依赖性脉络丛功能障碍 导致发育中的小鼠大脑中的短暂铜缺乏和代谢变化

克洛丽莎·华盛顿-休斯 ，舒布拉吉特·罗伊 ，赫拉纳·卡迈勒·塞内维拉特内，森蒂尔库马尔·卡鲁帕戈德，尤莱姆尼·莫雷尔，杰斯·琼斯，亚历克斯·扎克，肖彤，塔蒂亚娜·博罗妮娜，罗伯特·科尔，纳曼杰·克里斯托弗·张，泰德·道森，斯韦特兰娜·卢岑科

发布时间：2023 年 1 月 10 日

抽象

铜 （Cu） 在大脑发育、功能和新陈代谢中具有多方面的作用。两种同源的Cu转运蛋白Atp7a（Menkes病蛋白）和Atp7b（Wilson病蛋白）维持组织中的Cu稳态。Atp7a介导Cu进入大脑并激活Cu依赖性酶，而Atp7b的作用不太清楚。我们表明，在出生后发育过程中，Atp7b对于脉络丛（ChPl）的正常形态和功能是必需的。Atp7b的失活导致ChPl'细胞骨架和细胞间接触重组，顶膜Slc31a1丢失，微绒毛和纤毛的长度和数量减少。在缺乏Atp7b的ChPl中，Atp7a上调但仍在细胞内，这限制了Cu转运到大脑中并导致显着的Cu缺陷，这仅在老年动物中逆转。尽管多巴胺-β-羟化酶表达正常，但铜缺乏与腔规则位点 Atp7a 和儿茶酚胺失衡的下调有关。此外，脑脂质组有显着变化，这可以归因于抑制二酰基甘油酯到磷脂酰乙醇胺的转化。这些结果确定了Atp7b在大脑发育中的新作用，并确定了Cu螯合疗法可能加剧的代谢变化。

作者摘要

铜（Cu）在人脑的发育和功能中起着关键作用，Cu失衡与许多神经病理学有关。维持大脑Cu稳态的关键转运蛋白已被确定，但对Cu进入大脑的调节知之甚少。我们发现Cu转运蛋白Atp7b是小鼠剖腹后发育过程中Cu正常进入大脑所必需的。Atp7b功能的丧失导致脉络丛的形态变化，包括其细胞骨架的重塑，这会影响必需的Cu转运蛋白Atp7a和Slc31a。这导致Atp7a明显无法将Cu转运到脑脊液中，大脑中短暂的Cu缺陷以及相关的儿茶酚胺和脂质的不平衡。我们的研究结果有助于了解人类威尔逊病的神经病理学，这是由ATP7B失活突变引起的。

引文： 华盛顿-休斯 CL， 罗伊 S， 塞内维拉特内 HK， 卡鲁帕戈德 SS， 莫雷尔 Y， 琼斯 JW， 等. （2023） Atp7b 依赖性脉络丛功能障碍 导致发育中的小鼠大脑中的短暂铜缺乏和代谢变化。公共科学图书馆基因19（1）： e1010558. https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010558

编辑 器： Andrea Gropman，美国乔治华盛顿健康科学大学儿童国家医疗中心

收到： 七月 20， 2022;接受： 12月 7， 2022;发表： 1月 10， 2023

版权所有： ? 2023 华盛顿-休斯等人。这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。

数据可用性： 所有相关数据都在手稿及其支持信息文件中。

资金： 这项工作得到了NIH向SL授予R01 GM101502，NIH R01 GM103853和R01 AG064908授予NNB，NIH向CJC授予GM 79465的支持。质谱研究是在约翰霍普金斯大学质谱和蛋白质组学设施进行的，该设施由NIDDK的P30 DK089502和NCATS的UL1 TR003098资助支持。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。

竞争利益： 作者声明没有竞争利益。

介绍

铜（Cu）是一种过渡金属，可调节大脑代谢活动和信号传导[1]，Cu平衡的丧失对大脑发育和功能有许多负面影响。Cu由Cu转运蛋白ATP7A提供给大脑，ATP7A将Cu从脉络丛（ChPl）的上皮细胞输出到脑脊液（CSF）中-图1和[2]。Menkes病患者ATP7A失活会导致脑部Cu缺乏、多种代谢异常（包括儿茶酚胺失衡）、神经发育延迟和儿童早期死亡[3]。

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图1. 描绘了当前对脉络丛（ChPl）中铜（Cu）转运的理解的漫画。

两个同源的Cu转运蛋白Atp7a和Atp7b调节ChPl上皮细胞中的Cu转运。在基础条件和低Cu中，Atp7a和Atp7a主要具有细胞内定位，它们将Cu隔离到分泌途径区室的腔中。虚线箭头表示Atp7a在基础条件下输送到质膜并将Cu输出到CSF的能力。当铜升高时，Atp7a向顶膜重新定位并促进铜转运到脑脊液。Atp7b输送到基底外侧膜，将多余的Cu转移到循环中。这些活动是如何协调的尚不清楚。Ctr1 （Slc31a1） 位于上皮细胞的顶膜，将铜从脑脊液转运到上皮细胞中。Cu是否通过Ctr1或其他机制穿过基底外侧膜尚不清楚。

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WD是由Cu转运蛋白ATP7B突变引起的另一种Cu稳态疾病[4，5]。WD患者可表现为震颤、共济失调、吞咽困难[6-8]、5-羟色胺、DA、去甲肾上腺素代谢紊乱、抑郁和行为改变[7，9]。尽管近年来做出了重大努力并取得了一些进展，但ATP7B失活与这些病理之间的分子联系仍然知之甚少[10-13]。精神科WD可能被误诊为精神分裂症[14，15];神经系统WD的诊断和治疗延迟很常见，可能致命[16]。

这些挑战部分是由于对ATP7B在大脑中的作用的了解非常有限造成的。ATP7B在许多大脑区域表达，包括脉络丛[17]，腔规则位点[18]，小脑[19]等。ATP7B的一般功能是将Cu从细胞质转运到分泌途径的腔中，以掺入Cu依赖性酶中，并将多余的Cu隔离在囊泡中以进一步从细胞中输出（图1）。这种活性对细胞代谢的具体贡献取决于细胞类型，并且可能因组织而异[20]。因此，虽然ATP7B失活对脑代谢的负面影响从WD表现中很明显，但ATP7B失活破坏了哪些特定的细胞功能尚不清楚。

有充分的证据表明，ATP7B的失活与组织中Cu的时间依赖性积累有关 - 首先在肝脏中 - 然后是其他地方。在WD的动物模型中，如Atp7b小鼠和tx小鼠，Cu在出生后6-8周达到肝脏中的最高水平[21]。在大脑中，在10-16周时观察到初始Cu升高，随着动物年龄的增长，Cu水平继续升高[22-24]。据信，这种逐渐积累的Cu最终会导致病理发展[5]。然而，临床报告表明情况更为复杂。WD 患者可能会在其他身体和神经系统变化发生前数年出现急性精神病发作和其他行为改变;一项研究显示，近50%的神经系统WD患者在临床表现前MRI异常[25]。这些结果表明，发育中的大脑需要ATP7B功能，并且该功能的丧失可能会在临床症状出现之前破坏大脑代谢。-/-

