高的基序（图2J）。因此，OTX2的已知靶标与LHX2结合位点相关，这表明这两个TF共同调节RPE中一组共享的靶基因。为了直接检查 hES-RPE 中 LHX2 和 OTX2 结合位点之间的重叠程度，我们使用 ChIP-seq 分析了分化 hES-RPE 细胞 （d14） 中 OTX2 结合的基因组区域。OTX2 的 ChIP-seq 分析确定了 6，461 个峰，这些峰根据与 TSS 的接近程度映射到 3，480 个基因（S5 表）。从头基序分析表明，这些基因组区域对于已知的OTX2结合基序高度富集（76.4%的OTX2峰含有OTX2结合基序，p = 1 × 10?1060; 图3B）。接下来，我们描述了OTX2和LHX2峰相对于其最近的TSS位置的全球分布。有趣的是，两者都显示出广泛的距离分布。在LHX2的情况下，到其最近的TSS的平均距离约为134 kbp（中位数=约46 kbp，图3C），对于OTX2，平均值约为126 kbp（中位数=约43 kbp，图3C）。 LHX2和OTX2结合位点的分布共同支持两种TF在基因调控中的作用，主要是通过远离TSS的远端增强子区域。
基因组中的相似分布和结合位点内的基序富集表明LHX2和OTX2的共同占有。接下来，我们与LHX2（1，278）和OTX2（6，461）绑定的区域相交，发现68%的LHX2绑定的站点也与OTX2绑定（864个站点;S6 表）。这2个TF的共同占用程度非常显著（p < 1×10?5;基于排列测试，参见材料和方法，图3D）。两个TF占据的位点均显示出OTX2和LHX2结合基序的显着富集（在其中582个峰上检测到两个TF的结合基序;p = 1 × 10?103和 p = 1 × 10?98），表明这2个RPE调节因子的合作直接染色质结合。LHX2和OTX2共同占据的864个位点与720个基因相关，基于与TSS的接近程度（S6表）。
我们的转录组学分析确定了195个基因，这些基因在LHX2 KD的hES-RPE中显着下调。其中，我们的 ChIP-seq 分析将 71 个 （36%） 确定为直接 LHX2 靶基因，134 个 （69%） 为直接 OTX2 靶基因（基于 OTX2 结合位点与基因 TSS 的接近程度），包括 OTX2 本身和几种以遗传性视网膜变性形式发生突变的基因（例如，RPE65、BEST1、MITF、TYR、MYO7A 和 TIMP3）以及与 AMD 风险升高相关的基因（例如， COL8A1，TRPM1）。值得注意的是，在这71个LHX2的下调直接靶标中，有69个（97%）被确定为OTX2的靶标，表明与OTX2的合作对于LHX2在RPE中的转录活性很重要（维恩图和基因调控网络图4A和4B）。未被检测为LHX2直接靶标的另外65个OTX2靶基因的下调可归因于在LHX2-KD RPE细胞中观察到的OTX2表达显着降低。
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图4. LHX2-OTX2基因调控网络和通过报告基因对CRE-OTX2的功能验证。
（A）基于与结合调控区域的接近程度和LHX2 KD之后的基因下调，OTX2和LHX2预测基因靶标之间的重叠。（B）hES-RPE细胞中LHX2和OTX2基因调控网络的模型（使用BioTapestry生成;http://www.biotapestry.org/）。（C）先前确定的hs1150增强子中与LHX2和OTX2（CRE-OTX2）相关的保守基因组区域的概述。显示了 LHX2 和 OTX2 的 ChIP-seq 峰值和基序。（D）归一化以控制PGL4.23-Empty的PGL4-CRE-OTX2报告活性是由LHX2和OTX2的共表达诱导的，而不是单独由每个TF诱导的相对升高。p值通过单因子方差分析计算，匹配并与Tukey检验进行多重比较（N = 7，数据和分析详见S10表）。CRE，顺式调节元件;KD，击倒。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001924.g004
检测 OTX2 上游的 2 个 LHX2 和 OTX2 结合位点支持 OTX2 的自动调节。事实上，其中增强子位于OTX2上游约150，000 bp（LHX2_peak_356，Otx2_d14_peak_1839;S6 表）包含在先前报道的名为HS1150的进化保守增强子元件中[41]。已被证明可以驱动模拟Otx2的模式表达，包括在RPE中，支持该区域在Otx2调控中的功能[42]。为了检查该基因组区域的转录活性（CRE-OTX2; 1352 bp，chr14：57418450–57419802 （hg19），图4C），我们在D407中使用了荧光素酶报告基因测定，D407是一种缺乏OTX2表达的人RPE细胞系[43]。
