单纯疱疹病毒被膜蛋白pUL21是衣壳内病毒基因组保留所必需的
伊桑·托马斯，迈克·博塞特，布鲁斯·班菲尔德
发布时间：2022 年 11 月 14 日
抽象
在病毒粒子形态发生期间，单纯疱疹病毒核衣壳通过称为核出口的过程从核质转运到细胞质，其中病毒粒子组装的最后阶段发生。与核出口耦合的是一种鲜为人知的质量控制机制，它优先选择含有基因组的C衣壳，而不是缺乏基因组的A和B衣壳，以转运到细胞质。我们和其他人报告说，感染了被膜蛋白pUL21缺失的HSV菌株的细胞在感染细胞的细胞质中积累了空的A衣壳和C衣壳。定量显微镜实验表明，C衣壳优先被选择包封在内核膜上，并且在感染pUL21突变体的细胞中核完整性保持完整，这促使对A衣壳在细胞质中的积累有其他解释。与野生型（WT）对应物相比，在感染pUL21突变体的细胞核中也发现了更多的A-衣壳，这表明pUL21可能需要pUL21才能在衣壳内实现最佳基因组包装或基因组保留。为了支持这一点，与WT感染相比，在pUL21突变体感染期间，更多的病毒基因组过早释放到细胞质中，并导致细胞质DNA传感器的激活增强。WT和pUL21突变衣壳的质谱和蛋白质印迹分析显示，已知的pUL21结合蛋白pUL16与pUL21突变衣壳的关联增加，表明pUL16与衣壳的过早和/或增强关联可能导致衣壳不稳定。进一步支持这一观点，从pUL21突变株中删除pUL16挽救了衣壳内的基因组保留。综上所述，这些发现表明pUL21调节pUL16添加到核衣壳中，并且过早和/或过度添加pUL16会损害衣壳内的HSV基因组保留。
作者摘要
pUL21是一种保守的多功能α疱疹病毒蛋白，参与感染的细胞间传播，衣壳沿微管的运输以及病毒和宿主蛋白磷酸化状态的调节。因此，pUL21控制各种过程，例如衣壳的核排出和细胞脂质运输。这项研究为HSV-1和HSV-2 pUL21活性提供了额外的见解，并表明，通过结合pUL16，pUL21可以防止pUL16过早地与核衣壳相互作用，否则会导致衣壳不稳定和病毒基因组过早抛射。因此，防止pUL21与pUL16的相互作用可能被证明是干扰病毒粒子组装的有用策略。
引文：托马斯 ECM，博塞特 M，班菲尔德 BW （2022） 单纯疱疹病毒被膜蛋白 pUL21 是衣壳内病毒基因组保留所必需的。公共科学图书馆病理18（11）： e1010969. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1010969
编辑 器：Neal A. DeLuca，美国匹兹堡大学医学院
收到：八月 2， 2022;接受：2022 年 11 月 2 日;发表：11月 14， 2022
版权所有：? 2022 托马斯等人。这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。
数据可用性：所有相关数据都在手稿及其支持信息文件中。
资金：这项工作得到了加拿大卫生研究院运营补助金162162，加拿大自然科学和工程研究理事会发现补助金04249-2018和加拿大创新基金会对BWB的16389的支持。ECMT得到了皇后大学的R. Samuel McLaughlin奖学金的部分支持。资助者在研究设计、数据收集和解释或提交作品发表的决定中没有任何作用。
竞争利益：提交人声明不存在相互竞争的利益。
介绍
HSV1型和2型是高度流行的人类病原体[1，2]。病毒基因组合成、衣壳组装和基因组包装成衣壳发生在受感染细胞的细胞核中。衣壳组装始于形成一个球形的双壳结构，称为前衣壳[3]。外壳由主要衣壳蛋白VP5的150个戊子和11个六角质组成，由连接六角质和五角蛋白的蛋白质VP23和VP19c组成的三重物，以及一个由pUL6十二聚体组成的衣壳门户，通过该链包装新生基因组[3]。内壳为衣壳支架，由大小支架蛋白pUL26和pUL26.5构成。基因组包装是由终止酶复合物与门户的关联引发的，该门户触发信号转导事件，导致pUL26蛋白酶活性的激活和支架的随后释放。这导致衣壳角化，因为基因组被包装到衣壳中。成功的基因组包装会产生含有基因组的衣壳，称为C-衣壳。除C-衣壳外，衣壳成熟的两种副产物A-和B-衣壳也在受感染的细胞核中产生。B衣壳被认为启动了支架蛋白的蛋白水解裂解，并在不参与终止酶复合物的情况下变得棱角化[4，5]。因此，B衣壳是缺乏基因组DNA的终端产物，含有被困在衣壳内的小支架蛋白VP22a的裂解形式。A衣壳的产生是由于基因组包装事件不成功或衣壳无法保留病毒基因组[4-6]。无论其来源如何，A衣壳都是有棱角的和空的，其内部不存在基因组DNA或支架蛋白。一般来说，与C-衣壳相比，A衣壳在感染细胞中的丰度较低，因为包装后利用多种机制将病毒基因组保留在衣壳内[3]。
衣壳内病毒基因组保留研究最多的因素之一是衣壳顶点特异性成分（CVSC）蛋白pUL17、pUL25和pUL36[7-12]。这些蛋白质与衣壳顶点相邻的三联体结合，是稳定衣壳结构以抵御包装基因组施加的高内部压力所必需的[7，12-15]。虽然CVSC蛋白见于A、B和C衣壳，但C衣壳上更丰富[14，16]。pUL17对于基因组包装以及pUL25和pUL36在衣壳中的高效募集非常重要[12，14]。衣壳顶点上的pUL25可防止衣壳结构在包装后破裂[17，18]。此外，最近检查pUL25及其β和γ疱疹病毒同系物的冷冻电镜研究表明，与衣壳门相邻的pUL25被认为延伸到门上，形成一个五聚体门帽，在基因组包装后堵塞衣壳门[14，19-21]。pUL36对于衣壳成熟期间衣壳的募集和门静脉塞构象的适当性很重要[9，14，22]。除CVSC蛋白外，衣壳还具有二硫键，可共价连接衣壳蛋白[23-25]。损害这些复合物会导致戊子、三重体和CVSC蛋白从衣壳中解离，并从衣壳中丢失基因组。最终，将基因组成功包装并保留到新组装的衣壳中只是HSV衣壳在病毒粒子成熟过程中必须面对的一个障碍。
基因组包装后，C衣壳必须从细胞核转运到细胞质，才能进入病毒粒子组装的最后阶段[26]。然而，衣壳太大而无法通过核孔复合物。因此，衣壳经历了一个在整个疱疹病毒科家族中保存的特殊过程，称为核出口[26，27]。核出口是一个复杂且高度调节的过程，其中C-衣壳萌芽到核周空间，获得来自内核膜的初级包膜，然后将该包膜与外核膜融合，从而将衣壳释放到细胞质中。核排出还与一种知之甚少的质量控制机制相结合，该机制优先选择C衣壳，而不是A和B衣壳，在核膜内进行初级包络[28]。
