医学免费论文-庇护蛋白的异常表达和定位有助于年龄相关表型
阿曼达·斯托克，罗斯·麦克德维特，钱德拉卡拉·普利吉拉，王亚军，张永清，王坤，孙崇奎，凯文·贝克尔，艾琳·莱尔曼，威廉·伍德 3rd，龚毅，穆罕默德·阿克达斯，成明熙， [ ... ],刘烨[ 查看全部 ]
发布时间：2022 年 11 月 28 日
抽象
短端粒诱导DNA损伤反应（DDR），唤起人类细胞的凋亡和衰老。一个现存的问题是端粒功能障碍诱导的DDR对衰老和端粒生物学疾病中观察到的表型的贡献。一个候选者是RAP1，一种端粒相关蛋白，也控制端粒外区域的转录。为了区分这些作用，我们生成了一只携带突变Rap1的敲入小鼠，该小鼠无法结合端粒，不会导致端粒或DDR。原发性Rap1敲入胚胎成纤维细胞显示RAP1表达降低，并远离端粒重新定位，细胞质分布增加类似于在经历端粒侵蚀的人成纤维细胞中观察到的细胞质分布。Rap1敲入小鼠是可行的，但表现出转录组改变，促炎细胞因子/趋化因子信号传导，寿命缩短，健康寿命降低，体重/空腹血糖水平增加，自发性肿瘤发病率和行为缺陷。综上所述，我们的数据呈现出与端粒诱导的DDR不同的机制，这是与年龄相关的表型的基础。
作者摘要
随着年龄的增长，染色体末端的特殊结构（称为端粒）逐渐变短。极短的端粒激活破坏细胞分裂和功能或诱导细胞死亡的途径。我们试图解决端粒缩短时端粒蛋白可能重新定位到细胞其他区域的程度，从而通过端粒非依赖性机制改变细胞功能。我们选择专注于端粒相关蛋白RAP1，因为RAP1主要是一种端粒蛋白，但也存在于影响基因表达的细胞其他区域。为了确定端粒远端RAP1的影响，我们生成了一个Rap1突变小鼠模型，其中RAP1不定位在端粒处。来自该模型的细胞显示RAP1表达降低，RAP1在细胞质中的分布增加，类似于在经历端粒损耗的人成纤维细胞中观察到的情况。Rap1突变小鼠表现出基因表达，炎症，葡萄糖代谢，行为的变化以及寿命和健康寿命的缩短。这些发现支持RAP1的两个重要功能作用，端粒和端外，并表明这两种各自的功能可能是衰老表型的组成部分。
引文：Stock AJ， 麦克德维特 RA， 普利吉拉 C， 王 Y， 张 Y， 王 K， 等. （2022） RAP1 庇护蛋白的异常表达和定位有助于与年龄相关的表型。公共科学图书馆基因18（11）： e1010506. https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010506
编辑 器：Gregory S. Barsh，哈德逊阿尔法生物技术研究所，美国
收到：四月 22， 2022;接受：2022 年 11 月 2 日;发表：11月 28， 2022
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资金：资金由国家老龄化研究所校内研究计划提供。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。
竞争利益：提交人声明不存在相互竞争的利益。
介绍
端粒是染色体末端封顶结构，由串联DNA核苷酸重复序列和包括阻遏蛋白/激活蛋白1（RAP1）的六蛋白庇护素复合物组成[1]。端粒重复序列缺失或庇护素复合物保护缺失可引起共济失调-毛细血管扩张突变（ATM）或共济失调-毛细血管扩张和Rad3相关（ATR）激酶依赖性DNA损伤反应（DDR），从而导致端粒功能障碍诱导的病灶（TIF）形成并驱动细胞死亡或衰老[1]。在人类中，端粒缩短是衰老的标志[2]。新出现的证据表明，极短端粒诱导的DDR在端粒生物学疾病细胞功能障碍中起着至关重要的作用[3]。然而，在与年龄相关的疾病（如癌症、糖尿病和神经变性）中，端粒侵蚀引起的因果机制仍然难以捉摸。
RAP1是从酵母到人类最保守的端粒蛋白[4]。哺乳动物RAP1依靠其与端粒重复结合因子2（TRF2）的相互作用定位为端粒[4]。RAP1中异亮氨酸318和苯丙氨酸336的疏水残基已被证明可以介导人类RAP1和TRF2的相互作用[5]。在小鼠中，RAP1中异亮氨酸312突变为精氨酸会破坏其与TRF2的相互作用，从而破坏其端粒定位[6]。鼠RAP1似乎是端粒末端保护的可有可无的。与其他庇护无效小鼠不同，Rap1无效小鼠具有活力和可育性[7，8]，并且缺乏端粒功能障碍诱导的DDR或染色体端到端融合[7，9，10]。相反，Rap1的缺失会在端粒酶缺乏[10]或衰老[11]的情况下加剧端粒缩短和功能障碍。当端粒失去关键庇护蛋白或TRF2介导的端粒包裹/拓扑的保护时，rap1缺乏也会影响端粒重组[7，12，13]。
虽然哺乳动物RAP1主要是端粒，但它发挥端外功能，包括转录抑制/激活参与代谢和癌症的基因[6，8，14-16]。RAP1定位到端粒外基因组位点与端粒长度有关，因为进行性端粒缩短导致RAP1从端粒重新定位到端外基因组位点[10]。RAP1影响基因转录，独立于TRF2介导的与端粒的结合[6，14，17]。RAP1似乎通过与端粒远端蛋白质的相互作用来影响基因转录，包括表观遗传修饰剂[17]以及细胞质中的IkappaB激酶[16]，后者激活核因子-κB（NF-kB），这是一种在许多信号级联中起重要作用的主转录因子[18]。Rap1无效小鼠还表现出端粒非依赖性病理改变，包括肥胖伴白色脂肪组织沉积增加、肝脂肪变性和葡萄糖耐受不良[6，8]。这些结果和其他已发表的出芽酵母[19，20]工作表明，RAP1除了在端粒维持中发挥作用外，还参与细胞功能。
鉴于端粒长度和TRF2表达与年龄相关的下降，以及端粒结合的RAP1随着端粒侵蚀而下降[10，21-23]，我们假设与年龄相关的端粒外“游离”RAP1的增加可能会改变转录组并加剧与年龄相关的表型。因此，我们生成了一个敲入小鼠模型，该模型仅表达无法结合TRF2的Rap1突变体。这些Rap1敲入小鼠显示出RAP1蛋白水平的降低和端粒外/胞质RAP1的分布增加。在经历端粒损耗的原代人成纤维细胞中观察到RAP1的类似改变。Rap1敲入小鼠表现出基因转录，促炎细胞因子和趋化因子以及各种年龄相关表型（即炎症，代谢功能障碍，肿瘤发病率增加，行为缺陷）的全身改变。因此，我们的研究表明，端粒结合的RAP1的缺失会引起影响哺乳动物健康和寿命的年龄相关表型。这些发现表明，RAP1具有重要的端粒和非端粒作用，可能是衰老表型不可或缺的一部分，并且可以进行修改以获得治疗益处。
结果
表达端粒外RAP1的小鼠寿命缩短
为了确定RAP1的端外作用及其对体内加速衰老和疾病的潜在贡献，我们使用CRISPR / Cas9编辑生成了Rap1敲入（KI）小鼠，该小鼠在先前建立的氨基酸中具有点突变（I312R），是RAP1与TRF2和端粒关联所必需的[5，6]（图1A）。Rap1敲入等位基因通过Sanger测序得到证实（图1B）。Rap1纯合子敲入（Rap1基/基）和杂合子敲击（Rap1基/WT）小鼠具有正常的孟德尔遗传模式，具有可存活且可育，支持端粒处的RAP1对于小鼠胚胎发生是可有可无的观察结果。然而，值得注意的是，与野生型（WT）同窝小鼠相比，Rap1敲入小鼠的寿命缩短（图1C）。
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图1.Rap1敲入小鼠的世代和寿命。