监测荧光素酶报告基因活性，标准化为Renilla以考虑转染效率，以响应LHX2或OTX2或两者的过表达（图4D和S3）。CRE-OTX2的归一化荧光素酶活性相对于空的PGL4.23载体通过LHX2过表达（约13倍p = 0.012，N = 7）和OTX2过表达（约14倍，p = 0.03，N = 7）显着诱导 。 LHX2和OTX2的过表达进一步增强了相对报告活性（约21倍，p = 0.01，N = 7）。与单独使用LHX2和OTX2相比，LHX2和OTX2过表达后的报告基因活性增强（图4D）进一步支持了它们在CRE-OTX2上的共享转录活性。
综上所述，我们的整合RNA-seq和ChIP-seq分析在基因组规模上揭示了LHX2和OTX2靶向的共享顺式调控区域，以及这两个关键TF在维持RPE基因表达方面的前馈调控层次结构。报告基因测定进一步支持2种TF在激活保守的OTX2增强子方面的综合功能，该增强子可能参与人RPE中OTX2表达的自动调节。
hES-RPE 中的 LHX2 和 OTX2 蛋白辅助因子
LHX2和OTX2结合的众多基因组区域以及与这些区域相关的基因表达减少（基于邻近性）表明，这些因素在CRE上共同起作用以调节RPE中的基因表达。
为了鉴定与LHX2和OTX2相互作用的因子，我们从hES-RPE（d14）制备的核提取物中免疫纯化了LHX2或OTX2，并与使用质谱（IP-MS）的IgG对照相比鉴定了显着相关的多肽。在两种免疫沉淀物中，我们检测到与用于免疫纯化的抗体对应的相应蛋白质的强烈富集，支持抗体的特异性（图5A）。此外，与OTX2相互作用的蛋白质中有MITF，此前有报道称MITF在组织培养物中使用下拉测定法与OTX2相互作用[16，18]。然而，我们没有在OTX2免疫沉淀物中检测到LHX2肽，反之亦然。这可能是由于蛋白质复合物的稳定性低和/或这些蛋白质之间相互作用的间接性质，这可能取决于其他辅助因素。有趣的是，在两种免疫沉淀物中，我们检测到LDB1/2和SSBP2（单链结合蛋白2）——LDB1复合物的已知辅助因子[44，45]，在LHX2的3个重复和3个OTX2免疫纯化样品中的2个中检测到（图5A，S9表）。我们通过单独或一起或与LHX2联合过表达OTX2或LDB1的293T细胞的Flag-LDB1共免疫沉淀，然后用OTX2抗体进行蛋白质印迹分析，进一步验证了OTX2和LDB1之间的相互作用（图5B）。在Flag-LDB1免疫沉淀物中检测OTX2，无论是否使用LHX2，都进一步支持了人LDB1 / 2与hES-RPE中OTX2的直接相互作用。从这些结果中，我们推断LDB1与hES-RPE中的OTX2直接相关，并且这种相互作用不需要LHX2，也不会受到LHX2的抑制。这些发现表明，已知与LHX2相互作用的LDB1可能介导OTX2和LHX2之间的相互作用，至少在hES-RPE中的一些共结合CRE上。
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图5. LHX2和OTX2在人类RPE中的辅助因子。
（A）表总结了统计分析（t检验，双尾，配对）和与基于免疫沉淀后质谱（IP-MS）分析的非特异性IgG结合的蛋白质相比，LHX2，OTX2和BRG1结合的蛋白质的Log2倍变化。（B）在指示的组合（输入）中过表达OTX2，LDB1，LHX2的293T细胞，用Flag抗体进行IP，然后用OTX2抗体进行蛋白质印迹分析和免疫标记，箭头指向OTX2。S1 原始图像。（C）hES-RPE中已确定的辅助因子和关键下游靶标的说明（使用Biorander）。IP，免疫沉淀;MITF，小眼症相关 TF;RPE，视网膜色素上皮;TF，转录因子;TSS，转录起始位点。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001924.g005
除了与LDB1的关联外，我们还在OTX2免疫沉淀物中检测到了几个SWI / SNF复合物亚基，包括BRG1 / BRM（SMARCA4 / 2），BAF155 / 170（SMARCC1 / 2），BAF57（SMARCE1），BAF60a，60b（SMARCD1 / 2）和ARID1A / B。
总体而言，IP-MS蛋白质组学分析的结果表明，LHX2和OTX2之间的相互作用是通过LDB1 / 2介导的（图5C）。检测OTX2与BAF复合物的直接相互作用表明OTX2及其结合的辅因子具有染色质重塑活性，允许多个组织特异性基因的强健转录激活（拟议的转录模块和辅因子方案，图5C）。
鉴定通过 LHX2-OTX2 转录复合物影响 TRPM1 调控的 AMD 风险 SNP