衣壳相关被膜蛋白pUL21是在核排出中起作用的几种病毒蛋白之一，在α疱疹病毒亚家族中保守[29-32]。pUL21在成熟的HSV病毒粒子中形成三方复合物，与被膜蛋白pUL16相互作用，pUL16又与pUL11相互作用[33-37]。在感染的早期阶段，pUL21与HSV-1、HSV-2和PRV感染细胞中衣壳转运到细胞核有关，也是最佳病毒基因表达所必需的[31，38-40]。在感染晚期，pUL21调节核出口、被盖形成、感染的细胞间扩散，并激活神经酰胺转运蛋白CERT[29，32，33，35，41–44]。尽管对几种pUL21活性进行了大量研究，但pUL21在衣壳上发挥的功能尚未得到彻底研究。该实验室和其他实验室先前的研究表明，HSV-1和HSV-2 pUL21突变菌株在感染细胞的细胞质中积累了A-和C-衣壳[42，45]。在WT病毒感染的细胞中，细胞质中发现的大多数衣壳是C-衣壳，而A衣壳几乎只存在于细胞核中[3，16]。目前，尚无解释A-衣壳在感染pUL21缺陷菌株的细胞质中的积累。
至少有三种假设可以解释A-衣壳在感染pUL21突变体的细胞中的细胞质积累。首先，感染pUL21突变菌株的细胞中的核完整性可能会被破坏，导致衣壳从核质不加选择地泄漏到细胞质中。其次，优先选择用于核出口的C-衣壳可能需要pUL21，删除pUL21可能导致选择A-衣壳用于核出口。最后，可能是病毒基因组没有稳定地包装成pUL21突变衣壳，导致基因组在到达细胞质后过早地从衣壳中排出。本研究的目的是评估这三个假设。
结果
UL21的缺失导致感染细胞中核和细胞质A-衣壳的丰度增加
HSV-1和HSV-2 pUL21突变体（Δ21）在感染细胞的细胞质中积累A-衣壳和C衣壳[42，45]。尽管已经记录了这种表型，但尚未对HSV-1和HSV-2 Δ21感染细胞中的A衣壳进行定量。
为了量化Δ21感染细胞中核A衣壳的数量，使用来自HSV-1和HSV-2的多种WT和Δ21突变菌株感染Vero细胞进行透射电子显微镜（TEM）分析（图1A-1F）。与WT感染细胞相比，感染HSV-1和HSV-2 Δ21突变体的细胞具有更高的核A衣壳百分比（图1G）。对HSV-2（186，SD90e，HG52）和HSV-1（F，KOS）菌株进行未配对t检验，以比较Δ21感染与WT感染中核A衣壳的百分比。与相应的WT感染相比，HSV-2 186和SD90e以及HSV-1 F和KOS的Δ21突变体在感染细胞中存在的核A衣壳百分比显着更高。HSV-2 HG52 Δ21突变体与WT病毒之间没有显著差异（p = 0.0846），尽管Δ21感染细胞中核A衣壳的百分比较高。
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图1.细胞核和细胞质A衣壳在HSV WT和Δ21菌株中的积累。
Vero细胞感染HSV-1或HSV-2 WT病毒或其相应的Δ21突变体，MOI为3。在18 hpi下，固定样品并制备TEM。获得每种HSV-1和HSV-2菌株的显微照片，并定量感染细胞核和细胞质中的WT和Δ21衣壳。A-F）HSV-2 SD90e WT（A、B 和C）与其 Δ21 突变体（D、E 和F）的显微照片示例比较。如Δ21面板（E和F）所示，与WT菌株（B和C）相比，A衣壳（白色箭头）丰度。黑色箭头表示C衣壳，白色箭头表示包封的C衣壳。2μm 比例尺适用于面板A和D。图B和E是图A和D的三倍放大图像。图C和F是图B和E的三倍放大图像。G）描述了感染HSV WT和Δ21菌株的细胞中核A-衣壳的定量（每种条件n = 9-12张显微照片）。H）描述了感染HSV WT和Δ21菌株的细胞中细胞质A-衣壳的定量（每种条件n = 11-14张显微照片）。一）HSV-1 F WT和Δ21细胞外病毒粒子的显微照片示例。如 Δ21 突变显微照片所示，与 WT 菌株相比，Δ21 细胞外病毒粒子（白色箭头）中含有丰富的 A 衣壳，WT 菌株在细胞外病毒粒子（黑色箭头）中主要具有 C-衣壳。J）描绘了HSV-1 F WT和Δ21细胞外病毒粒子内A-衣壳的定量（每种条件n = 11-14张显微照片）。在Δ21突变体和WT病毒之间进行非配对t检验。*、**、*** 和 **** 分别表示 p ≤ 0.05、p ≤ 0.01、p ≤ 0.001 和 p ≤ 0.0001。ns = 不显著。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1010969.g001
TEM显微照片也用于量化感染细胞细胞质中A衣壳的数量。测定感染HSV-2（186，SD90e，HG52）和HSV-1（F，KOS）WT病毒的细胞中细胞质A-衣壳的百分比，以及它们相应的Δ21突变体（图1H）。与WT感染相比，HSV-2 186和SD90e以及HSV-1 F和KOS的Δ21突变体在细胞质中存在的A衣壳百分比显着更高。HSV-2 HG52 Δ21突变体和WT病毒之间没有显着差异（p = 0.2701），尽管Δ21感染细胞中细胞质A-衣壳的百分比较高。
此外，TEM显微照片用于量化包装在细胞外病毒粒子中的A-衣壳的数量。先前研究对导致核包膜破裂以及A、B和C衣壳渗漏到细胞质中的PRV突变体进行了研究，发现这些突变体有效地将A和B衣壳掺入细胞外病毒粒子中[43，44]。这表明在PRV感染期间，C衣壳不被优先选择进行二次包封。我们量化了与质膜相关的HSV-1 F WT和Δ21细胞外病毒粒子中A-衣壳的百分比（图1I）。有趣的是，与PRV类似，在WT和Δ21细胞外病毒粒子中观察到A衣壳，并且与WT菌株相比，观察到A-衣壳更频繁地包装成Δ21细胞外病毒粒子（图1J）。
这些数据表明，与WT感染细胞相比，感染来自所有HSV-1菌株的Δ21突变体的细胞和三分之二的HSV-2菌株具有显着更多的核和细胞质A衣壳。此外，数据表明HSV-1 WT和Δ21细胞质A衣壳很容易包膜，并且在没有pUL21的情况下，在细胞外病毒粒子中发现了更多的A衣壳。
Δ21感染细胞中的核完整性保持完整
