《用于筛选埃及伊蚊种群杀虫剂抗性突变的下一代靶向扩增子测序方法揭示了佛得角蚊子的rdl突变》期刊简介
用于筛选埃及伊蚊种群杀虫剂抗性突变的下一代靶向扩增子测序方法揭示了佛得角蚊子的rdl突变
艾玛·柯林斯，乔迪·费兰，马格达莱娜·胡布纳，安东·斯帕达尔，莫妮卡·坎波斯，丹尼尔·沃德，霍莉·阿克福德-帕尔默，安娜·丽塔·戈麦斯，凯莉·席尔瓦，劳拉·费雷罗·戈麦斯 ，塔恩·克拉克 ，苏珊娜·坎皮诺
发布时间：2022 年 12 月 13 日
抽象
伊蚊媒介传播许多引起全球健康问题的病毒，包括登革热、基孔肯雅热和寨卡病毒。这些媒介传播的病毒性疾病的治疗选择有限，疫苗的有效性也各不相同。因此，病媒综合管理是疾病控制的主要战略。然而，杀虫剂耐药性的日益出现和蔓延正在威胁病媒控制方法的功效。鉴定病媒群体中与耐药性相关的突变对于监测杀虫剂耐药性的发生和演变以及为控制策略提供信息非常重要。迫切需要快速和具有成本效益的基因组测序方法。在这里，我们提出了一种适应性强的靶向扩增方法，用于在下一代测序平台中经济高效地实施。这种方法可以鉴定埃及伊蚊中参与杀虫剂抗性的基因中的单核苷酸多态性（SNPs）和小插入和缺失（indels）。我们设计并测试了11个扩增子，其中包括ace-1（氨基甲酸酯靶标）、电压门控钠通道（vgsc;拟除虫菊酯、滴滴涕和有机氯）和rdl（狄氏剂）基因的片段;从而涵盖已建立的敲低抗性（kdr）突变（例如，S989P，I1011M / V，V1016G / I和F1534C），并有可能识别新的突变。扩增子测定采用内部条形码设计，便于以低成本对大量蚊子进行多重检测，并使用Illumina平台进行测序。我们的方法在152 Ae上进行了评估。在佛得角收集的埃及伊蚊，佛得角是一个有虫媒病毒爆发历史的群岛。扩增子序列数据揭示了146个SNP，包括vgsc基因中的4个非同义多态性，ace-1中的1个和先前与有机氯抗性相关的296S rdl突变。在98%的蚊子中发现了296S rdl突变，与过去使用有机氯化合物（例如滴滴涕）一致。总体而言，我们的工作表明，靶向扩增子测序是一种快速、稳健且经济高效的工具，可用于对杀虫剂耐药性进行高通量监测。
作者摘要
许多病毒，如登革热和寨卡病毒，都是由埃及伊蚊传播的。这些媒介传播的疾病是全世界热带和亚热带地区的主要公共卫生问题。减轻其负担的主要战略是病媒控制，包括通过施用杀虫剂。然而，许多蚊子种群已经对杀虫剂产生了耐药性。在这里，我们提出了一种快速，强大且具有成本效益的工具，可以筛选与许多埃及伊蚊的杀虫剂耐药性相关的基因，鉴定已知的抗性和新的突变。该测定将通过告知杀虫剂抗性突变在埃及伊蚊种群中的出现和传播来支持媒介控制策略。
引文： 柯林斯 EL， 费兰 JE， 胡布纳 M， 斯帕达尔 A， 坎波斯 M， 沃德 D， 等人. （2022） 用于筛选埃及伊蚊种群杀虫剂抗性突变的下一代靶向扩增子测序方法揭示了佛得角蚊子的 rdl 突变。PLoS Negl Trop Dis 16（12）： e0010935. https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0010935
编辑 器： Gordana Rasic，QIMR Berghofer医学研究所，澳大利亚
收到： 3月 30， 2022;接受： 11月 6， 2022;发表： 12月 13， 2022
版权： ? 2022 柯林斯等人。这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。
数据可用性： 所有文件均可从ENA数据库获得（入藏号ERS12467832至ERS12467857）。
资助：E.L.C.由医学研究委员会LiD博士生奖学金资助。J.E.P.由牛顿机构联系赠款（英国文化协会，第261868591号）资助。T.G.C.由英国MRC资助（拨款号。MR/M01360X/1、MR/N010469/1、MR/R025576/1 和 MR/R020973/1）。H.A.P和M.H由BBSRC LIDo博士生资助。SC由MRC英国赠款资助（参考MR / M01360X / 1，MR / R025576 / 1和MR / R020973 / 1）。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。
竞争利益： 提交人声明不存在相互竞争的利益。
介绍
媒介传播疾病对公共卫生构成重大风险，每年导致~70万例死亡[1]。引起登革热、寨卡和基孔肯雅热感染的节肢动物传播病毒（虫媒病毒）大大加重了全球疾病负担。伊蚊属的蚊子负责许多虫媒病毒的传播，与Ae。埃及伊蚊是最有能力的媒介之一。Ae的分布。近年来，埃及伊蚊数量急剧增加，这主要是由于它们适应城市环境和人类活动的全球化[2，3]。病媒控制策略对于预防虫媒病毒传播至关重要，这主要是由于缺乏有效的疫苗和可用的抗病毒药物。病媒控制主要涉及使用杀虫剂，包括喷洒或处理蚊帐[4，5]。然而，全世界大量使用杀虫剂导致对拟除虫菊酯、有机氯、氨基甲酸酯、新烟碱类和有机磷酸盐产生耐药性[6，7]，这威胁到病媒控制运动对重要病媒传播疾病的有效性。
杀虫剂耐药的主要机制是靶位点、代谢和表皮以及行为回避[6，8]。靶位点耐药是由编码杀虫剂靶向蛋白的基因的点突变引起的，包括电压门控钠通道（VGSC基因）、乙酰胆碱酯酶（ACE-1）和γ-氨基丁酸（GABA）受体（对狄氏剂位点RDL的耐药性）[9]。VGSC蛋白存在于神经系统中，是滴滴涕和拟除虫菊酯的靶标。对这两种杀虫剂的敲低抗性（kdr）与许多昆虫中vgsc基因的多个靶位点突变有关[9]。乙酰胆碱酯酶 （AChE） 酶水解突触间隙处的神经递质乙酰胆碱，从而终止神经信号。有机磷酸盐和氨基甲酸酯杀虫剂与AChE结合，从而破坏神经冲动并最终导致死亡。编码AChE的ace-1基因（G119S）中的单个靶位点突变已被证明可抑制包括Ae在内的许多蚊媒的杀虫作用[10，11]。埃及伊蚊[12]。最后，rdl基因突变（例如A301S黑腹果蝇，包括Ae在内的许多蚊子物种中的A296。埃及伊蚊，埃。白纹和阿拉伯按蚊[13]和V327I An。Funestus [14]），与按蚊、伊蚊和库蚊媒介对有机氯杀虫剂的耐药性有关[15-17]。