（一）使用CRISPR / Cas9系统在小鼠Terf2ip（Rap1）基因中产生点突变的示意图。sgRNA结合序列下划线，点突变（红色，I312R）在WT和Rap1敲入等位基因的RCT结构域内RAP1-TRF2结合所需的残基处产生。BD：绑定域。（二）Rap1突变的序列。点突变以红色框框，左框中显示单个氨基酸取代。（三）WT，Rap1的寿命基/WT和说唱1基/基以卡普兰-迈耶生存曲线为代表的小鼠。总小鼠曲线（n = 28 WT，n = 33Rap1基/WT，且 n = 26Rap1基/基，左侧面板）显示。P值使用Gehan-Breslow-Wilcoxon检验测定。（四）来自初级WT，Rap1的细胞核（蓝色）的代表性图像和条形图量化基/WT和说唱1基/基使用IF与抗RAP1（绿色）和端粒鱼（红色）染色的MEF。在WT和Rap1中检测到RAP1和端粒的共定位基/WT，但不是在Rap1 中基/基MEF。分析每个基因型~100个细胞核，比例尺：5μm。（五）TRF2 和 RAP1 对 RAP1 免疫沉淀剂进行蛋白质印迹分析，并使用全裂解物进行输入。（六）全细胞裂解物中RAP1水平的蛋白质印迹和定量。P值由单因素方差分析与Tukey的事后比较确定。n = 6 WT，n = 5 KI/WT，n = 5 KI/KI 主要 MEF 线。（七）用抗 RAP1、抗 α-微管蛋白（胞质蛋白）和抗 TRF2（核蛋白）探测的细胞质 （C） 和核 （N） 级分的蛋白质印迹。细胞核中 RAP1 水平（左）、细胞质（中）和 RAP1 胞质分布百分比（右）的定量显示在条形图中。n = 4 WT， n = 2Rap1基/WT，且 n = 4Rap1基/基主要 MEF 行。WT 和Rap1 之间的 P 值基/基由学生的未配对 t 检验确定。所有数据均为平均值± SEM。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010506.g001
端粒和核RAP1的保留需要其与TRF2相互作用
评估Rap1端粒中RAP1的预期缺失基/基小鼠，我们对原代小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）进行了免疫荧光 - 端粒荧光原位杂交（IF-端粒FISH）。RAP1与WT和Rap1中的端粒共定位基/WTMEF。在说唱1中基/基MEFs，100%的细胞表现出弥漫性核/胞质染色，并且在核病灶或端粒处未检测到RAP1（图1D）。抗RAP1免疫沉淀结果显示，在WT和Rap1中检测到TRF2基/WTMEF，但不是在Rap1 中基/基MEF（图1E）。这些结果证实，该RAP1突变体不结合TRF2或与端粒结合[6]。我们没有检测到Rap1中Rap1mRNA水平的变化。基/基MEF（S1A图）。蛋白质印迹显示 RAP1 蛋白水平在Rap1 中降低基/基与WT MEFs（图1F）相比，MEFs与先前的观察结果一致，即在没有RAP1-TRF2相互作用的情况下RAP1蛋白水平降低[7]。Rap1 中的 RAP1 蛋白水平基/WTMEF与WT MEF相当（图1F）。细胞分级分离和蛋白质印迹显示Rap1 中的胞质 RAP1 增加基/WT和说唱1基/基MEF，与WT MEF相比（图1G）。在Rap1中观察到RAP1的类似变化基/基小鼠，I.e.，说唱1基/基脑组织显示RAP1表达降低，胞质RAP1分布增加（图2），这在年轻和老年雌性和雄性小鼠中很明显。在长时间培养过程中经历端粒损耗的人原代成纤维细胞中，RAP1表达适度降低，胞质RAP1增加，TRF2胞质分布没有明显变化（S2图）。我们没有检测到表达RAP1 I312R的MEF中Trf2mRNA（S1B图）或TRF2蛋白水平（S1C图）的变化，也没有检测到TRF2重新定位到细胞质的证据（图1G），表明RAP1可以独立于TRF2定位到细胞质中。总之，Rap1敲入模型中发生的Rap1表达和RAP1胞质分布的变化让人想起在人类细胞复制衰老期间观察到的那些变化。
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图2.Rap1的胞质分布在Rap1敲入脑组织中增加。
来自年轻和老年女性 （A） 和男性 （B）WT 和Rap1 全脑的细胞质溶胶 （C）、可溶性核 （SN） 和染色质结合核 （CBN） 部分的蛋白质印迹基/基用抗RAP1，抗β-微管蛋白（胞质蛋白）和抗组蛋白3（H3，核蛋白）探测小鼠。RAP1胞质分布的定量（右）显示在条形图中。（C）显示印迹的丽春红S染色剂，以阐明脑系中较高分子量（RAP1和β-微管蛋白）与低分子量条带（H3）相比的大小差异。n = 7 WT 和 n = 5Rap1基/基小 鼠。P值由双向方差分析确定。所有数据均为平均值± SEM。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010506.g002
端粒RAP1缺失不会破坏端粒维持
越来越多的证据表明，复制性衰老和端粒病是由端粒DNA重复序列缺失和端粒功能障碍诱导的DDR引发的[3，24]。由于Rap1 中端粒 RAP1 丢失基/基小鼠，我们评估了原发性WT和Rap1中端粒长度和端粒功能障碍诱导的DNA损伤病灶（TIF）形成基/基MEF。Rap1 中的端粒信号强度基/基MEFs与WT MEFs在中期扩散上的定量端粒原位杂交（Q-FISH）相当（S3A图）。此外，我们没有观察到Rap1中的端粒信号自由端，端粒脆性，染色体端到端融合或其他明显的染色体异常。基/基MEF（S3A图）。TIFs是通过使用IF-端粒鱼对γH2AX病灶和端粒DNA进行共定位来确定的[25]。约1%的WT和说唱1基/基MEFs每个细胞核有一个TIF，没有MEF显示每个细胞核≥3个TIF（S3B图）。在WT和Rap1中也观察到了类似的结果。基/基小鼠组织（S3C图）。这些结果与先前对MEF的研究一致，其中该Rap1突变体未引起端粒功能障碍诱导的DDR[6]。集体，说唱1基/基小鼠表现出完整的端粒长度和封顶。此外，我们测量了原代WT和Rap中与衰老相关的β半乳糖苷酶活性（SA-β-gal）1基/基MEF，并且观察到SA-β-gal阳性细胞的百分比没有差异（S4图）。因此，说唱1基/基小鼠模型使我们能够区分由RAP1改变驱动的表型和由端粒诱导的DDR驱动的表型。
全身基因转录在体内表达端粒外RAP1的小鼠中被破坏
先前的研究结果支持小鼠RAP1在调节基因转录（包括参与代谢的基因）中的作用[6，8，14]。RAP1的转录作用可在很大程度上归因于其端外作用，因为Rap1I312R等位基因几乎完全恢复了体外Rap1无效MEF的转录谱[6]。我们评估了端粒外RAP1对Rap1转录组谱的影响。基/基小鼠体内。与WT同窝对照相比，Rap1的大脑、心脏、肝脏和骨骼肌共有135、299、486和74个转录本发生显著改变。基/基，分别（S1 表）。在Rap1 的肝脏、大脑、心脏和骨骼肌中观察到改变的转录本基/基年轻雄性小鼠（2-5个月）（S1表和图3）。许多转录本在中年Rap1的肝脏中被改变基/基雌性小鼠（12-14个月），尽管在其他检查组织中很少有转录本显着改变（S1表和S5图）。基因本体/通路分析揭示了显著失调通路的完整列表，其中大部分与代谢有关（S2表和图3和S5图）。肝脏显示出最大数量的显着失调的mRNA，对应于大多数代谢途径的下调，但这些途径在大脑，心脏和骨骼肌中上调（S2表）。Rap1 这些组织中编码代谢因子的 mRNA 的上调可能是基/基动物作为一种补偿机制来减轻肝脏中编码代谢蛋白的mRNA的下调。免疫反应途径在分析的所有四种组织中均显着上调，尤其是在大脑和肌肉中（S2表）。总之，我们的结果表明，端粒中RAP1的缺失在代谢的转录调节和体内免疫反应调节中具有重要作用。
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图3.基因转录和本体在Rap1敲入雄性小鼠中被改变。
通过微阵列分析在Rap1的肝脏（A）、大脑（B）、心脏（C）和骨骼肌（D）中检测到显著改变的转录本的基因本体分类基/基男性与WT对照男性相比。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010506.g003
表达端粒外RAP1的小鼠显示促炎细胞因子和趋化因子的产生增加