迄今为止描述的数据表明，在没有pUL21的情况下，有更多的核，细胞质和细胞外A衣壳，表明衣壳内的基因组保留受损。然而，如果在 Δ21 感染期间核包膜完整性受损，则可能发生 A 衣壳从核质被动泄漏到细胞质中。为了评估Δ21感染期间的核完整性，Vero细胞感染了HSV-1 KOS WT或Δ21。在18 hpi下，固定细胞，用皂苷或Triton X-100（TX-100）透化，并染色主要衣壳蛋白VP5。TX-100可透化质膜和核包膜，而皂苷可透化质膜，但不透化核包膜。因此，如果核包膜完整，皂苷透化细胞将仅显示细胞质VP5信号，因为用于VP5检测的抗体无法进入核质。在用TX-100透化的WT和Δ21感染细胞中观察到细胞质和细胞核VP5染色，而在用皂苷透化的WT和Δ21感染细胞中仅观察到细胞质VP5信号（图2）。这些数据表明，在WT和Δ21感染细胞中，核包膜的完整性保持完整，并强烈表明A衣壳在Δ21感染细胞的细胞质中的积累不是由于感染期间核包膜完整性的丧失。为了进一步支持这一结论，我们未能鉴定出Δ21感染细胞细胞质中的B衣壳积累（图1A-1F），反对这些细胞中核包膜屏障功能的严重扰动。
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图2.核完整性在ΔUL21感染细胞中保持完整。
Vero细胞感染HSV-1 KOS WT或Δ21病毒，MOI为0.1。在18 hpi下，固定细胞，用Triton X-100（TX-100）或皂苷透化，并染色主要衣壳蛋白VP5。用TX-100透化的WT和Δ21感染细胞在细胞核和细胞质中具有VP5衣壳信号。用皂苷透化的WT和Δ21感染细胞具有细胞质VP5衣壳信号（箭头），但没有核VP5衣壳信号（箭头），表明感染细胞中的核包膜是完整的。图像代表每个条件的三个生物学重复。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1010969.g002
在没有pUL21的情况下，优先选择用于核出口的C衣壳
Δ21感染细胞的细胞质中A-衣壳数量增加的另一种可能的解释是，在核出口过程中C-衣壳选择性被破坏，使得A衣壳有效地获得初级包膜，使其能够传递到细胞质。为了解决这个问题，我们通过TEM量化了初级包膜病毒粒子（PEV）（图3A）。如果C-衣壳选择性在没有pUL21的情况下起作用，则应优先在PEV中发现C-衣壳。PEV中的衣壳被评分为A衣壳，B衣壳，C衣壳或未识别（即无法明确识别为A，B或C的衣壳）。当比较HSV-1（F，KOS）和HSV-2（186，SD90e，HG52）Δ21突变体与其相应的WT病毒时，PEV中C衣壳的百分比差异很小（图3B）。事实上，大多数Δ21菌株在PEV中具有更多的C衣壳。这可能是由于PEV在核周空间中积累，这是先前在没有pUL21的情况下观察到的[30]。然而，这些分析表明，在没有pUL21的情况下，C衣壳对核排出的选择性仍然起作用，并且增强的A衣壳用于初级包封的选择不太可能是A-衣壳在细胞质中积累的原因。
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图3.HSV WT 和 Δ21 感染细胞中的核周 C-衣壳丰度。
Vero细胞以3的MOI感染HSV-1或HSV-2 WT菌株或其相应的Δ21突变体，持续18小时。然后将细胞固定并准备用于TEM。获得每种HSV-1和HSV-2菌株的显微照片，以量化PEV中的WT和Δ21衣壳。一）含有源自HSV-2 SD90e WT及其Δ21突变体和HSV-1 F WT及其Δ21突变体的PEV的显微照片示例。显示的比例尺为 500nm，适用于所有面板。二）定量感染HSV WT和Δ21菌株的细胞的PEV内的C-衣壳（每种条件n = 11-27张显微照片）。每种情况共分析了7-158个PEV。由于PEV是一种瞬时组装中间体，并且在每个显微照片中不一致，因此无法进行统计分析。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1010969.g003
在没有pUL21的情况下，衣壳内的病毒基因组保留会受到影响
为了评估衣壳中的WT和Δ21基因组保留，我们使用点击化学检查了感染早期阶段的基因组喷射。在感染早期，病毒粒子包膜与细胞膜融合后，含有病毒基因组的衣壳被转运到核孔复合物，基因组通过核孔复合物沉积到细胞核中。然而，如果衣壳不能保留其基因组，它们就会过早地被喷射到可以量化的细胞质中。HSV-1 KOS WT和Δ21菌株在核苷类似物EdC存在下繁殖，EdC被掺入后代病毒粒子的基因组中。然后使用含有EdC标记基因组的病毒感染在玻璃底培养皿上生长的Vero细胞。以0至4 hpi之间的间隔固定细胞，并进行点击化学以荧光标记从衣壳中弹出的病毒基因组中的EdC（图4A）。重要的是，衣壳中包含的EdC标记的基因组没有通过点击反应进行荧光标记（图4B）。对代表单个病毒基因组的荧光点进行定量，以确定每个细胞衣壳释放的核（图4C）和细胞质（图4D）病毒基因组的数量。与WT相比，Δ21感染细胞传递到细胞核的病毒基因组在1至4 hpi之间显着减少（图4C）。此外，与WT相比，Δ21感染细胞在细胞质中具有1至4 hpi之间的非包膜病毒基因组明显更多（图4D）。这些发现表明HSV-1 KOS Δ21衣壳损害了病毒基因组保留，并可能解释了在感染后期Δ21感染细胞的细胞质中观察到的A-衣壳的丰度。
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图4.HSV-1 KOS WT和Δ21衣壳在早期感染期间的基因组保留比较。