目前鉴定杀虫剂耐药性的方法涉及生物和生化测定[18-20]，耗时且需要多次重复，并且涉及蚊子击倒的主观判断。此外，生物测定通常只能在频率已经很高时才检测耐药性，如果耐药等位基因的频率较低，则可能需要分子方法[21，22]。已经开发了用于检测杀虫剂耐药相关突变的分子方法，当已知预测病媒控制干预失败的诊断标志物时，分子方法可以成为监测耐药等位基因的有效方法[10，23-25]。鉴于最近分子技术的创新与成本降低，基于杀虫剂耐药性的分子基础的检测可能是支持监测的有效方法。这项创新将使公共卫生组织能够监测已知耐药突变的出现和传播，并检测新遗传多态性的出现。此外，除了药敏性的生物和生化测定外，分子监测还可以识别新的耐药性标志物，并提供对作用机制的见解。
扩增子测序是一种靶向的下一代测序方法，可以高通量检测特定感兴趣基因组区域中的低频变异。在这里，我们描述了一种靶向Ae的vgsc，ace-1和rdl位点的多重扩增子测序方法。埃及伊蚊。这些测定针对这三个基因的11个基因组区域，在这些区域中，伊蚊和其他载体中报告了与杀虫剂耐药性相关的突变。双索引方法与单个条形码系统一起使用，允许对多个PCR产物进行合并和同时测序。序列数据随后从原始序列数据中解复用到单个蚊子和基因，提供了一种快速且具有成本效益的监测方法来检测与杀虫剂耐药性有关的突变。为了证明我们方法的实用性，它被应用于Ae。来自佛得角的埃及伊蚊，佛得角是一个距离西非海岸500公里的群岛。佛得角曾发生登革热和寨卡疫情[26-28]。2009年，诊断出超过21，000例登革热病例，2015年寨卡流行导致至少7，580例报告病例。为了预防病媒传播的疾病，佛得角有应用多种策略来防治按蚊、伊蚊和库蚊病媒的历史，包括过去使用滴滴涕（有机氯）以及最近喷洒的甲美磷（有机磷酸盐）和溴氰菊酯（拟除虫菊酯）杀虫剂[29]。与按蚊相比，佛得角和整个非洲对伊蚊杀虫剂的耐药性和相关突变知之甚少[30]。佛得角低频报道了VGSC突变（例如V1016I、F1534C）对拟除虫菊酯具有抗性[26]，但没有研究其他突变。在Illumina测序平台上使用基于双指数扩增子的方法，我们筛选了与Ae中杀虫剂抗性相关的已知突变。埃及伊蚊来自佛得角。通过这项工作，我们证明了我们的方法在检测杀虫剂抗性突变以及新型多态性方面的实用性，为媒介传播的疾病控制工作提供信息。
方法
扩增子引物设计
从OVID检索和近期综述中提取了伊蚊载体中靶位点杀虫剂抗性突变列表[9，31–41]。总体而言，发现了12个与杀虫剂耐药性相关的突变，其中9个在vgsc中（V410L，G923V，L982W，S989P，I1011V/M，V1016I / G，T1520I，F1534C / L，D1763Y），rdl（A301S）中1个，ace-1（G119S）中1个。从公开的Ae组装中提取vgsc（AAEL023266-RL），ace-1（AAEL000511-RJ）和rdl（AAEL008354-RA）的序列。埃及伊蚊（LVP AGWG）。通过对Ae进行BLAST序列比对来鉴定感兴趣的突变。埃及伊蚊参考基因组与描述突变的物种序列（见S1表）。
提供了扩增子方法的摘要（S1图）。使用PrimerBLAST软件设计正向和反向引物，以扩增含有已知SNP位点或感兴趣区域的450-500bp区域。引物的长度范围为18-25bp，设计为具有相似的退火条件以允许多重（表1）。在三个基因中选择了靶向11个区域的引物。使用赛默飞世尔多重引物分析仪检查每种多重组合中的引物交叉杂交。每个多重PCR使用至少3个靶标的组合（表1）。为了允许合并单个蚊子PCR产物，在每个引物的5'端添加6bp条形码（正向和反向唯一条形码），以区分测序后的单个蚊子产物（S2表）。对于每个蚊子DNA样本，在所有位点上分配了正向和反向6bp条形码，从而可以汇集许多不同的蚊子PCR产物。~30bp的部分Illumina尾巴也被添加到每个引物的5'末端，就在6bp条形码引物标签之后，以与商业测序兼容。此功能允许使用任何Illumina序列器，内部或由商业提供商对池进行排序。商业测序公司进行的第二次PCR能够在必要时添加Illumina适配器和索引以合并实验（S1图）。
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表 1. 扩增子区域，先前描述的突变和引物序列。
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蚊虫采集、DNA 提取、PCR 和纯化
Ae 的合并样本。埃及伊蚊用作对照，以测试扩增子测序引物。嘶。埃及伊蚊是在佛得角圣地亚哥岛的普拉亚市收集的[42]。蚊子在形态上都被鉴定为Ae。埃及伊蚊。根据制造商对Qiagen DNeasy血液和组织试剂盒的说明提取蚊子DNA。使用Qubit测定DNA浓度。多重PCR在以下条件下进行：初始变性（98.0°C，30秒），然后进行35个变性循环（98.0°C，10秒），退火（60.4°C，70秒）和延伸（72.0°C，90秒）。每个反应包括来自Q5高保真PCR试剂盒（英国新英格兰生物实验室）的试剂，4μlDNA模板和0.5μl每个正向和反向引物，浓度为10pmol/μl。进行了三次多重PCR（表1）。PCR产物在SYBR安全（英国剑桥生物科学）1%琼脂糖凝胶和100bp分子量标准上可视化。用AMPure XP磁珠（贝克曼库尔特）纯化PCR产物，比例为0.8：1（微珠与DNA）。