在这里，我们在已建立的WD，Atp7b小鼠小鼠模型中测试了这一假设。我们发现，在出生后大脑成熟期间（出生后4周），Atp7b大脑出现了意想不到的显着Cu缺陷。我们提供的证据表明，铜缺乏源于铜进入大脑的失调，这反过来又影响脑实质中的特定代谢途径。我们发现脉络丛细胞骨架是Atp7b依赖性Cu失衡的重要靶标。综上所述，这些结果证明了Atp7b在出生后大脑成熟过程中的新作用，并提出了为什么在此期间的Cu螯合可能会产生负面结果。-/--/-

结果

出生后 4 周时 Atp7b 小鼠大脑中的铜水平较低-/-

Atp7b在中枢神经系统的各种细胞类型中表达（https://www.proteinatlas.org/ENSG00000123191-ATP7B/brain）;在一些神经元中，早在出生后2周就检测到ATP7B蛋白[19]。然而，Atp7b在大脑中的作用，特别是在大脑成熟期间，在很大程度上是未知的。为了更好地理解这一作用，我们首先确定了Atp7b失活如何影响出生后发育过程中的全脑Cu含量。在对照中分析Cu水平，Atp7b大脑在出生后4周（发育中的大脑）匀浆，并与出生后20周（成人）进行比较。正如预期的那样，与年龄匹配的对照组相比，20周Atp7b小鼠大脑中的Cu升高（图2A）。然而，在4周时，Atp7b大脑中的Cu水平显着低于对照动物（图2A）。这种差异不是由于对照动物中Cu水平的年龄依赖性变化，在4周和20周时相似。相反，在出生后发育过程中，Atp7b大脑表现出显着的Cu缺陷，随后是Cu积累。与对照组相比，受Cu水平影响的铁（Fe）含量在4周时也显示Atp7b小鼠减少（图2B）。Fe的降低不如Cu显著;在20周时，对照组和Atp7b大脑之间的Fe水平没有差异（图2B）。-/--/--/--/--/--/-

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图2.

Atp7b小鼠大脑在出生后4周时显示出组织特异性Cu缺陷（a）与年龄匹配的野生型对照相比，4周龄和20周龄Atp7b小鼠大脑中的Cu水平（4周龄组n = 8，20周龄组n = 4）。（b）与野生型相比，4周龄Atp7b小鼠的Fe水平也降低。在20周龄的Atp7b和野生型动物中未观察到Fe水平的显着差异。（c）与大脑不同，与年龄匹配的对照组（每组n = 3）相比，4周龄Atp7b小鼠中心脏，肾脏，脾脏和肝脏等组织中的Cu水平显着升高。使用不成对的双尾t检验分析数据。p ≤ 0.05被认为具有统计学意义。* p ≤ 0.05，** p ≤ 0.01，**** p ≤ 0.0001。（d）对照（A，B）和Atp7b（C，D）小鼠组织切片中Cu分布图。显示的图像是大脑的冠状部分，大约在Bregma -5.80mm处。A和C是来自组织的自动荧光。B和D是通过激光烧蚀电感耦合等离子体质谱（LA-ICP-MS）测量的Cu63浓度。比例尺为200μm。箭头指向脉络丛。V 代表 心室。比色比例尺表示铜浓度范围为 0 至 15 ppm。（e）对照小鼠（上图）和Atp7b小鼠（下图）的ChPL中Ctr1（红色），顶膜标志物NKCC1（绿色）和F-肌动蛋白（洋红色）的免疫染色。ChPl上皮细胞的顶膜用白色箭头表示。比例尺，10 μm。使用来自ImageJ软件的RGB轮廓图确认了Ctr1，NKCC1和F-肌动蛋白在顶端和基底外侧膜上的共定位。-/--/--/--/--/--/--/-

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Atp7b大脑中的Cu缺乏可能是由肝脏中膳食Cu的捕获引起的，Atp7b通常维持Cu稳态，因此Cu对其他器官的可用性较低。然而，对几个外周组织中的Cu含量的分析显示，除大脑外，所有Atp7b样品中的Cu都积累。因此，年轻大脑中的Cu缺陷是组织特异性的（图2C）。-/--/-

脑实质中的低铜也可能是室管膜细胞向脑脊液中铜外排增加的结果。然而，激光消融-ICPMS成像室管膜层的4千室在室管膜层中未显示较低的Cu水平。Cu信号的强度与对照细胞相同或可能更高，这与这些细胞中Cu的加速损失不一致（图2D）。

脑脊液中铜的水平也由高亲和力铜摄取转运蛋白Ctr1（SLC31A1）调节-图1。当脑脊液中Cu升高时，Ctr1将Cu从脑脊液转移到ChPl上皮细胞中，随后通过Atp7b输出[26]。ChPl 中 Ctr1 表达增加可能会将 Cu 分布从脑实质转向 ChPL;因此，我们比较了对照组和Atp7b小鼠ChPl中的Ctr1水平。在对照4周小鼠中，第四脑室ChPl中Ctr1的免疫染色显示上皮细胞顶膜的预期信号（脉络丛的极性与其他上皮细胞相反[27]。通过与顶端膜标志物NKCC1[28]（图2E和S1）共定位证实了这种靶向性（上皮细胞基底外侧的强信号似乎与基质/基质细胞有关，S1图，但需要进一步研究）。在Atp7b小鼠中，顶端Ctr1染色丢失（图2E），反对增强的Cu从大脑转移到ChPl作为脑Cu缺陷的原因。-/--/-

综上所述，结果表明，从ChPl进入Atp7b大脑的Cu减少是实质Cu缺乏的可能原因。-/-

铜转运机制在Atp7b小鼠脉络丛中失调-/-

为了验证这一假设，我们研究了脉络丛的Cu传输机制。在人类中，脉络丛（ChPl）在Cu进入发育中的大脑中起主要作用[29]。成年动物的ChPl上皮细胞表达两种ATP驱动的铜转运蛋白Atp7a和Atp7b[30]。Atp7a主要负责将Cu从ChPl转移到CSF（图1，[31]），而Atp7b被认为将多余的Cu返回循环[30]。我们发现两种转运蛋白在出生后4周均以正常的ChPl表达（图3A和3B），并测试了Atp7a下调是否可以解释Cu进入大脑的减少。然而，免疫染色显示Atp7b ChPl中的Atp7a表达没有降低;事实上，与年龄匹配的对照组相比，Atp7a信号更强（图3B）。因此，Atp7a可用于促进Cu输送到大脑。-/-

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图3. Atp7a在对照和Atp7b脉络丛中的表达和定位。-/-

（a） 说明铜在脉络丛上皮细胞（ChPE）中的运输示意图。Atp7b的失活导致Atp7a的表达增加，但水疱定位未改变。（b）Atp7b（左）和Atp7a（右）对Atp7b-/-和野生型（+/+）小鼠的ChPE进行免疫荧光染色。比例尺，10 μm。（c）对照组（上图）和Atp7b小鼠（下图）对ChPE的Atp7a（绿色）和Na，K ATP酶（红色）（顶端表面标志物）进行免疫荧光染色。比例尺，10 μm。（n = 3 对于每个基因型）。（d）使用彩色直方图工具（ImageJ）测量免疫染色的Atp7a（绿色）的荧光强度，并将其标准化为Na + / K + ATP酶（红色）的荧光强度。使用Graphpad Prism（9.4.0软件）中的Mann-whittney t检验分析数据。P 值;<0.0001。-/-

