停滞核糖体的泛素化使mRNA通过体内HBS-1和NONU-1衰变
帕里萨·莫奈姆，尼廷·维迪亚萨加，奥黛丽·皮亚特，埃尼莎·塞加尔，约书亚·阿里贝雷
发布时间：2023 年 1 月 10 日
抽象
当核糖体翻译遗传密码时，它们会遇到各种阻碍其进展的障碍。如果核糖体长时间停滞，细胞会因翻译核糖体的损失和异常蛋白质产物的积累而受到影响。因此，为了保护细胞，停滞的核糖体会经历一系列反应来缓解停滞并降解有问题的mRNA，这一过程称为No-Go mRNA衰变（NGD）。虽然NGD的大部分机制是已知的，但沿着这一途径的事件和因素的精确顺序尚未经过测试。在这里，我们部署 C。秀丽隐杆线虫解开构成NGD的协调事件。利用一种新的报告基因和正向和反向遗传学，我们确定了NGD所需的机制。我们随后的分子分析定义了至少两种核糖体蛋白（eS10和uS10）泛素化的功能要求，并且我们表明eS10和uS10上缺乏泛素化位点的核糖体无法在体内执行NGD。我们表明核酸酶NONU-1在泛素连接酶ZNF-598之后起作用，并发现了通过NONU-1在mRNA衰变中核糖体救援因子HBS-1 / PELO-1的新需求。综上所述，我们的工作证明了核糖体向mRNA抑制效应子发出信号的机制，并且我们描绘了抑制因子之间朝着明确定义的NGD途径工作之间的联系。
作者摘要
核糖体是大型分子机器，被赋予读取mRNA和构建蛋白质的基本任务。至关重要的是，核糖体要毫不气馁地继续工作，以避免mRNA上核糖体之间的交通拥堵;然而，他们有时会遇到挑战，使交通拥堵不可避免。在这些情况下，细胞已经进化出清理停滞核糖体并去除有害mRNA的机制。这种机制的大部分现已确定，但因素之间的关系尚未得到检验。在这里，在 C 中。秀丽隐杆线虫 我们识别响应失速的机器，并相对于彼此对因素进行排序。我们发现核糖体必须被泛素标记才能发出mRNA衰变的信号，因为缺乏泛素位点的核糖体无法引发mRNA衰变。此外，我们发现这些泛素信号招募了一种切割mRNA的酶，并且我们提供了核糖体救援因子也是mRNA衰变反应所必需的证据。总体而言，我们的工作提供了协调消除阻碍核糖体的问题mRNA的因素之间的新联系。
引文： Monem PC， Vidyasagar N， Piatt AL， Sehgal E， Arribere JA （2023） 停滞核糖体的泛素化使mRNA在体内通过HBS-1和NONU-1衰变。公共科学图书馆基因19（1）： e1010577. https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010577
编辑 器： Gregory P. Copenhaver，美国北卡罗来纳大学教堂山分校
收到： 11月 29， 2022;接受： 12月 18， 2022;发表： 1月 10， 2023
版权所有： ? 2023 莫奈姆等人。这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。
数据可用性： 本出版物中讨论的数据可通过GEO系列入藏号GSE218514和S2表访问。
资金： 这项工作部分得到了美国国家普通医学科学研究所（NIGMS）（5T32GM133391）向P.C.M.提供的T32培训补助金奖学金，NIGMS（1R01GM131012）向J.A.A.提供的R01赠款，对J.A.A.的Searle学者奖以及UCSC向J.A.A.提供的启动资金的支持。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备中没有发挥任何作用。
竞争利益： 提交人声明不存在相互竞争的利益。
介绍
生物体的生长、功能和对环境变化的反应依赖于核糖体准确地产生蛋白质。mRNA中的细微错误通常难以捉摸，需要主动翻译来检测和触发下游抑制。如果不加以控制，有缺陷的mRNA有可能产生毒性蛋白，导致疾病表型，如神经变性[1，2]。
翻译有问题的mRNA的核糖体可以引发各种抑制机制。两种这样的机制是不间断mRNA衰变（NSD）和No-Go mRNA衰变（NGD）。NSD由缺乏终止密码子的mRNA触发，终止密码子可能由聚腺苷酸化或mRNA切割引起[3]。NGD发生在含有多种伸长抑制特征的mRNA上，例如稳定的二级结构、稀有密码子的延伸、多碱性氨基酸编码序列或受损的核苷酸[4]。虽然由不同的mRNA物种触发，但这两种途径都通过协调募集几种效应子导致mRNA衰变，核糖体拯救和新生肽降解。
NGD的一个关键事件是在mRNA上有问题的位点产生停滞的碰撞核糖体物种。该物种被认为是NGD独有的，可以想象招募下游效应子[5，6，7]。碰撞核糖体之间的界面是mRNA路径附近多种核糖体蛋白泛素化事件的位点[6，7]。保守的E3泛素连接酶ZNF-598被认为在至少两种核糖体蛋白上沉积泛素标记，包括RPS-10（eS10）和RPS-20（uS10）[8，9]。先前的eS10泛素化缺陷点突变过度表达表明，核糖体蛋白泛素化对NGD很重要[8]，但其他泛素化非依赖机制是否起作用仍不清楚。我们对核糖体泛素化的有限理解部分是由于难以恢复靶核糖体蛋白的活突变体，到目前为止，这使得通过ZNF-598对单个泛素化位点及其与抑制的关系的直接分析变得复杂。利用一个系统来研究核糖体泛素化的功能贡献将阐明其重要性。
早期的NGD工作指出，酿酒酵母Dom34和Hbs1（高等真核生物中的Pelota和HBS1）对mRNA切割很重要[4]。尽管早期的一项研究声称Dom34具有核酸酶活性，但现在认为这一要求是间接的[10]，随后对Dom34/Hbs1的研究显示其在核糖体救援中具有生化作用[11，12，13，14]。后来在秀丽隐杆线虫和S中工作。酿酒会发现NONU-1/Cue2/YPL199C是负责在停滞核糖体附近切割NSD和NGD靶标的核酸内切酶[15，16]。虽然NONU-1是有效NSD和NGD所必需的，但尚不清楚该因子如何以及何时靶向失速诱导的mRNA。然而，存在其募集机制的线索：NONU-1及其同系物包含至少两个保守的泛素结合CUE结构域[15]。
关于NGD的大部分知识来自对个体因素和事件的影响的研究，目前尚不清楚这些步骤如何相互关联以产生靶mRNA抑制。在这里，我们部署了 C。秀丽隐杆线虫解开NGD期间的一系列事件。我们表明RPS-10（eS10）和RPS-20（uS10）表型上核糖体泛素化位点的突变敲除ZNF-598。我们提供了支持ZNF-598首先在摊位点泛素化核糖体，然后通过NONU-1降解mRNA的模型。有趣的是，我们还通过NONU-1切割恢复了HBS-1和PELO-1在mRNA衰变中的作用，这与S早期的北方数据一致。酿酒，表明核糖体拯救可能是mRNA切割之前的重要步骤。
结果
一种新型核糖体失速筛选识别核心NGD机制
要建立C.秀丽隐杆线虫作为研究NGD的系统，我们在unc-54位点使用CRISPR / Cas9建立了一个核糖体失速报告基因。UNC-54编码动物运动所需的主要肌肉肌球蛋白，但终生可有可无[17，18，19]。UNC-54也是许多遗传筛选的起点，其表达特征相对较好。为了构建NGD报告基因，我们通过CRISPR / Cas9向UNC-54的C末端添加了T2A“走走停停”肽，FLAG标签，12个稀有精氨酸密码子和GFP，我们将所得等位基因称为unc-54（rareArg）（图1A）（报告序列可在S1表中找到）。我们选择稀有的精氨酸密码子有两个原因：（1）精氨酸是一种带正电荷的氨基酸，先前的工作[20，21]表明这可能通过与肽出口隧道的相互作用诱导核糖体停滞，以及（2）Arg-tRNA在C中解码两个最稀有的密码子（CGG，AGG）。秀丽隐杆线虫在正常生长条件下的表达非常低（艾丹·曼宁，托德·洛，个人通讯，2021 年 6 月），提供了可能发生停滞的第二种途径。
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图1. 遗传筛选可识别No-Go mRNA衰变的抑制因子。
（A）显示unc-54（rareArg）的注释外显子（黑色矩形）的基因图。彩色矩形代表内源性unc-54位点的CRISPR / Cas9插入：T2A序列（灰色），FLAG（深灰色），12个罕见的精氨酸密码子（蓝色）和GFP（绿色）。（B）稀有Arg遗传筛选示意图。（C）znf-598，uba-1，nonu-1和hbs-1等位基因，左侧每个基因一个等位基因的代表性图像。黑色矩形代表外显子，较粗的矩形是CDS，细线是内含子。显示了通过EMS在rareArg屏幕1（浅蓝色）或rareArg屏幕2（深蓝色）以及通过CRISPR / Cas9（黑色）或CGC（灰色）进行的突变。对于HBS-1，多序列比对显示GTP酶结构域中的保守甘氨酸（G200）。
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具有unc-54（rareArg）构建体的菌株显示出与UNC-54蛋白还原一致的不配位（Unc）表型。由于UNC-54的其他C端标签具有功能性[22]，UNC-54蛋白的缺失表明unc-54（rareArg）位点产生的mRNA受到抑制。unc-54（rareArg）动物也表现出非常低水平的GFP，这表明由于mRNA水平降低和/或在翻译伸长过程中大量停滞，很少有核糖体能够进入unc-54（rareArg）的3'末端。
