医学论文发表-的识别。秀丽隐杆线虫ASNA-1结构域和组织要求对铂的敏感性和生长控制有不同影响

多罗塔·拉吉，阿格涅什卡·波德拉扎-法哈尼耶，巴勃罗·加列戈，高锟 ，彼得·纳雷迪

发布时间：2022 年 12 月 8 日

抽象

ASNA1在顺铂化疗反应、2型糖尿病和心脏病中起重要作用。它也是许多疾病治疗反应中的重要生物标志物。在生物化学上，ASNA1具有两个相互排斥的氧化还原调节作用：还原状态下的尾锚蛋白（TAP）靶向功能和氧化状态下的保持酶/伴侣功能。将哺乳动物ASNA1的生化作用分配给生物医学功能对于成功的治疗开发至关重要。我们之前的工作显示了C的相关性。秀丽隐杆线虫ASNA-1同系物在模拟顺铂反应和胰岛素分泌中的应用。在这里，我们分析了C中高度保守残基中的两点突变体。秀丽隐杆线虫ASNA-1并确定它们在分离顺铂反应功能及其在胰岛素分泌中的作用方面的重要性。asna-1（ΔHis164）和asna-1（A63V）点突变体均优先以氧化态存在，表现出顺铂敏感性表型和TAP插入缺陷，但无胰岛素分泌缺陷。此外，使用靶向耗竭，我们分析了asna-1对C的组织需求。秀丽隐杆线虫的生长发育。ASNA-1的体细胞耗竭以及神经元和肠道中ASNA-1的同时耗竭导致L1停滞。我们得出的结论是，与完全敲低相比，针对ASNA-1中影响开关I/开关II结构域功能的单个残基，在不损害其他重要生物学功能的情况下抵消顺铂耐药性。综上所述，我们的研究表明，ASNA1突变对健康的影响可能具有不同的生化基础。

作者摘要

顺铂是一种广泛用于癌症治疗的化疗药物。然而，肿瘤对顺铂的耐药性及其对健康肾脏和神经元的细胞毒性作用限制了其使用。逆转耐药性和限制副作用的能力可以显着改善患者的顺铂治疗。为了提高顺铂介导的死亡的效率，需要更多关于分子机制和靶点的信息。我们研究C的靶向性。秀丽隐杆线虫ASNA-1蛋白作为增加顺铂敏感性的一种方法。人类和C。秀丽隐杆线虫蛋白是高度同源的。击倒人类或C。秀丽隐杆线虫ASNA1 / ASNA-1蛋白不仅导致顺铂敏感性表型，而且同时导致小鼠胰岛素分泌减少和2型糖尿病。因此，有必要剖析ASNA1/ASNA-1的临床相关功能，以增加耐药肿瘤的敏感性而不引起糖尿病。在这里，我们表明解剖这两个相关功能（顺铂反应和胰岛素分泌）是可能的。此外，我们在蛋白质中发现了一个潜在的药物靶点，它将使我们能够使耐药肿瘤对顺铂治疗重新敏感，同时保持胰岛素分泌不受干扰。

引文： 拉吉 D， 波德拉扎-法哈尼耶 A， 加列戈 P， 高 G， 纳雷迪 P （2022） 识别 C.秀丽隐杆线虫ASNA-1结构域和组织要求对铂的敏感性和生长控制有不同的影响。公共科学图书馆基因18（12）： e1010538. https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010538

编辑 器： Cathy Savage-Dunn，皇后学院，库尼，美国

收到： 8月 4， 2022;接受： 11月 21， 2022;发表： 12月 8， 2022

版权所有： ? 2022 拉杰等人。这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。

数据可用性： 所有相关数据都在手稿及其支持信息文件中。

资金： 这项工作得到了瑞典癌症协会（https://www.cancerfonden.se/forskning）CAN 2018/664（P.N.）和ALF V?stra G?taland（https://www.alfvastragotaland.se/）nr：ALFGBG-722971（P.N.）的资助;Stiftelsen Assar Gabrielssons Fond （https://www.agfond.se/） FB19-44 （DR） 和 Stiftelsen Assar Gabrielssons （https://www.agfond.se/） Fond FB20-32 （DR）。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。

竞争利益： 提交人声明不存在相互竞争的利益。

介绍

秀丽隐杆线虫ASNA-1 /S.酿酒GET3/哺乳动物ASNA1是必需的胞质ATP酶，在进化上与细菌亚砷酸转运因子ArsA相关[1]，但真核生物中的功能已明确分离[2]。哺乳动物同系物ASNA1不仅在尾锚（TA）蛋白插入[3]和胰岛素分泌[4]中起重要作用，而且已被描述为精神分裂症治疗反应中的重要生物标志物[5]，预测登革热病毒感染的疾病严重程度[6]，区分活动性和潜伏性结核病受试者[7]，与超高风险精神病相关的异常的生物标志物[8]，以及唐氏综合征的生物标志物[9]。ASNA1突变与小儿心肌病相关[10]，其通路蛋白钙调节配体（CAML）突变与患者肌张力低下、脑部异常和癫痫有关[11]。此外，ASNA1与囊泡相关蛋白B（VAPB）相互作用并可能调节其功能，VAPB在肌萎缩侧索硬化症病例中发生突变[12]。因此，很明显，ASNA1在多种人类疾病中起作用，对ASNA1的临床相关功能的更深入理解是普遍感兴趣的。

ASNA1在不同疾病表现中的不同作用反映在该蛋白的不同生化作用上。ASNA-1/GET3/ASNA1最了解的典型和最深入研究的作用是在内质网（ER）靶向一类称为尾锚蛋白（TAP）的特殊膜蛋白中[13]。这种靶向功能严格要求其ATP酶活性[14]，TAP蛋白的跨膜区域在插入ER膜之前与二聚体ASNA1中的疏水沟相关。通过ASNA1 / GET3插入TAP，需要ER膜蛋白WRB / CAML（在哺乳动物中）或Get1 / Get2（在酵母中）[15]，ASNA1 / GET3将结合的TAP交给它们。

ASNA-1/GET3蛋白的ATP酶活性需要开关I和开关II结构域的功能。这两个结构域结合ATP并形成所谓的“加载弹簧”，在ATP水解时释放[16，17]。ATP水解后开关II区塌陷，导致稳定复合槽的保守交叉单体相互作用网络中断[14]。此外，酵母Get3中的Switch II结构域对于从开放状态到闭合状态的过渡至关重要，并且具有确保ATP或TAP结合诱导的结构变化的功能[14]。这种结构变化确保了TAP与GET3的结合[18-20]。在结构上，GET3的开关I和开关II结构域中的残基配位水和镁2+对ATP酶活性很重要的分子[14]。开关I和开关II结构域之间的相互作用至关重要，因为GET3开关I结构域中的Asp57Asn突变体对于ATP水解有缺陷，并且无法挽救Δget3酵母的湿霉素敏感表型[14]。