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为了使Atp7a将Cu运输到CSF，它必须输送到顶膜。预计Atp7b的失活会阻断Cu通过基底外侧膜的转运，增加胞质Cu并触发Atp7a向顶膜的转运[17]。然而，在Atp7b ChPl中，Atp7a的细胞内定位没有改变：在任何一个基因型中，它主要是囊泡的（图3B）。与质膜标志物Na，K-ATPase共染色未发现顶膜处Atp7a的显着富集（图3C）。Atp7a的细胞内而不是顶端定位表明Atp7a运输可能受到损害，限制了Cu外排进入脑脊液。我们试图直接测量脑脊液中的铜水平，但动物体积小，很难获得足够的脑脊液;在我们能够分析的一对年龄匹配的小鼠中，Atp7b动物的脑脊液水平较低。-/--/-

缺乏 Atp7b 的 ChPl 改变了形态，微绒毛和纤毛的数量减少了

为了确定 ChPl 功能异常的潜在原因，我们更详细地检查了 ChPl。首先，我们注意到与对照小鼠相比，Atp7b ChPl精细形态的变化（图4A）。膜突起，微绒毛和纤毛，是ChPl的重要形态特征，因为它们增加了运输面积并促进脑脊液运动;在Atp7b ChPl中，这些突起的数量和长度大大减少（图4B）。-/--/-

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图4. Atp7b小鼠ChPl中顶端微绒毛和纤毛细胞的变化。-/-

（a）来自Atp7b-/-的矢状切片的H&E染色，以及显示第4脑室脉络丛的对照小鼠大脑。比例尺;200 μm（前两个面板）。比例尺;10 μm（最后三个面板）。箭头表示 ChPE 细胞顶端表面的微绒毛和睫状结构。（b）与WT小鼠相比，Atp7b小鼠中ChPE细胞的微绒毛长度显着减少;n = 3。使用ImageJ分析明场图像，并使用未配对的双尾t检验进行评估。p ≤ 0.05被认为具有统计学意义。p ≤ 0.001。（c）对来自Atp7b -/-和野生型（+/+）小鼠的ChPE细胞上的非肌肉肌球蛋白Myh10（绿色）进行免疫荧光染色。比例尺;20微米。（d）ChPl细胞的透射电子显微照片（TEM）显示，与野生型小鼠相比，4周龄Atp7b小鼠的顶端微绒毛改变。脉络丛上皮细胞的低（6000 X）和高（20000 X）放大显示细长的健康顶端微绒毛（左图），而在Atp7b中，顶端微绒毛和睫状结构退化和杂乱无章（用箭头标记）（右图）。（e）在Atp7b和野生型（+/+）小鼠的ChPE细胞上用乙酰化微管蛋白（绿色）和基底体标志物?微管蛋白（红色）对纤毛进行免疫荧光染色。比例尺;20微米。纤毛结构在放大图像中用箭头标记。（f）来自Atp7b-/-和野生型（+/+）小鼠的ChPE细胞上的睫状膜标志物Arl13b（绿色）和基底体标志物?微管蛋白（红色）的免疫荧光染色。比例尺;10微米。（g）与野生型相比，4周龄Atp7b-/-小鼠的脉络丛中纤毛上皮细胞的百分比降低。数据表示为标准±平均值*P < 0.001（韦尔奇校正 t 检验）。n = 3。-/--/--/--/-

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在上皮细胞中，膜突起的维持取决于肌球蛋白，肌球蛋白调节肌动蛋白束的动力学[32]。已知参与丝状伪足形成和细胞粘附的肌球蛋白10的免疫染色[33]显示其细胞内分布的显着变化。在对照ChPl细胞中，肌球蛋白10均匀地集中在质膜附近，而在Atp7b ChPl中，肌球蛋白模式杂乱无章，顶膜染色较弱，基底外侧膜染色较强（图4C）。透射电子显微镜（TEM）证实了Atp7b ChPl上皮中微绒毛的紊乱（图4D）。为了确定Cu不平衡是否会改变纤毛的丰度，我们对乙酰化微管蛋白进行了免疫染色（图4E），结果显示Atp7b ChPl中的纤毛较少（图4E）;使用纤毛特异性标记 Arl13b（图 4F、4G 和 S2-/--/--/-)

Atp7b ChPl的形态变化与细胞骨架的显着重塑有关-/-

为了更好地了解这些变化的分子基础，我们比较了对照组和Atp7b小鼠中的ChPl蛋白质组。为了进行定量比较，从4周大的对照和Atp7b脑切片中激光解剖ChPl的相同区域，并在TMT标记后通过质谱分析蛋白质谱。PCI图显示对照和Atp7b ChPl蛋白质组的明显分离，表明Atp7b依赖性变化可重复（图5A）。在所有样品中常见的995种蛋白质中，大多数蛋白质具有相似的丰度或显示出统计学上无显着变化（图5B）;68种蛋白质表现出显著变化（倍数变化>1.3，p值<0.1）。后一种蛋白质调节细胞间接触和细胞粘附、线粒体功能、RNA加工和离子平衡（S1表）。改变最显著的蛋白质（p值<0.05）——全部——是细胞骨架蛋白和参与细胞间接触的蛋白质。粘连激酶、肌球蛋白11、维门汀、连接平台蛋白、紧密连接蛋白2、凝集素、联盟蛋白和他林1的丰度增加了1.3-2.5倍（图5B）。相比之下，肌动蛋白、钩微管栓系蛋白、连接中间丝的蛋白表斑蛋白和肌球蛋白 9 与重神经丝蛋白和轻神经丝蛋白一起显着下调（图 5B 和 S1 表）。-/--/--/-

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图5. ChPl蛋白质组识别Atp7b小鼠的细胞骨架变化。-/-

（a） PCI 图显示 ChPl 蛋白质组与 4 周龄 Atp7b 和对照组的明显分离（每种基因型 n = 4。火山图说明了蛋白质分布。显著上调和下调（|倍变化| ≥1.3，x 轴;p 值≤0.05，y 轴）分别以桃色和绿色突出显示。（b） 显示从质谱研究中鉴定的 Atp7b ChPl 中显着上调和下调蛋白质的表格。（c）来自Atp7b -/-（下）和野生型（+/+）（上）小鼠的ChPE细胞上的粘性粘附激酶（绿色）的免疫荧光染色。比例尺;20微米。（左图和中图）;比例尺;10 μm（右图） （d） 使用 ImageJ 软件从 4 周龄野生型和 Atp7b-/- ChPl 的共聚焦图像测量焦点粘附激酶 （FAK）（绿色）的总荧光强度，并归一化为 F-肌动蛋白（洋红色）的荧光强度。使用双尾不配对t检验和Graphpad Prism（9.4.0软件）中的Welch校正对数据进行分析。*P 值;<0.05.（e）对来自Atp7b-/-（下）和野生型（+/+）（上）小鼠的ChPE细胞上的vimentin（白色）和F-肌动蛋白（洋红色）进行免疫荧光染色。比例尺;10微米。-/--/-

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为了验证质谱分析的结果，我们对局灶粘附激酶（FAK）和III型中间丝vimentin进行了免疫染色，这两种成分在Atp7b蛋白质组中含量更高。与年龄匹配的对照相比，FAK的免疫染色在Atp7b ChPl中显示出更强的信号，证实了蛋白质组学的发现（图5C，5D和S3）。模式vimentin响应于Atp7b失活而显着改变。Atp7b细胞具有明亮染色的vimentin聚集体，与野生型ChPl中的细丝状结构形成鲜明对比（图5E）。Vimentin的丰度很难比较，因为它的细胞内分布存在差异。综上所述，这些结果表明，Atp7b的丢失与ChPl细胞骨架和参与细胞 - 细胞接触的蛋白质机制的显着重塑有关。细胞骨架的变化以及参与膜蛋白系留和囊泡运输的蛋白质的下调可能导致Atp7a无法运输到顶膜。-/--/--/-

