医学论文发表-靶向高度重复的基因组序列，对来自人类血液和蚊子的丝虫寄生虫曼索氏菌进行灵敏和特异性的分子检测

尼尔斯·皮洛特 ，塔玛拉·托马斯，迈克尔·祖尔奇，艾莉森·西罗伊斯，科拉多·米内蒂，丽莎·雷默，史蒂文·威廉姆斯，洛瑞·桑德斯

发布时间：2022 年 12 月 29 日

抽象

背景

曼索氏菌是最被忽视的热带疾病之一，据信比非洲任何其他丝虫病原体引起更多的人类感染。主要基于感染相关发病率有限的假设，这种病原体的研究仍然不足，许多关于其致病性、分布、患病率和媒介-宿主关系的基本问题仍未得到解答。然而，近年来，越来越多的证据表明曼索氏菌感染相关疾病的可能性增加，引发了研究兴趣的重新燃起。这反过来又产生了对改进诊断的需求，能够提供更准确的感染流行率、病原体分布和媒介-宿主相互作用的图片。

方法/主要发现

利用前面描述的管道来发现最佳分子诊断靶点，我们鉴定了一个重复的DNA序列，并开发了相应的测定方法，该测定允许对M进行灵敏和物种特异性鉴定。人类血液样本中的珀斯坦。测试还证明了利用该测定法检测M的能力。实地收集的蚊子样本中的Perstans。在测试两种样品类型时，我们的重复靶向指数测定优于核糖体序列靶向参考测定，有助于鉴定其他M。使用灵敏度较低的检测方法将Perstans阳性样品错误地表征为“阴性”。

结论/意义

通过开发基于最佳DNA靶序列的系统鉴定的检测方法，我们的新型诊断检测将为程序化工作提供能够准确定位M的灵敏和特异性测试平台。珀斯坦斯感染和确定患病率。此外，增加了识别M存在的能力。Perstans 在蚊子样本中，该测定将有助于定义我们对这种病原体与各种地理上相关的蚊子物种之间存在的关系的了解，这些蚊子物种已被推测在某些条件下代表潜在的次要媒介。检测M.蚊子体内的Perstans还将展示基于蚊子的丝虫病原体监测概念验证，而不是主要由蚊子传播的丝虫病原体，这种方法扩大了综合监测的机会。

作者摘要

曼索氏菌感染在世界许多热带和亚热带地区仍然极为普遍。然而，M.Perstans在很大程度上没有得到充分研究，因为长期以来人们认为这种病原体几乎没有临床意义。然而，近年来，研究界的许多人开始倡导增加对这种病原体的研究，指出曼索氏菌病相关疾病发病率的证据，曼索氏菌属混淆其他病原体的诊断测试的可能性，以及与M合并感染的可能性。Perstans影响疾病进展和其他感染的治疗结果。由于人们越来越认识到M.Perstans，需要改进的诊断选项，能够为研究人员提供准确有效地绘制感染图，探索病原体 - 载体关系并确定病原体流行率所需的工具。为了满足这些需求，我们开发了一种针对M内高度重复DNA序列的新型实时PCR检测方法。珀斯坦斯基因组。当比较测试人类血液和现场收集的蚊子样本时，该指数测定优于核糖体序列靶向参考测定。因此，该测定将为研究人员提供鉴定M的改进工具。Perstans作为各种运筹学工作的一部分。

引文： Pilotte N， Thomas T， Zulch MF， Sirois AR， Minetti C， Reimer LJ， et al. （2022） 靶向高度重复的基因组序列，用于对来自人类血液和蚊子的丝虫寄生虫曼索氏菌进行灵敏和特异性分子检测。PLoS Negl Trop Dis 16（12）： e0010615. https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0010615

编辑 器： 巴勃罗·马拉维拉，墨西哥综合医院

收到： 6月 28， 2022;接受： 12月 15， 2022;发表： 12月 29， 2022

版权所有： ? 2022 皮洛特等人。这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。

数据可用性： 所有 RepeatExplorer2 和 TAREAN 输出文件均可从 Dryad （datadryad.org） 获得。可以使用doi：10.5061/dryad.37pvmcvp0访问此Dryad数据集。出于伦理考虑，基础序列数据不能向公众公开。对此数据的请求可以发送到丝虫病研究试剂资源中心（FR3）的分子资源部，地址为 genome@smith.edu。

资金： 这项工作得到了比尔和梅琳达·盖茨基金会对NP的奖励[大挑战探索第二阶段投资编号OPP1154992“通过蚊子排泄物/粪便的高通量筛查对淋巴丝虫病和疟疾进行可持续，低成本的异种监测”（www.gatesfoundation.org）]以及由MRC资助的全球挑战研究基金对LJR的奖励， AHRC、BBSRC、ESRC 和 NERC [授权号 MR/P025285/1 （www.ukri.org/what-we-offer/international-funding/global-challenges-research-fund/）]。史密斯学院的Blakeslee遗传学研究基金为LJS提供了额外的支持。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。

竞争利益： 作者没有竞争利益需要披露。

介绍

曼索氏菌是30多个撒哈拉以南非洲国家以及中美洲和南美洲部分地区记录的人类感染，是世界热带和亚热带地区广泛传播的病原体[1]。然而，估计有超过1亿例感染，因此曼索氏菌被认为是非洲最常见的人类丝虫寄生虫[1，2]，与其他人类感染丝虫病原体相比，曼索氏菌正在研究中。研究兴趣不大和缺乏资金是长期以来认为曼索氏菌临床意义有限的直接结果[1，3]。这导致曼氏菌病被称为最被忽视的热带病（NTD）之一[1]。然而，科学文献中很少有研究评估M.Perstans感染，一些流行地区的证据表明，高达10%的曼索氏菌感染者可能患有严重疾病[4]，越来越多的研究界支持需要更彻底地调查广泛性曼索氏菌病对公共卫生的影响[1，5]。还有人担心M.Perstans感染可能混淆旨在诊断密切相关的丝虫病原体的血清学检测或快速诊断试验的结果，从而间接影响人类健康[6]。虽然这种影响的程度仍不确定，并且有限的证据表明这种交叉反应可能不太可能[7]，但这种可能性引起了淋巴丝虫病界的担忧，其中RDT与丝虫病原体（如罗阿丝虫）的交叉反应性可能会显着扭曲调查结果，影响对干预结果的解释，并使疾病绘图工作复杂化[8，9]。

