II型味觉细胞参与黏膜免疫监测
秦玉梅，萨林·拉吉·帕拉扬，郑欣，田诗一，罗伯特·马戈尔斯基，苏尼尔·苏库马兰
发布时间：2023 年 1 月 12 日
抽象
口腔微生物组在多样性和丰度方面仅次于肠道对应物，但其对味觉细胞的影响在很大程度上仍未得到探索。使用单细胞RNASeq，我们发现小鼠味觉细胞，特别是表达味觉1受体成员3（Tas1r3）的甜味和鲜味受体细胞，具有让人联想到微折叠（M）细胞的基因表达特征，微折叠（M）细胞是粘膜相关淋巴组织（MALT）免疫监视的核心参与者，例如Peyer贴片和扁桃体中的细胞。施用肿瘤坏死因子配体超家族成员11（TNFSF11;也称为RANKL），M细胞分化所需的生长因子，显着增加味和野生型（WT）小鼠培养的味觉类器官中的M细胞增殖和标记基因表达。品尝缺乏Spib（Spib）的敲除小鼠的和类器官高)另一方面，M细胞发育和再生所需的RANKL调节转录因子对RANKL没有反应。品尝来自斯皮布的高小鼠还表现出NF-κB信号通路成分和促炎细胞因子的表达降低，并吸引较少的免疫细胞。然而，脂多糖诱导的细胞因子表达在Spib中强烈上调高小鼠与WT小鼠的比较。像M细胞一样，味觉细胞来自WT而不是Spib。高小鼠很容易吸收荧光标记的微珠，这是微生物转胞作用的代表。味觉细胞亚型的比例在 Spib 中保持不变高小 鼠;然而，他们对甜味和鲜味刺激表现出更大的吸引力。我们建议味觉细胞参与免疫监视，并可能调整它们对微生物信号和感染的味觉反应。
引文： 秦 Y， 帕莱扬 SR， 郑 X， 田 S， 马戈尔斯基 RF， 苏库马兰 SK （2023） II 型味觉细胞参与粘膜免疫监视。公共科学图书馆生物学21（1）： e3001647. https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001647
学术编辑： Piali Sengupta，布兰迪斯大学，美国
收到： 四月 15， 2022;接受： 12月 10， 2022;发表： 1月 12， 2023
版权所有： ? 2023 秦等这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。
数据可用性： 本研究中使用的所有测序数据都可以从NCBI的短读长档案（SRA）中检索，入藏号为SRP094673。所有其他相关数据均在论文及其支持信息文件中。
资金： 这项研究得到了NIH-NIDCD对RFM的R01 DC014105和P30 DC011735，中国国家自然科学基金（31800875）的青年科学家基金和内布拉斯加州肥胖疾病预防中心的项目负责人奖（NIH-NIGMS资助号）的支持。P20GM104320）到S.K.S.成像在Monell组织学和细胞定位核心进行，部分由NIH-NIDCD核心资助P30DC011735和国家科学基金会资助DBI-0216310（Gary Beauchamp）资助。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。
竞争利益： 提交人声明不存在相互竞争的利益。
缩写： APC， 抗原呈递细胞;CVP， 环状;EGFP， 增强型绿色荧光蛋白;刚果核酸， 荧光激活细胞分选;FAE， 卵泡相关上皮;FFP， 真菌状;视场角， 叶状;GP2， 糖蛋白2;消费税， 谷胱甘肽-S转移酶;IPTG， 异丙基-D-1-硫代吡喃半乳糖苷;MBM 卢里亚-贝尔塔尼;LPS， 脂 多糖;麦芽 粘膜相关淋巴组织;M细胞， 微折叠细胞;.MSG 味精;NF-κB， 核因子河童B;新约， 无味;公共广播公司， 磷酸盐缓冲盐水;PGLYRP1， 肽聚糖识别蛋白1;光电倍增管， 光电倍增管;PVR， 脊髓灰质炎病毒受体;scRNASeq， 单细胞核糖核酸eq;Tas1r3， 味觉1受体成员3;TLR， Toll样受体;TNFSF11， 肿瘤坏死因子配体超家族成员11;WT， 野生型
介绍
在小鼠等哺乳动物中，大多数味蕾存在于舌背表面的三种味中[1，2]。其中，位于舌前部的真菌状（FFP）各有一个味蕾，位于后舌侧侧和内侧的叶状（FOP）和环状各有几百个味蕾[1，2]。CVP和FOP中的味蕾排列在向下延伸到舌头的沟渠周围。每个味蕾含有大约50-100个成熟受体细胞，根据形态和标记基因表达分为I型、II.型、III.型和IV型细胞[1-3]。这些细胞进一步分为功能亚型，对甜、苦、鲜味（II.型细胞亚型）、酸味和咸味（主要是III.型细胞亚型）的基本味道品质作出反应[1-3]。味觉细胞的半衰期为8-24日，并且从位于味觉底部的干细胞群中不断再生[4-7]。
16s RNA测序和宏基因组学研究表明，包括舌背在内的口腔被多种微生物物种定植[8-11]。与非味觉（NT）舌上皮中的细胞不同，味觉细胞通过其通过味觉孔投射到舌表面的微生物绒毛不断暴露于口腔微生物群。然而，它们对味觉信号和味觉细胞再生的影响没有得到应有的关注。味觉由多种免疫细胞群巡逻，主要是树突状细胞，包括朗格汉斯细胞亚型、T细胞和巨噬细胞[12，13]。大多数口腔黏膜居民微生物是无害或有益的，宿主对它们产生免疫耐受性[14]。然而，口腔生态失调可导致味觉丧失或扭曲，常见于流感、鹅口疮（念珠菌病）、HIV、细菌感染和COVID-19等患者[15-21]。确定味觉细胞、口腔微生物组和上皮免疫细胞之间精细调谐串扰的途径将有助于揭示微生物群如何影响健康和疾病中的味觉细胞。
