2020年3月至2021年10月在加蓬中部非洲对逆转录环介导的等温扩增（RT-LAMP）测定进行长期验证，用于快速检测SARS-CoV-2

阿部遥香，尤里·牛岛，罗德里格·比坎吉，乔治林·恩圭马·翁多，阿勇·穆尔，约里克·亚利-阿西-奥亚姆利，吉川六介，伯特兰·莱尔，阿约拉·阿德尼卡，安田次郎

发布时间：2022 年 12 月 1 日

抽象

背景

尽管开发了几种诊断COVID-19的方法，但对这些方法的长期验证仍然有限。在COVID-19大流行的早期阶段，我们开发了一种基于逆转录环介导的等温扩增（RT-LAMP）方法的快速灵敏诊断方法，适用于即时应用或用于资源有限的环境中检测SARS-CoV-2。为了评估RT-LAMP检测技术对资源有限地区（如非洲农村地区）的适用性，并验证该方法对各种SARS-CoV-2变异株的可用性，使用大流行期间纵向收集的临床样本验证了该方法。

方法/主要发现

首先，使用便携式电池支持设备从细胞培养物中提取的病毒RNA样品评估RT-LAMP检测10个SARS-CoV-2变体的灵敏度，从而在15分钟内成功检测到20-50个病毒基因组拷贝，无论变体如何。2020年3月至2021年10月期间在加蓬收集的COVID-19阳性样本用于评估检测的敏感性并计算SARS-CoV-2基因组的拷贝数。在几乎所有测试中，在15分钟内以100%的概率检测到超过292个病毒基因组拷贝。

结论

这项长期验证研究清楚地证明了RT-LAMP测定在非洲资源有限的地区（例如加蓬农村地区）对COVID-19临床诊断的适用性。结果表明，该测定作为一种有前途的COVID-19诊断方法具有潜力，特别是在远离城市或半城市地区官方诊断设施的农村和偏远地区。

作者摘要

RT-LAMP是一种快速灵敏的病原体检测方法，可用于资源有限的环境。尽管已经开发了几种用于诊断传染病的RT-LAMP检测方法，但关于这些检测方法的长期验证的报告有限。为了证明该测定的适用性并验证该方法对各种SARS-CoV-2变体的可用性，重要的是使用在可能引入该测定进行诊断的地区收集的临床样本进行长期验证研究。这项研究揭示了 RT-LAMP 检测 10 种 SARS-CoV-2 变体（包括 Omicron 变体）的病毒 RNA 的高灵敏度。此外，使用2020年3月至2021年10月在加蓬收集的临床样本，在15分钟内以100%的概率检测到超过292个病毒基因组拷贝。结果表明，该检测方法适用于非洲农村地区，那里的居民难以获得官方的COVID-19诊断设施。

引文：Abe H， 牛岛 Y， Bikangui R， Ondo GN， Moure A， Yali-Assy-Oyamli Y， et al. （2022） 2020 年 3 月至 2021 年 10 月在加蓬中部非洲快速检测 SARS-CoV-2 的逆转录环介导等温扩增 （RT-LAMP） 测定的长期验证。PLoS Negl Trop Dis 16（12）： e0010964. https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0010964

编辑 器：乔纳斯·克林斯特伦，瑞典卡罗林斯卡学院

收到：6月 9， 2022;接受：11月 19， 2022;发表：12月 1， 2022

版权所有：? 2022 安倍等人这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。

数据可用性：所有相关数据都在手稿及其支持信息文件中。

资金：这项研究得到了日本国际协力机构（JICA）和日本医学研究与发展机构（AMED）的可持续发展科学技术研究伙伴关系（SATREPS）的支持，批准号SATREPS，JP20jm0110013;AMED，授权号JP20wm0225003;a 日本科学促进会科学研究补助金（KAKENHI），资助号JP19K24679;以及JSPS的RONPAKU（论文博士）计划，批准号为R12110。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。

竞争利益：提交人声明不存在相互竞争的利益。

介绍

自世界卫生组织（WHO）宣布新型冠状病毒病（COVID-19）为大流行以来的过去两年中，每个国家都制定并实施了适合控制COVID-19传播的适当对策。尽管全球均已接种疫苗，但由于SARS-CoV-2（SARS-CoV-2）的新型变异株频繁出现，全球仍多次报道COVID-19感染浪潮，这些变异株表现出更高的感染性和/或逃离中和抗体作用的能力[1，2]。

已经开发了几种检测SARS-CoV-2的技术，例如核酸扩增测试（NAAT）和侧流装置（LFD）。NAAT因其高敏感性和特异性而仍然是COVID-19诊断的常用方法[3-5]。世界各地研究机构开发的几种逆转录定量PCR（RT-qPCR）方法被认为是金标准[6，7];但是，RT-qPCR需要检测仪器和稳定的功率。因此，在资源有限的环境中使用RT-qPCR或进行现场诊断可能很困难。LFD因其出色的可用性和便携性而在全球范围内常规用于COVID-19诊断，但LFD的敏感性低于NAAT仍然是一个潜在问题[8，9]。逆转录环介导的等温扩增（RT-LAMP）是一种快速灵敏的NAAT，涉及简单的等温步骤，可以使用便携式电池驱动设备进行。它显示出与RT-qPCR相当的灵敏度[10]，表明RT-LAMP适用于COVID-19分子诊断，即使在RT-qPCR实施困难的环境中，也可以在15-20分钟内完成。

