医学论文发表-介导的出芽酵母减数分裂过程中的同系物重组由减数分裂重组检查点和保守的Pif1解旋酶促进

安德鲁·齐塞尔，翁启轩，贾斯文德·阿布舍克·巴塔查里亚，劳纳克·杜塔，程斌，瓦伦丁·伯纳，迈克尔·利希滕，南希·霍林斯沃思

发布时间：2022 年 12 月 12 日

抽象

在减数分裂期间，同源染色体（同系物）之间的重组产生交叉，促进第一次减数分裂时的适当分离。重组由Spo11催化的DNA双链断裂（DSB）启动。DSB的5'末端切除产生3'单链尾巴，两种重组酶Rad51和Dmc1结合形成突触前丝，寻找同源性，介导链侵袭并产生位移环（D环）。然后D环处理形成交叉和非交叉重组体。减数分裂重组发生在两个时间不同的阶段。在第1阶段，Rad51被抑制，Dmc1介导促进同源突触的同系物重组。在第2阶段，Rad51变得活跃并与Rad54一起修复残留的DSB，从而越来越多地使用姐妹染色单体。从第 1 阶段到第 2 阶段的过渡由减数分裂特异性效应激酶 Mek1 的减数分裂重组检查点控制。这项工作表明，Rad51在第1阶段的本构激活导致DSB的子集被Rad51介导的同系物重组途径修复，该途径与Dmc1的同源物重组途径不同。 Rad51产生的链侵袭中间体需要更多时间才能加工成重组体，导致前期I的减数分裂重组检查点延迟。如果没有检查点，Rad51生成的中间体更有可能涉及姐妹染色单体，从而增加减数分裂I染色体不分离。这种Rad51同系物间重组途径由保守的5'-3'解旋酶PIF1及其副同源物RRM3特异性促进，并且需要Pif1解旋酶活性及其与PCNA的相互作用。这项工作表明，（1）在第1阶段抑制Rad51对于防止与Dmc1竞争进行DSB修复很重要，（2）Rad51介导的减数分裂重组中间体的初始处理方式与Dmc1制造的不同，以及（3）减数分裂重组检查点在前期1期间为处理Rad51产生的重组中间体提供了时间。

作者摘要

为了有性繁殖，包含每个染色体两个拷贝的细胞必须经历减数分裂的特殊细胞分裂，以将染色体分类为包含每个染色体单个拷贝的配子。这种染色体数量的减少是通过一轮染色体重复和两轮染色体分离来实现的。在第一次减数分裂时，同系物分离到纺锤体的相对两极。同源染色体通过重组相互识别，与姐妹染色单体凝聚力一起，也用于物理连接同系物以促进它们在减数分裂I处的适当分离。在酵母和哺乳动物中，这种同源性搜索涉及由两种高度保守的重组酶Rad51和减数分裂特异性Dmc1结合单链末端。 Rad51在有丝分裂细胞中用于修复断裂，主要使用姐妹染色单体作为模板，而Dmc1在减数分裂中起作用以产生同源物间交叉。在出芽酵母中，Rad51链交换活性通常受到抑制，而Dmc1活跃。我们在这里表明，当Rad51和Dmc1同时活跃时，Rad51与Dmc1竞争以介导双链断裂子集的同源物重组。然而，由于Rad51生成的重组中间体需要更长的处理时间，因此在发生同源物重组时需要保持Rad51无活性。

引文： Ziesel A， Weng Q， Ahuja JS， Bhattacharya A， Dutta R， Cheng E， et al. （2022） 出芽酵母减数分裂过程中Rad51介导的同源物重组由减数分裂重组检查点和保守的Pif1解旋酶促进。公共科学图书馆基因18（12）： e1010407. https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010407

编辑 器： 瓦莱丽·博尔德，居里研究所，法国

收到： 9月 5， 2022;接受： 11月 16， 2022;发表： 12月 12， 2022

这是一篇开放获取的文章，没有任何版权，任何人都可以出于任何合法目的自由复制、分发、传输、修改、建立或以其他方式使用。该作品在知识共享CC0公有领域奉献下提供。

数据可用性： 来自热点实验的测序数据存放在序列读取存档：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/PRJNA873686。所有其他相关数据均在手稿及其支持信息文件中。

资金： 这项工作得到了美国国立卫生研究院向NMH拨款R01 GM050717和R35 GM140684以及向GVB拨款R01 GM125800的支持;通过国家癌症研究所癌症研究中心向ML进行的校内研究计划，以及Eugene和Carol Cheng向NMH的私人捐款。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。

竞争利益： 提交人声明不存在相互竞争的利益。

介绍

有性繁殖的二倍体生物通过减数分裂的特化细胞分裂产生单倍体配子，使两个配子的融合在每一代中保持恒定的染色体数。减数分裂通过一轮DNA复制和两轮染色体分离将染色体数分成两半。在减数分裂I（MI）中，同系物分离到相反的两极，而姐妹染色单体在减数分裂II（MII）分离。精确分选染色体，使每个配子只包含一个拷贝，需要通过交叉和姐妹染色单体凝聚力的组合进行物理连接[1]。减数分裂的过程在进化上是保守的，交叉形成的缺陷导致从酵母到哺乳动物等生物体的MI不分离增加和无法存活的后代[2，3]。

交叉形成过程始于DNA复制后，此时高度保守的减数分裂特异性拓扑异构酶样Spo11蛋白在基因组中称为热点的首选位点催化程序性DNA双链断裂（DSB）[4-7]。然后切除5'末端，产生3'单链（ss）尾[8-10]。在许多生物体中，包括出芽酵母和哺乳动物，这3'末端被两种重组酶结合：Rad51（也用于有丝分裂重组）和减数分裂特异性Dmc1[11-18]。在酵母和哺乳动物中，Rad51和Dmc1在相邻斑块的ssDNA上组装成右旋螺旋，形成突触前丝[19-24]。Rad51的存在，但不是其链交换活性，是Dmc1正常加载到突触前丝和减数分裂重组的野生型（WT）水平上所必需的[25-30]。在小鼠中，Dmc1位于每根细丝的3'末端[22]。重组酶的功能是介导基因组的同源搜索，然后链侵袭供体双链体，形成称为置换（D）环的三链结构[17，31，32]。

当突触前细丝与供体双链体相互作用，形成新生的D环和不稳定的巴拉病毒关节时，D环形成就开始了[33-36]。当重组酶从入侵的ssDNA中移除，同时在入侵链和相反极性的供体链之间形成异质双链DNA时，副神经关节随后转化为稳定的多端关节（或成熟的D环），从而取代同极性链[34，36，37]。细菌重组酶RecA可以介导同源性搜索和新生到成熟D环的转化[38]。相比之下，Rad51可以产生新生的D环，但需要一种称为Rad54的DNA转位酶来产生成熟的D环[32，35，39，40]。

Rad54与Snf2家族解旋酶相关，是一种沿双链DNA易位的运动蛋白[41，42]。Rad54具有多种参与D环的功能：它直接与Rad51相互作用并稳定Rad51-ssDNA丝，促进突触前丝与供体DNA的结合，并已被提议促进沿DNA的基于易位的同源性搜索[39，43-49]。此外，Rad54可以从新生的D环中去除Rad51，从而形成一个模型，其中Rad54充当“泵”，将去除Rad51与异质双链形成耦合，以产生成熟的D环[37，50，51]。

一旦形成成熟的同源物间D环，3'末端就会被DNA聚合酶δ延伸（Pol δ）[52-55]。一些延伸的链被STR（Sgs1，Top3，Rmi1）复合体从D环上拆解出来，并退火到断裂另一侧的3'尾部，通过称为合成依赖链退火的过程导致非交叉[56-61]。或者，入侵链的延伸可能导致位移的单链退火到DSB的另一侧，以形成双霍利迪结[62-64]。在减数分裂期间，大多数形成双Holliday连接的D环由一组称为“ZMMs”的功能多样化的蛋白质处理，这些蛋白质保护它们免于拆卸，并且几乎完全作为交叉解析[56-58，65，66]

除了促进同源物间交叉外，ZMM通路产生的重组中间体对于染色体突触也是必需的[66-68]。在前期I开始时，姐妹染色单体沿着由减数分裂特异性蛋白质制成的蛋白质核心凝结，形成称为轴向元件的结构[69]。在出芽酵母中，这些蛋白质是含有Hop1、Red1和Rec8的内聚素[70-72]。ZMM介导的同系物间重组产生突触起始位点，减数分裂特异性横丝蛋白Zip1和中心元件蛋白Ecm11和Gmc2从中聚合成“zip”同源轴向元件，形成突触复合物（SCs）[65-67，73]。

减数分裂同系物重组的关键调节因子是减数分裂特异性激酶Mek1（也称为Mre4）[74-76]。MEK1是同源物间偏差、ZMM交叉途径和减数分裂重组检查点所必需的[77-80]。在有丝分裂细胞中，Rad51通过同源重组介导DSB修复，并偏爱姐妹间染色单体重组[81，82]。在减数分裂过程中，链侵袭偏向同系物，以产生染色体分离所需的同系物间交叉[83]。MEK1 通过两种机制抑制突触前丝上 Rad51-Rad54 复合物的形成，部分促进同源物偏差。首先，Mek1磷酸化稳定与Rad51结合并排除Rad54的减数分裂特异性Hed1蛋白[84-86]。其次，Rad54苏氨酸132的Mek1磷酸化降低了Rad54对Rad51的亲和力[87]。阻止Rad51-Rad54相互作用的Mek1特异性靶标（hed1Δ和/或RAD54-T132A）发生突变，导致有效的DSB修复，偏向于dmc1Δ二倍体中的姐妹染色单体（其中Rad51是唯一的重组酶），具有足够的同源物重组以产生一些活孢子[84，86，88-90].因此，当Mek1积极促进同系物间偏差并且存在Dmc1时，允许Rad51和Rad54在减数分裂期间使用HED1和RAD54中的适当突变进行组成型相互作用，导致Rad51介导的姐妹和非姐妹染色单体的链侵袭。我们将这种情况称为“激活”Rad51。

Mek1也是减数分裂重组检查点（MRC）的效应激酶，将前期I期退出与DSB修复偶联[91]。Mek1磷酸化通过抑制减数分裂特异性转录因子Ndt80来控制前期I期退出的时间[77，91，92]。由于突触仅在同系物之间产生ZMM交叉指定的重组中间体时才发生，因此完整的染色体突触表明不再需要额外的重组[66，93]。突触通过减少DSB形成和从染色体中去除大部分Mek1来降低Mek1活性[94-97]。结果，Ndt80被激活，交叉形成、SC拆卸和减数分裂进展所需的基因表达[91，94，98-102]。Mek1的完全失活使Rad51-Rad54能够在进入减数分裂之前修复任何剩余的DSB[18，94，103]。因此，减数分裂前期I期间的Rad51活性可以分为两个阶段，由Ndt80的Mek1控制的活化态描述。在第 1 阶段，Rad51 不活跃，Dmc1 主要介导同系物之间的重组;在第2阶段，Rad51-Rad54通过姐妹染色单体的链侵袭介导残留DSB的修复。在线虫减数分裂期间观察到从I期后期的同系物到姐妹间重组的类似转变，哺乳动物减数分裂I期晚期的DSB修复似乎也切换到Rad51介导的途径[104-106]。

在第1阶段抑制Rad51链侵袭的两种独立机制的事实表明，同时具有Dmc1和Rad51活性对细胞不利。然而，当Rad51在DMC1存在下被hed1Δ或hed1Δ RAD54-T132A持续激活时（为简单起见，以下简称hedΔR），表型是适度的：姐妹间重组增加2倍，减数分裂进展延迟，对孢子活力几乎没有影响[88，89，107].因此，Rad51抑制仅部分导致同源物间偏差，表明还有其他Mek1靶标尚未被发现。相比之下，hed1Δ dmc1Δ突变体的同源物间偏差降低了约30倍[88，89]。与hed1Δ dmc1Δ相比，在hed1Δ中观察到的表型更温和，因此存在Dmc1本身部分抑制Rad51介导的链交换的假设[88，89]。另一种假设是，Dmc1在DSB的链入侵中胜过活化的Rad51[107]。然而，这些假设都不能解释为什么hedΔR对Rad51的本构激活会导致减数分裂进展延迟[88，107]。

在营养细胞中，断裂诱导复制（BIR）是一种DNA修复途径，由于DSB另一侧的同源性差或不存在，Rad51介导的D环的入侵链通过Polδ延伸到染色体末端[108，109]。 BIR需要保守的5'-3'解旋酶Pif1与PCNA相互作用并刺激Polδ介导的延伸，从而产生迁移的D环[109-111]。最近的研究表明，PIF1在酵母的减数分裂重组中也有作用[112]。Pif1定位于减数分裂DSB，在那里它与PCNA相互作用，促进Dmc1形成的D环中入侵链的延伸[112]。然而，在野生型（WT）细胞中，PIF1对链延伸的贡献相对较小，因为Mer3-MutLβ复合物的存在抑制了其活性[112]。

为了更好地理解为什么Rad51的链交换活性通常在第1阶段受到抑制，我们研究了hedΔR减数分裂进展延迟的基础，发现允许Rad51在第1阶段与Rad54相互作用会导致Rad51介导的同源物间链侵袭在DSB的一个子集上不如Dmc1介导的侵袭健壮。由此产生的同源物重组中间体需要更长的时间来修复，从而使MRC保持活性的时间更长。在没有MRC的情况下，Rad51的组成性激活导致姐妹间重组增加，交叉减少，MI非分离增加和孢子活力降低。此外，我们的工作表明，PIF1及其旁系物RRM3促进了这些中间体的加工。我们建议Rad51通常在第1阶段被抑制，以防止它与Dmc1竞争链入侵，并且已经进化出多种机制来促进同源物Rad51介导的D环的处理。此外，我们的研究结果还揭示了在第2阶段发生的依赖于Rad51的DSB修复事件的潜在机制。

结果

减数分裂期间Rad51的本构激活延迟DSB消失和前期I退出

当Rad51在整个前期I期间活跃时，进入减数分裂的延迟[88，107]。该结果是使用hedΔR组合重现的，该组合消除了抑制Rad54与Rad51相互作用的Mek1依赖性机制（图1A）。WT和hedΔR的不同生物学重复之间的减数分裂进展动力学存在显着差异，但两种菌株的孢子形成量相似（图1A-1C）。为了比较不同菌株之间减数分裂进展的时间，T50通过确定每种培养物达到通过细胞核荧光染色确定的最大%MI + MII值的一半所需的时间来计算值（MI =双核，MII =四核）。平均 T50hedΔR的值为6.4小时，明显长于WT平均值5.6小时（图1C）。

缩略图 下载：

.PPT幻灯片

.PNG大图

.TIFF原始图像

图1. Rad51在第一阶段的激活导致减数分裂进展延迟，DSB消失和前期I退出。

（A）减数分裂进展。WT（NH716或NH2598 RCEN）（n = 18）和hedΔR（NH2528或NH2616 RCEN）（n = 21）二倍体转移到Spo培养基中。在指定的时间点固定细胞，用4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色，并通过荧光显微镜检查是否存在双核（MI）或四核（MII）细胞。绘制每个时间点不同时间路线的平均值。每个时间点至少计数200个细胞。（二）孢子形成。通过光学显微镜检查细胞是否存在含有一到四个孢子的腹水。对于每个生物学重复，计数200个细胞。（C）减数分裂进展时间的量化。T50表示图A的孢子培养物达到其最大%MI + MII值的一半所需的时间（小时）。（D）DSB存在的细胞学测定。 在Spo培养基中四小时后拍摄的WT（NH716）和spo11Δ（NH1055）细胞产生的染色体扩散的代表性图像。用DAPI观察DNA，并使用针对Rad51和Dmc1的抗体来检测DSB的存在。 比例尺为2μm。（E）定量显示至少三个Dmc1和Rad51病灶的细胞百分比。分析了图A所示重复子集的WT（n = 3）和hedΔR（n = 3）二倍体的染色体扩散，以确定在不同时间点是否存在Rad51和Dmc1病灶。含有至少三个Rad51和三个Dmc1病灶的细胞核被评为阳性。每个时间点至少检查120个细胞核。（F）同时表现出Rad51和Dmc1病灶的细胞的寿命。绘制图E的每次病程，通过将每条曲线下的面积除以完成相应培养物的MI或MII的最大细胞数来计算Rad51/Dmc1阳性细胞核（hr）的寿命[113]。（G）WT减数分裂时间过程中Red1全细胞免疫荧光的示例。比例尺为 2 μm。（H） 第一阶段进展。通过免疫荧光测定来自图A所示重复子集（WT和hedΔR，n = 11）的整个固定细胞是否存在Red1，并绘制平均值。每个时间点至少计数200个细胞。（I）前期I长度的量化。按照图F所述计算图H中包含的每种孢子培养物的第一阶段寿命。对于所有条形图，每个点代表一个生物学重复，条形的高度表示平均值，误差条表示标准偏差。对于所有折线图，误差线表示标准偏差。使用未配对的双尾学生 T 检验分析数据的统计学显著性。（* = p < .05; ** = p < .01; *** = p < .001）

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010407.g001

对hedΔR减数分裂进展延迟的一种解释是Rad51的本构激活延迟了DSB修复，从而使减数分裂重组检查点保持活动时间更长。通过用抗Rad51和Dmc1的抗体染色染色体扩散，可以在单细胞中细胞学检测DSB和新生D环[27]（图1D）。作为我们抗体的对照，Rad51和Dmc1病灶仅在减数分裂细胞中观察到，并且分别依赖于RAD51和DMC1（S1A图）。此外，在rad51Δ中观察到的Dmc1病灶很少，正如预期的那样，因为需要RAD51来促进Dmc1组装到突触前丝上（S1A图）[25，27]。最后，在spo11Δ二倍体中未观察到病灶，证实Dmc1 / Rad51病灶依赖于Spo11生成的DNA DSB（图1D）。

在hedΔR中，与WT相比，含有Rad51和Dmc1病灶的细胞部分累积到更高的水平并在以后的时间点持续存在（图1E）。细胞核具有大量DSB的持续时间（每个细胞核≥3个Rad51和Dmc1病灶）是通过绘制每个重复的每个时间点的Dmc1和Rad51正扩散的百分比来确定的，然后将每个图中的曲线下面积（AUC）除以最大%MI+MII细胞（图1F）[113]。同时表现出Rad51和Dmc1病灶的细胞的平均寿命明显长于WT（4.4 vs 2.7小时）（请注意，该分析低估了hedΔR的寿命，因为Rad51 Dmc1细胞的频率在八小时内没有达到零）。++

未修复的DSB导致MRC激活延长，从而延迟退出前期I.[77，114，115]。通过计数细胞核数量来测量减数分裂进展并不能提供减数分裂的哪一部分延迟的信息。为了确定hedΔR是否特异性地增加前期I长度，使用全细胞免疫荧光监测轴向元素蛋白Red1的存在（图1G）。由于出现马球样激酶Cdc5，Red1在Ndt80活化后降解，使其成为前期I的极佳标志物[94，98，101，103]。Red1抗体的细胞学特异性通过NDT80Δ red1Δ对照细胞中缺乏信号得到证实（S1B图）。