黏膜适应性免疫的最重要组成部分是MALT[22，23]。MALT是免疫诱导位点，可对管腔微生物进行采样并产生适当的粘膜免疫反应。MALT由含有B细胞和T细胞的淋巴滤泡组成，这些滤泡被称为卵泡相关上皮（FAE）的上皮层覆盖[24]。FAE中的特化上皮细胞称为微折叠细胞（M细胞），它们将管腔微生物转胞，并将其传递给位于其基底口袋中的抗原呈递细胞（APC），例如树突状细胞和巨噬细胞[25，26]。APC的抗原处理和呈递刺激下层淋巴滤泡中的B和T淋巴细胞，从而产生适当的免疫应答[24，26，27]。然后，这些效应细胞迁移到粘膜的其他部位，并在血液中全身迁移。因此，M细胞在粘膜免疫中起着核心作用。M细胞表达几种微生物受体，如糖蛋白2（GP2）、肽聚糖识别蛋白1（PGLYRP1）和脊髓灰质炎病毒受体（PVR），它们与腔内微生物结合并内化[28-30]。它们具有发达的微泡系统，但溶酶体发育不良，使其微生物货物能够快速运输，大部分完好无损地穿过上皮[26]。M细胞分化是由MALT上皮下结缔组织细胞分泌的肿瘤坏死因子配体超家族成员11（TNFSF11;也称为RANKL）诱导的[31]。RANKL与受体肿瘤坏死因子受体超家族成员11A（TNFRSF11A）结合，激活非规范核因子κB（NF-κB）信号通路，开启早期M细胞标志基因的表达[31-34]。其中最突出的是Spib，这是一种协调M细胞分化后期阶段的转录因子[35，36]。使用GFP标记的小鼠味觉细胞的单细胞RNASeq（scRNASeq），我们发现味觉细胞包括表达味觉1受体成员3（Tas1r3）（Tas1r3+细胞）的甜味和鲜味受体细胞，表达多个M细胞标记基因[37]。与该基因表达谱一致，RANKL给药导致味和来自野生型（WT）培养的味觉类器官中的M细胞标记基因显着上调，但不是Spib敲除（Spib高） 小鼠。斯皮布高小鼠在其味觉中也表现出NF-κB信号通路成分和促炎细胞因子基因表达的表达降低，并将较少的免疫细胞吸引到上。然而，脂多糖（LPS）诱导的细胞因子表达在Spib中高度上调高小鼠与它们的WT同窝伙伴相比。使用荧光标记的微珠摄取测定，我们表明来自WT而不是Spib的味觉细胞高小鼠能够对管腔微粒进行转吞。尖刺消融不影响中味觉细胞亚型的比例，但引起对甜味和鲜味刺激的吸引力增加。我们的研究结果表明，味觉细胞具有类似M细胞的特性，并可能调节味觉信号以响应微生物定植和感染。
结果
味觉细胞表达M细胞标记基因
为了鉴定参与味觉细胞中表达的粘膜免疫的基因，我们分析了来自表达Gnat3-EGFP（Gnat3-EGFP +，主要是CVP中表达的苦味受体，II型），Tas1r3-EGFP +（甜味和鲜味受体表达，II型）和Gad1-EGFP +（III型）味道细胞的scRNASeq数据来自相应EGFP转基因小鼠的CVP。我们的分析显示，所有细胞类型，尤其是Tas1r3+细胞，都选择性地表达几种对M细胞成熟和功能至关重要的基因（S1表）[37]。使用分子和组织学技术证实了这些基因子集在味觉细胞中mRNA和蛋白质水平的表达。终点PCR和定量实时PCR显示M细胞标志基因Gp2，Marcksl1，Ccl9，Anxa5，Sgne1和Spib在CVP中的表达稳定，而它们在NT舌上皮中的表达水平要低得多或根本不表达（S1A和S1B图）。RNAscope与Spib特异性探针组的杂交表明，它在CVP和FFP的味觉细胞中表达（S1C和S1D图）。这些结果在蛋白质水平上得到证实，使用针对SPIB的抗体进行间接免疫组织化学，该抗体对CVP，FOP和PP中味觉细胞亚群的细胞核进行了染色（S1E和S1G图）。SPIB抗体和二抗的特异性通过Spib的PP和CVP中缺乏染色得到证实高小鼠和当一抗在WT小鼠的CVP染色时省略时（S1H和S1J图）。
为了鉴定表达M细胞标记基因的味觉细胞类型，我们转向RNAscope Hiplex荧光测定和双标记免疫组织化学。RNAscope测定是用针对CVP中的M细胞标记基因Spib，Gp2和Tnfrsf11a以及味觉细胞标记基因Tas1r3，Gnat3，Trpm5（所有II型细胞的标记物）和Ddc（所有III型细胞的标记物）的探针组进行的。与scRNASeq数据一致，在Spib和Tas1r3之间观察到强烈的共定位，95%的Spib+细胞共表达Tas1r3（图1A和S2表）。约27%的Spib+细胞共表达Gnat3，93%共表达Trpm5，约18%共表达Ddc（图1B-1D和S2表）。值得注意的是，Spib 在 Ddc+ 和 Gnat3+ 细胞中的表达水平（由每个细胞的荧光斑点数量表示）远弱于 Tas1r3+ 和 Trpm5+ 细胞（图 1A–1D）。Gp2表达分布在所有测试的细胞类型中，尽管它往往与II型味觉细胞更紧密地相关（图1E-1H和S2表）。Tnfrsf11a表达均匀分布在所有细胞类型中（图1I–1L和S2表）。
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图1. 味觉细胞中M细胞标志物基因表达的RNA分析。
RNAscope Hiplex荧光测定法用于测定CVP中Spib （A-D）、Gp2 （E-H）和Tnfrsf11a（I-L）与味觉细胞标志物Tas1r3、Gnat3、Trpm5和Ddc的共表达。使用Tas1r3和Trpm5观察到Spib的强共表达，在Gnat3和Ddc中观察到较弱的共表达。Gp2倾向于与II型味觉细胞更相关，而Tnfrsf11a表达在所有味觉细胞类型中均匀分布。比例尺 = 10 μm。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001647.g001
使用SPIB抗体联合针对CVP和FOP中的II型味觉细胞标志物TRPM5，T1R3和GNAT3，III型标记CAR4或I型标记ENTPD2（图2）的第二种抗体进行双标记免疫组化。我们的结果证实，约91%至97%的SPIB表达细胞共表达TRPM5和T1R3（S3表）。SPIB与GNAT3的共表达较弱（8%至28%），与CAR4共表达可忽略不计（4%至6%）。SPIB似乎不与ENTPD2共表达，尽管这没有被量化，因为I型细胞包裹着其他味觉细胞，使得准确确定共表达变得困难。
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图2. SPIB与T1R3共表达。
CVP 和 FOP 切片的双标记免疫荧光共聚焦显微镜，具有针对 SPIB 和 II 型味觉细胞标志物 TRPM5 （A， F）、T1R3 （B， G） 和 GNAT3 （C， H）、III 型味觉受体标志物 CAR4 （D， I） 和 I 型味觉细胞标志物 ENTPD2 （E， J）显示SPIB与T1R3的频繁共表达，而与TRPM5和GNAT3的共表达较少，与CAR4和ENTPD2的共表达可以忽略不计。细胞核用DAPI复染蓝色。比例尺，50 μm。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001647.g002