非洲已经建立了COVID-19诊断系统，大多数国家都启动了免费疫苗接种计划。为了正确了解COVID-19，正在积极开展SARS-CoV-2基因监测，南非、尼日利亚和塞内加尔等国家在监测方面处于领先地位。这种广泛的监测导致发现了一种新的变异株Omicron，该变异株具有高感染性和逃避免疫系统的能力[11-13]。尽管如此，COVID-19在非洲的总体传播和传染性模式仍不清楚，特别是在偏远地区，这可能是由于居民难以获得通常位于城市或半城市地区的诊断设施。在中非加蓬，自大流行早期阶段以来，COVID-19病例一直得到良好监测，在政府的持续努力下，正在积极开展SARS-CoV-2的基因监测[14-17]。然而，在该国的城市或半城市环境中，使用RT-qPCR诊断COVID-19。在观察到居民的COVID-19症状后，很难在农村地区进行诊断测试。

我们开发了多种RT-LAMP检测方法，用于检测埃博拉病毒和寨卡病毒等对公共卫生构成关注的病毒，用于现场监测[18-20]。利用我们的经验，我们开发了一种快速灵敏的RT-LAMP检测方法来检测SARS-CoV-2，并于2020年3月被日本政府批准为官方诊断方法[21]。RT-LAMP检测靶向Orf1ab区域，在15分钟内以100%的概率检测到超过23.7个SARS-CoV-2基因组拷贝，显示出与RT-qPCR相当的灵敏度[21]。尽管已经发表了其他几篇关于RT-LAMP检测SARS-CoV-2检测进展的报告，但大多数检测仅使用来自原始武汉型或D614G变异株感染患者的样本进行评估[22-25]。因此，这些RT-LAMP检测方法在检测其他变异方面是否表现出相似的灵敏度和特异性仍然未知。然而，与检查这些方法开发的报告相比，验证新诊断方法的报告有限。

为了检查RT-LAMP检测对自大流行开始以来出现的各种SARS-CoV-2变异株的持续可用性，我们使用在加蓬收集的临床样本进行了一项长期验证研究，并考虑了未来将该检测引入资源有限的地区。还尝试对临床样本中检测到的SARS-CoV-2进行全基因组测序，以准确确定变异，这可能会影响测定的灵敏度。因此，RT-LAMP 检测对检测本研究中测试的所有 SARS-CoV-2 变异株表现出高灵敏度。我们的结果表明了诊断测定在农村和偏远地区的适用性，可能有助于准确了解COVID-19在非洲的传播和传染性。

方法

道德声明

这项研究得到了兰巴雷内医学研究中心（CERMEL）和长崎大学热带医学研究所的机构伦理委员会的批准（批准号分别为CEI-007和170921177）。不需要知情同意，因为该研究使用匿名样本，每个样本完全保密。

从临床样品中提取病毒RNA和标准RNA的合成

在 CERMEL 的常规 COVID-19 诊断过程中，使用 QIAamp 病毒 RNA 迷你试剂盒（德国希尔登市 Qiagen）常规从鼻咽拭子样本中提取病毒 RNA。本研究使用了从 COVID-19 阳性样本中提取的病毒 RNA。为了计算病毒基因组的拷贝数，使用T7 RiboMAX快速大规模RNA生产系统（Promega，麦迪逊，威斯康星州，美国）制备合成的RNA，与T7启动子序列偶联的病毒靶序列的人工合成DNA，如前所述[21]。

加蓬的COVID-19感染病例数

加蓬新发感染病例数来自WHOCOVID-19仪表板[1]。我们对加蓬的第一波、第二波和第三波 COVID-19 的定义如下：2020 年 4 月 27 日至 8 月 17 日;2021年1月11日至5月31日;以及2021年9月6日至11月22日[17]。

SARS-CoV-2变异株的病毒株

如前所述，为了获得病毒RNA，SARS-CoV-2变体在VeroE6细胞中繁殖[26]。感染后4天收集培养物上清液，以2，000×g离心15分钟，并储存在-80°C直至进一步使用。本研究中使用的参考菌株名称如下：B.1.1 （D614G），hCoV-19/Japan/NGS-SC-1/2020（GISAID入藏号，EPI_ISL_481254）;阿尔法（B.1.1.7），hCoV-19/日本/QK002/2020（EPI_ISL_768526）;测试版 （B.1.351）， hCoV-19/日本/TY8-612-P1/2021 （EPI_ISL_1123289）;伽马（第1页），hCoV-19/日本/TY7-503/2021（EPI_ISL_877769）;德尔塔 （B.1.617.2）， hCoV-19/日本/TY11-927-P1/2021 （EPI_ISL_2158617）;λ （C.37）， hCoV-19/日本/TY33-456/2021 （EPI_ISL_4204973）;Mu （B.1.621.1）， hCoV-19/日本/TY26-717/2021 （EPI_ISL_4470503）;河童 （B.1.617.1）， hCoV-19/日本/TY11-330-P1/2021 （EPI_ISL_2158613）;奥密克戎（BA.1），hCoV-19/日本/TY38-873P0/2021（EPI_ISL_7418017）;奥密克戎（BA.2），hCoV-19/日本/TY40-385/2022（EPI_ISL_9595859）。这些病毒株由日本国立传染病研究所提供，但hCoV-19/Japan/NGS-SC-1/2020（B.1.1）毒株除外，该毒株是从长崎大学热带医学研究所检测到COVID-19阳性的患者的临床样本中分离出来的。为了选择BA.2变异序列来计数引物结合区的突变，从GISAID下载了2022年从欧洲、美洲、亚洲、非洲和大洋洲提交的“完整”和“低覆盖率排除”序列（2022年4月5日访问）。获得对应于5，924株菌株的数据，并使用MAFFT（https://mafft.cbrc.jp/alignment/server/）对序列进行比对。对于 BA.3 变体，所有“完整”和“低覆盖率排除”序列均从 GISAID（2022 年 4 月 5 日访问）下载，其中包含对应于 1，751 株菌株的数据。在去除引物结合位点外的序列后，手动去除引物结合区域中显示模糊碱基或N的SARS-CoV-2菌株。