接下来，我们寻找了RPE中LHX2和OTX2结合的增强子与AMD遗传易感性之间的可能联系。大规模GWAS研究发现了35个与AMD风险显著相关的基因组位点[46，47]。像大多数其他复杂疾病一样，对于AMD来说，大多数风险变异不会改变蛋白质编码序列，而是映射到基因组的非编码部分，从而阻碍了GWAS结果的功能解释。为了确定这些基因组位点中AMD风险的潜在致病基因，Orozco及其同事最近为眼睛生成了一个全面的表达定量性状位点（eQTL）资源[48]。通过将共定位分析应用于35个AMD风险位点中每个位点的GWAS和eQTL信号，该研究确定了15个风险位点，其中具有很高的置信度，相同的遗传变异驱动与AMD风险和靶基因表达水平的关联。在这些强共定位的情况下，eQTL 关联指向每个位点中推定的致病 AMD 风险基因。有趣的是，在通过eQTL分析确定的15个假定的AMD致病风险基因中，3个基因（TRPM1，TSPAN10和RDH5）的表达水平在RPE（早期疾病病理学的部位）中高度富集[48]，因此，这些基因是AMD发病机制基础分子途径的关键参与者。我们试图研究LHX2和OTX2基因调控在介导这些AMD风险信号中的可能性。因此，首先，对于15个基因组位点中的每一个，我们生成了一组与AMD风险相关的SNP（在每个位点中考虑eQTL标签SNP和所有与之处于高连锁不平衡（LD）的SNP;见材料和方法）。然后，我们将这些SNP集与分析检测到的LHX2和OTX2 ChIP-seq峰相交。值得注意的是，1 SNP，rs3809579，这是RPE中TRPM1的重要eQTL（图6A）重叠LHX2和OTX2的峰，位于TRPM1启动子内，在其TSS上游约400 bp（图6B）。此外，该SNP位于LHX2结合基序内，其中C等位基因符合共识，而与AMD风险较高的替代T等位基因破坏了它（图6C）。这种SNP在人群中非常常见（例如，根据dbSNP，其次要等位基因C等位基因在欧洲人群中的频率为42%[49]）。根据更高的LHX2结合亲和力，因此对C等位基因的启动子活性更强，基于[48]提供的资源的eQTL分析确实表明，与T等位基因相比，该等位基因与更高的TRPM1表达水平相关（图6A）。
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图6. 识别调节TRPM1表达的AMD的因果非编码风险-SNP。
（A） rs3809579 是 TRPM1 的 eQTL（来自 http://eye-eqtl.com/;[48]）。 C等位基因与高表达有关。（B）TRPM1基因组区域的概述，包括上游调控区域，脊椎动物的保护，并放大到rs3809579变体（红色下限），该变体位于TRPM1启动子的LHX2和OTX2 ChIP-seq峰内，以及来自2个人类供体（D1和D2）的RPE的ATAC-seq轨迹。（C）rs3809579的T等位基因破坏了LHX2的共识结合基序。共识LHX2 PWM取自Jaspar DB [104]（加入：MA0700.1）。（D）AI分析的插图，对所检查SNP的杂合子个体的样本进行。该分析检查了源自所检查SNP的2个等位基因的读取计数与预期的1：1比率的显着偏差。引起更强转录活性的等位基因预计将与更开放的染色质状态相关，因此具有更高的ATAC-seq读取计数。（五）来自 rs3809579 杂合子的 2 个供体（d1、d2）的 RPE ATAC-seq 读数显示，C 等位基因的读数明显多于替代 T 等位基因。（六）TRPM1的表达水平在LHX2 KD上降低了18倍以上。（G） 荧光素酶测定，用于比较 rs3809579 的 2 个等位基因对 LHX2 过表达后 TRPM1 启动子中 LHX2 结合的调节元件活性的影响。通过t检验计算的p值，成对，双尾，（N = 6，数据和分析详见S10表）。AI，等位基因失衡;AMD，年龄相关性黄斑变性;CRE，顺式调节元件;eQTL，表达-定量性状位点;KD，击倒;RPE，视网膜色素上皮;SNP，单核苷酸多态性。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001924.g006
为了进一步证实rs3809579调节TRPM1启动子内LHX2结合的调节元件的活性，我们进行了等位基因失衡（AI）分析[50]。在该分析中，只有与所检查的SNP杂合的个体才是信息丰富的。在记录的关于这些个体的 ChIP-seq 数据中，我们期望在所检查的调控元件中发现来自携带等位基因的染色体的读取数量明显高于来自携带降低结合亲和力的等位基因的其他染色体的读取数量。然而，我们的 ChIP-seq 实验中使用的 hES-RPE 细胞是该 SNP（TT 基因型）的纯合子，因此对该区域的 AI 分析没有信息。作为替代资源，我们检查了Wang及其同事在人黄斑RPE中获得的ATAC-seq数据集[51]。ATAC-seq提供了染色质开放性的测量，该测量与转录调控元件的活性水平相关，因此可以用作AI分析中TF结合亲和力的代表（图6D）。通过检查覆盖rs3809579的ATAC-seq读数，我们确定了2个与该SNP杂合的供体。令人放心的是，对于这两个个体来说，源自具有C等位基因的染色体的ATAC-seq读取数是源自具有T等位基因的染色体的读取数的3倍（供体1 – 5T：15C; 供体2 – 4T：12C;p值= 0.021），支持T等位基因降低黄斑区域TRPM1启动子活性的观点，黄斑区域是AMD的受影响组织（图6E）。最后，在我们的RNA-seq分析中，证实TRPM1是LHX2的靶基因，导致RPE中TRPM1表达水平降低约18倍（图6F）。