然而，很明显，并非ASNA1和GET3的所有功能都是其规范TAP靶向功能的结果。ASNA1 / GET3有替代角色，它独立于其TAP插入功能，因此对于这些功能，它不需要与Get1 / Get2或WRB / CAML交互。哺乳动物ASNA1与尾锚蛋白VAPB相互作用，但仅通过MSP结构域中的FFAT基序相互作用，而不是其疏水槽，这对于其与尾锚蛋白的相互作用至关重要。因此，哺乳动物ASNA1可以显示出新的相互作用模式，即使使用不涉及规范ASNA1 / WRB / CAML途径的尾锚蛋白。VAPB也可作为ASNA1的替代受体，而不是WRB/CAML[12]。对于我们理解ASNA1/GET3功能而言，重要的是，优雅的生化和细胞生物学研究表明，在氧化诱导的结构重排中，GET3充当保持酶伴侣，在氧化应激和ATP耗竭的条件下与聚集蛋白结合[21，22]。Get3中保守半胱氨酸的氧化将二聚体GET3转化为四聚体。这种结构变化掩盖了TA蛋白结合所需的疏水结构域，并大大降低了其ATP酶活性：GET3的TA蛋白结合和ATP酶特性对于其在TAP靶向中的作用和与WRB / GET1的相互作用至关重要，对于氧化Get3的伴侣功能是完全可有可无的。这些证据表明，在氧化应激条件下，Get3促进不需要WRB / GET1的功能。此外，Voth等人，2014年表明，氧化的GET3也可作为一般伴侣，在没有WRB/GET1的情况下在体外重组变性柠檬酸盐合酶[22]。此外，GET3直接与非尾锚定蛋白（如氯化物转运蛋白Gef1p）结合[23]和Gα亚基Gpa1，充当鸟嘌呤核苷酸交换因子[24]。在这两种情况下，结合都具有生物学意义，因为它导致独立于GET1的生化结果改变。

我们之前关于C的工作。秀丽隐杆线虫ASNA-1显示ASNA-1促进胰岛素分泌，后来发现ASNA1敲低小鼠的胰岛素分泌有缺陷，导致2型糖尿病[25，26]。此外，ASNA1在人肿瘤细胞顺铂敏感性中的作用也在蠕虫中成功建模，重要的是，人ASNA1基因可以替代蠕虫基因的顺铂和胰岛素分泌功能[25，27]。我们之前在蠕虫方面的工作证明了ASNA-1的TAP靶向功能，并表明顺铂暴露仅对ASNA-1依赖性尾锚蛋白SEC-61β靶向ER产生负面影响，而对ASNA-1独立TAP没有影响[28]。

像酵母直系同源物一样，蠕虫ASNA-1也通过两个保守的半胱氨酸被氧化。我们发现，ASNA-1在胰岛素分泌和保护顺铂毒性中的相关作用可以根据蛋白质的氧化状态进行分离。与GET3一样，ASNA-1以两种氧化还原敏感状态存在：还原（ASNA-1红）和氧化（ASNA-1牛) [28]. 单点突变体asna-1（ΔHis164）的蛋白质优先以氧化态存在，不仅对顺铂治疗的敏感性与完全缺失突变体一样敏感，而且在TAP插入方面也存在严重缺陷[27，28]，表明存在功能突变分离，并表明ASNA-1在胰岛素分泌中的作用很可能与其在TAP靶向和顺铂反应中的作用无关[27，28]。

在这里，我们检查了ASNA-1的表达并进行选择性耗竭以确定促进生长的组织需求。我们还扩展了对在Switch II域中具有病变的asna-1（ΔHis164）蠕虫的分析。在这里，我们表明这种突变体具有高水平的氧化ASNA-1，具有正常水平的胰岛素分泌和功能。此外，我们测试了一组活的纯合C。秀丽隐杆线虫ASNA-1点突变体探索将ASNA-1的临床相关功能与遗传变异完全分离的可能性。因此，我们将开关I附近位置63的高度保守丙氨酸表征为功能分离的相关靶标。asna-1（A63V）突变体对顺铂敏感，但未表现出ASNA-1缺失突变体所显示的任何形态、生长、寿命、育雏大小或氧化应激表型。所有这些特征使asna-1（A63V）动物成为研究asna-1在顺铂反应中的作用而没有其他表型缺陷复合效应的绝佳模型。事实上，asna-1（A63V）突变体表现出顺铂敏感性缺陷和TAP插入缺陷，其严重程度与缺失突变体一样严重，在胰岛素分泌或信号通路中没有任何可检测到的缺陷。此外，这种突变导致蛋白质的氧化形式水平更高，并改变了其亚细胞分布。最后，我们进行了计算机建模，以更好地了解单点突变引起的结构变化的后果。对于具有非重叠功能的多功能蛋白质，影响一种功能而不干扰其他功能的药物将减少不良副作用，并可能增加化疗反应。

结果

ASNA-1在C中广泛表达。秀丽隐杆线虫

表达ASNA-1：：GFP（svIs56）的转基因表达见于感觉神经元、肠道和皮下组织[25]。利用CRISPR / Cas9技术，我们获得了一种菌株，其中两个标签mNeonGreen（mNG）和生长素诱导的degron（AID）入到蛋白质C末端的ASNA-1基因组位点（ASNA-1：：mNG：：AID;syb2249;菌株PHX2249）。mNeonGreen标签使我们能够在所有上游和下游元素的上下文中更精确地表征ASNA-1表达模式。mNeonGreen信号在咽部、肠、肌肉、近端和远端种系细胞、卵母细胞、发育中的外阴、外阴肌肉、精子、精子、鞘细胞、最近端的一对性腺鞘细胞（图1）和头部神经元（S1图）中强烈可见。该分析不仅证实了我们之前的观察结果[25]，而且还表征了C中以前未知的ASNA-1表达位点。秀丽隐杆线虫生殖系统。我们得出结论，鉴于ASNA-1在这些组织中的广泛表达，种系和体细胞性腺可能是ASNA-1功能的重要部位。为了更精确地鉴定每个组织中表达ASNA-1的细胞，我们接下来检查了该基因的双顺反子ASNA-1^SL2：：mNeonGreen：：H2B等位基因syb5730（菌株PHX5730）。从这个等位基因，ASNA-1 mRNA独立制造未标记的ASNA-1和核定位的mNeonGreen，以报告表达asna-1 mRNA的每个细胞核。对asna-1（syb5730）动物中mNeonGreen信号的分析表明，几乎体内的每个细胞在体细胞和种系的整个发育过程中都表达ASNA-1 mRNA（S2图）。

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图1. ASNA-1在C中广泛表达。秀丽隐杆线虫。

代表性荧光和微分干涉对比（DIC）图像表达ASNA-1：：mNeonGeen：：AID （syb2249）的蠕虫。白色箭头表示存在ASNA-1：：mNneonGreen：：AID的不同结构。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010538.g001