Vero细胞以0.1的MOI感染，将含有EdC的HSV-1 KOS WT或Δ21病毒掺入其基因组。感染后的早期（0-4 hpi）固定感染的细胞，并且使用点击化学标记从衣壳中喷射的基因组。一）WT和Δ21感染细胞的代表性图像为4 hpi，使用点击化学标记喷射的病毒基因组。比例尺为20μm。标记的基因组被鉴定为在细胞质（箭头）和受感染细胞核（箭头）中看到的强烈点状。对斑点进行定量，并将其数量除以细胞总数，以确定每个细胞的核基因组和细胞质基因组。二）使用EdC标记的HSV-2 186 WT或Δ21进行对照实验，产生mCh标记的核衣壳（MOI 3），表明点击化学不会在2 hpi下标记衣壳内的基因组。箭头指向EdC标记的点状点，毗邻mCh标记的衣壳。请注意，大多数mCh标记的衣壳不与EdC信号共定位。（三））显示了每个细胞在 0-4 hpi 以上的核病毒基因组 （vDNA） 的定量（每个时间点和条件 n = 21 张图像）。D）显示了每个细胞在 0-4 hpi 上的细胞质基因组 （vDNA） 的定量（每个时间点和条件 n = 21 张图像）。在Δ21突变体和WT病毒之间进行3次生物学重复的未配对t检验。和 **** 分别表示 p ≤ 0.001 和 p ≤ 0.0001。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1010969.g004
作为分析其他HSV-1和HSV-2 Δ21突变体中病毒基因组过早射出的补充方法，研究了cGAS/STING通路的激活。当病毒基因组过早地喷射到细胞质中时，可通过cGAS/STING途径的组分检测到，导致细胞质中的干扰素调节因子3（IRF-3）磷酸化，随后易位到细胞核[46，47]。因此，IRF-3的核易位可作为病毒基因组过早射入感染细胞细胞质的替代措施[47，48]。由于HSV-2 186 Δ21病毒存在严重的生长缺陷[42]，这些实验中未对该菌株进行研究。T12细胞，延长生命的人成纤维细胞，用于这些实验，因为与Vero细胞不同，它们可以产生干扰素，因此具有完整的IRF-3信号通路。T12细胞以MOI为3感染WT或Δ21病毒。通过共聚焦显微镜在WT和Δ21感染细胞中定量具有核IRF-3的细胞（图5A）。在2、4和6 hpi下，HSV-1 F和KOSΔ21感染与各自的WT感染相比，具有核IRF-3的细胞明显更多（图5B和5C）。此外，在HSV-1 F和KOS Δ21感染期间，IRF-3向感染细胞核的易位比各自的WT感染早2小时发生。在 2、4 和 6 hpi 下，与 WT 相比，HSV-2 SD90eΔ21 感染也显示出具有核 IRF-3 的细胞明显更多（图 5D）。应该注意的是，几种通过IRF-3发出信号的不同模式识别受体可以在HSV感染时被激活并检测HSV病毒粒子[49]。尽管存在这种限制，但总的来说，我们的结果表明，Δ21突变体过早地将更多的病毒基因组喷射到细胞质中（图4D和5A-5D），并将更少的基因组传递到感染细胞的细胞核中（图4C）。
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图5.在HSV WT和Δ21菌株感染的早期阶段检查IRF-3核定位。
T12细胞以MOI为3感染，在冰上接种一小时后，将细胞在含有50μg/ ml环己酰亚胺的培养基中孵育以抑制蛋白质合成。将感染的细胞固定在0，2，4和6 hpi，染色IRF-3并通过共聚焦显微镜成像。一）HSV-1 KOS WT和Δ21感染细胞的代表性图像。IRF-3 定位为 0、2、4 和 6 hpi。核 IRF-3 由白色箭头表示。用poly I：C转染6小时的T12细胞的代表性图像显示为阳性对照。N = 每个时间点和条件 33–37 张图像。比例尺为20μm，适用于所有面板。二）定量感染HSV-1 KOS WT和Δ21菌株的细胞中的核IRF-3（每个时间点和条件n = 33-36张图像）。（三））定量感染HSV-1 F WT和Δ21菌株的细胞中的核IRF-3（n = 36个图像/每个时间点和条件）。D）定量感染HSV-2 SD90e WT和Δ21菌株的细胞中的核IRF-3（每个时间点和条件n = 36张图像）。进行非配对t检验以比较来自三个生物学重复的WT病毒的Δ21突变体中每个时间点的细胞与核IRF-3的百分比。表示 p ≤ 0.0001。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1010969.g005
在没有pUL21的情况下，核衣壳的组成会改变
先前关于衣壳蛋白和被盖蛋白突变病毒的研究报告了衣壳和被皮组成的变化[7，14，50–53]。为了了解Δ21衣壳损害基因组保留的机制，我们通过质谱研究了衣壳组成。排除常见污染物后，在HSV-1 KOS WT和Δ21核A-，B-和C-衣壳制剂中共鉴定出265种独特的细胞和病毒蛋白（S1表）。使用主要衣壳蛋白VP5的总谱数丰度对不同生物学重复中衣壳丰度以及WT和Δ21菌株之间的变异进行归一化，每个衣壳正好有955个拷贝[54]。接下来，确定每种鉴定蛋白质的百分比变化，并在三个生物学重复中对Δ21 A-，B-和C-衣壳与WT A-，B-和C-衣壳进行比较。我们将显着的蛋白质变化定义为光谱计数丰度增加或减少20%以上。在265种鉴定蛋白中，与WT衣壳相比，Δ21 A、B和C衣壳的被膜蛋白pUL16分别提高了9.68%、96.52%和161.75%。pUL16是pUL21的已知结合伴侣，有趣的是，它与衣壳的关联被认为仅发生在感染细胞的细胞质中[35，55]。已知CVSC对衣壳稳定性和基因组保留至关重要[14]。将Δ21衣壳与WT衣壳进行比较时，CVSC蛋白pUL17和pUL25的含量相似。有趣的是，与WT A衣壳相比，Δ21 A衣壳上的CVSC蛋白pUL36降低了37.19%（S1表）。与pUL25不同，pUL36与基因组保留无关，与WT感染的细胞核相比，pUL36突变体具有相似数量的核A、B和C衣壳[14]。鉴于此，在没有pUL21的情况下，pUL36水平的改变不太可能损害衣壳内的基因组保留。此外，在没有pUL21的情况下，没有符合我们定义标准的细胞蛋白脱颖而出，成为损害衣壳基因组保留的候选者。因此，我们接下来通过蛋白质印迹分析检查了各种HSV-1和HSV-2 Δ21衣壳上的pUL16是否增加。
pUL16水平升高与HSV-1和HSV-2核衣壳有关，但无pUL21
通过20-50%蔗糖梯度超速离心从感染细胞中分离出核衣壳，以分离A-、B-和C-衣壳（图6A）。将 Δ21 A、B 和 C 衣壳的光散射带与 WT A、B 和 C 衣壳的光散射带进行比较时，未发现明显差异。对蔗糖梯度进行分馏，对含衣壳的馏分进行SDS-PAGE处理，然后进行银染（图6B）。WT和Δ21衣壳的蛋白质谱没有明显差异。