双标记免疫组织化学还显示，另外两种M细胞标志物GP2和CCL9似乎与II型细胞标志物TRPM5共表达，但与CVP中的III型细胞标志物CAR4没有共表达，尽管共表达未定量（S2图）。值得注意的是，味蕾顶端的强GP2染色，大概是在味觉细胞微绒毛中，类似于在其他MALT中观察到的M细胞中对该受体蛋白的模式（S2C和S2F图）[28]。来自Pou2f3敲除小鼠的CVP，缺乏包括Tas1r3+细胞在内的所有II型味觉细胞，不表达CCL9、GP2和SPIB（S3图）[38]。总的来说，上述结果最终表明，味觉细胞，特别是II型亚型，表达几种M细胞标记基因。
RANKL上调味觉和培养的味觉类器官中的M细胞标记基因表达
接下来，我们询问RANKL是否可以像其他MALT一样触发味中M细胞标志基因表达的Spib依赖性增加[31，35，36]。M细胞标记蛋白GP2、CCL9、MARCKSL1和SPIB的基础表达水平在WT动物中相对较低，编码Gp2和Ccl9的mRNA在STB动物CVP中较低高小鼠（S4A，S4D，S4I和S4K图）。施用RANKL导致GP2，CCL9，MARCKSL1和SPIB表达细胞的比例以及WT但未Spib的CVP中相应mRNA的水平急剧增加高小鼠（S4E和S4L图）。同时，qPCR分析表明，两种菌株NT上皮的RANKL处理均未上调Gp2、Ccl9和Marcksl1 mRNA的表达（S4M图）。
在PP和肠绒毛中，RANKL治疗以刻板的时间顺序诱导各种M细胞标志基因的表达[35]。为了确定这在味觉细胞中是否保守，我们转向了源自Spib的味觉类器官。高：Lgr5-EGFP敲入或对照（Lgr5-EGFP）菌株。与PP和肠道类器官一样，早期M细胞标志物Marcksl1和Ccl9 mRNA以及相应蛋白质的表达在第1天开始增加，并在第2天达到峰值;Spib的增幅逐渐增加，并在第3天达到峰值;晚期标志物Gp2的增加更慢，并在来自对照小鼠的类器官中施用RANKL后第4天达到峰值（S5A-S5P图）。味道来自斯皮布的类器官高另一方面，小鼠在RANKL给药时表现出Gp2，Ccl9和Marcksl1 mRNA的诱导显着受损（S5M-S5P图）。
斯皮布的黏膜免疫应答受损高小 鼠
接下来，我们比较了WT和Spib的CVP中粘膜免疫的各个方面高小 鼠。多种刺激，包括RANKL、其他TNF家族配体和病原体相关分子模式，例如通过NF-κB途径的LPS信号[39]。我们问斯皮布是否高小鼠表现出NF-κB信号通路成分及其靶基因表达缺陷。qPCR分析显示，接头蛋白Myd88、调节蛋白Tollip、Irak3和Irak4以及转录因子Nfkb1、Nfkb2、Rela、Rel和Irf6的表达在Spib中下调高小鼠（S6A和S6B图）。与这些发现一致，NF-κB调控的几种促炎细胞因子（即Il1b，Il6，Mcp1和Tnf）的表达下调，而抗炎细胞因子Il10和Il12以及Ifnγ的表达在Spib中没有变化 高小鼠（S6C图）。已知LPS在CVP中引起强烈的促炎细胞因子表达，我们测试了这是否在Spib中被概括高小鼠[20]。与上述基线表达水平相反，LPS给药触发了SpibCVP中夸大的细胞因子基因表达高小鼠与WT同窝小鼠的比较（S7图）。接下来，我们询问Spib中基线细胞因子表达是否降低高小鼠影响了免疫细胞对CVP的募集。用标记广谱免疫细胞或 T 细胞标志物 CD3 的 CD11B 和 CD45 抗体进行免疫染色，表明 Spib高小鼠在CVP上巡逻的免疫细胞较少（图3A-3F）。最后，我们测试了味觉细胞是否能够进行微生物转吞，以及这是否在Spib中受损高小 鼠。荧光标记微珠的摄取，这是转吞作用的代表，在WT的CVP中表达KCNQ1的味觉细胞中很明显，但Spib没有高小鼠（图3G-3I）。
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图3. 尖刺敲除小鼠的免疫反应受损。
(A-F） 来自WT和Spib的CVP切片的间接免疫荧光共聚焦显微镜高用针对小鼠免疫细胞标志物CD45（A，D），CD11B（B，E）和CD3（C，F）的抗体染色的小鼠。与WT小鼠相比，斯皮布高小鼠在CVP中的免疫细胞较少。（G-H）在WT（G）和Spib的CVP的味觉细胞中摄取200nm直径的荧光珠高使用共聚焦显微镜观察小鼠（H）。通过在面板A-H中用泛味细胞标记KCNQ1染色来观察味觉细胞。（I）通过图像分析定量磁珠的摄取并进行归一化，使得WT小鼠的平均摄取量为1.0。（图表背后的数据可以在S6_Data的数据I中找到。与WT小鼠相比，斯皮布高小鼠吸收的珠子较少。p < .001。比例尺，50 μm。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001647.g003
斯皮布高小鼠对甜味和鲜味的吸引力增强
鉴于其在M细胞再生和功能中的作用，我们询问了Pibb的消融是否会导致味觉细胞再生和/或味觉偏好缺陷。用针对味觉标记蛋白T1R3，TRPM5，GNAT3和CAR4的抗体进行免疫染色，表明II型和III型细胞的比例在Spib的CVP中没有改变高小鼠与WT的比较（S8A-S8I图）。这些结果通过相应mRNA的qPCR分析得到证实（S8J图）。然而，在简短的访问味觉测试中，斯皮布高与WT同窝小鼠相比，小鼠对典型的甜味和鲜味刺激蔗糖和谷氨酸单钾表现出更大的吸引力（图4A和4C）。对三氯蔗糖的吸引力似乎在斯皮布中也更高。高小鼠，虽然没有统计学意义（图4B）。另一方面，由Tas1r3+细胞以外的味觉细胞类型介导的对苯甲酸地那铵（苦味），氯化钠（咸味）和柠檬酸（酸味）的反应在两种菌株之间保持不变（图4D-4F）。
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图4. 斯皮布高小鼠对甜味和鲜味品酒表现出更大的行为吸引力。
简短的访问测试用于测量对甜味（蔗糖和三氯蔗糖，A和B），鲜味（谷氨酸一钾[MPG]，C），苦味（denatonium，D），咸味（NaCl，E）和酸味（柠檬酸，F）味觉刺激的行为反应。（图表背后的数据可以在S8_Data的数据A-F中找到。与同窝对照WT小鼠相比，斯皮布高小鼠对甜味和鲜味（蔗糖和MPG）的舔舐反应增加，而对其他味觉刺激的反应保持不变。舔比的计算方法是将每次测试会话中的舔到味觉溶液的次数除以舔到水的次数。数据是使用事后t检验的双向方差分析进行SEM分析±均值。N = 12（WT小鼠）和14（尖峰）高小鼠）。*p < .05， **p < .01.