脑实质中的Cu缺乏不影响胸径表达

为了确定脑实质中的ChPl紊乱和较低的Cu含量是否对大脑产生代谢后果，我们检查了去甲肾上腺素（NE）生物合成的状态，这是一个Cu依赖性过程。该过程的限制步骤是将多巴胺（DA）转化为NE;此步骤由Cu依赖性酶多巴胺-β-羟化酶（DBH）介导[34]。鉴于Cu缺乏可能导致神经元死亡[35]，我们首先检查了DBH阳性（去甲肾上腺素能）神经元的数量。胸径在脑中NE生物合成的主要部位腔规则位点[10]中高度表达[36]，胸径免疫染色可用于鉴定组织切片中的LC（图6A）。Atp7b切片的胸径阳性区域似乎扩大（图6A）。因此，为了确保比较WT和Atp7b大脑之间的等效LC区域，从第四心室完全闭合开始300微米开始进行连续切片。每个切片以10微米的厚度收集，每5-/--/-千切片染色胸径。对第四脑室两侧的胸径阳性细胞进行定量（S4图）。具有最大胸径阳性细胞数的切片用于进一步分析。

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图6.

Atp7b的失活不会降低小鼠大脑中的DBH表达（a）胸径免疫荧光染色显示小鼠脑组织冠状切片腔规则（LC）位点区域的富集胸径阳性细胞（DBH+）。比例尺，20 μm。分别比较Atp7b-/-和WT（+/+）小鼠在LC左侧（LS）和右侧（RS）中DBH+细胞占据的（b）数量和（c）面积。比较Atp7b-/-和WT小鼠的（d）DBH+细胞总数和LC区细胞占据的（e）面积。使用不成对的双尾t检验分析数据。p ≤ 0.05被认为具有统计学意义。（f）使用蛋白质印迹比较Atp7b和WT（+/+）小鼠大脑之间的胸径蛋白（70 kDa）表达。家务基因GAPDH的表达被认为是负荷对照。（g）与Atp7b-/-和WT小鼠之间相应的GAPDH条带相比，胸径条带的密度分析。（n = 4）这些值表示SD的平均值±，一式三份。p ≤ 0.05被认为具有统计学意义。使用GraphPad Prism 9软件进行数据分析。-/-

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与对照组相比，分别计数左侧或右侧LC的胸径阳性细胞对Atp7b LC的细胞数略高，尽管差异没有达到统计学意义（图6B）。DBH阳性细胞在Atp7b样品中的密度似乎也较低，并且占据了更大的区域（图6C）。当合并两个LC区域中的细胞数量时，与对照组相比，Atp7b LC中的DBH阳性细胞数量以及这些细胞占据的面积显着更高（图6D和6E）。Atp7b和对照脑部分的胸径信号强度相似。全脑裂解物的蛋白质印迹分析也发现胸径蛋白水平没有降低（图6F）。事实上，当标准化为GAPDH时，在Atp7b大脑中检测到胸径蛋白丰度的小幅但统计学显着增加（图6G）。因此，发育中的大脑中DBH阳性神经元的数量和DBH表达都不会受到Atp7b失活和Cu缺陷的负面影响。-/--/--/--/--/-

Atp7a，多巴胺（DA）和去甲肾上腺素（NE）水平在4周龄Atp7b小鼠的腔规则位点中较低-/-

Cu递送至胸径由Atp7a介导，而Atp7b将Cu螯合到囊泡中以缓冲胞质Cu（图7A）[18]。Atp7a功能的丧失会降低NE生物合成并破坏LC功能[37]。对照组织切片的免疫染色显示，Atp7a和Atp7b在出生后4周均在LC神经元中表达（图7B），尽管其水平较低且不均匀于成人大脑（S2图）。与对照LC相比，4周龄的Atp7b LC的Atp7a丰度显着降低（图7B）。因此，除了脑实质中整体低铜水平外，通过Atp7a蛋白将Cu递送到DBH的主要途径在Atp7b小鼠中受到损害。这些结果表明，Atp7b LC的NE产生受损。为了验证这一假设，DA和NE在对照和Atp7b脑组织切片中衍生化，并使用基质辅助激光解吸/电离质谱（MALDI-MSI）成像;通过碰撞诱导的解离证实了切片中衍生化DA和NE的身份（S4图）-/--/--/--/-)

DA和NE的MALDI-MS成像显示，与对照组相比，Atp7b大脑中的儿茶酚胺水平存在显着差异（图7C）。信号密度，以确定为包含信号的像素与总面积的比率，在Atp7b切片中显着降低 - 对于DA和NE。 在含LC区域内更具体地定量DA和NE信号（图7C;虚线白框）发现，与对照小鼠相比，Atp7b小鼠的DA信号减少了2.5倍，NE信号减少了80%（图7D).为了验证儿茶酚胺水平的这些变化，特别是NE的降低，解剖了脑干区域（LC所在的大脑部分），并通过HPLC_ECD测量儿茶酚胺水平（图7E）。与与成像数据一致的对照相比，Atp7b样品中的NE水平较低。多巴胺代谢物DOPAC也较低，反映了Atp7b样品中DA水平的降低（图7E-/--/--/--/--/-)

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图 7. 多巴胺（DA）和去甲肾上腺素（NE）在4周龄Atp7b -/-小鼠中减少。

（一）示意图显示了多巴胺β羟化酶（DBH）在DA到NE转化中的作用。铜转运蛋白Atp7a将Cu递送至胸径，而Atp7b缓冲胞质Cu.（b）免疫荧光染色显示Atp7b（红色）在对照位点腔规则（LC）的胸径阳性神经元中表达。在Atp7b-/-小鼠的组织中未检测到Atp7b染色。Atp7a（红色）在对照小鼠的LC中表达，并在年龄匹配的Atp7b-/- LC中下调。（三）比较Atp7b -/-（n = 9）和野生型（+/+）小鼠（n = 8）在含LC区域的DA和NE信号。（d） NE和DA的信号密度确定为包含像素的信号与总面积之间的比率。使用不成对的双尾t检验分析数据。p ≤ 0.05被认为具有统计学意义。（e） 使用HPLC测量脑干匀浆中NE和DA代谢物3，4-二羟基苯乙酸（DOPAC）水平。p ≤ 0.05被认为具有统计学意义。（f）比较Atp7b-/-和野生型（+/+）小鼠之间黑质（SNc）和（g）纹状体（Str）的DA和NE水平。DA，NE和DOPAC的所有值均归一化为总蛋白。M， 男;F，女。使用GraphPad Prism 9软件进行数据分析。

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与脑干相反，在黑质区域未发现DA和NE水平的统计学显着差异（图7F）。DA周转率略有升高，但这种差异没有统计学意义（S5A-S5C图）。在纹状体中，与对照组相比，雄性ko的DA平均水平较低，而NE水平的变化无统计学意义（图7G）。在对照动物中观察到性别特异性差异：对照雄性在黑质和纹状体中具有最高的DA水平（图7G）。与男性相比，对照女性黑质的DA和NE水平均较低。相比之下，在Atp7b黑质（SNc）中没有看到DA或NE的性别依赖性差异（图7F）。综上所述，这些数据表明儿茶酚胺生物合成在4周时在Atp7b脑中发生改变，特别是在LC /脑干区域。-/--/-