对于任何疾病发病率评估的关键是能够灵敏和特异性地识别疾病病原体的存在。适当和充分的诊断策略对于克服与感染绘图、患病率评估和影响建模相关的挑战也至关重要。促进媒介定罪的分子方法同样重要，因为对潜在节肢动物宿主的载体能力的基本了解对于了解任何媒介传播病原体的传播动力学和传播能力至关重要。在M的情况下。Perstans，对媒介-病原体关系仅存在部分和不足的理解。而Culicoides spp.是M唯一经过验证的载体。Perstans [3]，Simulium属的黑蝇[10-12]和至少一种属于Leptoconops属的蠓的能力，与密切相关的物种Mansonella ozzardi的载体已有记录[13]。这些发现与现场研究相结合，报告了M的病媒和宿主患病率水平之间的严重不一致。Perstans [14，15]，导致社区中的一些人推测蚊子可能代表有能力的M。珀斯坦斯载体在某些设置或特定条件下[2]。历史研究表明，曼索氏菌在按蚊和埃及伊蚊中的部分发育为这种可能性提供了进一步的支持[10]。应优先考虑制定能够解决围绕该病原体的许多悬而未决问题的诊断策略。

为了满足这一诊断需求，我们现在描述了一种针对M内高度重复序列的新型实时PCR（qPCR）测定的开发。珀斯坦斯基因组。利用我们之前描述和验证的检测开发管道，旨在生物信息学地鉴定给定病原体基因组中重复性最强的物种特异性元件[16，17]（[18]中回顾的方法和用例），我们创造了一种检测方法，与核糖体序列靶向参考测定相比，该检测方法证明了更高的分析和临床灵敏度。使用重复基因组元件的测定是可取的，因为此类序列为测定靶标提供了更高的拷贝数。由于这些基因组元件通常是非编码的，使它们不太容易受到进化保守的影响，因此它们也提供了出色的特异性，密切相关的物种经常在这些基因组区域中显示出分歧。值得注意的是，我们已经展示了改进的M。在测试人类血液样本和蚊子池是否存在病原体时进行珀斯坦斯检测。虽然血液检查仍然是M最明显的用途。Perstans测定，该测定在蚊子监测中的效用应该引起研究界的极大兴趣。除了对媒介定罪目的可能产生的影响外，基于蚊子的检测将有助于扩大M。Perstans通过允许与其他蚊媒病原体进行综合监测来绘制地图工作。随着LF社区[19-21]以及其他NTD社区[22-24]对分子异种监测（MX）可能用途的兴趣重新燃起，联合监测的前景正在扩大。认识到这一机会，许多捐助者和倡导者开始倡导整合策略，通过创造性地扩展测试来最大化投资[25]。对噬血昆虫监测有能力和不能力的载体病原体提出了一种有吸引力的可能性。

方法

道德声明

人类血液样本采集是在先前一项研究获得并充分描述的情况下进行的[26]。简而言之，利物浦热带医学院伦理委员会（研究协议17-035病媒排泄物监测系统VESS以支持病媒传播疾病的快速检测）和加纳阿克拉科学与工业研究委员会获得了伦理批准。对于所有参与者，由参与者或参与者的监护人提供书面同意。

分离M.珀斯坦斯微丝蚴科

为了隔离M.Perstans微丝蚴（MF）用于下游测序，大约250μL储存的静脉血样本，先前作为一项无关研究的一部分从单个患者收集[27]使用根据NIH / NIAID丝虫病研究试剂资源中心（www.filariasiscenter.org 修改的方案进行了基于注射器的过滤).为此，首先在1 X PBS中以1：10稀释血液。然后使用无菌注射器将稀释的血液通过5μM聚碳酸酯膜过滤器（Sterlitech，肯特，WA）。正压允许血液成分和细胞通过过滤器，同时使较大的微丝蚴留在过滤器的表面上。过滤后，将 10 个样品体积 （5 mL） 的 1 X PBS 加入注射器并通过过滤器，有助于冲洗掉残留的血液成分。然后将过滤器放入 15 mL 锥形管中，并在过滤器表面反复洗涤 1 mL 的 1 X PBS，以释放/去除分离的微丝蚴。然后取下过滤器，并将管子以1，000×g短暂旋转以沉淀收集的微丝蚴。

从M中提取DNA。珀斯坦斯微丝蚴科

颗粒M.Perstans微丝蚴使用DNeasy血液和组织试剂盒（Qiagen，Germantown，MD）进行了DNA提取。提取按照制造商建议的方案进行，该方案用于基于离心柱从动物的血液或细胞中纯化总DNA，并进行微小的修改。简而言之，将微丝蚴重悬于200μL的1X PBS中，然后加入20μL蛋白酶K和200μL缓冲液AL。将样品涡旋，在56°C下孵育10分钟，并加入200μL100%乙醇。将样品涡旋，转移到DNeasy Mini离心柱中，并以6，000×g旋转1分钟。丢弃流通液，并根据制造商的建议依次用缓冲液AW1和AW2洗涤样品。然后，通过离心以推荐的时间和速度从100 μL缓冲液AE中的离心柱中洗脱DNA。为了最大限度地提高DNA回收率，洗脱产物随后被重新加载到离心柱中，并通过重复离心进行第二次通过。