体细胞特异性asna-1敲低导致L1幼虫停滞

蠕虫缺乏母体和合子 asna-1 在 1圣即使有食物存在，幼虫（L1）分期[25]。L1停滞是在缺乏食物或强daf-2/胰岛素受体突变体的情况下孵化的野生型幼虫的特征[29]。考虑到ASNA-1在体细胞和种系组织中表达的广泛程度，我们询问ASNA-1：：mNG：：AID的体细胞耗竭是否会导致类似于ASNA-1完全遗传耗竭后看到的幼虫停滞表型。拟 南 芥TIR1是一种F-box蛋白，在生长素存在下与AID标签相互作用，组装E3泛素连接酶复合物，并靶向含AID的蛋白，以便蛋白酶体快速降解[30，31]。TIR1的组织或细胞类型特异性表达限制了AID标记蛋白向表达TIR1的细胞的降解。利用生长素诱导的组织特异性敲低系统，我们创建了表达ASNA-1：：mNG：：AID（syb2249）和TIR1泛体细胞驱动程序ieSi57的菌株。第4幼虫期（L4）雌雄同体暴露于1mM生长素（AUX）48h，同时产生后代，然后从平板中取出。它们的后代留在含生长素的平板上，在移除母亲后48小时进行分析（S3A图）。在非生长素NGM平板上类似处理的L4蠕虫作为对照。首先，我们观察到asna-1：：mNG：：AID;ieSi57母体在暴露于生长素48小时后未表现出任何形态缺陷，但与未处理的对照动物相比，产生的后代较少。在生长素平板上，它们的所有后代都在L1阶段被捕（图2A）。生长素介导的ASNA-1耗竭是有效的，因为mNeonGreen信号在任何先前表征的体细胞组织中都不可见（图1和2A）。然而，我们在Z2和Z3种系祖细胞中看到了强烈的mNeonGreen信号（图2A），这在发育过程中产生了整个种系[32]。即使在移除母体72小时后，也没有一个被逮捕的幼虫在性腺原基中显示出超过两个细胞（Z2和Z3）。这些细胞可以被鉴定为Z2和Z3，因为它们位于性腺原基的中心，彼此接触[32]，并在周围所有体细胞中耗尽时表达ASNA-1：：mNG：：AID。为了进一步表征ASNA-1耗竭的影响，我们试图确定asna-1：：mNG：：AID;仅从第1期开始暴露于生长素的ieSi57蠕虫将显示出进一步的发育，并可能达到后期幼虫阶段。将分期L1雌雄同体暴露于1mM生长素（AUX）24h，48h和72h，并在这些时间点进行分析。（S3B图）。类似分期的未暴露的asna-1：：mNG：：AID;ieSi57幼虫作为对照。我们观察到AUX平板上的所有动物在L1阶段仍然被逮捕（图2B和S4），而对照动物则达到成年期。正如预期的那样，生长素处理的动物的特征在于体细胞组织中缺乏ASNA-1：：mNG：：AID表达，我们在种系祖细胞中观察到强烈的ASNA-1：：mNG：：AID信号（图）然而，与在含有AUX的平板上孵化的蠕虫相比，ASNA-1：：mNG：：AID在更多种系细胞中可见，最多有14个阳性细胞（图3C）。总共分析了13/20的蠕虫具有4个以上的种系细胞。这与仅在AUX板上孵化的动物的两个原始生殖细胞Z2和Z3中观察到的mNeonGreen信号形成鲜明对比（图2A）。然而，第二个实验中的幼虫没有L2动物的特征，表明L1幼虫出生后消耗体细胞ASNA-1：：mNG：：AID允许种系的进一步发展，但不允许幼虫达到L2幼虫阶段。性腺的大小也是L1期幼虫的特征。相比之下，生长素介导的ASNA-1从L4期开始的耗竭并没有阻止进展到成体阶段。

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图2. 体细胞特异性ASNA-1耗竭导致L1幼虫停滞。

（A）表达ASNA-1：：mNeonGreen：：AID（syb2249）和泛体细胞TIR1驱动器ieSi57的蠕虫的代表性荧光和微分干涉对比（DIC）图像在没有（NGM）或（NGM + AUX）1mM生长素的平板上生长。白色箭头表示 Z2 和 Z3 单元格位置。所有生长素暴露的后代（n = 109）均显示L1停滞表型。该图表示syb2249的量化;ieSi57动物种群在没有（NGM）或（NGM + AUX）1mM生长素的平板上生长。（B）生长素诱导的泛体细胞ASNA-1敲低的第二个实验装置的示意图。表达syb2249的蠕虫的代表性DIC图像;ieSi57在特定时间点生长在没有（NGM）或（NGM + AUX）1mM生长素的平板上。该图表示syb2249的72h时间点量化;ieSi57动物种群在没有（NGM）或（NGM + AUX）1mM生长素的平板上生长。（C）syb2249的代表性荧光图像;ieSi57蠕虫在含有1mM生长素的平板上生长。虚线勾勒出ASNA-1：：mNG：：AID阳性细胞。该表表示ASNA-1：：mNG：：AID阳性生殖细胞计数的动物数量。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010538.g002

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图3. 肠道特异性ASNA-1耗竭导致发育迟缓。

（A）表达ASNA-1：：mNeonGreen：：AID（syb2249）和TIR1泛体细胞驱动器ieSi61的蠕虫的代表性荧光和微分干涉对比（DIC）图像在没有（NGM）或（NGM + AUX）1mM生长素的平板上生长。该图表示syb2249的量化;即Si61动物种群在没有（NGM）或（NGM + AUX）1mM生长素的平板上生长。（B）生长素诱导肠ASNA-1敲低的第二次实验装置的示意图。表达syb2249的蠕虫的代表性DIC图像;ieSi61在特定时间点生长在没有（NGM）或（NGM + AUX）1mM生长素的平板上。（C）生长素诱导的肠道和神经元同时ASNA-1敲低的代表性图像。蠕虫生长在不含（NGM）或（NGM + AUX）4mM生长素的平板上。生长素暴露的后代（n>250）显示出L1停滞表型。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010538.g003

肠道特异性asna-1敲低导致发育迟缓

我们之前的研究已经确定，asna-1是生长非自主细胞所必需的。驱动asna-1表达的神经元和肠道特异性启动子都能挽救ASNA-1（OK938）体型表型[25]，而ASNA-1在肠道中是拯救顺铂敏感性表型所必需的，但神经元不需要[27]。肠道中也需要ASNA-1才能正确靶向尾锚蛋白[28]。因此，我们试图确定ASNA-1的肠道功能在生长和发育中的作用，以询问L1停滞表型是否可以归因于肠道中的TAP靶向功能。为此，我们在ASNA-1：：mNG：：AID（syb2249）背景中构建了一种表达肠道特异性TIR1驱动程序ieSi61的菌株。为了比较ASNA-1的泛体细胞耗竭与肠道特异性耗竭，就像之前一样，我们将asna-1：：mNG：：AID;ieSi61 L4雌雄同体暴露于1mM生长素（AUX）48小时，将它们从平板中取出并在去除母亲48小时后分析它们的后代（S3A图）。不含生长素的NGM平板上的蠕虫作为对照。显微镜检查显示肠道中没有mNeonGreen荧光，而咽部和种系表达在正常水平下可见（图3A）。与对照动物相比，胚胎发育开始的肠道特异性ASNA-1耗竭导致发育延迟（图3A）。在这些盘子上孵化的幼虫需要额外的一天才能达到成年。当L1幼虫暴露于1mM AUX时（S3B图），没有看到生长延迟（图3B）。因此，肠道中对ASNA-1的生长有需求，但要求并不像泛体细胞耗竭那样严格。基于此，我们得出结论，依赖于ASNA-1的生长和发育是多组织的需求，或者生长素介导的耗竭尚未完成。

肠道和神经元中ASNA-1同时耗竭相当于泛体细胞耗竭

在表明ASNA-1的肠道耗竭不足以产生L1生长停滞表型后，我们希望确定我们是否可以缩小组织需求，这些组织需求导致泛体细胞耗竭时在asna-1突变体中观察到强烈的L1停滞表型[25]。为此，我们首先使用泛神经元驱动程序reSi7在神经元中通过生长素治疗ASNA-1：：mNG：：AID来耗尽[31]。asna-1：：mNG：：AID （syb2249）;reSi7蠕虫从孵化时开始暴露于生长素，方法是将第4个幼虫期的母体放在补充生长素的NGM板上。蠕虫产生正常数量的后代，后代没有表现出生长缺陷或发育迟缓。为了询问第一幼虫阶段停滞是否是由肠道和神经元中同时消耗ASNA-1引起的，我们接下来制作并测试了一种基因型asna-1：：mNG：：AID （syb2249）;reSi7;ieSi61的菌株。在这种菌株中，两个TIR1驱动因子促进了两种组织中ASNA-1的同时消耗。在这些蠕虫中，我们观察到，当将第4个幼虫阶段的雌雄同体放在补充生长素的NGM板上时（S3A图），它们仍然在成年时产生大量后代，但所有后代（n>250）都作为第一幼虫阶段大小的动物被捕。这种停滞再现了在所有体细胞组织中消耗ASNA-1的作用（图3C），并表明神经肽分泌缺陷（例如DAF-28分泌）和单独或与其他TAP一起运输SEC-61β的缺陷对于控制第一幼虫阶段的生长是必需的。为了获得对这一概念的支持，我们接下来检查了在TAP插入中具有已知缺陷的asna-1突变体，并确定其胰岛素/ IGF信号状态。

