医学论文范文-驱动程序使用双重转录调节和从孢子中选择性排除蛋白质来引起减数分裂驱动

妮可·努克尔斯 ，阿纳尼亚·尼达曼加拉·斯里尼瓦萨 ，安东尼·莫，雷切尔·赫尔斯顿，玛丽亚·安杰利卡·布拉沃·努涅斯，杰弗里·兰格，托德·加拉格尔，克里斯·塞德尔，莎拉·赞德斯

发布时间：2022 年 12 月 7 日

抽象

减数分裂驱动因素偏向配子发生，以确保它们传递到杂合子的一半以上的后代中。在柚子裂殖酵母中，wtf减数分裂驱动因素破坏不从杂合子继承驱动因素的减数分裂产物（孢子），从而降低生育能力。WTF 驱动程序对 Wtf 进行编码毒蛋白质和 Wtf解药蛋白质使用替代转录起始位点。在这里，我们分析了Wtf蛋白的表达和定位如何被调节以实现驱动。我们表明，转录时机和从发育中的孢子中选择性排除蛋白质可确保所有孢子都暴露于Wtf4毒，但只有继承 WTF4 的孢子才会接受一定剂量的 Wtf4解药足以生存。此外，我们表明Mei4转录因子是减数分裂的主要调节因子，控制着减数分裂的主要调节因子的表达WTF4毒抄本。这种转录调控，包括使用关键的减数分裂转录因子，可能会使wtf基因的普遍抑制复杂化，而不会伴随破坏孢子活力。我们建议这些功能有助于 wtf 驱动程序的进化成功。

作者摘要

基因组通常被认为是为生物体提供有益功能的“好”基因的集合。从这个角度来看，疾病被认为是由于“好”基因的功能失调而引起的。例如，不孕症可能是由通常有助于生育的基因失败引起的。这种观点是不完整的，因为也存在对生物体没有益处的“寄生”基因。这些基因也可能导致疾病，通常是由于它们用来确保其传播给下一代的机制。例如，杀伤性减数分裂驱动因素遍布整个真核生物，并通过主动破坏不遗传它们的配子（例如卵子和精子）导致不孕症。在这项工作中，我们研究了wtf4的转录调控，wtf4是在裂变酵母中发现的一种模型杀手减数分裂驱动因素，以了解驱动机制。wtf4基因在大量重叠的编码序列上编码毒物和解毒剂蛋白。我们发现毒物和解毒剂蛋白的不同启动子和不同的定位特性都有助于杀伤减数分裂驱动。我们还发现，毒蛋白的表达依赖于配子发生所必需的关键转录因子。这种转录因子的使用可能会使抑制wtf4复杂化而不影响配子发生。这一特征可能有助于wtf驱动程序的进化成功，wtf驱动程序在裂变酵母基因组的许多拷贝中发现。

引文： Nuckolls NL， Nidamangala Srinivasa A， Mok AC， Helston RM， Bravo Nú?ez MA， Lange JJ， et al. （2022） S.Pombe WTF驱动利用双重转录调节和从孢子中选择性排除蛋白质来引起减数分裂驱动。公共科学图书馆基因18（12）： e1009847. https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009847

编辑 器： Gregory P. Copenhaver，美国北卡罗来纳大学教堂山分校

收到： 9月 29， 2021;接受： 11月 15， 2022;发表： 12月 7， 2022

版权所有： ? 2022 努克尔斯等人。这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。

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资金： 这项工作得到了斯托尔斯医学研究所（SEZ）的支持;美国国立卫生研究院 （NIH） R00GM114436 和 DP2GM132936 （经济特区）;塞尔学者计划（SEZ）;美国国立卫生研究院国家癌症研究所，奖励号为F99CA234523（MABN）;以及美国国立卫生研究院的Eunice Kennedy Shriver国家儿童健康与人类发展研究所，奖励号为F31HD097974（NLN）。资助者在研究设计、数据收集和分析或手稿准备方面没有任何作用。内容完全由作者负责，不一定代表资助者的官方观点。

竞争利益： 这项工作得到了斯托尔斯医学研究所（SEZ）的支持;美国国立卫生研究院 （NIH） R00GM114436 和 DP2GM132936 （经济特区）;塞尔学者计划（SEZ）;美国国立卫生研究院国家癌症研究所，奖励号为F99CA234523（MABN）;以及美国国立卫生研究院的Eunice Kennedy Shriver国家儿童健康与人类发展研究所，奖励号为F31HD097974（NLN）。资助者在研究设计、数据收集和分析或手稿准备方面没有任何作用。内容完全由作者负责，不一定代表资助者的官方观点。

介绍

大多数真核基因的传播遵循孟德尔第一分离定律。该定律规定杂合子生物的两个等位基因（例如A/a）随机分离成配子，使得每个等位基因传播给50%的后代[1]。然而，有些等位基因可以打破孟德尔定律，迫使自己的传播到一半以上的后代中。这些违法基因被称为减数分裂驱动因素[2，3]。减数分裂驱动基因种类繁多，在整个真核生物中发现了不同的进化起源和机制[4-28]。然而，这些系统如何表达和功能的分子细节是有限的。揭示这些细节对于理解减数分裂驱动很重要，更广泛地说，有可能揭示关于配子发生的新见解。例如，尽管姐妹精子之间存在细胞质连接，但通过研究小鼠的T单倍型驱动因素，发现了精子自主表型的存在[14]。

减数分裂驱动因素通常被认为是自私基因或寄生基因[29]。这是因为由于驱动力的传播优势，驾驶员可以在基因组中持续存在，而不是由于它们为携带它们的生物体提供的健身益处。事实上，减数分裂驱动因素通常通过各种直接和间接机制导致体能下降[30-33]。在被称为杀手减数分裂驱动因素的司机类别中，健身成本尤其有害（在[34]中审查）。这些驱动因素可以通过破坏不从杂合子继承驱动因素的减数分裂产物来实现高达100%的活配子传播。

尽管杀手减数分裂驱动因素的健身成本很高，但许多人群都携带这些基因（综述于[34]）。然而，裂变酵母S.庞贝可能代表了一个极端的例子。S的不同天然分离株。Pombe含有来自WTF（With TRansposon fIssion酵母）基因家族的4-14个预测杀伤减数分裂驱动因素[35-38]。这些基因使用由两个编码序列大致重叠的转录本产生的两种蛋白质杀死不从杂合子继承它们的减数分裂产物（孢子）：一个 Wtf毒杀死孢子和Wtf的蛋白质解药拯救遗传驱动物的孢子的蛋白质（图1A和1B;[37，38]）。在wtf驱动杂合子中减数分裂后，Wtf毒存在于所有孢子中，而 Wtf解药在继承WTF驱动程序的驱动程序中得到丰富[37，39]。这些分布模式解释了驱动如何具有杀死所有孢子的潜力，但具体地拯救了那些继承了驱动物的孢子（图1B）。这种双Wtf蛋白定位模式是如何建立和维持的尚不清楚。

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图1. WTF4毒和 Wtf4解药蛋白质具有不同的表达谱。

(A）显示了wtf4基因的描述。有一个Tf反转录转座子LTR，位于外显子1上游的284个碱基对。外显子1上游的序列含有解毒剂启动子p解药（橙色）和内含子1含有毒物促进剂，p毒（黄色）。箭头表示预测的平移起始位点。WTF4解药（洋红色圆圈）由外显子1-6编码。WTF4毒（青色圆圈）由外显子2-6编码。（B）wtf4杂合子Wtf4毒解毒剂减数分裂驱动模型。WTF4毒存在于所有四个孢子中，而 Wtf4解药表达仅在四个孢子中的两个中富集。（C） mCherry-wtf4/wtf4的延时显微镜毒-GFP二倍体经历减数分裂和孢子化。mCherry-Wtf4 以洋红色和 Wtf4 显示毒-GFP 在合并图像中以青色显示。视频开始后~0小时（二倍体），~5小时（未成熟子囊）和~8小时（成熟子囊）的延时摄影中的代表性细胞图像。这些菌株的不同图像首次出现在[37]中，这些菌株在成熟腹水中蛋白质运动后的延时摄影[52]中出现。（D）Wtf4的归一化荧光强度图毒-GFP（青色线）和mCherry-Wtf4解药（洋红色线）在延时 （n = 25） 的过程中。（E） wtf4的延时显微镜解药-mCherry/wtf4毒-GFP二倍体经历减数分裂和孢子化。WTF4解药-mCherry 以洋红色和 Wtf4 显示毒-GFP 在合并图像中以青色显示。视频开始后~0小时（二倍体），~5小时（未成熟子囊）和~8小时（成熟子囊）的延时摄影中的代表性细胞图像。（F） Wtf4的归一化荧光强度图毒-GFP（青色线）和Wtf4解药-mCherry （洋红色线） 在延时 （n = 13） TL = 透射光的过程中。所有比例尺代表 2 μm。误差线表示 95% 置信区间。在相同的设置下进行延时成像。并非所有图像都以相同的亮度和对比度显示，以避免较亮图像中的像素过度饱和。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009847.g001

揭示减数分裂驱动因素的机制对于了解这些寄生虫如何影响携带它们的生物体非常重要。特别是wtf基因，没有提供已知的健康益处，并且主要负责在杂合S中观察到的不孕症。不同分离株之间异交产生的庞贝二倍体[40-45]。由于 wtf 车手的健身费用，S.庞贝可能已经进化出容忍或抑制驱动力的方法。目前有两种机制可以抑制wtf减数分裂驱动因素：其他wtf基因抑制和配子二体[39-41]。通过反式作用调节剂或顺式作用染色质包装操作的转录沉默是抑制机制的其他候选者。虽然在孢子形成过程中尚未探索这种可能性，但组蛋白去乙酰化和TOR介导的RNA加工已被证明有助于wtf基因的有丝分裂沉默[46-49]。

我们在这项研究中的目标是了解Wtf驱动蛋白的表达和定位是如何协调的，并找到wtf驱动蛋白转录抑制的可能途径。为此，我们使用来自S的wtf4基因。S的坎普茶天然分离物。庞贝作为模型系统。我们定义了控制WTF4毒和WTF4解药成绩单。我们证明，由于发育孢子中两种Wtf4蛋白的不同启动子和差异包含而导致的差异表达都有助于Wtf4蛋白定位，从而有效驱动。我们还发现，表达WTF4毒转录本由转录因子Mei4控制，Mei4是减数分裂中基因表达的主要调节因子[50，51]。在我们的研究结果的背景下，我们讨论了为什么进化或维持wtf基因和驱动因素的转录沉默可能具有挑战性。

结果

WTF4毒和 Wtf4解药蛋白质具有不同的表达谱

在以前的工作中，我们使用荧光标记物分别标记和可视化Wtf4蛋白[37，52]。我们主要对成熟的腹水（装有孢子的袋子）和二倍体细胞进行成像，这些细胞存在于尚未完成孢子形成的同一时间点。在二倍体细胞中，这些分析揭示了来自标记的Wtf4的信号毒-GFP等位基因，但不是mCherry-Wtf4解药等位基因。在成熟的腹水中，我们观察到Wtf4毒-所有孢子和mCherry-WTF4中的GFP解药孢子中强烈富集，遗传了编码等位基因的位点[37，52]。然而，这些分析过于粗糙，无法重建两种蛋白质的完整表达动力学。