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001647.g004
讨论
黏膜是微生物定植的重要途径，动物已经进化出强大的黏膜免疫系统，由先天和适应性成分组成，以对抗感染[40-42]。MALT是一种对粘膜适应性免疫至关重要的次级淋巴组织。PP和扁桃体中的MALT研究得最好，但MALT也发生在其他黏膜中，如唾液腺、鼻咽、结膜和泪管[24，43，44]。舌背黏膜被口腔微生物组大量定植，甚至比颊黏膜更严重[9，45]。舌头表面的大部分由角质化的分层鳞状上皮组成，可作为微生物入侵的有效屏障。然而，味觉细胞的微绒毛通过味蕾中的味孔投射到舌头表面，并且可能代表了微生物入侵的更简单途径。CVP和FOP中被味蕾包围的沟渠是长期微生物定植的理想场所，因为它们在很大程度上被屏蔽了唾液冲洗。然而，到目前为止，口腔微生物群对味觉细胞的影响尚未得到足够详细的研究。已有Toll样受体（TLR）、干扰素受体及其下游信号通路成分在味觉细胞中的表达[46-48]。给予LPS或双链RNA分别与TLR结合并模拟细菌和病毒感染，激活味觉细胞中的TLR和干扰素信号通路，并减少味觉细胞再生和味觉转导，可能通过促进促炎细胞因子的分泌[20，47，49，50]。同样，敲除小鼠LPS的主要受体Tlr4会导致对糖、脂质和鲜味的味觉反应减弱[48]。有趣的是，甜味和苦味受体结合微生物代谢物，并在几个额外的口腔组织中介导免疫应答，但它们是否在味觉本身中起作用尚不清楚[51，52]。
味觉和肠上皮之间有几个功能和发育相似之处。例如，CVP和FOP中的肠上皮细胞和味觉细胞来自内胚层，起源于表达Lgr5的干细胞[4，53，54]。味觉感受器和味觉转导机制的其他成员也在肠道中的营养感应肠内分泌细胞和微生物和寄生虫感应簇细胞中表达[55-60]。最后，味觉和肠上皮细胞都大量暴露于各自的微生物群中，并且某些味觉细胞类型可能具有M细胞的功能特征。事实上，我们使用scRNASeq在味觉细胞中鉴定出M细胞样基因表达特征（图1，2，S1和S2和S1表）。引人注目的是，RANKL给药导致CVP中的M细胞增殖和培养的味觉类器官中M细胞标记基因的上调，其时间顺序与PP和PP衍生类器官中观察到的时间顺序相同（S4和S5图）。最后，与PP一样，CVP和味觉类器官中的M细胞标记基因表达需要Spib。斯皮布高小鼠具有低基础水平的M细胞基因表达，并且对RANKL没有反应（S4和S5图）。与这些观察结果一致，味觉细胞来自WT，而不是Spib。高小鼠能够转胞管腔微珠（图3G-3I）。因此，所有证据表明味觉细胞具有类似M细胞的特性。然而，目前尚不清楚是否所有味觉细胞类型都具有M细胞的特性。在基础水平上，II型细胞，特别是Tas1r3+群体，在mRNA和蛋白质水平上强烈共表达Spib和Gp2（图1，2和S2）。Ddc+细胞中Spib的表达水平（由每个细胞的荧光斑点数量决定）远低于II型细胞（图2A-2H）。然而，不太可能所有在RANKL刺激下表达M细胞标志基因的细胞都是II型细胞，或者如果只有II型细胞能够进行转吞作用。一些III型味觉细胞也表达Tnfrsf11a（RANKL受体），并且它们可能在RANKL刺激下形成相当比例的表达M细胞标记基因的细胞（图1L和S1和S2表）。同样，III型味觉细胞也可能具有转吞作用，尽管由于技术困难而未进行亚型水平的转吞测定。然而，SPIB、GP2 和 CCL9 的基础水平表达在 Pou2f3 中被废除。高动物，表明II型味觉细胞在免疫监视中的重要作用（S3图）。I型或IV型细胞不太可能发生转吞作用，因为它们的微绒毛不会从味觉孔中伸出[3]。总之，我们的数据表明，II型味觉细胞，特别是Tas1r3 +细胞，可能构成M细胞样味觉细胞的大部分，尽管其他味觉细胞的较小子集，可能是III型细胞也可以获得M细胞特性。
尽管有上述相似之处，但味觉细胞和经典M细胞之间有几个关键区别。味觉细胞没有在容纳APC的M细胞中发现的基底口袋。在这方面，它们类似于绒毛状M细胞，它们与肠绒毛顶端的肠细胞自发转分化[61，62]。同样，绒毛状M细胞和味觉与潜在的生发中心无关[63]。绒毛M细胞刺激的T细胞和B细胞成熟可能发生在肠固有层，但尚不清楚这是否发生在味觉固有层[27]。然而，来自WT小鼠的味觉含有多种免疫细胞群，而Spib则高小鼠的数量要少得多，强烈支持味觉细胞在免疫监视中的作用（图3A-3F）。值得注意的是，虽然不存在于啮齿动物中，但人类和大多数其他哺乳动物的舌扁桃体位于CVP和FOP附近。它们含有 MALT，味觉细胞刺激的 T 细胞和 B 细胞可能会成熟，尽管这也可能发生在宫颈或其他淋巴结中。事实上，肠系膜淋巴结似乎是肠黏膜T细胞和B细胞成熟的原发部位[64]。
味觉细胞的M细胞样特性可能还有什么其他作用？味觉细胞分泌细胞因子，如IL-10和TNF α，影响味觉信号传导[49，50，65]。已知M细胞调节PP中细胞因子的分泌[66]。斯皮布高小鼠表达较低水平的促炎细胞因子，味觉中的免疫细胞较少，而抗炎细胞因子的表达未改变（图3A-3F和S6C）。调节急性期细胞因子基因表达的NF-κB信号通路成分在Spib的CVP中表达较低高小鼠，这可能是这种表型的基础（S6A和S6B图）。值得注意的是，在IL-10敲除小鼠中观察到T细胞募集增加以品尝，该小鼠的味蕾也较小，每个芽的味觉细胞也较少[65]。Spib CVP 中免疫细胞募集水平较低高小鼠可能反映了细胞因子的下调，尤其是趋化因子（图3A-3F和S6C）。然而，在LPS刺激下，斯皮布高小鼠表现出夸张的炎性细胞因子基因表达（S7图）。这些数据和Spib中味觉细胞的无法高小鼠转胞腔颗粒表明，在没有抗原监测的情况下，CVP中的粘膜免疫应答受损。Spib是M细胞和浆细胞样树突状细胞的发育和再生所必需的[35，36，67]。引人注目的是，Spib 中味觉细胞亚型的比例高小鼠没有改变，这表明它在味觉细胞中的作用可能仅限于调节粘膜免疫相关基因的表达（S8图）。调节味觉信号本身的直接作用仍然是一个悬而未决的问题。斯皮布对甜味和鲜味刺激的更高行为吸引力高小鼠可能是由于促炎细胞因子表达减少或味觉信号通路下游成分表达的变化引起的（图4）。我们的研究结果表明，味觉细胞介导的免疫监视是口腔粘膜免疫的一个关键方面，该途径的失调可能导致微生物感染和味觉丧失。