与asna-1缺失突变体相比，asna-1（ΔHis164）的胰岛素信号传导正常，种系发育缺陷不太严重

我们先前的工作表明，asna-1（ΔHis164）突变体对顺铂的敏感性与基因中的缺失突变体一样敏感，并且具有严重的TAP插入缺陷[28]。此外，我们发现ASNA-1ΔHis164GFP蛋白主要以氧化状态存在[28]。表达asna-1的转基因ΔHis164：：GFP拯救缺失突变体的asna-1生长表型，间接表明点突变蛋白可以恢复胰岛素信号传导[27]。为了检查asna-1（ΔHis164）突变体的生长表型，我们通过分析DAF-16：：GFP定位和DAF-28 /胰岛素：：GFP分泌来直接测量胰岛素分泌和信号传导效率。DAF-16：：GFP的细胞质定位表明IIS水平较高，因为DAF-16：：GFP定位于具有胰岛素信号缺陷的突变体的细胞核[33]。在开放循环系统中发现的腔胞细胞对分泌的DAF-28/胰岛素：：GFP的摄取报告了胰岛素分泌[25]。在asna-1（ΔHis164）动物中，DAF-16：：GFP蛋白为细胞质，DAF-28/胰岛素：：GFP蛋白在正常水平下被腔肠细胞分泌和吸收（图4A，4B，S5A和S5B）。对两位报告人的分析表明，与asna-1缺失突变体的强缺陷相比，asna-1（ΔHis164）突变体的胰岛素分泌和信号传导不受影响。尽管两种突变体在IIS状态上确实不同，但asna-1（ΔHis164）和asna-1缺失突变体都是无菌的。asna-1（ΔHis164）蠕虫的较大尺寸（图4C）表明两种突变体的种系缺陷存在显着差异。我们试图通过检查asna-1（ok938）和asna-1（ΔHis164）动物的种系表型来了解这些差异。为此，我们使用转基因ltIs37和ltIs38同时监测体内生殖细胞膜和种系细胞核。asna-1（OK938）动物不产生任何卵母细胞或精子，并表现出性腺迁移缺陷（图4C）。asna-1（ΔHis164）也显示出性腺迁移缺陷，但种系包含卵母细胞和精子以及子宫内未受精的胚胎型结构。这些细胞仅包含一个细胞核，没有显示胚胎分裂（S6A图）。排卵、卵子通过精子膜的运输以及卵母细胞进入子宫都需要精子的存在[34]。这促使我们研究asna-1（ΔHis164）突变体在受精方面是否存在缺陷，同时考虑到成熟卵母细胞，精子和野生型蠕虫中精子的强烈ASNA-1表达（图1和S2）。事实上，表达pie-1p：：mCherry：：his-58的ltIs37标记物可视化种系细胞核表明，精子存在于asna-1（ΔHis164）动物的精子中，如asna-1（+）（S6B图）。然而，由于通过精子的卵母细胞不包含一个以上的细胞核或显示任何胚胎分裂，我们得出结论，asna-1（ΔHis164）动物的卵母细胞或精子存在缺陷。点突变体和缺失突变体之间的种系缺陷差异与这两种突变体顺铂敏感性表型的相似性形成鲜明对比[28]，表明不同的功能可以独立靶向。

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图4. asna-1（Δ His164）和asna-1（ok938）缺失突变体中种系和胰岛素/ IIS缺陷的比较。

具有指示基因型的 1 天龄成人的百分比仅显示 （A） 细胞质定位的 DAF-16：：GFP 和 （B） 腔胞细胞中分泌 DAF-28：：GFP 的 1 天大成人的百分比。实验一式三份进行。条形表示SD±平均值。 （A）统计显著性由单因素方差分析确定，然后是邦弗朗尼事后校正。（C）具有代表性的成虫DIC图片，显示野生型ASNA-1（ok938）和asna-1（ΔHis164）菌株的体型。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010538.g004

对ASNA-1点突变体的分析揭示了保守丙氨酸对顺铂耐药性的重要性

我们之前已经证明 C.秀丽隐杆线虫ASNA-1以两种氧化还原状态存在：还原（ASNA-1红）和氧化（ASNA-1牛），并且蛋白质的重要生物学功能可以根据氧化还原状态分离[28]。如前所述，这些结论是基于对asna-1单点突变体asna-1（ΔHis164）的分析得出的，该突变体也显示了上述不育表型。因此，我们想知道这是否是His164突变的独特特征，或者ASNA-1蛋白中的任何其他单点突变是否也能够完全分离ASNA-1的重要生物学功能：胰岛素分泌，TAP靶向和顺铂敏感性，同时不引起蠕虫的无菌。出于这个原因，我们检查了百万突变计划产生的一组七种菌株，每种菌株都携带ASNA-1中的错义点突变以及基因组中的其他突变[35]（S1表）。在这七个突变体中，只有四个突变体是与人类ASNA1保守的突变氨基酸（S1表和S7A图）。单个氨基酸的变化都没有导致ASNA-1蛋白的稳态水平降低（S8图）。我们对所有七种菌株进行了顺铂存活分析，以询问这些突变体中是否有任何一种可以增加对顺铂治疗的敏感性。劳工处50处理24小时后，ASNA-1（OK938）缺失突变体的顺铂为300μg/mL[27]，因此我们在实验中使用该浓度。我们发现只有两种菌株asna-1（gk687101）和asna-1（gk592672）在暴露于药物24小时后显示出顺铂敏感性增加（图5A）。由于asna-1（gk592672）菌株产生更严重的敏感性表型，我们在进一步分析中重点关注该点突变。asna-1（gk592672）突变是丙氨酸到缬氨酸的变化，位于高度保守的位置63，对应于人类同系物中的丙氨酸82，并且靠近开关I结构域（S7A图）。该结构域在TA蛋白靶向过程中ATP水解的激活中起着至关重要的作用。我们使用GnomAD浏览器（https://gnomad.broadinstitute.org/）来评估该点突变对ASNA-1人类同系物的影响。浏览器不仅提供变异列表，还提供临床应用的关键视图[36]。在60，706个个体的外显子组序列数据中，ASNA1有79个观察到的单核苷酸变异（SNV），导致错义突变。在这些人群中，检测到A82突变为苏氨酸（T）（A82T），在欧洲（非芬兰）人群中具有两个等位基因计数。PoyPhen-2（http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/）是一种预测氨基酸替代对人类蛋白质结构和功能的可能影响的工具。人类ASNA1（A82T）突变被归类为“可能有害”。丙氨酸到缬氨酸的取代也是如此。考虑到含有菌株的asna-1（gk592672）中其他基因的其他突变，我们比菌株交叉13次，并再次进行了顺铂敏感性测定。事实上，杂交菌株，以下简称asna-1（A63V），对顺铂暴露与asna-1（ok938）缺失突变体一样敏感。顺铂敏感性表型被与转基因表达的GFP（knuSi184）融合的野生型ASNA-1的单个拷贝拯救（图5B）。该转基因还拯救了顺铂敏感性表型的ASNA-1蛋白零突变体（图5B）。我们得出结论，位于第63位的高度保守的丙氨酸的变化是导致顺铂敏感性与缺失突变体一样严重的遗传位点，并且遗传背景中没有其他突变有助于表型。

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图5. 对ASNA-1点突变体的分析揭示了保守丙氨酸对顺铂耐药性的重要性。