Atp7b失活导致脑脂质组发生特异性变化

鉴于Atp7b中ChPl形态的变化表明上皮表面减少，我们测试了Atp7b大脑中其他不直接依赖于Cu的代谢过程（如脂质代谢）是否受到影响。从全脑中提取脂质，并通过液相色谱与高分辨率质谱（HRMS）耦合进行分析。数据集的偏最小二乘判别分析（PLS-DA）显示基因型（即对照组和Atp7b）内样本紧密聚类，基因型之间存在显着差异，表明脂质组响应Atp7b失活而发生变化（图8A）。前25种最显着差异脂质的热图显示对照组和Atp7b小鼠的脂质谱呈负相关（图8B），这表明脂质合成中潜在的前体 - 产物关系。为了验证这一假设，我们使用火山图确定了变化最显着的脂质（图8C）。与年龄匹配的对照小鼠相比，Atp7b大脑中的磷脂酰乙醇胺（PE）水平显着降低，而PE的前体二酰基甘油DG 18：0_20：4水平升高（图8C）。乙醇胺磷酸转移酶1（EPT1）是高尔基体定位的酶，对DG 18：0_20：4具有底物特异性，可将其转化为PE[38]。底物的积累和产物的减少表明，发育中的Atp7b脑中的EPT1活性降低。-/--/--/--/--/--/-

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图8.

出生后 4 周 Atp7b-/- 脑脂质谱的变化与对照组相比 （a） 偏最小二乘判别分析 （PLS-DA） 图比较正离子模式下 LC-MS/MS 下的 WT（绿色）和 KO（红色）;R2 = 0.99，Q2 = 0.48。每个点代表来自单个动物的数据集。95% 置信区间由每组周围的椭圆阴影区域表示。数据被求和归一化、对数变换和均值居中。（b） 热图显示正离子模式下基于 t 检验、欧氏距离和病房聚类的前 25 个差异丰度特征 LC-MS/MS。 （C） 火山图突出显示在比较 WT 与 KO 时 p < 0.05（绿色）、p < 0.01（蓝色）和 p < 0.001（红色）的特征。指示选定的脂质。x 轴为 log2 （FC）（FC = 倍数变化），y 轴为 log10（p）（p = 基于 t 检验的 p 值）。Acar = 酰基肉碱，DG = 二酰基甘油，PC = 甘油磷酸胆碱，SM = 鞘磷脂。使用代谢分析师生成的 A-C 中的绘图;n = 6 表示 WT，n = 4 表示 KO。

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总之，在出生后大脑发育过程中，Atp7b的失活导致血-脑脊液屏障和脑实质的显着变化，包括儿茶酚胺水平的区域特异性改变，脂质代谢失调以及ChPl中细胞骨架的重塑。这些变化早在Cu积累之前就发生了，反映了Atp7b在出生后大脑发育过程中细胞内和细胞间Cu分布中的重要作用。

讨论

脉络丛在维持脑脊液离子平衡和向脑实质输送微量营养素方面起着核心作用。在这里，我们证明了Atp7b依赖性Cu稳态对ChPL形态和功能的重要性。Atp7b失活对大脑发育过程中ChPL和脑实质的多方面影响为肝豆状核变性（WD）发病机制提供了新的见解。在WD中，Cu在肝脏中的积累最多，可引起线粒体功能改变、核受体信号失调、炎症反应和其他病变[5]。Cu在大脑中的积累发生较晚，此时肝脏积累Cu的能力饱和[22，24]。人们认为大脑的代谢变化是由WD进展后期坏死肝脏释放的过量Cu引发的[5]。在这里，我们表明，在Atp7b小鼠中，大脑代谢早在出生后4周就失调，这些变化是由短暂的Cu缺乏引起的，后来才被Cu积累所取代。脑实质中的短暂性铜缺陷与 ChPL 中 Atp7a 的上调和 ChPl 上皮细胞顶膜 Ctr1 的下调有关。这些变化可能代表旨在增加/保留脑铜含量的保护性反应。值得注意的是，失调的代谢途径涉及直接需要Cu（NE生物合成）的途径以及间接受组织Cu含量（脂质代谢）影响的途径。人们很容易推测，影响这些重要途径的代谢变化或环境压力可能会加速WD神经病理学的发展。 过量的铜螯合可能是这种压力源之一。-/-

鉴于Atp7a主要负责Cu进入大脑，并且Atp7a的表达在Atp7b ChPl中没有降低，在脑实质中观察到的Cu缺陷似乎令人惊讶。这种铜缺乏症的起源可能是双重的。尽管年轻Atp7b小鼠的血清中可交换的Cu没有降低[39]，并且脑以外的器官积累了Cu（图1），但我们不能排除在年轻小鼠中较少的Cu在基底外侧进入ChPl。在人类中，Ctr1功能障碍会导致大脑中明显的Cu缺陷，并且有人提出Ctr1通过基底外侧膜将Cu转移到ChPl中[40]。我们的数据既不支持也不反驳这种模式。在4周龄小鼠中，上皮细胞基底外侧的Ctr1信号与基质而不是质膜的染色更一致，但需要进一步的研究来确定Ctr1是否靶向并在基底外侧膜起作用。同样，我们的 LA-ICP-MS 测量的分辨率和灵敏度不足以准确确定 ChPL 中的铜含量，需要进一步的高分辨率研究。事实上，在20周时，当Atp7b肝脏摄入较少的Cu[41，42]时，更多的Cu可供大脑使用，Cu开始在Atp7b脑组织中积聚。-/--/--/--/-

另一个可能限制铜进入大脑的因素是细胞骨架元件的显着重组，这可能会影响蛋白质向质膜的运输。在肠道中观察到相关现象，其中Atp7b下调导致肠道总Cu含量降低，蛋白质运输异常和铁外排中断[43]。在肠道和ChPl中，Atp7a的表达不会受到损害，相反，蛋白质运输和递送到质膜的途径失调。在肠道中，细胞内Cu失衡改变了ApoB和乳糜微粒组装的运输[43];在 ChPL 中，细胞骨架发生了显着的重塑，这会影响纤毛的数量和长度，并可能影响 Atp7a 到达质膜的能力，尽管这仍有待正式测试。有趣的是，小鼠Atp7b失活会影响神经丝的丰度，因为最近的临床研究发现血清神经丝轻链是神经系统WD的生物标志物[44]。需要进一步的研究来更好地了解人类WD和WD模型中ChPl，轴突健康和血清神经丝中的细胞骨架变化之间的关系。

另一个有趣的问题是细胞骨架或其他铜依赖性过程的变化是否是纤毛数量减少的原因。肽基-α-单加氧酶（PAM）是一种重要的Cu依赖性酶，是活动纤毛和初级纤毛正常组装所必需的[45]。PAM在ChPl中表达[46]，其表达减少与活动纤毛密度降低有关[45]。细胞骨架的变化也可能改变PAM和含神经肽的外泌体的释放[47]，进一步改变信号传导事件。