为了直接检查rs3809579的2个等位基因对TRPM1启动子内该调节元件的转录活性的影响，我们对含有T或C等位基因的311-bp片段进行了荧光素酶报告基因测定（chr15：31394293-31394602，Hg19，分别表示为CRE-TRPM1-T和CRE-TRPM1-C）。在LHX2过表达时，两种构建体诱导的荧光素酶活性都高于空载体（S4图）。重要的是，根据我们的模型，LHX2过表达对CRE-TRPM1-C的激活明显高于CRE-TRPM1-T的激活（图6G，p = 0.01，N = 6）。这些结果表明，rs3809579不仅与人RPE的开放染色质相关（图6E），而且还影响TRPM1启动子LHX2的转录输出。综上所述，我们的分析描绘了rs3809579的完整因果链，作为一种假定的因果遗传变异，通过调节LHX2与其启动子的结合来改变RPE中的TRPM1表达，从而影响AMD风险。
讨论
人类基因组研究的一个主要挑战是揭示非编码区域内遗传变异对复杂疾病易感性的功能意义。为了应对这一挑战，必须识别组织特异性转录调节因子，描绘它们的顺质体，并评估它们对与疾病病理相关的细胞类型中转录调节的影响。在这里，我们发现了一种由LHX2和OTX2组成的新型RPE转录模块，这是中枢神经系统模式化和发育的两个重要因素。我们表明，在RPE（AMD中受影响的原代组织）中，LHX2是OTX2表达所必需的，并且两者都共同结合多个顺式调控区域，控制定义RPE身份的转录程序，包括参与单基因和复杂视网膜疾病的基因。LHX2和OTX2在RPE程序转录调控中的共同活性可能是由控制染色质构象和可及性的辅助因子介导的。事实上，我们的蛋白质组学分析揭示了染色质环因子LDB1（LHX2的已知辅助因子）与OTX2的直接关联。此外，我们报告了OTX2与SWI / SNF染色质重塑复合物的多个亚基的直接关联，该亚基的功能是增强DNA可及性。最后，通过将鉴定的LHX2-OTX2顺式调控图谱与来自人类RPE的已发表的eQTL和ATAC-seq数据相交，我们揭示了AMD的因果非编码遗传变异，并证明它通过调节LHX2与其启动子的结合来改变RPE中的TRPM1表达。
Trpm1和Trpm3是瞬时受体电位间弹性蛋白（TRPM）离子通道的结构相似的成员，在RPE中高度表达[52]。Trpm1突变可引起哺乳动物色素沉着缺陷以及视网膜疾病，称为完全性静止性夜盲症[53]。这种表型归因于视网膜ON中心双极细胞中的Trpm1活性，而Trpm1或Trpm3在RPE中的作用尚不完全清楚（综述于[52]）。重要的是，两个TRPM1/3基因位点的内含子中都含有编码miR-211和miR-204的基因，它们与宿主基因共同调控，并具有相似的种子序列来推断共同的靶标（综述于[52，54]。这些miRNA在RPE中高度富集，通过具有多个RPE基因（包括Mitf和Pax6）的调节环发挥作用[55，56]。此外，体内和人胎儿RPE的功能研究记录了它们对上皮完整性和吞噬/自噬-溶酶体途径基因调控的需求，与AMD中记录的RPE功能障碍一致[57-61]。因此，LHX2对Trpm1位点（包括miR211）的调节有望同时改变多个RPE基因的表达，最终调节对AMD的易感性。
ChIP-seq 提供了一种无偏的方法，用于在基因组规模上绘制 TF 结合区域，并通过实验鉴定 TF 和与细胞特异性调控区域相关的辅助因子的组合。该方法有助于确定视网膜祖细胞和视网膜谱系中Otx2、Crx和Lhx2的细胞类型特异性顺式调控区[38，62，63]。在这里，我们在hES-RPE中绘制了LHX2和OTX2结合位点。在LHX2-KD hES-RPE中下调的191个基因中，71个（37%）与基于邻近性的LHX2结合位点相关。其中，69个（97%）与OTX2调节结合区域相关，在这些病例中的59个（86%）中，LHX2和OTX2位于约200 bp的同一DNA片段中（图3）。对于TRPM1，我们确定了TSS上游的单个位点，其中的遗传变异与RPE中的TRPM1表达水平相关。相比之下，对于许多其他RPE调控基因，我们鉴定了多个远距离增强子。OTX2基因本身似乎受5个CRE的调控，其中2个同时与OTX2和LHX2结合，另外3个仅由OTX2结合。同样，对于COL8A1（一种与AMD和角膜营养不良相关的ECM成分）[64，65]，4个位点同时受OTX2和LHX2结合，3个位点仅受OTX2结合。TRPM3基因与LHX2和OTX2结合的3个位点相关，另外7个位点仅与OTX2结合。
许多LHX2-OTX2靶标的多个CRE的鉴定支持增强子之间的功能冗余，这符合“阴影增强子”的概念，即增强子集以部分或完全重叠的方式调节共同靶标（由[66]审查）。可能需要多种调控元件来建立和维持含有基因表达所需的高TF浓度的局部转录中心[67]。重要的是，多种调控元件也为防止非编码突变提供了保障，这些突变可能对组织维护有害，如此处所示的AMD中TRPM1的风险SNP。