（A）分析带有ASNA-1点突变的700万个突变项目菌株的顺铂敏感性表型。（B）挽救具有单拷贝ASNA-1（+）转基因knuSi184的asna-1（ok938）缺失突变体和asna-1（gk592672 /A63V）突变体的顺铂敏感性表型。条形代表暴露于 300 μg/mL 顺铂 24 小时 1 天大的成年动物的平均生存率± SD。统计学显著性由单因素方差分析确定，然后是邦弗朗尼事后校正。生存实验一式三份进行。（C）蛋白质印迹分析以估计野生型和asna-1（A63V）突变体中的ASNA-1水平。用抗ASNA-1抗体探测印迹。微管蛋白被用作负荷对照。有关完整的未裁剪蛋白质印迹图像，请参见S9图。（D）野生型和asna-1（A63V）突变体的育雏大小分析（n = 5）。统计学意义由独立的双样本t检验确定。（E）野生型（n = 40）和asna-1（A63V）（n = 40）动物的寿命分析。±（F）顶部面板显示了具有代表性的成虫DIC图片，以显示野生型，asna-1（ok938）和asna-1（A63V）菌株的体型。动物种系的放大倍数显示在底部面板中。白色箭头表示外阴位置，以便定向。（G-H）具有指示基因型的 1 天龄成人的百分比仅显示 （G） 细胞质定位 DAF-16：：GFP 和 （H） 腔细胞中分泌 DAF-28：：GFP 的 1 天龄成人的百分比。实验一式三份进行。条形表示SD±平均值。 （G）统计显著性由单因素方差分析确定，然后是邦弗朗尼事后校正。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010538.g005

asna-1（A63V）突变体具有正常的育雏大小和胰岛素/ IIS信号传导和分泌

为了获得更多关于ASNA-1可分离功能的证据，我们表征了asna-1（A63V）菌株。与asna-1（ΔHis164）蛋白的情况一样[28]，A63V突变不影响蛋白的稳态水平（图5C和S9）。ASNA-1A63V：：在ER中以与野生型蛋白ASNA-1：：GFP相同的方式检测多拷贝转基因表达的GFP（S7B图）。asna-1（A63V）动物未显示asna-1（ok938）缺失突变体显示的增强ER应激表型（S7C和S7D图）[28]。虽然asna-1（A63V）动物对顺铂的敏感性与缺失突变体一样敏感（图5B），但它们具有正常的育雏大小和寿命（图5D和5E），并且具有适当的生殖系发育（图5F）。这一特性开辟了分离ASNA-1顺铂、TAP插入和胰岛素功能的可能性，而不会影响ASNA-1（ok938）或ASNA-1（ΔHis164）突变体的无菌表型[28，37] 重要的是，asna-1（A63V）突变体既没有胰岛素信号传导，也没有胰岛素分泌缺陷（图5、5H、S5A和S5B），分别通过DAF-16：：GFP的胞质/核定位和腔胞细胞对DAF-28：：GFP的摄取进行测量。这一证据得出的结论是，ASNA-1在顺铂敏感性和胰岛素信号传导/分泌方面的功能确实在动物中是完全可分离的，而没有种系中的功能受损，并且ASNA-1突变体的顺铂敏感性纯粹是体细胞特异性缺陷，因为种系在asna-1（A63V）突变体中是正常的。

asna-1（A63V）突变体将TAP插入功能与胰岛素分泌分离

我们之前已经证明，asna-1（ok938）和asna-1（ΔHis164）突变体在TAP SEC-61β的靶向方面表现出强烈的缺陷[28]。这一结论得到了两项独立测试的支持。首先，皮尔逊共定位分析与ER标记mCherry：：SP12共表达GFP：：SEC-61β的蠕虫共聚焦显微镜。其次，对SEC-61β进行N-连接糖基化分析，以监测SEC-61β插入ER膜的情况[28]。由于asna-1（ok938）和asna-1（ΔHis164）突变体具有asna-1（A63V）突变体的顺铂敏感性表型，因此我们想知道asna-1（A63V）动物是否可以支持ASNA-1依赖性SEC-61β插入。对asna-1（A63V）突变体中两个共表达转基因（GFP：：SEC-61β和mCherry：：SP12）的共聚焦显微镜图像的Pearson相关性分析显示TAP靶向表型存在显着缺陷（图6A和6B）。接下来，我们测量了SEC-61β蛋白直接插入ER膜的情况[28]。我们使用表达标记SEC-61β的转基因（rawEx64），其中β-视蛋白标签插入终止密码子之前。视蛋白标签含有一种反应性精氨酸，当 C 末端暴露于 ER 腔时，该精氨酸被 ER 腔内酶糖基化。这报告了SEC-61β蛋白正确插入ER膜的情况。糖基化事件通过糖基化标记蛋白的电泳迁移率的变化来揭示。该分析表明，SEC-61β的ER插入在asna-1（A63V）突变背景中减少（S10图），与共聚焦显微镜分析得出的结论一致。

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图6. asna-1（A63V）突变体在TAP插入方面存在缺陷，但胰岛素分泌正常。

（A）asna-1（+）和asna-1（A63V）1天龄成年动物在肠道中共表达GFP：：SEC-61β和mCherry：：SP12的代表性共聚焦图像。在 int8 和 int9 细胞中进行成像。刻度：10 μm 和 60 μm 用于放大。（B）皮尔逊对GFP：：SEC-61β和mCherry：：SP12在asna-1（+）（n = 13）和asna-1（A63V）（n = 19）中的共定位的相关性分析。箱形图表示所示菌株的平均皮尔逊相关系数 （R）。统计学显著性由曼-惠特尼检验确定。（C） ASNA-1：：GFP 和 ASNA-1 膜/胞质部分的条带强度定量A63V：：GFP基于S11图中的蛋白质印迹。统计学意义由独立的双样本t检验确定。误差线代表±SD。 （D）还原和非还原SDS-PAGE后的代表性蛋白质印迹，以检测氧化和还原的ASNA-1水平A63V：：GFP.对照蠕虫表达ASNA-1（+）：：GFP转基因。用抗：GFP抗体探测印迹，微管蛋白为上样对照。有关完整的未裁剪印迹源图像（包括用于定量的重复），请参见S11图。图表示氧化/还原的ASNA-1的条带强度定量A63V：：GFP.统计学意义由独立的双样本t检验确定。实验一式三份进行。条代表±SD。 （E）还原和非还原SDS-PAGE后的代表性蛋白质印迹，以检测氧化和还原的ASNA-1水平A63V：：顺铂（+CP）处理时的GFP（300μg/ mL持续6小时）。对照蠕虫表达ASNA-1A63V：：GFP转基因。用抗：GFP抗体探测印迹，微管蛋白为上样对照。有关完整的未裁剪印迹源图像（包括用于定量的重复），请参见S13图。图表示氧化/还原的ASNA-1的条带强度定量A63V：：GFP.统计学意义由独立的双样本t检验确定。实验一式三份进行。条形代表±标清。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010538.g006

A63V突变改变了ASNA-1的亚细胞定位

ASNA-1与ER膜驻留受体WRB-1发生物理相互作用[28]。接下来，我们研究了GFP：：SEC-61β靶向的缺陷是否也与ASNA-1（A63V）蛋白与膜的结合减少有关。通过超速离心从膜组分中分离细胞质，发现ASNA-1的膜缔合显著降低A63V：：GFP蛋白与ASNA-1：：GFP蛋白的比较（图6C和S11）。我们得出结论，asna-1（A63V）突变体具有asna-1缺失突变体中观察到的TAP插入缺陷，可能是通过降低与ER膜结合的能力。这种缺陷是在不影响胰岛素信号传导的情况下表现出来的，事实上，ASNA-1的这两个重要功能很可能是相互独立的。+