RT-灯检测

使用等温预混液试剂（ISO-004;佳能医疗系统，日本枥木县），使用Genelyzer FIII实时荧光检测平台（佳能医疗系统），如前所述[21]。反应混合物（总体积，25 μL）含有 15 μL 等温预混液、1 U AMV 逆转录酶（日本基因，日本东京）、20 pmol（各）的 FIP 和 BIP 引物、5 pmol（各）的 F3 和 B3 外引物、10 pmol（各）的 LF 和 LB 环引物以及 1 μL RNA 样品（模板）。使用的引物序列列于表1中。反应在以下条件下进行：68°C20分钟，然后在95-75°C下进行解离分析，温度变化率为0.1°C / s。 通过RT-LAMP对每个临床样本进行两次SARS-CoV-2检测，并计算平均阳性时间（Tp）。Tp定义为从测定开始到荧光信号达到20，000的时间段（分钟）。含有RT-LAMP测定靶序列的合成RNA用作阳性对照。通过将熔解温度与阳性对照的熔解温度进行比较，排除了非特异性扩增[20]。

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表 1.RT-LAMP和RT-qPCR中使用的引物序列。

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RT-qPCR 检测

如前所述，RT-qPCR使用一步法PrimeScript III RT-qPCR混合物（日本滋贺市高良生物）进行[27]。反应混合物（总体积 = 20 μL）包含 10 μL 的 2× 一步法 PrimeScript III RT-qPCR 混合物、0.4 μL ROX 参比染料、2 μL 10×引物-探针混合物、1 μL RNA 样品和 6.6 μL 无 RNase 水。引物和探针由日本国立传染病研究所（NIID）开发。正向引物、反向引物和FAM标记探针的终浓度分别为500 nM、700 nM和200 nM[28]。引物和探针序列列于表1中。RT-qPCR反应使用StepOnePlus仪器（赛默飞世尔科技，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）进行，热循环程序使用以下条件进行：52°C5分钟和95°C10秒，然后45个95°C循环5秒，60°C35秒。阈值循环（Ct）值40设置为临界值。为了定量病毒基因组拷贝，使用来自RT-qPCR靶序列的合成标准RNA的十倍连续稀释液生成标准曲线。使用RT-qPCR分析每个临床样本，以量化病毒基因组的拷贝数。

SARS-CoV-2的全基因组测序

通过RT-qPCR评估的COVID-19阳性样本使用与先前报道的方法类似的方法进行全基因组测序[29]。简而言之，使用在线程序Primal Scheme（https://primalscheme.com/）设计的引物集进行多重PCR，扩增子大小为450 bp。模板序列来源于武汉-胡-1菌株的序列（GISAID加入号）。EPI_ISL_402125）。根据制造商的方案，使用SuperScript IV逆转录酶（赛默飞世尔科技）结合随机六聚体对提取的病毒RNA进行逆转录。如前所述，逆转录互补DNA用于使用Q5高保真DNA聚合酶（美国马萨诸塞州伊普斯威奇的新英格兰生物实验室）进行多重PCR[30]。根据制造商的说明，使用50-500 ng的多重PCR产物和NEBNext Ultra II FS DNA文库制备试剂盒（新英格兰生物实验室）与NEBNext多重寡核苷酸（新英格兰生物实验室）结合使用制备文库。使用NEBNext Quant Kit对每个文库进行定量检查后，我们使用IniSeq高输出试剂盒（美国加利福尼亚州圣地亚哥Illumina）获得SARS-CoV-2的完整基因组序列。使用CLC Genomics Workbench 11.0.1软件（Qiagen）使用武汉-Hu-1菌株的全基因组序列作为模板，对配对末端读段进行映射。使用BioEdit 7.0.5.3软件（http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html）提取共识序列并与参考菌株进行比对。进行Sanger测序以获得几种菌株的完整基因组序列，这些菌株显示出短间隙或模糊序列。全基因组测序后，使用穿山甲v3.0（https://github.com/cov-lineages/pangolin）分析每种菌株的谱系。

统计分析

统计数据分析，包括相关性分析，使用GraphPad Prism 7（GraphPad Software，圣地亚哥，加利福尼亚州，美国）进行。当p 值小于 0.05 时，结果被认为具有统计显著性。

结果

在加蓬收集COVID-19阳性样本并确定SARS-CoV-2谱系

自2020年3月加蓬COVID-19疫情开始以来，一直对SARS-CoV-2进行持续的基因监测。总共选择了336个样品进行RT-LAMP测定的验证，包括每月至少收集一个样品。尽管SARS-CoV-2的谱系是在监测期间通过全基因组测序确定的[17]，但40个样本的SARS-CoV-2谱系仍不清楚。我们试图使用二代测序和桑格测序来确定这些样本中的SARS-CoV-2谱系。总共确定了310种SARS-CoV-2菌株的谱系。2020年3月至2021年10月期间，加蓬记录了三波主要的COVID-19感染（图1）。在刺突蛋白中具有D614G取代的B.1.1变体在第一波中很普遍，第三波主要涉及delta变体的感染，正如在非洲大陆的相应浪潮中观察到的那样。在加蓬的第二波中发现了多种变体：B.1变体，9.7%;B.1.1， 7.1%;阿尔法， 35.7%;贝塔， 5.6%;预计到达时间，12.2%;B.1.1.318， 17.3%;和其他次要变体，12.2%（图1和S1表）。

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图1.在加蓬COVID-19浪潮期间收集的样本数量和SARS-CoV-2谱系确定。

图表上显示了每月收集的样本数量。条形颜色描绘了在每个样本中检测到的SARS-CoV-2谱系。加蓬每月的COVID-19病例在图表上用虚线表示。第一波、第二波和第三波 COVID-19 以橙色突出显示，在每次 COVID-19 波期间收集的样本中检测到的 SARS-CoV-2 谱系显示在上面的饼图中。

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RT-LAMP检测SARS-CoV-2变异株病毒RNA的灵敏度