OTX2和LHX2在许多基因组位点上普遍共占表明它们合作以确保组织特异性靶基因的激活。LHX2和OTX2在发育中的神经结构中广泛表达，它们在其中发挥阶段和组织特异性作用。在发育中的视网膜中，它们的表达是相互排斥的，并且具有不同的作用：LHX2对于维持视网膜祖细胞的增殖和多能性很重要，在后期阶段，LHX2是介导穆勒胶质细胞应激反应所必需的[20，22，25]。相反，OTX2在光感受器和双极细胞的前体中检测到，对这两种神经元谱系的分化很重要[68-71]。到目前为止，RPE是唯一已知这两个因素共同表达的眼系。我们发现RPE中的大多数LHX2靶基因由LHX2和OTX2共结合的增强子调节，这表明它们的组合活性对于RPE特异性顺式调控位点的选择至关重要。为了支持这一观点，RPE中OTX蛋白的丢失导致其转分化为具有视网膜特征的神经组织[12]。从机制上讲，可能是观察到的小鼠突变体中OTX活性的降低导致了这种转移，这是由于LHX2顺式调节靶标选择性的改变，从RPE相关基因转变为控制视网膜神经发生的基因。
LHX2和OTX2绑定的监管区域远离TSS。因此，预计这些区域通过染色质环的形成与启动子区域相关联。LDB1是LIM结构域蛋白的已知必需辅助因子，是不同物种和谱系中增强子-启动子环的重要因子[72-76]。LDB1/2不直接结合DNA，而是通过与LIM结构域蛋白相互作用，LIM结构域蛋白含有HD，将复合物引导至特定靶标或与其他DNA结合TF结合[77，78]。Ldb和Otx2之间的相互作用先前在果蝇胚胎中被注意到，其中Ldb1/2的苍蝇同源物Chip在体外与配对型HD蛋白发生物理相互作用，包括Bicoid（Bcd）和Otd，Otx2的同系物在果蝇胚胎的早期分割过程中[79]。Ldb1和Otx2之间的相互作用也被记录为不同脊椎动物（包括非洲爪蟾和小鼠）的前部结构（包括头部）的早期胚胎发育所必需的[80-82]。在这里，我们通过定量共IP-MS检测hES-RPE中内源性LDB1 / 2和OTX2之间的直接结合。这与检测多个LHX2和OTX2共结合RPE远端增强子一起，表明LDB1在介导LHX2和OTX2之间的相互作用中可能起作用，至少在一些共结合增强子中。它表明LHX2-LDB-OTX2在增强RPE特异性基因表达中的作用，可能是通过蛋白质复合物的成核，染色质结构的局部调节以及与RPE组织特异性启动子的结合。
LHX2和OTX2结合的调控区域可能招募染色质修饰剂和重塑剂，以建立和维持组织特异性转录。SWI/SNF复合物对于多种细胞类型的正常发育至关重要，被认为可以对抗Polycomb复合物的抑制活性[83-85]。催化亚基Brg1直接与组织特异性和/或生长因子/激素诱导型TF（例如FoxA1、MyoD、Pax6、类固醇激素和Fos/Jun（AP-1））相互作用，并在增强子选择中起核心作用[86-89]。SWI/SNF 复合物的多个亚基与人类 RPE 中 OTX2 的物理相互作用表明，OTX2 在募集 SWI/SNF 复合物和/或稳定它们与 RPE 中组织特异性增强子的相互作用和/或稳定它们与 RPE 中组织特异性增强子的相互作用以及可能在 CNS 的其他谱系中起主要作用。OTX2，LDB1和SWI / SNF之间的相互作用可以在有或没有LHX2的情况下发生。未来的研究需要进一步表征蛋白质的组成和它们之间的物理相互作用（OTX2和LHX2或OTX2单独，有或没有LDB1和SWI / SNF），并进一步确定这如何影响转录输出及其与视网膜疾病机制的相关性。
材料和方法
鼠标行
这Lhx2洛克斯· [21]和Dct-Cre [31]小鼠系已在前面描述过。本研究中使用的小鼠的遗传背景为C57BL / 6J。小鼠根据符合美国国家研究委员会（NRC）的国际指南进行维护，其使用已获得特拉维夫大学IACUC审查委员会的批准（批准号0121013）。
hES-RPE的细胞培养和分化
293FT和D407细胞系在Dulbecco的改良鹰培养基（DMEM）中生长，补充10%认证胎牛血清（FBS）的293FT和3%的D407细胞，青霉素（100U / ml）和链霉素（100μg/ ml），在37°C和5%CO2.hES-RPE细胞的产生和维持如下所述[35]。
组织学和免疫荧光
如所述，对10 μm石蜡切片进行免疫荧光分析以及苏木精和伊红染色[90]。简而言之，将切片浸入PBS中并在揭开面溶液（VECTOR，H3300）中煮沸两次以进行抗原决定簇取。将切片在PBSTG（0.2%吐温20，0.2%明胶PBS中）中封闭2小时，与一抗孵育过夜，用PBSTG洗涤，在室温下与二抗孵育2小时，用PBSTG洗涤，并安装在moviol中。所有抗体均列在S8表中。
hES-RPE细胞在涂有2.5μg/ ml玻连蛋白（GIBCO）的96孔玻璃板上生长。用4%多聚甲醛固定细胞10分钟，然后在室温下用0.2%Triton-X100，5%正常山羊血清和0.1%BSA在PBS中封闭和透化1小时。然后使用封闭溶液中的一抗在4°C下将细胞染色过夜，在PBS中洗涤3次，并与二抗孵育30分钟。使用DAPI（GBI实验室）将样品安装在封片介质中，并使用奥林巴斯BX61荧光显微镜采集图像。使用尼康C2+激光扫描共聚焦显微镜获取共聚焦图像。