材料和方法
动物
所有动物实验均按照美国国立卫生研究院关于研究中动物护理和使用指南进行，并由莫奈尔化学感官中心的机构动物护理和使用委员会审查和批准（协议：RFM 的 1163 和 1151）。将动物饲养在特定的无病原体动物饲养室中，具有12小时的光照/黑暗循环，并开放获取食物和水。斯皮布高C57BL/6J背景的小鼠来自Lee Ann Garrett-Sinha博士（美国纽约州立大学布法罗分校）[68]。Lgr5-EGFP-IRES-CreERT2小鼠（库存#008875）是从杰克逊实验室购买的。Tas1r3-GFP、Gad1-GFP和Gnat3-GFP转基因小鼠如前所述[69-71]。Lgr5-EGFP-IRES-CreERT2小鼠与Spib杂交高小鼠获得Lgr5-EGFP-IRES-CreERT2：Spib高和Lgr5-EGFP-IRES-CreERT2：用于产生味觉类器官的Spib动物。使用杰克逊实验室和辛哈实验室推荐的引物集确认基因型。+/+
兰克尔制剂和注射
重组小鼠RANKL的表达和纯化如前所述进行一些修改[31]。截短的小鼠RANKL转录本（编码小鼠RANKL的氨基酸137-316）进行PCR扩增（正向引物：CACCCCCGGGCAGCTTCTCAGGCT，反向引物：GAGACTCGAGTCAGTCTA TGTCCTGAAC），然后在SmaI和XhoI位点之间克隆到pGEX-5X-2载体（GE Healthcare）。通过测序验证插入片段，然后转化为BL21大肠杆菌菌株（Stratagene）进行表达。选择含有表达质粒的细菌，并在补充有100 μg/ml氨苄素的Luria-Bertani（LB）培养基中生长。用20μM异丙基-D-1-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）在25°C下诱导培养物16小时，并通过GSTrap FF色谱柱（货号71-5016-96 AM，GE医疗，芝加哥，伊利诺伊州）上的亲和色谱从细菌裂解物中纯化谷胱甘肽-S转移酶（GST）标记的RANKL（GST-RANKL），然后对磷酸盐缓冲盐水（PBS）（pH 7.4）的多次变化进行透析。使用空pGEX-5X-2通过相同的方法制备用作对照的重组GST。GST或GST-RANKL，如SDS-PAGE所示，纯度至少为95%，被施用于Spib高和他们的同窝对照动物通过腹膜内注射（250μg/天/小鼠3天）。在第4天杀死小鼠并收集舌上皮或舌组织。
LPS治疗小鼠。
WT和Spib的一半高小鼠接受单次腹膜内注射5mg / kg LPS（溶解在PBS中），另一半接受载体注射（PBS缓冲液）作为对照。LPS处理后6小时杀死小鼠以提取味觉组织。
舌上皮分离。
舌上皮按所述酶剥离[37]。小鼠被一氧化碳杀死2窒息，舌头被切除。由分散酶II（2mg / ml;罗氏，曼海姆，德国;猫。第04942078001号）和胶原酶A（1毫克/毫升;罗氏猫。第10103578001号）在加利福尼亚州2+-不含Tyrode溶液（145 mM NaCl，5 mM KCl，10 mM HEPES，5 mM NaHCO3，10mM丙酮酸，10mM葡萄糖）在舌上皮下注射并在37°C下孵育15分钟。 舌上皮从下面的肌肉组织中轻轻剥离，用于荧光激活细胞分选（FACS）或RNA分离。
荧光激活细胞分选。
来自Lgr5-EGFP-IRES-CreERT2的GFP-荧光Lgr5+味觉细胞;斯皮布高和Lgr5-EGFP-IRES-CreERT2;如前所述，通过FACS分离尖顶小鼠[4，72]。简而言之，将含有来自3只小鼠的CVP的舌上皮区域切除并汇集，切成小块，在37°C下与胰蛋白酶（PBS中的0.25%）孵育10至25分钟，并使用热拉巴斯德移液管机械解离成单个细胞。使用70 μm细胞过滤器（BD Biosciences，马萨诸塞州贝德福德;货号352350）过滤细胞悬浮液，然后使用35 μm细胞过滤器过滤（BD Biosciences货号352235）。根据增强型绿色荧光蛋白（EGFP）信号（激发，488 nm;发射，530 nm），将细胞分选到类器官培养基中进行类器官培养。+/+
3D品味类器官培养。
味道类器官按描述进行培养[4，72]。简而言之，将FACS分选的GFP荧光细胞与4%冷藏基质胶（v / v;BD生物科学，加利福尼亚州圣何塞;猫。第 354234 号）并保持在 DMEM/F12（赛默飞世尔，沃尔瑟姆，马萨诸塞州;货号 11320-033）中，补充有 HEPES（10 mM，赛默飞世尔猫第 15630080 号）、谷氨酸 MAX（2 mM，赛默飞世尔;货号 35050061）、Wnt3a 条件培养基（50%，v/v）、R-spondin 条件培养基 （20%， v/v）、诺金条件培养基 （10%， v/v）、N2 （1%， v/v;赛默飞世尔;猫。编号 17502–048）、B27 （2%， v/v;赛默飞世尔;猫。编号 12587–010）、Y27632 （10 μM;西格玛-奥尔德里奇;猫。不。Y0503）和表皮生长因子（50 ng/mL;赛默飞世尔）。如前所述，Wnt3a和R-spondin条件培养基由Wnt3a和R-spondin稳定细胞系产生[73]。诺金条件培养基是在内部制造的。首先在第5至7天更换培养基，此后每2至3天更换一次。培养14天后，将重组小鼠RANKL以50ng / ml浓度加入新鲜培养基中，连续5天。在不同的时间点（第0天到第5天），收获味觉类器官。
聚合酶链反应和链反应链反应。