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图6.HSV WT 和 Δ21 核 A、B 和 C 衣壳的分离和分析。
从感染HSV-1或HSV-2 WT和相应Δ21菌株的Vero细胞中分离出核衣壳。一）在 20–50% 蔗糖梯度中观察到光散射带，用于分离从感染 WT 和 Δ21 HSV-1 KOS 的细胞中分离的 A、B 和 C 衣壳。二）将来自WT和Δ21 HSV-1 KOS感染细胞的含核衣壳梯度组分通过SDS-PAGE凝胶电泳并银染以鉴定与A，B和C衣壳相关的蛋白质。VP5和VP23在所有样品中都清晰可见，而VP22a仅在WT和Δ21 B衣壳级分样品中可见。WT和Δ21 A-、B-和C-衣壳之间没有明显差异。C和D）HSV-1（KOS，F）（分别为三个和两个生物学重复）和HSV-2（186，SD90e）（分别为一个和两个生物学重复）的蛋白质印迹分析。WT 和 Δ21 A、B 和 C 衣壳级分用抗血清探测，在每个面板的右侧指示。分子量标记物（kDa）的迁移位置在每个面板的左侧指示。E）Vero细胞被模拟感染或感染HSV-1 KOS WT或Δ21菌株（MOI 3）。在18 hpi下，使用每个面板右侧指示的抗血清通过蛋白质印迹分析细胞裂解物。分子量标记物（kDa）的迁移位置在每个面板的左侧指示。检查了三个生物学重复。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1010969.g006
然后使用抗血清对VP5、pUL17、pUL25、pUL21和pUL16的反应性进行蛋白质印迹分析WT和Δ21衣壳。使用LI-COR CLx成像仪对印迹进行成像，以评估衣壳蛋白组成的差异。WT和Δ21衣壳负载水平使用从主要衣壳蛋白VP5获得的信号进行归一化。虽然WT和Δ21 HSV-1和HSV-2菌株的A-、B-和C-衣壳中存在的pUL17和pUL25含量有适度波动，但这些波动在菌株之间都不一致（图6C和6D以及表1）。例如，虽然来自HSV-1 F Δ21的A衣壳比亲本WT菌株具有更多的pUL17，但HSV-1 KOS的情况并非如此（图6C）。同样，虽然来自HSV-2 SD90e Δ21的C-衣壳的pUL25低于亲本WT菌株（图6D），但所研究的其他HSV-2和HSV-1菌株的情况并非如此。在分析的所有HSV-1和HSV-2菌株之间一致观察到的衣壳组成的唯一差异是与WT对应物相比，与Δ21衣壳相关的pUL16增加。
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表 1.衣壳相关蛋白的定性分析。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1010969.t001
对这些发现的一个微不足道的解释是，在没有pUL21的情况下，pUL16表达的增加导致pUL16与衣壳的关联增强。为了消除这种可能性，我们检查了Δ21感染细胞中的pUL16表达水平（图6E）。WT和Δ21感染细胞裂解物使用VP5信号强度进行归一化。与WT感染细胞相比，Δ21感染细胞的pUL16含量低38%。这表明pUL16与Δ21核衣壳的相关性增加并不是由于pUL16在Δ21感染细胞中的表达水平升高。
HSV-1 KOS Δ21中UL16的缺失降低了感染细胞中核A衣壳的丰度
我们推断，如果pUL16与Δ21核衣壳的关联增加损害了基因组保留，那么从HSV-1 KOS Δ21菌株中删除UL16将恢复基因组保留。我们使用CRISPR / Cas9诱变构建了两个独立的HSV-1 KOS Δ21 / Δ16突变菌株（HΔ21 / Δ16和EΔ21 / Δ16）。通过TEM分析这些菌株，并在感染细胞核中量化A-，B-和C-衣壳的数量（图7A-7F）。有趣的是，在Δ21/Δ16感染细胞中观察到有限数量的细胞质衣壳，这表明删除UL21和UL16基因的综合效应导致核出口减少。虽然 Δ21 突变体在细胞核中的 A 衣壳数量大约是亲本 WT 菌株的两倍，但 Δ21/Δ16 双突变体的 A 衣壳数量与 WT 菌株无法区分。单因素方差分析显示，至少两种病毒之间核A衣壳的百分比存在显着差异（F（3，46）= 8.95，p<0.001）。Tukey的HSD测试进行多重比较发现，WT和Δ21（p<0.01，95%C.I.= [-15.55，-2.35]），Δ21和HΔ21/Δ16（p<0.001，95%C.I.= [-17.01，-4.27]）以及Δ21和EΔ21/Δ16（p<0.001，95%C.I.= [-17.67，-4.72]）之间，核A-衣壳的平均百分比显着不同。WT和HΔ21/Δ16（p = 0.886）的核A衣壳百分比无显著差异，WT和EΔ21/Δ16（p = 0.781）之间无显著差异（图7G）。此外，我们确认HΔ21 / Δ16和EΔ21 / Δ16在感染细胞中不表达pUL21和pUL16（图7H）。这些发现表明，pUL16和pUL21的缺失恢复了衣壳在WT水平上保留基因组的能力。这些数据，加上我们发现与WT衣壳相比，HSV-1和HSV-2 Δ21突变体具有更多的衣壳相关pUL16，表明在没有pUL21的情况下，pUL16与核衣壳的关联增加和/或过早会损害衣壳基因组保留。
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图 7.Δ21/Δ16双突变体产生的衣壳的表征。
A-F）Vero细胞感染HSV-1 KOS WT（A和B），Δ21（C和D）或EΔ21 / Δ16菌株（E和F），MOI为3，18 hpi，并通过TEM检查。1μm 比例尺适用于面板 A、C 和E。白色箭头表示核A衣壳，面板B，D和F分别是面板A，C和E的三倍放大图像。G）定量感染了指示的HSV-1 KOS衍生菌株的细胞中的核A-衣壳（每种条件n = 11-14张显微照片）。用于此分析的WT和Δ21数据与图1G中包含的数据相同。对所有病毒进行了单因素方差分析与Tukey的HSD测试以进行多重比较。** p ≤ 0.01。当比较HΔ21 / Δ16（p = 0.886）和EΔ21 / Δ16（p = 0.781）突变体与WT.H）蛋白质印迹分析时，核A-衣壳百分比的差异不显着，该分析由感染指定菌株的Vero细胞制备的裂解物在MOI为3，18 hpi。使用的抗血清在每个面板的右侧标明。分子量标记物（kDa）的迁移位置在每个面板的左侧指示。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1010969.g007