在WT减数分裂时间过程中，Red1细胞的频率在3小时达到峰值，并逐渐降低，直到~8小时接近零（图1H）。在hedΔR中，Red1细胞以WT动力学出现，但消失速度比WT慢。通过计算 % Red1 细胞的 AUC 并归一化为 MI+MII 细胞的最大百分比 [前期寿命 （小时） = AUC/完成 MI 或 MII 的最大 # 细胞] 来确定每次重复的前期 I 寿命的定量值。hedΔR的平均前期I寿命为3.8小时，明显长于WT（3.0小时）（图1I）。观察到的 hedΔR 减数分裂进展延迟可以通过前期 I 长度的增加来解释，因为 T 的 hedΔR 和 WT 之间的差异+++50第一阶段的寿命相同（~0.8小时）。

Rad51链交换活动是导致前期I出口的hedΔR延迟的原因

突触前丝中的Rad51：Dmc1化学计量对于正常的同系物重组很重要[116]。Hed1和Rad54可以稳定灯丝上的Rad51，这增加了hedΔR中观察到的DNA修复问题是由于缺乏HED1和/或Rad54的存在而导致突触前丝组装不正确的可能性[49，117，118]。另一种可能性是突触前丝组装是正常的，但Rad51介导的链入侵事件比Dmc1产生的事件需要更长的处理时间。后一种假设使用rad51-II3A突变体进行了测试，该突变体形成正常的突触前丝，但在链交换方面存在缺陷[25]。

rad51-II3A二倍体表现出减数分裂进展延迟和孢子活力小幅但显著下降，这可能是由于Rad51未能在第2阶段修复残留的DSB（图2A-2C）[25，94，103]。与这一观点一致，rad51-II3A四联体中活孢子的分布与随机孢子活力一致，MI不分离不增加（图3F和3H）。此外，虽然50rad51-II3A减数分裂进展值显著大于WT，前期I期长度差异不显著（图2C和2E）。rad51-II3A减数分裂进展延迟的一种解释是，一些DSB持续超过MI，从而在MII之前触发DNA损伤检查点[119]。

缩略图 下载：

.PPT幻灯片

.PNG大图

.TIFF原始图像

图2. 减数分裂期间Rad51的组成性激活延迟了第一阶段的退出。

（一）孢子活力。解剖液体和固体孢子形成条件下的WT（NH716或NH2598 RCEN），hedΔR（NH2528或NH2616 RCEN），hedΔR rad51-II3A（NH2566）和rad51-II3A（NH2618或NH2666 RCEN）四联体以确定活孢子的百分比。对于每个重复，至少解剖18个四分体。（B）减数分裂进展。如图1所示，分析了WT、hedΔR、hedΔR rad51-II3A（n = 10）和rad51-II3A（n = 10）的减数分裂进展的时间过程。 绘制所有仿行的平均值。（三）T的比较50小组B中显示的各个时间过程的值。 （D）第一阶段进展。如图1所示，分析了图A中时间过程的子集（WT和hedΔR，n = 11，rad51-II3A和hedΔR rad51-II3A，n = 8）的前期I进展。 绘制所有仿行的平均值。（E）图D中每种孢子培养物的第一阶段寿命如图1所示计算。用于面板B和D的WT和hedΔR的数据与图1所示相同。小组A中菌株之间差异的统计学意义使用曼-惠特尼检验确定，而图C和E使用未配对的双尾学生T检验。（* = p < .05; ** = p < .01; *** = p < .001， **** = p < .0001）。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010407.g002

缩略图 下载：

.PPT幻灯片

.PNG大图

.TIFF原始图像

图3. 消除MRC挽救了由于本构型Rad51激活引起的前期I期延迟，同时降低了孢子活力并增加了MI非分离性。

（A）减数分裂进展。如图1所示，分析了以下二倍体的减数分裂进程的时间过程：WT，hedΔR，NDT80-mid（NH2495或NH2634 RCEN）（n = 13）和hedΔR NDT80-mid（NH2505或NH2610 RCEN）（n = 25）。 绘制所有仿行的平均值。（b） T 的比较50图A中显示的时间历程值。 （C）第一阶段进展。如图1所示，分析了图A中时间过程的子集（NDT80-mid，n = 11，hedΔR NDT80-mid，n = 15）的前期I进展。 WT 和 hedΔR 数据来自图 1。绘制所有仿行的平均值。（D）图C中每种孢子培养物的第一阶段寿命如图1所示计算。（五）孢子活力。解剖来自液体和固体孢子培养基的孢子细胞以确定活孢子的百分比。每个重复至少解剖20个四分体。除了为A组列出的二倍体外，还包括hedΔR NDT80-mid rad51-II3A（NH2705 RCEN）和rad51-II3A。（F）图E中解剖的四分体中活孢子的分布。 （G）用于监测非分离的VIII染色体同系物示意图。左边的四分体是正常染色体VIII分离的一个例子，而右边的四分体中发生了MI非分离（NDJ）。B = 蓝色，R = 红色。（H）染色体VIII MI不分离的频率。每个条形上方的数字表示测定的四分体总数。WT、hedΔR和rad51-II3A的面板A-E使用了图1和图2所示的相同数据。面板B和D中菌株差异的统计学意义是使用未配对的双尾学生T检验确定的，而Mann-Whitney检验用于面板E和H.（* = p < .05; ** = p < .01; *** = p < .001， **** = p < .0001）

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010407.g003

为了观察组成型Rad51介导的链入侵是否会延迟前期I期的退出，将rad51-II3A与hedΔR结合使用，这应该允许链交换缺陷的Rad51-II3A蛋白与Rad54相互作用。正如预期的那样，hedΔR rad51-II3A二倍体表现出比hedΔR更低的孢子活力，因为组成活性的Rad51-II3A蛋白在第2阶段无法修复残留的DSB（图2A）。相反，阻止 Rad51 介导的链侵入在 hedΔR rad51-II3A 二倍体中通过将前期 I 的长度减小到与 WT 相同来抑制 hedΔR 减数分裂进展延迟（图 2B–2E）。平均 T50hedΔR rad51-II3A的值为5.7小时，明显低于hedΔR的6.4小时。此外，前期I的寿命从hedΔR的3.8小时显著降低到hedΔR rad51-II3A的3.1小时。这些结果表明，在减数分裂期间，允许Rad54与Rad51相互作用会导致链交换事件，从而在前期I期间触发延迟。

由Rad51的本构激活引起的前期I延迟取决于MRC

第一阶段的延迟退出和 DSB 在 hedΔR 中的持续存在表明 MRC 活性响应于激活的 Rad51 而延长。如果为真，则消除此检查点应该可以挽救 hedΔR 前期 I 延迟。Mek1通过与Ndt80中的RPSKR基序结合并磷酸化Ndt80 DNA结合结构域来控制MRC[91]。缺乏RPSKR基序的NDT80等位基因（称为NDT80-mid，对于Mek1 I-nteractionD有效）使Ndt80对检查点不敏感，而不影响其激活转录的能力[91]。

NDT80-中二倍体表现出与WT相似的减数分裂进展时间（图3A和3B）。然而，在存在活化的Rad51（hedΔR NDT80-mid）的情况下取消检查点并不能消除hedΔR中观察到的减数分裂进展延迟（图3A和3B）。NDT80-mid未能抑制hedΔR减数分裂进展延迟的一种解释是，这种突变组合延长减数分裂进展的原因与单独使用hedΔR的原因不同：例如，由于对非交换染色体的纺锤体组件检查点的激活，中期I期到I期过渡的延迟[120].由于MRC专门控制第一阶段退出的时间，因此确定了hedΔR NDT80-mid的第一阶段寿命。由于尚不清楚的原因，与WT，NDT80-mid和hedΔR相比，hedΔR NDT80-mid延迟进入第一阶段（图3C）。尽管进入前期I较晚，但hedΔR NDT80-mid细胞退出前期I明显早于hedΔR，平均寿命为2.9小时，而hedΔR为3.8小时（图3D）。这些数据表明，减数分裂期间Rad51的组成性激活导致链交换中间体需要更长的处理时间，并触发MRC延迟从前期I退出。

当Rad51在前期I期间具有组成活性时，MRC是适当的减数分裂I分离和孢子活力所必需的

如果MRC为细胞提供时间处理Rad51产生的链侵袭中间体，则当检查点不存在时，应该会出现表型后果。其中Rad51被组成性激活（hedΔR）或MRC被消除（NDT80-mid）的二倍体在孢子活力方面表现出非常小但显着的降低（图3E）。相比之下，在hedΔR NDT80-mid二倍体中没有检查点的情况下激活Rad51显着降低了孢子活力，平均为~60%（图3E）。该值小于hedΔR和NDT80-mid的单个孢子活力乘积预测的值（86.5%），表明具有协同效应。此外，与单独使用hedΔR相比，hedΔR NDT80-mid菌株中单个菌落之间观察到的孢子活力变异性增加（图3E）。

来自hedΔR NDT80-mid的四分体表现出与MI非分离一致的孢子不活力模式，其中4个活孢子四分体减少，有利于2个和零活孢子四分体（图3F）[121]。为了直接监测MI分离，在VIII号染色体着丝粒附近的等位基因位置引入编码孢子自主表达的红色荧光蛋白（RFP）或青色荧光蛋白（CFP）的基因（图3G）[122]。VIII号染色体的适当分离在每个四联体中产生两个红色和两个蓝色孢子，而MI不分离导致两个粉红色和两个黑色孢子（图3G）。在2075个WT四分体中未观察到MI不分离（图3H）。与WT一样，hedΔR二倍体（0.1%，943个四分体）的染色体分离非常准确，而NDT80-mid（0.2%，10，988个四分体）的MI非分离性小幅但显着增加（图3H）。相比之下，hedΔR NDT80-mid菌株的MI非分离性显着增加（9.4%。 5322个四分体），与孢子活力的降低一致（图3H）。

hedΔR NDT80-mid分离和孢子活力缺陷是由于Rad51介导的链入侵造成的，因为破坏了Rad51在hedΔR NDT80-mid rad51-II3A二倍体中的链侵袭活性，将孢子活力恢复到与单独使用rad51-II3A相同的水平，并显着降低了MI不分离（图3E和3H）。在hedΔR NDT80-mid中，rad51-II3A对MI非析取的不完全抑制可能反映了Rad51-II3A在第1阶段激活时对链的低水平侵袭。因此，当Rad51被组成激活时，MRC在促进适当的染色体分离方面起着至关重要的作用。

MRC促进hedΔR二倍体中的交叉形成

hedΔR NDT80-mid中MI非析取大幅增加的一种解释是交叉形成减少。交叉以两种不需要活孢子的方式测量。第一种方法对DSB修复HIS4LEU2热点产生的交叉和非交叉产物进行物理分析[92，123]。该减数分裂热点的DSB位点两侧是XhoI限制性位点，这些位点在每个同系物上差异分布，其中一个同系物上的NgoMIV位点非常靠近DSB位点（图4A）[123]。用XhoI和NgoMIV对基因组DNA进行双重酶切，产生独特的片段，指示交叉（CO2）和非交叉（NCO1）的子集。减数分裂时程分析表明，与之前的结果类似，NCO1和CO2在hedΔR中延迟并降低了~2倍（S2C和S2B图）[88，107]。然而，当绘制两个不同时程的平均值时，在hedΔR NDT80-mid二倍体中没有观察到CO2或NCO1量的进一步减少（S2C和S2B图）。

thumbnail 下载：

.PPT幻灯片

.PNG大图

.TIFF原始图像

图4. 各种突变体重组的物理和遗传分析。

（A）复合的物理分析。HIS4LEU2热点示意图。虚线表示DSB的位置，其两侧是XhoI限制位点。还显示了DSB站点附近的NgoMIV站点。（B）由WT（NH716和NS2598 RCEN），hedΔR（NH2528和NH2H2616 RCEN），NDT80-mid（NH2634 RCEN），hedΔR NDT80-mid（NH2505和NH2610），hedΔR NDT80-mid rad51-II3A（NH2705 RCEN）和rad51-II3A（NH2666 RCEN）的独立单菌落产生的培养物在Spo培养基中孵育10小时。 分离DNA，用XhoI和NgoMIV消化，并通过南方印迹分析交叉和非交叉，如[123]所述。显示了来自每种菌株的个体培养物的代表性凝胶。P1 和 P2 代表亲本同系物。NCO1和CO2代表明确的非交叉带和交叉带。每条泳道的编号都用图例中指示的菌株进行彩色编码。（C） 在 Spo 培养基中 10 小时后对 CO2 进行定量。（D）在Spo培养基中10小时后定量NCO1。图C和D中菌株差异的统计学意义是使用未配对的双尾学生T检验确定的。（* = p < .05; ** = p < .01; *** = p < .001， **** = p < .0001）。 （五）交叉形成的遗传分析。来自WT （NH2598 RGC） （n = 7;tetrads = 3374）、hedΔR （NH2616 RGC） （n = 7;tetrads = 3812）、NDT80-mid （NH2634 RGC） （n = 7;tetrads = 3592）、hedΔR NDT80-mid （NH2610 RGC） （n = 8;tetrads = 3899）、pif1-md （NH2695 RGC）（n = 7;四分体得分 = 2974）、hedΔR pif1-md （NH2702 RGC）（n = 6;tetrads = 2799）和hedΔR NDT80-mid pif1-md （NH2687 研资局）（n = 8;四联体 = 2605）在固体培养基上孢子化，并通过荧光显微镜分析CEN8-ARG4和ARG4-THR1间隔内的交叉（S3图）。误差线显示标准误差。由于MI非析取和非亲本双型四联体在CEN8-ARG4区间中无法区分（S3图），因此使用hedΔR和NDT80-mid的MI非析取频率校正非亲本二型的频率。WT不需要校正，因为没有观察到MI不分离。所有CEN8-ARG4 NPD均假定是由于VIII号染色体MI非分离频率≥9%的菌株的MI不分离（图3H）[122]。使用斯塔尔实验室在线工具（https://elizabethhousworth.com/StahlLabOnlineTools/）计算地图距离（cM）和标准误差。（F）CEN8-ARG4和ARG4-THR1间隔之间的交叉干扰比是使用Malkova，Swanson描述的方法确定的[124]。染色体VIII图上方和下方的箭头分别表示ARG4-THR1和CEN8-ARG4为参考区间。测试间隔/参考间隔映射距离比值明显小于 1 表示干扰，p 值用星号 （*<0.05; ****<0.0001） 表示（G 检验）。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010407.g004

由于hedΔR NDT80-mid的不同生物学重复表现出的孢子活力具有很高的变异性，因此需要两个以上的重复来确定统计学意义。因此，通过在10小时时间点比较几个生物学重复中的CO2和NCO1频率来进行终点分析，此时所有菌株都已完成MI或MII（图2B和3A）。将CO2和NCO1片段量化为总DNA的百分比，以确定统计学意义。随着样本量的扩大，当hedΔR与NDT80-mid结合使用时，观察到交叉数量在统计学上显着减少，与孢子活力和MI非分离表型密切相关（图4B和4C）。在hedΔR NDT80-mid二倍体中，非交叉相对于hedΔR也减少了两倍，但这种减少在统计学上并不显着，可能是由于样本量有限（图4B和4D）。

rad51-II3A突变体单独表现出与WT相当的CO2和NCO1水平（图4B-4D）[25]。向hedΔR NDT80-mid二倍体中添加rad51-II3A增加了NCO1水平，但与hedΔR NDT80-mid相比，没有观察到CO2的统计学显着增加（图4C和4D）。然而，鉴于hedΔR NDT80-mid rad51-II3A二倍体中MI非分离和孢子不活力表型的抑制，未能看到交叉形成的抑制可能是由于样本量有限以及hedΔR NDT80-mid观察到的减数分裂进展速率的变异性。

还使用荧光孢子测定法从遗传上确定了交叉频率[122]。一条 VIII 号染色体包含与 CEN8 相邻的 RFP。在同系物上，GFP*（绿色荧光蛋白）基因在ARG4整合，CFP在THR1整合。不同间隔的交叉通过独特的荧光孢子模式来区分（S3图）。与HIS4LEU2热点分析相反，hedΔR和NDT80-mid在CEN8-ARG4区间的映射距离均高于WT（图4E）。这种增加是着丝粒相邻区域特有的，因为ARG4-THR1区间中的hedΔR和NDT80-mid交叉发生在等于或低于WT的频率下（图4E）。有趣的是，在hed1Δ和WT二倍体中，III号染色体不同间隔的映射距离也观察到了类似的模式[88]。在该实验中，hed1Δ突变体的CEN3-MAT间期交叉形成较高，但在手臂更远的区间中等于或低于WT[88]。与hedΔR相比，消除Rad51激活菌株（hedΔR NDT80-mid）中的MRC显着降低了CEN8-ARG4和ARG4-THR1间隔的交叉（图4E）。这些结果表明，当Rad51在第1阶段被激活时产生的同源物重组中间体子集需要MRC成功加工成交叉。

Rad51的组成性活化导致依赖于MRC的同源物和姐妹间关节分子的积累

分频器是由双霍利迪结中间体（dHJ）的分辨率形成的复合终点。先前使用hed1Δ的研究表明，同源物间（IH）dHJs适度降低，对INTERSISTER（IS）dHJ几乎没有影响，同系物间偏倚从5.7 IH：IS比值降低到2.1[88]。在我们的hedΔR二倍体中，IH dHJ的峰值水平相对于WT延迟，表明链侵入或第二端捕获延迟（图5A和5B）。在hedΔR中增加IS-dHJ，IH：IS比率偏差从WT中的~8：1降低到hedΔR的2：1（图5A和5B以及S1数据）。在缺乏MRC（NDT80-mid）的细胞中，IH和IS dHJ的动力学与WT相似，并且IH dHJs有特异性降低，IH：IS比值降低至5：1（图5A和5B）。NDT80-mid的IH dHJ的总体减少可能是由于dHJ的分辨率更快而无法捕获这些物种，当CDC5的转录不再受MRC调节时，它们更加短暂。NDT80-mid中HIS4LEU2热点处没有减少的交叉和非交叉与这一想法一致（图4C和4D）。

thumbnail 下载：

.PPT幻灯片

.PNG大图

.TIFF原始图像

图5. 减数分裂重组检查点促进Rad51介导的dHJ形成。

（A） 在 WT、hedΔR、NDT80-mid、hedΔR NDT80-mid、pif1-md 和 hedΔR NDT80-mid pif1-md 中最大关节分子水平时的代表性二维凝胶 Southern 印迹分析摘录。 右侧面板显示左侧面板的放大摘录。同源物间 dHJ（黑色箭头）、同源物 dHJ（红色箭头）、同源物间和同源物 SEI（黑线）。（B）hedΔR和NDT80-mid对IH-dHJs（左）和IS-dHJs（右;时程tc17-1）影响的定量分析。联合分子（JM）水平表示为平行WT培养物中最大IH-dHJ水平的分数（黑色;此处为总杂交信号的1.7%）。（C）WT、hedΔR和hedΔR NDT80-mid背景中pif1-md对IH-HJs（左）和IS-dHJs（右;tc14）的影响的定量分析。JM水平表示为平行WT培养物（黑色）中最大IH-dHJ水平的分数，此处为总杂交信号的1.0%。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010407.g005