我们之前使用武汉-Hu-1菌株（GISAID入藏号EPI_ISL_402125）的序列作为参考[21]开发了RT-LAMP检测方法。为了检查RT-LAMP检测法对检测SARS-CoV-2其他变体的灵敏度，为B.1.1（D614G）、α、β、γ、Delta、Kappa、Lambda和Mu变体制备了一系列纯化的病毒RNA，对应于每个反应的拷贝数从2到200，000不等。RT-LAMP测定对所有测试的变体都显示出高灵敏度，以100%的概率检测50个病毒RNA拷贝（表2和S2）。在 20 个拷贝的病毒 RNA 中，RT-LAMP 测定以 100% 的概率检测到 B.1.1、Alpha 和 Beta 变体，而 Delta 变体的检测概率为 83.3%，γ、Kappa 和 Mu 变体的检测概率为 66.7%，Lambda 变体的检测概率为 50.0%。对SARS-CoV-2变异株的敏感性与先前的数据一致，该数据显示检测到靶RNA的50个拷贝的概率为100%[21]。特别是，在所有测试中，最大平均阳性时间 （Tp） 为 13.08 分钟（Lambda 变体的 20 个拷贝），任何变体的 Tp 值都低于 15 分钟。这些结果表明，RT-LAMP测定在检测其他变异方面表现出相似的灵敏度，可以被认为是适合作为COVID-19的快速诊断方法。

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表 2.使用 SARS-CoV-2 变体的病毒 RNA 评估 RT-LAMP 测定的灵敏度。

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使用2020年3月至2021年10月在加蓬收集的临床样本验证RT-LAMP检测

为了评估快速诊断测定的准确性，使用RT-LAMP测定法测试了在加蓬收集的336个临床样本。结果显示每个反应的拷贝数与Tp之间存在显著相关性（皮尔逊相关系数，r = -0.809;p< 0.001）（图2）。最小拷贝数为每次反应69.2拷贝，在本研究中使用RT-LAMP测定法检测。结果与先前报告一致[21]。为了验证本研究中检测到的每个变异的RT-LAMP测定的准确性，计算了变异特异性检测率（表3）。该测定在含有 100 个以上2每个反应的 Delta 或 B.1.1.318 变异基因组拷贝。对于其他变体，通过RT-qPCR分析为阳性的几个样品被RT-LAMP视为阴性，拷贝范围从102–103，并且很少有 <10 的样品2拷贝被检测为阳性。总体而言，RT-LAMP检测可以在临床样本（包括超过292个靶标拷贝）中以100%的概率检测SARS-CoV-2基因组。当考虑 10 的复制范围时2–103，当使用每次反应少于292拷贝的临床样本时，SARS-CoV-2检测能力显着下降。包括几个通过RT-qPCR分析阴性的样品，所有这些样品也被RT-LAMP检测为阴性，表明使用RT-LAMP测定没有假阳性反应。这一结果将支持引物对SARS-CoV-2的高特异性，正如我们之前的研究所报道的那样，该研究表明引物与SARS-CoV没有交叉反应[21]。

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表 3.使用在加蓬收集的临床样本验证RT-LAMP测定。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0010964.t003

验证RT-LAMP检测在检测奥密克戎变异株中的应用

为了验证该检测检测方法检测奥密克戎变异株的能力，这些变异株未包含在本研究中评估的临床样本中，我们评估了 RT-LAMP 检测从奥密克戎变异株 BA.1 和 BA.2 的培养上清液中提取的病毒 RNA 的灵敏度。RT-LAMP测定可以100%的概率检测不超过20个BA.1基因组拷贝，而它可以以100%的概率检测50个BA.2基因组拷贝，以83.3%的概率检测20个拷贝（表4）。结果清楚地表明，该测定法检测奥密克戎和其他变异株的灵敏度相当。为了估计检测当前传播的BA.2和BA.3变体的潜在能力，我们检查了RT-LAMP引物序列和奥密克戎变体基因组之间的核苷酸身份。通过选择在GISAID中寻找“完整”和“低覆盖率排除”序列，本研究使用了从全球各地区提交的5，920株BA.2菌株的基因组数据以及包含对应于1，678株菌株的数据的BA.3菌株的所有沉积序列。引物序列和基因组数据之间的比较显示，BA.2菌株的186个位点中有27个位点发生突变（图3）。然而，B1引物第六个核苷酸的最低核苷酸同一性为99.85%，BA.2菌株整个引物结合区的平均核苷酸同一性超过99.99%（图3）。在5，920株BA.2菌株中显示突变的61株中，58株显示每种菌株一个突变，只有3株在该地区显示两个突变。关于BA.3菌株，仅在引物结合区域内的8个位点观察到突变，最小核苷酸同一性为99.88%（图3）。在具有突变的六种BA.3菌株中，一种印度菌株（GISAID入藏号，EPI_ISL_10716808）显示出五种突变;然而，在其他五种菌株中，每个菌株仅观察到一个突变。由于每个亚系中只有极少数群体在引物结合位点具有突变，这些结果强烈表明RT-LAMP测定可用于检测奥密克戎变异株。

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图3.BA.2 和 BA.3 菌株中 RT-LAMP 引物结合位点内的核苷酸身份。

根据每个RT-LAMP引物序列的核苷酸位置绘制核苷酸身份图。箭头描绘了每个引物的长度和方向。颜色表示每个底漆组。总共有5，920和1，678株分别用于评估BA.2和BA.3变异序列。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0010964.g003

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表 4.评估 RT-LAMP 测定法检测奥密克戎变异株病毒 RNA 的灵敏度。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0010964.t004