讨论
在这项研究中，我们定义了A-衣壳在感染多个HSV-1和HSV-2 UL21缺失突变体的细胞中积累的机制。我们发现A衣壳积聚在Δ21感染细胞的细胞质和细胞核中，与WT病毒相比，缺乏基因组的衣壳更常被掺入Δ21细胞外病毒粒子中（图1）。有趣的是，尽管与WT感染细胞相比，HSV-2菌株HG52在Δ21感染细胞中具有更多的核和细胞质A衣壳，但这是唯一WT和Δ21之间差异不显着的菌株（图1）。鉴于来自HSV-2 186，SD90e和HG52的pUL21蛋白是相同的，令人惊讶的是菌株HG52是一个异常值。当比较每种WT感染的核和细胞质A衣壳的比例时，HG52感染细胞的核A衣壳百分比第二高（图1G），细胞质A衣壳的百分比最高（图1H）。这一观察结果表明，相对于所研究的其他菌株，基因组包装或HG52衣壳的形成具有固有缺陷，并且缺乏pUL21可能不会像其他菌株那样对A-衣壳积累产生那么大的影响。可能是HG52在UL21位点之外具有影响衣壳形成或基因组保留/包装的多态性。也许值得注意的是，虽然pUL16在HSV-2菌株186和SD90e中是相同的，但在残基182和188之间有五个氨基酸，在HG52 pUL16中有所不同。可能是 HG52 pUL16 在 pUL21 存在下具有过早与核衣壳结合的倾向;然而，这需要通过实验来解决。
我们的实验表明，A-衣壳在Δ21感染细胞的细胞质中的积累不是由于核包膜破裂（图2）或C衣壳优先选择核出口的破坏（图3）。相反，数据表明，在没有pUL21的情况下，衣壳保留病毒基因组的能力会受到损害（图4和5）。我们对衣壳基因组保留的分析是在病毒进入期间进行的。然而，一个重要的考虑因素是，在出口过程中，衣壳在进入过程中的稳定性可能会有所不同，这可能会影响对我们研究结果的解释。由于感染后期的病毒DNA合成水平会产生如此强大的EdC信号，因此测定排除了我们在病毒粒子出口期间评估衣壳基因组保留的能力，这依赖于对产生相对较弱EdC信号的单个基因组的检测。无论如何，这些发现促使对Δ21衣壳组成进行分析。奇怪的是，当通过蔗糖梯度超速离心分离核A，B和C衣壳时，WT A衣壳条带的强度与来自Δ21感染核的条带相似（图6A）。基于透射电镜在Δ21感染细胞核中看到的A衣壳比例增加（图1），我们可能期望在Δ21样品中看到更强烈的A衣壳带。对这种明显差异的一种解释是，通过TEM在Δ21感染细胞中看到的大部分A衣壳是不稳定的，并且不适合在蔗糖梯度上分离。为了支持这一概念，感染HSV-1 pUL25突变体的细胞在通过TEM评估时产生核A，B和C衣壳，然而，核衣壳制剂的蔗糖梯度上不存在C衣壳条带;可能是因为缺乏pUL25的衣壳无法承受衣壳分离程序[7，14]。尽管存在这个难题，但与WT衣壳相比，我们的分析发现，从HSV-1和HSV-2 Δ21分离的所有衣壳类型上具有更多的pUL16（图6和表1）。理想情况下，我们还会对细胞中WT和Δ21衣壳的pUL16共定位进行分析。不幸的是，这是不可能的，因为我们的pUL16抗血清在间接免疫荧光测定中效果不佳。未来使用感染带有表位标记pUL16和荧光衣壳的病毒的细胞的实验应该能够进行这种分析。在WT感染细胞中，pUL16在到达细胞质之前不被认为与衣壳相关[55]。由于pUL16具有泛细胞分布，这表明存在一种机制来防止pUL16与细胞核中的衣壳结合。对这些发现的简单解释是，细胞核中pUL21和pUL16之间的复杂形成阻止了pUL16与衣壳结合（图8）。
为了研究这一假设，我们构建了两种独立的HSV-1 KOS Δ21 / Δ16突变菌株（HΔ21 / Δ16和EΔ21 / Δ16）。我们只能量化HΔ21 / Δ16和EΔ21 / Δ16感染细胞中的核A衣壳，因为这些细胞中的细胞质A衣壳数量有限。在单独缺乏pUL21或pUL16的HSV-1突变体中，尚未记录核出口缺陷[40，56-60]。因此，令人惊讶的是，在HSV-1 HΔ21 / Δ16和EΔ21 / Δ16感染细胞中，细胞质衣壳比HSV-1 Δ21和WT感染细胞少，这表明这些双突变体具有核出口缺陷。有趣的是，Benedyk及其同事注意到，最接近HSV-1 pUL21的N端结构域的结构同源物是pUL16 C端结构域的AlphaFold结构预测[41，61]。HSV-1 pUL21和pUL16中的冗余活性可能支持核出口，而两种分子的缺失会导致这一过程的缺陷。有趣的是，缺乏pUL21或单独缺乏pUL16的HSV-2突变体缺乏核排出[31，62]。HΔ21/Δ16和EΔ21/Δ16感染细胞中核A衣壳的定量与WT感染相比，核A衣壳的比例没有显著差异。然而，与Δ21感染细胞相比，核A衣壳明显较少（图7G）。这些发现表明，从HSV-1 KOS Δ21突变体中缺失UL16恢复了衣壳基因组的保留。
我们假设pUL21调节pUL16添加到衣壳中的位置和时间（图8），并且在WT感染期间，pUL16与细胞核中pUL21的相互作用阻止了pUL16与衣壳结合。过早和/或过度的pUL16与衣壳结合如何影响衣壳稳定性？在前衣壳形成过程中，囊体和三重体添加到支架蛋白中受到调节，并通过戊子和六角星与支架蛋白和三重组分之间的相互作用发生[16]。此外，衣壳成熟过程中，衣壳结构组分之间会形成二硫键配合物[23-25]。具体而言，主要衣壳蛋白VP5，三重蛋白，CVSC蛋白，pUL6和被盖蛋白VP22之间形成二硫键。二硫键稳定HSV衣壳，这些键的破坏可导致衣壳稳定性和基因组保留受损。pUL16含有20种半胱氨酸，其中8种在所有疱疹病毒中保守[55，63]。因此，如果pUL16在组装过程中过早地与核衣壳结合，可能会导致衣壳组分之间形成不当的二硫键，并损害包装后的基因组保留。未来应检查衣壳蛋白之间在没有pUL21的情况下形成的二硫键复合物，以更好地了解pUL16过早和/或过度添加影响衣壳内基因组保留的机制。