与hedΔR相比，在没有MRC（hedΔR NDT80-mid）的情况下激活Rad51大大降低了IH和IS dHJ（图5A和5B）。hedΔR NDT80-mid的IH：IS比也降至1：1（图5A和5B以及S1数据）。尽管与hedΔR相比，hedΔR ndt80-mid中IS dHJ的稳态水平较低，但相对于NDT80-mid，这一数量有所增加，这可能解释了在没有MRC的情况下激活Rad51时观察到的交叉减少。

当 Rad51 被组成型激活时，前期 I 的延长时间促进染色体分离

一个意想不到的发现是来自同一二倍体的不同单个菌落（包括WT）的培养物之间的前期I长度的变异性（图3D）。尽管存在这种变异性，但在WT、hedΔR或hedΔR rad51-II3A中，孢子活力与前期I期长度之间没有相关性（图6A）。此外，使用NDT80-mid专门消除WT细胞中的检查点并没有改变这种相关性的缺乏。相比之下，在hedΔR NDT80-mid培养物中，前期I长度与孢子活力呈正相关，与染色体VIII MI非分离呈负相关（图6A和6B）。这些相关性在hedΔR NDT80-mid rad51-II3A菌株中丢失的事实表明，该表型需要Rad51链侵袭活性（图6A和6B）。我们得出的结论是，在hedΔR中观察到的较长的前期I长度是由于重组中间体的产生，与Dmc1介导的中间体相比，重组中间体需要更长的时间才能有效地加工成交叉。在没有检查点的情况下，前期I的长度不再受到控制，因此没有足够数量的交叉的细胞过早进入MI，导致同系物不分离。

thumbnail 下载：

.PPT幻灯片

.PNG大图

.TIFF原始图像

图6. 当Rad51被组成性激活时，减数分裂重组检查点将前期I长度与孢子活力和MI染色体分离解耦。

（A）绘制了WT（n = 12）、hedΔR （n = 11）、hedΔR rad51-II3A （n = 8）、NDT80-mid（n = 11）、hedΔR NDT80-mid （n = 16）和hedΔR NDT80-mid rad51-II3A （n = 11）的孢子活力与前期I长度的关系。（B）使用与图A相同的重复，绘制了hedΔR NDT80-mid和hedΔR NDT80-mid rad51-II3A的染色体VIII MI非分离与前期I长度的关系图。这些数据来自图 2 和图 3 所示的相同时间过程。相关系数和统计显著性分别由“r”和“p”表示，并使用GraphPad Prism 9.0确定。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010407.g006

当Rad51具有组成性活性时，链入侵不太强

Rad51/Dmc1病灶在Rad51被组成型激活的菌株中的持久性，以及需要检查点介导的延迟才能成功完成hedΔR菌株的减数分裂重组，这表明链侵袭可能不如WT可靠。先前的研究表明，减数分裂重组通常涉及多轮链侵入和D环中间体拆卸，然后通过链退火形成稳定的重组中间体或产物[125-128]。通过将平衡从D环形成转移到拆卸/退火，不太稳健的链侵袭将减少在稳定的中间体或产物形成之前通过DNA束合成可检测到的链侵袭事件的数量。

为了验证这一想法，使用高通量测序确定在高度多态性测试区间中亲本链对重组体的贡献，其中重组由URA3-tel-ARG4热点处紧密聚焦的DSB启动（图7A），以对hedΔR msh2Δ二倍体中159个四联体中的多态性标记的分离进行评分[127]。虽然 natMX 和 hphMX 插入片段在侧翼的交叉，但 hedΔR 和 WT 的间隔相似（分别为 26.8 ± 2.6 和 30.4 ± 1.9 cM;S2数据，表13），在hedΔR的大部分区间内，标记的基因转换频率降低了约25%（p <0.0001，Wilcoxon匹配对符号秩检验;图7B和S2数据表4），与减少同源物间链侵袭一致。WT和hedΔR之间natMX-hphMX区间的映射距离相似性与先前的观察结果一致，即Rad51激活不会显着减少映射距离（图4E）[88]。此外，虽然WT中的大多数事件在DSB的两侧都含有异源双链DNA，但hedΔR中只有少数事件是双面的（图7C和S4图，以及S2数据表5）。由于双侧事件可以由DSB末端入侵和素合成的事件产生，因此此类事件的减少提供了hedΔR中同源物间链入侵减少的额外指示。

thumbnail 下载：

.PPT幻灯片

.PNG大图

.TIFF原始图像

图 7. Rad51的组成型激活导致减数分裂过程中低效的同系物间链侵袭。

URA3-tel-ARG4重组区间显示了多态标记（蓝色-野生型;红色-多态性）相对于双链断裂质心（DSB，绿色闪电）的位置。~85% 的 DSB 形成于 -49 和 +63 之间;所有 DSB 的形成都在 -148 和 +164 之间（Ahuja 等人，2021 年）。侧翼耐药性插入物允许交叉的基因评分。为了进行分析，从hedΔR msh2Δ二倍体NH2700的159个四分体的四个孢子中分离DNA。然后将包含热点区域的片段扩增并对其进行整体测序。（B）每个多态性标记的基因转换频率（具有非孟德尔分离（NMS）的四联体/总四分体）。hedΔR中的转换频率明显低于野生型（p < 0.0001，Wilcoxon匹配对符号秩检验）。基础数据位于 S2 数据、表 4 和 [127] 中。（C）非交叉（NCO）和交叉（CO）之间的单侧和双侧杂交DNA。示意图——在单侧事件中，一个DSB端侵入同系物并在拆卸和退火之前引发DNA合成，导致杂交DNA到DSB的一侧;在双侧事件中，两端侵入同系物并延伸，导致DSB两侧的杂交DNA。表 - 具有单侧和双侧事件的四边形数，括号中为每种类型的四分体的分数。各个事件在 S4 图中进行了说明。在hedΔR中，单侧事件比在WT中更多（分别为55%和37%;p = 0.02，费舍尔精确检验）。基础数据在S2数据表5和[127]中。（D） 模板切换，表示为非孟德尔分离 （NMS） 半束（从 DSB 到上次转换标记的间隔）的分数，具有指示的模板切换次数。hedΔR（绿色）的模板开关比WT（黑色;p = 0.02，卡方检验）少。有（填充）或不有（透明）模板切换的四分体的插图-分数（p = 0.003，卡方检验）;C - 交叉，N - 非交叉。基础数据在S2数据，表6和表7以及[127]中。（E）基因转换片段的长度，表示在没有发生模板切换的情况下DSB和基因转换道末端之间的DNA延伸，或者，如果发生模板切换，则DSB和模板切换之间或两个模板切换之间的DNA延伸。中位数段长度在 X 轴下方表示;红线表示下四分位数、中四分位数和上四分位数。用于比较hedΔR（绿色）和WT（黑色）的p值（曼-惠特尼检验，双尾）位于图的顶部。基础数据位于 S2 数据、表 6 和 [127] 中。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010407.g007

减数分裂重组通常涉及模板切换，其中链侵袭在同系物和姐妹染色单体之间切换，从而经历多轮侵袭、末端引物合成和拆卸[126-131]。相对于WT，hedΔR的模板切换也减少了（图7D和7E，以及S2数据表7）。比较 hedΔR 和 WT，每个转换区的平均模板切换次数（0.25 vs 0.57;p = 0.02，卡方检验）和显示模板切换的事件分数（0.22 对 0.51;p = 0.003，卡方检验）在Rad51被组成型激活时显著降低。原则上，可以通过减少链侵入或D环拆卸来减少模板切换;预计后者将增加可用于末端延伸的时间，从而增加基因转换片段的长度。然而，hedΔR中的基因转换片段（如果有的话）比WT短（图7E和S2数据，表6）。

总之，hedΔR细胞的总体基因转换频率和多链侵袭事件的比例均降低，这与减数分裂同源物链侵袭在Rad51被组成型激活时减少的建议一致。

当Rad51具有组成活性时，PIF1解旋酶活性和PCNA相互作用促进孢子活力和染色体分离

当Rad51具有组成活性时观察到的从前期I退出和IH dHJ出现的延迟表明，Rad51生成的中间体的处理与Dmc1生成的D环的处理不同。一个可能的区别是使用Pif1解旋酶，它在BIR中Rad51介导的D环的延伸和部分营养交叉的形成中起关键作用，但在Dmc1介导的重组中仅起次要作用[109，112]。为了观察当Rad51在前期I期间被组成型激活时PIF1是否具有功能，通过将PIF1置于CLB2启动子的控制下，产生了减数分裂耗竭等位基因（pif1-md）[112，132]。CLB2在营养细胞中表达，但在减数分裂期间不表达[133]。单独使用pif1-md突变体表现出~85%的孢子活力，较WT显著降低，而VIII MI染色体非分离仅略有增加（0.4% vs 0%）（图8A和8C）[112]。在没有PIF1（hedΔR pif1-md）的情况下激活Rad51对孢子活力没有明显影响，但MI非分离显著增加至~3%，表明具有协同效应（图8A和8C）。此外，与hedΔR NDT80-mid相比，hedΔR NDT80-mid二倍体中PIF1的消耗使平均孢子活力从~60%显着降低到~25%，并将染色体VIII MI不分离增加了三倍（图8A和8C）。pif1-md对染色体分离的影响不仅限于VIII号染色体，因为与hedΔR NDT80-mid相比，hedΔR NDT80-mid pif1-md二倍体中活孢子的MI非分离模式加剧（S5B图）。hedΔR NDT80-mid pif1-md 的孢子活力和 MI 非分离表型均通过 PIF1 质粒的整合得到补充，证实了 PIF1 的耗竭是这些表型的原因（S5A 和 S5B 图）。此外，这些表型被rad51-II3A抑制，表明在没有PIF1的情况下观察到的更极端的突变表型是由于Rad51的组成性激活和MRC的缺失（图8B和8D）。

thumbnail 下载：

.PPT幻灯片

.PNG大图

.TIFF原始图像

图8. 当Rad51在没有减数分裂重组检查点的情况下被组成型激活时，PIF1和RRM3促进同系物析取。

（一）孢子活力。WT、hedΔR、NDT80-mid和hedΔR NDT80-mid的数据取自图3E。 其他菌株是pif1-md（NH2657或NH2685 RCEN），rrm3Δ（NH2485：:p RS3042或 NH2623 RCEN）， pif1-md rrm3Δ （NH2671：:p RS3042）、hedΔR pif1-md （NH2691 或 NH2702 RCEN）、hedΔR rrm3Δ （NH2540 或 NH2629 RCEN）， hedΔR pif1-md rrm3Δ （NH2704）， NDT80-mid pif1-md （NH2725）， NDT80-mid rrm3Δ （NH2549）， hedΔR NDT80-mid pif1-md （NH2661 或 NH2687 RCEN）， hedΔR NDT80-mid rrm3Δ （NH2596） 和 hedΔR NDT80-mid pif1-md rrm3Δ （NH2670）。解剖来自液体和固体孢子培养基的孢子细胞以确定活孢子的百分比。每个重复至少解剖20个四分体。（B）通过rad51-II3A（NH2741 RCEN）抑制hedΔR NDT80-mid pif1-md孢子的不活力。（C）心肌梗死期间VIII染色体不分离的频率。WT、hedΔR、NDT80-mid和hedΔR NDT80-mid的数据取自图3H。 C组中使用的其他菌株是pif1-md （NH2685 RCEN），rrm3Δ（NH2623 RCEN），hedΔR pif1-md （NH2702 RCEN），hedΔR rrm3Δ（NH2629 RCEN），hedΔR NDT80-mid pif1-md （NH2687 RCEN）和hedΔR NDT80-mid rrm3Δ（NH2637 RCEN）。 测定的四联体数量：pif1-md （3168），rrm3Δ （1062），hedΔR pif1-md （1665），hedΔR rrm3Δ（900），hedΔR NDT80-mid pif1-md （1491）和hedΔR NDT80-mid rrm3Δ（ 1489）。（D）通过rad51-II3A（NH2741 RCEN）抑制hedΔR NDT80-mid pif1-md染色体VIII MI非分离。hedΔR NDT80-mid pif1-md rad51-II3A （3469） 测定的四联体数量。（E）来自图F中分析的菌株的不同核Pif1蛋白的稳态水平.使用由营养细胞制成的蛋白质提取物的免疫印迹用α-FLAG抗体探测以检测Pif1-3FLAG。Arp7被用作加载控件。携带未标记pif1-m1（pJW5-m1）的二倍体作为对照包括在内。每个泳道底部的数字表示每个菌株中的质粒数量。蛋白质的量被量化并标准化为Arp7和Pif1-m1-3FLAG。[Pif1-m1-X-3FLAG/Arp7]/[Pif1-m1-3FLAG/Arp7]，其中X表示突变。每个泳道上方的数字表示三个独立重复的平均值。（F）PIF1不同等位基因的互补试验。用载体pRS306（v）转换了hedΔR NDT80-mid pif1-md二倍体，pJW14（pif1-m1-3FLAG）和pJW14-R3E（pif1-m1-R3E-3FLAG）各一个拷贝，以及两个拷贝pJW14-K264A（pif1-m1-K264A-3FLAG）。转化体在固体培养基上孢子化，每个转化体至少解剖20个四联体。使用曼-惠特尼检验（* = p < .05; ** = p < .01 ; *** = p < .001， **** = p < .0001） 确定菌株之间差异的统计学意义。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010407.g008

PIF1在细胞核和线粒体中均起作用[134，135]。 线粒体Pif1可以通过突变第一个蛋氨酸（pif1-m1）来消除，因此仅存在核Pif1[136]。pif1-m1等位基因补充了hedΔR NDT80-mid的孢子活力缺陷，甚至优于PIF1，这可能是因为所有的Pif1蛋白都定位在细胞核上（S5A图）。Pif1-m1在C末端（pif1-m1-3FLAG）处用三个FLAG表位标记，以允许核蛋白的可视化。标签的添加对pif1-m1功能没有明显影响，因为pif1-m1和pif1-m1-3FLAG互补得同样好（S5A图）。

PIF1解旋酶活性和PCNA相互作用都是BIR所必需的[109，111]。为了测试减数分裂Rad51介导的中间体的加工是否同样需要这些功能，使用消除解旋酶活性（K264A）或破坏Pif1-PCNA相互作用（R3E）的突变pif1等位基因在hedΔR NDT80-mid pif1-md二倍体中进行互补测试[109，111]。Pif1-m1-K264A-3FLAG蛋白的稳态水平比Pif1-m1-3FLAG和Pif1-m1-R3E-3FLAG低约两倍（图8E）。因此，使用pif1-m1-3FLAG WT和R3E等位基因的半合二倍体和K264A突变体的纯合子进行互补测试，以使三种蛋白质的蛋白质水平相等（图8E和8F）。pif1-R3E突变体仅部分互补（图8F）。先前在其他测定中已观察到pif1-R3E的部分互补，因此突变可能不会完全破坏体内Pif1-PCNA相互作用[111，112]。与这一观点一致，pif1-R3E突变体中Pif1向减数分裂DSB的募集减少，但并未消除[112]。相比之下，解旋酶死亡的K264A突变体表现出与单独载体相同的低孢子活力（图8F）。我们得出结论，Pif1解旋酶活性及其与PCNA相互作用的能力是减数分裂前期I期间处理Rad51介导的D环所必需的。

PIF1促进具有组成活性的Rad51菌株中的减数分裂进展和交叉形成

虽然在WT和pif1-md中观察到相似的减数分裂进展时间，但与单独的hedΔR相比，从hedΔR背景中消耗Pif1显着延迟了减数分裂进展（S6A和S6B图）。这种延迟不是由于前期I寿命增加（S6C图）。即便如此，使用NDT80-mid从hedΔR pif1-md二倍体中消除MRC抑制了减数分裂进展延迟至相同的T50值为 hedΔR NDT80-中期，并恢复了与 WT 相比的前期寿命（S6 图）。这些结果表明，在没有PIF1的情况下激活Rad51可能会产生在MI之前未修复的中间体，从而可能触发MII中的DNA损伤检查点延迟[119]。

pif1-md在HIS4LEU2热点处表现出CO2和NCO1形成的WT动力学，但两者的水平略有降低，这可能是由于进入减数分裂的细胞数量减少（S2和S6A图）。IH dHJs减少，但IS dHJs没有相应增加（图5C）。在hedΔR pif1-md中CO2形成延迟，但与hedΔR和hedΔR NDT80-mid相比达到相似的水平（S2图）。与pif1-md或hedΔR相比，hedΔR pif1-md中的ISdHJ增加，这也许解释了在该二倍体中观察到的MI非析取的小幅增加（图5C和8C）。hedΔR NDT80-mid pif1-mid中的CO2和NCO1水平比hedΔR NDT80-mid降低得更多（S2图）。

使用正交荧光孢子系统确定的交叉频率与物理分析一致。单独使用pif1-md突变体在VIII号染色体上的CEN8-ARG4和ARG4-THR1区间中几乎没有显示映射距离的减少（图4E）。相比之下，来自hedΔR二倍体的PIF1消耗显着降低了CEN8-ARG4区间的交叉，并且在两个区间中观察到hedΔR NDT80-mid pif1-md二倍体的交叉进一步减少（图4E）。

交叉干扰是一种遗传现象，其中一个区间内的交叉降低了相邻区间内交叉的概率[137]。为了分析CEN8-ARG4和ARG4-THR1区间交叉之间发生的干扰，使用了Malkova，Swanson（124）的方法。交越干扰比<1表示正在发生干扰。在每个应变内，使用CEN8-ARG4或ARG4-THR1作为参考区间计算的交叉干涉比相似（图4F）。在WT、hedΔR、NDT80-mid、pif1-md和hedΔR pif1-md中观察到交叉干扰，其水平与文献一致（~0.2）[122]。 相比之下，在hedΔR NDT80-mid pif1-md中不存在干扰。干扰丢失的一种解释是，在第1阶段中效率低下的Rad51介导的DSB修复（由于PIF1和MRC的缺失）导致许多DSB，包括那些被指定为干扰交叉的DSB，使用姐妹染色单体进行修复。因此，这些潜在交叉站点的丢失可能会使交叉分布随机化。

PIF1 在没有 DMC1 的情况下，由于 Rad51 介导的同源物链间侵袭而促进孢子活力

dmc1Δ细胞与未修复的DSB在前期停滞，因为Rad51-Rad54相互作用受到抑制[11，86，87，90]。在dmc1Δ hed1Δ中，DSB主要使用姐妹染色单体进行修复，但由于活性Mek1的存在，形成足够的同源物间交叉以产生70-80%的活孢子[84，86，88]（S5C图）。当Mek1的Rad54磷酸化也被阻止时（hedΔR dmc1Δ），孢子活力进一步降低（S5C图）[87]。这一结果表明，通过Rad54-T132磷酸化减缓Rad51与Rad54的关联，增加了发生同系物间链侵袭的机会。

dmc1-II3A突变体在链交换活性方面存在特异性缺陷[25]。在hedΔR背景中用dmc1-II3A取代dmc1Δ显著提高了孢子活力（S5C图）。这一观察结果与Rad51和Dmc1共同有助于制造具有正确化学计量的突触前细丝的观点一致，这是促进Dmc1和Rad51介导的同源物间重组所必需的[26，27，83，116]。从hed1Δ dmc1Δ或hedΔR dmc1Δ中消耗PIF1显着降低了孢子活力（S5C图）。由于Rad51是这些菌株中唯一的重组酶，这些结果证实了PIF1是处理Rad51生成的重组中间体所必需的。