使用PureLink迷你试剂盒（赛默飞世尔;货号12183018A）和柱上DNA消化（使用PureLink DNase，赛默飞世尔;货号12185010）从新鲜剥皮的舌上皮或味觉类器官中分离出味或NT上皮，并使用超级脚本VILO试剂盒（赛默飞世尔;货号11755050）将其转化为cDNA。PCR和qPCR如前所述进行。所有qPCR结果均采用ΔΔCt方法以Gapdh为参考进行归一化。使用的引物显示在S4表中。
组织制备。
小鼠被颈椎脱位杀死，舌头上含有的部分被迅速取出，并在冰冷的PBS中短暂冲洗。对于RNAScope测定，使用100%乙醇干冰浴将组织新鲜冷冻在Tissue-Tek O.C.T.封片介质（Sakura）中，然后在解剖后1小时内切片。对于免疫组织化学，将组织在4°C下在4%多聚甲醛/ 1×PBS中固定1小时，并在4°C下在20%蔗糖/ 1×PBS中冷冻保护过夜，然后包埋在O.C.T.使用CM3050S低温恒温器（徕卡显微系统）制备切片（8至10μm厚度）并应用于预包被的显微镜载玻片（Superfrost plus;费舍尔科学）。用于RNAScope 的切片立即在 ?80°C 下储存，用于免疫组织化学的切片在 40°C 下干燥 20 分钟，然后在 ?80°C 下储存。
RNAScope Hiplex测定。
根据制造商的说明，使用Hiplex12小鼠荧光测定试剂盒（目录#324443，高级细胞诊断，美国加利福尼亚州海沃德）进行RNAscope测定。阳性和阴性对照探针与测试探针并行运行，以确保在我们的实验中获得适当的杂交和成像条件。使用尼康A1R-Ti2共聚焦显微镜拍摄共聚焦图像。以 1 μm 的步长捕获每个堆栈具有 6 张图像的 Z 系列堆栈。使用512×512像素格式扫描图像，平均扫描线两次，扫描帧3次。采集参数[即增益、偏移、光电倍增管（PMT）设置]在实验中保持不变。共定位计数是使用Advanced Cell Diagnostics的QuPath软件进行的。根据DAPI染色自动检测细胞边界。通过人工检查确认每个细胞边界的保真度。提取每个细胞每个通道中的荧光点数量（对应于单个mRNA分子）并用于共定位计数。合并来自2只小鼠的2个以上非连续切片的数据。
免疫染色。
对含有CVP、FOP或FFP的切片进行免疫染色，如下所述[37，74]。简而言之，切片在PBS中冲洗，并用补充有0.3%（v / v）Triton X-100和2%驴血清的SuperBlock封闭缓冲液（Thermo Fisher;货号37515）封闭30分钟。将切片与一抗在4°C下孵育过夜。 用1×PBS洗涤3×5分钟后，使用物种特异性二抗来可视化特异性味觉细胞标志物。使用去离子水中的6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI; 1：1，000）观察二抗染色后的细胞核。本研究中使用的一抗和二抗列在S5表中。
味觉类器官的免疫染色如前所述[4，72]。简而言之，通过离心收集培养的类器官，并在补充有MgCl的1×PBS中的新鲜4%多聚甲醛中固定15分钟2（5 mM）， EGTA （10 mM） 和蔗糖 （4%， wt/v）。用 1× PBS 洗涤 3 × 5 分钟后，用补充有 0.3% （v/v） Triton X-100 和 2% （v/v） 驴血清的 SuperBlock 封闭缓冲液（赛默飞世尔货号 37515）封闭类器官 45 分钟，然后在 4°C 下与所需的一抗孵育过夜。用1×PBS洗涤3×5分钟，并在室温下与物种特异性二抗（1：500）孵育1小时。使用去离子水中的6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，1：1，000）来观察二抗后的细胞核。所有图像均使用TCS SP2光谱共聚焦显微镜（徕卡显微系统）捕获。Scanware软件（徕卡显微系统）用于采集以0.5μm步长捕获的z系列堆栈。使用512×512像素格式扫描图像，平均扫描线两次，扫描帧3次。对于抗体实验和无抗体对照，采集参数[即增益、偏移、PMT设置]保持不变。数字图像使用Photoshop CS（Adobe Systems）进行裁剪和排列。使用来自至少2个部分的图像完成每个味觉细胞标记的共定位，显示每只小鼠的整个CV或叶状（N = 3）。只计算那些可以可视化整个细胞体和细胞核的味觉细胞。
评估味觉细胞对荧光珠的摄取。
通过腹膜内注射（10ml / kg）氯胺酮（4.28mg / ml），甲苯噻嗪（0.86mg / ml）和乙酰丙嗪（0.14mg / ml）混合物麻醉的小鼠施用荧光聚苯乙烯乳胶纳米颗粒（荧光灯YG;200nm直径）（Polysciences，Warrington，PA;货号09834-10）。2小时后，用4%多聚甲醛在1×PBS中分离并固定舌头。然后，如上所述获得10μm厚的冷冻切片，并用T1R3特异性抗体染色。如上所述捕获共聚焦图像。如前所述，对含有CVP的舌上皮摄取荧光珠的定量分析[31]。通过使用ImageJ的阈值分析，分析含有CVP的口腔中的珠子摄取程度。荧光珠的图像被保存为8位灰度图像，然后转换为二进制图像。对于CVP占用的区域，计算了信号强度超过阈值截止点（共255个）的像素百分比。在单独通道中获取的同一场中的DAPI染色细胞核的图像在截止点70处的阈值。磁珠摄取的延伸表示为标准化后具有荧光珠的像素与具有DAPI的像素的比率，WT小鼠的CVP平均值为1.0。计数来自2或3个部分的味蕾（味区域，不包括沟槽区域和固有层），每只小鼠的整个CVP（N = 5）。
简短的访问味觉测试。