测序和生物信息学分析
使用Qubit 2.0荧光计HS DNA试剂盒（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆赛默飞世尔）测试纯化PCR产物的DNA浓度。DNA浓度在7.9和47.7ng / μl之间变化。将所有PCR稀释并以相等浓度分组，以在25μl总体积中形成20ng / μl的总池，包含约220个扩增子（每个池20个蚊子中的11个扩增子= 220个扩增子）。第二个PCR将IIlumina适配器和索引插入池实验（无需进一步的文库制备），这允许在同一次Illumina运行中对许多池进行测序。第二个PCR步骤，然后是扩增子测序，由Genewiz（来自Azenta生命科学）进行，每个池的成本为~60美元（~220个扩增子，每个扩增子0.30美元）。每个池至少获得 50，000 个读取（250bp 读取对），相当于每个扩增子平均 ~220 个读取。从测序池中，使用内部管道（https://github.com/LSHTMPathogenSeqLab/amplicon-seq）根据每个正向和反向引物中的6bp条形码引物标签对单个蚊子数据进行解复用，从而消除了条形码之间的任何错误标记。序列被修剪并与 Ae 对齐。埃及伊蚊参考资料（LVP AGWG）。使用FastQC（v 0.11.5）检查序列数据的质量。使用BWA-MEM算法（v0.7.17，默认参数）将配对的末端读取映射到参考序列。SNP和小插入缺失使用freebayes（v1.3.5，—单倍型长度-1）和GATK HaplotypeCaller（v 4.1.4.1，默认参数）软件工具调用。在任一软件调用者中检测到的变体被用作跨扩增子表征的初始集。使用过滤器鉴定高质量的SNP，这些过滤器包括每个调用碱基的最低phred质量得分为30，最小深度为50个读数，最小等位基因深度为10倍。仅保留存在于不止一只蚊子中且存在于两个独立池中的SNP。总结了生物信息学管道（S2图）。分析了每种SNP的等位基因深度和频率分布，以分配二倍体生物所述基因分型呼叫的阈值临界值[43]。标识的SNP的注释是使用bcftools csq（v1.1.0，默认参数）调用的。使用单个正向或反向引物对38只蚊子进行Sanger测序，以确认ace和rdl扩增子区域的扩增子测序结果。进行卡方检验以评估与哈代-温伯格均衡的可能偏差。田岛的D检验用于区分随机进化（“中性”）和非随机过程（例如，选择，人口扩张/收缩）下的序列。该测试是使用MEGA11软件实现的[44]。
结果
靶标扩增子表示和变体调用
在vgsc（9个扩增子跨越9个已知杀虫剂突变的位置）、ace-1（1个扩增子;1个已知突变）和rdl（1个扩增子;1个已知突变）位点（见图1）上共设计了11~500bp扩增子测定。每个扩增子测定都单独验证并跨多重PCR进行验证，并且可以扩增在三种不同PCR反应中多重的11个位点（表1）。
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图1. ace-1、vgsc 和 rdl 基因的伊蚊突变和引物位置。
先前描述的与杀虫剂耐药性相关的突变用红色三角形表示，引物用箭头表示。扩增的第一个和最后一个密码子位于每个扩增子图下。
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共152个Ae。来自佛得角的埃及伊蚊使用多位点扩增子测定法单独处理。对于每只蚊子，获得11个扩增子，其中包含相同的条形码组合（正向和反向6bp条形码引物标签）（S2表）。每个池中的11个扩增子对每只蚊子使用独特的组合。每个池由220个扩增子（20只蚊子的11个位点）组成，并在Illumina平台上进行测序。选择该数字以获得每个扩增子的高覆盖率，每个测序池至少获得50，000个读段（每个扩增子平均220个读段）（参见方法）。开发了一种生物信息学管道，从原始测序数据中解复用每个蚊子数据（使用6bp条形码引物标签），去除错误标记序列，执行与参考菌株的比对，调用变异和基因型，同时去除低质量数据和变异（见方法）。该管道揭示了基因组覆盖率的一些细微差异，反映了由于引物结合效率的预期差异，区域扩增的差异。总体而言，DomainIIExon26Aeg（vgsc基因）的平均覆盖率最低，为120倍，而DomainIIIExon36（vgsc基因）的放大子之间的覆盖率不同，平均覆盖率高出近20倍。所有扩增子的平均读取计数为936倍（表2）。
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表 2. 11个扩增子及其在152个佛得角Ae中的测序性能。埃及伊蚊。
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共鉴定出146个SNP变异体。为了验证我们的管道，87 Ae。对埃及伊蚊个体进行重新测序并添加到不同的池中，导致所有SNP得到确认，基因型调用的一致性为84.2%。仅在纯合子和杂合子呼叫之间的五个位置观察到基因型差异，并且仅在等位基因比为0.8-1.0的蚊子中观察到，其中所有测试蚊子中的一个等位基因和重复存在于大多数总读数中。