RAP1在细胞质中检测到，在那里它激活NF-κB[16]，NF-κB是一种与衰老相关的主转录因子，在刺激炎症和免疫反应以及促进肿瘤发生方面起重要作用[18]。Rap1缺失导致小鼠NF-κB活化缺陷[16];然而，鉴于Rap1 中胞质 RAP1 和免疫应答基因转录的显着增加1基/基小鼠，我们通过交叉Rap1评估p65（主要的NF-κB亚基）的水平基/基具有RelA-EGFP报告小鼠的小鼠[26]。表达WT或Rap1的RelA-EGFP小鼠体内p65（RelA）水平基/基通过流式细胞术测定新鲜分离的骨髓细胞和脾细胞。在Rap1中观察到p65阳性细胞（GFP+）和p65荧光强度的百分比适度增加基/基与WT骨髓细胞和脾细胞相比（S6A图）。该结果表明，体内一小部分骨髓细胞和脾细胞的NF-κB表达升高。还通过测量原代WT和Rap1中p65的水平来评估NF-κB活化基/基骨髓来源巨噬细胞（BMDM）核提取物通过p65酶联免疫吸附测定。Rap1核提取物中p65的水平基/基BMDM略有增加（S6B图）。尽管在没有任何刺激的情况下p65的激活是微妙的，但由NF-κB激活诱导的各种促炎细胞因子和趋化因子，包括IL-6和IL-1β，在Rap1中升高。基/基相对于 WT BMDM 的 BMDM（S3 表）。这些结果表明，胞质RAP1可以促进Rap1中的NF-κB信号传导基/基小鼠，即使在不受挑战的条件下。
作为说唱1基/基小鼠组织显示免疫反应转录本升高，我们分析了Rap1是否基/基小鼠表现出血清和各种组织中细胞因子和趋化因子的扰动（S4表）。我们发现Rap1血清和组织中的总体细胞因子水平增加基/基不同年龄的小鼠，包括促炎细胞因子IL-12p40，IL-17和IL-18，CCL3和RANTES（图4和S7图和S4表）。所有细胞因子的原始表达值显示在S4表中。有趣的是，一些细胞因子以性别依赖的方式上调（图5A-5C）。促炎细胞因子IL-6和G-CSF仅在Rap1血清中上调基/基女性，而抗炎细胞因子IL-10仅在Rap1的血清中上调基/基雄性（图5A）。同样，促炎细胞因子MIG和G-CSF在Rap1的大脑（图5B）和/或肌肉（图5C）中上调。基/基仅女性，在Rap1 的大脑中观察到 IL-10 增加基/基仅雄性（图5B）。
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图4.细胞因子和趋化因子在Rap1敲入血清、BMDM 和组织中的表达增加。
（一）血清中细胞因子和趋化因子的总体水平显着升高（n = 12 WT，15Rap1基/基小鼠）、BMDM（每个基因型n = 3）和脑组织（n = 7 WT，11Rap1基/基小鼠）源自Rap1基/基相对于WT使用多重细胞因子分析确定。P值由双向方差分析确定。（二）包括IL-12p40、IL-17和IL-18在内的单个细胞因子在Rap1血清中升高基/基.图表显示了源自Rap1 的细胞因子的倍数表达基/基P值由学生的不配对t检验确定。（三）细胞因子在Rap1中的折叠表达基/基相对于年轻/中年和老年小鼠WT血清的血清。（D-E）脾脏中的单个细胞因子/趋化因子CCL3和肺部的RANTES升高（每个基因型n = 9只小鼠）在Rap1中升高基/基与WT组织相比。P 值由学生的未配对t 检验确定。数据是所有图形中± SEM 的平均值。在 A-E 中将 WT 设置为 1，KI/KI 值显示为相对于每个图形的平均 WT 值。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010506.g004
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图5.Rap1敲入小鼠在免疫反应中表现出性别依赖性差异。
（一）条形图显示了Rap1 中细胞因子的倍数表达基/基相对于 WT 血清（n=5 名 WT 女性、10 名 KI/KI 女性、7 名 WT 男性、5 名 KI/KI 男性）。IL-6（上）和G-CSF（中）在Rap1中显著增加基/基仅女性，而 IL-10（底部）在Rap1 中显着增加基/基仅限男性。P值由双向方差分析与Tukey的多重比较确定。（二）条形图显示了Rap1 中细胞因子的倍数表达基/基相对于WT大脑（n = 5名WT女性，9名KI/KI女性，4名WT男性，4名KI/KI男性）。MIG（上）和G-CSF（中）在Rap1中明显更高基/基仅女性，而IL-10（底部）在Rap1中显示表达增加基/基仅限男性。P值由双向方差分析与Tukey的多重比较确定。（三）条形图显示了Rap1 中 MIG 的折叠表达式基/基相对于 WT 肌肉（n = 3 名 WT 女性、3 名 KI/KI 女性、3 名 WT 男性和 3 名 KI/KI 男性）。MIG在Rap1中明显更高基/基仅限女性。（四）图表显示了LPS（200ng / ml，24小时）诱导的细胞因子/趋化因子在源自Rap1的BMDM中的表达基/基相对于WT女性和男性。P值由双向方差分析与Sidak的多重比较确定。数据是平均± SEM。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010506.g005
我们进一步调查了Rap1基/基小鼠对炎症刺激表现出异常反应。来自WT和Rap1的BMDM基/基用脂多糖（LPS）治疗小鼠24小时。与未经治疗的BMDM相比，大多数炎症细胞因子对LPS的反应表现出更高的水平（S3表）。与WT小鼠相比，来自雌性Rap1的BMDM中炎症细胞因子的诱导显着降低基/基小鼠（图5D）。相比之下，男性说唱1基/基小鼠表现出炎症细胞因子的总体较高诱导（图5D）。因此，说唱1基/基小鼠可能在NF-κB活化和免疫反应方面表现出性别依赖性差异。
表达端粒外RAP1的小鼠自发肿瘤发病率增加
鉴于几种人类肿瘤中胞质RAP1的显著增加[16，27]，参与免疫应答的转录网络的显着改变，促炎细胞因子的持续上调以及Rap1敲入小鼠的寿命缩短，我们研究了Rap1敲入小鼠与WT小鼠相比的肿瘤发病率。我们监测了自发性肿瘤的形成，并通过WT，Rap1的组织病理学分析检查了具有严重异常或肿块的组织基/WT和说唱1基/基小鼠（图6A-6C和S5表）。严重异常包括女性和男性Rap1 的脾脏和肝脏肿大基/WT和说唱1基/基老鼠，在Rap1中尤为突出基/基增加Rap1KI剂量的小鼠（S5表）。Rap1中，没有明显异常的全脾和肝脏的重量也有所增加基/WT和说唱1基/基小鼠与WT对照的比较（图6A和6B）。随着Rap1 KI剂量从WT增加到Rap1，肿瘤负荷增加有显着趋势WT/KI到说唱1基/基以及Rap1 中肿瘤发病率的显着增加基/基小鼠，肝脏和脾脏中肿瘤形成的患病率（图6C和S5表）。
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图6.Rap1敲入小鼠具有脾脏和肝脏肿大和更高的肿瘤发病率。
（一）最左边的图像显示了来自Rap1 的肿大脾脏，长 3.7 厘米、宽 12 毫米、厚 3.5 毫米。基/WT鼠。还显示了源自WT和Rap的脾脏的并排比较1基/基鼠。条形图显示来自WT（n = 8），Rap1的脾脏重量基/WT（n = 4） 和Rap1基/基（n = 8） 同窝仔。（B）肝脏肿大伴组织细胞肉瘤广泛浸润（左图）。条形图显示了来自WT（n = 7），Rap1的肝脏重量基/WT（n = 4） 和Rap1基/基（n = 8） 同窝仔。（三）H&E 染色显示Rap 肝脏中存在组织细胞肉瘤浸润1基/基Rap1 肠系膜淋巴结中的小鼠（上部）和淋巴瘤基/基鼠标（下部）。比例尺：20 μm。（四）与 Rap1 中与癌症有关的转录本的 Z 评分基/基，相对于WT小鼠。#和&分别表示仅在女性和男性中解除管制的转录本。（五）Ly6dmRNA 的水平，通过 WT 和Rap1 中的 RT-qPCR 分析确定基/基肝脏。n = 每个基因型 6 只小鼠。P 值使用学生的未配对t 检验确定。所有数据均为平均值± SEM。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010506.g006