为了初步验证unc-54（rareArg）报告基因作为NGD的靶标，我们将其与已知在C中NGD所需的两个因子的等位基因杂交。秀丽隐杆线虫（nonu-1（AxA））和其他系统（znf-598（Δ））[8，9，15，23]。在每种情况下，我们观察到报告者的去压抑，表现为荧光增加以及动物运动和产卵的改善（外阴肌肉需要UNC-54才能产卵）。nonu-1结果与我们之前的工作一致，表明这段12个罕见的精氨酸密码子赋予非u-1依赖性mRNA衰变[15]。值得注意的是，在nonu-1敲除上看到的表型效应与在S中看到的表型效应不同。酿酒酵母：敲除S中的同源CUE2。酿酒术仅在同时敲除其他因子时具有效果[16]。鉴于我们对NGD的大部分机制理解来自S的工作。酿酒[4，5，16]，并且人类K562细胞中的遗传筛选未能识别NONU-1同系物[24]，我们推断C中的遗传筛选。秀丽隐杆线虫将被证明是有见地的，并增加了从其他系统获得的信息。
使用unc-54（rareArg），我们进行了两次遗传筛选（方法）（图1B）。在这些筛选中的第一个中，我们EMS处理unc-54（rareArg）动物，收获卵，并筛选~90，000个F1基因组。其中，我们在六个平板上发现了六个突变体，运动增加（表明unc-54（rareArg）的去抑制）和GFP增加（指示翻译到unc-54（rareArg）转录本的末尾）。失速通读的证据可以通过GFP在去压制时的核定位可见（图1C）。这一观察结果揭示了我们偶然构建的N末端基序（一系列精氨酸），符合核定位信号的序列要求[25]。我们对变异进行了基因定位和鉴定，发现有四个等位基因映射到znf-598（图1C）。
推断NGD比znf-598更多，我们使用覆盖znf-598位点的染色体平衡器重复筛选，以排除隐性znf-598突变的恢复。 我们筛选了另外~105，000个F1基因组，其中我们在14个平板上发现了另外14个突变体。这些动物的运动和GFP的增加不如第一个屏幕中的znf-598突变体明显。然而，表型足够强大，使我们能够在遗传上绘制和识别致病位点。在这里，我们报告了来自两个屏幕的四个基因中的总共九个等位基因（图1C）。鉴定出另外一个基因中的五个等位基因（catp-6，S1表）;其余六个突变体的绘图和表征正在进行中。
七个等位基因被分成三个容易识别的NGD成分：nonu-1，znf-598和hbs-1。 我们在nonu-1中发现了两个突变，这是基于unc-54（rareArg）报告验证所预期的。我们在znf-598中分离出四个突变（全部来自第一个遗传筛选），其中三个是错义突变。一个突变（C183Y）位于与C中C2H2锌指共识相匹配的区域内。秀丽隐杆线虫和智人，但在S中不守恒。酿酒。P255（P255S，P255H）的两个等位基因在C2H2锌指开始时突变了一个高度保守的脯氨酸。在C中发现了一个等位基因。秀丽隐杆线虫的HBS1同系物（k07a12。4，以下简称HBS-1）。该等位基因处于保守的GTP结合和活性位点残基（G200E）（图1C）中，符合GTP结合和HBS-1在NGD中水解的功能要求。
在uba-1中定位了另外两个突变，uba-1是C中唯一的E1泛素激活酶。秀丽隐杆线虫。两种uba-1突变（E665K、P679S）的存活率都较差，正如预期的那样，因为uba-1的完全丧失被认为是致命的[26]。我们通过杂交该基因已知的温度敏感功能丧失等位基因（it129;P1024S），并观察到GFP的温度依赖性去抑制。由于已知ZNF-598在其他系统中作为泛素连接酶起作用[8，9]，我们预计uba-1功能丧失会损害泛素偶联级联反应，导致unc-54（rareArg）去抑制。
通过因子过表达进行细胞特异性NGD挽救
我们还开发了一个系统，使用染色体外阵列分析特定NGD通路成分过表达的影响。过表达是生成因子的过度活跃等位基因以测试它们在途径中的相对顺序的有用方法。将外源DNA注射到C的种系中。秀丽隐杆线虫导致DNA序列融合成染色体外阵列[27，28]。所得阵列可以是减数分裂和有丝分裂遗传的，尽管与内源性染色体相比效率降低。我们创建了一个质粒载体，用于在具有以下组分的转基因阵列上过表达目的基因：（1）myo-3启动子，以驱动体壁肌肉中的表达，其中unc-54也表达，（2）荧光mCherry蛋白，用于监测阵列的遗传和表达，（3）“走走停停”的T2A序列，将mCherry与目的基因分离， （4）插入目的基因的位点。我们构建了编码与C相连的荧光蛋白的质粒。秀丽隐杆线虫的ZNF-598和Nonu-1。
为了检查从数组中表达的因子的功能，我们在每个同源突变背景中制作了过表达数组。野生型ZNF-598和NONU-1蛋白的过表达分别恢复了unc-54（rareArg）的抑制，并挽救了znf-598（图2A）和nonu-1（图2B）的功能丧失表型。因此，过度表达的因素是功能性的。阵列可以在动物的细胞谱系中随机丢失或沉默，使我们能够逐个细胞水平检查救援。对于znf-598和nonu-1中的每一个，我们观察到因子表达（通过mCherry监测）和unc-54（rareArg）（通过GFP监测）之间存在反比关系。因此，救援是细胞自主的，正如目前ZNF-598和NONU-1直接作用于核糖体和mRNA的模型所预期的那样。
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图2. ：通过因子过表达进行细胞特异性NGD救援。
（A）ZNF-598构建质粒和znf-598菌株种系显微注射示意图。以下是表达上述结构的代表动物的GFP和mCherry图像，放大了一个区域，展示了mCherry标记因子表达对NGD（GFP）的影响。（B）如（A）中，对于nonu-1菌株中的nonu-1构建体。（C）（A，B）中菌株的平均重叠评分。每个黑点代表一个独立分离株（n≥4只动物/分离株）的平均值，所有分离株的平均值显示为绿色条。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010577.g002
为了量化因子过表达（mCherry）与NGD（GFP）的反比关系，我们根据多个独立动物中最亮的红色和绿色像素计算了重叠分数（方法）（S1图）。如果mCherry和GFP不重叠（正如救援所预期的那样），重叠分数将为负数。如果mCherry和GFP重叠（如预期的那样，如果没有救援），重叠分数将是正的。对于znf-598和nonu-1，我们观察到的值接近-1（图2C），证明了动物救援的普遍性。
通过NGD（unc-54（rareArg）），因子突变体（znf-598，nonu-1，hbs-1和pelo-1）以及过表达/拯救系统的功能读数，我们着手表征因子关联和抑制基因表达以响应核糖体停滞的分子机制。
ZNF-598是C中核糖体泛素化所必需的。秀丽隐杆线虫
在NGD筛选中，我们恢复了znf-598的几个等位基因。ZNF-598同系物被认为可识别小亚基上的核糖体碰撞和泛素酸盐位点，包括RPS-10（eS10）和RPS-20（uS10）[8，9]。通过多序列比对，我们鉴定出高度保守的半胱氨酸（C89）（图3A）[9]，已知是Hel2 / ZNF598泛素偶联所需的，并且我们通过CRISPR / Cas9在内源性位点产生了点突变（C89A）。znf-598（C89A）突变体表现出unc-54（rareArg）去抑制，与znf-598（Δ）的表型无法区分（图3B），支持泛素化在抑制C中失速诱导的mRNA中的作用。秀丽隐杆线虫，就像在其他系统中一样。
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图3. ZNF-598是C中核糖体泛素化所必需的。秀丽隐杆线虫。
（A）S的多序列比对。酿酒Hel2， H.智人ZNF598 和 C.秀丽隐杆线虫ZNF-598 无名指域。保守的残基（灰色）和C89（橙色）突出显示。排列下方的守恒如下：星号表示同一性，冒号表示具有强相似性质的氨基酸，句点表示具有弱相似特性的氨基酸。（B）unc-54（rareArg）背景中指示菌株（n≥15只动物/株）的平均RFU（相对荧光单位）。一个标准偏差显示为误差线。来自韦尔奇 t 检验的 p 值。（C）指示菌株的蛋白质印迹以监测RPS-20和RPS-10表达。按指示加载野生型标记蛋白的稀释液，比其他两个样品多两倍，少两倍，以生成在右侧图中显示为黑线的标准曲线。对标记蛋白的赖氨酸突变体进行定量，并在右侧的图中绘制为蓝绿色点。（D）指示菌株的蛋白质印迹，以监测HA标记的RPS-10的泛素化。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010577.g003
为了研究ZNF-598的核糖体蛋白靶标，我们通过CRISPR / Cas9在内源性位点标记了RPS-10（eS10）和RPS-20（uS10）。通过免疫印迹，我们观察到同源核糖体蛋白在每个菌株中的强健表达（图3C）。我们还在RPS-10和RPS-20中突变了保守赖氨酸，已知这些赖氨酸是其他系统中泛素化的位点（S2A和S2B图）[8，9]。K>R取代不会对RPS-10和RPS-20的表达产生不利影响（图3C），也不会对动物的活力产生不利影响。在RPS-10的情况下，我们还观察到一个与Ub-RPS-10的预期大小相对应的条带。该条带在rps-10（K125R）（图3C）和znf-598（C89A）突变体（图3D）中不存在。这些结果表明，在K125上RPS-10泛素化需要znf-598。
通过消融泛素化位点制成的NGD缺陷核糖体