PIF1 旁系物 RRM3 在减数分裂期间 Rad51 具有组成性活性时促进染色体分离

RRM3和PIF1在某些过程中具有不同的功能，例如，RRM3不是BIR所必需的，Rrm3与复制体一起移动以去除非核小体蛋白，而Pif1仅在特定情况下被募集到回复体中[109，138-141]。 然而，也有一些例子表明PIF1和RRM3似乎具有冗余功能[142，143]。因此，研究了RRM3在减数分裂中的作用。在rrm3Δ或NDT80-mid rrm3Δ细胞中未观察到对孢子活力的影响（图8A）。相反，在hedΔR rrm3Δ中观察到孢子活力的小幅但显着降低（图8A）。此外，VIII 号染色体 MI 非分离也相应增加（图 8C）。当减数分裂重组检查点被移除时，这些表型加剧（hedΔR NDT80-mid rrm3Δ）（图8A和8C）。孢子活力和MI非分离表型均通过在质粒上添加RRM3来补充（S5A和S5D图）。孢子活力缺陷不是在没有RRM3的情况下营养生长过程中积累的突变的结果，因为hedΔR NDT80-mid rrm3Δ的孢子活力表型通过使用REC8启动子在减数分裂期间特异性表达RRM3来补充（S5A图）。

如果PIF1和RRM3在减数分裂过程中处理Rad51生成的中间体中具有冗余功能，则当两个突变体结合时，预计孢子活力会出现协同缺陷。或者，如果它们彼此独立地发挥作用，则pif1-md rrm3Δ在不同背景下的预测孢子活力将是它们个体孢子活力的乘积。含有pif1-md和rrm3Δ的二倍体表现出与单独使用pif1-md相同水平的活孢子，这与在其他WT二倍体中缺乏rrm3Δ的任何表型一致（图8A）。相比之下，在hedΔR和hedΔR NDT80-mid背景中，含有二倍体的pif1-md rrm3Δ的平均孢子活力接近单个值的乘积（hedΔR pif1-md x hedΔR rrm3Δ，预期：82% * 80% = 66%;观察到hedΔR pif1-md rrm3Δ 59%; hedΔR NDT80-mid，预期：25% * 47% = 12%;hedΔR NDT80-mid pif1-md rrm3Δ 观察到 16%）。我们得出结论，PIF1和RRM3在加工Rad51介导的中间体中起着不同的作用。

讨论

减数分裂重组检查点促进WT和hedΔR二倍体中适当的染色体分离和孢子活力

人们经常建议MRC的功能是延迟前期I的退出，以便有时间进行DSB修复。然而，证明这一想法的一个困难是Mek1激酶的多效性。MEK1不仅需要调节Ndt80，从而调节前期I期退出，还需要调节同源物间偏差[75]。Mek1通过突变或激酶抑制失活，可通过姐妹染色单体快速修复DSB，从而消除检查点的信号并允许有效的减数分裂进展[77-79]。此外，破坏MRC的突变体如RAD24、RAD17和MEC1/TEL1都在Mek1激活中发挥作用，因此它们的影响可能是间接的，因为影响其他MEK1过程[92，144-146]。发现使用NDT80诱导等位基因人为延长前期I的长度可以提高mec1和rad24突变体的孢子活力，并且认为这种情况可以模仿减数分裂重组检查点引起的前期I延迟[147]。然而，这种解释的一个问题是，当NDT80不活跃时，细胞在延长的前期I停滞期间表现异常。例如，在mek1Δ ndt80Δ二倍体中，姐妹关节分子在前期I早期占主导地位，但随着被捕细胞中时间的增加，这种偏向转变为同源性JMs[148]。与这一结果一致，mek1Δ孢子的活力可以通过在NDT80诱导前增加前期I的时间来挽救[94]。相反，我们的工作利用NDT80-mid突变体，它在不影响Mek1激酶活性的情况下消除MRC，来检查MRC在WT细胞中的作用，以及在hedΔR突变体中的作用，该突变体在DSB修复中表现出适度的缺陷，其中减数分裂进展延迟但不被阻止。

NDT80-mid突变体的前期I期长度并不明显短于WT。然而，孢子活力降低了少量但显着的量，ARG4-THR1间隔中的交叉也是如此，并且VIII染色体的MI非分离略有升高。这些结果表明，在少数其他WT电池中存在DSB修复问题，需要MRC提供的时间来解决。

出乎意料的是，来自WT二倍体的不同单菌落的培养物在前期I的长度上显示出2-5小时的变异性（图6A）。然而，在所有培养物中都观察到高水平的活孢子，无论它们进展得快还是慢，这表明一些培养物更早地完成了重组并退出了前期I，而另一些培养物需要更多的时间来修复DSB。在hedΔR中也观察到变异性，尽管在这种情况下，前期I的长度更长，范围为3-6小时。尽管如此，孢子活力仍然很高（图6A）。相比之下，当hedΔR NDT80-mid中取消减数分裂重组检查点时，前期I.寿命与孢子活力之间存在显着的统计学显着正相关，前期I期寿命与MI非分离之间存在负相关（图6A和6B）。这些相关性在hedΔR NDT80-mid rad51-II3A中被消除，与Rad51链交换活性导致孢子活力降低的事实一致。这些实验表明，MRC的一个关键功能是在减数分裂DSB修复过程中为处理重组中间体提供时间。

第一阶段 Rad51 和 Rad54 之间的相互作用允许 Rad51 介导的同系物间链在 Dmc1 存在下侵袭

酵母中有丝分裂和减数分裂重组之间的两个主要区别是，在减数分裂期间，突触前丝包含Rad51和Dmc1的斑块，并且链侵袭偏向同系物而不是姐妹染色单体。然而，这些重组酶之间的相互作用很复杂：虽然Rad51蛋白的存在是适当的Dmc1负载和同系物间偏差所必需的，但Rad51链交换活性不是同系物重组所必需的，并且被主动抑制[25，30，84，86，87]。此外，尽管DMC1的缺失消除了同系物间链的侵袭，但dmc1Δ突变体中Rad51的激活导致同系物间重组水平明显高于mek1Δ，这表明当Mek1活跃时，活化的Rad51可以产生同系物间中间体[88，89]。hed1Δ和hedΔR二倍体表现出的适度表型归因于Dmc1本身的存在有助于抑制Rad51链交换活性[88，89]。然而，激活Rad51应该减少Dmc1存在下的同系物重组的想法假设Rad51将优先将链侵袭引导到姐妹染色单体，就像它在营养细胞中所做的那样。这项工作表明，在hed1Δ或hedΔR酵母突变体中，Dmc1并未完全抑制Rad51链交换活性。相反，hed1Δ和hedΔR二倍体表现出的近WT水平的交叉和孢子活力是由于不同因素的组合，这些因素促进了Rad51介导的同源物间交叉的产生。

hedΔR二倍体中MRC的特异性消除减少了同源物间事件，增加了MI非分离性和降低了孢子活力，这表明Rad51正在产生MRC提供时间处理的中间体。这一想法的证明是，通过使用rad51-II3A突变体阻止Rad51交换活动，所有这些突变表型都被抑制了。因此，在这些细胞中，Rad51 在 Mek1 介导的同源物间偏差的第 1 阶段是活跃的并产生交叉。与hed1Δ dmc1Δ相比，在hed1Δ二倍体中观察到高水平的交叉和孢子活力可能是由于Dmc1的存在有助于突触前丝通过Hop2/Mnd1等辅助因素在同系物而不是姐妹染色单体上寻找同源物的同源性[149]。

线虫、秀丽隐杆线虫、果蝇、黑腹果蝇和真菌大孢子虫等生物仅使用Rad51进行减数分裂重组[3，150]。 这项工作提出了一个有趣的问题，即Rad51介导的减数分裂重组在这些生物体中是否类似于我们在酵母中发现的途径。这个想法可以通过确定这些物种的减数分裂重组是否需要Pif1直系同源物来测试。

减数分裂过程中Rad51介导的重组模型

我们建议Rad51产生的新生减数分裂D环的处理与Dmc1产生的D环不同，原因有几个。首先，Rad51的激活导致前期I退出延迟，表明当存在Rad51链交换活性时，细胞需要比Dmc1是唯一起作用的重组酶时更多的时间来满足MRC。其次，当Dmc1介导的同源物重组时，MRC在促进WT细胞的染色体分离和孢子活力方面仅起很小的作用，但当Rad51在第1阶段也活跃时，MRC非常重要。第三，PIF1活性通常受到抑制，因此其对Dmc1介导的修复的贡献可以忽略不计，但促进Rad51产生的中间体的修复[112]。

Dmc1介导的重组的现有模型基于以下假设：与小鼠类似，Rad51和Dmc1在突触前细丝中形成相邻斑块，Dmc1最靠近3'端，负责链侵袭（图9 WT）[19，22]。在同源性搜索结果形成新生的D环（图9B）后，Dmc1被DNA转位酶从3'端移除，在入侵链和互补供体链之间形成异质双链，导致类似极性的链位移，形成成熟的D环（图9C）。目前尚不清楚是什么DNA转位酶负责这一步。虽然Rdh54似乎是体内和体外证据的明显选择，表明它优先与Dmc1合作，但这种活性尚未在Rdh54中得到证实[32，151]。然后，入侵链的3'端充当DNA合成的引物，使用PCNA和Polδ延伸入侵链（图9D）[52-55]。拆卸D环路，然后退火到断路的另一侧，产生非交叉，而延伸端的第二端捕获产生双Holliday结，可以解析为交叉（图9E）。请注意，我们的模型显示了重组过程的简化视图。最近的研究表明，减数分裂DSB修复是非常动态的，具有多轮链侵袭和拆卸，以及同系物和姐妹染色单体之间的模板切换[126-128]。

thumbnail 下载：

.PPT幻灯片

.PNG大图

.TIFF原始图像

图 9. 减数分裂期间Rad51介导的同源物间交叉模型。

（A）WT细胞中DSB一侧的突触前丝。蓝线代表一个同系物的双链体，而红线代表另一个同系物的染色单体。点表示DNA的5'端。（B）新生的D环或副神经关节。（C）通过去除Dmc1和相反极性的入侵链和供体链之间的异质双链形成，转换为成熟的D环。问号表示发生这种情况的机制未知。（D）通过Polδ-PCNA合成DNA扩展D环，然后进行第二端捕获。（E） 双霍利迪路口。（F） 在 hedΔR 细胞中显示 DSB 一侧的突触前丝，Rad54 与 Rad51 相互作用。（G）新生的D环或副神经关节。（H）由Rad54去除Rad51和侵入链和相反极性供体链之间的异质双链形成而产生的内部D环。（I） 从入侵链的 3' 端去除 Dmc1。（J） Pif1与PCNA相互作用，通过展开双链体来扩展D环，从而促进DNA合成，从而捕获第二端。（K） 双霍利迪路口。没有显示延伸端可能被拆解，以便通过合成依赖链退火实现非交叉形成。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010407.g009

图9（hedΔR）说明了由Rad51介导的DSB修复的机制模型，当它在第一阶段被人为激活时。Rad54在体外与ssDNA上Rad51斑块之间的间隙结合[118，152]。我们建议Rad54类似地结合突触前丝上Rad51和Dmc1之间存在的间隙（图9F）。由此产生的突触前细丝随后形成类似于WT的新生D环（图9B和9G）。然而，在DSB的一个子集中，Rad54顺序去除Rad51单体，从而在侵入链和相反极性的供体链之间产生异源双链DNA，以产生内部D环（图9H）。Rad51-Rad54形成内部D环已在体外得到证实[37]。

Rad51形成内部D环会产生一个问题，因为3'端仍然被Dmc1结合，因此被阻止作为DNA Polδ合成DNA的引物（图9H）。要延长D环，DNA聚合酶必须能够进入3'羟基以启动DNA合成[50]。为了使这种3'羟基可用于DNA聚合酶，必须通过转位酶将Dmc1从突触前丝中去除并产生异质双链DNA转化为成熟的D环。此外，没有自由的3'端可能使该中间体更容易被STR复合物拆卸，这可以解释为什么hedΔR中的双侧事件和模板开关较少。必须移除Dmc1以释放3'端（图9I）是一个额外的步骤，会延迟链延伸，从而需要更长的时间才能进行第二端捕获（图9J），这可以解释在hedΔR观察到的dHJ形成的延迟。此外，将中断转换为 MRC 无法识别的中间体所需的时间增加将导致 MRC 依赖性前期 I 延迟。

已知Pif1沿5'-3'方向移动以从DNA中去除蛋白质，因此它在处理Rad51生成的中间体中的功能可能是在内部D环形成后去除Dmc1。然而，使用由Dmc1结合的ssDNA组成的DNA幕的体外实验未检测到Pif1的这种活性，这使得这种可能性降低（Eric Greene，个人通讯）。另一种可能性是，包含Dmc1的末端被切割掉，以在DSB站点的上游创建一个自由的3'端。预计这一端的延伸将在DSB位点周围产生3：1的基因转换，这是未观察到的。最简单的解释是，Dmc1被图9C所示的相同机制去除。

在Mer3和MutLβ介导的Dmc1重组过程中，Pif1活性通常受到抑制[112]。这些蛋白质可能不识别Rad51产生的内部D环，因此不存在抑制Pif1，从而使Pif1通过与PCNA结合并解开DNA来促进入侵链的合成（图9J）。然后可以以类似的方式处理所得的扩展链，用于Dmc1生成的D环，以产生交叉和非交叉（图9K）。该模型的一个关键测试是查看hedΔR pif1-md二倍体中的转换轨迹长度是否减小。

哺乳动物Rad51活性的下调是否保守？

在哺乳动物中没有Mek1的直系同源物的报道，这引发了哺乳动物细胞前期I期间Rad51活性是否受到抑制的问题。一些观察表明，答案是肯定的。首先，小鼠卵母细胞外源性DNA损伤的修复在厚皮细胞过程中表现出两个时间上不同的过程——一个是同时存在Dmc1和Rad51的早期过程，另一个是Rad51（而非Dmc1）与DSB相关的后期[106]。此外，小鼠精子细胞中Rad51的特异性消耗会导致前期I.早期细胞凋亡[153]。这种表型与Dmc1耗竭或Dmc1精子细胞表现出的合子停滞非常不同[14，153，154]。这些结果表明，（1）Dmc1介导的重组需要Rad51的存在，（2）当Dmc1在I期不存在时，Rad51不介导链侵袭，这表明其链交换受到抑制类似于酵母。这种抑制的机制尚不清楚，但它需要一个功能性染色体轴，因为编码小鼠轴向元素蛋白Sycp2和Sycp3的基因中的突变体允许Rad54依赖性间源修复Dmc1卵母细胞中的DSB[155]。-/+/+-/-

总之，人们早就确定，突触前丝上Rad51的存在对于Dmc1有效介导酵母和植物中的同源物重组是必要的[26，30，83，116]。然而，酵母细胞竭尽全力防止Rad51在减数分裂重组的第1阶段参与链入侵。以往研究中，Rad51在减数分裂期间被组成型激活，显示孢子活力和同源间偏倚几乎没有表型[88，89，107]。这项工作表明，当允许Rad51与Rad54相互作用时，Rad51将与Dmc1竞争以介导同源物链入侵。然而，这些中间体的加工涉及额外的限制，例如MRC提供的时间和Pif1等因素，使得Rad51介导的1期重组与Dmc1相比不太理想。一旦发生足够的DSB修复以使MRC失活，Rad51自然被激活以使用姐妹染色单体修复残留的DSB。由于这种修复也从同时包含Rad51和Dmc1的细丝开始，因此看看PIF1是否也促进第二阶段Rad51介导的修复将是一件有趣的事情。Pif1在哺乳动物中是保守的，BIR也需要PIF[156]。看看Pif1是否在Dmc1 Sycp2小鼠卵母细胞中修复DSBs中起作用将是很有趣的。-/--/-

材料和方法

株

所有菌株均来源于SK1背景，其基因型列于S1表中。液体和固体介质在[157]中描述。使用耐药标记kanMX6、natMX4和hphMX4产生聚合酶链反应（PCR）介导的基因缺失，这些标记分别赋予抗生素G418、NOUTSOTHRICIN （NAT）和潮霉素B（HygB）的耐药性[158，159]。使用基因开放阅读框（ORF）上游的正向引物和位于药物标记内的反向引物通过PCR确认缺失，而使用相同的正向引物和位于开放阅读框（ORF）内的反向引物测定WT等位基因的缺失。pif1-md等位基因是通过将WT PIF1 ORF融合到CLB2启动子来构建的。 一个坎MX6-P负载均衡2-3公顷使用pMJ787（也称为455）[132]扩增来自上游PIF1 ATG的50 bp同源性，以及来自下游端ATG的+1至+50的50 bp同源性PCR片段，并转化为选择G418抗性的单倍体酵母菌株。使用CLB2启动子中的正向引物和PIF1 ORF中的反向引物通过集落PCR确认基因融合。

NDT80-mid、RAD54-T132A和rad51-II3A等位基因通过两步基因替换引入单倍体菌株[160]。用SnaBI消化整合质粒pNH317的NDT80-mid URA3，以靶向整合ndt80Δ：：kanMX6上游的质粒。在YPD中生长Ura转化体，然后接种在5-氟乳清酸（5-FOA）上，以选择失去URA3质粒的细胞[161]。福阿+R保留NDT80-mid等位基因的菌落通过NDT80Δ：：kanMX6标记的缺失进行鉴定，使细胞对G418敏感。

RAD54-T132A URA3整合质粒pHN104与BsiWI一起消化，以靶向RAD54上游的整合。在YPD中生长Ura转化体，然后接种在5-FOA上。来自每个Foa的RAD54基因片段+R通过PCR扩增菌落并进行测序以检测T132A突变的存在。除了用于DSB热点分析的PacBio测序（见下文）外，所有DNA测序均由石溪大学DNA测序设施进行。

将 rad51-II3A URA3 整合质粒 pAM1-II3A 与 SpeI 一起消化，以靶向 RAD51 上游的整合。在YPD中生长Ura转化体，然后铺在5-FOA上。福阿+R将菌落贴在YPD上，并复制接种到YPD + 0.04%甲磺酸甲酯（MMS）以筛选MMS敏感性。rad51-II3A等位基因包含三个突变，R188A，K361A和K371A。确认彩信S福阿R细胞包含所有三种突变，RAD51基因从基因组DNA扩增并测序。