因为肝脏是Rap1中肿瘤形成的常见位置基/基小鼠，我们确定与肿瘤发生有关的转录本是否在Rap1中失调基/基利用基因本体/途径和逆转录 （RT） 进行肝组织，然后进行定量 （q） PCR 分析。事实上，与肿瘤发生有关的20个转录本在Rap1中失调。基/基与WT肝脏相比（图6D）。有趣的是，Ly6d在所有Rap1中都显着上调。基/基与WT小鼠相比（S1表和图6E）。虽然没有证据支持这些转录改变在肿瘤形成中的因果作用，但我们注意到编码细胞表面糖蛋白的Ly6dmRNA在人类各种类型的肿瘤[28]以及小鼠的肝肿瘤中上调[29]。
表达端粒外RAP1的小鼠表现出代谢功能障碍
肥胖和代谢功能障碍与癌症风险增加有关[30]。既往报道证实，Rap1无效小鼠存在肥胖和代谢功能障碍[6，8]。说唱1基/基小鼠提供了确定这些表型是否是由于RAP1完全丢失和/或端粒RAP1丢失的机会。类似于 Rap1 空小鼠，Rap1基/基与WT雌性相比，雌性表现出增加的体重（S8A和S8B图）。Rap1的体重增加基/基雌性不是由于这些小鼠的食物摄入量增加（S8C和S8D图）。这些结果与Rap1KI小鼠中参与代谢的基因的转录改变一致。
为了进一步评估代谢功能，小鼠接受了高脂肪/高糖饮食（HFHS）的挑战。关于HFHS饮食，说唱1基/基与WT女性相比，女性表现出更快的体重和更高的空腹血糖水平（S8E-S8H图）。为了确定端聚体外RAP1是否影响HFHS饮食的新陈代谢，我们检查了Rap1的体重和空腹血糖。基/WT细胞溶质RAP1增加的小鼠，但与WT相比RAP1蛋白水平相似（图1F和1G）。与WT女性相比，Rap1基/WTHFHS饮食中的女性表现出体重较高和空腹血糖水平升高的趋势（S8E和S8G图），表明端外RAP1的增加加剧了代谢功能障碍，以应对代谢挑战。另一方面，男性说唱1基/基和说唱1基/WT小鼠在体重或空腹血糖水平方面没有显着差异（S8B，S8F和S8H图）。先前在Rap1无效小鼠中发现的也报道了女性特异性体重增加和葡萄糖代谢总体缺陷[6，8]。
表达端粒外RAP1的小鼠表现出性别依赖性和性别依赖性神经缺陷
端粒极短的端粒酶空小鼠在学习和记忆、神经肌肉协调和嗅觉方面表现出缺陷[31，32]。然而，端粒损伤促进这些缺陷的机制仍然难以捉摸。Rap1敲入小鼠在大脑和肌肉组织中的大量免疫反应转录物/途径和促炎细胞因子中表现出失调，这可能促进破坏神经传递和神经可塑性的慢性炎症。因此，我们进行了行为测试以评估运动，感觉，情感和认知功能。说唱1基/基小鼠从倒置的线网格上掉落的潜伏期较短（图7A），无论是否对体重进行统计校正，其显着性。这表明肢体力量和/或协调性下降。此外，禁食说唱1基/基小鼠找到埋藏的食物颗粒的速度较慢（图7B），表明嗅觉敏感性受损。由于这两种缺陷都随着小鼠的正常衰老而发展[33，34]，这些结果可能表明Rap1的神经衰老加速。基/基小鼠，在雌性中更为明显。在开放现场测试中，探索性运动在性别 - 基因型相互作用方面没有差异（图7C），但Rap1敲入突变体对中心时间的影响，这是焦虑的迹象，在女性和男性之间显着不同（图7D）。在零迷宫的开放象限中观察到按性别划分的基因型相互作用（图7E），在明暗盒试验（S9A图）中观察到不显着的趋势，这也是焦虑样行为的衡量标准[35]。在所有测试中，影响的方向是减少和增加Rap1中的焦虑样行为。基/基分别为男性和女性。有趣的是，人类研究表明，焦虑与短端粒之间存在正相关关系[36，37]，尽管这些关联与性别无关。最后，评估Rap1的认知能力基/基小鼠，我们评估了自发交替任务（Y迷宫）中的工作记忆和逆转学习任务（水T迷宫）中的认知灵活性。在两项测试中均未观察到显着差异（S9B和S9C图）。总之，我们发现男性和女性Rap的运动和嗅觉功能受损1基/基小鼠，而焦虑以性别依赖的方式双向改变（图7F），认知功能保持不变。
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图 7.Rap1敲入小鼠以性别依赖性方式表现出神经变化。
（一）线挂测试显示小鼠跌落的最大潜伏期，n = 19 WT（9 只雌性和 10只雄性）和n = 24 Rap1基/基（14只雌性和10只雄性）小鼠。WT 与 Rap1 中的 P 值基/基显示了女性和/或男性。（二）掩埋食物检验。n = 19WT（10 名女性和 9 名男性），n = 19 Rap1基/基（女性12人，男性7人）。WT 与 Rap1 中的 P 值基/基显示了女性和/或男性。（C）露天测试/15分钟内行驶的距离。n= 21 WT（11 名女性和 10 名男性）和n = 24 Rap1基/基（14名女性和10名男性）。p= 0.128 （WT vs.Rap1基/基).（D）露天测试/中心时间超过15分钟。p= 0.003（基因型/性别相互作用）。（E）零迷宫测试，n = 14 WT（8 名女性和 5 名男性）和n = 11 Rap1基/基（5只雌性和6只雄性）小鼠。p = 0.054（基因型/性别相互作用）。（六）行为测试的数据显示为 % WT 控制（设置为 100%）。在R软件中使用基因型和性别作为因子的2元方差分析分析行为结果，并在适当的情况下包括波和体重的协变量。所有数据均为平均值± SEM。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010506.g007
神经炎症与星形胶质增生和Rap1敲入小鼠脑中炎症小体通路成分的上调有关
调查Rap中低度神经炎症的来源和/或观察到的行为缺陷的来源1基/基脑，我们对源自WT和Rap1的矢状脑切片进行了免疫染色基/基小 鼠。脑部神经炎症的主要效应因素是神经胶质细胞，包括星形胶质细胞和小胶质细胞（脑内巨噬细胞）[38，39]。为了鉴定星形胶质细胞和小胶质细胞并检查它们的数量、形态和染色强度的差异，我们使用了分别识别神经胶质原纤维酸性蛋白（GFAP）和离子化钙结合衔接分子1（IBA1）的抗体。IBA1免疫染色显示Rap1中小胶质细胞的特征无差异基/基与WT大脑相比（图8A）;然而，GFAP免疫染色显示GFAP染色强度显着增加（图8B和8C），并且胼胝体中GFAP阳性星形胶质细胞的数量有增加的趋势（图8B和8D）。胼胝体中的星形胶质细胞表现出扩大的形态（图8B）。这些发现表明胼胝体中存在反应性星形胶质细胞（星形胶质细胞病），已知胼胝体可分泌炎性细胞因子并驱动神经炎症[38，39]。与这些发现一致，我们观察到Rap1敲入脑组织中的炎症小体途径成分显着增加，包括裂解的半胱天冬酶-1，前IL-1β，IL-18，这在女性中更为明显（S10图）。这些数据表明，反应性星形胶质细胞和炎症小体活化可能有助于增加Rap中炎性细胞因子的表达1基/基脑组织。
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图8.Rap1敲入小鼠在胼胝体中表现出星形胶质增生。
（一）来自WT和Rap1的矢状脑切片的代表性图像基/基小鼠显示（A）用抗IBA1染色的大脑皮层（绿色）并安装有含有DAPI（蓝色）的培养基。比例尺：200μm。（二）代表性矢状脑切片安装有含有DAPI的培养基（顶部面板，蓝色）并用抗GFAP（中间面板，绿色）染色。顶部和中间面板显示包含胼胝体的区域（以绿色勾勒）。胼胝体内的框状区域在底部以较高的放大倍数显示。比例尺：500 μm（顶部和中间面板）;40 μm（底板）。（中四）量化GFAP染色的平均强度和胼胝体（概述区域）内GFAP阳性细胞的百分比。每个基因型n = 3只小鼠，数据是平均值±SEM。 P值使用学生的未配对t检验获得。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010506.g008
讨论