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图8.在没有pUL21的情况下解释病毒基因组保留受损的可能机制。
在感染WT菌株的细胞核中，pUL21对pUL16的隔离可防止pUL16与核衣壳结合。然而，在没有pUL21的情况下，pUL16更容易与核衣壳结合，并阻碍Δ21衣壳内的基因组保留。该图表明病毒基因组DNA通过门户排出Δ21衣壳，然而，基因组可能在门户以外的位点逃避这些衣壳。用 BioRender.com 创建的图。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1010969.g008
总之，本研究通过阐明pUL21在维持多种HSV-1和HSV-2菌株衣壳稳定性中的作用，解决了重要的知识差距。识别有助于衣壳稳定性的因素暴露了可用于治疗由这些重要人类病原体引起的疾病的潜在药物靶点。
材料和方法
细胞和病毒
非洲绿猴肾细胞（Vero），延长寿命的人包皮成纤维细胞（T12），W. A. Bresnahan博士（明尼苏达大学）的礼物[64]，人角质形成细胞（HaCaT），稳定表达HSV-2 186 pUL21 [42]的HaCaT21和293T21细胞，以及稳定表达HSV-2 186 pUL16 [30]的HaCaT16细胞维持在Dulbecco的改良鹰培养基（DMEM）中，并补充有10%胎牛血清（FBS）， 青霉素/链霉素和谷氨酸Max在5%一氧化碳中2环境。pUL21（Δ21）缺乏的HSV-2和HSV-1菌株的构建如前所述[31，42]。所有pUL21缺陷病毒均在HaCaT21细胞中繁殖。含有单体红色荧光蛋白（mRFP）的重组HSV-1菌株F与次要衣壳蛋白VP26融合，是G. A. Smith博士（西北大学）的一份礼物。如前所述，相应的Δ21突变体是通过CRISPR/Cas9诱变构建的[42]。含有mCherry（mCh）的重组HSV-2菌株186与次要衣壳蛋白VP26和相应的Δ21突变体融合，已在上文中描述过[31]。感染后报告为感染后数小时（hpi）的次数是指接种一小时后更换培养基所经过的时间。
利用先前报道的UL16向导RNA通过CRISPR/Cas9诱变构建了两种独立分离的HSV-1 KOS Δ21/Δ16菌株（HΔ21/Δ16和EΔ21/Δ16）[42]。简而言之，使用磷酸钙共沉淀法将HSV-1 KOS Δ21基因组DNA与表达UL16特异性gRNA的质粒共转染到293T21细胞中[65]。在转染后24小时，用含有2%FBS和1%羧甲基纤维素的DMEM替换培养基，以使斑块形成。三天后，采摘斑块，从采摘的斑块中分离DNA，并通过PCR筛选UL16和UL21缺失。通过蛋白质印迹分析含有UL21和UL16缺失的病毒，以确认感染细胞中未产生pUL21和pUL16。HSV-1 KOS HΔ21/Δ16 和 EΔ21/Δ16 突变体在 HaCaT21 和 HaCaT16 细胞单层的 1：1 混合物上繁殖。
免疫试剂和化学品
在E中生产了重组全长HSV-2 186 GST-UL25融合蛋白。大肠杆菌菌株BL21。裂解细菌，并根据制造商的说明使用B-Per蛋白纯化试剂盒（赛默飞世尔科技，渥太华，安大略省）纯化包涵体。包涵体中的蛋白质在制备型SDS-PAGE凝胶上分离，对应于谷胱甘肽S-转移酶融合的条带被切除并送到Virussys（马里兰州Taneytown）对山羊进行pUL25抗血清生产免疫。使用针对HSV-2 pUL25的山羊多克隆抗血清进行蛋白质印迹，稀释度为1：15000。纯化的小鼠抗人IRF-3（BD PharMingen，圣地亚哥，加利福尼亚州）以1：100的稀释度使用，Alexa Fluor 568偶联驴抗小鼠（Thermo Fisher Scientific，渥太华，安大略省）以1：500的稀释度用于间接免疫荧光显微镜。将针对HSV ICP5（Virusys，Taneytown，MD）的小鼠单克隆抗体用于蛋白质印迹和免疫荧光，稀释度为1：500。抗β-肌动蛋白的小鼠单克隆抗体（Sigma，圣路易斯，密苏里州）用于蛋白质印迹，稀释度为1：2000。针对HSV pUL16的兔多克隆抗血清[34]是J. W. Wills博士（宾夕法尼亚州立大学）赠送的礼物，用于蛋白质印迹，稀释度为1：3000。针对HSV-1 pUL25的小鼠单克隆抗体[13]是F. L. Homa博士（匹兹堡大学）赠送的礼物，用于蛋白质印迹，稀释度为1：2000。针对HSV pUL17的鸡多克隆抗血清[66]是J. D. Baines博士（康奈尔大学）赠送的礼物，用于蛋白质印迹，稀释度为1：2500。使用针对HSV pUL21的大鼠多克隆抗血清[31]进行蛋白质印迹，稀释度为1：600。根据制造商的说明，AF 488吡啶叠氮化物和5-乙炔基-2'-脱氧胞苷（EdC）（点击化学工具，亚利桑那州斯科茨代尔）用于点击化学。
透射电子显微镜
在感染前一天将Vero细胞接种在100mm培养皿上。Vero细胞以3的感染多重性（MOI）感染WT菌株，Δ21突变体或Δ21 / Δ16突变体18小时。用PBS洗涤感染的细胞三次，然后在0.1M二甲胂酸钠缓冲液（pH 7.4）中的2.5%EM级戊二醛（Ted Pella，Redding，CA）中固定60分钟。通过刮入固定剂中并以300×g离心5分钟来收集细胞。将细胞沉淀小心地包覆在等体积的熔融5%低熔点温度琼脂糖（龙沙，罗克兰，ME）中并使其冷却。将琼脂糖中的标本在2.5%戊二醛中0.1M二甲胂酸钠缓冲液（pH 7.4）中孵育1.5小时，并在1%四氧化锇中后固定1小时。琼脂糖中的固定细胞用蒸馏水洗涤三次，并在0.5%乙酸铀酰中染色过夜，然后以递增等级的乙醇（30%-100%）脱水。将样品从乙醇过渡到环氧丙烷浸润并嵌入Embed-812硬树脂中（电子显微镜科学，宾夕法尼亚州哈特菲尔德）。在50-60ηm处切片块，并用乙酸铀酰和雷诺兹柠檬酸铅染色。使用日立H-7000透射电子显微镜收集图像。A-，B-和C-衣壳在细胞核（每个条件n = 9-12张显微照片）和细胞质（每种条件n = 11-14张显微照片）以及PEV中定量（每个条件n = 11-27张显微照片）。每种条件总共定量了 276–901 个核/细胞质衣壳（A、B 和 C 衣壳）。每种条件总共定量了143-176个细胞外病毒粒子。每种情况共分析了7-158个PEV。