先前的研究强调了核糖体泛素化事件在NGD中的重要性[8，9]。然而，单个泛素化位点的确切功能贡献仍不清楚，部分原因是难以在相关核糖体蛋白中获得活突变体。在先前的工作中，RPS-10在泛素化位点的K>R取代的过表达使停滞报告基因的去抑制作用介于野生型和ZNF598敲除人细胞中观察到的抑制[8]。该实验的解释因许多因素而变得复杂，包括野生型RPS-10的残余表达。完全去除RPS-10泛素化位点会模仿ZNF598的损失吗？ZNF598在核糖体泛素化中的作用之外是否还有助于功能抑制？到目前为止，我们的工作支持类似于人类细胞的NGD机制，因此我们的系统似乎是探索这些问题的有用模型。特别是，核糖体点替换在内源性位点的可行性以及制造双突变体和过表达构建体的便利性为我们提供了测试核糖体泛素化功能重要性及其与ZNF-598关系的模型的方法。
为了初步测试核糖体泛素化在NGD中的功能作用，我们将rps-10（K125R）和rps-20（K6R + K9R）杂交到unc-54（rareArg）中。在每种情况下，我们都观察到NGD的缺陷，表现为unc-54（rareArg）产生的GFP增加（图4A）。双突变体（rps-10（K125R）;rps-20（K6R+K9R））NGD表现出更强的缺陷，与在znf-598突变体中观察到的相当。我们解释这些数据表明核糖体泛素化是NGD所必需的，并且仅消融这两个部位就足以预防功能性NGD。有趣的是，这些实验表明，通过一些赖氨酸的突变，有可能使核糖体缺乏NGD的版本，突出了核糖体和泛素化在NGD中的核心作用。
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图4. 通过消融泛素化位点制成的NGD缺陷核糖体。
（A）unc-54（rareArg）背景中指示菌株（n≥15只动物/株）的平均RFU（相对荧光单位）。一个标准偏差显示为误差线。来自韦尔奇 t 检验的 p 值，星号表示与野生型的所有比较的 p<0.01。（B）如图2所示，在rps-10中构建znf-598;rps-20菌株。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010577.g004
我们还进行了额外的实验，以阐明核糖体泛素化与znf-598相关的功能。首先，我们进行了双突变体分析。在核糖体泛素化在功能上独立于znf-598的模型中，我们期望rps-10（K125R）;znf-598（Δ）突变体将表现出比单独单个突变体更强的NGD表型（更多的GFP）。然而，如果ZNF-598和Ub-RPS-10位于相同的途径上，我们预计rps-10（K125R）;znf-598（Δ）表型类似于单个突变体之一。rps-10（K125R）;znf-598（Δ）表型与znf-598（Δ）单突变体难以区分（图4A），与后一种模型一致。其次，我们使用了过表达系统。在rps-10（K125R）和rps-20（K6R+K9R）位于通往znf-598的部分冗余路径上的模型中（i.例如，ZNF-598在这两个位点的泛素化之外还包含额外的抑制功能），我们预计ZNF-598的过表达将在rps-10（K125R）中提供NGD的恢复;rps-20（K6R+K9R）突变体。然而，如果ZNF-598通过RPS-10和RPS-20起作用，则ZNF-598在rps-10（K125R）中过表达;rps-20（K6R+K9R）突变体将产生与rps-10（K125R）相同的表型;rps-20（K6R+K9R）。我们观察到后者（图4B），再次表明ZNF-598通过RPS-10和RPS-20的泛素化起作用。
综上所述，我们的实验表明ZNF-598是至少RPS-10和RPS-20泛素化所需的泛素连接酶，并且这些泛素化事件对NGD至关重要。ZNF-598的丢失可以通过核糖体蛋白的突变来模拟，这一事实提供了令人信服的证据，证明ZNF-598在NGD期间的主要功能是在核糖体上沉积泛素。
NGD 期间的 NONU-1 功能需要 CUE 结构域并遵循 ZNF-598
在该系统中确定了ZNF-598泛素化的要求后，我们决定研究泛素化与mRNA衰变的关系。NGD的一个关键效应物是NONU-1，在我们的筛查（图1C）和之前的NSD筛查中也发现了NONU-1[15]。在我们之前的工作中，我们注意到NONU-1及其同系物含有CUE结构域（图5A）[15，29]，已知它们与泛素结合，这表明NONU-1募集到核糖体停滞位点的机制。为了测试nonu-1功能中对CUE结构域的要求，我们删除了CUE结构域，并观察到与其他nonu-1突变体无法区分的表型（图5B）。这一结果与 CUE 结构域对 NONU-1 功能至关重要是一致的。我们还试图通过标记N末端（S1表）来检查NONU-1的表达，但标记的等位基因是无功能的。我们没有标记NONU-1的C末端，因为它是保守的。我们期待未来的工作，我们可以确定NONU-1中CUE结构域的要求是仅用于NONU-1表达还是其生化功能。
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图5. NGD期间的NONU-1功能需要CUE结构域并遵循ZNF-598。
（一） 三.秀丽隐杆线虫由AlphaFold预测的NONU-1蛋白结构[29]。预测置信度如下：蓝色区域表示置信度，黄色区域表示置信度较低，橙色区域表示置信度非常低。置信域以蓝色圈出并标记。（乙、丙）unc-54（rareArg）背景中指示菌株（n≥15只动物/株）的平均RFU（相对荧光单位）。一个标准偏差显示为误差线。来自韦尔奇 t 检验的 p 值，星号表示与野生型的所有比较的 p<0.01。（D）如图2所示，znf-598在nonu-1菌株中构建。（E）如图2所示，在znf-598菌株中具有nonu-1构建体。（F）指示菌株的蛋白质印迹，以监测HA标记的RPS-10的泛素化。（G） unc-54（不间断）背景中指示菌株（n≥15 只动物/株）的平均 RFU（相对荧光单位）。一个标准偏差显示为误差线。来自韦尔奇 t 检验的 p 值，星号表示与野生型的所有比较的 p<0.01。（H） ZNF-598互信息图。90%百分位截止值显示为虚线，NONU-1以粉红色突出显示，阴性对照蛋白以灰色突出显示。
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为了确定NONU-1是否与ZNF-598在同一途径中起作用，我们进行了双突变体分析。如果这两个因子在不同的途径中起作用，我们预计双突变体中unc-54（rareArg）报告基因会出现加性表型。然而，如果NONU-1和ZNF-598在相同的抑制途径中起作用，我们预计双突变体类似于单个突变体之一。我们将znf-598和核糖体泛素化位点的突变与nonu-1（AxA）相结合，Nonu-1是nonu-1的催化突变，与nonu-1的缺失无法区分（S3图）[15]。nonu-1;znf-598双突变体模仿znf-598单突变体（图5C），与NGD中在同一途径中起作用的两个因子一致。
接下来，我们研究了ZNF-598和NONU-1在NGD中相对的顺序。在第一对实验中，我们在nonu-1突变体中过表达ZNF-598，在znf-598突变体中也过表达NONU-1。根据经典逻辑，在功能通路中对基因进行排序时，我们预计上游因子的过表达不会补偿下游因子的损失，但下游因子的过表达会补偿上游因子的损失[30，31，32，33]。我们观察到ZNF-598过表达对nonu-1表型的影响很小（图5D），我们看到NONU-1过表达挽救了znf-598表型（图5E）。这些结果支持NONU-1在ZNF-598下游起作用的模型。在第二组实验中，我们通过免疫印迹检查了nonu-1（AxA）中的RPS-10泛素化，并观察到它没有变化（图5F）。我们将这一结果解释为表明nonu-1突变体的缺陷是在核糖体泛素化之后，i。e，在泛素化核糖体对mRNA衰变的承诺中。
我们很想知道nonu-1和znf-598是否在NSD中也同时起作用。因此，我们量化了突变体对unc-54（不间断）报告基因的影响，unc-54的等位基因标记有C端GFP，缺乏所有终止密码子[15，34]。与其对unc-54（rareArg）报告基因的强烈影响相反，znf-598突变体表现出轻微的unc-54（不间断）去抑制（图5G）。这一结果与znf-598在NSD中的作用比在unc-54（rareArg）中观察到的更温和一致，并解释了为什么先前的NSD筛查未能识别znf-598[15，34]。nonu-1突变体对unc-54（不间断）的去抑制程度高于znf-598，并且双突变体表达的GFP水平高于任何一个单个突变体。nonu-1和znf-598一起表现出加性效应的事实表明，NONU-1在NSD期间通过除ZNF-598以外的E3泛素连接酶募集。有关此内容的详细信息，请参阅讨论。
综上所述，我们与unc-54（rareArg）报告基因的结果支持ZNF-598和NONU-1在NGD中共同起作用的模型。基于我们的遗传和分子分析，我们倾向于核糖体泛素化将NONU-1募集到mRNA中进行切割的模型。
ZNF-598和NONU-1在整个真核生物中的保守作用
为了确定ZNF-598和NONU-1之间的关系是否是整个真核生物中广泛保守的现象，我们进行了系统发育分析（综述于[35]）。简而言之，系统发育分析使用相互信息对蛋白质对进行评分，这可以解释为蛋白质对一起起作用的趋势，无论是冗余的还是顺序的。当两种蛋白质一起遗传或一起丢失时，或者当两种蛋白质在遗传上是多余的并且至少一种蛋白质得以维持时，可以实现高度的互信息。