在这项工作中，我们更彻底地探索了两种Wtf4蛋白的表达，以揭示这两种蛋白质如何实现对不从杂合子继承wtf4的孢子的靶向破坏（图1B）。我们再次使用WTF4毒-GFP，一种不表达 Wtf4 的功能分离等位基因解药并在 Wtf4 的 C 端添加 GFP 标签毒 (S1 图等位基因 1）。我们之前已经证明，这种等位基因作为一种功能性毒药，但毒性略低于相应的未标记WTF4毒等位基因（[37]，S2A图，二倍体4）。我们还使用了mCherry-wtf4等位基因，它标记了Wtf4。解药，但仍生成未标记的 Wtf4毒 (S1 图等位基因 2）。该等位基因的功能类似于等位基因传递和活孢子产量（VSY）测定中的野生型wtf4（[37]，S2A图，二倍体3）。活孢子产量是衡量生育力的指标，它测定每个细胞产生形成孢子的活孢子数量[53]。在这项工作中，我们将活孢子产量标准化为在野生型对照细胞中测量的孢子产量，其中基因组中集成了空载体而不是wtf4等位基因。因此，这些野生型细胞被认为具有100%的生育能力。杂合子中的完全驱动预计将使生育能力降低约50%，并且Wtf4的表达毒没有 Wtf4 时的等位基因解药预计将使生育率降低50%以上。

我们集成了mCherry-wtf4和WTF4毒-GFP上面提到的等位基因进入不同单倍体菌株的ADE6位点。我们将这两种菌株杂交在一起以产生杂合子mCherry-wtf4 / wtf4毒-GFP二倍体。然后，我们完成了裂变酵母减数分裂和孢子形成过程中的延时显微镜检查（图1C和1D）。在本文中，我们描绘了 Wtf4解药洋红色和 Wtf4毒在所有图像中呈青色，与荧光蛋白标签无关。我们一直观察到 Wtf4毒-GFP 小时前 mCherry-Wtf4解药 (图 1C 和 1D）。鉴于GFP成熟仅比mCherry快几分钟[54-56]，Wtf4的早期信号毒-GFP不能仅用荧光蛋白的成熟时间来解释。通过时间过程，GFP信号减少，但随后增加以在孢子形成之前达到高强度。该信号存在于所有四个孢子中，而不仅仅是那些遗传了WTF4毒-GFP等位基因（图1C和1D，S1视频面板A）。这些观察表明，大多数Wtf4毒蛋白质是在孢子个体化之前产生的，或者WTF4毒转录本和/或蛋白质在孢子之间自由交换。我们通过光漂白两个孢子或表达Wtf4的asci中的整个腹水来区分这些模型毒-GFP和测定荧光恢复（即FRAP）。我们发现Wtf4的回收率最低毒-光漂白孢子和腹水后的GFP信号（S3A-S3D图）。这些支持大多数 Wtf4毒在孢子形成之前产生，然后包装在所有孢子中。

mCherry-WTF4解药孢子形成前信号非常低，孢子形成后达到最大强度（图1C和1D，S1视频面板A）。我们很好奇，如果转录WTF4毒可能会干扰WTF4解药在孢子形成之前，因为WTF4毒转录起始位点位于WTF4解药转录起始位点。为了测试这一点，我们生成了一个替代等位基因m樱桃-wtf4解药缺乏内含子，因此缺乏产生毒物转录本的能力（图1A和S1等位基因3）。该等位基因编码功能性解毒剂，因为它抑制野生型wtf4的驱动，但不单独引起驱动（S2A图，二倍体10和11）。在具有该等位基因的杂合子中，我们再次看到来自该mCherry-Wtf4的最小信号解药二倍体中的蛋白质和两个孢子中的强富集。这表明WTF4毒表达对mCherry-Wtf4的总体定位动力学没有显著影响解药 (S2B 图）。

我们还测试了我们观察到的标记Wtf4之间的信号差异解药和 Wtf4毒蛋白质可能是由于N端与C端标签的差异。为了测试这一点，我们分析了一个C端标记的Wtf4解药功能分离等位基因，WTF4解药-m樱桃.该等位基因不编码 Wtf4毒因为它缺乏内含子（图1A和S1等位基因4）。我们将这个等位基因整合到ura4位点中，发现它确实起到了仅解毒剂等位基因的作用，因为它不会自行驱动，但它确实抑制了wtf4的驱动（S2A图，二倍体8和9）。然后我们越过了一个携带WTF4解药-m樱桃等位基因到携带单倍体细胞WTF4毒-GFP以生成WTF4解药-mCherry/ura4+， wtf4毒-GFP/ade6+二倍体。我们在一段时间内对这些二倍体进行了成像，并观察到Wtf4解药定位与我们用mCherry-wtf4等位基因观察到的模式不同，因为细胞在孢子形成之前具有mCherry信号（图1E和1F，S1视频面板B）。具体来说，我们看到了 Wtf4解药-mCherry在诱导进行减数分裂的二倍体细胞和未成熟腹水的无脊髓细胞质（即孢子外部）中（图1E和1F和S2C，S1视频面板B）。在成熟腹水中，Wtf4解药-mCherry在四个孢子中的两个中强烈富集，类似于N末端标记的蛋白质，但在孢子图1E和1F以及S2C，S1视频面板B之外的ascal细胞质中仍然存在显着信号。另一个C端标记的Wtf4解药功能分离等位基因，WTF4解药-GFP (S1 图等位基因 5），定位类似于WTF4解药-m樱桃 (S2C 和 S2D 图）并表现为功能性解毒剂等位基因（S2A图，二倍体13和15）。

我们通过蛋白质印迹测定Wtf4蛋白的表达。在样品中WTF4解药-mCherry/ura4+， wtf4毒-GFP/ade6+二倍体，我们检测到游离GFP和我们推断为全长Wtf4的条带毒-GFP当细胞经历减数分裂和成熟孢子存在时。我们从不检测到全长 Wtf4解药-mCherry，但是当细胞经历减数分裂和存在成熟孢子时，我们检测到游离mCherry（S4图）。在表达麦克里-WTF4解药等位基因，我们也只检测游离的mCherry，但只有当存在成熟的孢子时，与我们的图像分析一致，显示mCherry仅在孢子中（S5图）。我们无法检测到全长标记的 Wtf4解药在西方并不奇怪，因为我们之前表明蛋白质会迅速被贩运到液泡中，在那里它可能被降解[52]。

我们还尝试检测Wtf4毒-GFP 和 Wtf4解药-mCherry 在蛋白质印迹上，这些印迹来自使用抑制减数分裂进入的 Pat1 激酶的类似敏感等位基因诱导进行同步减数分裂的细胞中收集的样品（pat1.L95G;[57]）。 结果与我们在上述野生型细胞中的结果相似，除了我们可以在减数分裂早期检测到一条微弱的条带，可能是Wtf4。解药-mCherry，除了在所有时间点观察到的自由mCherry波段（S6图）。总体而言，西部片支持我们的成像，因为我们看到了来自标记的Wtf4的信号。毒当细胞经历减数分裂和含有孢子的样品中的位点。我们观察到来自两个标记的 Wtf4 的信号解药含有孢子的样品中的等位基因，但仅来自孢子形成前收集的样品中的C末端标记等位基因（S5和S6图）。

我们得出结论，C末端标记的等位基因揭示了Wtf4解药蛋白质群在孢子形成之前就存在，但N末端标记的等位基因并不明显。额外蛋白质的性质尚不清楚。早期的 Wtf4解药蛋白质可以通过泄漏的转录扫描使用外显子1（密码子12）中发现的第二个翻译起始位点产生[58]。第二个起始位点可用于编码功能齐全的解毒剂蛋白（S1图等位基因6，S2A图二倍体6-7，[37]）。在两个N端Wtf4解药上面讨论的标记等位基因，假定较短的 Wtf4解药蛋白质不会被标记，即使它是生产的。也有可能 Wtf4解药用C端标签显示的群体是全长蛋白，但其在孢子形成前的表达被N端标签破坏。我们没有区分这些可能性。

总体而言，我们的结果表明，来自N端标记的Wtf4的信号解药我们之前的研究中使用的并不反映总 Wtf4解药人口。这里描述的C末端标记等位基因揭示了额外的Wtf4解药蛋白质在孢子形成之前就存在。这种解释也与先前的长读长RNA测序数据一致，数据显示在孢子形成前（例如，减数分裂诱导后0-6小时）至少有一些wtf解毒剂的转录[37，38，59]。两个等位基因都表明额外的 Wtf4解药蛋白质产生发生在孢子形成后。相比之下，我们对Wtf4的时间历程分析毒-GFP生产显示大部分Wtf4毒蛋白质在孢子形成之前就存在，蛋白质不能在孢子之间自由移动。

不同的启动子有助于Wtf4蛋白的不同定位模式

接下来，我们想探索不同的启动子是否有助于Wtf4的不同定位模式。毒和 Wtf4解药腹水中的蛋白质。为了测试这一点，我们在WTF4解药和WTF4毒启动子（包括5'非翻译区域（UTR））分别。对于WTF4解药发起人 （p解药），我们使用了在外显子1上游发现的285个碱基对。这只是附近 Tf 转座子长末端重复 （LTR） 的下游，这对于 Wtf 不是必需的解药生产（图1A;[38，52]）。先前测定cw9和cw27（CBS5557分离物中的两个wtf驱动程序）的工作发现，外显子1上游的288 bp不足以产生功能齐全的p解药启动子[38]。尽管基因的启动子区域高度相似，但我们之前的结果表明，对于wtf4，285 bp上游序列足以促进功能性Wtf4的产生。解药 [52]该序列在编码解毒剂的wtf基因中也非常保守，这也支持该区域包括WTF4解药([36–38，59，60];图2A）。为了表征毒物促进剂（p毒），我们使用构成解毒剂转录本内含子1的230 bp序列（图2D）。该序列包括WTF4毒转录本，在WTF驱动程序中保存良好（图2D，[36-38，59]）。

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图2. 不同的启动子在很大程度上解释了Wtf4的差异定位毒和 Wtf4解药蛋白质。

显示了（A）wtf4解毒剂启动子和（D）wtf4毒物启动子的描述和对齐。对于解毒剂启动子的比对，我们对齐了来自三种不同S菌株的41个预测的仅解毒剂等位基因[36]上游的600个碱基对。庞贝（参考基因组，S.坎普茶和FY29033，[85]）。对于毒物启动子的比对，我们比对了来自三种不同S菌株的28个预测毒解毒剂wtf驱动因子的内含子1序列（两侧是上游和下游内含子100个碱基对的序列166]。庞贝（参考基因组，S.坎普茶和FY29033）。该图像显示了每个核苷酸位置的同一性百分比，不包括间隙。（B） 图像解药-mCherry/ade6+ 二倍体和子囊。（C） p内mCherry荧光的定量解药-mCherry/ade6+ asci （n = 24）.（E） 图像毒-GFP/ade6+ 二倍体和子囊。（F） p内GFP荧光的定量毒-GFP/ade6+ asci （n = 34）。所有图像均在孢子培养基上3天后采集。为了定量，我们测定了每个孢子内的荧光强度，然后将该数字除以所有4个孢子中的总荧光强度。TL = 透射光。所有比例尺代表 2 μm。二倍体的图像以相同的亮度和对比度显示，并且在与由相同基因型的二倍体生成的腹水相同的设置下成像。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009847.g002