端粒损耗是衰老的标志[2]，与年龄相关疾病有关，包括癌症、糖尿病和神经退行性疾病[40]。剩下的问题是这些表型在多大程度上是由端粒诱导的DNA损伤反应驱动的，而不是端粒侵蚀时发生的端粒蛋白的其他涌现特性。RAP1 就是一个重要的例子;在出芽酵母中，端粒损耗导致RAP1远离端粒，并导致衰老过程中发生的基因表达变化[19，20]。此外，小鼠RAP1的丢失会导致免疫应答和代谢的深刻改变，端粒RAP1丢失或其在控制基因转录中的其他作用在多大程度上触发这一点尚不清楚[6，8，10，14]。为了了解异常RAP表达和细胞定位对寿命和健康寿命的影响，我们生成并表征了Rap1敲入小鼠模型。通过破坏RAP1-TRF2相互作用，我们消除了端粒处的RAP1定位，这导致了其端外定位，包括在细胞质中。与单独删除RAP1类似[7，9]，去除端粒处的RAP1不会诱发端粒侵蚀或端粒DDR。因此，我们可以解决RAP1的这些其他特性在多大程度上有助于哺乳动物的病理生理学。我们发现Rap1敲入小鼠虽然可行，但寿命缩短，免疫功能，新陈代谢和行为方面存在其他一些缺陷。因此，我们的研究支持这样一种观点，即RAP1表达和定位的改变以端粒诱导的DDR非依赖性方式有助于病理生理学。
既往研究表明，RAP1水平取决于其与小鼠TRF2的相互作用[7，41]。因此，RAP1 I312R无法结合TRF2可能导致Rap1中RAP1蛋白表达降低。基/基小 鼠。RAP1 在 Rap1 中细胞溶质增加/核分布减少基/基小鼠提供了RAP1-TRF2相互作用有助于促进RAP1核保留的证据。值得注意的是，RAP1的变化与TRF2表达或定位无关，这在Rap1中没有改变。基/基小 鼠。
非端粒RAP1可调控基因表达[6，14–16]。因此，RAP1水平的改变和/或RAP1中从端粒定位到非端粒定位的转换可能会影响基因转录并导致Rap1KI小鼠的病理变化。事实上，我们的数据揭示了大量的转录本（图3和S5图和S1表）和途径（S2表），这些转录本在各种Rap1KI小鼠组织中发生了改变，尤其是肝脏。Rap1肝脏中代谢转录物和途径的下调基/基小鼠与在这些小鼠中观察到的体重增加和空腹血糖一致，这在雌性Rap中更为明显1基/基小 鼠。代谢的这些性别依赖性差异与先前在Rap1无效小鼠中的发现一致[6，8]。这种重叠的表型和代谢途径的一些共同变化，包括Rap1中PPARα途径的下调基/基 (S2 表）和Rap1无效肝脏[8]，表明Rap1 KI小鼠体重增加和代谢缺陷可能是由于Rap1KI小鼠中RAP1表达降低。然而，说唱1基/WT小鼠的RAP1水平与WT小鼠相当（图1F），但HFHS饮食显示出更高的体重和空腹血糖水平的趋势（S8E和S8G图）。因此，Rap1 中的代谢功能障碍似乎是可行的基/基小鼠也可以通过端粒外RAP1增强。
除转录扰动外，胞质RAP1还与中性粒细胞中的NLRP3炎性小体共定位[42]并激活NF-kB[16]。这些胞质因子在胞质炎症和免疫应答中起重要作用[18，43]。虽然Rap1缺失导致NF-kB激活缺陷[16]，但我们发现Rap1基/基大脑和/或骨髓显示出NF-kB和/或炎症小体激活的迹象。Rap1 中促炎细胞因子的产生增加基/基脑组织、骨髓来源的巨噬细胞和血清。在所有检查的组织中观察到免疫反应转录物和途径的增加。这些发现与Teo和Liu等人[16，42]的报告一致，并表明增加的胞质RAP1可能促进NF-kB和炎症小体活化，从而推动Rap1中免疫反应转录物和促炎细胞因子产生增加。基/基小 鼠。有趣的是，我们观察到Rap1中免疫反应和基础促炎和抗炎细胞因子水平的性别差异。基/基小 鼠。我们推测，基因组和/或蛋白质组中的性别差异促进了与端外RAP1的不同相互作用，导致影响细胞因子产生的下游途径的性别依赖性失调。因此，Rap1中促炎或抗炎基底细胞因子产生的性别二态性基/基BMDM可以解释观察到的性别差异，即它们对炎症刺激产生有效的促炎或抗炎反应的能力。在人类和啮齿动物中观察到LPS诱导的促炎细胞因子的性别/性别二态性相似[44]。因此，研究RAP1在调节人类性别依赖性免疫反应和疾病易感性方面的潜在作用将是非常有趣的。
据报道，在几种人类肿瘤中，包括乳腺癌和非小细胞肺癌，胞质RAP1升高[16，27]。此外，Rap1缺乏会加速小鼠肿瘤的发病率，以响应致癌物和Myc癌基因[45，46]。可以合理推断，RAP1 水平降低和/或 RAP1 胞质分布升高可能促进了Rap1 肿瘤发病率升高基/基小 鼠。淋巴瘤和组织细胞肉瘤是Rap1 中观察到的主要肿瘤基/基小鼠，主要在肝脏和脾脏中检测到。这两个器官的重量也增加了。因此，小鼠肝脏和脾脏可能最容易受到RAP1变化的肿瘤发生的影响。因此，与肿瘤发生和免疫反应有关的转录网络的显着改变以及促炎细胞因子的上调可能导致Rap的肿瘤负荷增加和死亡率加速1基/基小 鼠。
尽管Rap1敲入小鼠与Rap1空小鼠共享一些病理变化，例如体重增加，但它们与Rap1空小鼠不同，其中端粒和非端粒RAP1都被消除。不到5%的失调基因在Rap1敲入和无效肝组织中重叠[6，8]（S11图）。由于Rap1敲入小鼠与WT或Rap1无效小鼠之间的主要区别是端粒远端RAP1的存在，具有改变的细胞溶质和核分布，我们认为RAP1的这些变化可以改变转录景观，而这种方式无法通过单独使用RAP1来实现。Rap1之间重叠的失调基因基/基和无效肝脏，超过一半被反向调节（S11图）。说唱中的其他途径1基/基小鼠也与Rap1无效小鼠中的调节相反。例如，与能量代谢有关的途径，包括氧化磷酸化和电子传递途径，在Rap1中被下调基/基肝脏，但在Rap1无效肝脏中上调[8]。Rap1敲入小鼠的寿命缩短，这在Rap1无效小鼠中未观察到[8]。此外，Rap1敲入小鼠表现出自发肿瘤发病率增加和行为改变，在没有任何易患癌症的遗传背景或致癌物暴露的情况下，Rap1无效小鼠未报告[45，46]。尽管Rap1敲入小鼠的寿命缩短表明KI等位基因的主要负面影响，但我们认为这种表型是端外/胞质RAP1增加的结果。这一观点得到了我们的发现的支持，即Rap1敲入小鼠表现出增加的胞质RAP1和增加的NF-κB激活/促炎细胞因子的表达。相反，Rap1缺失导致NF-κB活化缺陷和促炎细胞因子产生[16，47，48]。这些观察结果支持KI等位基因表现为野生型的观点。因此，Rap1敲入小鼠为研究端粒远端TRF2非依赖性RAP1功能的作用及其在衰老和年龄相关表型中的作用提供了机会。
说唱1基/基小鼠在运动和化学感觉功能的行为测试中表现出缺陷。在小鼠和人类的正常衰老过程中，这些功能的下降是有据可查的[49，50]。免疫反应转录本在Rap1 中上调最多基/基脑，与该组织中促炎细胞因子的产生增加一致。免疫染色显示胼胝体内的星形胶质细胞是神经炎症的潜在来源。由于胼胝体的实验损伤会导致运动协调性检查受损[51，52]，因此胼胝体中的星形胶质增生症可能是导致Rap表现出的一些缺陷的原因1基/基小 鼠。说唱1基/基小鼠在绞线和掩埋食物测试中表现出缺陷。值得注意的是，患有正常衰老或神经退行性疾病的小鼠在胼胝体中表现出白质损伤和发育不全，在悬线试验中出现缺陷和/或嗅觉功能障碍[53-58]。嗅觉功能障碍也随着端粒缩短而增加[31]。总的来说，这些观察结果表明，RAP1的畸变可能导致与年龄相关的运动和感觉功能下降，并加速正常衰老的某些方面。有趣的是，说唱1基/基小鼠表现出性别二态性的行为改变。说唱1基/基小鼠雌性小鼠表现出增加的焦虑样行为，而Rap1基/基雄性小鼠表现出减少的焦虑样行为。这些表型特征与人类的数据一致，其中约33.7%的人口在其一生中患有焦虑障碍，女性焦虑相关障碍的患病率几乎是男性的两倍[59]。异常的RAP1会加剧女性的焦虑并降低男性的焦虑，这一事实值得进一步研究RAP1是否可能导致焦虑的性别依赖性差异。