慢病毒的产生、纯化和转导
使用pGIPZ载体（赛默飞世尔科技）对hES-RPE中的LHX2进行下调，以靶向LHX2 mRNA（NM_004789）。在转导和孵育48小时后在D407细胞中检查4种载体的效率。我们通过定量PCR检查了KD效率。显示最强效果的2个载体，75%（V2LHS_35479，成熟的反义AATGGCAAAGTAAGACTTC;和V3LHS_319912，成熟的反义AGATGCTACCGTCCTTGCT）用于hESRPE中的LHX2 KD。对于阴性对照，我们使用NS-shRNA pGIPZ载体（RHS4531）。
为了产生传染性病毒，使用jetPEI（Polyplus）与慢病毒骨架质粒shRNA-LHX2-pGIPZ或shRNA-NS-pGIPZ，包装质粒pCMVΔR8.2和包膜质粒pVSV-G共转染293FT包装细胞系。72小时后，收集培养基中的病毒颗粒并通过0.45μm孔径过滤器过滤，然后使用Vivaspin（GE医疗）进行浓缩。
hES-RPE 细胞 （2.5 × 105）接种在24孔板中并生长14天。对于感染，将细胞与含病毒培养基在100μg/ ml聚溴乙烯（六二甲基溴化物;西格玛）在37°C下离心30分钟，然后离心（30分钟，37°C，1，100xg）。然后用新鲜生长培养基替换培养基。24小时后，加入10μg/ ml嘌呤霉素（Sigma）再添加5天，然后收获RNA分离（使用RNeasy迷你试剂盒，QIAGEN）。
核糖核酸序列
对于转录组学分析，使用RNEASY KIT（Qiagen）和qScript cDNA合成试剂盒（QantaBio）从用LHX2-shRNA或NS-shRNA（重复）转导的hES-RPE中分离的RNA制备cDNA文库。样品在Illumina NextSeq机器上使用单读60协议进行测序。测序的读数映射到人类基因组版本GRCh37，使用TopHat v2.0.10[91]。使用来自Ensembl release 82的注释鉴定基因。每个基因的读数使用featureCounts进行计数。使用DESeq2计算DEG的读取计数和p值的归一化[92]。使用Benjamini-Hochberg错误发现率（FDR）校正对p值进行多次测试。使用TANGO通过Expender进行功能富集分析[93-95]。使用GSEA软件（http://www.broad.mit.edu/gsea/）进行基因集富集分析[105]。
ChIP-seq
如前所述，ChIP在分化的hES-RPE细胞上进行[96][35]。染色质由10^7个细胞制备，20μg染色质用5μg山羊抗LHX2抗体（Millipore，ABE1402）或OTX2抗体（Abcam，ab21990）免疫沉淀。ChIP-seq文库一式两份制备，并使用G-INCPM内部方案进行测序。对于 ChIP-seq 数据分析，使用领结2 [97] 将测序的读段映射到人类基因组 （v19）（比对统计参见 S7 表）。LHX2和OTX2结合位点（“峰”）使用MACS2称为[98]。我们应用了基于排列的测试来检查观察到的 1，278 个 LHX2 和 6，461 个 OTX2 结合位点之间重叠的重要性，如下所示：我们生成了 1，000 个随机组 1，278 个基因组区域，这些区域 （1） 属于 RPE 细胞中的开放染色质（由 ATAC-seq [51] 确定）;（2）具有匹配的GC含量概况;（3）到最近启动子的距离分布为1，278个LHX2峰的真实集合。然后，对于每个随机集，我们检查了与真正的6，461个OTX2峰集的重叠，并使用该数字为LHX2和OTX2峰集之间的重叠生成零分布。这些随机排列与OTX2组的平均重叠为105个峰，明显低于在真正的LHX2峰集上观察到的864个重叠位点（图3D）。
免疫沉淀和质谱分析
大约 2 × 10 的细胞核7hES-RPE细胞（培养中的d14至d30）通过在细胞质提取物缓冲液（10mM HEPES，60mM KCl，1mM EDTA，1mM DTT，0.015%NP 40）中孵育10分钟，4°C来分离。 用500μl裂解缓冲液（1mM MgCl2，1%蛋白酶抑制剂，1%NP40，1%苯并酶，150mM NaCl，50mM Tris（pH 7.5））。通过与蛋白-A 琼脂糖珠（密理博）孵育进行预纯化，然后将上清液与 10 μg 兔抗 OTX2 抗体 （Abcam-ab21990） 或抗 Lhx2/LH2 抗体 （Abcam-ab184337） 在 4°C 下孵育过夜。作为对照，裂解物用正常兔对照IgG沉淀（Jackson，011-000-003）。然后，再加入磁珠2小时。用碱性缓冲液（150 mM NaCl，50 mM Tris （pH 7.5））洗涤样品4次。