ASNA-1（A63V）突变蛋白优先以氧化态存在

我们之前已经证明 C.秀丽隐杆线虫ASNA-1是一种氧化还原调节蛋白，其功能可根据蛋白质的氧化还原状态分离[28]。我们基于对asna-1（ΔHis164）点突变体的分析获得了这种功能分离的证据，其中蛋白质优先以氧化状态存在。该突变体在TAP插入和顺铂抵抗方面存在缺陷[28]，如图4所示，ΔHis164突变体的胰岛素分泌/信号传导功能正常。因此，我们想知道，基于对asna-1（A63V）突变体的分析，在asna-1（A63V）动物中，ASNA-1功能的分离是否反映在蛋白质氧化状态的变化中。为了解决这个问题，我们进行了非还原SDS-PAGE来评估ASNA-1的氧化状态。A63V：：GFP蛋白。事实上，分析显示，更多的ASNA-1A63V蛋白质以氧化状态存在（图6D和S11）。引人注目的是，ASNA-1的转变A63V：：GFP到氧化态发生在ER应激标志物（hsp-4）（S7C和S7D图）或线粒体应激标志物（hsp-6和hsp-60）（S7E图）表达没有增加的情况下，而氧化应激标志物（gst-4，gst-30和gst-38）略有增加（S7F图）).顺铂治疗不能进一步增加氧化ASNA-1的量A63V：：GFP （图 6E）.我们得出结论，ASNA-1中的A63V突变体具有固有的高ASNA-1牛水平，导致对顺铂的敏感性。它们也有TAP插入缺陷，但不仅保持正常的胰岛素分泌功能，而且没有受损的种系表型。这一结论与我们之前的分析一致，该分析表明，较低水平的ASNA-1减少对生长和DAF-28分泌没有影响。

在ASNA-1（A63V）和ASNA-1（ΔHis164）蛋白的计算机模型中预测了开关I和开关II结构域在功能分离中的重要性

组装为二聚体的野生型ASNA-1蛋白的模型表明，二聚化界面呈现三个主要的相互作用区域：锌原子配位，ATP结合位点和组氨酸164接触（S12图）。通过单点突变A63V获得的模型表明，丙氨酸被缬氨酸取代，通过在P环基序中直接指向Thr32（螺旋α2）的位置添加异丙基，减少了螺旋α3和螺旋α2之间的距离（图7A）。该模型提出了由与缬氨酸的密切接触诱导的苏氨酸羟基的运动校正。Thr32在镁原子的配位（图7A和S12）、其水合状态以及ATP的结合和催化中起关键作用。ATP的结合是闭合二聚体形成和闭合界面形成的关键事件，通过其直接参与其中。我们得出结论，A63V的变化可能会影响P环结构并影响ATP结合。

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图 7. A63V 和 ΔH164 突变在 ATP 结合的 ASNA-1 二聚体复合物中作用的结构表示。

C的计算机模型。秀丽隐杆线虫ASNA-1突变体显示了这些突变在ASNA-1 ATP酶活性和二聚体复合物形成的关键过程中的结构影响。（A）在左图中，ASNA-1野生型蛋白质单体与Mg（绿色）和AMPPNP（白色）复合物的模型以浅橙色显示。氨基酸 Ala63 以粉红色显示。所描绘的氨基酸显示了位于位置63的氨基酸对配位镁原子的氨基酸的影响。在右图中，ASNA-1（A63V）的单体以绿色表示，Val63以粉红色表示。位置 63 和 Thr32 处的氨基酸之间的距离以黄色显示。（B）在左图中，ASNA-1野生型二聚体的每个单体与浅橙色和黄橙色中的Mg（绿色）和AMPPNP复合物表示，在深鲑鱼中显示了His164的位置。每个单体的His164之间的距离以黄色显示。在右图中，ASNA-1（ΔHis164）的每个单体都以青色和浅青色着色，氨基酸Thr164在深色鲑鱼中着色。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010538.g007

野生型模型显示了每个单体的His164和His164'之间的密切相互作用，以执行二聚体界面（图7B）。ASNA-1的模型显示His164的缺失表明，组氨酸的丢失意味着产生二聚体界面的关键氨基酸之一的丢失，并且不表明补偿相互作用的形成。（图7B）。因此，这种氨基酸的缺失会影响封闭构象的稳定性，并可能以负方式影响其形成。

讨论

ASNA-1同系物的一个深入研究的作用是将尾锚蛋白的子集靶向ER膜及更远的地方。然而，ASNA-1及其同系物的作用与其尾锚定位功能无关，这一点也很明显。这些包括调节氯离子通道功能、聚集蛋白的保持酶功能以及与ALS相关蛋白VAPB蛋白的结合等[12，21，38]。我们实验室的早期工作也解决了这个问题，并将胰岛素分泌与顺铂反应分开[28]。由于ASNA-1促进肠道中SEC-61β的ER靶向[28]，并且也是DAF-28/胰岛素的神经元分泌所必需的[25]，因此本研究的一个目的是进一步检查不同组织对生长和繁殖的相对贡献。第二个主要目标是发现C中是否存在单点突变。秀丽隐杆线虫ASNA-1将满足ASNA-1对顺铂反应功能的要求，与其在生长和繁殖中的作用分开。

首先，我们表征了ASNA-1在体细胞组织和种系中的表达模式。我们发现，一般体细胞组织耗竭导致严格的L1停滞表型与从母体和合子贡献中耗尽的asna-1突变体中所看到的表型相同。我们还发现，ASNA-1的肠道特异性耗竭导致生长缺陷，但不像泛体细胞耗竭那么严重，这增加了ASNA-1对L1停滞的贡献可能来自神经元和肠道的可能性。这通过肠道和神经元中ASNA-1的同时消耗进一步证实了这一点。胚胎发生后的泛体细胞耗竭表明，ASNA-1是蠕虫从L1期到L2期发育所必需的，但从L4幼虫期到成虫期不是必需的。这表明ASNA-1不能被视为一种管家基因，其功能以构成方式需要。

百万突变计划（MMP）是探索几乎每个C突变的强大资源。秀丽隐杆线虫基因[35]。它导致了2000多种全基因组测序菌株中大量突变的收集。我们在该项目产生的ASNA-1中测试了七个单点突变体的顺铂敏感性（S1表）。由于所有这七个菌株都是点突变体的纯合子并且具有可育性，因此很可能七个点突变体中没有一个影响繁殖。鉴于突变体具有生育能力，我们预计对突变体ASNA-1功能的总体影响只有轻微变化。然而，我们不能排除补偿性第二位点突变体在某些情况下可能起作用的可能性。七种菌株中只有两种对顺铂敏感。我们得出的结论是，所有菌株中都存在的重突变负荷本身不会导致顺铂敏感性，并且由于某些非特异性原因，不健康的蠕虫本质上不容易产生顺铂敏感性。在筛选可行的ASNA-1突变体时，能够分离ASNA-1在胰岛素分泌和顺铂抵抗中的临床相关功能，我们发现asna-1（A63V）在功能分离中很重要。

asna-1（A63V）突变体产生的蛋白质优先以氧化态存在，具有很强的顺铂敏感性表型和尾锚蛋白插入缺陷，并且具有缺陷的亚细胞定位。重要的是，尽管存在这些缺陷，但突变并未影响IIS活性，也没有引起任何生长或发育问题。这使我们能够在不影响蠕虫活力的情况下进一步遗传分离asna-1功能。功能分离的证据来自对另一个点突变体的早期研究：asna-1（ΔHis164）。我们之前已经证明，这种突变体也对顺铂敏感，突变蛋白优先以氧化状态积累[28]。在这里，我们提出的证据表明，ASNA-1的IIS功能在ΔHis164突变体中基本保持完整，并且种系发育明显优于asna-1缺失突变体，因为卵母细胞和精子形成并且排卵（卵母细胞从卵巢中退出）也发生。综上所述，我们的工作表明，向更高水平的氧化ASNA-1积累的显着转变不会干扰胰岛素的分泌和生长，但确实对TAP靶向和顺铂敏感性表型有影响（表1和S14图）。

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表 1. 总结了论文中讨论的ASNA-1缺失和点突变体的表型，以突出不同水平的ASNA-1活性所显示的不同表型。