WD患者和WD动物模型报道了儿茶酚胺平衡的变化[48-50]。这些研究显示，DA和NE水平的具体变化因年龄和大脑区域而异[48]。我们的结果与这些观察结果一致。与大鼠一样，我们看到在Cu积累之前NE降低。Atp7b失活导致脑干LC区域的DA和NE水平降低，而在脑的其他区域NE水平没有显着影响，DA水平变化较小。与其他区域相比，LC（去甲肾上腺素能神经元的体所在的位置）中Atp7a的低丰度可能解释了对NE含量的更强的负面影响。Atp7a是否从细胞体重新分布到神经元投影以维持局部胸径运动活性和NE合成仍有待测试。Fe的一些降低可能导致DA缺陷，因为酪氨酸转化为DOPA（多巴胺的前体）是由Fe依赖性酪氨酸羟化酶介导的，但是在疾病后期，Fe水平正常化（至少在大脑中），并且影响多巴胺能神经元的其他机制必须发挥作用。

血脂代谢失调是针对Cu超负荷[51-54]或Menkes病中观察到的Cu缺乏[55]。我们的数据表明，Atp7b活性是发育中的小鼠大脑中磷脂酰乙醇胺形成所必需的。低水平的磷脂酰乙醇胺表明PC甲基化程度低，形成PE。需要进一步的研究来确定抑制甘油二酯向磷脂酰乙醇胺的转化是否可能是由甲基供体可用性的变化引起的，正如另一种WD模型（tx小鼠）中报道的肝脏[56，57]）。

总之，我们的结果说明了Atp7b在大脑成熟过程中以前未被重视的作用，并表明WD发病机制比组织对Cu超负荷的反应更复杂。在小鼠中，大脑的功能成熟在出生后35-50天内完成，髓鞘形成和前额叶皮层神经网络特化的高峰出现在出生后3-4周[58]。在人类中，类似的大脑成熟是在出生后12-18年实现的。小鼠和大多数小儿WD患者缺乏明显的神经系统症状，导致假设ATP7B失活在Cu超负荷之前不会影响大脑代谢。

我们的研究结果表明，当大脑中的总铜暂时低或尚未改变时，可能会发生显着的代谢变化。我们的数据还表明，Cu螯合的副作用（如神经系统恶化和胃肠道不适）可能是由治疗期间局部/短暂性Cu缺陷的组织特异性恶化引起的。

材料和方法

道德声明

所有动物实验均按照约翰霍普金斯大学机构动物护理和使用委员会批准的协议（M017M385）进行。

小鼠饲养和组织收集

C57BL/6J小鼠和B6;129S1-ATP7btm1Tcg本研究使用C57BL/6J背景上的/LtsnkJ（Atp7b）小鼠[59]。这些染色将在整个手稿中分别称为对照和Atp7b小鼠（敲除）。小鼠被安置在约翰霍普金斯医学院动物设施;实验按照约翰霍普金斯大学机构动物护理和使用委员会批准的协议（M017M385）进行。在出生后4周或20周，对小鼠实施安乐死，用磷酸盐缓冲盐水（PBS）灌注，然后用4%多聚甲醛（PFA）溶液灌注2分钟。提取全脑并在4°C下储存在4%PFA溶液中过夜。 然后，将大脑转移到4°C的30%蔗糖溶液中过夜，嵌入Tissue-Tek OCT冷冻培养基中，并储存在-80°C进行冷冻切片。或者，在PBS灌注后，使用干冰冷冻整个大脑。-/--/-

对于金属分析，脑部灌注磷酸盐缓冲盐水（PBS），然后如上所述注入4%多聚甲醛（PFA）溶液。使用全脑（图1A上图）以及肝脏，肾脏，脾脏和心脏（图1B）测量金属水平。称量的样品在硝酸中消解，并通过原子吸收光谱法（Perkin Elmer Pinnacle 900T）进行分析。对金属含量进行定量并除以组织重量。

冷冻切片和切片选择

将OCT冷冻的大脑从-80°C取出，平衡至-20°C，并使用徕卡低温恒温器CM 3050S从脑干切向前额叶皮层。将十微米的冠状面和矢状面切片放置在Superfrost Plus显微镜载玻片上（Thermo：货号12-550-15），每张载玻片两个切片。每五张载玻片使用抗兔多巴胺-β-羟化酶（DBH）一抗（由Betty Eipper博士提供）或抗兔酪氨酸羟化酶（Millipore;猫。不。AB152），如下所述，并使用蔡司LSM800共聚焦显微镜对免疫荧光进行成像。将图像导入ImageJ，并对DBH阳性细胞和这些细胞占据的面积进行量化。这些值是使用GraphPad Prism版本5软件绘制的。使用具有最多胸径阳性细胞的切片进行进一步分析。

组织切片的免疫组织化学

从– 80°C取出脑切片，并用1X PBS洗涤以去除残留的OCT培养基。将一抗稀释在含有0.5%BSA（牛白蛋白血清，密理博;中国科学院。编号 9048-46-8）， 0.1% 吐温-20 （西格玛奥德里奇;中国科学院。编号9005-64-5）和0.5%的Triton X-100（西格玛奥德里奇;中国科学院。编号9002-93-1）。加入1：1000稀释度的胸径一抗，在室温或4°C下孵育1小时过夜。然后将脑切片在1X PBS中洗涤三次，持续5分钟。山羊抗兔亚历克萨福陆488（Invitrogen;猫。不。A-11008）或Alexa Fluor 555（Invitrogen;猫。不。A-21434）稀释到含有0.5%BSA和0.1%吐温-20的1X PBS中。在室温下以1：1000的比例加入二抗3小时。然后将脑组织切片在1X PBS中洗涤三次5分钟。带有DAPI（电子显微镜科学17984-24）的氟卡口-G用于将24 x 50 mm盖玻片安装到显微镜载玻片上。将载玻片在黑暗中放置一小时，然后使用蔡司LSM800或奥林巴斯FV3000RS显微镜成像。抗ATP7A和抗ATP7B一抗购自圣克鲁斯（分别为SC-376467和SC-373964）。抗NKCC1抗体购自Cell Signalling（D208R XP; 85403）。抗Arl13b、抗γ微管蛋白和抗乙酰化微管蛋白抗体分别从Proteintech（17711-1-AP）、Milllipore-Sigma（T6557）和Cell Signalling（D20G3 XP; 5335）从抗局灶性粘附激酶（FAK）购买，抗Vimentin抗体分别从Invitrogen（MA5-15588）和Abcam（ab92547）购买。肌球蛋白重链10（MYH10）一抗购自Invitrogen（货号。MA5-27767）。F-肌动蛋白用鬼笔环肽AlexaFluor 647（Invitrogen，A22287）染色。所有抗体均按照上述程序使用。

透射电子显微镜

从4周龄Atp7b和野生型小鼠的脑室中新鲜分离ChPl组织，并通过浸入EM级2%多聚甲醛1%戊二醛100mM磷酸盐缓冲液（Sorenson's）和3mM氯化镁pH 7.2在4°C下固定。 所有后续步骤均在4°C下完成，直到70%乙醇脱水。在不超过2毫米的固定剂中仔细解剖组织-/-3.在含有3%蔗糖的缓冲液中冲洗样品（3 X 15分钟）。在含有3mM氯化镁的1.5%亚铁氰化钾还原1%四氧化锇的100mM磷酸盐缓冲液中在4°C下进行渗透2小时。 在含有3%蔗糖的100mM马来酸盐缓冲液（3 X 5分钟）中冲洗组织，然后在同一缓冲液中用2%过滤的乙酸铀酰染色1小时。将样品脱水至100%乙醇。