文库构建和二代测序

为了准备下一代测序（NGS），使用Nextera DNA Flex文库制备试剂盒（加利福尼亚州圣地亚哥Illumina）创建了一个文库。使用60 ng的gDNA（浓度为2ng/μL），根据制造商建议的方案生成双索引文库。制备、定量和纯化后，将 250 μL 稀释至 10 pM 浓度的该文库与 7.5 μL 的 10 pM PhiX 文库混合以增加多样性。然后使用150循环v3试剂盒（Illumina）在MiSeq仪器（Illumina）上进行配对末端测序。

重复分析

使用基于Galaxy的预处理工具准备原始测序读数以进行下游分析。为了确保仅包含高质量的输入读取，其组件基数未能达到或超过质量分数阈值 10 的读取（读取的总基本位置为 95% 或更多）将被排除在外。然后选择通过文件管理器的 500，000 个隔行读取的随机子集进行分析。识别M中高度重复的元素。如前所述，使用RepeatExplorer2 [28]和TAREAN [29]应用程序分析了读取[16-18，30，31]。这些分析导致了相似序列的聚类，并确定了预测在M中高度代表性的重复DNA元件。珀斯坦斯基因组。然后选择为每个重复簇生成的共识序列，并预测代表每个相应父重复的最丰富版本，以进行进一步分析。

为了验证候选共识序列的起源，使用国家生物技术信息中心（NCBI）网站（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）提供的“核苷酸BLAST工具”分析了每个序列。由于用于从宿主血液中分离幼虫的过滤过程不完善，因此所得DNA提取物含有两种M。Perstans衍生和人类衍生的序列。因此，对簇进行了与人类序列的BLAST相似性搜索，并且那些映射到人类基因组元素的簇被排除在考虑之外。从剩余的序列元素中，选择预测在原始读数集合中患病率最高的候选药物作为可能的测定靶标。这个M.Perstans Target被命名为Mansonella perstans Repeat 1（MpR1），并将在本手稿中这样称呼。

引物和探针设计

利用PrimerQuest工具（集成DNA技术，爱荷华州Coralville）的默认参数，设计了用于扩增MpR1重复序列的qPCR测定。按照设计，合成正向和反向引物，以及用6FAM荧光团标记并使用ZEN / 3IABkFQ化学品进行双淬灭的探针。

检测优化和验证

引物优化。

为了确定可实现最佳扩增的引物浓度，制备了一系列反应，其中将候选正向和反向引物稀释至300 nM、500 nM和800 nM的浓度。将含有每种浓度正向引物的反应与每种浓度的反向引物组合制备，从而产生3 x 3的反应基质。所有反应均使用 10 μL TaqPath ProAmp 预混液（赛默飞世尔科技，马萨诸塞州沃尔瑟姆）和 125 nM 浓度的探针运行。反应以含有100 pg M的20 μL体积运行。珀斯坦斯 gDNA 模板。循环条件包括在50°C下保持22分钟，然后在95°C下保持10分钟。 在这些孵育之后，发生40个95°C循环15秒，然后60°C循环1分钟。根据每种引物组合产生的结果计算引物浓度和平均Cq值（积累扩增衍生荧光越过高于背景的“阈值”水平，指示真正扩增的qPCR循环数）的每种组合制备12个重复反应。

确定最佳反应温度。

为了确定能够产生最低Cq值的退火/延伸温度，使用55°C至60°C的温度梯度进行了一系列反应。 利用每种退火/延伸温度结合最佳引物浓度，并使用上述所有其他反应参数以及试剂和模板浓度进行四个重复反应。反应完成后，计算每个温度下产生的结果的平均Cq值。

检查分析特异性。

为了评估我们的候选引物/探针配对的特异性，NCBI的引物-BLAST工具（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi）用于筛选针对各种测定靶标的预测扩增。在计算机分析之后，使用上述确定的最佳引物浓度和循环温度，使用含有从丝虫寄生虫中分离的gDNA提取物的特异性组合 布鲁吉马来布鲁吉、布鲁吉帕汉吉、罗亚罗亚、棘皮螨、盘尾丝虫扭转、班克罗夫蒂乌切氏菌、迪罗丝蚴和奥扎尔曼索氏菌，以及人类gDNA的测试。将所有提取物用作模板，一式三份，一式三份，每个反应孔中加入100 pg的gDNA。

分析灵敏度检查

为了确定我们测定的分析检测限，等分试样为M。perstans gDNA被连续稀释10倍，产生的储液浓度范围为100 pg/μL至1 ag/μL。利用最佳反应条件，在一式三份的20 μL反应中测试所有浓度的模板，每个反应孔中加入1 μL模板。

反应效率评估

创建阳性对照质粒。

利用我们的qPCR引物，测定的靶序列从M扩增。如前所述，通过常规PCR进行纯gDNA[17]。然后将PCR产物克隆到pCR-Blunt II-TOPO载体（赛默飞世尔科技）中，按照制造商建议的方案。克隆反应后，NEB快车主管E的转化。进行大肠杆菌（新英格兰生物实验室，伊普斯威奇，马萨诸塞州）并根据已发表的方法将转化产物接种在选择性培养基上[17]。然后允许大肠杆菌在一夜之间生长，然后通过用移液管吸头刮擦单个菌落进行采样。然后使用集落PCR和测序的组合来鉴定含有仅具有MpR1重复序列拷贝的质粒的菌落，如前所述[17]。含有MpR1重复序列的单个拷贝的该质粒储备液用作所有未来实验的阳性对照。

反应效率的测定。

为了评估反应效率，滴定阳性对照质粒的制备，进行稀释以产生浓度范围为500 pg/μL至1 pg/μL的储备液。由于 MpR1 保质粒的大小为 3，644 bp，核苷酸碱基对的平均质量数估计为 650 Da，因此 100 ag 质粒估计包含大约 25 个质粒拷贝。根据该数字，然后计算稀释系列中使用的每种质粒浓度的估计拷贝数。利用优化的反应条件，以每种质粒浓度为模板运行9至11次重复反应。然后进行反应效率的计算。