我们将启动子报告构建体整合到不同单倍体菌株的ade6位点。然后，我们为每个报告者单独（即报告者/ ade6 +）生成二倍体细胞杂合，并通过减数分裂诱导和孢子形成对它们进行成像。随着p解药-m樱桃报告者，我们在经历减数分裂的二倍体中观察到低信号，但在四个孢子中的两个（图2B和2C）中观察到最强的mCherry信号，可能是遗传了报告分子结构的两个。重要的是，观察到的本地化p解药-m樱桃报告蛋白支持在孢子个体化之前和之后都发生表达。

如上所述，功能齐全的 Wtf4解药蛋白质可以使用第二个ATG密码子在12千密码子位置[37]。我们推测，在密码子12上游的那些编码序列中可能会发现额外的转录调控序列。为了测试这一点，我们生成了p解药长-m樱桃，一个在WTF4解药启动子，还包含WTF4解药编码顺序（S7B图）。我们将这个等位基因整合到lys4，并将这个菌株杂交到野生型，产生杂合二倍体。在这些二倍体和通过这些二倍体生成的asci中，我们看到mCherry表达自p解药长-m樱桃与mCherry相似的报告员从较短的表达p解药 (S7A–S7C 图）。对我们数据的最简单解释是p解药启动子在孢子形成前后表达。此外，我们观察到的报告信号富集模式表明，孢子中产生的转录本和蛋白质可以保留在该孢子中。我们没有直接探索5' UTR在确保孢子特异性表达中的作用，但UTR可能会影响孢子中的翻译或转录本保留。

对于p毒-GFP记者，我们观察到诱导进行减数分裂的二倍体细胞中的表达。我们还在四个孢子中观察到类似的GFP报告信号（图2D和2F）。这些观察结果类似于我们在Wtf4中观察到的定位模式。毒-GFP（例如，图1C）。这种大致相等的分布p毒-GFP报告信号在四个孢子中，即使只有两个遗传了p毒-GFP记者，与观察到的双孢子富集明显不同p解药-m樱桃记者。假设GFP和mCherry之间的孢子与孢子迁移率相等，这进一步支持了大多数p毒转录本在孢子个体化之前产生。与p解药，则 5' UTR 可能会影响由以下因素驱动的转录本的翻译或移动性p毒发起人，但我们没有探索这些可能性。

这些实验共同证明了差异基因表达模式在p解药和p毒发起人。我们的结果还表明，这些不同的启动子在很大程度上有助于Wtf4的定位。毒所有孢子中的蛋白质和Wtf4的富集解药遗传WTF4位点的孢子内的蛋白质。

主减数分裂调节器，Mei4，控制Wtf4毒表达

接下来，我们试图探索wtf4转录本的转录调控。先前的工作指出，多个wtf基因的转录由叉头转录因子Mei4控制，因为如果删除mei4，wtf转录会降低，如果Mei4过表达，wtf基因表达会增加[61]。Mei4控制着数百个基因的表达，被称为中间减数分裂基因的主要调节因子[50，51]。然而，先前的研究是在发现wtf驱动程序可以制作两个转录本之前进行的，因此尚不清楚Mei4控制哪个转录本。

为了了解Mei4控制哪些wtf转录本，我们首先在wtf4启动子中寻找Mei4结合基序。叉头转录因子结合含有FLEX基序的序列，完整的Mei4结合基序包含九碱基对（GTAAACAAA）核心序列[50，51，62，63]。我们在p毒启动子110碱基对上游WTF4毒平移起始位点（图3A）。此外，我们发现这个序列在S中已知的wtf驱动程序中是保守的。pombe（图3A）和其他裂殖酵母菌种的wtf驱动[64]。相比之下，p解药启动子不包含 FLEX 基序。

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图3. 主减数分裂调节器，Mei4，控制Wtf4毒转录。

(A） 对 wtf4 的描述毒内含子1中包含的启动子。有一个FLEX基序（黑匣子，TGTTTAC在相反的方向）位于Wtf4上游的111至117个核苷酸毒转录起始位点。来自三种不同S菌株的28种预测毒解毒剂wtf驱动程序的内含子1序列的百分比共识核苷酸身份[36]。庞贝（参考基因组，S.坎普茶和FY29033）。该图显示了每个核苷酸位置的共识身份百分比，不包括间隙。（B）Mei4 Chip-seq数据（数据来自[50]），显示Mei4在减数分裂诱导后0小时和4小时与wtf基因结合。在顶部面板上，读数与预测的wtf减数分裂驱动基因（wtf4，wtf13）对齐，在底部，读数与预测仅编码S中的解毒剂蛋白（wtf5，wtf9，wtf10，wtf16，wtf18，wtf20，wtf21，wtf25）的wtf基因对齐。 庞贝基因组版本ASM294v2。对于映射到多个位置的任何读取，仅报告随机选择的单个位置。（C）具有所描述基因型的二倍体的等位基因传递和生育能力（通过viable spore yield，VSY测定）。列出的等位基因位于ade6。基因型列显示相关基因型的卡通描述。然后，后代表型显示在右侧。对于在一个位点（例如，二倍体 1）杂合的二倍体，显示了代表两种可能的单倍体基因型的两个值（顶部和底部）。表现出两种亲本表型的孢子被认为是二倍体或非整倍体，并且被排除在本表之外，但可以在S1数据中找到。预期值假定孟德尔等位基因传递。（* = p < 0.05，NS = 不显著;等位基因传递的G检验，VSY的Wilcoxon检验，与空载体对照相比）。我们将所有二倍体与二倍体1作为对照进行比较。二倍体 1 的数据也显示在 S2A 和 S9A 图中。二倍体5也如图S2A所示。（D） 杂合 wtf4-GFP/ade6+（左）和 wtf4 的图像柔性Δ-GFP/ade6+（右）在孢子培养基上 1 天后获得的二倍体和 asci。Wtf4-GFP 和 Wtf4FLEXΔ-GFP 以绿色显示。比例尺代表 2 μM。TL = 透射光。所有图像均以相同的亮度和对比度显示，以便进行准确比较。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009847.g003

要测试 Mei4 是否绑定了p毒减数分裂细胞中的FLEX基序，我们分析了先前在S实验室分离中进行的减数分裂期间Mei4的染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）实验的数据。庞贝 [50]。由于wtf基因的相似性，许多读段不能唯一地分配给wtf4或任何单个wtf基因，因此被随机分配给匹配位点。然而，内含子 1 的序列在包含p毒仅含有启动子和解毒剂的WTF基因p毒启动子，使我们能够区分完整WTF驱动因子和其他WTF基因之间的Mei4结合[36，38，39]。在减数分裂之前，我们观察到Mei4与wtf驱动程序（wtf4，wtf13）的结合相对于基因组平均值较低（图3B，0小时）。减数分裂4小时后，当大多数细胞处于前期I时，我们看到读数在p毒WTF驱动器的启动子（内含子1）（图3B，4小时）。在减数分裂期间，我们没有看到Mei4与仅解毒剂的wtf基因（wtf5，wtf9，wtf10，wtf16，wtf18，wtf20，wtf21和wtf25）结合的增加（图3B）。 我们还在wtf基因的两个亚群的C末端区域看到了Mei4峰。我们预测这个峰值是由于附近的LTR，因为我们看到LTR上的高Mei4结合与它们与wtfs的关联无关（S8图）。

为了进一步测试这个想法WTF4毒表达由Mei4控制，我们比较了两个标记的等位基因：一个全功能等位基因（WTF4-GFP，[37]）和一个缺乏FLEX基序的等位基因（wtf4柔性Δ-GFP;S1 图等位基因 7 和 8）。我们将ade6的等位基因整合到测试功能中。我们没有预料到删除Mei4结合基序会影响Wtf4的表达或功能。解药蛋白质，因为我们可以从WTF4中删除所有内含子1（如WTF4解药-m樱桃），而不影响 Wtf4解药函数（S1图等位基因4，S2A图二倍体8和9）。与我们的期望一致，wtf4柔性Δ-GFP等位基因编码功能性解毒剂，因为它抑制wtf4中野生型WTF4的驱动柔性Δ-GFP /wtf4+ 杂合子（图 3C，二倍体 19）。此外，我们在wtf4产生的asci中四个孢子中的两个内看到了强烈的GFP信号。柔性Δ-GFP/ade6+ 二倍体（图 3D），类似于标记的 Wtf4解药等位基因（例如，S2C 和 S2D 图）。我们测试了 wtf4 的能力柔性Δ-GFP 等位基因编码功能性 Wtf4毒通过测定等位基因是否可以在 WTF4 中驱动柔性Δ-GFP/ade6+ 杂合子。这些二倍体具有孟德尔等位基因传递（图3C，二倍体18）。作为 wtf4柔性Δ-GFP确实编码功能性解毒剂，我们得出结论，等位基因不会驱动，因为Mei4结合基序对于Wtf4的产生至关重要毒.这些数据，结合其他人先前的遗传和生化数据[50，61]支持Mei4控制Wtf4的表达。毒以及可能是其他WTF驱动因素产生的毒蛋白。

Wtf4的独特转录调控毒和 Wtf4解药促进高效减数分裂驱动

探讨WTF4毒和WTF4解药，我们生成了表达解毒剂蛋白的等位基因p毒发起人，反之亦然。我们使用了p毒-WTF4解药-GFP等位基因（集成在ADE6），以测试模式是否p解药转录对驱动很重要（S1图等位基因9）。我们将该启动子交换等位基因的表型与功能性WTF4解药-GFP等位基因（在ADE6处整合）与上述内源性启动子（S1图等位基因5）。我们发现p毒-WTF4解药-GFP减数分裂驱动有缺陷。具体来说，p毒-WTF4解药-GFP等位基因无法抑制完整 WTF4 驱动程序在p毒-WTF4解药-GFP/wtf4杂合子（S9A图二倍体22）。对照等位基因（WTF4解药-GFP） 完全抑制完整 wtf4 的驱动（S9A 图二倍体 15）。我们还测试了p毒-WTF4解药-GFP抑制由仅表达Wtf4的等位基因引起的孢子不活力毒 (m樱桃-wtf4毒; S1 图等位基因 10）。我们发现p毒-WTF4解药-GFP仅提供最低限度的孢子死亡挽救，并且挽救仅限于遗传孢子的孢子p毒-WTF4解药-GFP (S9A图比较二倍体12和21）。

我们的结果让我们质疑为什么Wtf4毒表达自p毒启动子能够毒害所有孢子，但 Wtf4解药表达自p毒启动子无法拯救所有孢子。这样的救援是意料之中的，因为我们之前观察到 Wtf4毒有丝分裂细胞中异位诱导的Wtf4通过表达中和解药来自匹配的启动子[52]。为了解释这种差异，我们假设 Wtf4解药可能比 Wtf4 更有可能毒从孢子中排除，因为它们在无脊髓细胞质内个体化。这个假设是基于我们的Wtf4图像。解药具有C端标签的蛋白质倾向于在ascal细胞质中显示比所有新发育的孢子更多的信号。在无脊椎细胞质中也往往比不继承编码Wtf4位点的孢子中有更多的信号解药在成熟的腹水（图1E，S2C和S2D）。如果 Wtf4解药被排除在孢子之外，因为它们个体化超过Wtf4毒， wtf4解药除非在孢子中表达，否则不会期望很好地保护孢子。

为了正式检验我们的假设，我们测量了 Wtf4 的分数解药-GFP 和 mCherry-Wtf4毒在携带p毒-WTF4解药-GFP和/或m樱桃-wtf4毒等位基因（图4A-4D）。我们发现mCherry-Wtf4的很大一部分毒信号在孢子中，相对于总Wtf4的比例解药-孢子中发现的GFP信号（图4D，左图）。这表明 Wtf4解药蛋白质比Wtf更能从孢子中排除毒作为孢子个体化。此外，我们发现mCherry-Wtf4的一小部分毒信号是在携带p毒-WTF4解药-GFP等位基因，与不表达WTF4解药等位基因。这表明 Wtf4解药可以促进排除某些 Wtf4毒从孢子中个体化。

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图4. WTF4解药比 Wtf4 更能排除发育孢子毒.