使用环氧丙烷（2 X 5 min）作为过渡溶剂，组织包埋用 eponate 12（Ted Pella，Redding CA），最后在 60°C 烘箱中固化 2 天，然后使用金刚石切片机切片至 60 nm。使用在80.0 kV下运行的日立7600透射电子显微镜收集EM图像。图像以6，000至20，000×直接放大倍率采集，分别对应于0.010744μm/像素至0.003223μm/像素。

衍生化、基质应用和 MALDI 质谱成像 （MSI）

MALDI基质，α-氰基-4-羟基肉桂酸（CHCA）从Millipore Sigma（美国）获得。除非另有说明，否则所有溶剂均购自费希尔科学（美国），并且均为试剂或高效液相色谱（HPLC）级。TMP（2，4，6-三甲基吡喃）溶液如前所述制备[60]。将TMP储备溶液（7 mg在3 mL甲醇中）稀释于含有3.5 μL三乙胺的4 mL 70%甲醇中。如前所述，使用TM-Spray（HTX Technologies， LLC，Chapel Hill，NC）将稀释的TMP喷洒在组织切片上[61]。在充满50%甲醇蒸汽的腔室中孵育15分钟后，如前所述，使用TM-Spray（HTX Technologies，LLC，北卡罗来纳州教堂山）将含有0.2%TFA的50%乙腈中的5mg/mL CHCA（美国Sigma-Aldrich）施用于组织切片[62]。所有 MALDI MSI 实验均使用 LTQ Orbitrap XL（德国不来梅赛默飞世尔科技）质谱仪在正离子模式下进行，直射光束 N2激光 （λ = 337.7 nm）。数据采集使用100至1000道尔顿的质量范围，以覆盖DA和NE的m / z值。质谱数据处理和分析使用Xcalibur 3.0软件（赛默飞世尔科技）进行。对于组织成像实验，使用MALDI相机通过扫描包含组织切片的载玻片来确定感兴趣的区域。使用Image Quest 1.1.0软件（赛默飞世尔科技）以100μm的空间分辨率生成DA和NE的分布剖面。用于计算相对DA和NE水平（基于覆盖范围）;信号像素总数除以总面积像素”。然后比较覆盖率的百分比。

含有LC区域的脑干中去甲肾上腺素的HPLC定量

如前所述，通过HPLC-ECD测量神经递质浓度[63]。简而言之，小鼠通过斩首被安乐死，大脑被冷冻在-80C，直到脑干显微切割。称量组织并在含有0.01%EDTA和60nM 3，4-二羟基苄胺的0.2μl冰冷的0.01μM高氯酸中超声处理，作为内标。在15，000g，4°C下离心30分钟后，将上清液通过0.2μm管过滤器。在HPLC柱（亚特兰蒂斯T3，3μM×150μM C-18反相柱中分析20微升上清液;沃特斯，美国马萨诸塞州米尔福德），由双通道库尔赫姆III电化学检测器（型号5300;赛默飞世尔科技）。使用BCA蛋白质检测试剂盒（赛默飞世尔科技）测量组织匀浆中的蛋白质浓度。数据归一化为蛋白质浓度（ng神经递质/mg蛋白质）。

使用激光烧蚀电感耦合等离子体质谱的铜成像

解剖PBS灌注的小鼠大脑，并立即嵌入冷冻模具（Tissue Tek）中的最佳切割温度（OCT）封片介质（Tissue Tek）中，然后在液氮/异戊烷浴中快速冷冻并储存在-80°C直至切片。使用（徕卡低温恒温器CM 3050S）将嵌入的大脑切成20μm切片。将切片风干并在室温下储存直至分析。使用以下参数在具有TV2样品室（ESI，Bozeman，MT）的NWR213激光器上进行激光烧蚀：光斑尺寸：6μm;通量： 3.1 J cm-2;载物台速度：15 μm s-1;射速：20赫兹;他流量：800 mL min-1;图案间距：6 μm。通过氦气流将烧蚀材料引入iCAP-Qc ICP-MS（赛默飞世尔），并在标准采集模式下使用0.4秒的停留时间分析63Cu。生成的质谱迹线和激光日志文件在Igor Pro中使用带有自定义矩阵的Iolite应用程序进行处理。

激光介导的 ChPl 解剖和蛋白质组分析

在设置为a – 20°C的低温恒温器（Leica CM3050 S）上以10μm的厚度切片小鼠大脑，并收集在超级加磨砂载玻片上（美国费舍尔科学）。然后将切片储存在– 80°C。 为了进行激光捕获，将配对的对照和KO组织切片从– 80°C冰箱中取出，加热至室温约30分钟。将载玻片分两步短暂固定在冰冷的乙醇中;首先 100% 乙醇（2 次浸渍，每次 3 秒），然后用 70% 乙醇浸渍两次。在PBS中洗涤两次之前，使乙醇蒸发2分钟。然后将载玻片在去离子H中洗涤两次2O 30 秒。用Kimwipe擦拭载玻片边缘多余的水，并风干约5-10分钟。风干载玻片被装载到蔡司Palm MicroBeam的Axio Observer A1部分的载物台上。使用Palm Robo软件（蔡司），使用透射模式，5倍放大倍率，272毫秒曝光和数值孔径对切片进行筛选。的 0.17 定位 4千心室。徒手工具用于勾勒脉络丛。然后将LCM切换到20倍放大倍率，数值孔径增加到0.22。然后将切片激光切割并收集在粘合帽管（蔡司）上。收集相同的总面积 3.05 mm2每只动物使用6-16个切片。将收集的材料在含有8M尿素，50mM TEAB，0.444Mβ-巯基乙醇和0.74%（M / V）SDS的缓冲液中孵育1小时。孵育后，将样品以10，000g离心，并转移到新鲜的Eppendorf管中。

蛋白质提取物的TMT标记和分析由约翰霍普金斯质谱和蛋白质组学设施进行（见S1文本）。根据倍数变化和p值对鉴定出的蛋白质进行分类，p值小于0.05且倍数变化大于1.5的蛋白质被提交给Ingenuity途径分析（Ingenuity，Thermo Fisher Scientific，Halethorpe，MD）进行功能分类。其他详细信息可在 S1 文本中找到。

脂质提取和分析

使用改良的MTBE脂质提取方案制备来自10mg匀浆脑组织的总脂质提取物[64];有关详细信息，请参阅 S1 文本。总脂质提取物通过液相色谱与高分辨率质谱（HRMS）耦合分析。有关HPLC分析，请参阅S1文本。质谱分析分为两个工作流程：1.） 使用迭代 MS/MS 采集对混合样品进行脂质鉴定，以及 2.）使用高分辨率、准确的质量数MS1采集对所有样品进行脂质半定量。迭代工作流程的MS参数如下：扩展动态范围，2 GHz;气体温度，200°C;气体流量，10升/分钟;雾化器，50 psi;护套气体温度，300°C;护套气体流量，12升/分钟;VCap， 3.5 kV （+）， 3.0 kV （–）;喷嘴电压，250V;参考质量 m/z 121.0509， m/z 1221.9906 （+）， m/z 119.0363， m/z 980.0164 （–）;MS 和 MS/MS 范围 m/z 100–1700;采集速率，3光谱/秒;隔离，窄（~1.3米/赫）;碰撞能量 20 eV （+）， 25 eV （–）;最大前驱体/周期，3;基于前体丰度的扫描速度，25，000 计数/谱;MS/MS 阈值，5，000 个计数和 0.001%;已启用活动排除是;纯度，严格度70%，切断0%;同位素模型，常见有机分子;静态排除范围，m/z 40 到 151 （+，–）。MS1工作流程的MS参数对于源和参考质量数参数相同，仅在采集方面有所不同（选择MS（相同参数）而不是自动MS/MS）。