讨论

自 2020 年 3 月宣布大流行以来，全世界每个国家都建立了针对 COVID-19 的系统诊断方法。NAAT是在各种类型的临床样本中检测SARS-CoV-2的最灵敏和可靠的方法之一。已经开发了几种用于COVID-19诊断的RT-LAMP检测方法，其优点是在简单的等温扩增步骤中快速灵敏地进行检测[22-25]。然而，与显示这些方法发展的报告相比，验证新诊断方法的报告有限，尽管检查这些方法的长期适用性至关重要。

RT-LAMP是一种快速灵敏的方法，使用可由电池供电的便携式检测器检测目标序列。此外，RT-LAMP对靶向病原体具有高度特异性，因为使用了4-6个靶向6-8个引物结合位点的引物[31]。该测定的优点包括在现场或在资源和稳定电力在很大程度上有限的农村地区诊断传染病。在COVID-19出现之前，我们已经开发了多种RT-LAMP检测方法来检测与公共卫生有关的病毒，如埃博拉病毒、马尔堡病毒、拉沙病毒和寨卡病毒[18-20，32-35]。特别是，在疫情暴发期间，针对埃博拉和寨卡病毒的RT-LAMP检测在现场进行了检测，在30分钟内检测到目标病毒。其他研究小组还积极开发了几种LAMP诊断检测方法，不仅可以检测病毒，还可以检测其他病原体，如疟疾寄生虫和细菌，用于资源有限的地区[36-40]。因此，RT-LAMP因其在农村地区现场诊断或使用中的应用而得到认可。

在 COVID-19 的诊断中，RT-qPCR 偶尔会报告扩增失败，例如脱落或异常延迟。在欧洲流行Alpha变异（B.1.1.7）期间，一些研究小组使用基于RT-qPCR的商业诊断试剂盒报告了S或N基因脱落，这严重影响了准确诊断[41-43]。随后，在其他变异株中报道了几例基因脱落病例，尤其是S或N基因，表明使用RT-qPCR进行诊断存在潜在风险[44，45]。然而，引物结合位点中的任何点突变对扩增时间和灵敏度的影响最小，并且对于RT-LAMP进行快速准确的分子诊断都是可以接受的[46]。此外，由于引物结合位点的突变很少，我们的RT-LAMP检测在BA.2和BA.3 Omicron变异株的当前传播期间可以很好地发挥作用（图3）。幸运的是，我们选择了orf1b区21100-21355核苷酸位置的引物结合位点，该位点的多样性可能低于S或N基因，具有用于诊断的显著敏感性（表2和表4）[47]。因此，我们的RT-LAMP检测证明了长期使用的潜力，即使在未来的新变体浪潮中也是如此。

迄今为止，已经开发了几种RT-LAMP检测方法来检测SARS-CoV-2，包括我们之前的研究[21-25，48，49]。这些检测中的大多数是在宣布 COVID-19 大流行后不久开发的，可以检测 1.0 × 104–2.0 × 101SARS-CoV-2基因组的拷贝/反应，表明有足够的敏感性用于COVID-19的诊断。几项开发新型COVID-19RT-LAMP检测方法的研究使用临床标本计算了RT-qPCR检测限的Ct值，范围为32-35[23，26，48，49]。使用临床标本，当前RT-LAMP测定的检测限范围在33-36的Ct值范围内（表3），与以前的研究具有良好的一致性。由于这些已建立的RT-LAMP测定的引物结合区域在每项研究中基本不同，因此敏感性和特异性似乎仅取决于每个引物序列，而不依赖于特定的靶基因。几项研究试图直接从临床标本中检测SARS-CoV-2。尽管直接RT-LAMP的灵敏度比使用提取的RNA样品的灵敏度低10-100倍，但最近用于直接RT-LAMP测定的试剂的可用性可能有助于测定变得更加简单和方便。已建立的RT-LAMP检测使用原始的武汉型或D614G变体进行验证，而这些检测方法的开发后出现了许多变体。因此，需要使用新出现的变体来验证已建立的测定。

抗原检测快速诊断检测 （Ag-RDT） 是在护理点进行临床诊断的有力工具。检测限 （LOD） 为 106基因组拷贝/毫升（相当于大约 102PFU/ml）被WHO认为用于临床诊断的Ag-RDTs是可接受的[50-52]，相当于2.5×104在我们的诊断系统中复制/反应（总共25μl/反应）。本研究中评估的RT-LAMP检测显示，在分析多种SARS-CoV-2变异株期间，靶向病毒RNA的LOD为20-50拷贝，该检测检测到超过292个拷贝，临床诊断概率为100%（表2-4）。尽管纯化的病毒RNA和临床样品之间存在LOD差异，但由于RT-LAMP反应的现有抑制剂，剩余的盐和乙醇以及大量不必要的标本来源RNA干扰退火或延伸步骤，因此通常观察到这种情况。这些结果清楚地表明，即使病毒滴度太低而无法使用Ag-RDT成功检测，RT-LAMP测定的灵敏度也足以检测COVID-19感染。此外，与核酸横流检测（NLFA;例如试纸）相比，RT-LAMP检测在及时检测病毒方面显示出优势，因为NLFA通常需要通过RT-qPCR或RT-LAMP对病毒基因组进行预扩增[53]。因此，RT-LAMP检测有可能在护理点用作强大的诊断工具，例如Ag-RDT。

在非洲大陆，到目前为止已经报告了四次主要的COVID-19浪潮[1]。每个非洲国家都旨在通过系统诊断和基因监测来了解COVID-19的传播和传染性，促进向公共数据库提交SARS-CoV-2全基因组序列，确定新的关注变异株（VOC），如奥密克戎变异株[11-13]。然而，超过50%的非洲SARS-CoV-2序列是从少数国家提交的，包括南非、肯尼亚、尼日利亚和塞内加尔，这些国家正在进行广泛的基因监测，这可能表明非洲国家对COVID-19的诊断和监测能力不平衡。在中部非洲，持续监测仍然具有挑战性，迫切需要推广使用简单可靠的诊断方法，以阐明COVID-19在偏远地区的传播，因为很难进入通常位于城市或半城市城市的诊断设施。基于这一观点，我们在加蓬检查了RT-LAMP检测的准确性，预计未来该检测将在中非农村地区广泛分布。该测定经过验证，可检测许多对 COVID-19 诊断具有足够灵敏度的变异。仍然有必要提供可持续的支持，以了解非洲COVID-19的整个情况。