先前对人类的研究表明，RAP1蛋白水平随着年龄的增长而降低[23]。我们发现RAP1 I312R无法结合TRF2导致RAP1水平降低，RAP1在小鼠中细胞质/核分布增加，这一趋势在经历端粒逐渐磨损的人类细胞中也观察到。我们假设端粒随时间缩短可能会改变RAP1的表达和定位，从而导致与年龄相关的病理。我们的数据在生理学相关的环境中确定，RAP1的异常表达/定位可导致与其在端粒本身中的作用不同的年龄相关和性别特异性特性。我们的研究结果提供了重要的额外证据，证明RAP1从端粒的重新定位可能导致小鼠表型衰老，其方式可与端粒DDR的诱导分离[20，60]。我们的研究支持这样一种观点，即端粒功能的丧失，或者在这种情况下，RAP1的端粒结合活性的丧失，可能导致并非由端粒损伤本身触发的紧急特性。我们的研究结果进一步证实，尽管非端粒RAP1能够在很大程度上模仿野生型MEF的基因表达谱[6]，但细胞因子和免疫反应基因的表达存在足够的扰动，导致小鼠出现明显的性别特异性表型，并缩短寿命。我们的数据表明，年龄相关疾病和端粒生物学障碍的机制是多方面的，端粒蛋白RAP1在组织稳态和机体衰老中起着至关重要的多效性作用。
材料和方法
道德声明
所有动物实验均根据“实验动物护理和使用指南”（美国国家学院出版社，1996年）进行，并得到国家老龄化研究所机构动物护理和使用委员会的批准（ASP #383-LGG-2025）。
小鼠和细胞培养
Rap1I312R敲入小鼠是使用Crispr/Cas9技术生成的[61]。简而言之，IDT （https://www.idtdna.com/pages）产生了sgRNA（GAACTGCCATTAAGGTGATC）和单链供体寡核苷酸，其中包含所需的突变（CAGCCAGACGAGGAGGAAGAAGAAAAGTTTCTACGCAAGAAGTGGGAACTGCCATTAAGGTGCGGCG CCAGCTAATGGAGAGGAGATTCAACTTGGATCAACAGTTACACAGGCC; 四个粗体和下划线的核苷酸从野生型序列中改变，以引入真实和沉默的突变）。将Rap1I312R敲入小鼠回交C57BL / 6N菌株四次。之前描述了RelA-EGFP报告小鼠[26]。使用Kaplan-Meier生存分析确定寿命。根据NIA-ACUC政策005人道终点标准，小鼠在任何明显痛苦之前自然死亡（发现动物死在笼子里）或安乐死[49，50]。安乐死后，将具有严重异常和肿块的整个身体或器官提交给NIH兽医资源部进行组织病理学分析。
从13.5天的胚胎中分离出初级MEF。原代MEF和人成纤维细胞在补充有10-20%FBS、2mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM中培养。通过在含有粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）的L929细胞中的15%FBS，2mM L-谷氨酰胺，100 U / ml青霉素，100μg/ ml链霉素，1.5%1M Hepes，1%非必需氨基酸溶液（#11140050，赛默飞世尔科技）和15%条件培养基中培养小鼠骨髓获得BMDM。
小鼠体重、食物摄入量、空腹血糖分析
喂食标准食物饮食（ad lib）的小鼠在14至74周之间每周称重。喂食由20.3%蛋白质，47%碳水化合物，27.1%脂肪，11.5%蔗糖和31 103806%葡萄糖组成的高脂肪高糖饮食（ad lib）的小鼠每周称重6至20周龄。为了测量食物摄入量，每只小鼠在每个笼子中放置50g食物。食物分发一周后，对笼子中剩余的食物进行称重。为了测量空腹血糖，小鼠禁食过夜（~17小时）。从小鼠尾静脉抽血并直接放在Accu-chek血糖条上（#K6570210410，ADW糖尿病，Pompano Beach，FL），并通过Accu-chek血糖监测仪（#C6570210110，ADW糖尿病）测量空腹血糖读数。
小鼠行为测试
对中年（12-17个月）的小鼠进行小鼠行为评估，年龄在不同性别和基因型（F3，40= 1.08，p>0.5）。在两个不同的场合重复测试，组的代表人数大致相等。使用数码相机和ANY-Maze软件（Stoelting Co;伊利诺伊州伍德戴尔）。电线悬挂测试：测试小鼠从倒置的电线笼顶部掉落的延迟。进行了三项试验，间隔30分钟。开放领域：在40 x 40 x 40厘米的不透明室中记录小鼠15分钟。自发交替：在对称的Y迷宫装置中记录小鼠8分钟。使用公式（#交替）/（#手臂条目– 2）计算交替的手臂条目（连续三次进入不同手臂）的百分比。逆转学习：程序改编自Filali等人[62]。首先训练小鼠找到一个隐藏的平台，该平台位于T型迷宫的一个手臂中，淹没在用无毒油漆着色的水中。在初始阶段，对于任何给定的鼠标，平台始终位于同一臂中。在达到连续10次正确试验的标准（到达平台而不进入错误的手臂）后，将平台移动到另一侧手臂，并将每只动物训练到连续5次正确试验的新标准。浅暗盒：在包含深色（黑色墙壁和天花板）和明亮（750勒克斯）隔间的装置中测试小鼠10分钟，通过一个小的5.5 x 5.5厘米开口连接。记录隔间之间的转换。埋藏食物测试：将小鼠禁食过夜并测试潜伏期，以找到埋在3厘米床上用品下的45毫克食物颗粒。记录了在埋藏颗粒位置上方连续挖掘至少 2 秒的延迟。为了验证食物动机，随后向小鼠展示放置在床上用品顶部的相同颗粒[63]。五只小鼠在一分钟内没有吃掉暴露的颗粒，因此在该测试中被排除在分析之外。
细胞因子和NF-κB活化
除IL-18水平外，细胞因子/趋化因子水平由Eve Technologies（加拿大卡尔加里AB）使用小鼠细胞因子/趋化因子31重阵列（#MD31）进行定量。IL-18使用ELISA试剂盒（MBL国际，#7625）测量。IL-1β使用ELISA试剂盒（R&D Systems，#MLB00C）在WT，Rap1的子集上测量基/WT和说唱1基/基大脑匀浆。为了测量NF-κB活化，用来自大肠杆菌（200ng / ml，O111：B4，Sigma-Aldrich）的LPS处理细胞24小时。使用核提取试剂盒（# ab113474，Abcam）分离细胞核，并使用NF-κB p65转录因子测定试剂盒（# ab133112，Abcam）测定细胞核中p65的水平。为了测量RelA-EGFP小鼠的GFP阳性细胞和GFP信号强度，在BD FACS Canto II流式细胞仪（Becton Dickinson，富兰克林湖，新泽西州）上分析从骨髓和脾脏获得的单细胞。使用FlowJo软件（Becton Dickinson）分析结果。
端粒长度、端粒功能障碍诱导的病灶和 SA-β gal 分析
端粒长度通过定量端粒原位杂交（Q-FISH）[64]和使用Cy3标记（CCCTAA）端粒限制性片段分析[65]来确定3PNA探针（Panagene）和Telo-C-Biotin（CCCTAA）3分别是探针（PNA创新）。使用一抗γH2AX（#05-636-AF488，密理博）和Alexa Fluor 488染料偶联二抗（#R37120，Invitrogen）通过免疫荧光和端粒-FISH检测TIF，然后进行固定和端粒-FISH[65]。TIFs通过γ-H2AX和端粒-FISH信号的共定位进行评分。使用SPiDER-β-半乳糖苷酶染色试剂盒（#SG04-1，Dojindo）进行β-半乳糖苷酶活性。
蛋白质检测