用于荧光孢子分析的所有菌株都与NH716同基因，NH716是通过杂交NHY1210和NHY1215单倍体产生的。为了整合适当的质粒，分别从NHY1210和NHY1215（及其突变衍生物）中删除了LEU2和TRP1基因。除了位于NHY1210单倍体中的LEU2 ORF的第一个和最后一个100 bp外，其他所有被kanMXM6（指定为leu2ΔI：：kanMX6）替换。此外，在NHY1215单倍体中，TRP1基因的5'末端被hphMX4取代[80]。

为了测量VIII号染色体不分离的频率[122]，用AflII消化质粒pSK693（pYKL050c-RFP LEU2）和pSK694（pYKL050c-CFP TRP1），以分别靶向整合到NHY1210和NHY1215中与着丝粒相邻的VIII号染色体右臂（及其突变衍生物）。具有等位基因位置的RFP和CFP基因的二倍体用“RCEN”表示。为了测量CEN8-ARG4和ARG4-THR1之间的遗传图谱距离，用AflII消化pSK729（pYKL050c-GFP* URA3）和pSK695（pYKL050c-CFP TRP1），并分别在ARG4和THR1处依次整合到NHY1215单倍体中。这些单倍体被杂交到适当的NHY1210 CEN8：：RFP单倍体，以创建包含“RGC”指示的标记配置的二倍体。

用于DSB热点实验的hedΔR msh2Δ单倍体分几个步骤创建。首先，使用natMX4从S5495和S5497中删除HED1基因。为了使natMX4失活以便该基因可以在后续步骤中使用，然后将hed1Δ：：natMX4单倍体用pSZ5转化，pSZ5是含有LEU2和CAS9的2μ质粒，融合到5'TTCGTCGCGTACGGGGGGACGA3'，这是一种引导DNA序列，一旦转录，就会靶向natMX4内的DSB形成。由于断裂的染色体是致命的，因此对于发生容易出错的非同源末端连接的细胞，破坏Cas9切割位点并破坏natMX4 ORF的细胞具有很强的选择性。将Leu转化体贴在SD-leu板上，然后复制接种至YPD + NAT以寻找未能生长的贴片。纳特+S（NS）贴片在YPD上的单个菌落上划线，然后将其复制接种到SD-leu上以找到失去pSZ5的细胞。如上所述，将RAD54-T132A等位基因引入S5495 hed1NS和S5497 hed1NS。所得菌株被命名为S5495 h ΔR和S5497 hΔR。然后将hed1Δ：：NS RAD54-T132A突变体引入含有msh2Δ和URA3-tel-ARG4热点的单倍体菌株中，有或没有SNP。首先，将S5495 hΔR与S4955交叉以制造NH2694。该二倍体与hed1Δ：：NS，RAD54-T132A以及leu2-R，his4Δ：：kanMX，his4：：URA3rev-tel1-ARG4 + SNPs-RNQ-hphMX-FUS1和msh2Δ：kanMX6杂合。NH2694被孢子化并解剖100个四联体。Ura，Arg，HygB的菌株++R和G418R然后筛选交配类型并选择MATA菌株。（his4Δ：：kanMX基因位于III号染色体上，his4：：URA3rev-tel1-ARG4 +SNPs-RNQ-hphMX-FUS1也是如此，因此它不应该存在于该组中）。通过PCR确认了msh2Δ：：kanMX6和hed1Δ：：NS的存在，而DNA测序则检测了含有RAD54-T132A的孢子菌落。由此产生的单倍体NH2694-a2被冷冻。为了构建另一个亲本，将S5497 hΔR与S5085交叉以生成NH2685。这个二倍体是hed1Δ：：NS RAD54-T132A以及his4Δ：：kanMX，STE50-natMX-RRP7-his4：：URA3rev-tel1-ARG4和msh2Δ：kanMX6的杂合子。解剖来自NH2685的100个四联体，并对孢子菌落进行Nat筛选R乌拉Arg和G418++R.从该组中，选择MATα菌株并通过PCR测试msh2Δ：：kanMX6和hed1Δ：：NS。RAD54-T132A的存在是通过DNA测序确定的。单倍体NH2695-f8被冻结。

转化前，用BmgBI消化URA3整合载体pRS306中含有PIF1的质粒，靶向P下游的整合负载均衡2-PIF1 （pif1-md） 等位基因。类似地，用SnaBI消化含有RRM3各种等位基因的URA3整合质粒，以靶向rrm3Δ下游的整合。引入等位基因的存在通过使用基因座特异性引物和基因特异性引物的PCR确定。对于载体对照，pRS306用NsiI消化并整合到ura3的下游。

质 粒

本研究中使用的质粒的基因型列在S2表中。含有来自Cloud， Chan（25）的rad51-II3A（rad51-R188A-K361A-K371A）等位基因的pAM1-II3A质粒是通过PCR定点诱变产生的。首先将含有RAD51的3.7 kbBamHI片段克隆到用BamHI酶解的YIp5质粒骨架中以产生pAM1。在pAM1上使用定点诱变，随后引入R188A，然后引入K621A，最后引入K371A以产生pAM1-II3A。引入pAM1-II3A的所有突变均通过DNA测序得到证实。

pNH257质粒在位于REC8 ORF上游的266 bp片段中含有REC8启动子。该质粒是通过从含有REC8的质粒中扩增该片段而创建的，该质粒末端具有Not1和BamHI限制性位点。BamHI位点位于REC8起始密码子的上游。该片段被克隆到NotI/BamHI消化的pRS306中。

Gibson组装创建的所有质粒都使用NEBuilder HiFi DNA组装试剂盒（New England Biolabs，#E2621）。为了构建 URA3 RRM3 质粒，pBG22，从 pBG18 扩增含有 RRM3 ORF 和 900 bp 5' 侧翼序列和 400 bp 3' 侧翼序列的 3.5 kb 片段，并通过 DNA 组装克隆到 pRS306 中，用 EcoRI 和 ClaI 酶切。pJW7 是通过克隆含有 RRM3 ORF 和 REC8 启动子下游 18 bp 的下游序列 378 bp 的片段构建的，该片段使用 EcoRI 和 ClaI 使用 Gibson 组装法酶解。

pJW5是通过首先从SK1基因组DNA中分别用904 bp和401 bp的上游和下游侧翼序列扩增整个PIF1基因来构建的。该片段由Gibson Assembly克隆到pRS306中，用EcoRI和XhoI消化。gibson Assembly还通过引入两个片段来产生pJW5的突变衍生物，这些片段将用于pJW5构建的插入片段分开：一个从PIF1开放阅读框（ORF）上游的904 bp延伸到突变，另一个从突变延伸到PIF1 ORF下游的401 bp，进入用EcoRI和XhoI消化的pRS306。pJW14 （pif1-m1-3FLAG） 是通过 Gibson 组装将三个片段克隆到 EcoRI-HindIII 酶解的 pRS306 中构建的：片段 1 从 PIF1 ORF 上游的 904 bp 延伸到 pif1-m1 突变 （M1A）。片段 2 从 pif1-m1 突变延伸至 3xFLAG 标签序列，片段 3 从 3xFLAG 标签序列延伸至 PIF1 ORF 下游的 401 bp。pJW14的突变衍生物通过与pJW14类似的工作流程构建，除了片段2是从含有K264A（AAA至GCG）或R3E（I817R，M820R，L821R，R823E）的pJW5衍生物扩增而来的。pJW11（URA3 PIF1-3FLAG）是通过扩增两个片段构建的，其中一个片段含有PIF1基因，另一个包含3FLAG序列，并通过Gibson组装将它们克隆成用EcoRI和XhoI消化的pRS306。所有质粒构建均通过石溪大学DNA测序设施的DNA测序得到证实。

酵母培养基和减数分裂时间进程

酵母培养基和孢子形成方案见[157]。YPDcom平板含有2%琼脂，0.7%不含氨基酸的酵母氮碱，2%葡萄糖和2g完全粉末，如[157]所述制成。

免疫印迹和抗体

蛋白质提取物使用[162]中所述的三氯乙酸方法生成。Rad51抗体由Covance Research Products（现为Labcorp）在豚鼠体内使用肽QKDGNDFKFNYQGDEC产生。与WT中同一时间点存在的许多病灶相比，在rad51Δ二倍体中4.5小时减数分裂时间点观察到的病灶不足证明了抗体对染色体扩散免疫荧光的特异性（S1A图）。对于Pif1-m1-3FLAG免疫印迹，在室温下以1：5000稀释度使用小鼠α-FLAG抗体（Sigma F-1804）2小时。二抗是山羊α小鼠（Invitrogen，#PI32430），在室温下以1：10，000稀释1小时。使用Arp7蛋白作为上样对照，并使用α-Arp7一抗（Santa Cruz Biotechnology，#SC8961）与小鼠α-山羊二抗（Santa Cruz Biotechnology，#SC2354）在室温下以1：10，000稀释1小时进行检测。蛋白质通过使用Fisher的Advansta Westernbright ECL试剂盒（#K-12045-D20）的化学发光测定进行检测。

测量减数分裂进展和全细胞免疫荧光

1.5毫升4.5x107将减数分裂时程的孢子细胞在4°C下固定过夜，在不同时间点的终浓度为3.7%甲醛。第二天，用1ml磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤固定细胞一次，并在4°C下储存在1.5ml PBS中。 为了使用DAPI分析减数分裂进展，将30μl固定细胞置于包被载玻片的每个孔上（卡尔森科学cat#101206）。允许细胞在室温（RT）下沉降到载玻片上15分钟。孵育后，将剩余的液体吸走，并将载玻片风干。向每个孔中加入3μlDAPI加封片剂（Vectashield H-1200），并用盖玻片覆盖载玻片并用指甲油密封。使用蔡司Axio Imager.Z2显微镜和蔡司Plan-复消色差63X物镜观察DAPI染色细胞。在每个时间点计数200个细胞，并分类为单核，双核（减数分裂I）或四核（减数分裂II）。T50对于每种培养物，以图形方式确定特定孢子培养物达到其最大%MI + MII值的1/2的时间（以小时为单位）。

对于全细胞免疫荧光分析，通过将30μl0.01%聚-L-赖氨酸（Sigma Cat#p4707）移液到每个孔中并在室温下孵育15分钟来处理含有12孔（卡尔森科学cat#101206）的包被载玻片。使用吸气器从孔中除去残留的聚-L-赖氨酸。然后通过将30μl水移液到每个孔中来洗涤载玻片两次，然后抽吸。

对于球状体，1.5x107将固定细胞在75μlZK缓冲液（25mM Tris-Cl pH7.5，0.8M KCl）+ 0.04M二硫苏糖醇（DTT）中在室温下孵育2分钟。沉淀细胞，除去上清液。将细胞沉淀重悬于75μlZK缓冲液+ 0.1mg / mL酶解酶100T（美国生物Z1004）中，并在室温（RT）下孵育10分钟。将球状细胞以低速（900×g）离心，并在500μl冰冷山梨糖醇/ MES缓冲液（1M山梨糖醇，0.1M MES pH6.5，1mM EDTA，0.5mM MgCl2).洗涤后，将细胞重悬于150μl山梨糖醇/ MES + 0.1%Triton X-100中，并在室温下孵育5分钟以透化细胞膜。重复山梨糖醇/MES缓冲液洗涤。

将透化的细胞重悬于40μl山梨糖醇/ MES缓冲液中。将30μl重悬细胞加入到印刷显微镜载玻片的每个孔中。让细胞沉淀在载玻片上15分钟后，将剩余的液体吸走。将载玻片放入-20°C下装有甲醇的科普林罐中6分钟，然后转移到-20°C下装有丙酮的科普林罐中30秒。之后，将载玻片风干，直到所有残留的丙酮蒸发。将30μl1%牛血清白蛋白（BSA）加入Tris缓冲盐水（TBS）（140mM NaCl，2.7mM KCl，25mM Tris pH8.0）中，并在室温下在带有湿纸巾的载玻片盒中孵育30分钟。孵育后，将载玻片在TBS缓冲液中洗涤30秒。用纸巾将载玻片靠在边缘上去除多余的TBS。将兔α-Red1多克隆抗体（兔16440）（Wan等人，2004）在1%BSA中以1：300稀释。将80μl一抗稀释液加入整个载玻片中，然后将25x50 mm盖玻片置于载玻片上。将一抗在4°C下用湿纸巾在载玻片盒中孵育过夜（~14-18小时）。第二天，在TBS中取出盖玻片，载玻片在TBS中洗涤2X10分钟。将山羊α兔Alexa 488抗体（Fisher Cat# A11008）在1%BSA中按1：1000稀释。向每张载玻片中加入80μl二抗稀释液并用盖玻片覆盖。将二抗在4°C下用湿纸巾在载玻片盒中孵育2小时。二抗孵育后，在TBS中除去盖玻片，并在TBS中洗涤载玻片2X10分钟。将载玻片在黑暗中完全风干，并向每个孔中加入3μL DAPI加封片剂。在载玻片上添加盖玻片并用指甲油密封。显微镜图像使用蔡司Axio Imager.Z2显微镜和蔡司Plan-复消色差63X物镜拍摄。

为了分析前期I在不同时间过程中的长度，在每个时间点计数200个细胞，并将其分类为Red1或Red1。%-Red1细胞随时间绘制图，并使用GraphPad Prism软件计算曲线下面积（AUC）。将每个时程的AUC除以最大%MI + MII值，以归一化该时程进入减数分裂的细胞数量。该计算得出“前期I期寿命”（hr），类似于先前用于计算减数分裂前S期长度的方法[113]。+-+

核扩散

核扩散的制备如Grubb，Brown中所述[163]。对于 Rad51 和 Dmc1 共染色免疫荧光，将多克隆豚鼠 α-Rad51 抗体血清和多克隆山羊 α-Dmc1 抗体血清（芝加哥大学 D. Bishop 的慷慨礼物）分别以 1：100 或 1：200 稀释成 1% BSA。向每张载玻片中加入80μl稀释的一抗，并用25 x 50 mm盖玻片覆盖。将载玻片在4°C的潮湿载玻片盒中孵育过夜（~14-18小时）。第二天，在TBS中取出盖玻片，载玻片在TBS中洗涤2X10分钟。将驴α豚鼠Alexa 488（Jackson ImmunoResearch 706-545-148）和驴α山羊Alexa 594（Fisher Cat#A11058）二抗分别按1：800和1：1000稀释至1%BSA。向每张载玻片中加入80μl稀释的二抗并用盖玻片覆盖。将载玻片在4°C的潮湿载玻片盒中孵育2小时。之后，将载玻片在1X TBS缓冲液中洗涤2X10分钟。将载玻片在黑暗中风干1小时，然后将30 μLDAPI加入载玻片中。载玻片上盖有盖玻片，并用指甲油密封。对于核扩散，使用蔡司Axio Imager.Z2显微镜和蔡司Plan-复消色差100X物镜拍摄显微镜图像。

荧光孢子测定

使用蔡司Axio Imager.Z2显微镜和蔡司Plan-复消色差63X物镜拍摄用于对VIII染色体非分离和交叉进行评分的四分体中的荧光孢子图像。在评分前，将细胞在 30°C 的固体 Spo 上孢化至少 3 天或在 30°C 的液体 Spo 中至少 24 小时。每个系统的荧光标记的遗传结构和预测的荧光孢子模式如图3G和S3所示。

在RGC系统中，根据产生的荧光孢子模式，可以在CEN8-ARG4和ARG4-THR1区间之间区分亲本二型（PD），四型（T）和非亲本二型（NPD）（S3图）。然而，CEN8-ARG4区间中的NPD导致与Chr VIII非分离相同的荧光孢子模式（S3图），使这两个事件难以区分。因此，使用在RCEN系统中观察到的VIII染色体不分离的频率估计CEN8-ARG4区间中NPD四联体的数量。该MI非析取频率乘以RGC四分体的总数，并从白色：白色;黑色;黑色四分体中减去该数字以获得NPD。对于WT，没有进行校正，因为在该菌株中没有观察到Chr VIII非分离。对于pif1-md、hedΔR和NDT80-mid，在映射距离计算中减去可以用RCEN系统中chr VIII非析取频率来解释的CEN8-ARG4 NPD四元组的数量。对于hedΔR NDT80-mid、hedΔR pif1-md和hed1Δ NDT80-mid pfi1-md，所有CEN8-ARG4非亲本二型四联体均假定是由于非分离所致[122]。使用斯塔尔实验室在线工具（https://elizabethhousworth.com/StahlLabOnlineTools/）使用珀金斯方程[164]计算遗传图谱距离。CEN8-ARG4和ARG4-THR1间隔之间的遗传干扰比与Malkova，Swanson[124]使用斯塔尔实验室在线工具计算。一个区间被指定为参考，该区间的四联体被分为两组：一组具有没有交叉的亲本二型（PD），另一组具有包含至少一个交叉的四型（Ts）或非亲本二型（NPD）。然后使用来自参考区间的PD或T+NPD组的四边形计算相邻测试区间的映射距离。将T+NPD组推导的测试区间内映射距离除以PD组得到的映射距离，得到交叉干涉比。如果参考区间的交叉干扰了测试间隔中的交叉，则此比率应小于 1，而没有干扰则给出等于 1 的比率。CEN8-ARG4和ARG4-THR1间隔之间交叉干扰的意义是使用独立性G检验完成的。

分频器、非分频器和dHJ的物理分析

分析减数分裂时程中HIS4-LEU2 DSB热点处的交叉和非交叉形成[123]。使用MasterPure 酵母DNA纯化试剂盒（Lucigen MPY80200）从孢子培养物中分离基因组DNA。基因组DNA样品的处理和用于可视化HIS4LEU2热点处交叉和非交叉的Southern 印迹分析如[165]所示。为了检测包括SEI，IH-dHJ和IS-dHJ在内的关节分子，对来自减数分裂时间过程的细胞进行补骨脂素交联，然后提取基因组DNA，用XhoI限制性酶切和2D凝胶南方印迹分析，如之前在Sandhu，Monge Neria（128）中所述。

URA3-tel-ARG4热点分析

为了防止由于NH2700 hedΔR msh2Δ二倍体中缺乏错配修复而导致的营养生长过程中突变积累，首先将单倍体亲本从冷冻库存中划出到YPDcom上，并在30°C下生长51小时。 将来自每个单倍体的五个单菌落在微量离心管中的 200 μL YPD 中合并，并通过涡旋将细胞充分混合。将整个体积移液到YPD板上，并将细胞在30°C下孵育7小时以允许交配。从平板上刮下细胞，修补到含有孢子培养基（1%乙酸钾，2%琼脂和0.0004%组氨酸）的平板上，并在30°C下孵育两天。 所得四联体被解剖到YPDcom上。

将具有四个活孢子和hphMX和natMX4的2：2分离的四分体的孢子菌落接种到含有2ml YPD的15ml玻璃试管中，并在30°C振荡孵育过夜。注意确保每次接种都使用整个孢子菌落。为了储存，将每种培养物中的0.4ml转移到含有0.4ml 50%甘油的无菌1ml 96孔板中的孔中，并在-80°C下冷冻。 此外，将0.1ml细胞培养物转移到具有尖底的0.45ml 96孔板中的相应位置（Fisher Scientific，#249946）。将细胞在贝克曼台式离心机中以3000rpm沉淀10分钟，并通过抽吸除去上清液。每个板使用微密封“F”PCR板密封（Bio-Rad，#MSF1001）密封并储存在-80°C。 重复此过程以从总共216个四分体（9 * 24四分体/板）中生成包含孢子菌落的九个板。