本研究的局限性在于难以预测RT-LAMP测定对在不久的将来流行的新型未知SARS-CoV-2变体的适用性。与其他分子诊断方法相比，RT-LAMP更适合在资源有限的环境中使用，而该测定需要多种基本资源，例如实验室设备（例如微量移液器和管）和充满电的黄油。试剂的采购成本也是建立可持续诊断系统的关键问题。本测定在日本被批准为官方诊断方法，表明使用该测定的结果具有足够的可重复性。当地研究人员/临床医生对可重复性的进一步验证将加强该测定的优势。为了在全球范围内使用当前检测方法，包括资源有限的地区，必须要求研究人员、公司、国际公共卫生组织和每个国家的政府之间开展合作，以适当克服这些挑战。

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在加蓬COVID-19浪潮期间收集的样本数量和SARS-CoV-2谱系确定。

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1 表 S1 （与图1相关）

2 加蓬COVID-19浪潮期间收集的样本数量和SARS-CoV-2谱系确定

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S1 表。在加蓬COVID-19浪潮期间收集的样本数量和SARS-CoV-2谱系确定。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0010964.s001

（三十）

S2 表。使用 SARS-CoV-2 变体的病毒 RNA 评估 RT-LAMP 测定的灵敏度。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0010964.s002

（三十）

确认

我们感谢兰巴雷内医学研究中心（CERMEL）的COVID-19诊断团队每天采样并进行RT-qPCR检测。我们还要感谢木村真由子的技术援助和高野Miku的后勤管理。

引用

1.世界卫生组织。世卫组织冠状病毒（COVID-19）仪表板。可用时间：https://covid19.who.int/

2.科勒 K， 马丁马， 安蒂亚 R， 洛普曼 B， 迪恩 NE.SARS-CoV-2流行病学的变化。科学。2022;375(6585):1116–1121.pmid：35271324

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

3.区文萍， 张PPH. 医院和诊所常见SARS-CoV-2核酸检测的诊断性能：系统评价和荟萃分析。柳叶刀微生物。2021;2（12）：e704–e714.密码：34661181

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

4.Eftekhari A， Alipour M， Chodari L， Maleki Dizaj S， Ardalan M， Samiei M， et al.全面回顾SARS-CoV-2的检测方法。微生物。2021;9(2):232.密码：33499379

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

5.创新诊断的基础。新冠肺炎 （COVID-19）。测试目录。可用从：https://www.finddx.org/covid-19/test-directory/

6.科尔曼VM， 兰特 O， 凯撒 M， 莫伦坎普 R， 梅杰 A， 楚 DK， 等.通过实时RT-PCR检测2019年新型冠状病毒（2019-nCoV）。欧元监控。2020;25(3):2000045.密码：31992387

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

7.Vogels CBF， Brito AF， Wyllie AL， Fauver JR， Ott IM， Kalinich CC， et al.SARS-CoV-2 RT-qPCR引物探针组的分析灵敏度和效率比较。纳特微生物。2020;5(10):1299–1305.密码：32651556

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

8.佩托·英国 COVID-19 侧流监督小组。COVID-19：通过侧流测定快速检测SARS-CoV-2抗原：大规模检测敏感性和特异性的国家系统评估。电子医学。2021;36:100924.pmid：34101770

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

9.米斯特里达， 王建， 莫瑟梅， 斯塔基 T， 李莱.关于侧流装置检测SARS-CoV-2的敏感性和特异性的系统评价。BMC 感染分析， 2021;21（1）：828.密码：34407759

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

10.Soroka M， Wasowicz B， Rymaszewska A. 环介导的等温扩增 （LAMP）： PCR 的更好兄弟姐妹？细胞。2021;10(8):1931.pmid：34440699

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

11.崔志， 刘萍， 王楠， 王玲， 范珂， 朱琪， 等.SARS-CoV-2 奥密克戎感染性和免疫逃避的结构和功能特征。细胞。2022;185（5）：860–871.e13.密码：35120603

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

12.曹毅， 王军， 简芳， 肖婷， 宋文， 易思玛依， 等.奥密克戎逃脱了大多数现有的SARS-CoV-2中和抗体。自然界。2022;602(7898):657–663.密码：35016194

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

13.铃木R， 山草场D， 木村I， 王L， 岸本M， 伊藤J， 等.SARS-CoV-2 奥密克戎变异株的减毒梭性和致病性。自然界。2022;603(7902):700–705.密码：35104835

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

14.Abe H， Ushijima Y， Bikangui R， Zoa-Assoumou S， Ondo GN， Manouana GP， et al.中非关注的未经识别的SARS-CoV-2变异株的引入：B.1.1.7在变种传播到非洲大陆的早期阶段，加蓬的输入和本地传播。J 梅德维罗尔。2021;93(10):6054–6058.pmid：34185327

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

15.Zoa-Assoumou S， Ndeboko B， Manouana GP， Houechenou RMA， Bikangui R， Mveang-Nzoghe A， et al. 非洲SARS-CoV-2新兴变种：来自加蓬的观点。柳叶刀微生物。2021;2（8）：e349.pmid：34124702

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

16.Manouana GP， Nzamba Maloum M， Bikangui R， Oye Bingono SO， Ondo Nguema G， Honkpehedji JY， et al.加蓬共和国出现B.1.1.318 SARS-CoV-2病毒谱系，αB.1.1.7变异株的高发病率令人担忧。国际感染杂志 2022;114：151–154.密码：34742926