临床敏感性评估

现场采集的血液和蚊子样本的比较分析。

为了评估我们新描述的重复序列靶向测定的临床敏感性，对先前作为一项无关研究的一部分收集和提取的158份干人血液样本和316份蚊子样本（>98%按蚊属和<2%其他蚊样）的DNA进行了检测[26]，以检测是否存在M。Perstans使用我们的指数测定和先前描述的核糖体序列靶向参考测定[5，26]。使用每种测定各自的最佳条件对所有样品进行测试，并且测试一式两份。对于血液样本检测，在与任一检测的初始检测过程中产生不一致结果的样本，用适当的检测方法重新检测，再次一式两份，如果两次复测重复中至少有一个产生阳性结果（定义为Cq值<40），则评分为阳性。如果两个复测重复都未能产生可检测的产品，则样品被记录为阴性。由于样品量有限，两种检测结果不一致的蚊子样本无法重新测试，因此被排除在研究之外。

结果

重复分析和检测设计

在去除映射到人类DNA的簇状序列后，选择制备的文库中最具代表性的剩余重复序列作为潜在的测定靶标。该共识序列，MpR1重复序列，单体单元的长度预测为281个碱基对，被用作候选测定引物和探针设计的模板（表1）。

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表 1. 用于 MpR1 重复靶向索引测定的引物和探针序列。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0010615.t001

检测优化和验证

引物滴定。

在 3 x 3 基质中使用滴定引物储备液检测 gDNA 模板，确定正向引物的最佳浓度为 500 pmol/μL，反向引物的最佳浓度为 300 pmol/μL（S1 表）。

确定最佳反应温度。

通过在55°C至60°C的退火/延伸温度梯度上测试最佳引物浓度（如上所述），确定了扩增的有利条件。由于所有温度产生的Cq值几乎相同（S2表），因此选择60°C的退火/延伸温度，以最大程度地降低非特异性扩增的风险。

分析特异性检查

利用优化的反应条件和循环方案，通过测试人类gDNA模板以及从相关丝虫寄生虫B中分离的gDNA来评估我们测定的分析特异性。马来伊，B.帕汉吉，L.洛亚，A.维蒂亚，O.扭转，W.班克罗夫蒂，D.伊米炎和M.奥扎尔迪。未观察到“脱靶”扩增（S3表）。

检查分析灵敏度。利用最佳反应条件和循环方案，在所有重复中检测到所有含有10 fg或更多DNA模板的测试样品（S4表）。

反应效率的测定。使用我们的阳性对照质粒滴定法计算反应效率（衡量测定接近真实指数扩增的程度）和扩增因子（每个反应周期中每个模板分子产生PCR产物拷贝数的值）。利用质粒大小和模板质量数估计靶拷贝数，将结果绘制为对数变换拷贝数与平均Cq值的关系。根据所得曲线的斜率，计算出反应效率为97.16%，扩增因子为1.97（图1）。

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图1. 测定测定效率和扩增因子。

为了确定测定效率和扩增因子，使用对照质粒制备稀释系列。所有稀释液，含有 2.5 x 10 的质粒浓度5目标拷贝/反应至 1.25 x 108靶拷贝/反应在9至11个重复反应中运行。然后计算包含每个模板拷贝数的所有重复的平均Cq值和标准偏差，绘制斜率，并确定反应效率和扩增因子。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0010615.g001

临床敏感性评估

现场采集的血液样本的比较分析。

对 158 种人血来源的 DNA 提取物的测试导致鉴定出 58 个样品 （36.7%），使用 MpR1 指数测定和前面描述的核糖体序列靶向参考测定产生了阳性 qPCR 结果。另外95个样品（60.1%）在使用两种测定方法进行测试时产生了阴性结果。使用MpR1指数测定法测试时，五个样品（3.2%）产生阳性结果，但使用参考测定法测试时产生阴性结果。使用参比测定法未发现阳性样品，但使用MpR1测定法检测时检测结果为阴性（表2和S5）。比较所有共阳性样品之间的Cq值导致平均差异为11.16个周期，MpR1测定对所有样品产生较低的平均Cq值（图2A）。各测定中副样品平均Cq值差异的分布如图2B所示。

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图2. 对参考和指数测定产生阳性结果的样品的平均Cq值之间的差异。

（A）对于每个共阳性样品，绘制核糖体ITS靶向参考测定（红色圆圈）和重复序列靶向（MpR1）指数测定（蓝色方块）的平均Cq值。（B）对于所有共阳性样品，通过从参考测定测试得出的平均Cq值中减去指标测定测试结果的平均Cq值来计算差异。然后将差异分箱并绘制图。所有绘制（共阳性）样品的平均差异为11.16个周期。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0010615.g002

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表 2. 在对人类血斑样本进行比较测试时同意测定结果。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0010615.t002

现场收集的蚊子样本的比较分析。

从单个蚊子尸体（>98%按蚊属和<2%其他属）中分离出的总共316个DNA样本中检测了M的存在。使用指数和参考测定的珀斯坦斯。在初步测试之后，由于样品量不足，从数据集中删除了25个样品，从而防止了对一次或两次测定的不一致阳性结果的重新测试。在其余291个样本中，使用两种测定方法确定262个提取物（90.0%）为阴性，其中16个样品（5.5%）检测为M阳性。同时定位索引和参考目标时的珀斯坦。另外13个样品（4.5%）在检测MpR1测定的重复靶标时产生阳性结果，但在检测核糖体重复时产生阴性结果。没有一个样品产生参考测定阳性结果与指标测定阴性结果相结合（表3和S6）。