从0.1ml细胞沉淀中分离DNA，如下所示。一次处理两个 96 孔板。首先，将5.5ml缓冲液1（100ml 1M山梨糖醇，0.1M EDTA）置于100ml无菌储液槽（Stellar Scientific，#1930-1030）中，其中加入1430μL 10mg / ml酶解酶100T（100单位/ mg）（美国生物，#Z1004）。为了对细胞进行球状增塑，使用多通道移液器将每个细胞沉淀重悬于20μL缓冲液1 +酶解酶中。将板盖上并在37°C下振荡孵育30分钟。 将6ml缓冲液2（50mM Tris-HCl，pH 8，20mM EDTA，0.35M SDS）置于新鲜储液器中，向每个孔中加入20μl并用移液器充分混合。将板盖上并在65°C下旋转孵育30分钟。在储液槽中使用6 ml 5 M乙酸后酯向每个孔分配16 μL。混合充分后，将板盖上并在4°C下孵育10分钟。使用9ml 1 X TE（10 mM Tris-HCl，pH8，1 mM EDTA）向每个孔中加入80μL TE，然后将板盖上并在贝克曼台式离心机中以3500rpm在4°C下旋转60分钟。 为了沉淀DNA，将50μL上清液转移到每个孔中含有50ul异丙醇的新96孔板中并混合。用塑料盖覆盖板并在室温下孵育五分钟。通过使用贝克曼台式离心机以3500rpm旋转板10分钟获得DNA沉淀，然后通过抽吸小心地除去上清液。用100μl70%乙醇洗涤DNA沉淀并像以前一样离心。通过抽吸除去上清液后，将未覆盖的板置于42°C下30分钟以使沉淀干燥。每孔加入30μL TE后，将板密封并在4°C下孵育过夜。第二天，通过与移液器混合将DNA重悬。根据制造商的说明，使用 BioTek Synergy 2 荧光计，使用 Qubit dsDNA HS 检测试剂盒（费希尔科学，#33231）在黑色、圆底未处理的 96 孔板（费希尔科学07200762）中测定每个样品 1 μL 的 DNA 浓度。

为了便于DNA测序分析，使用以下引物扩增含有6，865 bp重组间隔的PCR扩增子：ACGGCACCACTATAAACCCG和GTGGGCTAAAGAACGCGAAC，5'端带有孢子特异性条形码（S2数据）。如S2数据所示，所有反应均在96孔板中进行。每个反应含有20μL并使用Q5聚合酶（新英格兰生物实验室，#M0491）。将试剂分配到96孔板的每个孔中，如下所示。通过添加（13 X 4.0 μL 5X Q5反应缓冲液）+（13 X 2.6 μL dNTP）+（13 X 0.75 μL水）+（13 X 0.4 μL 50 mM MgCl）来创建“色谱柱预混液”2） +（13 X 0.5 μL Q5 聚合酶），将 82 μL 加入到 12 条含有 8 个 0.2 ml 管的试纸中。然后将10 μL用于适当色谱柱的10 uM Forward引物等分到给定试纸的每个管中。混合后，将单条中每个试管中的 9.25 μL 等分到96孔PCR板的适当色谱柱中。通过加入 14 X 8.75 μL 水，然后将 122.5 μL 水分装到 8 条（每条 8 个管）中，生成“行预混液”。每条纸条代表一行，因此将14 μL指定用于该行的10 μM反向引物添加到试纸条内的每个试管中。然后将 9.75 μL 行预混液加入已包含色谱柱混合物的 PCR 板每行的 12 个孔中。最后，将 1 μL DNA 加入到每个板的适当孔中。用光学透明的PCR板塑料密封覆盖板，并在贝克曼台式离心机中以2000rpm旋转2分钟。使用罗氏光循环仪96进行PCR反应，程序如下：98°C，40秒;98°C 20秒，67°C，20秒，72°C，7分钟（30次循环）;72°C，10分钟;保持 20°C。

PCR完成后，像以前一样离心样品以收集每个孔底部的所有液体。将每个反应的 2 μL 在 0.5X TBE 缓冲液中的 0.9% 琼脂糖凝胶上以 100 V 运行 1 小时。检查所有反应是否存在~6 kb片段。共有159个四联体，其中所有四个孢子都表现出突出的PCR条带，并被纳入测序分析。将每个成功反应的 4 μL 合并到一个 1.5 ml 微量离心管中，并使用 Agencourt AMPure XP 磁珠（贝克曼库尔特 #A63881）去除引物。

DNA测序和分析

混合扩增子在Pacbio RS II仪器上测序。随后，使用 seqkit 的定位功能在 PacBio 读取（253 万）中识别条形码（Shen 等人，2016 年）。根据条形码信息，使用自定义脚本将 Pacbio-fastq 文件 （https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/PRJNA873686） 解复用为特定于样本的 fastq 文件 （n = 794）。每个样本特定的fastq文件都使用minimap2[166]与热点对齐（Ahuja等人，2021），使用jvarkit的sam2tsv函数确定每次读取的每个核苷酸的碱基组成[167]。

随后，通过自定义脚本确定相位，其功能如下：（1）确定每个读取（n = 2，384，252）上每个多态位置（n = 48）存在的碱基;（2）根据每个位置存在的核苷酸，为每个读取的每个多态位置分配W（WT）或S（SNP）;（3）选择具有所有多态性位点信息的读段;（4）在所有多态性位置通过相同的标记配置对读段进行分组，并将它们绘制为支持单倍型的单倍型和读段数。接下来，手动分析这些图，并将链分为以下类别：（1）只有一个单倍型，表示整个区间内所有标记处的同型双链，即两条链相同;（2）跨区间的两个单倍型表示孢子菌落的两条链;（3）这些图中有两个以上的单倍型。在这些情况下，大多数读段支持两个单倍型，而其他一些读段可能是由于PCR问题而导致的混杂重排，这些需要手动检查和删除。当前项目中使用的最终单倍型来自 1，179，721 个读数，其中每个单倍型读数的平均读数为 1584 个读数，标准偏差为 1286 个读数。一旦确定每个孢子群落的每条链的共识单倍型，并在S2数据中评分。每个四分体中的标记配置示意图在 S3 数据中。

支持信息

包含用于图中所示的所有数值数据的数据和计算。

显示 1/11： pgen.1010407.s001.xlsx

跳到无花果共享导航

一个 B C D E F G H 我 J

1 应变 基因型 在 spo 介质中的时间 （小时） 单核 双核 四核酸酯 总 % MI % MII %MI 和 MII

2 NH716 文晔 0 200 0 0 200 0 0 0

3 NH716 文晔 2 199 1 0 200 0.5 0 0.5

4 NH716 文晔 3 189 8 3 200 4 1.5 5.5

5 NH716 文晔 4 171 29 0 200 14.499999999999998 0 14.499999999999998

6 NH716 文晔 5 90 40 70 200 20 35 55

7 NH716 文晔 6 64 38 98 200 19 49 68

8 NH716 文晔 7 44 13 143 200 6.5 71.5 78

9 NH716 文晔 8 25 22 153 200 11 76.5 87.5

10 NH716 文晔 9 21 11 168 200 5.5 84 89.5

11 NH716 文晔 10 17 14 169 200 7.000000000000001 84.5 91.5

12 NH716 文晔 12 16 8 176 200 4 88 92

13

14 NH716 文晔 0 199 1 0 200 0.5 0 0.5

15 NH716 文晔 2 200 0 0 200 0 0 0

16 NH716 文晔 3 199 1 0 200 0.5 0 0.5

17 NH716 文晔 4 199 1 0 200 0.5 0 0.5

18 NH716 文晔 5 113 68 19 200 34 9.5 43.5

19 NH716 文晔 6 55 40 105 200 20 52.5 72.5

20 NH716 文晔 7 51 19 130 200 9.5 65 74.5

21 NH716 文晔 8 24 6 170 200 3 85 88

22 NH716 文晔 9 18 6 176 200 3 88 91

23 NH716 文晔 10 14 9 177 200 4.5 88.5 93

24 NH716 文晔 12 15 5 180 200 2.5 90 92.5

25

26 NH716 文晔 0 200 0 0 200 0 0 0

27 NH716 文晔 2 200 0 0 200 0 0 0

28 NH716 文晔 3

29 NH716 文晔 4 186 13 1 200 6.5 0.5 7

30 NH716 文晔 5

31 NH716 文晔 6 138 31 31 200 15.5 15.5 31

32 NH716 文晔 7

33 NH716 文晔 8 68 23 109 200 11.5 54.50000000000001 66

34 NH716 文晔 9

35 NH716 文晔 10 41 14 145 200 7.000000000000001 72.5 79.5

36 NH716 文晔 12 46 9 145 200 4.5 72.5 77

37

38 NH716 文晔 0 200 0 0 200 0 0 0

39 NH716 文晔 2 200 0 0 200 0 0 0

40 NH716 文晔 3

41 NH716 文晔 4 198 2 0 200 1 0 1

42 NH716 文晔 5

43 NH716 文晔 6 142 41 17 200 20.5 8.5 29

44 NH716 文晔 7

45 NH716 文晔 8 51 24 125 200 12 62.5 74.5

46 NH716 文晔 9

47 NH716 文晔 10 30 9 161 200 4.5 80.5 85

48 NH716 文晔 12 10 7 183 200 3.5000000000000004 91.5 95

49

50 NH716 文晔 0 200 0 0 200 0 0 0

图1A图1B图1C图1E图1F图1H图1I图2A图2B图2C图2D图2E图3A图3B图3C图3D，S7C图3E，F图3G图4C图4D图4E图4F图5图6A图6B图 8A， B图8C，D图8E图8F图S2CD图S5A图S5CS6A_FigS6B_Fig

1 / 11

下载

无花果分享

S1 数据。 包含用于图中所示的所有数值数据的数据和计算。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010407.s001

（三十）

S2 数据。 包含用于比较WT和hedΔR的URA3-tel-ARG4热点分析的数据。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010407.s002

（三十）

S3 数据。 包含每个四分体的四个染色单体中多态性分布的示意图。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010407.s003

（网页）

S1 表。 酿酒酵母菌株。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010407.s004

（文档）

S2 表。 质 粒。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010407.s005

（文档）

S1 图 验证用于细胞学分析的 Dmc1、Rad51 和 Red1 抗体。

（A）检测Dmc1和Rad51病灶。用针对 Rad51 或 Dmc1 的抗体探测由 WT （NH716）、dmc1Δ （NH2664） 或 rad51Δ （NH793） 制成的 Spo 培养基中指定时间点的染色体扩散，并通过间接免疫荧光检测。DAPI染色用于检测DNA。比例尺为 2 μm。（B）全细胞Red1免疫荧光。将二倍体ndt80Δ（NH2234）和ndt80Δ红1Δ（NH2233）在Spo培养基中孵育指定时间。固定细胞，用DAPI染色并用α-Red1抗体探测。通过间接免疫荧光检测Red1。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010407.s006

（提夫）

S2 图 在各种突变二倍体中HIS4LEU2热点处的交叉和非交叉形成。

（A）用于此图的两个时间序列之一的南方印迹，包含WT，hedΔR，hedΔR NDT80-mid，pif1-md （NH2657），hedΔR pif1-md （NH2691）和hedΔR NDT80-mid pif1-md （NH2661）。 用XhoI和NgoMIV消化基因组DNA，以检测图4A中描述的CO2和NCO1特异性条带。（B） CO2 的量化，显示两个不同时间过程的平均值。（C）NCO1的量化，显示两个不同时间过程的平均值。请注意，其中一个hedΔR NDT80-mid重复在6小时时间点表现出异常高的值，这扭曲了结果。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010407.s007

（提夫）

S3 图 来自RGC二倍体的四联体的可能荧光孢子模式。

左侧显示了CEN8：：RFP和ARG4：：GFP*（间隔1）与ARG4：：GFP*和THR1：：CFP（间隔2）之间的交叉位置（用“X”表示）。下一列显示了指示的交叉后每个染色单体上荧光蛋白基因的配置。该表指示给定间隔是亲本二型 （PD）、四型 （T） 还是非亲本二型 （NPD）。图中灰色阴影部分中指示的四分体可能是由于间隔 1 中的 NPD 或 MI 非分离造成的。R = 红色，A = 浅绿色，W = 白色，Bl = 黑色，P = 紫色，G = 绿色，Y = 黄色，B = 蓝色。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010407.s008

（提夫）

S4 图 hedΔR和WT中的基因转换道。

非杂交（A）和杂交（B）中的基因转换束在hedΔR（顶部）和野生型（底部）中。粗彩色条和细灰色条分别表示最小和最大 NMS 区。绿松石 - 一个染色单体上的异质双工;棕色 - 两个染色单体上的异质双链体。纵轴-四分体标识符;垂直线 - 标记位置。基础数据位于 S2 数据、表 6 和 [127] 中。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010407.s009

（提夫）

S5 图 在hedΔR NDT80-mid背景中RRM3和PIF1的不同等位基因的互补。

（一）孢子活力。hedΔR NDT80-mid rrm3Δ 二倍体 （NH2596） 的单个菌落，包含载体 （v） （pRS306）、RRM3 （pBG22） 或 P 的两个拷贝建议8-RRM3 （pJW7） 和含有两个拷贝的 pRS306、PIF1 （pJW5）、pif1-m1 （pJW5-m1）、PIF1-3FLAG （pJW11） 或 pif1-m1-3FLAG （pJW14） 的 hedΔR NDT80-mid pif1-m1-3FLAG （pJW14） 在固体培养基上孢子，每个转化体至少解剖 20 个四分体。 使用曼-惠特尼检验（* = p < .05; ** = p < .01 ; *** = p < .001， **** = p < .0001） 确定菌株之间差异的统计学意义。 （B）图A所示的hedΔR NDT80-mid pif1-md解剖子群的四分体中活孢子的分布。 （C）hed1Δ dmc1Δ （NH942），hed1Δ dmc1Δ pif1-md （NH2716），hedΔR dmc1Δ（NH2701），hedΔR dmc1-II3A （NH2714）和hedΔR dmc1Δ pif1-md（NH2693）的单菌落被孢子化并解剖和分析，如图A所述。 （D）四分体 中活孢子的分布hedΔR NDT80-mid rrm3Δ解剖如图A所示。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010407.s010

（提夫）

S6 图 当Rad51在减数分裂前期I期间持续活跃时，PIF1促进减数分裂进展。

（A）减数分裂进展。如图1A所示进行时程分析以确定双核细胞和四核细胞的百分比，并绘制每个时间点的平均%MI + MII值。WT、hedΔR和hedΔR NDT80-mid的菌株和数据与图3A相同，但增加了两个生物学重复。新菌株为pif1-md （NH2657） （n = 7）， hedΔR pif1-md （NH2691） （n = 11） 和hedΔR NDT80-mid pif1-md （NH2661） （n = 7）。（二） 吨50为面板A中的时间过程计算的值。 （C）前期寿命。面板B和C的WT、hedΔR和hedΔR NDT80-mid的数据取自图3。含有菌株的pif1-md的数据来自图A中的时间过程。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010407.s011

（提夫）

确认

我们感谢Doug Bishop，Brooks Crickard，Bruce Futcher，Wolf Heyer，Scott Keeney，Ed Luk，Aaron Neiman，Adam Rosebrock以及Hollingsworth和Luk实验室的成员进行有益的讨论。Bob Gaglione，Wolf Heyer和Aaron Neiman对手稿提供了有用的评论。Scott Keeney和Allison Marullo提供了质粒，Eric Greene与我们分享了未发表的数据。我们感谢Doug Bishop和Jennifer Grubb提供的抗体和有用的技术建议，感谢Aaron Neiman和Ed Luk分别允许我们使用荧光显微镜和酶标仪。我们感谢Lihong Wan和Bob Gaglione在四联体解剖和/或质粒/菌株构建方面的帮助。我们感谢癌症研究中心测序设施的高通量测序。这项工作使用了美国国立卫生研究院（NIH）Biowulf集群（http://hpc.nih.gov）的资源。

引用

1.Petronczki M，Siomos MF，Nasmyth K. Un menage a quatre：减数分裂中染色体分离的分子生物学。细胞。2003;112(4):423–40.

查看文章谷歌学术搜索

2.哈塞尔·犯错（从微缩上）是人类：人类非整倍性的起源。纳特·雷夫·热内。2001;2(4):280–91.Epub 2001/04/03.密码：11283700

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

3.维伦纽夫AM，希勒斯KJ。减数分裂从何而来？细胞。2001;106(6):647–50.Epub 2001/09/27.密码：11572770

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

4.Keeney S，Giroux CN，Kleckner N.减数分裂特异性DNA双链断裂由Spo11催化，Spo11是一个广泛保守的蛋白质家族的成员。细胞。1997;88(3):375–84.Epub 1997/02/07.pmid：9039264

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

5.Borde V，Goldman AS，Lichten M.减数分裂DNA复制和重组启动之间的直接偶联。科学。2000;290(5492):806–9.密码：11052944

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

6.Lam I， Keeney S. 减数分裂重组起始的机制和调控.冷泉哈伯透视生物学. 2014;7（1）：a016634.Epub 2014/10/18.密码：25324213

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

7.潘J， 佐佐木 M， 克尼维尔 R， 村上 H， 闪电战 HG， 蒂施菲尔德， 等.因子的分层组合塑造了酵母减数分裂重组启动的全基因组形貌。细胞。2011;144(5):719–31.Epub 2011/03/08.密码：21376234

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

8.加西亚五世，菲尔普斯SE，格雷S，尼尔MJ。通过Mre11和Exo1双向切除DNA双链断裂。自然界。2011;479(7372):241–4.Epub 2011/10/18.密码：22002605

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

9.孙 H， 特雷科 D， 索斯塔克 JW.广泛的 3'-悬垂单链 DNA 与 ARG4 重组起始位点的减数分裂特异性双链断裂相关。细胞。1991;64(6):1155–61.Epub 1991/03/22.

查看文章谷歌学术搜索

10.三木头EP， 山田 S， 基尼·减数分裂双链断端切除术的全球视图。科学。2017;355(6320):40–5.Epub 2017/01/07.密码：28059759

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

11.Bishop DK， Park D， Xu L， Kleckner N. DMC1：E的减数分裂特异性酵母同系物。重组、突触复合物形成和细胞周期进展所需的大肠杆菌 recA。细胞。1992;69(3):439–56.Epub 1992/05/01.

查看文章谷歌学术搜索

12.筱原A，小川H，小川T.参与S修复和重组的Rad51蛋白。酿酒是一种类似RecA的蛋白质。细胞。1992;69(3):457–70.Epub 1992/05/01.