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

17.Abe H， Ushijima Y， Bikangui R， Ondo Nguema G， Lell B， Adegnika AA， et al.COVID-19浪潮的延迟到来：加蓬与非洲大陆的比较。柳叶刀微生物。2022 4 月 21.密码：35779562

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

18.黑崎Y， 马加苏巴N， 奥洛尼尼伊OK， 谢里夫MS， 坂部S， 高田A， 等.开发和评估逆转录环介导的等温扩增（RT-LAMP）检测方法，结合便携式设备，用于几内亚埃博拉病毒病的快速诊断。公共科学图书馆 2016;10（2）：e0004472.密码：26900929

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

19.黑崎 Y， 马加苏巴 N， 巴哈， 索罗波吉 B， 多雷 A， 库鲁马 F， 等.在几内亚偏远地区部署逆转录环介导的等温扩增试验，用于埃博拉病毒监测。感染杂志 2016： 214 （增刊 3）： S229–S233.pmid：27481863

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

20.黑崎Y， 马丁斯DBG， 木村M， 卡特娜ADS， 博尔巴MACSM， 马托斯SDS， 等.开发和评估通过逆转录环介导的等温扩增对寨卡病毒感染的快速分子诊断测试。科学代表 2017;7（1）：13503.密码：29044149

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

21.Yoshikawa R， Abe H， Igasaki Y， Negishi S， Goto H， Yasuda J. 基于环介导的等温扩增的COVID-19快速简单诊断测定的开发和评估。公共科学图书馆 2020;14（11）：e0008855.密码：33147214

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

22.甘古利 A， 穆斯塔法 A， 伯杰 J， 艾登 MY， 孙 F， 拉米雷斯 SAS， 瓦莱拉 E， 坎宁安 BT， 金 WP， 巴希尔 R. SARS-CoV-2 的快速等温扩增和便携式检测系统。美国国家科学院院刊， 2020;117（37）：22727–22735.密码：32868442

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

23.Fowler VL， Armson B， Gonzales JL， Wise EL， Howson ELA， Vincent-Mistiaen Z， et al.一种高效的逆转录环介导等温扩增 （RT-LAMP） 检测，用于快速检测 SARS-CoV-2 感染。J 感染。2021;82(1):117–125.密码：33271166

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

24.卢茹， 吴旭， 万孜， 李彦， 金鑫， 张春.一种用于快速检测SARS-CoV-2的新型逆转录环介导等温扩增方法。国际分子科学杂志 2020;21（8）：2826.pmid：32325642

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

25.白英华， 乌姆， 安提瓜， 朴志华， 金茹， 吴淑， 等.开发逆转录环介导的等温扩增作为新型SARS-CoV-2的快速早期检测方法。新兴微生物感染。2020;9(1):998–1007.密码：32306853

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

26.樱井 Y， 吴威敦 MM， 黑崎 Y， 樱花 T， 稻冈 DK， 藤根 K， 等. 5-氨基乙酰丙酸在体外抑制 SARS-CoV-2 感染。生化生物物理学研究通讯.2021;545:203–207.密码：33571909

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

27.Abe H， Ushijima Y， Loembe MM， Bikangui R， Nguema-Ondo G， Mpingabo PI， et al.2016-2017年加蓬再次出现登革热病毒血清3型感染，并有证据表明存在反复感染登革热病毒的风险。国际感染杂志 2020;91：129–136.密码：31821892

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

28.白藤K， Nao N， 片野H， 高山I， 斋藤S， 加藤F， et al.日本开发用于检测新型冠状病毒2019（nCoV-2019）的遗传诊断方法。感染杂志 2020;73（4）：304–307.密码：32074516

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

29.阿部 H， 牛岛 Y， 天野 M， 樱井 Y， 吉川 R， 木下 T， 等.SARS-CoV-2在日本第二个大型游轮集群中的独特进化。微生物。2022;10(1):99.密码：35056548

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

30.Quick J， Grubaugh ND， Pullan ST， Claro IM， Smith AD， Gangavarapu K， et al.直接来自临床样本的寨卡病毒和其他病毒基因组的MinION和Illumina测序的多重PCR方法。国家协议。2017;12:1261–1276.密码：28538739

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

31.Notomi T， Okama H， Masubuchi H， Yonekawa T， Watanabe K， Amino N， et al.环介导的DNA等温扩增。核酸研究 2000;28：E63.密码：10871386

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

32.Kurosaki Y， Grolla A， Fukuma A， Feldmann H， Yasuda J. 使用逆转录环介导的等温扩增方法开发和评估马尔堡病毒检测的简单测定。临床微生物学杂志。2010;48(7):2330–6.密码：20421440

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

33.福马 A， 黑崎 Y， 森川 Y， 格罗拉 A， 费尔德曼 H， 安田 J. 通过逆转录环介导的等温扩增快速检测拉沙病毒。微生物免疫。2011;55(1):44–50.密码：21175773

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

34.Oloniniyi OK，Kurosaki Y，Miyamoto H，Takada A，Yasuda J.通过逆转录环介导的等温扩增（RT-LAMP）快速检测所有已知的埃博拉病毒物种。J 病毒方法。2017;246:8–14.pmid：28356221

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

35.奔巴CM， 黑崎Y， 吉川R， 奥洛尼尼伊OK， 浦田S， 末吉M， 扎德VR， 等.开发用于检测尼日利亚东南部和中南部拉沙病毒的RT-LAMP检测方法。J 病毒方法。2019;269:30–37.密码：30974179

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

36.巴黎DH， Imwong M， Faiz AM， Hasan M， Yunus EB， Silamut K， et al.环介导的等温PCR（LAMP）用于诊断恶性疟疾。Am J Trop Med Hyg.2007;77(5):972–6.pmid：17984362。