(A） p 的图像毒-WTF4解药-GFP/ mCherry-wtf4毒二倍体和子囊。（B） mCherry-wtf4的图像毒/ ADE6+ 二倍体和阿斯库斯。（C） p的形象毒-WTF4解药-GFP/ ade6+二倍体和子囊。（D）由p毒-WTF4解药-GFP/ mCherry-wtf4毒（左，n = 142），mCherry-wtf4毒/ADE6 二倍体（中心，n = 123）和 p+毒-WTF4解药-GFP/ade6二倍体（右，n = 134）。p+毒-wtf4解药-GFP 荧光数据以洋红色表示，而 mCherry-Wtf4毒以青色表示。误差线表示 95% 置信区间。p毒-wtf4解药-GFP 以洋红色和樱桃-WTF4 显示毒在合并图像中以青色显示。TL = 透射光。所有比例尺代表 2 μm。所有图像均在孢子培养基上1天后采集。图像以相同的设置拍摄，并以相同的亮度和对比度显示，以便进行准确比较。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009847.g004

要测试是否p毒转录时间对驱动很重要，我们用Wtf4生成了等位基因毒-GFP 表示为p解药发起人 （p解药-WTF4毒-GFP; S1 图等位基因 11）。然而，我们未能将这种结构转化为不携带WTF4解药等位基因，尽管多次尝试并使用多种转化方案（标准乙酸锂和电穿孔;[65，66]）。我们也无法产生携带的菌株p解药-WTF4毒-GFP在没有WTF4解药通过突变或遗传杂交（S9A图二倍体24）。这些结果表明，p解药启动子可能会导致一些 Wtf4毒营养生长过程中的表达，杀死缺乏的细胞WTF4解药.与此一致，已发表的长读长测序数据显示一些转录跆拳道解药等位基因发生在减数分裂诱导之前的细胞中[59]。

我们分析了p解药-WTF4毒-GFP等位基因（在ADE6）支持杂合子细胞中的驱动WTF4解药-m樱桃（在URA4）。我们比较了p解药-WTF4毒-GFP对照的等位基因m樱桃-wtf4毒等位基因。我们发现p解药-WTF4毒-GFP等位基因支持的最小驱动WTF4解药-m樱桃等位基因，而对照m樱桃-wtf4毒等位基因支持强大的驱动力WTF4解药-m樱桃 (S9A图，二倍体23和24）。重要的是，大部分驱动器WTF4解药-m樱桃等位基因诱导p解药-WTF4毒-GFP源于毒等位基因杀死遗传它的孢子（100%驱动遗传的孢子p解药-WTF4毒-GFP），对不遗传的孢子的杀伤最小（58%驱动不遗传的孢子p解药-WTF4毒-GFP).在控制十字中，驱动WTF4解药-m樱桃等位基因在遗传和未遗传的孢子中分别为 100% 和 91%m樱桃-wtf4毒分别是等位基因（S9A图，二倍体23和24）。

我们的遗传结果表明，Wtf4毒表达自p解药启动子在杀死不继承编码Wtf4的等位基因的孢子方面存在缺陷毒.鉴于有丝分裂S的高灵敏度，这是令人惊讶的。庞贝细胞甚至低水平的Wtf4毒我们在以前的工作[52]和这项研究（例如，S9图二倍体24）中观察到。我们假设 Wtf4解药更擅长预防 Wtf4毒从进入孢子时蛋白质从 P 共表达解药启动器比Wtf4时毒由其内源性启动子表达。为了测试这种可能性，我们比较了Wtf4的量毒二倍体杂合子产生的孢子中的信号p解药-WTF4毒-GFP等位基因（在ADE6）和WTF4解药-m樱桃（在 ura4 处）与类似的对照二倍体，其中WTF4毒-GFP从其内源性启动子表达（图5A和5B）。与我们的假设一致，我们发现总 Wtf4 中的较少毒-当蛋白质从p解药启动子，与蛋白质从内源性表达时相比p毒发起人（59 与 71%）。我们还注意到，Wtf4毒-GFP（来自内源性启动子）在Wtf4存在下包括孢子解药蛋白质（71 vs 79%），进一步支持 Wtf4解药在排除 Wtf4 中起作用毒来自孢子（图5B-5D）。

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图5. WTF4毒当从 p 表示时，定位会改变解药促进。

(A） p 的图像解药-WTF4毒-GFP/ ade6+， wtf4解药-m樱桃/ura4+ 二倍体和四型子囊。p解药-wtf4毒-GFP 以青色和 Wtf4 显示解药-mCherry 在合并图像中以洋红色显示。其他图像（亲本双型和非亲本双型）可在S9B图中找到。（B） wtf4的图像毒-GFP/ ade6+二倍体和子囊。该菌株的图像首次出现在[37]中。（C） 杂合子 wtf4 的图像解药-mCherry/ura4+， wtf4毒-GFP/ade6+ 二倍体和子囊。WTF4解药-mCherry 以洋红色和 Wtf4 显示毒-GFP 在合并图像中以青色显示。图1E中也描绘了这个十字架的图像。（D） 总 ascal Wtf4 百分比的量化毒-GFP荧光位于由以下二倍体产生的腹水孢子外部：1. WTF4毒-GFP/ade6+， wtf4解药-mCh/ura4+， 2.WTF4毒-GFP/ade6+ 和 3。p解药-WTF4毒-GFP/ade6+， wtf4解药-mCh/ura4+ （* = p < 0.01， t 检验， n> 每个样本 20 asci）。TL = 透射光。所有比例尺代表 2 μm。所有图像均在孢子培养基上2天后采集。图像使用相同的设置拍摄。并非所有图像都以相同的亮度和对比度显示，以避免较亮图像中的像素过度饱和。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009847.g005

讨论

具有不同调节的双启动子是wtf减数分裂驱动的关键

在wtf4驱动器中，所有孢子都暴露于wtf4毒，而只有那些继承了 WTF4 等位基因的人通常接受足够剂量的 Wtf4解药为了生存。之前，我们观察到 Wtf4毒在孢子形成前的减数分裂细胞中，但观察到Wtf4解药仅富集于遗传WTF4的孢子[37]。这些观察结果解释了所有孢子是如何中毒的，以及只有那些继承了wtf4位点的孢子是如何被解毒剂拯救的，但它提出了一个新的难题，即减数分裂细胞如何在暴露于Wtf4中幸存下来。毒在明显没有 Wtf4 的情况下解药.这种不确定性被随后的工作放大，显示Wtf4毒有效杀死不表达解毒剂的细胞，而不仅仅是孢子[52]。在这项工作中，我们的新数据为这个难题提供了一个解决方案，因为我们发现还有Wtf4。解药在经历减数分裂的细胞中表达。该结果与先前的长读长RNA测序数据一致，该数据显示转录水平低跆拳道解药早期减数分裂中的等位基因[59]。

我们的工作还表明，毒物和解毒剂启动子的不同转录调控是Wtf4分布的主要原因。毒到所有孢子和Wtf4的富集解药在继承位点的孢子中，转录报告者粗略地概括了标记蛋白的定位模式（图2）。然而，蛋白质的不同特征也有助于它们的定位模式。具体来说，我们发现两种Wtf蛋白包含在发育孢子中的倾向是不同的。The Wtf4解药孢子包封时存在于细胞质中的孢子比Wtf4多毒同时存在（图4D）。此外，我们的结果表明，Wtf4解药蛋白质可以促进排除Wtf4毒来自孢子，因为它们个体化，作为Wtf4的较小部分毒在Wtf4存在下进入孢子解药（图 4D 和 5D）。Wtf4本地化的这一变化毒在 Wtf4 存在的情况下解药与我们之前的观察结果一致，即Wtf4蛋白共同组装并被贩运到液泡[52]。

我们的数据表明以下模型（图6）：Wtf4毒主要在孢子形成之前表达，然后包装在孢子中（例如，图1E）。这可能确保每个孢子从杂合合子受精卵中获得致命剂量。相反，WTF4解药在孢子形成之前就存在，也许是为了防止经历减数分裂的细胞屈服于毒物（例如，图1E）。孢子形成时存在的解毒剂可能对不遗传驱动位点的孢子几乎没有保护，因为它不能阻止所有 Wtf4毒从进入孢子（图5D）和Wtf4解药被排除在发育中的孢子之外（图4）。我们推测排除Wtf4解药孢子与液泡有关，液泡也被排除在孢子发育之外[52，67]。由于这些因素，继承wtf4的孢子必须产生自己的Wtf4私人供应。解药，而那些不屈服于毒药的人。

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图6. wtf4+/wtf4-杂合子中wtf4驱动的模型。

Wtf4蛋白在孢子形成之前就已经存在（上图）。随着孢子的形成（中），更多的Wtf4解药相对于 Wtf4 从孢子中排除毒.附加 WTF4解药在WTF4+孢子（底部）中产生，将其从Wtf4中解救出来毒.wtf4-孢子被Wtf4破坏毒.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009847.g006

WTF驱动器普遍抑制的困难

这项工作也增加了我们对裂殖酵母物种中wtf驱动因素进化成功的理解[64]。在S.Pombe，所有测序的分离株都含有25-38个WTF基因，包括4-14个被预测或显示为完整减数分裂驱动因子的基因[35-38]。每个杂合子驱动因素可导致一半孢子的破坏，解毒剂蛋白通常不能防止具有不同序列的毒物[35，38]。由于这些特征，通过杂交两个分化分离株产生的二倍体受精卵产生的活孢子很少[35，38，43–45，68，69]。因此，发展抑制机制来抑制wtf驱动程序的动机似乎相当高[70]。