顺铂敏感性与种系发育能力和胰岛素分泌能力无关，但与TAP靶向表型有关。氧化 v/s 减少的 ASNA-1 比率大幅增加的动物仍将显示顺铂敏感性表型，表明增加的 ASNA-1 水平并不能保护这些突变体免受顺铂诱导的死亡。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010538.t001

计算机建模表明，接近开关I基序的A63V突变影响P环基序中保守苏氨酸的配位，并可能对ATP结合和水解产生影响。此外，分离高度保守组氨酸164突变的另一个功能位于Switch II基序中，对胰岛素分泌和信号传导没有影响。这表明开关I和开关II和P环基序是极好的成药靶标，可增加顺铂敏感性，同时保留ASNA-1的胰岛素分泌作用。事实上，ATP酶多年来一直是药物发现的一个有吸引力的目标，因为它们的失调是许多人类疾病的起源。已有几种ATP酶抑制剂的报道[39-42]，并已被证明对治疗各种疾病有益。为了分离ASNA1功能，靶向ASNA1中的Switch I/II结构域的可能性之一可能是使用小分子竞争性ATP抑制剂。特别是，它有利于治疗对化疗耐药的癌症类型。其中一种替代方案是合成特定的ATP抑制剂pro-dug，特异性于ASNA1中存在的开关I和开关II结构域，其中还含有一个小肽载体。药物的活化需要通过特异性蛋白酶切割肽，这将允许设计组织特异性ATP抑制剂。仍然需要对该策略进行全面验证，但似乎很明显，靶向对ASNA1中ATP酶活性重要的结构域是一种有吸引力的方法。

为了能够开发靶向癌症疗法，需要更好地了解哪些细胞途径参与顺铂反应和耐药性。基于这里给出的结果，我们相信通过作为竞争性ATP抑制剂的小分子药物靶向蛋白质的ATP酶结构域来分离ASNA1在胰岛素分泌中顺铂反应中的功能，将使我们能够使肿瘤对顺铂治疗重新敏感，使胰岛素分泌不受干扰。

材料和方法

秀丽隐杆线虫菌株维持和同步

布里斯托尔菌株（N2）是野生型。使用unc-32（e189）和oxTi719作为平衡器，将含有菌株VC40357的asna-1（gk592672）杂交13次，并反式与hT2（qIs48）平衡器杂交。ASNA-1A63V：：GFP 由 pVB222GK [25] 的诱变生成，以使用 QuickChange II 试剂盒（安捷伦科技公司）引入 A63V 变化。所得质粒（pGK200）用于生成染色体外阵列rawEx8。rawEx8的基因组整合产生了rawIs16。rawIs16蠕虫在分析前被杂交4次。单拷贝asna-1：：gfp（knuSi184）含有1.4 kb上游启动子序列，驱动基因组asna-1编码区在终止密码子之前融合到GFP，然后是tbb-2 3' UTR。该构建体使用Knudra Transgenics的MosSCI技术[43]插入ttTi5605位点的II号染色体上。rawEx64将vha-6p-3xFlag：：SEC-61β：：opsin表达为染色体外阵列，在使用前被杂交2次[28]。所有 C.本研究中使用的秀丽隐杆线虫菌株列在S2表中。除非另有说明，否则蠕虫在线虫生长培养基（NGM）平板上以20°C的标准条件下培养。大肠杆菌菌株OP50被用作食物来源。同步：如前所述，通过重力分离获得同步幼虫种群[44]。

TAP-targeting analysis

如前所述进行检测[28]。简而言之，将活的1天大的成年动物在1mM左旋米索/ M9中镇静并安装到2%琼脂糖垫上。对后肠中的int8和int9细胞进行成像。使用LSM700共聚焦激光扫描显微镜（卡尔蔡司）和LD C复消色差40x/1.1 W校正物镜在488 nm和555 nm处分析荧光信号。Z-stacks的图像处理是用ZEN Lite程序（蔡司）执行的。相关性量化是使用Volocity软件（PerkinElmer）完成的。使用自动阈值[45]方法进行相关性量化，以客观地设置阈值。

胰岛素检测

在20°C下生长集成daf-16：：gfp（zIs356）和daf-28：：gfp（svIs69）阵列的蠕虫，并使用配备Hammamatsu Orca Flash 4.0相机的尼康显微镜成像。DAF-16：：GFP动物在安装后10分钟内进行分析，以避免因压力而造成的伪影。如前所述，腔胞胎细胞对GFP摄取进行评分[25]。

标记SEC61β的糖基化分析

将来自rawEx64转基因的表达3xFlag：：SEC-61β：：opsin的年轻成虫均质化并用于蛋白质浓度测定。所有样品均在Laemmli缓冲液中溶解，通过SDS-PAGE分离，然后进行蛋白质免疫转移，并通过抗Flag（F1804，Sigma）抗体免疫印迹进行检测。

蛋白质印迹分析

减少SDS-PAGE：将同步的年轻成虫均质化，并使用BCA测定法（赛默飞世尔科技）测定蛋白质浓度。将样品在还原性上样缓冲液（SDS/β-巯基乙醇）中煮沸10分钟。蛋白质通过SDS-PAGE分离并印迹到PVDF膜上。非还原性SDS-PAGE：将裂解物在非还原性（无β-巯基乙醇）上样缓冲液中煮沸10分钟，并冷却至室温10分钟。为了保护游离半胱氨酸硫醇免受裂解后氧化，将碘乙酰胺以终浓度25mM加入样品中，然后在室温下在黑暗中孵育30分钟。蛋白质通过SDS-PAGE分离并印迹到硝酸纤维素膜上。抗体：使用抗ASNA-1抗体[25]，抗GFP抗体（3H9，Chromotek）和抗Flag M2抗体（F1804，Sigma）。为了评估等负荷，剥离膜并用抗α微管蛋白（T5168，Sigma）探测。使用ImageJ软件进行条带定量[46]。

亚细胞分离

收获在20°C下生长的年轻成年动物，洗涤并在提取缓冲液（50mM Tris，pH7.2，250mM蔗糖，2mM EDTA）中裂解。将上清液在4°C下以100，000xg离心60分钟。 使用Vivaspin浓缩器（Sigma）浓缩上清液级分。将沉淀级分重悬于1x Laemmli缓冲液（Biorad）中。两种组分中的蛋白质通过SDS-PAGE分离并印迹到PVDF膜上。使用抗GFP抗体（3H9，Chromotek）或抗α微管蛋白（T5168，Sigma）检测蛋白质。

RNA分离和定量PCR检测

使用Aurum Total RNA Mini Kit （BioRad）提取总RNA。cDNA是使用iScript cDNA合成试剂盒（BioRad）合成的。qPCR使用KAPA SYBR FAST qPCR试剂盒（KapaBiosystems）在CFX Connect机器（BioRad）仪器上进行，采用比较Ct方法，并与管家基因F44B9标准化。5. 所有样品一式三份。

生长素治疗

将动物转移到含有指定浓度的水溶性生长素衍生物萘乙酸（N610;植物技术实验室）。含生长素的琼脂平板在使用当天从新鲜制备的800mM水中储备溶液制备，并在黑暗中储存。

顺铂敏感性测定

如前所述制备顺铂板[28]。L4幼虫分离并生长24h后暴露于顺铂。在顺铂暴露24小时后，死亡是由使用铂丝受到剧烈触摸刺激时没有触摸引起的运动来确定的。

ASNA-1 模型预测

C的三种型号。秀丽隐杆线虫ASNA-1（CELE_Zk637.5 #1–342）是使用3D建模预测程序MODELLER[47]获得的，其模板是嗜热毛蚴的Get3蛋白复合物的结构，结合不可水解的ATP激动剂AMPPNP（PDB：3IQW）[48]。其中两个模型是通过加载具有以下突变之一的序列获得的：A63V和ΔH164。第三种结构不包含任何突变，模仿野生型蛋白。该模型组装为二聚体，并与AMPPNP，Mg和Zn复合，模拟嗜热毛茛（PDB：3IQW）获得的结构。

支持信息

ASNA-1 is expressed in head neurons.