如前所述，使用戴维斯MS-160小鼠味觉计（Dilog Instruments，佛罗里达州塔拉哈西）进行了短暂的访问测试[72，74，75]。测试了以下口味化合物：蔗糖（30，100，300，1，000 mM），三氯蔗糖（1，3，10，30 mM），味精（MSG; 30，100，300，600 mM），去那铵（0.3，1，3，10 mM），柠檬酸（1，3，10，30 mM）和NaCl（30，100，300，600 mM）。在测试食欲化合物（蔗糖，三氯蔗糖和MPG）之前，将小鼠限制水和食物（1g食物和1.5mL水）23.5小时。对于厌恶味化合物（柠檬酸，去钠和NaCl），在测试前将小鼠剥夺水和食物22.5小时。在每个测试会话中，在第一次舔舐后 5 秒内以随机顺序呈现每种口味化合物和水对照的 4 种不同浓度，并在 7.5 秒间隔后重新打开百叶窗。总测试时间为20分钟。在测试厌恶味剂的会话中，在每次试验之间插入额外的1-s水“洗脱期”。斯皮布高和它们的同窝伙伴Spib小鼠同时并行测试。用所有化合物测试每只小鼠。每次疗程后，允许小鼠恢复48小时，自由获取食物和水。每天监测小鼠的体重，并使用其初始值或超过85%的小鼠。味觉刺激与水舔的比率是通过将味觉化合物的舔次数除以平行测试会话中出现的水的舔次数来计算的。舔比>1表示对味觉化合物的偏好行为，舔比<1表示对味觉化合物的回避行为。+/+
统计分析。
Prism（GraphPad软件）用于统计分析，包括计算平均值，标准误差以及细胞计数和qPCR数据的未配对t检验。味觉行为测试的数据是使用Microsoft Excel编译的。对于行为反应的统计分析，使用双向方差分析和事后成对多重比较与Tukey校正，使用R中的tidyverse和emmeans包评估基因型和浓度之间的差异。统计学显著性水平设定为p < .05。p值<.05被认为对qPCR结果的配对t检验具有显著意义。用于统计分析的所有数据均在支持信息表中提供。支持信息文件 S1 代码中提供了用于此分析的代码。
支持信息
正文和辅助信息文件中的数字中报告的基础数据和统计分析结果。
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一个 B C D E F G H 我 J K L M
1 S1 无花果
2
3 数据 B
4 S1B 图
5 GP2 氯化钾9 马克斯尔1 安克萨5 Sgne1 斯皮布
6 新台币 CVP 新台币 CVP 新台币 CVP 新台币 CVP 新台币 CVP 新台币 CVP
7 0.0000704607 0.00392537 0.000171515 0.00339644 0.0013801 0.00939769 0.0502426 0.280696 0 0.00445669 0 0.002137962
8 0.0000733597 0.00292469 0.000188155 0.00308311 0.00125979 0.00902749 0.0462021 0.326971 0 0.0039542 0 0.001698
9 0.0000639122 0.00238265 0.000229031 0.00218469 0.00121442 0.00557634 0.0500781 0.244894 0 0.0036671 0 0.001349
10 平均值±扫描电镜 6.92e-5±2.79e-6 0.00308±4.52e-4 0.000196±1.71e-5 0.00289±3.61e-4 0.00128±4.94e-5 0.008±0.00122 0.049±0.00132 0.28±0.0238 0 0.00403±2.307e-4 0 0.00173±2.282e-4
11 P 值 0.00264 0.00177 0.00528 0.0005864
S1_DataS2_DataS3_DataS4_DataS5_DataS6_DataS7_DataS8_Data
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S1 数据。 正文和辅助信息文件中的数字中报告的基础数据和统计分析结果。
excel文件中与之对应的图形和工作表如下：S1图=S1_Data，S4图=S2_Data，S5图=S3_Data，S6图=S4_Data，S7图=S5_Data，图3=S6_Data，S8图=S7_Data，图4=S8_Data。图中每个面板的数据都标有相应的面板标签。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001647.s001
（三十）
S1 代码。 用于分析空气计数据的 R 代码。
图4中蔗糖的胃味计数据分析代码如下所示。其他品酒师的代码相似，只是文件名和浓度发生了相应的变化。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001647.s002
（文档）
S1 图 Spib和其他M细胞标志基因在味觉细胞中的表达。
(A）来自cDNA制备的CVP，非味舌上皮（NT）和Peyer贴片（PP）的Gapdh（管家控制基因）Gnat3（味觉组织控制基因），Gp2，Ccl9，Marcksl1，Anxa5，Sgne1和Spib的终点PCR（35个循环）。Gp2，Ccl9，Sgne1和Spib在CVP和PP中表达，但不在NT中表达。 Marcksl1和Anxa5在所有组织中表达，尽管在NT中水平较低。 右边的线表示分子量标记的位置。（B）上述基因在CVP和NT中表达的qPCR分析证实，所有M细胞标志基因在CVP中均高表达，而在NT中表达水平较低或根本不表达。每个标记基因的表达绘制为其周期阈值与Gapdh的周期阈值之比的对数。每个cDNA样本的单个数据点以蓝点显示（基础数据可以在S1_Data的数据B中找到）。（中四）使用Spib特异性探针组的RNAscope杂交在CVP和FFP的味觉细胞亚群中产生强信号。（E-G）用SPIB抗体染色的味和PP冷冻切片的间接免疫荧光共聚焦显微镜检查显示CVP，FOP和PP中味觉细胞亚群中有强烈的核染色。 （H-I） CVP 和 Spib PP 中缺乏 SPIB 信号高小鼠证明了SPIB抗体的特异性。（J）一抗（W / O）的遗漏表明CVP中二抗的非特异性背景较低。细胞核在面板C-J中用DAPI复染。比例尺，50 μm。**p < .01， ***p < .001.