查看文章谷歌学术搜索

13.羽生T， 泷 T， 西A， 西宗Y， 森田 T.DMC1（酵母减数分裂特异性同源重组基因）的小鼠和人类同系物在减数分裂中具有共同的独特形式的外显子跳过转录本。核酸研究 1996;24（3）：470–7.Epub 1996/02/01.密码：8602360

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

14.吉田K，近藤G，松田Y，羽生T，西宗Y，森田T。小鼠RecA样基因Dmc1是减数分裂期间同源染色体突触所必需的。摩尔细胞。1998;1(5):707–18.密码：9660954

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

15.Sung P. 酵母 RAD51 蛋白催化 ATP 依赖性同源 DNA 配对和链交换。科学。1994;265(5176):1241–3.Epub 1994/08/26.密码：8066464

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

16.红EL，筱原A，主教DK.酿酒酵母Dmc1蛋白促进单链DNA（ssDNA）的复性并将ssDNA同化为同源超螺旋双链DNA。生物学杂志 2001;276（45）：41906–12.Epub 2001/09/12.密码：11551925

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

17.Brown MS，Bishop DK. 减数分裂中的DNA链交换和RecA同系物。冷泉哈布透视生物学. 2014;7（1）：a016659.Epub 2014/12/06.pmid：25475089

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

18.Red-Hed调节：重组酶Rad51虽然能够发挥主导作用，但可能被降级为支持Dmc1在出芽酵母减数分裂中。基因开发 2006;20（13）：1685–91.密码：16818601

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

19.Brown MS， Grubb J， Zhang A， Rust MJ， Bishop DK. 小的Rad51和DMC1复合物经常共同占据减数分裂DNA双链断裂的两端。公共科学图书馆热内特。2015;11（12）：e1005653.Epub 2016/01/01.P pmid：26719980

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

20.李明， 张玉昌， 洪爱， 格拉布 J， 张 CS， 毕晓普 DK， 等.钙离子通过形成具有单链DNA的长而细的螺旋丝来促进酵母Dmc1活性。生物学杂志 2005;280（49）：40980–4.Epub 2005/10/06.pmid：16204247

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

21.小川T，Yu X，筱原A，埃格尔曼EH。酵母RAD51细丝与细菌RecA细丝的相似性。科学。1993;259(5103):1896–9.Epub 1993/03/26.密码：8456314

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

22.Hinch AG， Becker PW， Li T， Moralli D， Zhang G， Bycroft C， et al.RPA、RAD51和DMC1结合在减数分裂中的配置揭示了关键重组中间体的性质。摩尔细胞。2020;79（4）：689–701 e10.Epub 2020/07/02.pmid：32610038

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

23.Benson FE，Stasiak A，West SC.人类Rad51蛋白的纯化和表征，E的类似物。大肠杆菌建议。EMBO J. 1994;13（23）：5764–71.密码：7988572

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

24.Sheridan SD， Yu X， Roth R， Heuser JE， Sehorn MG， Sung P， et al.Dmc1和Rad51核蛋白丝的比较分析。核酸研究 2008;36（12）：4057–66.Epub 20080604。密码：18535008

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

25.Cloud V， Chan YL， Grubb J， Budke B， Bishop DK. Rad51是减数分裂过程中Dmc1介导的关节分子形成的辅助因子。科学。2012;337(6099):1222–5.Epub 2012/09/08.密码：22955832

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

26.老挝JP，Oh SD，筱原M，筱原A，亨特N.Rad52促进减数分裂双链断裂修复的入侵后步骤。摩尔细胞。2008;29(4):517–24.pmid：18313389

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

27.主教DK. RecA同系物Dmc1和Rad51在减数分裂染色体突触之前相互作用形成多个核复合物。细胞。1994;79(6):1081–92.Epub 1994/12/16.pmid：7528104

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

28.库兹鲍尔， 乌安舒 C， 陈 D， 施洛格尔霍夫 P.重组酶DMC1和RAD51在拟南芥减数分裂期间在功能和空间上分离。植物细胞。2012;24(5):2058–70.Epub 2012/05/17.pmid：22589466

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

29.兰华， 林思， 高茜， 张华， 叶海， 张海， 等.Rad51促进减数分裂特异性Dmc1重组酶的丝组装。美国国家科学院院刊， 2020;117（21）：11257–64.Epub 20200513。pmid：32404423

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

30.Da Ines O， Degroote F， Goubely C， Amiard S， Gallego ME， White CI.拟南芥减数分裂重组受DMC1催化，RAD51起支持作用。公共科学图书馆热内特。2013;9（9）：e1003787.Epub 20130926。密码：24086145

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

31.Petukhova G，Stratton S，Sung P.酵母Rad51和Rad54蛋白催化同源DNA配对。自然界。1998;393(6680):91–4.Epub 1998/05/20.密码：9590697

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

32.Nimonkar AV， Dombrowski CC， Siino JS， Stasiak AZ， Stasiak A， Kowalczykowski SC. 酿酒酵母Dmc1和Rad51蛋白分别优先与Tid1和Rad54蛋白一起发挥作用，以促进基因重组过程中的DNA链侵袭。生物学杂志 2012;287（34）：28727–37.Epub 2012/07/05.pmid：22761450

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

33.比安奇M，达斯古普塔C，拉德CM.突触和E的副神经关节的形成。大肠杆菌RecA蛋白。细胞。1983;34(3):931–9.Epub 1983/10/01.

查看文章谷歌学术搜索

34.谜语PW，雷曼IR。大肠杆菌的recA和单链DNA结合蛋白在DNA分子之间形成副肾和多端关节。生物学杂志 1985;260（1）：165–9.Epub 1985/01/10.

查看文章谷歌学术搜索

35.Van Komen S，Petukhova G，Sigurdsson S，Stratton S，Sung P.酵母重组因子Rad51和Rad54的超螺旋驱动同源DNA配对。摩尔细胞。2000;6(3):563–72.Epub 2000/10/13.密码：11030336

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

36.Christiansen G，Griffith J.由大肠杆菌RecA蛋白催化的同源DNA分子的副肾连接的可视化。美国国家科学院院刊， 1986;83（7）：2066–70.Epub 1986/04/01.密码：3515345

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

37.Rad54在D环形成过程中充当由其DNA底物和Rad51调节的异质双链DNA泵。摩尔细胞。2014;53(3):420–32.Epub 2014/02/04.pmid：24486020

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

38.Shibata T， DasGupta C， Cunningham RP， Radding CM. 纯化的大肠杆菌recA蛋白催化超螺旋DNA和单链片段的同源配对。美国国家科学院院刊， 1979;76（4）：1638–42.Epub 1979/04/01.密码：156361

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

39.Petukhova G，Van Komen S，Vergano S，Klein H，Sung P. 酵母Rad54通过ATP水解驱动的DNA双螺旋构象变化促进Rad51依赖性同源DNA配对。生物学杂志 1999;274（41）：29453–62.Epub 1999/10/03.pmid：10506208

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

40.Piazza A， Shah SS， Wright WD， Gore SK， Koszul R， Heyer WD. 重组 DNA 修复过程中位移环的动态处理。摩尔细胞。2019;73（6）：1255–66 e4.Epub 2019/02/10.密码：30737186

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

41.海耶WD，李X，罗尔夫斯迈尔M，张XP。Rad54：同源重组的瑞士军刀？核酸研究 2006;34（15）：4115–25.Epub 2006/08/29.密码：16935872

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

42.克里卡德JB。Rad54和Rdh54在同源重组过程中的离散作用。Curr Opin Genet Dev. 2021;71：48–54.Epub 2021/07/23.密码：34293661

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

43.Crickard JB，Moevus CJ，Kwon Y，Sung P，Greene EC. Rad54在同源重组过程中驱动ATP水解依赖性DNA序列比对。细胞。2020;181（6）：1380–94 e18.Epub 2020/06/06.密码：32502392

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

44.Crickard JB，Kwon Y，Sung P，Greene EC. Rad54和Rdh54在Rad51-ssDNA突触前复合物中占据空间和功能上不同的位点。EMBO J. 2020;39（20）：e105705.Epub 2020/08/14.pmid：32790929

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

45.Tavares EM， Wright WD， Heyer WD， Le Cam E， Dupaigne P. Rad54在Rad51-ssDNA丝依赖性同源搜索和突触复合物形成的体外作用。纳特公社。2019;10(1):4058.Epub 2019/09/08.密码：31492866

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

46.Mazin AV，Bornarth CJ，Solinger JA，Heyer WD，Kowalczykowski SC.Rad54蛋白靶向通过Rad51核蛋白丝配对位点。摩尔细胞。2000;6(3):583–92.Epub 2000/10/13.pmid：11030338

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

47.聪明 B， Interthal H， Schmuckli-Maurer J， King J， Sigrist M， Heyer WD. 酵母中的重组修复：Rad51 和 Rad54 蛋白之间的功能相互作用。EMBO J. 1997;16（9）：2535–44.Epub 1997/05/01.密码：9171366

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

48.蒋华， 谢莹， 休斯顿 P， 斯坦克-黑尔 K， 莫滕森 UH， 罗斯坦 R， 等.酵母 Rad51 和 Rad54 重组蛋白之间的直接关联。生物学杂志 1996;271（52）：33181–6.密码：8969173

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

49.马津AV，阿列克谢耶夫AA，科瓦尔奇科夫斯基SC。Rad54蛋白的新功能：稳定Rad51核蛋白丝。生物学杂志 2003;278（16）：14029–36.Epub 2003/02/05.密码：12566442

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

50.RAD54控制在酿酒酵母同源重组中RAD51介导的DNA链入侵后对入侵的3'-OH末端的访问。 核酸研究 2009;37（2）：638–46.Epub 2008/12/17.密码：19074197

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

51.Solinger JA，Kiianitsa K，Heyer WD. Rad54是一种Swi2 / Snf2样重组修复蛋白，可拆卸Rad51：dsDNA细丝。摩尔细胞。2002;10(5):1175–88.Epub 2002/11/28.密码：12453424

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

52.Maloisel L， Fabre F， Gangloff S. DNA聚合酶δ在同源重组过程中优先募集以促进异源双链DNA延伸。分子细胞生物学. 2008;28（4）：1373–82.Epub 2007/12/19.pmid：18086882

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

53.马洛瓦塞尔 L， 巴尔加瓦 J， 罗德 GS.DNA聚合酶δ在酿酒酵母减数分裂期间的基因转化和交叉中的作用。遗传学。2004;167(3):1133–42.Epub 2004/07/29.邮编：15280229

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

54.Li X， Stith CM， Burgers PM， Heyer WD. PCNA 是启动 DNA 聚合酶 δ 重组相关 DNA 合成所必需的。摩尔细胞。2009;36(4):704–13.密码：19941829

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

55.Sneeden JL，Grossi SM，Tappin I，Hurwitz J，Heyer WD.用人类蛋白质重建重组相关DNA合成。核酸研究 2013;41（9）：4913–25.Epub 20130327。pmid：23535143

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

56.Allers T，Lichten M.减数分裂过程中非交叉和交叉重组的差分时间和控制。细胞。2001;106(1):47–57.Epub 2001/07/20.密码：11461701

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

57.De Muyt A， Jessop L， Kolar E， Sourirajan A， Chen J， Dayani Y， et al. BLM解旋酶直系同源物Sgs1是减数分裂重组中间代谢的中枢调节因子。摩尔细胞。2012;46(1):43–53.Epub 2012/04/17.密码：22500736

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

58.Zakharyevich K， Tang S， Ma Y， Hunter N. 减数分裂中关节分子解析途径的描述确定了交叉特异性溶解酶。细胞。2012;149(2):334–47.Epub 2012/04/17.密码：22500800

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

59.McMahill MS，Sham CW，Bishop DK.减数分裂中的合成依赖性链退火。公共科学图书馆生物学. 2007;5（11）：e299.密码：17988174

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

60.Kaur H， De Muyt A， Lichten M. Top3-Rmi1 DNA单链脱链酶是减数分裂重组中间体形成和分离不可或缺的一部分。摩尔细胞。2015;57(4):583–94.密码：25699707

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

61.Tang S， Wu MKY， Zhang R， Hunter N. Top3-Rmi1脱级酶的普遍和重要作用协调重组并促进减数分裂中的染色体分离。摩尔细胞。2015;57(4):607–21.pmid：25699709

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

62.Bell L，Byers B.减数分裂期间酵母DNA中交叉链交换形式的发生。美国国家科学院院刊， 1979;76（7）：3445–9.Epub 1979/07/01.邮编：386340

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

63.Schwacha A，Kleckner N.鉴定双霍利迪结作为减数分裂重组中的中间体。细胞。1995;83(5):783–91.密码：8521495

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

64.Szostak JW， Orr-Weaver TL， Rothstein RJ， Stahl FW.用于重组的双链断裂修复模型。细胞。1983;33(1):25–35.密码：6380756

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

65.Pyatnitskaya A，Borde V，De Muyt A.交叉和压缩：ZMM蛋白在减数分裂中的分子作用。染色体。2019;128(3):181–98.Epub 2019/06/27.密码：31236671

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

66.Borner GV，Kleckner N，Hunter N.减数分裂的交叉/非交叉分化，突触复合物形成和瘦素/合子烯过渡的调节监测。细胞。2004;117(1):29–45.Epub 2004/04/07.密码：15066280

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

67.Sym M， Engebrecht JA， Roeder GS.ZIP1是减数分裂染色体突触所需的突触复合物蛋白。细胞。1993;72(3):365–78.Epub 1993/02/12.

查看文章谷歌学术搜索

68.Zickler D，Kleckner N.减数分裂期间同系物的重组，配对和突触。冷泉哈布透视生物学. 2015;7（6）.Epub 20150518。密码：25986558

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

69.Grey C， de Massy B. 早期减数分裂前期的染色体组织。前细胞开发生物学. 2021;9：688878.Epub 20210603。密码：34150782

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

70.史密斯AV，罗德GS。酵母Red1蛋白定位于减数分裂染色体的核心。细胞生物学杂志. 1997;136（5）：957–67.Epub 1997/03/10.pmid：9060462

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

71.克莱因 F， 马尔 P， 加洛娃 M， 布奥诺莫 SBC， 迈克尔斯 C， 奈尔兹 K， 等.在酵母减数分裂过程中，内聚力在姐妹染色单体内聚、轴向元素形成和重组中起核心作用。细胞。1999;98(1):91–103.

查看文章谷歌学术搜索

72.霍林斯沃思，格奇 L，拜尔斯 B.HOP1基因编码酵母染色体的减数分裂特异性成分。细胞。1990;61(1):73–84.Epub 1990/04/06.

查看文章谷歌学术搜索

73.汉弗莱斯 N， 梁 WK， 阿尔贡汉 B， 捷连季耶夫 Y， 德沃拉科娃 M， 椿内 H.Ecm11-Gmc2复合物通过在出芽酵母中组装横丝来促进突触复合物的形成。公共科学图书馆热内特。2013;9（1）：e1003194.Epub 20130110。密码：23326245

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

74.罗克米尔B，罗德GS。染色体突触和重组所需的减数分裂特异性蛋白激酶同系物。基因开发 1991;5（12B）：2392–404.密码：1752435

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

75.霍林斯沃思，加格里奥内·出芽酵母中的减数分裂特异性Mek1激酶调节同系物重组，并通过双链断裂修复协调减数分裂进展。柯尔热内。2019;65(3):631–41.Epub 20190122。pmid：30671596

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

76.李姆、小川·MRE4基因编码酿酒酵母减数分裂重组所需的新型蛋白激酶同系物。核酸研究 1992;20（3）：449–57.密码：1741279

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

77.Xu L，Weiner BM，Kleckner N.减数分裂细胞监测同源物重组复合物的状态。基因开发 1997;11（1）：106–18.Epub 1997/01/01.pmid：9000054

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

78.牛 H， 万 L， 鲍姆加特纳 B， 舍费尔 D， 洛德尔 J， 霍林斯沃思 NM.减数分裂过程中的伴侣选择由Hop1促进的Mek1二聚化调节。分子生物细胞。2005;16(12):5804–18.Epub 20051012。密码：16221890

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

79.Kim KP， Weiner BM， Zhang L， Jordan A， Dekker J， Kleckner N. 姐妹内聚力和结构轴分量介导减数分裂重组的同系物偏差。细胞。2010;143(6):924–37.Epub 2010/12/15.密码：21145459

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

80.陈旭， 苏汉迪纳塔， 桑德胡 R， 罗克米尔 B， 莫希布拉 N， 牛 H， 等.突触复合蛋白Zip1的磷酸化调节酵母减数分裂期间的交叉/非交叉决策。公共科学图书馆生物学. 2015;13（12）：e1002329.Epub 2015/12/20.pmid：26682552

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

81.卡迪克LC，哈特韦尔LH。姊妹染色单体优于同系物，作为酿酒酵母重组修复的底物。遗传学。1992;132(2):387–402.

查看文章谷歌学术搜索

82.Bzymek M，Thayer NH，Oh SD，Kleckner N，Hunter N.双Holliday连接是DNA断裂修复的中间体。自然界。2010;464(7290):937–41.Epub 2010/03/30.密码：20348905

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

83.Schwacha A，Kleckner N.减数分裂重组过程中的同源物间偏差：减数分裂功能促进高度分化的仅同系物间途径。细胞。1997;90(6):1123–35.Epub 1997/10/10.密码：9323140

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

84.Callender TL， Laureau R， Wan L， Chen X， Sandhu R， Laljee S， et al. Mek1 通过 Hed1 的磷酸化调节酵母减数分裂期间的 Rad51 活性。公共科学图书馆热内特。2016;12（8）：e1006226.Epub 2016/08/03.密码：27483004

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

85.Busygina V，Sehorn MG，Shi IY，Tsubouchi H，Roeder GS，Sung P. Hed1通过一种新的机制调节Rad51介导的重组。基因开发 2008;22（6）：786–95.Epub 2008/03/19.pmid：18347097

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

86.椿内H，罗德GS。当减数分裂重组受损时，出芽酵母Hed1下调有丝分裂重组机制。基因开发 2006;20（13）：1766–75.密码：16818607

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

87.牛海， 万玲， 布西吉娜， 权蕊， 艾伦， 李旭， 等.通过Mek1介导的Rad54磷酸化调节减数分裂重组。摩尔细胞。2009;36(3):393–404.密码：19917248

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

88.劳太平， 云五， 黄稽， 格拉布， 塞克， 李澎， 等.通过Rad51-DMC1在同系物模板偏置中的协同作用和稳健稳态调节进行减数分裂交叉控制。公共科学图书馆热内特。2013;9（12）：e1003978.Epub 20131219。pmid：24367271

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

89.洪 S， 宋 Y， 于明， 李 M， 克莱克纳 N， 金 KP.同源重组伴侣选择的逻辑与机制.摩尔细胞。2013;51(4):440–53.密码：23973374

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

90.Bishop DK， Nikolski Y， Oshiro J， Chon J， Shinohara M， Chen X. 由dmc1突变引起的减数分裂停滞的高拷贝数抑制：REC114施加早期重组阻滞，RAD54促进DMC1非依赖性DSB修复途径。基因细胞。1999;4(8):425–44.Epub 1999/10/20.