ELISA用于测定NF-κB和细胞因子表达。免疫荧光用于分别使用抗IBA1（Abcam，ab 178846）和抗GFAP抗体（Abcam，ab 7260）测定IBA1和GFAP表达。采用蛋白质印迹法测定RAP1（圣克鲁斯，sc-53434）、TRF2（Novus Biologicals，NB110-57130）、GAPDH（ABclonal，AC027）、β-肌动蛋白（细胞信号传导技术，497OS）、α-微管蛋白（Millipore Sigma，T5168）、LAMIN A（Abcam，ab26300）、H3的表达。 （Abcam，ab1791）和炎性小体成分[前半胱天冬酶-1/裂解半胱天冬酶-1（Adipogen，AG-20B-0042-C100），NEK7（Santa Cruz，sc-393539），前IL-18（Genetex，GTX32675），IL-18（MBL国际，D046-3），前IL-1β（细胞信号传导） 技术，12242）]。对于细胞分级分离，将细胞与缓冲液A[（低渗，10mM Hepes pH 7.9，10mM KCl，0.1mM EDTA，0.1mM EGTA和Halt蛋白酶抑制剂混合物（赛默飞世尔科技）]在冰上孵育15分钟，用冰冷的10%IGEPAL CA-630（Sigma-Aldrich）处理，并涡旋10秒以破裂肿胀的细胞质膜。将细胞短暂离心（~10秒）。收集含有细胞质派系的上清液后，将核沉淀重悬于冰冷的缓冲液C（20mM Hepes pH 7.9，400 mM NaCl，1 mM EDTA，1 mM EGTA和Halt蛋白酶抑制剂混合物）中15分钟，在4°C下摇摆，然后在5，000xg下旋转。收集上清液用于核级分。等量的细胞质和细胞核级分用于蛋白质印迹。
检测 mRNA
如前所述，微阵列程序和数据分析在美国国家老龄化研究所（马里兰州巴尔的摩）的基因表达和基因组学部门进行[66]。将脑和肝组织匀浆并溶解在含有10%β-巯基乙醇（BME）和玻璃珠的1 mL冷RLT缓冲液中。将心脏和肌肉组织溶解在含有氧化锆珠的1mL冷RLT缓冲液+10%BME中。使用Precellys 24组织匀浆器（Bertin Instruments，马里兰州罗克维尔）以5500-6000 rpm的速度用珠子匀浆组织30秒，并在4°C下以12，000rpm离心4分钟以除去未溶解的组织和珠子。使用RNeasy迷你试剂盒（#74104，Qiagen，Hilden，德国）提取脑和肝组织，并使用RNeasy纤维组织迷你试剂盒（#74704，Qiagen）提取用于心脏和肌肉组织。
定量逆转录聚合酶链反应（RT-qPCR）用于测定和验证Rap1中改变转录本的表达基/基小 鼠。使用高容量cDNA逆转录试剂盒（#4368814，赛默飞世尔科技）将总RNA转化为cDNA。使用SYBR绿色PCR预混液（#4364344，赛默飞世尔科技）和引物（Eurofins Genomics）进行cDNA扩增。引物序列如下：
Ly6d前锋： 5'-CAAAACCGTCACCTCAGTGGAG-3'
Ly6d反向： 5'-AGCCATAACAGTGAGCAGGC-3'
Actb前锋： 5'-GCTTCTAGGCGGACTGTTACTGA-3'
Actb反向： 5'-GCGCAAGTTAGGTTTTTTGTCAAA-3'
加普德前锋： 5'-ATGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3'
Gapdh反向： 5'-CCTGCTTCACCACCTTCTTGA-3'
所有反应一式三份进行，并使用 Bio-Rad CFX Connect 实时系统进行定量 PCR。ΔCt通过将基因表达标准化为β肌动蛋白（Actb）或甘油醛3-磷酸脱氢酶（Gapdh）来确定值。为了计算mRNA表达的倍数差异，公式[2（-ΔΔCt）]被使用。
统计分析
GraphPad Prism 8.0（GraphPad Software， Inc.）用于统计分析。数据表示为平均值±平均值的标准误差 （SEM） 或标准偏差 （SD）。P值<0.05表示显著差异。Gehan-Breslow-Wilcoxon检验用于确定用于寿命分析的Kaplan-Meiier生存曲线的差异。对于S5表中的肿瘤发病率数据，使用Fisher精确检验和Cochran-Armitage检验（趋势卡方检验）比较WT和Rap1敲入小鼠的肿瘤发病率。
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说唱1I312R 不影响 TRF2 的蛋白质和 mRNA 表达。
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S1 图说唱1I312R 不影响 TRF2 的蛋白质和 mRNA 表达。
（A-B）WT和Rap1中的Rap1和Trf2mRNA表达水平基/基通过RT-qPCR.n= 5个原代MEF细胞系，用于每个基因型，具有技术重复。（C） WT，Rap1全细胞裂解物上的蛋白质印迹基/WT和说唱1基/基主要 MEF。定量显示基因型之间的TRF2蛋白水平没有显着差异。P值不显著（N.S.），由单因素方差分析与学生未配对t检验（A-B）和Tukey事后比较（C）确定。数据是每个基因型±SEM.n= 5个原代MEF细胞系的平均值。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010506.s001
（提夫）
S2 图长时间培养后原代人成纤维细胞中的RAP1水平和胞质分布。
（一）在早期（E）和晚期（L）传代（非分裂）使用源自原代BJ成纤维细胞的全细胞裂解物对RAP1和TRF2水平进行代表性蛋白质印迹分析。（乙-丙）在早期（E）和晚期（L）传代中使用来自BJ成纤维细胞的细胞质（C）和核（N）级对RAP1和TRF2水平进行代表性蛋白质印迹分析。层粘连蛋白A和微管蛋白分别是核蛋白和胞质蛋白。显示了RAP1和TRF2在每个馏分中的百分比分布。（四）通过使用生物素偶联端粒探针进行端粒限制性片段分析，测量 HeLa、HeLa 1.2.11、早期传代 （E） 和晚期传代 （L） BJ 成纤维细胞的端粒长度。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010506.s002
（提夫）
S3 图在Rap1敲入小鼠中未检测到端粒功能障碍。
（一）Q-FISH分析在WT和Rap1上的代表性中期扩散基/基显示 DAPI（灰色）和端粒信号（红色）的主要 MEF。图中显示了端粒信号强度的定量测量（右图）。条形表示标准偏差±平均值。 比例尺：20μm。（乙-丙）使用端粒FISH（红色）和抗γH2AX（绿色）在原代MEF（B）和小鼠脾脏组织（C）上进行IF-端粒FISH分析TIF的代表性图像。n= 172 WT MEF，n= 134Rap1基/基MEFs，n = ~300只脾细胞每只小鼠分析。WT 和Rap1基/基小鼠分别为 20、22 和 24 个月。未观察到具有≥3个TIF的细胞。WT 和Rap1 之间的 P 值基/基并不重要。数据是平均± SEM。 比例尺：5μm。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010506.s003
（提夫）
S4 图在Rap1敲入小鼠中未检测到细胞衰老。
主要WT和Rap1的代表性图像（左）基/基用 SPiDER-β-gal（绿色）和 DAPI（蓝色）染色的 MEF。至少捕获了8张包含~300个细胞的图像。右侧面板显示了单个图像的绘制数据点，每个数据点都派生自图像。MEF在通道5。比例尺：50μm。数据是平均± SEM。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010506.s004
（提夫）
S5 图基因转录和本体在Rap1敲入雌性小鼠中被改变。
通过Rap1的肝脏（A）、大脑（B）、心脏（C）和骨骼肌（D）的微阵列分析确定的显著改变的转录本的基因本体分类基/基与WT小鼠相比。n = 每个基因型 3 只小鼠。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010506.s005
（提夫）
S6 图Rap1敲入骨髓、脾脏和BMDM在体内显示出轻度的NF-κB活化。
（一）直方图表示来自WT（蓝色直方图）或Rap1的骨髓（左）和脾细胞（右）中的GFP阳性细胞（GFP+）群基/基（红色直方图）小鼠在RelA-EGFP报告基因背景中通过流式细胞术分析。GFP+细胞的设门由虚线表示。n= 5 WT 和n= 3说唱1基/基小 鼠。（二）条形图显示NF-κB活化，由WT和Rap1衍生的核提取物中表达的p65水平决定基/基使用NF-κB p65转录因子测定试剂盒的小鼠BMDM。P值使用学生的未配对t检验确定。所有数据均为平均值± SEM。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010506.s006