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001647.s003
（提夫）
S2 图 M细胞和II型味觉细胞标志蛋白的共表达。
CVP 切片的双标记免疫荧光共聚焦显微镜检查，具有针对 M 细胞标志物 GP2 和 CCL9 的抗体，CVP 中的 II 型味觉细胞标志物 TRPM5（A-C 和 G-I）或 III 型味觉受体标志物 CAR4（D-F 和 J-L）。合并的图像显示GP2和CCL9与TRPM5（B，H）共表达，但与CAR4（E，K）不共表达。细胞核用DAPI复染蓝色。比例尺，50 μm。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001647.s004
（提夫）
S3 图 M细胞标记基因在缺乏II型味觉细胞的Pou2f3敲除小鼠中不表达。
具有针对SPIB（A），GP2（B）和CCL9（C）的抗体的免疫荧光图像显示，缺乏所有II型味觉细胞的Pou2f3敲除小鼠的CVP中没有染色。细胞核用DAPI复染蓝色。比例尺，50 μm。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001647.s005
（提夫）
S4 图 RANKL通过CVP中的Spib刺激M细胞标记基因表达。
(A-H）使用用针对M细胞标志物GP2，SPIB，CCL9和MARCKSL1的抗体染色的RANKL处理或未处理的WT小鼠的CVP切片的间接免疫荧光共聚焦显微镜。结果表明，施用RANKL导致表达这些蛋白质的味觉细胞比例急剧增加。（I-K）qPCR分析显示，在WT中，RANKL处理后上述所有标记基因和Spib均显著上调，但Spib未上调高小 鼠。ND，没有完成。（M）RANKL处理不影响NT舌上皮M细胞标志基因的表达水平。（图表背后的数据可以在S2_Data的数据I-M中找到。 **p < .01， ***p < .001。±细胞核用DAPI复染蓝色。比例尺，50 μm。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001647.s006
（提夫）
S5 图 RANKL处理诱导M细胞标记基因在培养的味觉类器官中以刻板的时间顺序表达。
(A-L）来自对照和Spib的味觉类器官的间接免疫荧光共聚焦显微镜高小鼠在RANKL处理后0-3天显示M细胞标志物MARCKSL1（A-D），CCL9（E-H）和GP2（I-L）的表达动力学。（M-P）qPCR分析RANKL处理后培养味道类器官中M细胞标志物的表达。RANKL处理后GP2，CCL9和MARCKSL1的表达动力学在蛋白质（A-L）和mRNA（M-P）水平上都是不同的。斯皮布高小鼠在RANKL给药后未能上调所有M细胞标记基因（M-P）。（图表背后的数据可以在S3_Data的数据M-P中找到。数据是平均平均值± SEM。 比例尺，50 μm。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001647.s007
（提夫）
S6 图 斯皮布高小鼠免疫反应受损。
促炎细胞因子和WT和Spib中NF-κB信号通路成分的qPCR分析高小 鼠。（A-B）转录因子Nfkb1，Nfkb2，Rela，Relb，Rel，Irf6和调节蛋白Tollip，Myd88，Irak3和Irak4属于NF-κB信号通路和Irf6的表达在Spib中显着下调高小 鼠。（C）与WT小鼠相比，斯皮布高小鼠表现出促炎细胞因子Il1b，Il6，Tnf和Mcp的表达较低，但抗炎细胞因子Il10和Il12的表达没有改变。（图表背后的数据可以在S4_Data的数据A-C中找到。数据是平均平均值± SEM. *p < .05。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001647.s008
（提夫）
S7 图 LPS诱导的炎性细胞因子表达的qPCR分析。
与WT小鼠相比，LPS给药触发了SpibCVP中夸大的细胞因子表达高小 鼠。（图表背后的数据可以在S5_Data的数据A-F中找到。数据是 SEM ±手段。 *p < 0.05， **p < .01， ***p < .001。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001647.s009
（提夫）
S8 图 味觉细胞类型的比例在 Spib 中保持不变高小 鼠。
(A-H） WT和Spib的CV切片的间接免疫荧光共聚焦显微镜高使用标记物T1R3（A，E），TRPM5（B，F），GNAT3（C，G）和具有抗CAR4（D，H）抗体的III型味觉细胞对II型细胞进行免疫染色的小鼠。细胞核用DAPI（蓝色）复染。（I）与WT小鼠相比，Spib中味觉受体细胞的比例高小鼠没有改变。（图表背后的数据可以在S7_Data的数据I中找到。（J）相应基因表达的qPCR分析证实了这一观察结果（S7_Data中的数据J）。数据是 SEM ±平均值，来自重复的单个数据点显示为黑/蓝点。比例尺，50 μm。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001647.s010
（提夫）
S1 表。 味觉细胞中M细胞标记基因的表达。
显示了来自T1r3-GFP（Tas1-10），Gnat3-GFP（Gnat 1-10）和Gad1-GFP（Gad1-12）细胞的标准化scRNASeq数据。显示的统计比较是使用DESeq2在T1r3-GFP和Gad1-GFP细胞之间进行的。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001647.s011
（三十）
S2 表。 Spib、Gp2 和 Tnfrsf11a mRNA 与编码味觉标记基因的 mRNA 共表达。
RNAscope Hiplex测定在CVP中进行，探针组针对Spib，Gp2，Tnfrsf11a，Tas1r3，Gnat3，Trpm5和Car4，并计数单标记和双标记细胞。分子是表达基因 1 和基因 2 的味觉细胞的数量。分母是表达基因1的味觉细胞的数量。括号中显示了表达基因 1 和基因 2 的味道细胞占表达基因 1 的味道细胞的百分比。ND，未确定。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001647.s012
（文档）
S3 表。 SPIB与味觉标记基因的共表达。
对来自CVP和FOP的味觉细胞进行SPIB双重染色，并对针对T1R3、GNAT3、TRPM5或CAR4的第二种抗体进行双重染色，并对单标记和双标记细胞进行计数。分子是表达基因 1 和基因 2 的味觉细胞的数量。分母是表达基因1的味觉细胞的数量。括号中显示了表达基因 1 和基因 2 的味道细胞占表达基因 1 的味道细胞的百分比。ND，未确定。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001647.s013
（文档）
S4 表。 用于RT-PCR和qPCR实验的引物的核苷酸序列。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001647.s014
（文档）
S5 表。 用于免疫荧光实验的一抗和二抗。
*RRID，研究资源标识符。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001647.s015
（文档）
S1 原始映像。 原始图像显示了琼脂糖凝胶中用于分析RT-PCR数据的所有孔，如图S1A所示。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001647.s016
（英文）
确认
作者希望感谢纽约州立大学布法罗分校的Lee Garrett-Sinha博士提供Spib敲除小鼠品系，感谢澳大利亚维多利亚州Walter and Eliza Hall医学研究所的Lynn Corcoran博士提供SPIB抗体，感谢Hong Wang博士提供创造性建议，感谢Kevin Redding先生提供技术援助。
引用
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