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

37.波利 SD， 莫里 Y， 沃森 J， 帕金斯医学博士， 冈萨雷斯 IJ， 诺托米 T， 等.线粒体DNA靶标使用环介导的等温扩增提高了疟疾检测的灵敏度。临床微生物学杂志。2010;48(8):2866–71.pmid：20554824

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

38.关 M， 基尔戈尔 PE， 金 EJ， 大西 M， 早川 S， 金 DW.用于诊断细菌性脑膜炎的环介导等温扩增方法。前儿科。2018;6:57.密码：29594087

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

39.维加拉 A， 布塔尔 H， 塞卡托 A， 洛佩斯 M， 克鲁尔斯 A， 布埃诺-弗莱雷 L， 等.评估环介导的等温扩增 （LAMP） 测定，用于快速检测医院获得性肺炎患者呼吸道样本中的致病菌。微生物。2020;8(1):103.pmid：31940771

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

40.世界卫生组织。使用环介导的等温扩增（TB-LAMP）诊断肺结核：政策指导。2016. 可用自：https://apps.who.int/iris/handle/10665/249154

查看文章谷歌学术搜索

41.巴尔 A， 德斯特拉斯 G， 盖马尔德 A， 斯特菲克 K， 马莱特 J， 埃米厄 S， 等.2020年8月至12月法国H69-V70，用于识别值得关注的SARS-CoV-2变体202012/01和其他具有尖峰缺失的变体的两步策略。欧元监控。2021;26(3):2100008.密码：33478625

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

42.Wollschl?ger P， Todt D， Gerlitz N， Pfaender S， Bollinger T， Sing A， et al. SARS-CoV-2 N 基因脱落和 N 基因 Ct 值偏移作为商业多重 PCR 检测中存在 B.1.1.7 谱系的指标。临床微生物感染。2021;27（9）：1353.e1–1353.e5.密码：34044153

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

43.桑切斯-卡尔沃，阿拉多斯·阿博莱达斯，罗斯·比达尔，德弗朗西斯科，洛佩斯·普列托医学博士。基于N基因脱落或延迟的诊断预筛查方法，以提高SARS-CoV-2 VOC B.1.1.7检测的可行性。诊断微生物感染 2021;101（4）：115491.密码：34464903

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

44.So MK， Park S， Lee K， Kim SK， Chung HS， Lee M. 通过分析 Allplex SARS-CoV-2 测定中的 RdRp/S 基因双扩增或低扩增模式进行变异预测。诊断（巴塞尔）。2021;11(10):1854.密码：34679552

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

45.Bozidis P， Tsaousi ET， Kostoulas C， Sakaloglou P， Gouni A， Koumpouli D， et al. 由突变的SARS-CoV-2毒株引起的商业多重PCR检测中异常的N基因脱落和Ct值转移。诊断（巴塞尔）。2022;12(4):973.密码：35454022

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

46.塔玛纳哈E， 张毅， 坦纳.分析 RT-LAMP 对序列变异的耐受性，用于 SARS-CoV-2 RNA 检测。公共图书馆一号。2022;17（3）：e0259610.密码：35324900

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

47.Kaushal N， Gupta Y， Goyal M， Khaiboullina SF， Baranwal M， Verma SC. 美国爆发最初几个月SARS-CoV-2基因组的突变频率。病 原 体。2020;9(7):565.密码：32668692

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

48.德奥利维拉·科埃略 B、桑丘基 HBS、扎内特 DL、纳尔丁 JM、莫拉莱斯 HMP、福纳扎里 B、青木 MN、布拉内斯 L. 比色逆转录环介导的等温扩增作为 SARS-CoV-2 诊断的即时检测的基本特性和陷阱。分子医学 2021;27（1）：30.密码：33771097

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

49.李 JYH， 贝斯特 N， 麦考利 J， 波特 JL， 西曼 T， 舒尔茨 MB， 赛特 M， 奥兰多 N， 默库利亚 K， 巴拉德 SA， 德鲁斯 J， 特兰 T， 卡顿 MG， 普赖尔 MJ， 崔 HL， 卢蒂克 A， 麦当劳 S， 格林哈尔 A， 邝 JC， 雪莉 NL， 格雷厄姆 M， 黄 T， 赫里斯 M， 皮多 SJ， 威廉姆森 DA， 豪顿 BP， 蒙克 IR， 斯蒂尼尔 TP. 单步验证， 用于快速检测 SARS-CoV-2 RNA 的单管逆转录环介导等温扩增测定。医学微生物学杂志。2020;69(9):1169–1178.密码：32755529

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

50.世界卫生组织。COVID-19 针对优先诊断的产品配置文件，以支持应对 COVID-19 大流行 v.1.0。2020. 可用自：https://cdn.who.int/media/docs/default-source/blue-print/who-rd-blueprint-diagnostics-tpp-final-v1-0-28-09-jc-ppc-final-cmp92616a80172344e4be0edf315b582021.pdf?sfvrsn=e3747f20_1&download=true

查看文章谷歌学术搜索

51.卫生和社会护理部。评估特定SARS-CoV-2抗原快速诊断测定的协议（侧流装置）GOV.UK。2020. 可用自：https://www.gov.uk/government/publications/assessment-and-procurement-of-coronavirus-covid-19-tests/protocol-for-evaluation-of-rapid-diagnostic-assays-for-specific-sars-cov-2-antigens-lateral-flow-devices

查看文章谷歌学术搜索

52.Cubas-Atienzar AI， Kontogianni K， Edwards T， Wooding D， Buist K， Thompson CR， et al.用于检测SARS-CoV-2的19种市售快速抗原检测试剂盒在不同基质中的检测限。科学代表 2021;11（1）：18313.密码：34526517

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索

53.萧伟， 黎天， 范德明， 高华华， 张慧， 李建， 等.用于检测COVID-19的新型侧向流动技术的最新进展。生物传感器。2021;11(9):295.密码：34562885

查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索