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表 3. 在对现场收集的蚊子样品进行比较测试时，测定结果的一致性。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0010615.t003

讨论

横跨多个大洲和广阔的地理区域，M.Perstans是一种研究不足的病原体，其对人类健康的重要性仍然知之甚少。然而，尽管历史上缺乏研究兴趣，但最近出现了进一步探索曼氏菌病对健康影响的趋势，越来越多的证据表明，感染结局可能导致的发病率高于先前的预期[4]。为了正确评估此类问题的影响和潜力，能够灵敏和特异性地识别阳性样本的其他诊断研究工具将至关重要。

为了满足这一需求，我们鉴定出了一种高拷贝数重复序列，并将其用作qPCR检测靶标。该候选测定的初步测试表明反应效率为97.16%，该指标使该测定在所需的效率范围内（>90%）并接近理想（100%）。将这种MpR1检测与核糖体序列靶向参考检测法进行了测试[5，26]，我们的指标检测显示出更高的分析灵敏度，有助于一致地检测低至10 fg的病原体来源的gDNA。估计基因组大小为75-85 Mb，估计单个二倍体M的质量。珀斯坦斯基因组约160-180 FG。因此，这种分析检测限表明，我们的指数测定能够检测到比单个M中发现的质量少得多的DNA。珀斯坦斯二倍体细胞。此外，该测定在针对来自密切相关属的丝虫线虫进行测试时显示出出色的特异性[32]。此外，临床敏感性也得到了提高，在测试人血源DNA提取物时发现了额外的阳性样本（表2）。值得注意的是，虽然灵敏度的衡量标准很差，但比较Cq值可以深入了解具有相似效率的测定之间靶序列的相对流行率。因此，对比较Cq值的检查表明，指标测定的重复靶标的患病率高于所采用的参考测定的核糖体序列靶标，Cq值的平均差异为11.16个周期。如果扩大M研究的势头日益增强，那么分析和临床敏感性的这种改进将为计划决策者提供一种能够准确了解感染状态的工具。Perstans带来了切实的运筹学工作。

虽然人类血液样本的测试仍然是我们新测定法最明显的应用，但已证明能够测试蚊子样本中是否存在M。珀斯坦斯也值得注意。这种能力不仅有可能通过作为人类感染的非侵入性替代物来促进绘图和监测工作，而且还具有促进病媒犯罪研究的能力。正如以前的研究假设M的潜在存在一样。Perstans蚊子媒介 在选定的地理环境中[2]，蚊子的测试将允许对这种可能性的更广泛了解。蚊子中肠的渗透和曼索氏菌的部分发育已经在埃及伊蚊[33]中记录，因此有必要评估可能的M的任何类似能力。珀斯坦斯向量。因此，通过对蚊子尸体部分（腹部、头部和胸部）的独立测试，可以深入了解部分或完全病原体的发展，以检查蚊子宿主内的蠕虫迁移模式。然而，即使蚊媒能力有限或不存在，对M的行为和/或部分发展的了解也应有所改善。蚊子宿主内的perstans很有价值，因为丝虫寄生虫的中肠渗透已被证明有助于病毒病原体的传播，包括登革热和东部马脑炎，在合并感染的情况下[34，35]。因此，对M的理解有所提高。Perstans在蚊子中的发育可以为共同流行环境中病毒传播的建模工作提供有价值的信息。

鉴于与M有关的大量开放研究问题。Perstans-Mosquito关系，分析蚊子是否存在这种病原体的能力为整合监测提供了极好的机会，允许为其他目的收集的蚊子进行筛查是否存在这种“非载体”病原体。通过创造性地和扩大使用这种捕获的蚊子种群，这些努力应使研究规划者能够发展有用的合作伙伴关系。这种伙伴关系将提高研究投资的总体回报，并最大限度地扩大从每项努力中收集的数据量。

尽管此处描述的指数测定有许多可能的应用，但重要的是要注意，实时荧光定量PCR需要基础设施和试剂，在某些情况下成本过高。对于被忽视的热带病应用来说尤其如此，在这些应用中，规划工作经常受到资金挑战的困扰。然而，新技术不断降低试剂成本，经济高效、现场友好的实时荧光定量 PCR 仪器的出现将扩大实时荧光定量 PCR 检测技术的范围。此外，COVID-19大流行导致许多地区对分子基础设施的支持扩大[36]，在许多有M风险的环境中提高了分子检测能力。珀斯坦斯感染。

这项研究的一个值得注意的缺点是无法获取，因此验证了我们对从曼索氏菌链球菌中分离的DNA的测定。正如M.链球菌和M.Perstans在地理上重叠[3，37]，核糖体序列分析表明M之间存在更密切的系统发育关系。珀斯坦斯和M.链尾虫比M之间。珀斯坦斯和M.Ozzardi [3]，针对这种密切相关的寄生虫进行测试对于充分验证我们的测定将曼索氏菌属的人类感染病原体区分到物种水平的能力非常重要。努力确定M.链尾丝虫材料和其他曼索氏菌属（如曼索氏菌）正在进行中，其他验证工作的计划也在进行中。

通过系统地鉴定基于DNA的最佳诊断靶点，我们开发了一种qPCR检测方法，能够改善M的检测。人类和蚊子样本中的珀斯坦。该测定为M的潜在扩增提供了有用的工具。Perstans监测工作，并有助于促进综合异种监视工作。鉴于缺乏关于这种寄生虫的分布、寄生虫-媒介关系和临床影响的知识，能够更好地了解其患病率的工具应该有助于在研究界扩大对这种寄生虫的研究。