对于质谱分析，在10%凝胶上运行由抗OTX2或LHX2抗体免疫沉淀的蛋白质，从3个重复序列中，并从凝胶中提取蛋白质。用3 mM DTT在100 mM碳酸氢铵（60°C，30分钟）中还原凝胶中的蛋白质，用10 mM碘乙酰胺在100 mM碳酸氢铵中修饰（在黑暗中，室温下30分钟），并在10%乙腈和10 mM碳酸氢铵中以1：10的酶底物比酶与底物的比例消化。 在 37°C 下过夜。 所得肽使用C18尖端（顶部尖端，Glygen）脱盐，并通过LC-MS-MS进行分析。肽通过反相色谱在填充有Reprosil反相材料的0.075毫米×180毫米熔融石英毛细管（J&W）上进行分离（Dr. Maisch GmbH，德国）。用5%至28%的线性60分钟梯度洗脱它们15分钟梯度为28%至95%和15分钟在95%乙腈和0.1%甲酸水中以0.15μl/min的流速洗脱。 MS在Q Exactive plus质谱仪（Thermo）中以阳性模式进行，使用重复完整的MS扫描，然后对从第一次MS扫描中选择的10个最主要的离子进行碰撞诱导解离（HCD）。原始质谱数据可通过ProteomeXchange获得，标识符为PXD038485。
使用MaxQuant软件1.5.2.8 [99]分析MS数据，使用Andromeda搜索引擎进行峰拾取和鉴定，而人类UniProt数据库的质量公差为6 ppm。蛋氨酸上的氧化和N末端的乙酰化被接受为可变修饰，半胱氨酸上的氨基甲酰甲基被接受为静态修饰。最小肽长度设置为6个氨基酸，最多允许2个裂解。使用靶诱饵策略将肽和蛋白质水平的FDR过滤至1%。对蛋白质表进行过滤，以消除反向数据库和常见污染物中的鉴定。使用相同的软件通过无标记分析对数据进行定量，基于肽的提取离子电流（XIC），从而能够对任何实验中鉴定的每种肽的每次LC / MS运行进行定量。缺失值被替换为项目中确定的最小强度。蛋白质定量、分类和统计分析（双尾、成对、t检验）使用Perseus 1.6.10.43软件完成[100]。
过表达和免疫共沉淀
过表达是通过含有人OTX2或LHX2[15，101]或Ldb1-FLAG（在pDEST-Flag骨架中;[102]）。
将表达载体以指示的组合转染到10cm培养皿中的HEK-293T细胞中;使用磷酸钙沉淀转染15 μg总DNA;转染后72小时，将细胞在1ml裂解缓冲液（50mM Tris-HCl（pH 7.9），100mM NaCl，0.5mM EDTA，2%甘油99%）中裂解10分钟，4°C，然后超声处理（12个循环，30秒开启，30秒关闭），用1%苯并酶，1mM MgCl孵育22小时，离心。使用蛋白A / G加琼脂糖（圣克鲁斯生物技术SC-2003）预纯化提取物，并用抗Flag M2琼脂糖（Sigma A2220）免疫沉淀。使用兔抗OTX2抗体（Abcam-ab21990）通过蛋白质印迹检测蛋白质。在3个独立实验中观察到OTX2与LDB1-Flag的Co-IP。
荧光素酶报告基因检测
D407细胞（5×105）在24孔板中培养5小时，转染400ng空pGL4.23（Promega）或CRE在pGL4.23中与LHX2、OTX2或两者一起克隆pcDNA3.1[16，101]。通过添加pcDNA3.1和20 ng的pRL-TK-Renilla载体，将表达载体的总量调节至1.2 μg，以提高转染效率。每个数据点代表至少 2 次技术重复的平均值（S10 表）。生物重复的数量在图例中表示。转染使用jetPEI（Polyplus）转染试剂进行。48小时后，根据制造商的说明使用双荧光素酶报告测定（Promega）测量增强子活性。统计分析使用GraphPad Prism 8.0统计软件进行，详见图例。
LHX2和OTX2结合基因组位点中GWASsSNP的分析
我们首先扩展了15个标签SNP的集合（Orozco及其同事[48]检测到的共定位eQTL-AMD GWAS SNPs，包括他们的LD伴侣（r2> 0.7） [PLINK， v1.90]，生成 304 个候选因果 SNP 的并集。然后，我们检查了这些AMD SNP与hES-RPE中LHX2或OTX2的峰值之间的重叠（使用BEDTools，v2.27），通过我们的ChIP-seq分析确定。基序映射是使用FIMO[103]完成的。黄斑RPE ATAC-seq数据使用Rsubread（v2.0.0）与人类基因组（GRCh37）进行比对。在AI分析中，为了避免对参考基因组等位基因的偏见，我们使用BEDTools（maskFastaFromBed）用N屏蔽了FASTA文件中的rs3809579碱基。我们使用 SAMTools 过滤掉不匹配的对读取以及映射质量低的读取（MAPQ 分数 <10），并使用 Picard 工具（MarkDuplicates）删除重复读取。然后，我们考虑了2个杂合子个体的ATAC-seq样本，对覆盖该SNP的读数进行了二项式测试。我们通过费舍尔方法（metap R包）组合了p值。
支持信息
在小鼠RPE的LHX2条件突变中，神经标志物没有升高。
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S1 Fig. Neural markers are not elevated in the LHX2 conditional mutation in the mouse RPE.