此外，对38只蚊子进行了Sanger测序，以确认ace和rdl amplicon区域的扩增子测序结果。观察到ace扩增子的Sanger测序和扩增子测序之间的基因分型一致性为90%。对于在rdl基因中检测到的唯一SNP，两种方法之间观察到67%的基因型一致性。同样，使用扩增子测序的杂合子测序在杂合子蚊子中观察到不一致的基因型调用，这些杂合子蚊子的等位基因比接近0.8，显示总读段中增加了一个等位基因。如前所述[45，46]，错误标记重排可能导致蚊子之间等位基因频率的意外分布和基因型调用的差异，特别是导致杂合基因型过多。通过根据其他二倍体生物[43]描述的等位基因比率分配阈值临界值，我们可以识别并重新分配最可能的基因型。因此，通过将等位基因比为0.8-1的杂合基因型召回纯合子，获得了100%的基因型一致性。所有基因的等位基因频谱显示，接近中性的低频等位基因（~40%的SNPS，次要等位基因频率（MAF）<0.1）接近中性（Tajima D' = -0.56;接近于零）。HWE有一些扭曲（37%的外显子和43%的内含子SNP，P<0.001）（表3），这可能是扩增子方法导致杂合子过量的结果。这些结果需要在更大规模的研究中进一步调查，并纳入更多的蚊子世代。
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表 3. Ae的每个基因中同义和非同义SNP的位置和频率。埃及伊蚊。
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单核苷酸单核苷酸菌和杀虫剂抗性变异株
分析管道检测到146个SNP变体，其中45个是外显子。在每个区域中鉴定出的SNP数量变化很大，其中大多数在vgsc外显子35扩增子（38个SNP，11个外显子）中最少，在rdl扩增子（1个外显子SNP）中最少（表3和图2）。几乎所有的外显子SNP都导致同义变化（39个SNP），6个导致错义遗传多态性。13个SNP发生在预测的剪接区域，使用bcftools csq工具确定。剪接区域的多态性可能对基因功能影响不大，但可以改变剪接模式，例如跳过外显子或在mRNA中保留大段内含子，这会影响蛋白质功能[47]。需要进一步的功能研究来证实剪接区域SNP的计算机预测。
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图2. 在11个扩增子中检测到的SNP分布。
灰色阴影条表示外显子区域。黑点表示已识别错义突变的位置，灰点是鉴定出的其他SNP，十字标记与杀虫剂耐药性相关的已知突变的位置。右侧的值是每个扩增子中识别的SNP数量。
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在vgsc基因中发现的多态性最多，主要是由于靶向这些位点的引物数量较多（11个扩增子中的9个），鉴定出142个SNP。未鉴定先前与杀虫剂耐药性相关的vgsc基因或ace基因突变（S1表）。在vgsc基因中发现了4个氨基酸取代（V977L、K1577T、N1595T、P1612H）。值得关注的是替代V977L，因为它与已知突变L978W（与黑腹果蝇L982W的位置同源）相邻，据报道，该突变可赋予拟除虫菊酯抗性[48，49]。
在rdl扩增子中，我们鉴定了氨基酸取代A296S，已知与有机氯抗性有关[33]。A296S突变（类似于D中的位置301。黑腹肌）在47只蚊子中发现（47/48;70.1%杂合子;27.1%突变纯合子）。在ace-1扩增子中，发现了3个SNP，其中2个是同义词（T506T，D444D），一个是错义翻译（L466V）。对于先前在印度尼西亚蚊子中报道的T506T突变（161500076 T>A;n = 108）[50]，所有蚊子都是非参考等位基因的纯合子。L466V氨基酸变化在低频率（1/105，0.95%;100%杂合子）下发现。已知的G119S杀虫剂抗性突变（G448S在Ae中的位置。埃及伊蚊）在这里调查的任何蚊子中都没有检测到。
讨论
杀虫剂耐药性对全世界病媒控制规划构成威胁。鉴定耐药性的传统方法可能既主观又耗时，因此分子监测正成为确定杀虫剂耐药性广泛分布和补充诊断性生物测定的一种有吸引力的选择。我们的研究成功表明，多位点靶点扩增子测序可用于鉴定Ae中杀虫剂抗性多态性。埃及伊蚊以稳健、经济高效和高通量的方式饲养。通过在 Ae 上测试该方法。来自佛得角圣地亚哥普拉亚市的埃及伊蚊，有可能在vgsc，rdl和ace-1位点中鉴定出146个SNP，包括与有机氯杀虫剂耐药性相关的rdl A301S突变。这一观察结果可能是由于佛得角过去使用过有机氯（例如滴滴涕）。据报道，与其他拟除虫菊酯耐药人群相比，对这种杀虫剂的耐药性对健康的影响最小[51]。没有检测到与杀虫剂耐药性相关的其他已知多态性。之前在圣地亚哥进行的一项研究在2017-2018年间采集的样本中检测到来自圣洛伦索-杜斯奥尔冈斯的两个杂合个体的kdr多态性1016I，在普拉亚的蚊子中检测到低频（≤2.0%）的1534C突变，但在前几年（2007-2016年）未观察到这些变异[26，42，52].这些结果表明，该岛最近起源于kdr突变，这可能是一个独立的事件或来自西非大陆邻国的引入。佛得角位于塞内加尔海岸~500公里处，在2017年进行的一项调查中未发现这些突变[53]。这些突变在喀麦隆、刚果和中非共和国也没有发现，但在加纳和布基纳法索的报道频率很高[54-57]。
我们还确定了进一步的多态性，大多数在内含子区域，一些在预测的剪接区域或导致同义变化，并且在ace-1和vgsc基因中只有五个非同义氨基酸取代。例如，vgsc基因中的取代V977L紧挨着先前报道的L978W（在D中的位置L982W。黑腹肌）据报道，拟除虫菊酯具有抗性[48，49]。ace-1基因中也有同义变异（Ae中的T506T。埃及伊蚊参考文献），这在印度尼西亚的 ae 中有所描述。埃及伊蚊抗性人群[50]，并且可能处于具有功能多态性的高连锁不平衡状态，但这些结果尚未在其他研究中得到证实。