支持信息

斯塔德清单。

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部分和主题不项目标题或摘要1使用至少一种准确性测量来识别诊断准确性的研究（如敏感性、特异性、预测值或 AUC）抽象2研究设计、方法、结果和结论的结构化摘要（有关具体指导，请参阅摘要的 STARD）介绍3科学和临床背景，包括预期用途和指标试验的临床作用4研究目标和假设方法研究设计5在指标测试和参考标准之前是否计划数据收集进行（前瞻性研究）或之后（回顾性研究）参与者6资格7确定潜在合格参与者的依据是什么（例如症状、先前测试的结果、包含在注册表中）8确定潜在合格参与者的地点和时间（设置，位置和日期）9参与者是形成连续的、随机的还是方便的序列测试方法10一索引测试，足够详细以允许复制10b参考标准，足够详细，允许复制11选择参考标准的理由（如果有替代品）12一检测阳性切口的定义和理由-关闭或结果类别的指数测试，区分预-从探索性指定12b检测阳性切口的定义和理由-关闭或结果类别参考标准，区分预-从探索性指定13一是否有临床信息和参考标准结果到指数测试的执行者/读者03C是否有临床信息和指标测试结果参考标准的评估员分析14估计或比较诊断准确性测量的方法15如何处理不确定的指标测试或参考标准结果16如何处理指标测试和参考标准缺失的数据17任何诊断准确性变异性的分析，区分前-从探索性指定18有意样本量及其确定方式结果参与者19参与者流程，使用图表20受试者的基线人口统计学和临床特征21一目标人群中疾病严重程度的分布条件31C分布无目标疾病的其他诊断22指标测试和参考标准之间的时间间隔和任何临床干预测试结果23指数测试结果（或其分布）的交叉制表。根据参考标准的结果24诊断准确性及其精度的估计值（例如 95% 置信区间）25执行指数的任何不良事件测试或参考标准讨论26研究局限性，包括潜在偏倚、统计不确定性和普遍性的来源27对实践的影响，包括指标测试的预期用途和临床作用其他信息28注册号和注册名称29在哪里可以访问完整的研究方案30资金来源和其他支持;资助者的作用标题导言第2、3段摘要第2段,3导言第3段方法第9小节;编号 #26编号 #26编号 #26编号 #26编号 #26编号 #26方法第9小节;编号 #26编号 #26不适用不适用不适用方法第9小节方法第9小节不适用不适用编号 #26不适用不适用不适用不适用表 2、3不适用结果部分 3;S5/ 06表十一、第4段的讨论讨论二、三、7方法第一节方法第一节资金说明

斯塔德2015一 我 米STARD 代表 “标准报告诊断准确性研究”。这制定项目清单是为了促进诊断准确性研究报告的完整性和透明度。作者可以使用该列表来撰写信息丰富的内容研究报告。编辑和同行评审员可以使用它来评估信息是否已包含在稿件中提交出版。E X P L A N A TI O N一个诊断准确性研究评估一项或多项医学检查的能力将研究参与者正确分类为具有一个目标条件。这可以是疾病、疾病阶段、反应或治疗益处，也可以是前途。医学检查可以是成像程序，实验室检查，病史和体格检查的元素，A这些的组合，或任何其他收集有关患者当前健康状况信息的方法。评估其准确性的测试称为指标测试.一项研究可以评估一个或多个指标检验的准确性。评估医学检查的能力要对患者进行正确分类，通常通过比较指数的分布来完成测试结果与参考标准.千e 参考标准是建立是否存在目标条件.准确度研究可以依赖于一个或多个参考标准。如果测试结果被归类为阳性或阴性，则指数测试结果与这些结果的交叉表的参考标准可用于估算敏感性的指数测试（参与者比例跟目标指标检测呈阳性的条件），及其特 异性（比例没有目标条件谁有阴性指数测试）。从此交叉制表（有时称为意外事件或"2x2"表），其他几个精度可以估计统计数据，例如正数和负数预测值的测试。置信区间然后可以计算准确性的估计值以量化统计精度的测量值。如果指数测试结果可以采用两个以上的值，则将测试结果分类为正或负需要测试阳性削减-关闭.什么时候倍数这样的切割-关闭s 可以是定义，作者可以举报接收者经营特征（中华民国）曲线以图形方式表示每个可能的测试阳性切割的敏感性和特异性组合-关闭.这中华民国曲线下面积在单个数字 VA 中通知LUE关于指标检验的整体诊断准确性。这预期用途医学检查可以是诊断、筛查、分期、监测、监测、预测或预后。这临床作用测试解释了其相对于临床路径中现有测试的位置。例如，替代测试,替换现有测试。在现有测试之前使用分类测试;在现有测试之后使用附加测试.除了诊断的准确性外，其他一些结果和统计数据可能与医学检查的评估有关。医疗测试也可用于对患者进行分类，用于诊断以外的目的，例如分期或预后。斯塔德名单是未针对这些其他结局、统计数据和研究类型明确开发，尽管大多数 STARD 项目仍然适用。D E V E L O P M E N T这份 STARD 名单于 2015 年发布。这30项目由一个国际方法学家专家组确定，研究人员和编辑。STARD开发的指导原则是选择在报告时将帮助读者判断研究中可能存在的偏倚，评估研究结果的适用性和有效性结论和建议。该列表是2003年出版的第一版的更新。更多信息可以在http://www.equator-network.org/reporting-guidelines/stard.

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S1 清单。 斯塔德清单。

确定了稿件中每个清单项目的位置。包含此清单是为了方便读者评估潜在研究偏倚的能力，并促进考虑报告结果的普遍性。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0010615.s001

（英文）

S1 表。 引物滴定实验结果。

提供了作为引物滴定实验一部分的反应产生的Cq值。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0010615.s002

（四十一）

S2 表。 温度优化实验结果.