我们通过在473名原生生物的基因组和转录组序列上搜索111，921个剖面HMM [36]来进行系统发育分析，因为这些序列代表了不同的真核生活方式（方法）。为了验证这种方法，我们计算了已知在复合物中共同起作用的因子对之间的互信息，例如PELO-1/HBS-1（S4A图）和LTN-1/RQC-2（S4B图）[11，12，14，37]。PELO-1/HBS-1和LTN-1/RQC-2表现出很高的互信息，得分分别在彼此的前99.88%（PELO-1在与HBS-1的15，909次相互作用中排名第19位）和98.86%（RQC-2在与LTN-1的15，909次相互作用中排名第181位）。同样，我们观察到ZNF-598和NONU-1在彼此的前99.38%中排名前99.38%（NONU-1在与ZNF-598的15，909次相互作用中排名第99位）（图5H）。因此，ZNF-598和NONU-1是不同真核生物中广泛保守的官能对，我们在C中的工作。秀丽隐杆线虫表明，这对在NGD中起作用以降解阻滞核糖体的mRNA。
HBS-1 N末端类似于泛素结合结构域，对NGD是可有可无的
我们的几个NGD抑制突变体（znf-598，nonu-1，uba-1）编码因子参与泛素依赖过程，所以我们最初感到惊讶的是，这个筛选还鉴定了核糖体救援因子hbs-1。 因此，我们检查了HBS-1，以确定它是否可以以泛素依赖的方式发挥作用。
HBS-1蛋白由一个N末端结构域、一个无序接头区域、一个GTP酶结构域和两个β-桶结构域组成[12，14，29]（图6A）。在2个已发表的结构中，我们注意到HBS-1的N端结构域位于核糖体上已知的泛素化位点（uS10和uS3）附近，并采用明显的三螺旋束[12，14]。Pfam将该折叠归类为泛素结合的Uba氏族的成员（图6B）[12，14，38]。乌巴氏族的著名成员包括乌巴和CUE域，在S中发现。酿酒拉德23和C。秀丽隐杆线虫分别是NONU-1。我们还注意到，植物HBS-1 N项同系物含有保守的C4型锌指（ZnF），与大鼠Npl4中已知的泛素结合C4 ZnF结构域同源（图6C）[39]。这些观察结果表明，来自不同生物体的HBS-1 N末端彼此缺乏序列或结构同源性，但许多N末端与结合泛素的结构域具有同源性。鉴于与泛素结合结构域的这种同源性，我们假设HBS-1的N末端结构域可能在NGD期间结合泛素。
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图6. HBS-1 N末端类似于泛素结合结构域，对于NGD是可有可无的。
（一） H.智人AlphaFold预测的Hbs1蛋白结构[29]。预测置信度如图 5A 所示，深蓝色表示高置信度区域。置信域以蓝色圈出并标记。（B）Hbs1 N末端结构域与泛素结合结构域之间的结构同源性。左边是代表UBA氏族的结构：来自[38]（tan，S.酿酒Vps9p，1P3Q）。右边是来自[12]的Hbs1 N末端的两个结构（粉红色，S。酿酒，3IZQ）和[14]（绿色，S。酿酒会，5M1J）。氨基和羧基末端分别用N和C表示。注意拓扑结构的整体相似性和跨结构折叠。（C）植物Hbs1的N末端锌指（ZnF）与大鼠Npl4的Ub结合ZnF同源。 来自系统发育多样性植物的Hbs1的ZnF的多序列比对。在Npl4同系物中高度保守的残基为蓝色，与Ub接触的残基为黄色，同时保守和接触Ub的残基为绿色。来自[39]的Npl4残基的着色和注释。（D）unc-54（rareArg）背景中指示菌株（n≥15只动物/株）的平均RFU（相对荧光单位）。一个标准偏差显示为误差线。来自韦尔奇 t 检验的 p 值。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010577.g006
为了确定HBS-1的N末端是否是其在NGD中的功能所必需的，我们通过删除跨越三螺旋束的区域和大部分接头区域来生成hbs-1的N末端缺失突变体，产生仅由前几个氨基酸，短接头和GTP酶结构域组成的HBS-1。令人惊讶的是，在测量unc-54（rareArg）GFP水平时，删除HBS-1的N末端没有可辨别的表型，表明HBS-1的N末端结构域对于C中的NGD是可有可无的。秀丽隐杆线虫（图6D）。
虽然我们的遗传分析支持HBS-1在NGD中的作用独立于N末端结构域，但它并不排除NGD之外的结构域的泛素结合作用。为了测试这种可能性，我们进行了体外泛素结合试验[40]。然而，我们未能观察到高于背景的泛素结合（S5图）。我们推测，体外结合测定的成功可能会受到需要核糖体表面以促进HBS-1结合的阻碍，因为在结构研究中，N末端与核糖体结合[12，14]。我们期待未来的工作来探索HBS-1 N末端在核糖体上的功能。
HBS-1和PELO-1对mRNA降解至关重要
HBS-1在其他情况下与PELO-1一起起作用，因此我们决定测试pelo-1在NGD中的功能作用。我们将一个pelo-1突变体（cc2849，带有大缺失）[34]杂交到unc-54（rareArg）报告基因中。pelo-1突变体表现出与hbs-1突变体中观察到的相当的unc-54（rareArg）的去抑制（S6图）。此外，HBS-1;pelo-1双突变体表现出与单突变体相似的表型（S6图），表明这两个因子在NGD中共同起作用，这在其他系统中是已知的。
HBS-1和PELO-1主要以其在核糖体救援中的作用而闻名，我们最初对它们对UNC-54（rareArg）记者的压制要求感到惊讶。尽管HBS-1/PELO-1在核糖体救援中具有明确的生化作用[11，12，13，14，41]，但在其他系统中NGD的mRNA降解中，HBS-1/PELO-1也存在已知但知之甚少的需求[4]以及C的NSD。秀丽隐杆线虫[34]。我们假设HBS-1 / PELO-1可能促进C中NGD期间mRNA衰变。秀丽隐杆线虫。为了验证这一假设，我们对携带unc-54（rareArg）报告基因的znf-598，nonu-1和hbs-1突变体进行了RNA-seq（图7A）。我们观察到unc-54（rareArg）mRNA水平的增加与每种菌株中观察到的GFP去抑制水平相当，其中znf-598赋予最高水平，nonu-1和hbs-1表现出较小且相似的mRNA水平增加。因此，我们得出结论，HBS-1是C中NGD过程中mRNA降解所必需的。秀丽隐杆线虫。
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图 7. HBS-1和PELO-1对mRNA降解至关重要。
（A）来自两个生物学重复（显示为菱形和正方形）的指示菌株中unc-54（rareArg）的RNA-seq平均倍数变化。（乙、丙）unc-54（rareArg）背景中指示菌株（n≥15只动物/株）的平均RFU（相对荧光单位）。一个标准偏差显示为误差线。来自韦尔奇 t 检验的 p 值，星号表示与野生型的所有比较的 p<0.01。（D）如图2所示，在pelo-1中构建znf-598; HBS-1菌株。（E）如图2所示，在pelo-1中具有nonu-1构建体; HBS-1菌株。（F）UNC-54（不间断）背景中指示菌株（n≥15只动物/株）的平均RFU（相对荧光单位）。一个标准偏差显示为误差线。来自韦尔奇 t 检验的 p 值，星号表示与野生型的所有比较的 p<0.01。（G） 通过ZNF-598、HBS-1和NONU-1的NGD模型。（H） ZNF-598互信息图。90%百分位截止值显示为虚线，HBS-1以黄色突出显示，阴性对照蛋白以灰色突出显示。（I） 如（H）所示，显示NONU-1与HBS-1的相互信息。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010577.g007
S.酿酒酵母将HBS-1和pelo-1（HBS1和DOM34）的同系物确定为NGD期间核内裂解切割所必需的[4，10，42]，但在这项工作进行时，核酸酶的身份尚不清楚。基于这些文献和我们的RNA-seq分析，我们假设HBS-1 / PELO-1可能与NONU-1以相同的途径起作用。为了验证这一假设，我们用hbs-1和nonu-1进行了双突变体分析。nonu-1;HBS-1双突变体与nonu-1单突变体无法区分，表明HBS-1与NONU-1具有相同的途径（图7B）。我们还发现HBS-1与ZNF-598具有相同的作用途径（图7C）。
为了在NGD中放置HBS-1相对于ZNF-598和NONU-1，我们测试了过量的ZNF-598或NONU-1是否可以补偿pelo-1和hbs-1的损失。ZNF-598的过表达导致NGD表型几乎没有变化（图7D），与HBS-1 / PELO-1在ZNF-598下游起作用的模型一致。相比之下，NONU-1的过表达在pelo-1中拯救了NGD;HBS-1动物（图7E）。这一结果表明，NONU-1在HBS-1/PELO-1的下游起作用。有趣的是，使用NSD报告基因的分析表明，NSD中NONU-1和HBS-1 / PELO-1具有不同的功能：NSD中pelo-1和nonu-1的双突变分析显示出加性效应（图7F）。
综上所述，我们的分析将HBS-1和PELO-1置于NGD期间与ZNF-598和NONU-1的途径上，并提出了HBS-1在ZNF-598下游起作用以促进NONU-1的mRNA衰变的模型（图7G）。
HBS-1与NONU-1和ZNF-598广泛保守
根据我们的遗传分析，我们很想知道HBS-1与NONU-1和ZNF-598之间关系的保守性。为此，我们对具有ZNF-598同系物的HBS-1进行了系统发育分析，并观察到彼此的96.9%/98.3%的互信息水平相对较高（图7H），表明HBS-1和ZNF-598在整个真核中共同发挥作用。NONU-1和HBS-1分别下降了93.7%和96.7%，仍然表现出一定的保守性，但低于ZNF-598的任何一种因素（图7I）。综上所述，我们的保护分析支持ZNF-598和HBS-1之间的保守关系，而HBS-1和NONU-1之间的保守关系较小。
讨论