鉴定和探索这些额外的多态性可能有助于了解这些位点的进化及其可能参与杀虫剂耐药性机制，包括通过与其他多态性或顺式调节元件的联系以及替代转录物的产生。进一步的基因型-表型研究对于探索这些突变是否可能参与杀虫剂耐药性至关重要。
更一般地说，对伊蚊种群杀虫剂耐药性的研究主要集中在vgsc基因的kdr变异上，而很少关注这里研究的其他位点。在整个西非和更广泛的非洲大陆，杀虫剂耐药性的分子检测有限，只有少数研究侧重于有限数量的多态性，通常使用基因分型方法。例如，最近在塞内加尔、喀麦隆、加纳、佛得角和象牙海岸进行的研究[42，53-55，58]仅关注对Ae中kdr突变F1534C、V410L、V1016G/I和S989P的研究。埃及伊蚊。有必要对vgsc基因和其他位点进行更多的调查，以了解遗传变异的频率，出现和传播及其与杀虫剂耐药性的关联。
如此处所示，多位点扩增子方法提供了同时在多个位点和大量样本中告知已知和发现新遗传变异的可能性。检查已知和新的SNP是非常有价值的，因为在杀虫剂耐药性中观察到的巨大无法解释的差异。这些测定具有适应性，可以扩展到包括与耐药性相关的新位点。例如，目前的面板没有考虑耐药性的代谢机制，其涉及蚊子中解毒酶的上调，例如细胞色素P450。只有少数SNP与这种类型的耐药性有关，所涉及的潜在基因尚不清楚，但我们的测定可以通过进一步了解来扩展。序列捕获和深度测序已应用于Ae。埃及伊蚊研究解毒酶的拷贝数变异（CNV）和多态性[59]。然而，该系统需要生产具有重叠RNA探针的捕获文库，成为比使用多重PCR测定更昂贵和更复杂的方法。定量PCR，如Cattel等人[60]开发的PCR，仍然是Ae中快速检测和拷贝数定量的主要方法。埃及伊蚊。
多位点PCR扩增方法可以应用于多个位点，并且可以汇集大量样品，这些样品可以通过独特的条形码组合进行区分。此外，无需为 Illumina 测序准备文库，因为 PCR 阶段已经包含与 Illumina 兼容的流通池衔接器序列，从而产生了多位点扩增子池，商业提供商可以以相对较低的成本（每个扩增子 <0.50 美元）进行测序。也可以使用便携式测序仪（例如，Oxford Nanopore MinIon）对相同的扩增子进行测序，从而在现场对杀虫剂耐药性进行更快速和更翔实的监测，并改善对新出现的耐药性的反应。与此相关的是，有可能在PCR步骤之前汇集蚊子，以快速监测总体种群，而不是像这里那样进行单个蚊子扩增[21]。这有助于应用于伊蚊传播疾病流行的低收入环境，知情病媒控制的益处将更大。具体而言，鉴定重要的杀虫剂抗性突变将为在完全无效之前改变杀虫剂类别的必要性提供早期预警和证据。
我们的扩增方法的主要局限性是事先需要有关哪些位点与杀虫剂耐药性相关的信息。杀虫剂生物测定法无法替代确定表型反应。多位点扩增方法可用于补充生物测定，并获得基因分型数据和表型信息，为寻求了解杀虫剂抗性分子机制的功能工作提供信息。我们的检测目前未检测到代谢抵抗的基因组贡献者;但是，我们的方法非常灵活，并且可以在需要时将更多感兴趣的区域添加到面板中。针对可能发生突变的区域的方法设计也是有益的，因为这意味着一些新发现的突变已经在面板中捕获。例如，最近在Ae中描述了一种新的突变（A1007G）。据推测，埃及伊蚊与滴滴涕抗性有关，并且已经被DomainII_F4扩增子捕获，尽管在我们的蚊子中没有检测到[61]。此外，有可能将病原体筛查与杀虫剂耐药性特征相结合，以便在综合监测规划中监测虫媒病毒和其他病原体。已经证明，使用扩增子测序可以从人血液中检测疟疾寄生虫[62，63]。
总体而言，我们的工作概述了一种经济高效、稳健且高通量的 Ae 筛选方法。埃及伊蚊已知和推定的新型杀虫剂抗性突变。5'标签条形码的集成允许在下一代测序应用中汇集许多蚊子和位点，并在分析过程中进行随后的分离。这些分子和生物信息学方法可以通过媒介控制计划实施，以监测杀虫剂耐药性并提高其他方法的功效。将该方法扩展到其他基因组学区域、病原体和其他媒介将进一步有助于支持病媒传播疾病的控制战略并减轻其全球负担。
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多重扩增子测序的步骤。
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S1 图 多重扩增子测序的步骤。
在第一个PCR中，靶基因被扩增，部分Illumina尾巴和6bp条形码包含在引物中以区分单个样品。在第二步中，扩增子在样品中汇集。之后，在每个池中进行第二次PCR，添加Illumina适配器和索引，并准备使用Illumina平台对池进行测序。
https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0010935.s001
（提夫）
S2 图 生物信息学管道流程图。
https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0010935.s002
（提夫）
S1 表。 参考生物体和相应Ae的氨基酸突变位置。埃及伊蚊。
https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0010935.s003
（文档）
S2 表。 6bp条形码和部分Illumina尾部添加到正向和反向引物的5'端。
https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0010935.s004
（文档）
S3 表。 在拼接区域中检测到的 SNP 的详细信息。
https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0010935.s005
（文档）
引用
1.世界卫生组织。媒介传播疾病。2020.