查看文章谷歌学术搜索

91.陈 X， 加廖内 R， 梁 T， 贝德诺 L， 德洛斯桑托斯 T， 陆 E， 等.Mek1通过直接磷酸化和抑制酵母厚皮烯出口调节因子Ndt80来协调减数分裂进程与DNA断裂修复。 公共科学图书馆基因。2018;14（11）：e1007832.Epub 2018/11/30.密码：30496175

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

92.Wu HY， Ho HC， Burgess SM. Mek1激酶控制减数分裂重组和检查点反应的结果。当代生物学. 2010;20（19）：1707–16.Epub 2010/10/05.密码：20888230

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

93.霍林斯沃思。突触复合物在减数分裂重组调节中的新作用。基因开发 2020;34（23–24）：1562–4.密码：33262143

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

94.普鲁加尔 E， 伯内特 C， 陈 X， 霍林斯沃思 NM.通过Mek1-NDT80负反馈环协调酵母中的双链断裂修复和减数分裂进展。遗传学。2017;206(1):497–512.Epub 2017/03/03.密码：28249986

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

95.Subramanian VV， MacQueen AJ， Vader G， Shinohara M， Sanchez A， Borde V， et al.染色体突触减轻了Mek1依赖性对减数分裂DNA修复的抑制。公共科学图书馆生物学. 2016;14（2）：e1002369.Epub 2016/02/13.pmid：26870961

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

96.Mu X， Murakami H， Mohibullah N， Keeney S. 染色体自主反馈在突触复合物形成时下调减数分裂DNA断裂能力。基因开发 2020;34（23–24）：1605–18.Epub 20201112。密码：33184224

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

97.李 MS， 东秀 MT， 崔 H， 李 K， 洪 S， 李 K， 等.突触复合体中心区调节减数分裂双链断裂形成的交叉途径和反馈控制。核酸研究 2021;49（13）：7537–53.密码：34197600

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

98.Okaz E， Arguello-Miranda O， Bogdanova A， Vinod PK， Lipp JJ， Markova Z， et al.减数分裂前期需要由减数分裂特异性APC/C Ama1介导的M期调节因子的蛋白水解。细胞。2012;151(3):603–18.Epub 2012/10/30.pmid：23101628

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

99.Chu S， Herskowitz I. 酵母中的配子发生由依赖于Ndt80的转录级联反应调节。 摩尔细胞。1998;1(5):685–96.Epub 1998/07/14.密码：9660952

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

100.Chu S， DeRisi J， Eisen M， Mulholland J， Botstein D， Brown PO， et al.出芽酵母中孢子化的转录程序。科学。1998;282(5389):699–705.Epub 1998/10/23.pmid：9784122

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

101.Sourirajan A，Lichten M. Polo样激酶Cdc5在出芽酵母减数分裂期间驱动厚皮烯退出。基因开发 2008;22（19）：2627–32.Epub 2008/10/04.密码：18832066

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

102.Clyne RK， Katis VL， Jessop L， Benjamin KR， Herskowitz I， Lichten M， et al.Polo样激酶Cdc5促进姊妹着丝粒的交叉形成和共偏析在减数分裂I.Nat Cell Biol. 2003;5（5）：480–5.Epub 2003/04/30.密码：12717442

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

103.Argunhan B， Leung WK， Afshar N， Terentyev Y， Subramanian VV， Murayama Y， et al.基础细胞周期激酶协同工作，确保减数分裂期间突触复合物的及时破坏。EMBO J. 2017;36（17）：2488–509.Epub 2017/07/12.密码：28694245

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

104.林M，钦总经理，维伦纽夫AM。秀丽隐杆线虫生殖细胞在减数分裂前期进展期间在双链断裂修复的不同模式之间切换。公共科学图书馆热内特。2007;3（11）：e191.pmid：17983271

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

105.Toraason E， Horacek A， Clark C， Glover ML， Adler VL， Premkumar T， et al.减数分裂DNA断裂修复可以利用C中的同系物非依赖性染色单体模板。秀丽隐杆线虫。当代生物学. 2021;31（7）：1508–14 e5.Epub 20210318。密码：33740427

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

106.恩吉塔-马鲁埃多 A， 马丁-鲁伊斯 M， 加西亚 E， 吉尔-费尔南德斯 A， 帕拉 MT， 维埃拉 A， 等.在小鼠减数分裂的厚皮阶段从减数分裂过渡到体细胞样DNA损伤反应。公共科学图书馆热内特。2019;15（1）：e1007439.Epub 20190122。密码：30668564

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

107.刘妍， 盖恩斯， 卡伦德 T， 布西吉娜 V， 奥克 A， 宋平， 等.酵母减数分裂期间Rad51活性的下调可防止与Dmc1竞争修复双链断裂。公共科学图书馆热内特。2014;10（1）：e1004005.Epub 20140123。密码：24465215

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

108.戴维斯AP，赛明顿LS。RAD51依赖性断裂诱导的酵母复制。分子细胞生物学. 2004;24（6）：2344–51.

查看文章谷歌学术搜索

109.马伟信， 权萍， 徐莹， 钟伟文， 池平， 牛华， 等.Pif1解旋酶和Poldelta通过气泡迁移促进重组偶联DNA合成。自然界。2013;502(7471):393–6.Epub 20130911。pmid：24025768

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

110.Saini N， Ramakrishnan S， Elango R， Ayyar S， Zhang Y， Deem A， et al.断裂诱导复制过程中的迁移气泡推动了保守的DNA合成。自然界。2013;502(7471):389–92.Epub 20130911。密码：24025772

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

111.Buzovetsky O， Kwon Y， Pham NT， Kim C， Ira G， Sung P， et al.Pif1-PCNA vomplex在pol delta依赖性链置换DNA合成和断裂诱导复制中的作用。细胞代表 2017;21（7）：1707–14.密码：29141206

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

112.Vernekar DV， Reginato G， Adam C， Ranjha L， Dingli F， Marsolier MC， et al.Pif1解旋酶在减数分裂重组过程中被积极抑制，从而抑制基因转换道长度。核酸研究 2021;49（8）：4522–33.密码：33823531

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

113.Cha RS，Weiner BM，Keeney S，Dekker J，Kleckner N.减数分裂DNA复制的进展由染色体间相互作用蛋白调节，由Spo11p负调节，由Rec8p正调节。基因开发 2000;14（4）：493–503.pmid：10691741

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

114.利达尔 D， 尼科尔斯基 Y， 主教 DK， 韦纳特 T.由有丝分裂检查点基因控制的减数分裂重组检查点。自然界。1996;383(6603):840–3.密码：8893012

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

115.Hochwagen A，Amon A.检查你的休息时间：减数分裂重组的监视机制。当代生物学. 2006;16（6）：R217–28.密码：16546077

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

116.雷茨D，格拉布J，主教DK。绕过辅助蛋白Mei5-Sae3要求的Dmc1突变形式揭示了Me5-Sae3和Rad51在Dmc1丝稳定性中的独立活性。公共科学图书馆热内特。2019;15（12）：e1008217.Epub 2019/12/04.密码：31790385

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

117.Busygina V， Saro D， Williams G， Leung WK， Say AF， Sehorn MG， et al.Hed1的新属性在减数分裂重组过程中影响Rad51突触前丝的动力学和活性。生物化学学报 2012;287（2）：1566–75.Epub 2011/11/26.密码：22115747

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

118.Crickard JB，Kaniecki K，Kwon Y，Sung P，Lisby M，Greene EC.减数分裂特异性突触前复合物成熟期间Hed1和Rad54结合的调节。EMBO J. 2018;37（7）.Epub 2018/02/16.密码：29444896

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

119.卡塔赫纳-利罗拉 H， 盖里尼一世， 曼弗里尼 N， 卢奇尼 G， 朗赫塞议员.酿酒酵母Rad53检查点激酶在减数分裂细胞周期中信号双链断裂中的作用。分子细胞生物学. 2008;28（14）：4480–93.Epub 2008/05/29.密码：18505828

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

120.切斯洛克PS，肯普BJ，布米尔RM，道森DS。MAD1，MAD2和MAD3在减数分裂进展和非交换染色体分离中的作用。纳特热内。2005;37(7):756–60.Epub 2005/06/14.密码：15951820

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

121.Hollingsworth NM，Ponte L，Halsey C. MSH5，一种新的MutS同源物，促进酿酒酵母同系物之间的减数分裂互易重组，但不能错配修复。基因开发 1995;9（14）：1728–39.密码：7622037

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

122.Thacker D，Lam I，Knop M，Keeney S.利用孢子自主荧光蛋白表达来量化酿酒酵母中的减数分裂染色体行为。遗传学。2011;189(2):423–39.Epub 2011/08/16.密码：21840861

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

123.Martini E，Diaz RL，Hunter N，Keeney S.酵母减数分裂中的交叉稳态。细胞。2006;126(2):285–95.Epub 2006/07/29.密码：16873061

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

124.马尔科娃 A， 斯旺森 J， 德国 M， 麦库斯克 JH， 豪斯沃思 EA， 斯塔尔 FW， 等.基因转换并沿酿酒酵母VII号染色体的405 kb左臂交叉。遗传学。2004;168(1):49–63.Epub 2004/09/30.密码：15454526

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

125.De Muyt A， Jessop L， Kolar E， Sourirajan A， Chen J， Dayani Y， et al. BLM解旋酶直系同源物Sgs1是减数分裂重组中间代谢的中枢调节因子。摩尔细胞。2012;46:43–53.密码：22500736

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

126.Marsolier-Kergoat M-C，Khan MM，Schott J，Zhu X，Llorente B.减数分裂过程中DNA重组的机制观点和遗传控制。摩尔细胞。2018;70:9–20.密码：29625041

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

127.Ahuja JS，Harvey CS，Wheeler DL，Lichten M.重复链入侵和广泛的分支迁移是减数分裂重组的标志。摩尔细胞。2021;81（20）：4258–70 e4.Epub 20210827。密码：34453891

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

128.桑德胡 R， 蒙日内里亚 F， 蒙日内里亚 J， 陈 X， 霍林斯沃思 NM， 伯纳 GV.DNA解旋酶Mph1（FANCM）通过解离早熟置换环来确保亲本染色体之间的减数分裂重组。开发单元。2020;53（4）：458–72 e5.Epub 20200507。密码：32386601

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

129.库珀 TJ， 克劳福德 MR， 亨特 LJ， 马索里尔-克尔戈特 M-C， 略伦特 B， 尼尔 MJ.失配修复可防止减数分裂交叉干扰。生物Rxiv。2018.

查看文章谷歌学术搜索

130.Martini E， Borde V， Legendre M， Audic S， Regnault B， Soubigou G， et al.对错配修复缺陷酵母细胞中异质双链DNA的全基因组分析揭示了减数分裂重组途径的新特性。公共科学图书馆热内特。2011;7：e1002305.密码：21980306

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

131.欧克A， 安德森CM， 任P， 冯建昌.控制减数分裂重组修复——明确ZMMs、Sgs1和Mus81/Mms4在交叉形成中的作用。公共科学图书馆热内特。2014;10：e1004690.密码：25329811

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

132.Lee BH，Amon A.Polo样激酶CDC5在编程减数分裂I染色体分离中的作用。科学。2003;300(5618):482–6.密码：12663816

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

133.格兰丁N，里德西。酿酒酵母B型细胞周期蛋白在有丝分裂和减数分裂中的差异功能和表达。分子细胞生物学. 1993;13（4）：2113–25.邮编：8455600

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

134.艾维萨， 周建庆， 扎基安.酵母Pif1p DNA解旋酶和高度相关的Rrm3p对核糖体DNA中的复制叉进展具有相反的影响。细胞。2000;100(4):479–89.

查看文章谷歌学术搜索

135.Lahaye A，Stahl H，Thines-Sempoux D，Foury F. PIF1：酵母线粒体中的DNA解旋酶。EMBO J. 1991;10（4）：997–1007.密码：1849081

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

136.舒尔茨副总裁，扎基安弗吉尼亚州。酵母PIF1 DNA解旋酶抑制端粒伸长和从头端粒形成。细胞。1994;76(1):145–55.

查看文章谷歌学术搜索

137.斯图特万特啊。果蝇中六个X连锁因子的线性排列，如它们的关联模式所示。实验动物学杂志。1913;(14):43–59.

查看文章谷歌学术搜索

138.阿兹沃林斯基 A， 杜纳威 S， 托雷斯 JZ， 贝斯勒 JB， 扎基安 VA.S.酿酒Rrm3p DNA解旋酶随复制叉移动并影响所有酵母染色体的复制。基因开发 2006;20（22）：3104–16.密码：17114583

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

139.博赫曼，萨布里N，扎基安VA。解开Pif1系列解旋酶的功能。DNA修复（Amst）。2010;9(3):237–49.Epub 20100125。密码：20097624

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

140.克劳辛C，巴斯克斯J，怀特豪斯I.重复体进展的单分子映射。摩尔细胞。2022;82（7）：1372–82 e4.Epub 20220302。密码：35240057

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

141.穆尔纳 J， 施密特 KH.通过多功能PIF1 DNA解旋酶家族进行酵母基因组维护。基因（巴塞尔）。2020;11(2).Epub 20200220。pmid：32093266

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

142.陈祠， 波尔， 波尔， 波特， 扎基安.两个Pif1家族DNA解旋酶在酿酒酵母中配合着丝粒复制和分离。遗传学。2019;211(1):105–19.Epub 20181115。pmid：30442759

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

143.陈普尔特， 波尔TJ， 陈福， 陈A， 波特S， 扎基安.PIF1家族DNA解旋酶抑制tRNA基因的R环介导的基因组不稳定性。纳特公社。2017;8:15025.Epub 20170421。密码：28429714

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

144.Pch2通过Xrs2和Tel1 / ATM调节减数分裂期间的同源物间偏差和检查点功能。公共科学图书馆热内特。2011;7（11）：e1002351.Epub 20111103。密码：22072981

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

145.卡瓦略，约翰逊，塞奇威克，查·Mec1/Tel1对轴向元素蛋白Hop1的磷酸化确保了减数分裂同源物重组。细胞。2008;132(5):758–70.Epub 2008/03/11.密码：18329363

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

146.MacQueen AJ，Hochwagen A.检查点机制：减数分裂前期的傀儡大师。趋势细胞生物学. 2011;21（7）：393–400.Epub 20110429。密码：21531561

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

147.克劳福德 MR， 库珀 TJ， 马索里尔-克尔戈特 M， 略伦特 B， 尼尔 MJ.DNA损伤反应激酶Mec1的可分离作用ATR及其活化剂Rad2RAD17在减数分裂重组的调节范围内。生物Rxiv。2018.

查看文章谷歌学术搜索

148.Goldfarb T，Lichten M.在出芽酵母减数分裂期间频繁有效地使用姐妹染色单体进行DNA双链断裂修复。公共科学图书馆生物学. 2010;8（10）：e1000520。Epub 20101019。pmid：20976044

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

149.陈玉刚， 冷澈， 奥利瓦雷斯， 李明， 张玉昌， 龚伟， 等.Hop2和Mnd1的异二聚体复合物与Dmc1一起促进减数分裂同系物并列和链同化。美国国家科学院院刊， 2004;101（29）：10572–7.Epub 20040712。密码：15249670

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

150.Zickler D，Espagne E. Sordaria，一个揭示减数分裂配对和重组之间联系的模型系统。细胞开发生物学. 2016;54：149–57.Epub 20160210。pmid：26877138;

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

151.Arbel A，Zenvirth D，Simchen G.基于染色单体的姐妹DNA修复由RAD54介导，而不是由DMC1或TID1介导。恩博杂志 1999;18（9）：2648–58.

查看文章谷歌学术搜索

152.Sanchez H，Kertokalio A，van Rossum-Fikkert S，Kanaar R，Wyman C.结合光学和地形成像揭示了人类RAD54与突触前和突触后RAD51-DNA细丝的不同排列。美国国家科学院院刊， 2013;110（28）：11385–90.Epub 20130625。邮编：23801766

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

153.Dai J， Voloshin O， Potapova S， Camerini-Otero RD. 减数分裂敲低和互补揭示了RAD51在小鼠精子发生中的重要作用。细胞代表 2017;18（6）：1383–94.密码：28178517

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

154.皮特曼 DL， 温伯格 LR， 施门蒂 JC.Rad51d的鉴定，表征和遗传图谱，Rad51d是一种新的小鼠和人类RAD51 / RecA相关基因。基因组学。1998;49(1):103–11.密码：9570954

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

155.李晓昌， 博尔昆-菲拉斯 E， 施门蒂 JC.遗传证据表明突触复合轴向元件控制小鼠的重组途径选择。遗传学。2011;189(1):71–82.Epub 2011/07/14.密码：21750255

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

156.Li S， Wang H， Jehi S， Li J， Liu S， Wang Z， et al. PIF1解旋酶促进哺乳动物细胞中断裂诱导的复制。EMBO J. 2021;40（8）：e104509.Epub 20210120。密码：33470420

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

157.洛慧聪，霍林斯沃思。使用半合成表位系统鉴定减数分裂特异性出芽酵母激酶Mek1的直接底物。方法分子生物学. 2011;745：135–49.密码：21660693

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

158.戈德斯坦，麦库斯克JH。三种新的显性耐药盒，用于酿酒酵母基因破坏。酵母。1999;15(14):1541–53.

查看文章谷歌学术搜索

159.Longtine MS， McKenzie A 3rd， Demarini DJ， Shah NG， Wach A， Brachat A， et al.用于酿酒酵母中多功能且经济的基于 PCR 的基因缺失和修饰的附加模块。酵母。1998;14(10):953–61.

查看文章谷歌学术搜索

160.Rothstein R. 靶向、破坏、替换和等位基因救援：酵母中的整合 DNA 转化。方法酶。1991;194:281–301.Epub 1991/01/01.

查看文章谷歌学术搜索

161.Boeke JD， Trueheart J， Natsoulis G， Fink GR. 5-氟乳清酸作为酵母分子遗传学中的选择性试剂。方法酶。1987;154:164–75.Epub 1987/01/01.噗嗤：3323810。

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

162.福克 JE， 陈 AC， 霍夫曼 E， 霍赫瓦根 A.Mec1和PP4依赖性检查点将着丝粒配对与减数分裂重组偶联。开发单元。2010;19(4):599–611.Epub 2010/10/19.pmid：20951350。

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

163.Grubb J，Brown MS，Bishop DK.酵母染色体的表面扩散和免疫染色。J Vis Exp. 2015;（102）：e53081.Epub 2015/09/02.密码：26325523

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

164.帕金斯DD.黑穗病真菌Ustilago maydis中的生化突变体。遗传学。1949;34(5):607–26.Epub 1949/09/01.密码：17247336

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

165.Owens S，Tang S，Hunter N.监测出芽酵母减数分裂期间的重组。方法酶。2018;601:275–307.Epub 2018/03/11.密码：29523236

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

166.Li H. Minimap2：核苷酸序列的成对比对。生物信息学。2018;34(18):3094–100.密码：29750242

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

167.Lindenbaum P. JVarkit：基于Java的生物信息学实用程序。2016.

查看文章谷歌学术搜索