可能有很多道路可以抑制 wtf 驱动程序。然而，我们推测，鉴于wtf基因家族已经引起减数分裂驱动超过1亿年，它们都没有非常成功[64]。已知的wtf驱动程序的基因抑制因子都是wtf解药蛋白质。重要的是，WTF解药蛋白质似乎具有高度特异性，因为它们仅中和Wtf毒具有非常相似序列的蛋白质[35，38，39，52]。正因为如此，Wtf解药预计蛋白质不会作为WTF驱动因子的一般抑制因子，因为基因组需要每个驱动程序的唯一抑制因子。与 Wtf 接口的非 Wtf 通用抑制器毒鉴于Wtf蛋白的多样性，蛋白质也可能难以想象，Wtf蛋白在一个物种内可以共享低至30%的氨基酸同一性[35，36]。

鉴于wtf驱动因子的保守性，转录抑制似乎是普遍抑制wtf驱动因子的更可行的途径（[36，38，60];图 2A 和 2D）。以前的工作已经确定了有助于调节wtf基因表达的一些因素，但是，这些研究没有区分跆拳道毒和跆拳道解药成绩单[46，48]。在有丝分裂细胞中，组蛋白去乙酰化酶clr6突变或药物曲古抑素A抑制组蛋白去乙酰化导致wtf基因转录增加[46-48，71]。同样在有丝分裂细胞中，wtf mRNA可以通过双链定向RNA衰变从细胞中消除[72]。这些有丝分裂机制也可能影响减数分裂过程中wtf基因的表达，但这尚未确定。在减数分裂细胞中，Cuf2降低了减数分裂晚期wtf基因的表达[51，73]。然而，这种转录抑制似乎对驱动的影响很小。例如，Cuf2降低了wtf13的表达，但即使在这种抑制状态下，wtf13也会驱动wtf13+/wtf13Δ杂合子产生的配子>90%[39]。

需要注意的是，并非所有wtf基因的表达方式都相同，并且跆拳道毒转录本与 S 中的驱动强度相关。八孢菌属[37，38，59，64]。这种差异表达可能反映了低效的转录抑制系统，但尚未得到研究。尽管如此，由于几个原因，对所有wtf驱动程序进行有效的转录抑制可能具有挑战性。第一个挑战是大量的wtf基因，以及它们并非都在同一位点发现的事实。这可能使得很难通过将一个基因组区域包装在异染色质中来简单地将它们全部关闭。即使这些基因在一个位置被发现，容纳wtf基因的基因组区域也可能受到强烈的选择，以抵抗这种异色化。具体来说，可以避免异色化从而更好地保持驱动器的单倍型将由驱动器选择。这是因为与减数分裂驱动相关的区域也可以享受驱动的好处，从而从增强驱动中获利，而不是抑制驱动[70]。这种抗异色化的选择性压力也适用于分布式wtf驱动器。这种情况与容纳转座元件的位点截然不同，因为这些自私的元素通常对侧翼序列没有进化优势[2]。

建立wtf驱动物抑制的另一个挑战是，部分或不完全抑制wtf基因可能弊大于利。例如，如果给定驱动因素的二倍体纯合子中的沉默不完整，则只能表达一个等位基因，并且驱动将发生在在没有沉默的情况下不会发生驱动力的细胞中。此外，在某些情况下，wtf驱动物被其他wtf基因抑制[35，39]。这是一种额外的情况，其中不完全沉默错误的wtf基因可能导致更多而不是更少的驱动。

一种理想的抑制方法是抑制驱动表达的关键转录因子p毒发起人。这种方法将允许电池停止驱动，但它也具有最小的风险，因为部分抑制仍然通过降低驱动的可能性来选择性地有利。在这种情况下，一个不完美的系统可以随着时间的推移而适应和改进。在这项工作中，我们确定Mei4是控制表达的关键转录因子p毒 (图3）。然而，抑制Mei4并不是抑制驱动的理想选择，因为它是减数分裂的重要调节因子。Mei4控制着100多个基因的表达，缺乏Mei4的细胞无法完成减数分裂[50，51，62，63，74-77]。

最终猜测

很难不钦佩wtf寄生虫在付出代价的情况下如何很好地适应自己。同样值得注意的是，绝缘的wtf寄生虫似乎对它们的宿主基因组有多么好的作用来阻止它们的表达。然而，这并不是说裂殖酵母菌没有找到其他方法来降低wtf驱动因素的成本。一些S。庞贝天然分离株优先近亲繁殖，一些分离株以高频率产生二组（非整倍体或二倍体）孢子（高达46%的孢子;[41，78]）。虽然很难说wtf基因是否促进了这些性状的进化，但这是可能的，因为这两种性状都有效地抑制了wtf驱动因素的适应成本[41，78]。如果这些性状是根据它们抑制驱动的能力来选择的，那么抑制可能会给适应性带来高昂的代价，因为近亲繁殖和减数分裂破坏通常不利于健身。也许这是必须付出的代价，因为更便宜的选择，如通用转录沉默，是遥不可及的。

材料和方法

酵母菌株的产生

所有酵母菌株、质粒和寡核苷酸均在 S1–S3 表中描述。我们通过Sanger测序确认了本节中产生的质粒。我们使用标准醋酸锂方案[65]完成了本节中描述的所有转化，首先选择耐药性，然后筛选相关的营养不足。

产生具有内源性启动子和mCherry-wtf4的wtf4等位基因毒.

我们从Integrated DNA技术（IDT，Coralville IA）订购了一个gBlock，其中包含p解药启动子 （-600 bp）、外显子 1、内含子 1 和编码 mCherry 标签和上游 5X 甘氨酸接头的序列WTF4毒启动密码子[79]。gBlock还包括177 bp的外显子2。我们使用寡核苷酸620和718扩增该gBlock。我们还使用寡核苷酸679和687扩增了pSZB189的wtf4序列的其余部分[37]。然后，我们使用重叠PCR使用寡核苷酸620和687将PCR片段缝合在一起。接下来，我们用SacI消化所得PCR产物，并将其连接到pSZB188的SacI位点[37]，pSZB188是与kanMX4盒的ade6整合载体，以创建pSZB250。我们用KpnI切割pSZB250，并将线性化的向量转换为SZY643以生成SZY1037。

生成仅编码 mCherry-wtf4 的 wtf4 等位基因毒在内源性启动子的控制下。

该等位基因具有全长 wtf4 基因（包括p解药启动子），但两个起始密码子在外显子 1 中（对于 Wtf4解药） 突变为 TAG。我们首先克隆了pSZB259，其中包含一个未标记的wtf4等位基因，其中两个起始密码子都发生了突变，类似于pSZB257[37]。我们放大了p解药启动子和来自pSZB259的外显子1的突变版本使用寡核苷酸620和861。我们放大了m樱桃-wtf4毒使用寡核苷酸862和687从pSZB250（如上所述）序列。然后，我们使用重叠PCR使用寡核苷酸620和687将两种PCR产物缝合在一起。我们用SacI消化所得PCR产物，并将盒连接到pSZB188的SacI位点[37]中以制造pSZB355。我们还用SacI消化了pSZB355以分离wtf4等位基因，并将其克隆到SacI消化的pSZB386中，这是一种耐湿霉素B的ade6整合载体[37]以产生pSZB824。我们用KpnI消化pSZB824以线性化构造，并转化为SZY2572以生成SZY4570。

生成仅编码 wtf4 的 wtf4 等位基因解药-GFP在内源性启动子的控制下。

我们使用pSZB203作为模板，用寡核苷酸620和736扩增wtf4-GFP的5'端，用寡核苷酸735和634扩增基因的其余部分[37]。然后使用寡核苷酸620和634使用重叠PCR将两种PCR产物缝合在一起。735和736寡核苷酸突变了起始密码子WTF4毒到塔克。然后将所得PCR产物与SacI一起消化并连接到pSZB188的SacI位点以生成pSZB260。我们用KpnI切割pSZB260并将其集成到SZY643的ade6位点中以创建SZY1056。

生成仅编码 mCherry-wtf4 的 wtf4 等位基因解药在内源性启动子的控制下。

我们使用定点诱变将翻译起始位点从ATG突变到TACWTF4毒在 pSZB248 [37] 内生成 pSZB367。我们用KpnI线性化了pSZB367，并将其集成到SZY643中，制成SZY3586。

产生wtf4等位基因，第一个解毒剂起始位点突变以产生wtf4短等位基因。

该等位基因具有全长wtf4基因，第一个解毒剂起始位点（ATG）突变为TAG。使用pSZB189作为模板，我们使用寡核苷酸620和702用突变的起始位点扩增wtf4的5'末端。然后，我们使用寡核苷酸701和686以pSZB189为模板扩增wtf4基因的其余部分。然后使用寡核苷酸620和686使用重叠PCR将两种PCR产物缝合在一起，并连接到pSZB188的SacI位点以产生pSZB244。我们用KpnI切割pSZB244并将其整合到SZY643的ade6位点中以创建SZY1026。

生成 p解药-m樱桃转录记者。

我们首先放大了WTF4解药使用pSZB248 [37]作为模板与寡核苷酸688和1447链接到mCherry的启动子。接下来，我们使用寡核苷酸1448和634扩增pKT127[80]的ADH1转录终止子。然后，我们使用重叠PCR将这些片段合并并生成p解药-m樱桃.然后我们消化了完整的p解药-m樱桃用SacI盒并将其连接到pSZB386的SacI位点[39]以创建pSZB766。我们用KpnI切割pSZB766并将其集成到SZY2080的ade6位点中以创建SZY2137。我们还消化了pSZB766形式的盒式磁带，并将其克隆到SacI消化的pSZB331 [35]中以创建pSZB744。我们用KpnI切割pSZB744，并将其整合到SZY2080的ura4位点中，以创建SZY4534。

生成 p解药长-m樱桃转录记者。

我们放大了大部分p解药长-m樱桃使用寡核苷酸3024和634以及pSZB891 [52]作为模板构建（使用ADH1转录终止子）。然后，我们将上游的其余部分添加到p解药长-m樱桃将其用作寡核苷酸3025和634的PCR模板进行构建。这生成了完整的p解药长-m樱桃构建。我们用SacI消化了这个盒，并将其连接到pSZB322的SacI位点[39]中，以产生pSZB1361。我们用KpnI切割pSZB1361并整合到SZY2080的lys4位点[52]中以生成SZY4442。

在ade6位点产生wtf4：：hphMX6的菌株。

我们用NotI消化pAG32（Goldstein和McCuster，1999）以分离hphMX6盒。我们将hphMX6盒式磁带转换为SZY887 [37]，选择海斯特-耶鲁电阻和缺乏G418电阻。这创造了SZY969。

生成 p毒-GFP转录报告。

我们使用pSZB203作为模板来放大p毒使用寡核苷酸1174和1549启动子，并使用寡核苷酸1548和634扩增GFP（使用ADH1转录终止子）[37]。我们使用重叠PCR使用寡核苷酸1174和634连接这两个片段。然后我们消化了完整的p毒-GFP用SacI构建并将其克隆到SacI消化的pSZB386中以生成pSZB821。我们用KpnI对pSZB821进行了线性化，并将其集成到SZY643中，制成SZY2279。

wtf4等位基因的产生解药-GFP，其中 p解药启动子替换为 p毒促进。

我们使用寡核苷酸1174和604扩增pSZB553（见上文）的毒物促进子和外显子1。我们使用寡核苷酸605和997扩增pSZB700 [52]的wtf4编码序列的其余部分。我们使用寡核苷酸998和634扩增来自pSZB203 [37]的GFP（带有ADH1转录终止子）。我们使用重叠PCR使用寡核苷酸1174和634连接三个片段。p毒-WTF4解药-GFP用SacI构建并将其克隆到SacI消化的pSZB386中以生成pSZB727。我们用KpnI消化pSZB727以线性化构造，并转化为SZY44以生成SZY2406。

p 的生成解药-WTF4毒-GFP等位基因。

我们放大了p解药从pSZB203使用寡核苷酸688和1383[37]。我们放大了WTF4毒使用寡核苷酸 1384 和 997 从 pSZB392 [52] 编码序列。我们使用寡核苷酸998和634扩增来自pSZB203 [37]的GFP（带有ADH1转录终止子）。我们使用重叠PCR使用寡核苷酸688和634连接三个片段。我们消化了完整的p解药-WTF4毒-GFP用SacI构建并将其克隆到SacI酶解的pSZB386中以生成pSZB758。我们用KpnI消化pSZB758以线性化构造，并转化为SZY2572以生成SZY4525。这p解药-WTF4毒-GFP等位基因缺少外显子 1，因此不编码 Wtf4解药.