2.Kraemer MUG， Sinka ME， Duda KA， Mylne AQN， Shearer FM， Barker CM， et al.虫媒埃及伊蚊和艾伊蚊的全球分布。白纹鱼。生活。2015;4.密码：26126267
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
3.布朗 JE， 埃文斯 BR， 郑 W， 奥巴斯 V， 巴雷拉-马丁内斯 L， 埃吉兹 A， 等.人类影响塑造了埃及伊蚊（登革热和黄热病蚊子）的历史和近期演变。演化。2014;68: 514–25.密码：24111703
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
4.世界卫生组织。疟疾病媒控制指南。2019.
5.Achee NL， Gould F， Perkins TA， Reiner RC， Morrison AC， Ritchie SA， et al.对登革热预防病媒控制的重要评估。公共科学图书馆 Negl Trop Dis. 2015;9： 1–19.pmid：25951103
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
6.世界卫生组织。《2010-2016年疟疾病媒杀虫剂耐药性全球报告》。世界治愈器官。世界卫生组织;2018.
7.Rivero A， Vézilier J， Weill M， Read AF， Gandon S. 杀虫剂控制病媒传播疾病：杀虫剂耐药性何时成为问题？公共科学图书馆病理学。2010;6： e1001000.密码：20700451
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
8.糸川 K， 关冢 T， 前川 Y， 八津 K， 驹形 O， 杉浦 M， 等.使用靶标捕获测序和分析管道 MoNaS 通过基因组 DNA 对全电压门控钠通道基因进行高通量基因分型，以发现新的杀虫剂抗性突变。公共科学图书馆 Negl Trop Dis. 2019;13.密码：31738756
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
9.Moyes CL， Vontas J， Martins AJ， Ng LC， Koou SY， Dusfour I， et al.感染人类虫媒病毒的主要伊蚊媒介中杀虫剂耐药性的当代现状。公共科学图书馆 Negl Trop Dis. 2017;11： 1–20.pmid：28727779
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
10.威尔 M， 马尔科姆 C， 钱德雷 F， 莫根森 K， 贝托米尤 A， 马奎恩 M， 等.ace-1的独特突变具有高杀虫剂抗性，在蚊子媒介中很容易检测到。2004;13: 1–7.可用： https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/14728661/
查看文章谷歌学术搜索
11.Weill M， Luffalla G， Mogensen K， Chandre F， Berthomieu A， Berticat C， et al.蚊媒中的杀虫剂耐药性。自然界。2003;423: 136–137.密码：12736674
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
12.Muthusamy R，Shivakumar MS.来自印度泰米尔纳德邦三个地区的埃及伊蚊（L.）（双翅目：Culicidae）对temephos的易感性状态。J Vector Borne Dis. 2015;52： 159–165.可用： https://www.researchgate.net/publication/279631792_Susceptibility_status_of_Aedes_aegypti_L_Diptera_Culicidae_to_temephos_from_three_districts_of_Tamil_Nadu_India pmid：26119549
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
13.谭文林， 李振兴， 王志明， 刘MD， 董永东， 冯晓燕， 等.在中国广西按蚊中，使用三种新的基因分型方法首次检测电压门控钠通道中的多个敲低抗性（kdr）样突变。J 医学恩托莫尔。2012;49: 1012–1020.密码：23025181
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
14.旺吉CS，达比雷RK，图库尔Z，欧文H，朱阿卡R，摩根JC。在非洲疟疾媒介按蚊中赋予狄氏剂抗性的GABA受体突变的鉴定和分布。昆虫生化分子生物学. 2011;41： 484–491.密码：21501685
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
15.Remnant EJ， Good RT， Schmidt JM， Lumb C， Robin C， Daborn PJ， et al.黑腹果蝇主要杀虫剂靶位点Rdl的基因复制。美国国家科学院院刊，2013;110：14706–14710。pmid：23959864
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
16.Asih PB， Syahrani L， Rozi IE， Pratama NR， Marantina SS， Arsyad DS， et al.印度尼西亚按蚊疟疾媒介中存在Rdl突变等位基因。马拉尔杂志 2012;11： 57.密码：22364613
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
17.肖特科斯基 F， 李 H -J， 张 H -G， 杰克逊 MB， 弗兰奇-康斯坦特 RH.来自蚊子埃及伊蚊的抗杀虫剂GABA受体的功能表达。昆虫分子生物学. 1994;3： 283–287.密码：7704314
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
18.谁。疟疾病媒蚊子杀虫剂耐药性监测测试程序 全球疟疾规划。2016.
19.谁。监测和管理伊蚊种群中的杀虫剂耐药性。谁。2016;16: 7.