通过安捷伦脂质注释器 （v 1.0） 分析迭代 MS/MS 工作流程中的 LC-MS 数据以进行脂质鉴定。使用了要素查找和识别参数的默认设置。包括正离子和负离子模式加合物 [M+H]+、[M+Na]+、[M+NH4]+、[M-H]- 和 [M+CH3一氧化碳2]-，分别。脂质注释器的结果被保存为PCDL文件。MS1工作流程中的LC-MS数据使用安捷伦的MassHunter Profinder仪（v 10.0）进行处理。使用默认参数和从脂质注释器创建的PCDL文件进行批量目标特征提取。Profinder生成的处理数据（包括峰面积和脂质鉴定）被导出到MetaboAnalyst 4.0 [65，66]中进行多变量分析。单变量分析使用Prism 6（GraphPad，La Jolla，CA）完成。其他详细信息可在 S1 文本中找到)

支持信息

S1 图——

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S1_Fig。Ctr1在顶膜和基底外侧（基质）的定位的 ChPl（一）Ctr1（红色）和顶端膜标志物NKCC1的免疫荧光染色（绿色）在 ChPl 上从 4 周 Atp7b-/-和野生类型。ChPl 是 co-用 F 染色-肌动蛋白（Phalloidin_Alex647;洋红色）。Ctr1在野生型ChPl中显示出与NKCC1的共定位千在Atp7b中完全不存在的顶膜-/-.还观察到Ctr1染色在ChPl的基底外侧膜上。放大的区域用白色虚线框标记。顶膜已用白色箭头标记。（b） 共聚地Ctr1 与NKCC1和F肌动蛋白使用RGB轮廓图显示。RGB 轮廓图绘制的区域已生成已用白线显示。比例尺 20?m.

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S1 图

Ctr1 在 ChPl 的顶膜和基底外侧（基质）方面的定位 （a） 免疫荧光染色 Ctr1（红色）和顶端膜标志物 NKCC1（绿色）在 ChPl 上从 4 周 Atp7b-/- 和野生型。ChPl与F-肌动蛋白（Phalloidin_Alex647;洋红色）共染色。Ctr1在顶膜上显示与野生型ChPl中的NKCC1共定位，而在Atp7b-/-中完全不存在。在ChPl的基底外侧膜上也观察到Ctr1染色。放大的区域用白色虚线框标记。顶膜已用白色箭头标记。（b）使用RGB图显示Ctr1与NKCC1和F肌动蛋白的共定位。生成 RGB 轮廓图的区域已用白线显示。比例尺 20 μm。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010558.s001

（英文）

S2 图

与对照组相比，4周龄Atp7b-/-ChPl的纤毛密度降低（a）4周Atp7b-/-和野生型对照的睫状膜标志物Arl13b（绿色），ChPl上的γ微管蛋白（红色）的免疫荧光染色。此处合并的Arl13b/γ-tub/DAPI的数据与图3G中的数据相同。比例尺 20 μm （b） 使用来自野生型和 Atp7b-/- ChPl 的 Arl13b（白色）和 γ 微管蛋白（红色）的合并 Z 堆栈图像来计数纤毛细胞的数量。纤毛结构用白框标记。比例尺 20 μm （c） 根据这些图像计算 Atp7b-/- 和野生型 ChPL 之间的纤毛上皮细胞的百分比。数据表示为标准±平均值*P < 0.001（韦尔奇校正 t 检验）。n = 3–4

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010558.s002

（英文）

S3 图 （扩展图4C）。

来自 4 周 Atp7b-/- 和野生型对照的 ChPl 上粘附激酶 （FAK） 的免疫荧光染色。对 ChPl 进行 FAK（绿色）、甲状腺素转运蛋白 （TTR）（红色）和 F-肌动蛋白（洋红色）染色。此处的 FAK 数据与图 4C 中的数据相同。图4D所示的FAK定量是通过将FAK的荧光强度标准化为F-肌动蛋白来进行的。比例尺 20 μm。S4 图定量位于4周龄对照C57Bl / 6小鼠第四脑室两侧的胸径阳性细胞。（A）从第四脑室完全闭合的不同距离处的代表性横截面和胸径染色。（B）对第四脑室两侧的胸径直肠阳性细胞进行定量，并使用个体样本重复绘制图。（C）距第四心室完全闭合不同距离的胸径阳性细胞的平均值。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010558.s003

（英文）

S4 图 定量位于4周龄对照C57Bl / 6小鼠第四脑室两侧的胸径阳性细胞。

（A）从第四脑室完全闭合的不同距离处的代表性横截面和胸径染色。（B）对第四脑室两侧的胸径直肠阳性细胞进行定量，并使用个体样本重复绘制图。（C）距第四心室完全闭合不同距离的胸径阳性细胞的平均值。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010558.s004

（英文）

S5 图 出生后4周和20周时Atp7a和Atp7b（红色）在腔规则位点的胸径阳性细胞（绿色）中的表达。

这里 Atp7a 在 4 周时的数据与图 5B 中的数据相同。比例尺 = 20μm。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010558.s005

（英文）

S6 图 （前两个面板）脑组织中衍生化DA和NE的代表性平均全扫描质谱，分别在m / z 258.1485和274.1435处检测到它们的离子。

CHCA被用作基质。（底板）为了确认衍生化DA和NE的身份，进行了碰撞诱导解离。从这些实验中，衍生化的DA在m / z 122.0958和137.0591处分别对应于C8H12N +和C8H8O2+。类似地，衍生化NE在m / z 122.0959和153.0540处分别对应于C8H12N +和C8H8O3+。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010558.s006

（英文）

S7 图 分析男性和女性纹状体（Str）和黑质（SNc）中的多巴胺降解产物。

5-HIAA 是 5-羟基吲哚乙酸、DOPAC—3，4-二羟基苯乙酸、5HT—5-羟色胺、3MT—3-高香草酸 （n = 3–4）

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010558.s007

（英文）

S1 文本。 补充方法和参考。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010558.s008

（英文）

S1 表。 与对照组相比，Atp7b-/- ChPl中蛋白质丰度的显着变化（p值<0.1）。

桃色表示蛋白质上调超过1.25倍;绿色 - 蛋白质下调超过1.25倍。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010558.s009

（英文）

确认

我们感谢Betty Eipper博士慷慨捐赠抗胸径特异性抗体、用于访问奥林巴斯FV3000R共聚焦的罗斯荧光成像中心设备，以及基恩士BZ-X700、JHU SOM MicFac为配备DP70彩色相机的奥林巴斯BX51TF提供帮助。我们感谢Abigael Muchenditsi博士对Ctr1抗体的帮助，并感谢Benjamin Devenney对小鼠群体的帮助。我们还要感谢约翰霍普金斯大学基础生物医学科学研究所显微镜设施的Michael Delannoy和Barbara Smith在样品制备和EM成像方面的培训。TMD是Leonard和Madlyn Abramson神经退行性疾病教授。

引用

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