在这里，我们研究了NGD所需的几个因素的功能和相互作用。总体而言，我们的工作支持一种模型，其中ZNF-598对RPS-10和RPS-20的泛素化通过泛素结合招募NONU-1以引发mRNA衰变，而HBS-1作用于ZNF-598的下游，使NONU-1的mRNA切割成为可能。
我们的数据与ZNF-598直接泛素化RPS-10和RPS-20的模型一致。我们注意到，我们的数据也可以用ZNF-598间接影响RPS-10和RPS-20泛素化的模型来解释。g.，通过中间E3连接酶。虽然我们没有在筛选中识别其他E3连接酶，但这些E3连接酶的丢失可能是不可行的，从而阻止了它们的恢复。需要做更多的工作来区分这些模型。
无论ZNF-598是否直接或间接作用于RPS-10和RPS-20，我们的数据表明这些蛋白质在单一途径中起作用，以产生mRNA抑制。NGD期间核糖体上也可能有其他泛素化位点起作用，正如其他系统所提示的那样[43，44]。值得注意的是，我们可以仅通过消融RPS-10和RPS-20位点来有效地阻止mRNA降解。我们对NONU-1与核糖体泛素化位点关系的分析表明，该模型比简单的单泛素化位点单效应模型更复杂。考虑到NONU-1的多个泛素结合结构域，这可能是可以预期的。需要进一步的遗传工作来阐明NGD中泛素化位点的网络，并且考虑到碰撞核糖体上位点的组合可能性，我们预计结构研究将是有见地的。
虽然我们的unc-54（rareArg）报告指出，在NGD期间，NONU-1和ZNF-598在很大程度上在同一途径中起作用，但我们的NSD数据与NONU-1招募的灵活性一致。鉴于ZNF-598在NSD中的轻微影响，以及NSD筛选中没有znf-598等位基因[15，34]，我们假设ZNF-598以外的因子用于识别停滞在mRNA3'末端的核糖体。其他E3连接酶也参与了监测，未来的工作有望阐明每种连接酶的募集机制[7，44，45]。这些数据也可以通过UNC-54（不间断）与unc-54（rareArg）的失速机制和/或报告器读数的差异来解释。无论如何，在znf-598中看到的温和的NSD去抑制表明ZNF-598在NSD期间确实作用于一些核糖体。我们假设ZNF-598靶向的碰撞在nonu-1突变体中恶化，解释了znf-598对nonu-1突变体中NSD的更大影响（图5G）。这些观点与其他模型一致，表明多种类型的碰撞，每种碰撞的相对数量取决于遗传背景[7]。
在这里，我们发现HBS-1的N端结构域对于NGD是可有可无的，尽管与泛素结合结构域具有结构同源性。我们的序列分析显示，尽管初级序列保守性很小，但HBS-1 N-termini编码的结构域与泛素结合结构域同源。虽然这表明HBS-1结合泛素，但我们未能观察到泛素在背景之上结合，这表明相互作用可能需要额外的因素。HBS-1 N末端也有可能干扰泛素化反应。鉴于目前核糖体结合的HBS-1结构缺乏泛素的密度，我们预计泛素化核糖体的结构研究将被证明是有见地的。
鉴于先前在S的工作。酿酒会揭示了Hbs1在NGD切割中的作用[4，10，42]，根据我们的数据，我们倾向于HBS-1活性大大增强NONU-1切割mRNA的模型。我们注意到我们在筛选中回收了HBS-1 GTP酶突变体，这表明GTP水解是mRNA衰变中HBS-1功能所必需的。因此，我们假设在拯救核糖体的过程中，HBS-1 / PELO-1产生NONU-1的底物或以其他方式启用NONU-1作用。在该模型中，尚不清楚哪些核糖体被拯救，但先前的工作支持HBS-1/PELO-1在内部停滞的核糖体上起作用[41]，这与救援第一切割第二NGD模型一致。HBS-1和NONU-1之间的这些机制联系将能够发现核糖体救援与mRNA衰变之间已知但知之甚少的联系背后的分子机制。
总体而言，我们的工作通过证明后生动物中NGD因子的守恒性，并排序ZNF-598，HBS-1 / PELO-1和NONU-1执行的事件序列来增加从其他系统获得的信息，以响应核糖体停滞的mRNA抑制。
方法
秀丽隐杆线虫菌株的构建和繁殖
秀丽隐杆线虫菌株来源于VC2010菌株（N2）[46]，CB4856（夏威夷）菌株用于抑制突变体定位。在以OP50为食物来源的NGM平板上以16C或20C生长动物[47]。一些菌株是从Caenorhabditis遗传中心（CGC）获得的，该中心由NIH研究基础设施计划办公室（P40 OD010440）资助。如前所述，进行CRISPR/Cas9以引入基因组编辑[48]。回收每个突变的多个独立分离株，并观察到具有相同的表型。突变组合是通过杂交产生的。S1 表中提供了菌株、突变等位基因序列、PCR 引物和来源的完整列表。
EMS 诱变和抑制突变筛选
EMS诱变基本上如描述[34]。简而言之，用M9洗涤每种菌株的大量菌群至4mL的最终体积。加入EMS至~1mM的终浓度，并将动物在室温下孵育4小时并章动。将动物洗涤并在室温下在接种有OP50的NGM板上过夜。第二天，清洗动物并通过次氯酸盐处理收集鸡蛋。将100-200个卵放在单个小NGM + OP50板上并使其繁殖。筛选平板以增加GFP荧光和增加运动的F2 / F3动物。每个NGM板仅保留一个分离物，以确保突变的独立性。
第一个 rareArg 筛选被 znf-598 的命中饱和，阻碍了我们在其他位点恢复其他等位基因的能力。为了解决这个问题，我们构建了一种覆盖含有znf-598的II号染色体区域的双平衡菌株，类似于NMD抑制器筛选中使用的方法[49]。该菌株（WJA 1040）在unc-54（srf1004）的染色体I上是纯合子，对于mnC1在染色体II上是杂合的[dpy-10（e128） unc-52（e444） nls190 let-？ （AG226）和tra-2（e1095）（CB2754）。mnC1纯合子或tra-2（e1095）纯合子的动物分别是不可存活的或Tra/无菌的，使我们能够消除平衡区域内隐性抑制突变体的恢复。如上所述，该菌株经受EMS诱变。仅保留维持 mnC1/tra-2 杂合平衡器的分离株，如 myo-2：：GFP（标记 mnC1）、非 Tra 表型和随后的活力所示。
抑制突变体映射和鉴定
从EMS筛选中恢复突变体后，我们采用了所述的夏威夷SNP映射方法[50]。我们将每个分离的抑制突变体杂交到夏威夷（CB4856）unc-54（cc4112）雄性（表达由CRISPR / Cas9设计的UNC-54：：mCherry融合）。杂交后代被分离并允许自我受精。然后将F2 GFP+后代回交至unc-54（cc4112）雄性至少2次。
经过几轮回交后，将给定突变体的几种表型抑制动物（~20-30）汇集到单个板上并繁殖直至饥饿。饥饿时，用1mL EN50将动物从平板上洗掉，并进一步用EN50洗涤以除去残留的E。大肠杆菌。蛋白酶K处理后提取基因组DNA，并重悬于50uL TE pH7.4中。使用50ng基因组DNA作为Nextera（Tn5）测序文库制备的输入。文库在Novogene Corporation Inc.加州大学戴维斯分校测序中心使用NovaSeq 6000进行测序。
读取映射到 C。使用Bowtie2的秀丽隐杆线虫基因组（版本2.3.4.1）。使用GATK [51]和先前发表的夏威夷SNP数据集[46]将读数分配给单倍型。在整个基因组中计算可分配给夏威夷或N2动物的读段比例，并通过基因组的一部分与0%夏威夷动物识别连锁。然后手动检查连接区域以识别候选病变和位点。
荧光显微镜和图像分析
所有动物均保持在20°C。选择L4动物并在3uL EN50中麻醉，在带有0.15mm盖玻片的显微镜孔载玻片中，含1mM左旋咪唑。
蔡司AxioZoom显微镜与1.0倍物镜一起使用，以获取用于GFP定量实验的图像。所有图像均使用以下参数：曝光时间为250ms，偏移为50%，变焦为80%。为每个品系对15-25只代表性动物进行成像。显示的所有比较都是在同一成像会话期间获得的图像之间的比较。我们使用斐济来定义动物的面积，减去背景，并确定每只动物面积的平均像素强度。
使用徕卡SP5共聚焦显微镜和10.0倍物镜同时采集过表达实验中的mCherry和GFP图像。所有图像均使用以下参数：针孔尺寸设置为106.2μm;400 Hz 双向扫描，线平均为 2;488激光捕获GFP和594激光捕获mCherry，功率均为50%，增益为700，偏移为-0.2%。对于每个过表达实验，从总共3个独立分离株中分析4-10只动物。自定义python脚本用于定义动物的区域，然后解析出绿色和红色像素的位置和强度。我们考虑了最亮的 1，000 个绿色像素和最亮的 1，000 个红色像素，并计算了 Jaccard 指数。Jaccard 指数的理论最大值为 1，表示绿色和红色像素没有重叠。在我们的菌株中观察到的Jaccard指数最小值为~0.75，高于理论下限零，这是mCherry和GFP在同一组织中表达的结果。为了更直观地显示图像量化，我们将Jaccard指数转换为重叠分数。这是通过在Jaccard空间中执行0.75（更多重叠）到1.0（较少重叠）到-1.0（较少重叠）到1.0（更多重叠）的重叠分数的简单线性转换来完成的。参见S1图，了解代表各种重叠分数的动物图像。
免疫印迹