（提夫）
S7 图细胞因子和趋化因子在女性和男性Rap1敲入血清、BMDM 和组织中的表达。
（一）血清中细胞因子和趋化因子的总体水平显着升高（n = 5 WT 女性，10Rap1基/基女性、7 名 WT 男性和 5名 Rap1基/基雄性小鼠），BMDM（n = 2 WT 雌性，2Rap1基/基女性，每个基因型 1 名男性）和脑组织（n = 5 WT 女性，9 名女性Rap1基/基，每个基因型 2 名男性）源自Rap1基/基相对于WT使用多重细胞因子分析确定。P值由双向方差分析确定。（二）包括IL-12p40、IL-17和IL-18在内的单个细胞因子在Rap1血清中升高基/基.图表显示了源自Rap1 的细胞因子的倍数表达基/基P值由学生的不配对t检验确定。（三）细胞因子在Rap1中的折叠表达基/基血清相对于年轻和老年小鼠WT血清（n = 每个基因型3个年轻/中年女性，2个老年WT女性，7个老年KI / KI雌性，每个基因型2个年轻/中年雄性，每个基因型3个老年雄性小鼠）。（D-E）脾脏中的单个细胞因子/趋化因子CCL3（n = 6 WT女性，6Rap1基/基女性、3 名 WT 男性和 3名 Rap1基/基男性）和肺部的 RANTES（n=6 名 WT 女性，6名 Rap1基/基女性、3 名 WT 男性和 3名 Rap1基/基男性）在说唱中升高1基/基与WT组织相比。P 值由学生的未配对t 检验确定。数据是所有图形中± SEM 的平均值。在 A-E 中将 WT 设置为 1，KI/KI 值显示为相对于每个图形的平均 WT 值。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010506.s007
（提夫）
S8 图Rap1敲入小鼠显示出代谢功能障碍的迹象。
（公元至日）用标准食物喂养的小鼠。随着时间的推移，每周评估女性和男性的体重。每周对女性和男性的食物摄入量进行量化。n = 8 个 WT 女性，n = 6个 Rap1基/WT女性，n = 5说唱1基/基女性。n = 每个基因型有 5 名男性。（E-H）喂食高脂肪高糖（HFHS）饮食的小鼠。从~2个月大开始，每周评估女性和男性的体重。在2-4个月大时测量女性和男性的空腹血糖。n = 6 个 WT 女性，n = 7个说唱1基/WT女性，n = 4说唱1基/基女性。n = 5 个 WT 男性，n = 3个说唱1基/WT男性，n = 5说唱1基/基男性。食物摄入量p值通过单因素方差分析进行评估。对所有其他实验进行具有事后火鸡检验的双向方差分析。所有数据均为平均值± SEM。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010506.s008
（提夫）
S9 图Rap1敲入小鼠在与学习/记忆相关的行为上没有显着差异。
（一）明暗盒测试，n=13 WT（8名女性和5名男性）和n = 11 Rap1基/基（5只雌性和6只雄性）小鼠。p = 0.170（基因型/性别相互作用）。（二）Y 迷宫测试显示Rap1 中迷宫新臂的交替百分比基/基相对于WT小鼠，n = 13 WT（8只雌性和5只雄性）和n = 12 Rap1基/基（5只雌性和6只雄性）小鼠。p = 0.917。（三）水 T 迷宫测试显示Rap1 中不正确手臂条目的百分比基/基相对于WT同窝。n= 8 WT（3 名女性和 5 名男性）和n = 13 Rap1基/基（9只雌性和4只雄性）小鼠。p = 0.190。在R软件中使用基因型和性别作为因子的2元方差分析分析行为结果，并在适当的情况下包括波和体重的协变量。所有数据均为平均值± SEM。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010506.s009
（提夫）
S10 图炎症小体通路成分在Rap1敲入脑组织中的表达增加。
蛋白质印迹（左图）和条形图定量（右图）的代表性图像显示了炎症小体途径成分的表达：前半胱天冬酶-1（前半胱天冬酶-1，n= 6 WT 雌性、6 个 KI/KI 雌性、7 个 WT 雄性、6 个 KI/KI 雄性）、裂解的半胱天冬酶-1（CASP-1p20，n= 6 个 WT 雌性、6 个 KI/KI 雌性、7 个 WT 雄性、6 个 KI/KI 雄性）、NEK7（n=3 个 WT 雌性、 6 名 KI/KI 女性、7 名 WT 男性、6 名 KI/KI 男性）、亲 IL-18（n= 3 名 WT 女性、6 名 KI/KI 女性、7 名 WT 男性、6 名 KI/KI 男性）、IL-18（活跃，n= 3 名 WT 女性、6 名 KI/KI 女性、7 名 WT 男性、7 名 KI/KI 男性）、前 IL-1β（n= 4 名 WT 女性、4 名 KI/KI 女性、6 名 WT 男性、 5 KI/KI 雄性）和源自 WT 和Rap1 的脑组织裂解物中的 GAPDH（蛋白质负载对照）基/基.每个点代表一个生物重复，并且在绘制图形之前对技术重复进行平均。雌性小鼠（A-B）和雄性小鼠（C-D）。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010506.s010
（提夫）
S11 图Rap1突变敲入和Rap1敲除肝组织中重叠的失调基因。
维恩图显示 Rap1 中的失调基因 null 与 WT 肝脏（蓝色），在Rap1中基/基与仅WT肝脏（粉红色）相比，以及在Rap1 null和Rap1中均失调的基因基/基肝脏（重叠）。列出了重叠的基因。上调基因为红色，下调基因为蓝色。来自Rap1无效肝脏组织的数据来自引用的来源（上图）。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010506.s011
（提夫）
S1 表。基因转录在Rap1 中被改变基/基组织。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010506.s012
（三十）
S2 表。遗传途径在Rap1中被改变基/基组织。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010506.s013
（三十）
S3 表。未经处理和LPS刺激的WT和Rap1敲入BMDM中的细胞因子/趋化因子表达。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010506.s014
（三十）
S4 表。WT和Rap1敲入血清和组织中的细胞因子/趋化因子表达。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010506.s015
（三十）
S5 表。Rap1敲入小鼠的肿瘤发生率和大体异常增加。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010506.s016
（三十）
确认
我们衷心感谢Josephine Egan博士，Deborah Croteau博士，Jennifer O'Connell博士，Beverly Baptiste博士和Erik Martin博士的有益讨论和建议，以及Mustafa N. Okur博士，Christopher Dunn博士，Susan Wu博士和Michael Eckhaus博士，Quia Claybourne女士和Lauren Wheatley女士的技术支持。
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