20.Dusfour I， Vontas J， David J-P， Weetman D， Fonseca DM， Corbel V， et al.虫媒病毒主要伊蚊媒介中杀虫剂耐药性的管理：进展和挑战。元首H-P，编辑。公共科学图书馆 Negl Trop Dis. 2019;13： e0007615.密码：31600206
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
21.Mavridis K， Wipf N， Müller P， Traoré MM， Muller G， Vontas J. 冈比亚按蚊杀虫剂抗性突变的检测和监测：个体与混合标本。基因（巴塞尔）。2018;9: 1.–10.密码：30282959
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
22.卢卡斯 ER， 罗基特 KA， 林德 A， 埃桑多 J， 格里萨莱斯 N， 基梅 B， 等.一种高通量多位点杀虫剂抗性标记面板，用于跟踪冈比亚按蚊中耐药性的出现和传播。科学报告 2019 91.2019;9: 1–10.密码：31527637
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
23.Donnelly MJ，Isaacs AT，Weetman D.疟疾媒介中杀虫剂耐药性的分子诊断的鉴定，验证和应用。趋势寄生虫。2016;32: 197.pmid：26750864
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
24.琼斯 CM， 利亚纳帕蒂拉纳 M， 阿戈萨 FR， 韦特曼 D， 兰森 H， 唐纳利 MJ， 等.与冈比亚按蚊电压门控钠通道突变 （N1575Y） 相关的正选择足迹。美国国家科学院院刊 2012;109： 6614–6619.密码：22493253
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
25.马丁内斯-托雷斯 D， 钱德雷 F， 威廉姆森 MS， 达里特 F， 贝尔热 JB， 德文郡， 等.主要疟疾媒介冈比亚按蚊中拟除虫菊酯敲低抗性（kdr）的分子表征 昆虫分子生物学. 1998;7： 179–184.密码：9535162
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
26.Ayres CFJ， Seixas G， Borrego S， Marques C， Monteiro I， Marques CS， et al.V410L敲低抗性突变发生在西非和中非埃及伊蚊的岛屿和大陆种群中。博尼佐尼M，编辑。公共科学图书馆 2020;14： e0008216.密码：32384079
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
27.Louren?o J， Monteiro M， Tomás T， Monteiro Rodrigues J， Pybus O， Rodrigues Faria N. 西非佛得角群岛寨卡病毒疫情的流行病学.公共科学图书馆。2018;10.密码：29637009
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
28.萨尔盖罗 P， 塞拉诺 C， 戈麦斯 B， 阿尔维斯 J， 索萨 CA， 阿贝卡西斯 A， 等.佛得角群岛（西非）埃及伊蚊、登革热和寨卡蚊媒介的系统地理学和入侵历史。应用电子学报 2019;12： 1797–1811.密码：31548858
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
29.皮雷斯 S， 阿尔维斯 J， 迪亚一世， 戈麦斯 LF.佛得角普拉亚市蚊媒对Temephos和苏云金芽孢杆菌的易感性。公共图书馆一号。2020;15： e0234242.密码：32520941
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
30.Weetman D， Kamgang B， Badolo A， Moyes C， Shearer F， Coulibaly M， et al. 非洲伊蚊和伊蚊传播虫媒病毒：当前和未来威胁。国际环境研究公共卫生。2018;15: 220.邮编：29382107
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
31.Haddi K， Tomé HV V.， Du Y， Valbon WR， Nomura Y， Martins GF， et al.在埃及伊蚊的钠通道中检测新的拟除虫菊酯抗性突变（V410L）：蚊子控制的潜在挑战。科学代表 2017;7： 46549.密码：28422157
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
32.刘文林， 文讷秀文英， 林国林， 陈天强， 梁春生， 陈春丹， 等.马来西亚白纹伊蚊γ氨基丁酸（GABA）受体A302S突变的首次分子基因分型—PubMed。特罗普生物医学。2015;32.
查看文章谷歌学术搜索
33.Thompson M，Shotkoski F，Ffrance-Constant R.黄热病蚊子埃及伊蚊的环二烯杀虫剂抗性基因的克隆和测序。二月刊 1993;325： 187–190.
查看文章谷歌学术搜索
34.萨维德拉-罗德里格斯 K， 乌达内塔-马尔克斯 L， 拉贾蒂莱卡 S， 莫尔顿 M， 弗洛雷斯 AE， 费尔南德斯-萨拉斯一世， 等.与拉丁美洲埃及伊蚊中拟除虫菊酯抗性的电压门控钠通道基因突变。昆虫分子生物学. 2007;16： 785–798.密码：18093007
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
35.Brengues C， Hawkes NJ， Chandre F， McCarroll L， Duchon S， Guillet P， et al.埃及伊蚊中的拟除虫菊酯和滴滴涕交叉耐药性与电压门控钠通道基因的新突变相关。Med Vet Entomol.2003;17: 87–94.pmid：12680930
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
36.Srisawat R， Komalamisra N， Eshita Y， Zheng M， Ono K， Itoh TQ， et al.耐溴氰菊酯的埃及伊蚊（双翅目：Culicidae）中电压门控钠通道基因结构域II中的点突变。应用动物学. 2010;45： 275–282.
查看文章谷歌学术搜索
37.亚诺拉 J， 松布恩 P， 沃尔顿 C， 纳柴文 W， 宋旺 P， 普拉潘塔达拉 L 艾德.高通量测定，用于检测耐氯菊酯埃及伊蚊中电压门控钠通道基因中的 F1534C 突变以及该突变在整个泰国的分布。Trop Med Int Health.2011;16: 501–509.密码：21342372
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
38.常春， 沈伟强， 王桦， 林永华， 许珂， 戴文.电压门控钠通道中的新型氨基酸取代与埃及伊蚊对氯菊酯的敲低抗性有关。昆虫生物化学分子生物学. 2009;39： 272–278.pmid：19171193
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
39.Kushwah RBS，Dykes CL，Kapoor N，Adak T，Singh OP.在印度埃及伊蚊中存在拟除虫菊酯抗性和两种敲低抗性（kdr）突变F1534C和新型突变T1520I的存在。公共科学图书馆 Negl Trop Dis. 2015;9： e3332.密码：25569164
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
40.格拉纳达 Y， 梅希亚-哈拉米略 A， 斯特罗德 C， 特里亚纳-查韦斯 O.来自埃及伊蚊自然种群的钠通道基因中的点突变V419L参与了哥伦比亚对λ-氰氟氰菊酯的耐药性。昆虫。2018;9: 23.密码：29443870
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
41.库什瓦 RBS， 考尔 T， 戴克斯 CL， 拉维 库马尔 H， 卡普尔 N， 辛格 OP.埃及伊蚊的电压门控钠通道中出现了一种新的抗敲低性（kdr）突变F1534L，与F1534C，S989P和V1016G共同发生。寄生媒介。2020;13.密码：32600469
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
42.坎波斯 M， 沃德 D， 莫拉莱斯 RF， 戈麦斯 AR， 席尔瓦 K， 塞普尔韦达 N， 等.佛得角普拉亚市埃及伊蚊种群监测：寨卡病毒感染、杀虫剂耐药性和遗传多样性。寄生虫和媒介。2020;13.密码：32958043
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
43.Corrêa RA， Santos D， Goldman GH， Ria?o-Pachón DM. ploidyNGS：使用下一代测序数据直观地探索倍性。2016.