用OP50在NGM平板上繁殖动物直至新鲜饥饿，然后用1ml M9洗涤两次并在液氮中快速冷冻。将动物颗粒在1x SDS上样缓冲液（0.1M Tris-HCl，20%甘油，4%SDS，0.1M DTT，0.05%溴酚蓝）中于99C煮沸10分钟。将样品涡旋并旋转成颗粒动物并收集上清液。蛋白质通过Qubit定量，15ug蛋白质在4-20%的迷你蛋白（R）TGX无染蛋白凝胶（Bio-Rad）上运行。将蛋白质转移到低背景荧光PVDF膜（Millipore Sigma）上，并将膜封闭在1x TBST的5%脱脂牛奶中。抗HA抗体（Enzo Life Sciences 16B12）以1：2000稀释度检测HA标记的RPS-10蛋白。抗FLAG抗体（Millipore Sigma F1804）以1：1000稀释度用于检测FLAG标记的RPS-20蛋白。抗H3抗体（Millipore Sigma SAB4500352）以1：2000稀释度检测组蛋白H3蛋白。用1：15000 LI-COR山羊抗小鼠或LI-COR山羊抗兔（LI-COR）进行二抗染色。成像使用LI-COR奥德赛成像系统（LI-COR）完成，定量在ImageStudio中完成。
互信息计算
系统发育分析使用PANTHER HMM文库版本16.0在Ensembl Protists Genome（第51版）和MMETSP上结合MMETSP [52]进行。为了鉴定来自PANTHER亚科HMM的蛋白质同系物，我们使用以下参数使用了HMMER的hmmsearch函数 - noali - notextw-cpu 2。然后，我们解析了来自HMMER的每个输出文件，并确定每个生物体中存在（1）或不存在（0）的亚家族HMM。
简而言之，如果多个亚家族HMM与一个物种中的给定蛋白质匹配，则该蛋白质被分配到具有最高位得分的亚家族，而得分较低的亚家族将被忽略。<5%或>95%的物种具有同源物的亚科被丢弃;这些亚族表现出的变异太小，无法进行准确的互信息计算。同样，对<10%的亚科有命中的物种被丢弃;这些物种可能代表转录组覆盖率和/或组装不良。我们还计算了所有物种和丢弃物种之间的成对汉明距离，直到所有物种之间的成对汉明距离至少为0.1，以确保生物多样性。然后，离散变量的互信息计算为：sum（i = 0，1）;sum（j = 0，1） [-log_2（p_ij/（p_i*p_j））]。
互信息计算的阴性对照生成如下。对于给定的因子 A 和 B 对，我们将生物体中存在 B 的 （1） 和不存在 （0） 的二元向量随机化，以创建新的阴性对照因子。然后计算因子A和新创建的阴性对照之间的离散变量的互信息。
核糖核酸序列和分析
通过次氯酸盐处理同步动物，在16C下用OP50在NGM平板上繁殖，并在L4/年轻成虫期收获。用N50洗掉动物，通过N50中的5%蔗糖垫以除去E。大肠杆菌，并在液氮中冷冻。通过在冷冻PLB（20mM Tris pH8.0，140mM KCl，1.5mM MgCl 2，1%Triton）和100ug / mL环己酰胺存在下在液氮中冷却的研钵和研杵中研磨来裂解动物。将地面动物以冷冻粉末形式储存在-70°C。用曲唑提取总RNA，重悬于TE pH7.4中，并通过Qubit定量。使用定制C去除核糖体RNA。秀丽隐杆线虫特异性rRNA杂交寡核苷酸，类似于所述的涡虫方案[53]。该协议的寡核苷酸包含在 S1 表中。使用NEBNext Ultra II定向RNA文库制备试剂盒制备文库，用于Illumina测序。文库在Novogene Corporation Inc.加州大学戴维斯分校测序中心使用NovaSeq 6000测序，并在加州大学伯克利分校的Vincent J. Coates基因组测序实验室使用HiSeq 4000测序。
我们生成了一个自定义 C。秀丽隐杆线虫基因组（Ensembl，WBCel235）包含unc-54（rareArg）作为单独的染色体和掩蔽的内源性unc-54位点。使用STAR v2.5.4b[54]将读段映射到该基因组，包括注释的剪接连接，允许六个错配。所有下游分析仅限于唯一映射读取。
体外泛素结合
泛素结合试验基本上如[40]所述。简而言之，重组蛋白在E中被诱导。大肠杆菌与 1 mM IPTG 在 37C 下持续 4 小时。收获细胞并悬浮在1x PBS（137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na 2 HPO4和1.8mM KH2PO4）中，然后根据制造商的方案在xTractor缓冲液（Takara）中裂解。裂解物通过离心清除，并根据制造商的方案固定在TALON金属亲和树脂（Takara）上。用1x PBS洗涤固定化蛋白，并在4C下与含有各种GST融合构建体的澄清裂解物孵育过夜。结合的蛋白质用1x PBS和5mM咪唑洗涤四次，并在1x SDS上样缓冲液中加热至99C洗脱5分钟。洗脱蛋白在4–20%迷你蛋白多肽（R）TGX免染蛋白凝胶（Bio-Rad）上运行，并用考马斯亮蓝色染色。
支持信息
秀丽隐杆线虫菌株和寡核苷酸。
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一个 B C D E
1 秀丽隐杆线虫菌株
2 源 应变 基因型 应变结构 突变序列
3 1 WJA 0032 佩洛-1（CC2849）三世 1 1
4 1 WJA 0438 unc-54（cc4092; unc-54：：GFP：：T2A：：nonstop）I 1 1
5 1 WJA 0572 UNC-54（CC4092）I;佩洛-1（CC2849）三世 1 1
6 本研究 WJA 0730 hbs-1， srf0730; δ）I 由CRISPR/Cas9制造 ATCCTGGTATTCCATCATCATCGTATCATCCACCTCATATGTAGCTAAGTGAATCTTCTGAAGTCGATTTAACATCATTTCGCGCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCATCATCATCATCGTATCATCCCATCATCTAAGTGAATCATCCACCTCATGTAGCTAAGTGAATCTTCTGAAGTCGATTTACATCATTTCGCGCCCCCCC
7 本研究 WJA 0808 UNC-54（CC4092）I;诺努-1（SRF3015） 佩洛-1（SRF0808）三世 由CRISPR/Cas9制造 ACTTCATCTTTTGCAGATTCGTAGTTTTAATGGCGGAAGAGGCAGAGGATAGATCTATTTGAAAGACGCATTTATGCAGCATTTAATAGCACATGCAGCAGCAA
8 本研究 WJA 0825 RPS-10（SRF0825;K125R）I 由CRISPR/Cas9制造 GCTCAAGGCGAAGAGGGAGAGACCGTGAAGCCTACAGAACCGAGAgaGTCACCGAGGCTGGACCAGGAGGCCCCAGTCTACAG
9 本研究 WJA 0828 nonu-1（SRF0828;N 项 3xFLAG） 由CRISPR/Cas9制造 actcgttttatgaaaaaaagttttcagtgatcagccaacaATGTCAGATtatAAAgatCATgacGGAGATtatAAAgacCATgatATTGATtatAAAgatGACgatGATaagCCAagaAAGCATGAACAGTGTTTTAATTTCGATGCTGAGATATCGG
10 本研究 WJA 0829 nonu-1（SRF0829;N 项 3xFLAG） 由CRISPR/Cas9制造 actcgttttatgaaaaaaagttttcagtgatcagccaacaATGTCAGATtatAAAgatCATgacGGAGATtatAAAgacCATgatATTGATtatAAAgatGACgatGATaagCCAagaAAGCATGAACAGTGTTTTAATTTCGATGCTGAGATATCGG
11 本研究 WJA 1004 unc-54（srf1004; unc-54：：T2A：：FLAG：：rareArg12：：GFP）I 由CRISPR/Cas9制造 CAGATCGCCATCTCGCGCCCGTGCCTCTGACTTCGAAGGTCGaGGaTCTTTgTTAACaTGTGGTGATGTcGAAGAAAATCCaGGaCctGACTACAAAGACGATGACGACAAGcggcggaggcggaggaggcggcggaggcggcggaggaaccggtggAAAGGAGAAGAACTTTTCACTGGAGTTGTCCCAATTCTTGTTGAATTAGATGGTGATGTTAATGGGCACAAATTTTCTGTCAGTGGAGAGGGTGAAGGTGATGCAACATACGGAAAACTTACCCTTAAATTTATTTGCACTACTGGAAAACTACCTGTTCCATGGgtaagtttaaacatatatatactaactaaccctgattatttaaattttcagCCAACACTTGTCACTACTTTCTgTTATGGTGTTCAATGCTTcTCgAGATACCCAGATCATATGAAACgGCATGACTTTTTCAAGAGTGCCATGCCCGAAGGTTATGTACAGGAAAGAACTATATTTTTCAAAGATGACGGGAACTACAAGACACgtaagtttaaacagttcggtactaactaaccatacatatttaaattttcagGTGCTGAAGTCAAGTTTGAAGGTGATACCCTTGTTAATAGAATCGAGTTAAAAGGTATTGATTTTAAAGAAGATGGAAACATTCTTGGACACAAATTGGAATACAACTATAACTCACACAATGTATACATCATGGCAGACAAACAAAAGAATGGAATCAAAGTTgtaagtttaaacatgattttactaactaactaatctgatttaaattttcagAACTTCAAAATTAGACACAACATTGAAGATGGAAGCGTTCAACTAGCAGACCATTATCAACAAAATACTCCAATTGGCGATGGCCCTGTCCTTTTACCAGACAACCATTACCTGTCCACACAATCTGCCCTTTCGAAAGATCCCAACGAAAAGAGAGACCACATGGTCCTTCTTGAGTTTGTAACAGCTGCTGGGATTACACATGGCATGGATGAACTATACAAAGCCTCTGACTTCTAA