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S1 图 ASNA-1在头部神经元中表达。

1天大的成虫在头部神经元中表达ASNA-1：：mNG：：AID（syb2249）的代表性图像（白色箭头）。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010538.s001

（蒂夫）

S2 图 bi-cistronic ASNA-1^SL2：：mNeonGreen：：H2B.

（A）双顺反子ASNA-1^SL2：：mNeonGreen：：H2B（syb5730）的示意图。（B）表达ASNA-1^SL2：：mNeonGreen：：H2B（syb5730）的代表性荧光和微分干涉对比（DIC）图像蠕虫。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010538.s002

（蒂夫）

S3 图 生长素诱导型ASNA-1敲低实验装置的示意图。

（A）第4期（L4）雌雄同体暴露于1mM生长素（AUX）48h，同时产生后代，然后从平板中取出。在移除母体48小时后，分析它们留在含生长素平板上的后代。在非生长素NGM平板上类似处理的L4蠕虫作为对照。（B）分期L1雌雄同体暴露于1mM生长素（AUX）24h，48h和72h，并在这些时间点进行分析。在非生长素NGM平板上类似分期的未暴露幼虫作为对照。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010538.s003

（蒂夫）

S4 图 表达syb2249的蠕虫代表性图像;即Si57。

表达syb2249的蠕虫代表性图像;ieSi57在特定时间点生长在没有（NGM）或（NGM + AUX）1mM生长素的平板上。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010538.s004

（蒂夫）

S5 图 野生型、asna-1（ok938）、asna-1（ΔHis164）和asna-1（A63V）成虫的代表性荧光图像。

野生型ASNA-1（ok938）、asna-1（ΔHis164）和asna-1（A63V）成虫的代表性荧光图像表达（A）DAF-16：：GFP或（B）DAF-28：：GFP。白色箭头表示表达DAF-28：：GFP的腔细胞，白色三角形表示表达DAF-28：：GFP的神经元。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010538.s005

（蒂夫）

S6 图 具有代表性的荧光和光学显微镜图片，以可视化asna-1（+）和asna-1（ΔHis164）成年动物的种系。

（A）asna-1（+）和asna-1（ΔHis164）成年动物的代表性荧光和光显微镜图片表达itIs37转基因以可视化种系细胞核（红色）和itIs38转基因以可视化体内生殖细胞膜（绿色）。白色箭头表示外阴位置，白色三角形表示精子位置。（B）表达itIs37转基因的asna-1（+）和asna-1（ΔHis164）成年动物的代表性荧光和光学显微镜图片，以可视化体内种系细胞核。白色箭头表示外阴的位置，用于定向，白色三角形表示精子在精子中。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010538.s006

（蒂夫）

S7 图 ASNA-100万个突变点突变体的分析。

（A）ASNA-1 / GET3 / TRC40的多序列比对比较4种不同物种中蛋白质的特定结构域。基本领域是高度保守的。整篇论文中提到的氨基酸都标有蓝色。（B）共表达mCherry：：SP12的1天大成人与ASNA-1：：GFP或ASNA-1的共聚焦成像合并A63V：：GFP.（C）通过荧光显微镜在1天大的成年野生型和asna-1（A63V）动物中成像的hsp-4p：：GFP报告基因（zcIs4）的表达。hsp-4p：：GFP在野生型（n = 5）和asna-1（A63V）动物（n = 5）中的表达定量。统计学意义由独立的双样本t检验确定。条形表示平均±标准偏差。 （D）1日龄成年asna-1（A63V）动物ER应激报告基因hsp-4的相对mRNA分析。统计学意义由独立的双样本t检验确定。实验一式三份进行。F44B9.5用作归一化对照。条形表示平均± SEM。 1 天龄成年野生型和 asna-1（A63V） 动物中 （E） 线粒体应激报告基因（hsp-6 和 hsp-60）和 （F） 氧化应激报告基因（gst-4、gst-30 和 gst-38）的相对 mRNA 分析。统计学意义由独立的双样本t检验确定。实验一式三份进行。F44B9.5用作归一化对照。条形表示 SEM ±平均值。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010538.s007

（蒂夫）

S8 图 蛋白质印迹的完整未裁剪图像。

蛋白质印迹的完整未裁剪图像，用于估计携带ASNA-1中单个氨基酸突变的动物的ASNA-1水平。用抗：ASNA-1抗体探测印迹。微管蛋白被用作负荷对照。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010538.s008

（蒂夫）

S9 图 蛋白质印迹的完整未裁剪图像。

图5C中使用的完整未裁剪印迹图像。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010538.s009

（蒂夫）

S10 图 asna-1（+）和asna-1（A63V）动物的糖基化。

还原SDS-PAGE以检测在asna-1（+）和asna-1（A63V）背景中携带3xFlag：：SEC-61β：：opsin（rawEx64）转基因的菌株中的糖基化（gSEC-61β）和非糖基化（SEC-61β）SEC-61β的蛋白质印迹的完整未裁剪图像。虚线代表膜切割的地方，以便同时探测反：标志和反：微管蛋白抗体。糖基化与非糖基化SEC-61β（gSEC-61β / SEC-61β）的带强度定量。条形表示SD±平均值。 统计学意义由独立的双样本t检验确定。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010538.s010

（蒂夫）

S11 图 蛋白质印迹的完整未裁剪图像。

用于图6C和6D定量的完整未裁剪印迹图像。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010538.s011

（蒂夫）

S12 图 在C的模拟模型中。秀丽隐杆线虫ASNA-1蛋白。

用MODELLER在其“封闭构象”中获得的ASNA-1二聚体的带状图，与AMPPNP结合并模拟嗜热毛茛（PDB：3IQW）的Get3蛋白复合物的构型。肽链以浅橙色和黄橙色表示，白色表示AMPPNP，绿色Mg原子表示，灰色Zn原子表示，粉红色表示Ala63，深鲑鱼表示His164。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010538.s012

（蒂夫）

S13 图 蛋白质印迹的完整未裁剪图像。

图6E中用于定量的完整未裁剪印迹图像。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010538.s013

（蒂夫）

S14 图 描述ASNA-1蛋白功能分离的示意图模型。

描述ASNA-1蛋白功能分离的示意图模型，显示对氧化还原平衡（1），顺铂抵抗/敏感性（2）和DAF-28/胰岛素分泌（3）的影响。尾部锚定蛋白（TAP）以绿色显示，带有横跨结构域的圆柱形C端膜。正常的TAP插入用ER膜双层中的三个TAP蛋白分子表示，而较低的TAP插入则用一个这样的分子表示。功能丧失 （lf） 情景中的 ASNA-1 蛋白显示为红色，表示仅由于来自 asna-1/+ 母亲的纯合突变体中的母体遗传而存在的低 ASNA-1 水平。点突变体（A63V和ΔHis164）中氧化还原平衡的改变导致降低的ASNA-1水平降低，导致TAP蛋白分子的参与减少，从而减少插入ER膜双层的TAP蛋白分子。使用BioRender创建。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010538.s014

（蒂夫）

S1 表。 在ASNA-1中携带点突变的百万突变项目菌株列表。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010538.s015

（三十）

S2 表。 本研究中使用的秀丽隐杆线虫菌株。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010538.s016

（三十）

S1 数据。 本文的基础数据。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010538.s017

（文档）

确认

我们感谢Caenorhabditis遗传中心（由NIH研究基础设施计划办公室P40 OD010440资助）和实验动物“线虫秀丽隐杆线虫”的国家生物资源项目提供菌株。

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