提供了作为温度优化实验的一部分进行的反应产生的Cq值。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0010615.s003

（四十一）

S3 表。 分析特异性实验的结果。

提供了作为分析特异性实验的一部分进行的反应产生的Cq值。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0010615.s004

（三十）

S4 表。 分析灵敏度实验的结果。

提供了作为分析灵敏度实验的一部分进行的反应产生的Cq值。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0010615.s005

（三十）

S5 表。 现场采集的血液样本测试的个体反应结果。

提供所有血液样本检测产生的Cq值，用于参考和指数测定。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0010615.s006

（三十）

S6 表。 现场收集的蚊子样本测试的个体反应结果。

提供所有蚊子样品测试产生的Cq值，用于参考和指数测定。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0010615.s007

（三十）

确认

作者感谢Edward J. Tettevi，Francis B. D. Veriegh和Mike Yaw Osei-Atweneboana参与的初步研究，该研究为验证该测定提供了研究资源。计算资源由ELIXIR-CZ项目（LM2015047）提供，该项目是国际ELIXIR基础设施的一部分。

引用

1.Simonsen PE， Onapa AW， Asio SM. 非洲曼索氏菌丝虫病.热带学报 2011;120： S109–S120.密码：20152790

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

2.Mediannikov O，Ranque S. Mansonellosis，最被忽视的人类丝虫病。新微生物新感染。2018;26： S19–S22.密码：30402239

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

3.Ta-Tang T-H，Crainey J，Post RJ，Luz SLB，Rubio J. Mansonellosis：当前的观点。RRTM.2018;第 9 卷：9-24。pmid：30050351

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

4.Agbolade O，Akinboye D，Ogunkolo O. Loa loa和Mansonella perstans：尼日利亚需要控制的被忽视的人类感染。Afr J 生物技术。2005;4: 1554–1558.

查看文章谷歌学术搜索

5.Mourembou G， Fenollar F， Lekana-Douki JB， Ndjoyi Mbiguino A， Maghendji Nzondo S， Matsiegui PB， et al.曼索氏菌，包括一种潜在的新物种，作为加蓬儿童常见的寄生虫。穆科科·公共科学图书馆 Negl Trop Dis. 2015;9： e0004155.pmid：26484866

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

6.Batsa Debrah L， Phillips RO， Pfarr K， Klarmann-Schulz U， Opoku VS， Nausch N， et al.多西环素治疗对曼索氏菌感染的疗效：加纳的一项开放标签随机试验。Am J Trop Med Hyg.2019;101: 84–92.pmid：31162017

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

7.Wanji S， Amvongo-Adjia N， Koudou B， Njouendou AJ， Chounna Ndongmo PW， Kengne-Ouafo JA， et al.丝虫ICT卡在喀麦隆罗亚罗亚和曼索氏菌流行区对比地区的交叉反应性：对中非区域淋巴丝虫病地图缩小的影响。Bottomley C，编辑。公共科学图书馆 Negl Trop Dis. 2015;9： e0004184.密码：26544042

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

8.Wanji S， Amvongo-Adjia N， Njouendou AJ， Kengne-Ouafo JA， Ndongmo WPC， Fombad FF， et al.Binax NOW丝虫病ICT卡与非Wuchereria bancrofti filariae交叉反应的进一步证据：Loa loa和Onchocerca ochengi的实验研究。寄生虫媒介。2016;9: 267.密码：27151313

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

9.Pion SD， Montavon C， Chesnais CB， Kamgno J， Wanji S， Klion AD， et al.用于诊断无班克罗夫提乌氏菌感染但高罗阿丝虫微丝虫血症患者的淋巴丝虫病的抗原检测阳性性。Am J Trop Med Hyg.2016;95: 1417–1423.密码：27729568

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

20米Shelley A， Coscarón S. Simuliid 黑蝇（Diptera： Simuliidae）和角蠓（Diptera： Ceratopogonidae）是阿根廷北部Mansonella ozzardi（线虫：Onchocercidae）的载体。梅姆·奥斯瓦尔多·克鲁兹。2001;96: 451–458.密码：11391415

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

11.蒂德威尔马，穆诺兹德奥约斯P，蒂德威尔马。曼索氏菌在哥伦比亚东部沃佩斯的血蝇组黑蝇物种中的发育。Am J Trop Med Hyg.1980;29: 1209–1214.密码：7004217

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

12.Shelley AJ， Dias APAL， Moraes MAP.Amazonicum组的模拟物种作为巴西亚马逊曼索氏菌的载体。Trans R Soc Trop Med Hyg.1980;74: 784–788.

查看文章谷歌学术搜索

13.埃伯哈德 ML， 拉柯特 CP， 卡茨 SP， 洛里 RC.评估贝夸尔蒂钩端菌作为海地奥扎尔迪曼索氏菌的潜在载体。Am J Trop Med Hyg.1983;32: 1013–1015.密码：6625054

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

14.Bassene H， Sambou M， Fenollar F， Clarke S， Djiba S， Mourembou G， et al. 塞内加尔农村曼索氏菌丝虫病的高患病率。Am J Trop Med Hyg.2015;93: 601–606.密码：26078318

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

15.Noireau F，Itoua A，Carme B.南刚果森林地区曼索氏菌丝虫病的流行病学。安特罗普医学寄生虫。1990;84: 251–254.密码：2222027

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

16.Pilotte N， Papaiakovou M， Grant JR， Bierwert LA， Llewellyn S， McCarthy JS， et al.使用下一代测序方法进行检测设计，改进了基于PCR的土壤传播蠕虫感染检测。阿尔博尼科·公共科学图书馆 Negl Trop Dis. 2016;10： e0004578.密码：27027771

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

17.Pilotte N， Maasch JRMA， Easton AV， Dahlstrom E， Nutman TB， Williams SA.靶向高度重复的种系 DNA 序列，以改进基于实时 PCR 的人类粪便蛔虫感染检测。坎塔塞西C，编辑。公共科学图书馆 Negl Trop Dis. 2019;13： e0007593.pmid：31329586