12 本研究 WJA 1016 UNC-54（SRF1004）I;ZNF-598（P255H）II 由EMS制造 ACATATACGAGAGATCAACTTCAAAGACATATGAGATCTGGAGATTTTGACGATAAAAGCTTTAAAGGTCATCATCAATGTCTCTTCTGTGAGCAGAAGTTCCTCGATGAAGAAAATCGTTATCGACATCTTAGGAAAGATCACTTTTTC
13 本研究 WJA 1017 UNC-54（SRF1004）I;ZNF-598（Q385*）II 由EMS制造 TTTCAGAGGACGAGGATTACGATCTAACGAGCCTCCTCCTCCGCCTGTTCCACGAGAAAGAATTGCGGTTGTGTAAAGACAAGTTGAAACGAATCCTCAAAGTGATCCGAGTCAATTTACAACTGTTCGATCCGCTCAAAGCAAGGGAGT
14 本研究 WJA 1018 UNC-54（SRF1004）I;ZNF-598（C183Y）II 由EMS制造 ATATGATATTCGCTTCAGTAACAAAATCGCTGGCACAAAATACGAAAAGTATCTGGCGCATGTGTACAAAATCTGCAAAACGTTAGTTGTTACAATTCTTTATAAATATTTAATTAAAAATTTGAATGTTTCAGTGACGATGGCGAGCGT
15 本研究 WJA 1019 UNC-54（SRF1004）I;ZNF-598（P255S）II 由EMS制造 GTCATATTTGTACTGACAATTTGAATTTATTTTCAAGAGAAAGAAAAACATATACGAGAGATCAACTTCAAAGACATATGAGATCTGGAGATTTTGACGATAAAAGCTTTAAAGGTCATTCTCAATGTCTCTTCTGTGAGCAGAAGTTCC
16 本研究 WJA 1022 UNC-54（CC4092）I;ZNF-598（SRF2119）II;诺努-1（SRF3015）III 通过交叉制造
17 本研究 WJA 1025 RPS-10（SRF1025;C 期 3xHA）I 由CRISPR/Cas9制造 AGTCTACAGAGCCGGATTCGGCCGTGGAGCCCCACCACCACAAagatctTATcctTACgatGTTccaGACtatGCTggaTACcctTATgatGTCccaGATtacGCAggaTCATATccaTACgatGTTccgGATtacGCATAAatgttattgtttttctaatgaaattgttacatcaaaa
18 本研究 WJA 1027 ZNF-598（SRF1027;C89A）二 由CRISPR/Cas9制造 agatatatgcaaatttaaaatttacagATTGGTTCCTGTCGTCATCCTGTCgctGCAGAATGTGTTATTCGAATGCGTATTCTTGGAAATT
19 本研究 WJA 1029 UNC-54（SRF1004）I;ZNF-598（SRF1027）II 通过交叉制造 不适用
20 本研究 WJA 1030 rps-10（srf1025）I;ZNF-598（SRF1027）II 通过交叉制造 不适用
21 中广电 WJA 1036 TRA-2（E1095）/DPY-10（E128） UNC-4（E120）II 从CGC获得，编号为CB2754 不适用
22 中广电 WJA 1037 rol-6（e187） unc-4（e120）/mnC1[dpy-10（e128） unc-52（e444） nIs190 let-？]第二;HIM-8（E1489）IV 从CGC获得，编号为AG226 不适用
23 本研究 WJA 1040 UNC-54（SRF1004）I;mnC1[dpy-10（e128） unc-52（e444） nls190 let-？/tra-2（e1095）II 通过交叉制造 不适用
24 本研究 WJA 1046 RPS-20（SRF1046;K6R/K9R）I;UNC-54（SRF1004）I 由CRISPR/Cas9制造 ttaccttttgtttttaataagttgcttttttccagGCTGTgGCcTTCAgaAATGAGAgaGCTATTACCGACAATTCGGAGCACCGCATCCGTCTGACCT
25 本研究 WJA 1049 UNC-54（SRF1004）I;rps-10（srf0825）I;ZNF-598（SRF2119）II 通过交叉制造 不适用
26 本研究 WJA 1054 UNC-54（SRF1004）I;rps-10（srf0825）I;诺努-1（SRF3015）III 通过交叉制造 不适用
27 本研究 WJA 1055 UNC-54（SRF1004）I;锰C1/特拉-2（e1095）II;猫-6（A741V）IV 由EMS制造 GTTCTACCGTATTCATCGAGCTCACCAGGCACATGTTCCACTAAAAATGCTCTTTTGGAAGGCCTTATAATACCACATTCACGAACCACTGAAAGGCCAGTAAGCAAATTATCGCCGGTAACCATGACTGTTCGAATGTTAGCTCTGTAA
28 本研究 WJA 1056 HBS-1（G200E）I;UNC-54（SRF1004）I;锰C1/钰-2（e1095）II 由EMS制造 ACACTTTCAAAGTTTCAATAACTTACATCATGAAGTAAATGACCCATGAGAGTACTTTTTTCTGCATCGACATGTCCAACGACAATCAAGTTAATTAAATCTTTATCAGCAACTCTTGGTTTTGGTGTTTTTCGGGCAACTGACGGAGCT
29 本研究 WJA 1057 UNC-54（SRF1004）I;锰C1/特拉-2（e1095）II;猫-6（W57*）IV 由EMS制造 ATATAAATATATTCGGCGGCTTCAAAAGTACACGGAACCATACGCATTTTGACATCCTATTTTTGTTTCCAGTGAAGAATTAATCGAAATATTCCAAGAGTCAGAACAGTGAGCGCATAGAACAAAATCTGAAATTTTTGTATTATTTAG
30 本研究 WJA 1060 UNC-54（SRF1004）I;锰C1/特拉-2（e1095）II;猫-6（K688*）IV 由EMS制造 TCACTGGTTTCACTCGGTTCTCCATTACAATGAGACCTAGCATCTCTAGATCACATTCCACCGCATCTTTTTAAACTTTTGAGGCTTTGTTAAAGTTCAAATCAAGAGGACGCCGGGCTACTGCAATAAGACGGAAGCCATGCTGAGCA
31 本研究 WJA 1061 UNC-54（SRF1004）I;锰C1/特拉-2（e1095）II;猫-6（G308R）IV 由EMS制造 ACCTTAAAATTTATTTTATTTCACATCTTTATTATATTGAATTTCTGACAAACCTTAGTAATAGGAACAGATTCTCTTGTGAGTACACTTTCATTGACAATCACCGTTCCATTCATCAGTACAGAATCACATTGCATCAAGCATCCATGT
32 本研究 WJA 1062 UNC-54（SRF1004）I;锰C1/特拉-2（e1095）II;猫-6（W566*）IV 由EMS制造 ATTGATGGTTGAACATTATCGAATCGTTGAGTTTCTTCTTCAATATCTCCTTCAATACCTTCTTCCATTGTTCATCCAGTTTTTTGGAACAATATTAAATCGAGTGGATCGCCGTGAAGGACTCCGTTGATTCTATAGAAACAAATATGA
33 本研究 WJA 1063 UNC-54（SRF1004）I;锰C1/特拉-2（e1095）II;诺努-1（M1I）三世 由EMS制造 AATTAAAATAATTGTGCGATGACCTTCGACAAGGCATTTTTGAATATCCGATATCTCAGCATCGAAATTAAAACACTGTTCATGCTTTCGTGGTGATATTGTTGGCTGATCACTGAAAACTTTTTTTCATAAAACGAGTGATAGATTTTT
34 本研究 WJA 1065 UNC-54（SRF1004）I;锰C1/特拉-2（e1095）II;诺努-1（W576*）三 由EMS制造 AAGTTTAACTGCTCCATCAACTGACATGTAATGTAAATCAAGAAATCATGGATTGTTGTGGGCTTCTCGAATTTTCCGATCAAGTTCTTTCACTTCCGATGATTTTTCAATTTTCATTCGTGACGCTCGATCGACAATTATCAATTGGCG