生成 wtf4FLEXΔ-GFP等位基因。

我们使用定点诱变来删除pSZB203中wtf4-GFP等位基因内含子1内的FLEX基序（TTTGTTTAC，[62，63]）[37]。这产生了pSZB848。我们用KpnI消化pSZB848以线性化构造，并转化为SZY643以生成SZY1479。

产生 ade6+：：his5Δ 等位基因。

这是以与[37]相同的方式完成的。简而言之，我们使用寡核苷酸795和796从基因组DNA扩增his5上游区域，使用寡核苷酸797和798扩增his5下游区域，使用寡核苷酸799和800扩增ade6+。我们使用重叠PCR和寡核苷酸795和798将这些片段缝合在一起。然后，我们将磁带转换为SZY631 [39]，选择ade6+，然后筛选his5-。这生成了这项工作中使用的SZY1285。

生成 ura4+， wtf4毒-GFP菌株。

我们使用寡核苷酸34和37以及SZY44 [37]作为模板扩增ura4+盒。然后我们将其转换为SZY1049 [37]，选择ura4+，以生成SZY5047。

生成 pat-1as（L95G），wtf4毒-GFP菌株。

我们将SZY44与J1687[63]杂交，并选择对潮霉素和G418耐药但对新苏霉素敏感的后代，以获得SZY5581。然后，我们将KpnI消化的pSZB257 [37]转化为SZY5581，从而产生了SZY5638，一种拍1.L95G 和 wtf4毒-GFP等位基因。

生成 pat1。L95G， wtf4解药-m樱桃菌株。

我们将KpnI消化的pSZB891 [37]转化为SZY5581，得到SZY5685，一种拍1.L95G 和 wtf4解药-m樱桃等位基因。

使用 pat1 生成二倍体。L95G， wtf4解药-mCherry， wtf4毒-GFP.

如前所述[81]，我们通过SZY5685和SZY5638的原生质体融合产生了h-/h-二倍体（SZY5742和SZY5743），但有以下变化：我们培养了每种菌株的50 mL YEL培养物至对数中期（~5x106细胞/毫升）在10mL 0.65M KCl中洗涤之前。然后，我们将细胞沉淀在含有0.1 g / mL Lallzyme MMX（Scott Labs）的0.65M KCl中孵育14分钟来制备原生质体。然后，我们将原生质体接种到YNP-腺嘌呤，-组氨酸，亮氨酸，-尿嘧啶中，并在32°C下孵育3天。然后，我们对菌落进行复制接种并对细胞进行成像以确认基因型和倍性。

等位基因传递和活孢子产量

所有等位基因传递和VSY测定均如前所述完成[37，53]。简而言之，我们通过在微量离心管中混合每个单倍体母体并将它们接种在SPA（1%葡萄糖，7.3mM KH）上来生成稳定的二倍体2采购订单4，维生素，琼脂）在室温下~15小时，以使细胞交配。我们从SPA上刮下交配的细胞并铺展在培养基上以选择杂合二倍体（最小酵母氮底板）。我们在 5 mL 丰富的 YEL 肉汤（0.5% 酵母提取物、3% 葡萄糖、250 mg/L 腺嘌呤、赖氨酸、组氨酸和尿嘧啶）中培养二倍体菌落过夜。然后，我们将~100mL接种到SPA上以诱导孢子形成，并将稀释的样品接种到YEA上（与YEL相同，但使用琼脂）。我们通过复制到诊断培养基确认在YEA平板上生长的菌落是真正的杂合二倍体细胞，并计数VSY的菌落。3天后，我们从SPA平板上刮下细胞，用葡萄糖磺酶（Sigma（G7017-10ML）和乙醇处理以分离孢子，并在YEA上接种孢子稀释液[53]。然后，我们使用标准方法对孢子菌落进行计数和表型分析。每次交叉至少测定2个二倍体，并对至少150个孢子进行基因分型以进行等位基因传递测定。原始数据可以在 S1 数据文件中找到。

启动子的对齐

对于解毒剂启动子的比对（图2A），我们对齐了来自三种不同S菌株的41个预测的仅解毒剂等位基因[36]上游的800个碱基对。庞贝（参考基因组，S.坎普茶和FY29033，洛克等人，2018 年）。对于毒物促进剂的比对（图2D），我们对齐了来自三种不同S菌株的28种预测毒物解毒剂wtf驱动程序的内含子1序列（两侧是100bp上游和下游内含子1的序列100bp）[36]。庞贝（参考基因组，S.坎普茶和FY29033）。我们使用Geneious（版本11.0.14.1，https://www.geneious.com）使用具有“无自由端间隙的全局对齐”设置的Geneious对准器，在每个核苷酸位置取百分比同一性。

使用蛋白质印迹进行蛋白质分析

为了分离用于pat1+蛋白质印迹（S4和S5无花果）的蛋白质，我们将二倍体在32°C的10ml YEL中生长~20小时至饱和。 然后，我们将细胞在 100 mL PM 培养基中以 1：200 稀释，并再次在 32°C 下生长过夜（20-24 小时）。然后，我们在PM-N中洗涤细胞一次，然后稀释至外径600的1.0（~1x107细胞/毫升）在500ml PM-N中在25°C下孵育。 如[82]所述，我们在图例中指示的时间点从100 mL等分试样中制备全细胞提取物，并添加以下溶液。为了阻止蛋白质降解，我们在旋转细胞之前向每个时间点添加1 mM PMSF。我们使用的细胞裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 7.5、150 mM NaCl、1 mM EDTA、0.5% NP-40、10% 甘油）补充了 1 mM PMSF 和 1 片完整的迷你、不含 EDTA 的蛋白酶抑制剂鸡尾酒片/5 mL。我们使用迷你珠打浆机（Biospec产品）破坏细胞，并对细胞进行成像以确保孢子被破坏。

为了制备表达组成型GFP或mCherry的阳性对照，我们将菌株SZY2636（GFP）和SZY2638（mCherry）[78]在YEL中饱和，然后沉淀1mL体积，在ddH中洗涤细胞20，重悬于 1 mL ddH 中20并将200μl接种到三个SPA + S板中的每一个上。然后，我们将板在 25°C 下孵育三天，然后将细胞刮入 1 mL 冰冷的 PBS 中，并如上所述制备全细胞提取物。我们使用蔡司Observer.Z1宽视场显微镜和63x 1.4 Oil DICII物镜对细胞进行成像以确保孢子形成，并使用μManager软件将发射物收集到滨松ORCA Flash 4.0上。我们使用BP 440-470 nm激发GFP，并使用FT 495二向色性收集BP 525-550发射，并使用FT 600二向色滤光片收集BP 530-585 nm激发和LP 615发射的mCherry。

为了运行蛋白质免疫印迹，我们在LDS样品缓冲液（Life Technologies）中以1：1稀释样品，并在上样前在75°C下加热10分钟。然后，我们将蛋白质在NuPAGE 4–12%Bis-Tris蛋白质凝胶（Life Technologies）的1 x MOPS缓冲液（Life Technologies）中以200V电泳50分钟，然后使用Trans-Blot Turbo系统转移到PVDF膜（Bio-RAD #1704156）上。我们用兔单克隆α-GFP抗体（细胞信号技术#2956）以1：1000和/或小鼠单克隆α-mCherry抗体（Millipore，MAB131873）在1：1000下探测膜，在4°C下搅拌过夜，在Odyssey封闭缓冲液（TBS，来自LI-COR生物科学）。二级，α兔抗体（800cW）和/或α小鼠抗体（680cW）用于蛋白质的荧光可视化。我们对Odyssey-CLx（LI-COR生物科学）上的印迹进行了成像。为了显示蛋白质上样量，我们要么用Piceau S（细胞信号技术#59803）染色膜，要么用相同体积的样品运行第二块凝胶并用Imperial蛋白染色剂染色（Thermo Scientific #24615）。

同步 pat1。L95G 培养物

为了产生同步减数分裂培养物（S6图），我们生长了h-/h-pat1。L95G/拍1.L95G 模拟敏感二倍体菌株（SZY5742 和 SZY5743）在 30°C 下在 10 mL YEL 培养基中放置 20 小时。然后，我们将细胞在补充有75μg/ml赖氨酸的50 mL EMM中以1：250稀释，并在30°C下培养20-24小时。 然后，我们在EMM-N中洗涤细胞两次，并在补充有10μg/ ml赖氨酸的EMM-N中稀释至外径600的1.0。在 30°C 下 12 小时后，我们向每种培养物中加入 50 μg/ml 赖氨酸、500 μg/ml NH4Cl 和 25 μM 3MB-PP1（开曼化学品），然后在图中描述的时间点对细胞进行 DAPI 染色、成像和蛋白质免疫印迹采样。

DAPI 染色

我们在指定的时间点沉淀1ml体积的每种培养物，并将细胞重悬于1ml 70%乙醇中。然后，我们将细胞在室温下孵育一小时，然后在1ml PBS中洗涤一次。然后，我们立即使用蔡司Observer.Z1宽视场显微镜和63x 1.4油DICII物镜可视化细胞，并使用μManager软件将发射物收集到滨松ORCA Flash 4.0上。我们在 365 nm 处激发 DAPI，并通过 445/50 nm 带通滤光片收集荧光。