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

18.格兰特，皮洛特N，威廉姆斯SA。使用基因组学和生物信息学管道为土壤传播蠕虫开发敏感和物种特异性PCR诊断的案例。前热内特。2019;10: 883.密码：31608116

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

19.Lau CL，Won KY，Lammie PJ，Graves PM.美属萨摩亚的淋巴丝虫病消除：分子异种监测作为终局监测工具的评估。里纳尔迪·公共科学图书馆 Negl Trop Dis. 2016;10： e0005108.密码：27802280

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

20.Subramanian S， Jambulingam P， Krishnamoorthy K， Sivagnaname N， Sadanandane C， Vasuki V， et al.分子异种监测作为消除淋巴丝虫病全球方案的MDA后监测工具：在印度的一个评估单位进行现场验证。萨米·AM，编辑。公共科学图书馆 2020;14： e0007862.密码：31978060

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

21.Pi-Bansa S， Osei JHN， Joannides J， Woode ME， Agyemang D， Elhassan E， et al.使用异种监测实施社区媒介收集策略，以消除淋巴丝虫病。寄生虫媒介。2018;11: 672.密码：30587226

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

22.Colebunders R， Basá?ez M-G， Siling K， Post RJ， Rotsaert A， Mmbando B， et al.从河盲症控制到消除：浑水过桥。感染贫困。2018;7: 21.pmid：29587844

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

23.弗拉明克 J， 费舍尔 PU， 威尔 GJ.盘尾丝虫病消除计划的诊断工具。寄生虫学趋势。2015;31: 571–582.密码：26458784

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

24.皮洛特N，乌纳什TR，威廉姆斯SA。淋巴丝虫病和盘尾丝虫病分子异种监测的现状.趋势寄生虫。2017;33: 788–798.pmid：28756911

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

25.Cleaveland S， Sharp J， Abela-Ridder B， Allan KJ， Buza J， Crump JA， et al.“同一个健康”有助于在低收入和中等收入国家采取更有效和更公平的卫生方法。Phil Trans R Soc B. 2017;372： 20160168.密码：28584176

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

26.Minetti C， Pilotte N， Zulch M， Canelas T， Tettevi EJ， Veriegh FBD， et al.使用蚊子排泄物/粪便对人类丝虫和疟疾寄生虫进行DNA检测的现场评估。坎塔塞西C，编辑。公共科学图书馆 2020;14： e0008175.密码：32267840

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

27.Minetti C， Tettevi EJ， Mechan F， Prada JM， Idun B， Biritwum N-K， et al.消除触手可及：一项横断面研究，重点介绍了加纳农村八个社区导致持续性淋巴丝虫病的因素。Reithinger R，编辑。公共科学图书馆 Negl Trop Dis. 2019;13： e0006994.密码：30608931

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

28.Novak P， Neumann P， Pech J， Steinhaisl J， Macas J. RepeatExplorer：基于银河系的网络服务器，用于对下一代序列读取的真核重复元件进行全基因组表征。生物信息学。2013;29: 792–793.pmid：23376349

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

29.Novák P， ávila Robledillo L， Koblí?ková A， Vrbová I， Neumann P， Macas J. TAREAN：一种用于从未组装的短读段识别和表征卫星DNA的计算工具。核酸研究 2017;45： e111–e111.pmid：28402514

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

30.Papaiakovou M， Pilotte N， Grant JR， Traub RJ， Llewellyn S， McCarthy JS， et al.一种新颖的、物种特异性的实时 PCR 检测方法，用于检测人类粪便中新出现的人畜共患寄生虫 Ancylostoma ceylanicum。Bethony JM，编辑。公共科学图书馆 Negl Trop Dis. 2017;11： e0005734.pmid：28692668

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

31.祖尔奇 MF， 皮洛特 N， 格兰特 JR， 米内蒂 C， 雷默 LJ， 威廉姆斯 SA.选择和利用流行的、串联重复的基因组靶标，以改进基于实时 PCR 的蚊子 Wuchereria bancrofti 和恶性疟原虫检测。Carvalho LH，编辑。公共图书馆一号。2020;15： e0232325.密码：32357154

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

32.克莱尼 JL， 马林， 席尔瓦 TRR 达， 德梅代罗斯 JF， 佩索阿 FAC， 桑托斯 YV， 等.曼索氏菌 ozzardi 有丝分裂基因组和假基因表征为丝虫寄生虫系统学和 CO-1 条形码提供了新的视角。科学代表 2018;8： 6158.密码：29670192

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

33.Vaughan JA， Bell JA， Turell MJ， Chadee DD. 摄入的曼索氏菌（螺旋藻科：盘尾丝虫科）微丝蚴通过埃及伊蚊（双翅目：Culicidae）的中肠。J 医学恩托莫尔。2007;44: 111–116.

查看文章谷歌学术搜索

34.Turell MJ， Spielman A， Mather TN， Bailey CL. 登革热 2 病毒在埃及伊蚊中的传播增加与同时摄入马来布鲁吉亚微丝蚴有关。Am J Trop Med Hyg.1987;37: 197–201.密码：3605503

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

35.沃恩 JA，图雷尔 MJ。双重宿主感染：东部马脑炎病毒对由布鲁吉微丝蚴介导的伊蚊的感染性增强。Am J Trop Med Hyg.1996;54: 105–109.密码：8651361

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

36.Tegally H， San JE， Cotten M， Moir M， Tegomoh B， Mboowa G， et al.非洲不断发展的SARS-CoV-2疫情：来自迅速扩大的基因组监测的见解。科学。2022;378： eabq5358.密码：36108049

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

37.Mathison BA，Couturier MR，Pritt BS.微丝蚴的诊断识别和分化。卡夫CS，编辑。临床微生物学杂志。2019;57： e00706–19， /jcm/57/10/JCM.00706-19.atom.密码：31340993

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索