35 本研究 WJA 1066 UNC-54（SRF1004）I;锰C1/特拉-2（e1095）II;乌巴-1（E665K）IV 由EMS制造 TCTTCAACGTGCAAACAGGAATCTCCTTCTCTGGTGGATCGACAGACGACGAGTATGACTTCGTGAGATATGGATAAACAACTTGAGTGTTTCCTTTGGTTCCCATGGTTCCAGACTCCAGCAAAGGCAAGCGATAGTAGACGCATCGAC
36 本研究 WJA 1067 UNC-54（SRF1004）I;锰C1/特拉-2（e1095）II;乌巴-1（P679S）IV 由EMS制造 GTGCTGAATTTCATTGGGGAAGTTCTTCAACGTGCAAACAGAAATCTCCTTCTCTGGTGGATCGACAGACGACGAGTATGACTCCGTGAGATATGGATAAACAACTTGAGTGTTTCCTTTGGTTCCCATGGTTCCAGACTCCAGCAAAGG
37 本研究 WJA 1096 HBS-1（SRF0730）I;UNC-54（SRF1004）I;ZNF-598（SRF2119）II 通过交叉制造 不适用
38 本研究 WJA 1097 rps-10（srf0825）I;UNC-54（SRF1004）I;RPS-20（SRF1046）I 通过交叉制造 不适用
39 本研究 WJA 1098 HBS-1（SRF1098; Δ）I;RPS-10（SRF0825;K125R）I 由CRISPR/Cas9制造 ATCCTGGTATTCCATCATCATCGTATCATCCACCTCATATGTAGCTAAGTGAATCTTCTGAAGTCGATTTAACATCATTTCGCGCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCATCATCATCATCGTATCATCCCATCATCTAAGTGAATCATCCACCTCATGTAGCTAAGTGAATCTTCTGAAGTCGATTTACATCATTTCGCGCCCCCCC
40 本研究 WJA 1100 HBS-1（SRF1098）I;rps-10（srf0825）I;UNC-54（SRF1004）I 通过交叉制造 不适用
41 本研究 WJA 1170 HBS-1（SRF0730）I;UNC-54（SRF1004）I 通过交叉制造 不适用
42 中广电 WJA 1172 UBA-1（IT129;P1024S）IV 从CGC获得的RV110 不适用
43 本研究 WJA 1176 UNC-54（SRF1004）I;乌巴-1（IT129）IV 通过交叉制造 不适用
44 本研究 WJA 1190 RPS-20（SRF1190;C期3xFLAG）I 由CRISPR/Cas9制造 CATCGAGCCAGGAGTCGATATTGAGGTCACCAGAGCCGACtctgattacaaagacgacgatgacaagtccgactacaaggatgatgacgacaaatctgattataaagatgacgatgataagTAAgcaccttggtgcggctgcagacgggtatccggctcgacgttca
45 本研究 WJA 1192 RPS-20（SRF1192;C项3xFLAG，srf1047;K6R+K9R）I 由CRISPR/Cas9制造 CATCGAGCCAGGAGTCGATATTGAGGTCACCAGAGCCGACtctgattacaaagacgacgatgacaagtccgactacaaggatgatgacgacaaatctgattataaagatgacgatgataagTAAgcaccttggtgcggctgcagacgggtatccggctcgacgttca
46 本研究 WJA 1194 HBS-1（SRF1194;N项删除）I;UNC-54（SRF1004）I 由CRISPR/Cas9制造 ATGGACGACGATTATGACGACGATTACGACGATTATGAAGatAAGAATCTTAATAGTCGACCGAGTACACCACAAACGTCTA
47 本研究 WJA 1195 nonu-1（SRF1195;提示删除）III;UNC-54（SRF1004）I 由CRISPR/Cas9制造 GTCAATAAAGGATCACTGACAGAATCGACAACTTCATCCACATGCGTGAAGTTGAAACCGAAACCGACATGGAGTAAAAAGTTGCG
48 本研究 WJA 1196 RPS-10（SRF1196;C期3xHA，srf0825;K125R）I 由CRISPR/Cas9制造 AGTCTACAGAGCCGGATTCGGCCGTGGAGCCCCACCACCACAAagatctTATcctTACgatGTTccaGACtatGCTggaTACcctTATgatGTCccaGATtacGCAggaTCATATccaTACgatGTTccgGATtacGCATAAatgttattgtttttctaatgaaattgttacatcaaaa
49 本研究 WJA 1205 UNC-54（SRF1004）I;ZNF-598（SRF2119）II;srfEx1205[pJA786（myo-3：：mCherry：：T2A：：znf-598）|pJA698（rps-0：：hygR）|1kb ladder|pJA56（Cas9）] 由阵列制造 不适用
50 本研究 WJA 1206 UNC-54（SRF1004）I;ZNF-598（SRF2119）II;srfEx1206[pJA786（myo-3：：mCherry：：T2A：：znf-598）|pJA698（rps-0：：hygR）|1kb ladder|pJA56（Cas9）] 由阵列制造 不适用
秀丽隐杆线虫菌株寡核苷酸
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S1 表。 秀丽隐杆线虫菌株和寡核苷酸。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010577.s001
（三十）
S2 表。 所有图形的原始数值。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010577.s002
（三十）
S1 图 展示各种重叠分数的代表动物。
表达unc-54（rareArg）和mCherry标记阵列的代表动物的GFP和mCherry图像。以上是计算出的重叠分数。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010577.s003
（提夫）
S2 图 RPS-10和RPS-20泛素化位点在C中是保守的。秀丽隐杆线虫。
（A）H的成对序列比对。智人eS10和C。秀丽隐杆线虫RPS-10。K125 以绿色突出显示。守恒如图3A所示。（B） 如（A），显示H。智人 uS10 和 C.秀丽隐杆线虫RPS-20，K6 和 K9 以绿色突出显示。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010577.s004
（提夫）
S3 图 nonu-1 零突变体表现出与催化突变体相似的 NGD 抑制。
unc-54（rareArg）背景中指示菌株（n≥15只动物/菌株）的平均RFU（相对荧光单位）。一个标准偏差显示为误差线。来自韦尔奇 t 检验的 p 值，星号表示与野生型的所有比较的 p<0.01。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010577.s005
（提夫）
S4 图 已知的监视因子伙伴表现出高度的相互信息。
（A）HBS-1互信息图。90% 百分位截止值显示为虚线，PELO-1 以紫色突出显示。（B）如（A），以红色显示LTN-1与RQC-2的互信息。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010577.s006
（提夫）
S5 图 泛素结合试验显示高水平的背景结合。
His6 标记的 S 构造。酿酒Cue2 CUE 域，H.智人HBS1 N项结构域，H。智人HBS1 N项球状（三螺旋）结构域，H。智人HBS1 具有 G93D 突变的 N 端球状（三螺旋）结构域（在预测结合位点中发现 Gly）和 H。智人SMG5 PIN 域。将His6构建体固定在钴金属亲和树脂上并与E孵育。表达 GST-Ub 或 GST 的大肠杆菌裂解物。用树脂煮沸的蛋白质显示在考马斯染色凝胶上，并指示蛋白质。星号表示树脂上存在的非特异性肽。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010577.s007
（提夫）
S6 图 HBS-1和PELO-1在C的NGD期间表现出相似的表型。秀丽隐杆线虫。
unc-54（rareArg）背景中指示菌株（n≥15只动物/菌株）的平均RFU（相对荧光单位）。一个标准偏差显示为误差线。来自韦尔奇 t 检验的 p 值，星号表示与野生型的所有比较的 p<0.01。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010577.s008
（提夫）
确认
我们感谢Arribere实验室成员的深思熟虑的讨论。我们感谢UCSC生命科学显微镜中心的Benjamin Abrams提供技术支持（RRID：SCR_021135）。我们感谢Wormbase。
引用
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