荧光显微镜

所有图像量化的原始数据显示在 S2 数据中。我们如前所述生成二倍体[37]，并将它们放置在孢子琼脂（SPA，1%葡萄糖，7.3mM KH2采购订单4，维生素，琼脂）1-3天。然后，我们将细胞从平板上刮到载玻片上进行成像。对于 pat1。S6 图中显示的 L95G 时程实验，我们将细胞在室温下固定在 4% 多聚甲醛中一小时，在 1 mL PBS 中洗涤 3 次，并在成像前将细胞储存在 4°C。对于所有显微镜，除下面列出的实验外，我们使用LSM-780（蔡司）显微镜，带有40x C复消色差水浸物镜（NA 1.2），光子计数通道模式，激发波长为488和561 nm。我们通过481-552带通滤光片收集GFP荧光，通过572长通滤光片收集mCherry。我们还使用光子计数λ模式，488和561 nm激发，收集整个可见光范围内的荧光发射。然后，我们使用这些图像使用内部自定义的ImageJ（https://imagej.nih.gov/ij/）插件线性解混合荧光光谱，以验证细胞中没有自动荧光。所有图像的亮度和对比度并不相同。我们使用了两个独立的祖二倍体，并为所代表的每个基因型测定了至少25个asci。如果所有四个孢子都通过透射光显示出明显的深色轮廓，则我们称腹水为“成熟”，这表明孢子膜已经形成。对于将孢子内部的荧光强度与孢子外部的荧光强度进行比较的图像，在获取数据时非常小心，以便仅使用所有孢子都清晰聚焦的asci进行比较。

对于WTF4解药-mCherryh/ura4+ (S2C 图）我们使用蔡司Observer.Z1宽视场显微镜和40倍C复消色差（1.2 NA）水浸物镜进行成像，并使用μManager软件将发射物收集到滨松ORCA Flash 4.0上。我们使用 BP 440–470 nm 激发 GFP，并使用 FT 495 二向色性收集 BP 525–550 发射，使用 FT 600 二向色滤光片收集 BP 530–585 nm 激发和 LP 615 发射的 mCherry，并使用 FT 600 二向色滤光片收集 BP 530–585 nm 激发和 LP 615 发射的 mCherry。所有图像的亮度和对比度并不相同。

对于配子发生延时成像（图1C-1F），我们将携带mCherry-wtf4（SZY1142）的单倍体Sp菌株与携带mCherry-wtf4（SZY1142）的单倍体Sp菌株杂交WTF4毒-GFP（SZY5047）生成杂合二倍体，如先前报道[37]。我们还越过了携带单倍体Sp菌株的WTF4解药-m樱桃（SZY2572） 与WTF4毒-GFP（SZY5047）使用与上述相同的方法生成杂合二倍体。我们将这些二倍体在 5 mL 丰富的 YEL 肉汤（0.5% 酵母提取物、3% 葡萄糖、250 mg/L 腺嘌呤、赖氨酸、组氨酸、亮氨酸和尿嘧啶）中在 32°C 下过夜。 然后，我们将 100 μL 这些二倍体培养物稀释到 5 mL PM 培养基中（20 mL 50x EMM 盐，20 ml 0.4 M Na2高原油4， 25 mL 20% NH4Cl， 1 mL 1000x 维生素， 100 μL 10，000x 矿物质储备液， 3 g 邻苯二甲酸氢钾， 950 mL ddH2O，高压灭菌后25mL无菌40%葡萄糖，补充250mg / L尿嘧啶），并在32°C下再次生长过夜。 第二天，我们旋转成颗粒并将颗粒重悬在PM-N培养基中（PM不含NH4Cl）.我们在28°C下摇动PM-N培养物4小时。 在用PBS洗涤和冲洗微流体板后，我们用PM-N介质加载板。二倍体被捕获在EMD密理博CellASIC（单倍体出芽酵母）微流体板中。PM-N介质在电影期间流过板。通过CellASIC歧管将温度保持在25°C.GFP和mCherry荧光分别用具有475 nm和555 nm二向色性的Spectra III照明器激发。然后用515/30 nm发射滤光片（用于GFP）和595/31 nm发射滤光片（用于mCherry）收集荧光发射。荧光由Prime 95B sCMOS相机（光度学）记录。每10分钟记录一次来自多个位置的图像，持续24小时。每个实验对每个二倍体进行两次生物学重复，并在并行分析的4个XY位置成像。我们用两个二倍体重复实验两次。对于mCherry-wtf4，分析的二倍体细胞总数为n = 25/WTF4毒-GFP二倍体和 n = 13 对于WTF4解药-McHerry/WTF4毒-GFP二倍体。

这些数据的分析是在斐济（https://imagej.net/software/fiji/）使用内部编写的几个不同的插件进行的（https://research.stowers.org/imagejplugins/）。第一级漂移用“stackregj”消除。然后用 1 像素高斯模糊对数据进行平滑处理。接下来，用一个 50 像素的滚动球减去背景。在此之后，在每个感兴趣的单元格周围手动绘制ROI。使用“创建频谱jru v1”绘制随时间推移的平均强度。分别记录每个细胞的GFP和mCherry的时间轨迹。接下来，通过标记孢子开始出现的第一帧（仅来自透射光）并使用“设置多图偏移 jru v1”将该帧设置为时间零，手动对齐每个时间轨迹。然后，将特定菌株以及GFP和mCherry的所有时间轨迹仅合并为一个具有“组合轨迹jru v1”的图。然后使用“归一化轨迹jru v1”将这些图归一化为最小值和最大值。然后使用XY图预设将迹线导入棱镜9（https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/），并绘制平均值和95%置信区间与时间的关系图。使用延时摄影的帧速率重新计算图的时间尺度。

对于光漂白实验后的荧光恢复，在与CSU-W1旋转盘（横河电机）耦合的Ti2-E（尼康）显微镜上对细胞进行成像。GFP和mCherry分别通过60x（孢子FRAP NA 1.4）或100x（全腹水FRAP NA 1.45）Plan复消色差物镜在488 nm和561 nm处激光激发。GFP的荧光发射通过525/36 nm滤光片收集，mCherry的发射通过605/25 nm滤光片收集。这两个信号都是在Prime 95B相机（光度学）上收集的。

对于孢子和整个腹水FRAP实验，在每个通道中记录了初始荧光帧。然后，使用来自450nm，550nm和640nm激光线的100%功率，将许多孢子或asci漂白到相同的大视场中背景。漂白完成后，每 10 分钟记录一次恢复，总时间 ~6 小时（整个 FRAP），或每 5 分钟记录一次，总时间 4 小时（孢子 FRAP）。为了生成回收曲线，使用斐济，分别量化每帧含有GFP信号的所有孢子和含有mCherry信号的所有孢子内的平均荧光强度。获得曲线后，将相同荧光团的所有曲线归一化为最小和最大强度值，并取平均值以产生最终曲线。

为了量化孢子内部和外部的荧光强度，使用40x LD C复消色差物镜（NA 1.1）在LSM 780（蔡司）上以光子计数模式对asci进行成像。GFP和mCherry分别在488nm和561nm处被激发。GFP荧光通过482–553 nm带通滤光片收集，mCherry荧光通过572–735 nm带通滤光片收集。用透射光收集单个z切片。然后对于每个子囊，在整个子囊周围绘制ROI，并分别围绕4个孢子中的每一个（在没有荧光输入的情况下在透射光上绘制）。这是手动或通过单元格（https://www.cellpose.org/）进行的，手动编辑自动生成的ROI。然后测量每个通道中腹水的总强度。然后还测量了每个通道中每个孢子的总强度。对于每个通道，将4个孢子的强度相加并除以总强度以产生分数孢子强度。这是为每个通道单独完成的。将许多分数孢子强度的结果绘制在一起。

分析已发布的Mei4 Chip-Seq数据

来自[50]的FASTQ数据是从欧洲核苷酸档案馆（ENA）检索的，入藏号为：ERP001894。使用Trimmomatic [83]对数据进行了质量修剪，并与S对齐。庞贝基因组版本ASM294v2与领结2 [84]使用默认参数。使用调用峰值 -gsize 为 1.38 的 MACS2 调用峰值E7和 -q 0.05。通过平均单个基因（预测的wtf减数分裂驱动基因（wtf4，wtf13，顶部）或预测仅编码解毒剂蛋白的wtf基因（wtf5，wtf9，wtf10，wtf16，wtf18，wtf20，wtf21，wtf25）的RPM（每百万读数）信号来构建宏基因图。 ，底部））在 400 个箱中，然后平均多个基因以创建单个轮廓，然后以 0.05 的跨度进行黄土平滑。对于映射到多个位置的任何读取，仅报告随机选择的单个位置。

支持信息

本研究中使用的等位基因的表示。

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S1 图 本研究中使用的等位基因的表示。

每个等位基因都表示为一个卡通，通过文本引用等位基因编号。描述描述了启动子（橙色表示p解药黄色表示 p毒），蛋白质的翻译起始位点（黑色箭头），荧光标签（mCherry或GFP），翻译起始位点突变（红星）和产生的每种蛋白质。WTF4解药表示为“A”和 Wtf4毒表示为“P”。我们还描绘了在p 中找到的 FLEX 主题（黑匣子）毒.这些描述也出现在使用这些等位基因的图中。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009847.s001

（提夫）

S2 图 C端标签揭示了Wtf4的表达解药在孢子形成之前。

(A）具有所描述基因型的15个二倍体的等位基因传递和生育能力（通过活孢子产量测定）。基因型列显示相关基因型的卡通描述。然后，后代表型显示在右侧。对于在一个位点（例如，二倍体 1）杂合的二倍体，显示了代表两种可能的单倍体基因型的两个值（顶部和底部）。这些描述不与染色体上位点的位置成比例。表现出两种亲本表型的孢子被认为是二倍体或非整倍体，并且被排除在本表之外，但可以在S1数据中找到。预期值假定孟德尔等位基因传递。我们使用活孢子产量测定（VSY）来量化生育力，其值归一化为相关的空载体对照（* = p < 0.05，NS =不显着;等位基因传递的G检验，VSY的Wilcoxon检验，与空载体对照相比）。我们比较了二倍体3，4，5，6，8，10，12，13控制二倍体1和二倍体7，9，11，14，15控制二倍体2。二倍体 1、2 和 12-15 的数据也显示在 S10A 图中，二倍体 1 和 5 的数据也显示在图 3C 中。二倍体3、4和14的数据先前发表于[37]。（B） 杂合子 mCherry-wtf4 的图像解药/ade6+ 二倍体细胞和成熟子囊。m樱桃-WTF4解药在合并图像中以洋红色显示。（C） 杂合子 wtf4 的图像解药-m樱桃/ura4+二倍体细胞和成熟的子囊。WTF4解药-樱桃以洋红色显示。（D） 杂合子 wtf4 的图像解药-GFP/ade6+二倍体细胞和成熟子囊。WTF4解药-GFP 以洋红色显示。所有图像均在孢子培养基上3天后拍摄。TL = 透射光。所有比例尺代表 2 μm。图像是使用相同的设置拍摄的。并非所有图像都以相同的亮度和对比度显示，以避免较亮图像中的像素过度饱和。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009847.s002

（提夫）

S3 图 WTF4毒在孢子个体化之前产生。

(A） 来自 Fluorescence Recovery 的代表性图像 一个fter Photobleaching （FRAP） 实验，由 mCherry-wtf4/ wtf4 生成的成熟腹水 （n = 10）毒-GFP二倍体。（B）将白化至0%强度后，将樱桃（品红色线）和GFP（青色线）的FRAP在6小时内量化。（C） 来自 FRAP 实验的代表性图像，其中 wtf4 产生的成熟腹水 （n = 40） 中的孢子解药-mCherry/wtf4毒-GFP二倍体。（D）漂白后GFP（青线）的FRAP至0%强度，并在3小时内量化恢复。并非所有图像都以相同的亮度和对比度显示，以避免较亮图像中的像素过度饱和。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009847.s003