查看文章谷歌学术搜索
44.Tamura K，Stecher G，Kumar S. MEGA11：分子进化遗传学分析第11版。分子生物学。2021;38: 3022–3027.密码：33892491
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
45.Esling P， Lejzerowicz F， Pawlowski J. 用于高通量扩增子测序的精确多路复用和滤波。核酸研究 2015;43.可用： /pmc/articles/PMC4357712/ pmid：25690897
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
46.Fiévet A， Bernard V， Tenreiro H， Dehainault C， Girard E， Deshaies V， et al. ART-DeCo：在诊断性下一代测序分析中检测和表征DNA样品交叉污染的简单工具。欧 J 哼哼热内。2019;27: 792–800.pmid：30683922
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
47.Djihinto O，Saizonou HDM，Djogbenou LS，Nolan T，Lee Y.双性（dsx）基因剪接位点中的单核苷酸多态性（SNP）及其在疟疾媒介冈比亚按蚊中的替代剪接的相关性[版本1;同行评审：1个有保留批准，1个未批准]。2022 [引用时间：2022-10-6]。
查看文章谷歌学术搜索
48.甘世杰， 梁玉庆， 宾巴哈努丁， 黄圣， 黄顺， 麦建伟， 等.东南亚伊蚊的登革热和杀虫剂耐药性：综述。寄生虫媒介 2021 141.2021;14: 1–19.密码：34112220
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
49.葛西 S， 糸川 K， 植村 N， 高冈 A， 古谷 S， 前川 Y， 等.印度支那半岛出现超抗杀虫剂登革热病媒：伴随敲低抗性突变的威胁。生物Rxiv。2022;2022.03.05.483084.
查看文章谷歌学术搜索
50.Hasmiwati Rusjdi SR，Nofita E.在印度尼西亚巴东DHF流行地区的埃及伊蚊种群中检测具有杀虫剂抗性的ace-1基因。生物多样性。2018;19: 31–36.
查看文章谷歌学术搜索
51.Saingamsook J， Yanola J， Lumjuan N， Walton C， Somboon P. 泰国三种抗杀虫剂埃及伊蚊菌株相对发育和生殖健身成本的研究。昆虫。2019;10.pmid：31443487
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
52.Rocha HDR， Paiva MHS， Silva NM， de Araújo AP， Camacho DDR da R de A， da Moura AJF， et al.佛得角圣地亚哥岛埃及伊蚊对杀虫剂的易感性概况。热带学报 2015;152： 66–73.密码：26307496
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
53.Sene NM， Mavridis K， Ndiaye EH， Diagne CT， Gaye A， Ngom EHM， et al.塞内加尔埃及伊蚊种群的杀虫剂耐药性现状和机制。公共科学图书馆 2021;15.密码：33970904
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
54.Kamgang B， Yougang AP， Tchoupo M， Riveron JM， Wondji C. 喀麦隆首都雅温得两种主要虫媒埃及伊蚊和白纹伊蚊的时间分布和杀虫剂耐药性概况。寄生媒介。2017;10.密码：29017606
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
55.Kamgang B， Wilson-Bahun TA， Yougang AP， Lenga A， Wondji CS. 中非刚果共和国两种主要虫媒埃及伊蚊和白纹伊蚊对 I 型和 II 型拟除虫菊酯的抗性模式对比。感染贫困。2020;9.密码：32114983
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
56.Djiappi-Tchamen B， Nana-Ndjangwo MS， Mavridis K， Talipouo A， Nchoutpouen E， Makoudjou I， et al.喀麦隆埃及伊蚊和白纹伊蚊种群杀虫剂抗性基因分析。基因（巴塞尔）。2021;12.pmid：34071214
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
57.宋比埃 A， 齐木 E， 山尾 F， 樱井 T， 白津 T， 福本 S， 等.来自布基纳法索松甘德（瓦加杜古）的埃及伊蚊的F1534C和V1016I kdr突变的高频以及与拟除虫菊酯耐药性的关联。特罗普医疗健康。2019;47: 2.密码：30787670
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
58.库多姆·昆虫学监测，以评估加纳海岸角的伊蚊传播虫媒病毒的潜在暴发和埃及伊蚊的杀虫剂耐药性状况。热带学报 2020;202.pmid：31682813
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
59.福孔 F， 杜斯福尔一世， 高德 T， 纳夫拉蒂尔五世， 博耶 F， 钱德雷 F， 等.通过深度靶向测序鉴定与登革热蚊埃及伊蚊杀虫剂耐药性相关的基因组变化。基因组研究 2015;25： 1347–1359.密码：26206155
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
60.卡特尔 J， 哈伯科恩 C， 拉波特 F， 高德 T， 库默 T， 雷诺 J， 等.影响羧酸酯酶基因簇的基因组扩增赋予蚊子埃及伊蚊的有机磷酸盐抗性：从基因组表征到高通量场检测。应用学报 2021;14： 1009–1022.pmid：33897817
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
61.Akhir MAM， Wajidi MFF， Lavoué S， Azzam G， Jaafar IS， Awang Besar NAU， et al.马来西亚埃及伊蚊的敲低抗性（kdr）基因，发现了一种新的区域特异性点突变A1007G。寄生虫和媒介。2022;15: 1–15.
查看文章谷歌学术搜索
62.Nag S， Dalgaard MD， Kofoed PE， Ursing J， Crespo M， Andersen LOB， et al.基于定制双索引和 Illumina 下一代测序技术的恶性疟原虫感染的高通量耐药性分析。科学代表 2017;7.密码：28546554
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
63.Makunin A， Korlevi? P， Park N， Goodwin S， Waterhouse RM， Wyschetzki K， et al.靶向扩增子测序组合，可同时识别整个按蚊属的蚊子种类和疟原虫的存在。Mol Ecol Resour.2022;22: 28–44.密码：34053186
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索