In E16.5 control (A, B; A’, A”, and B’ are the respective separate channels) and Lhx2loxP/loxP;D CT-Cre （C， D;C'，C“，”D'是各自的独立通道）发展RPE神经元标志物Tubb3，Vsx2（A，C）和NF-165（B，D）的表达未通过间接免疫荧光分析检测到。DAPI用于细胞核的复染。比例尺为 50 μm，下部插图为 10 μm。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001924.s001
（提夫）
S2 图 hES-RPE分化和LHX2敲低的表型。
紧密连接蛋白ZO-1（绿色）和转录调节因子MITF（红色）在hES-RPE的（A）d5和（B）d14培养物中的表达。比例尺为10μm。（C）比较分化（d14）和去分化（d5）hES-RPE细胞中基因表达谱的基因集富集分析显示，在d14中上调的基因中，“RPE基因特征”的富集显着富集。（D）对照NS-shRNA或（E）LHX2-shRNA KD到hES-RPE的慢病毒转导（d14）。GFP（绿色）标记转导的细胞。间接免疫荧光分析使用针对LHX2（红色，上排），CDH1（蓝色，中排）和OTX2（紫色，下排）的抗体进行。右图为复合材料;相邻的是单独的通道。DAPI（蓝色）标记细胞核。比例尺为 10 μm。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001924.s002
（提夫）
S3 图 LHX2 和 OTX2 一起激活 OTX2-CRE。
与空PGL4.23上的TFs活性相比，在PGL4.23-OTX2-CRE上由LHX2或OTX2或两者诱导的荧光素酶报告活性。通过t检验计算的p值，双尾，配对（N = 7，数据和分析详见S10表）。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001924.s003
（提夫）
S4 图 rs3809579的LHX2转录激活。
荧光素酶报告基因活性由LHX2过表达诱导的309 bp，其中含有rs3809579中LHX2结合的调节元件。CRE-TRPM1-T和CRE-TRPM1-C等位基因都被LHX2显着激活，而不是空PGL4.23的激活。通过单因素方差分析计算的p值，匹配样本，用邓内特校正以进行多重比较（N = 6）。在所有6个独立实验中，CRE-TRPM1-C的转录活性高于CRE-TRPM1-T（这种一致趋势的总体p值为0.56= 0.016;二项式检验）。该数字背后的数据详见S10表。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001924.s004
（提夫）
S1 原始图像。 蛋白质印迹分析的原始图像如图5B所示。
将过表达OTX2、LDB1和LHX2的293T细胞在指定的组合（输入）中进行Flag抗体免疫沉淀，然后进行蛋白质印迹分析和OTX2抗体免疫标记。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001924.s005
（英文）
S1 表。 基于基因集富集分析比较d5和d14 hES-RPE之间表达谱的分化（d14）hES-RPE中RPE特征基因[37]的富集[33]。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001924.s006
（三十）
S2 表。 在 2 个生物重复序列中进行 LHX2-shRNA 的慢病毒转导或非沉默-shRNA 对照后，在 hES-RPE S2A 中 LHX2 KD 后的差异表达基因 - lhx2_kd_hrpe_rnaseq_cnts_qnorm：_Transcriptional 的 hES-RPE 谱。
该表包括倍数变化、统计分析以及与指定基因相关的 LHX2 ChIP-seq 峰。S2B - OTX2_28_target_set_图3A：展示了小鼠RPE中Otx2失活后下调的基因在LHX2-KD之后的统计分析和倍数变化（基于[14]）。S2C - TRPM1 exp—图6F：在LHX2-shRNA的慢病毒转导或非沉默-shRNA对照在2个生物重复中进行并标准化为1之后，基于DESeq2的tRPM1在hES-RPE中的表达。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001924.s007
（三十）
S3 表。 LHX2 –KD（TANGO）之后差异表达的基因的基因本体富集列表。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001924.s008
（三十）
S4 表。 LHX2 ChIP-seq 在 hES-RPE （d14） 中达到峰值。
该表包括有关染色体坐标（人类基因组（v19）、峰值强度、最近的基因及其与峰值峰的距离）的信息。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001924.s009
（三十）
S5 表。 OTX2 ChIP-seq 在 hES-RPE （d14） 中达到峰值。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001924.s010
（三十）
S6 表。 LHX2 和 OTX2 ChIP-seq 峰值之间的重叠。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001924.s011
（三十）
S7 表。 对齐摘要统计信息。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001924.s012
（三十）
S8 表。 本研究中使用的抗体用于免疫染色。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001924.s013
（文档）
S9 表。 基于免疫沉淀和质谱法的蛋白质与LHX2，OTX2，BRG1的相互作用。
该表列出了在IP-MS相互作用组分析中鉴定的肽的强度（Log2）。每一行都包含可以从一组鉴定的肽重建的蛋白质的名称。MS数据分析由MaxQuant软件完成。蛋白质强度是与鉴定的氨基酸序列相关的所有同位素簇的提取离子电流的总和。T测试分析（双尾，使用Perseus软件配对完成）在使用特异性抗体（LHX2，BRG1，OTX2）拉下的蛋白质与使用非特异性IgG下拉的蛋白质之间进行。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001924.s014
（三十）
S10 表。 荧光素酶报告基因测定包括原始数据、归一化和统计分析。
该表包括2个选项卡：CRE_OTX2_图4_S3：LHX2或OTX2过表达或两者共表达后CRE_OTX2的荧光素酶活性。TRPM1C-T_图6_S4：LHX2过表达后CRE_TRPM1-T或CRE_TRPM1-C的荧光素酶活性。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001924.s015
（三十）
确认
我们感谢Tsadok Cohen和Heiner Westphal的Lhx2 cKO小鼠，Ivana Savic-Azoulay在组织培养和小鼠分析方面的帮助，以及OTX2和LHX2表达载体的Noriko Esumi。大卫博士。E. Fisher和Carmit Levy的MITF抗体。Yoni Haitin寻求组织培养方案的帮助。
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