（提夫）

S4 图 WTF4毒和 Wtf4解药S中的蛋白质表达时间过程。庞贝减数分裂。

(A） wtf4 的时间进程解药-mCherry/wtf4毒-GFP二倍体显示mCherry-Wtf4的定位解药（合并图像中的洋红色）和 Wtf4毒-GFP（合并图像中的青色）在 PM-N 介质中指定时间之后。所有比例尺代表 10 μm。这些是为西方人采样的细胞群的图像。（B） 来自表达wtf4的细胞的全细胞提取物的蛋白质印迹毒-GFP 在指定的时间。*表示非特定波段。凝胶上显示了两个生物学重复。（C） 来自表达wtf4的细胞的全细胞提取物的蛋白质印迹解药-mCherry 在指定的时间。（D）用Imperial蛋白染色剂染色重复凝胶以显示上样蛋白质的数量。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009847.s004

（提夫）

S5 图 WTF4解药-mCherry 和 mCherry- Wtf4解药S中的蛋白质表达时间过程。庞贝减数分裂。

(A） mCherry-wtf4的时间过程解药/EV 和 wtf4解药-m樱桃/显示Wtf4定位的EV二倍体解药（合并图像中的洋红色）在 PM-N 介质中指定的时间之后。所有比例尺代表 10 μm。这些是为西方人采样的细胞群的图像。（B） 来自表达mCherry-wtf4的细胞的全细胞提取物的蛋白质印迹解药或 WTF4解药-mCherry 在指定的时间。从表达组成型mCherry的有丝分裂生长细胞中分离mCh对照。（C）用Imperial蛋白染色剂染色重复凝胶以显示上样蛋白质的数量。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009847.s005

（提夫）

S6 图 WTF4毒和 Wtf4解药同步S中的蛋白质表达时间过程。庞贝减数分裂。

（A）显示h-/h-pat1减数分裂进展的时间过程。L95G/拍1.L95G二倍体细胞，对两个wtf4都是杂合的毒-GFP 和 wtf4解药-mCherry [57] 添加 3-MB-PP1 （25 μM） 诱导减数分裂后 0-24 小时（顶部）。在指定的时间点计数DAPI染色细胞中的细胞核数量。（B）来自A中描述的相同实验的细胞的全细胞提取物的抗GFP蛋白质印迹。 与Wtf4一致的条带毒-GFP 和免费 GFP 用箭头突出显示。*表示非特定波段。GFP和mCerry对照由组成型表达游离荧光团的孢子细胞制备（SZY2636和SZY2638;参见方法）。DMSO对照由与实验样品具有相同基因型的二倍体制备，但用DMSO处理24小时，而不是3-MB-PP1。（C）与B所示相同的膜上的抗mCherry蛋白质印迹。与 Wtf4 一致的波段解药-mCherry 和免费 mCherry 用箭头突出显示。（D）B-C中膜的丽春红染色。（E）在B-C印迹中使用的相同蛋白质样品在新的抗mCherry蛋白质免疫印迹上重新运行，其中通过在一抗中添加0.2%吐温20来增加印迹严格性。与 Wtf4 一致的波段解药-mCherry被观察到，并且不存在于阴性对照泳道中。（F）E所示膜的丽春红染色。DMSO对照样品错误地未上样到该印迹上。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009847.s006

（提夫）

S7 图 wtf4的表达解药二倍体和ASCI中的启动子报告。

两种长度的wtf4的描述和图像解药本研究中使用的启动子，P解药 (A） 和 p解药长 (两个不同p的图像解药-mCherry记者/ +来自杂合二倍体和asci。（C）杂合子中mCherry荧光的定量（p解药-mCherry reporter/ +） 二倍体和腹水。每个报告者至少量化了25个二倍体和25个腹水。所有图像均在孢子培养基上3天后采集。TL = 透射光。所有比例尺代表 2 μm。图像以相同的设置拍摄，并以相同的亮度和对比度显示，以便进行准确比较。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009847.s007

（提夫）

S8 图 Mei4与减数分裂中的LTRs相关。

将减数分裂诱导后4小时来自Mei4 ChIP-seq（数据来自[50]）的峰（由MACS2调用）与LTR区域（由BLAST识别）进行比较。如果区域重叠，则它们将显示在维恩图的共享区域中。对于映射到多个位置的任何 ChIP-seq 读取，仅选择随机选择的一个位置。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009847.s008

（提夫）

S9 图 WTF4毒和 Wtf4解药当从 p 表示时，函数被破坏解药和 p毒分别是发起人。

(A）所描述基因型的11个二倍体的等位基因传递和生育能力（通过活孢子产量测定）。基因型列显示相关基因型的卡通描述。然后，后代表型显示在右侧。对于在一个位点（例如，二倍体 1）杂合的二倍体，显示了两个值（顶部和底部），代表两种可能的单倍体基因型。对于两个位点杂合的二倍体，使用的位点是未连接的，应随机分离。这些描述不与染色体上位点的位置成比例。表现出两种亲本表型的孢子被认为是二倍体或非整倍体，并且被排除在本表之外，但可以在S1数据中找到。预期值假定孟德尔等位基因传递。（* = p < 0.05，NS = 不显著;等位基因传递的G检验，VSY的Wilcoxon检验，与空载体对照相比）。我们将二倍体12、13、14、20与二倍体1作为对照，将二倍体15、21、22、23、24与二倍体2作为对照进行比较。对照二倍体 1-2 和 12-15 的数据也显示在 S2A 图中。二倍体 1 的数据也在图 3C 中。（B） 图像解药-WTF4毒-GFP/ade6+， wtf4解药-mCherry/ura4+ 亲本和非亲本双型 asci。p解药-wtf4毒-GFP 以青色和 Wtf4 显示解药-mCherry 在合并图像中以洋红色显示。TL = 透射光。所有比例尺代表 2 μm。2天后在孢子培养基上获取的所有图像。所有图像均以相同的亮度和对比度显示，以便进行准确比较。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009847.s009

（提夫）

S1 视频。 图1C和1E所示的代表性细胞的延时视频。

视频中的面板 A 显示了具有代表性的 mCherry-wtf4/wtf4毒-经历减数分裂的GFP二倍体，由我们在图1C中进行的延时显微镜捕获。m樱桃-WTF4解药在洋红色和 Wtf4 中毒-GFP 在复合材料中呈青色。视频中的面板 B 显示了具有代表性的 wtf4解药-McHerry/WTF4毒-经历减数分裂的GFP二倍体，由我们在图1E中进行的延时显微镜捕获。WTF4解药-mCherry 在洋红色和 Wtf4毒-GFP 在复合材料中呈青色。比例尺代表 4 μm。视频是使用相同的设置拍摄的。视频不会以相同的亮度和对比度显示，以避免较亮帧中的像素过度饱和。每个视频由 115 帧组成，间隔为 10 分钟。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009847.s010

（移动）

S1 表。 使用的酵母菌株。

第 1 列是所用菌株的名称，而第 2 列是指基因型。第 3 列列出了酵母菌株的参考。如果它是在本研究中制作的，我们还在第 4 列中详细介绍了应变是如何产生的。第 5 列列出了使用该菌株的数字。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009847.s011

（三十）

S2 表。 使用的质粒。

第1列是所用质粒的名称。第2列给出了质粒的简短描述。第3列列出了质粒的参考文献。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009847.s012

（三十）

S3 表。 使用寡核苷酸。

第 1 列是使用的寡核苷酸的名称。第 2 列详细介绍了寡核苷酸的序列，而第 3 列给出了简短的描述。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009847.s013

（三十）

S1 数据。 所有二倍体的遗传学和活孢子产量（VSY）数据。

选项卡 1 是所有 22 个二倍体的所有等位基因传递和 VSY 数据的摘要。每个后续选项卡都包含单个交叉的原始数据。选项卡名称包含二倍体数，对应于论文中的二倍体数，并且两个菌株交叉以生成二倍体。每个选项卡中的顶部表格列出了 VSY 数据，包括每个交叉至少 3 个独立二倍体 （A-X） 的数据。列出了二倍体稀释液的菌落数和相应的孢子稀释液，以及与适当对照组相比的平均活孢子产量、标准偏差和 p 值（Wilcoxon 检验，* = p < 0.05，NS = 不显著）。下表包含等位基因传输数据。我们详细介绍了杂交产生二倍体（等位基因 1 和等位基因 2）的两种菌株的基因型和两个等位基因的传播频率，以及对照位点。我们在表中显示了有和没有二聚体的数据，但在图中使用了不包括二聚体的数据。我们还列出了与适当对照组相比的p值（G检验，* = p < 0.05，NS =不显著）。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009847.s014

（三十）

S2 数据。 图像量化的原始数据。

每个选项卡都包含手稿中提供的定量原始数据。第一个选项卡包含图1D和1F中描述的定量，其中计算了mCherry和GFP的归一化荧光强度，用于经历减数分裂的二倍体。绘制每个二倍体的迹线作为平均值绘制，随时间变化的置信区间为95%。第二个选项卡包含图2C和2F中描述的孢子中报告子（启动子-FP）表达的定量。对于每个子囊，我们详细说明了4个单独孢子的平均荧光强度和4个孢子的总和。然后，我们将每个单独的孢子除以总数，以获得给定孢子内总孢子荧光的百分比。第三个选项卡详细介绍了图4D中描述的给定荧光蛋白孢子内部强度百分比的定量。我们显示了三种不同基因型中孢子内荧光蛋白的百分比（p毒-WTF4解药-GFP/mCh-wtf4毒， p毒-WTF4解药-GFP/ade6+， mCh-wtf4毒/ade6+）。第四个选项卡详细介绍了S3B图中描述的光漂白后荧光恢复（FRAP）定量。我们将漂白前的荧光强度归一化为1。漂白完成后，每10分钟记录一次回收，持续约6小时。mCherry-Wtf4和Wtf4的荧光水平毒-GFP 记录每个时间点。第五个选项卡详细介绍了S3D图中描述的光漂白后荧光恢复（FRAP）定量。第六个选项卡详细介绍了S7C图中显示的定量，以及以下构建体的asci和二倍体内的荧光强度：p解药-mCherry， p解药长-mCherry，以及空矢量控件。第七个选项卡详细介绍了图5D，即给定荧光蛋白孢子内部强度的百分比。我们显示 Wtf4 的百分比毒-三种不同基因型的孢子内部GFP：p解药-WTF4毒-GFP/ade6+， wtf4解药-mCh/ura4+;WTF4毒-GFP/ade6+;和 WTF4毒-GFP/ade6+， wtf4解药-mCh/ura4+.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009847.s015

（三十）

确认

我们要感谢Zanders实验室的成员对论文的有益评论。我们感谢何塞·艾特提供菌株。这项工作的部分原因是为了满足NLN在斯托尔斯医学研究所研究生院的论文研究要求。

引用

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