核包膜完整性评估
Vero细胞以0.1的MOI感染HSV-1 KOS WT或Δ21菌株。在18hpi下，用PBS洗涤细胞三次，并在室温（RT）下固定在4%对位甲醛中15分钟。样品在PBS中洗涤三次，并通过在室温下在PBS中加入0.5%Triton X-10015分钟或在室温下在PBS中加入0.01%皂苷10分钟来透化。 用皂苷透化的样品在所有随后的洗涤和抗体稀释剂中具有0.01%皂苷。如前所述，使用小鼠单克隆HSV ICP5抗体对细胞进行染色[30]。使用奥林巴斯FV1000激光扫描共聚焦显微镜使用60X（1.42 NA）油浸物镜和FV10 ASW 4.01软件拍摄图像。
EdC标记病毒的制备
为了将EdC整合到病毒基因组中，将T12细胞接种到150mm培养皿上并生长到汇合。达到汇合期三天后，细胞以0.01的MOI感染。在4 hpi下，将终浓度为1μM的5-乙炔基-2'-脱氧胞苷（EdC）直接加入培养基中，每24小时加入新鲜EdC，直到观察到完全的细胞病变效应。将细胞刮入培养基中，如前所述制备病毒原液[67]。使用PD-10脱盐柱（GE医疗，密西沙加，安大略省）根据制造商的说明清除病毒库存中的残留EdC。将脱盐病毒制剂等分并储存在-80°C。
IRF-3的核易位
WT病毒及其相应的Δ21突变体用于感染冰上的T12细胞，MOI为3。一小时后，用含有50μg/mL环己胺的完全培养基替换接种物。在0，2，4和6 hpi下，用PBS洗涤细胞三次，并通过在室温下在PBS中加入4%对位甲醛15分钟来固定。如前所述，使用小鼠单克隆IRF-3抗体对细胞进行透化和染色[30]。作为IRF-3核易位的阳性对照，按照制造商的说明，使用X-treme GENE HP DNA转染试剂（罗氏，拉瓦尔，QC）用2μgpoly I：C（InvivoGen，圣地亚哥，加利福尼亚州）转染T12细胞。在转染后6小时，固定细胞并染色IRF-3。
衣壳分离
衣壳制备与先前发表的方法类似[62]。五个150mm融合的Vero细胞培养皿感染每个HSV WT或其相应的Δ21菌株。当达到完全CPE时，收获感染的细胞并在4°C下以1，000×g离心10分钟。 弃去上清液，将细胞沉淀重悬于50mL冷PBS中，并在4°C下以1，000×g沉淀10分钟。 弃去上清液，并通过重悬在10mL冷NP-40裂解缓冲液（150mM NaCl，10mM Tris pH 7.2，1%NP-40，5mM DTT，2mM MgCl2）含有蛋白酶抑制剂（罗氏，拉瓦尔，QC）在冰上30分钟。然后将细胞核在4°C下以1，000×g沉淀10分钟，弃去上清液，并将细胞核重悬于3mL TNE缓冲液（150mM NaCl，20mM Tris pH 7.5，1mM EDTA）中。然后通过连续通过18号、22号和25号注射器针头破坏细胞核。用1μL苯并酶（250U/μL）处理核裂解物，在室温下孵育15分钟，然后在4°C下以3，000×g离心10分钟澄清。 将澄清的核裂解物分层到在TNE中制备的2mL 35%（w / v）蔗糖垫上，并在贝克曼SW55转子中以35，000rpm在4°C下离心32分钟。将含有核衣壳的沉淀重悬于250μLTNE缓冲液中，并使用冷冻杯角超声仪进行短暂超声处理。然后将衣壳分层到使用梯度大师（BioComp，Fredericton，NB）制备的10mL 20%至50%线性蔗糖梯度上，并在贝克曼SW41转子中以25，000rpm离心1小时。离心后，代表A，B和C衣壳的不同光散射带很明显。对于通过蛋白质印迹分析衣壳，将梯度从试管顶部分馏成1mL级分。对于通过质谱分析的衣壳，使用16 1/2号针通过侧壁穿刺从梯度中分离衣壳。从梯度中收集的样品用0.5体积的TNE缓冲液和衣壳稀释，在贝克曼MLA130转子中以26，000rpm的速度沉淀30分钟。弃去上清液，将衣壳沉淀重悬于35μL 1X SDS-PAGE上样缓冲液中，并储存在-20°C直至通过蛋白质印迹或质谱分析。
核衣壳的质谱
将HSV-1 KOS WT和Δ21核A，B和C衣壳电泳0.5cm到9%SDS-PAGE凝胶中。通过用SimplyBlue染色（Thermo Fisher Scientific，渥太华，安大略省）染色来观察每个样品的蛋白质条带。蛋白质在0.5cm×0.5cm的丙烯酰胺板中切除。将板置于含有500μL 1%乙酸的2mL微量离心管中，并在湿冰上送至南艾伯塔省质谱设施进行液相色谱串联质谱。通过质谱法鉴定的符合以下标准的蛋白质被纳入分析：>95%的蛋白质和肽阈值，鉴定出的最少数量的≥3种独特肽，以及通过去除常见污染物（例如角蛋白）。为了确保可以在WT和Δ21样品之间进行直接比较，使用VP5的总光谱计数将Δ21 A，B和C衣壳归一化为各自的WT衣壳。分析每种菌株的三个生物学重复。
蛋白质印迹分析
蛋白质通过8%或10%SDS-PAGE凝胶电泳。将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，并在Intercept三缓冲盐水（TBS）封闭缓冲缓冲液（LI-COR，林肯，NE）中封闭1小时。用适当稀释的抗体（VP5、pUL25、pUL17、pUL21 或 pUL16）在 4°C 下过夜探测膜。 用含有0.1%吐温20（TBST）的Tris缓冲盐水（10mM Tris pH 8.0，150mM NaCl）洗涤膜3次7分钟，然后将适当稀释的二抗加入膜并在室温下孵育1小时。然后用TBST洗涤膜三次，持续7分钟，最后用TBS洗涤，然后在Odyssey CLx成像系统（LI-COR，林肯，NE）上成像。病毒蛋白的图像和信号强度是使用Image Studio Lite软件版本5.2.5获得的。VP5信号用于归一化WT和Δ21衣壳数。将Δ21 A、B和C衣壳样品中pUL21、pUL16、pUL25和pUL17的归一化信号强度直接与相应的WT衣壳样品进行比较。
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S1 表。
从HSV-1（KOS）WT和Δ21感染细胞核中分离的A，B和C衣壳的质谱分析结果。特别感兴趣的分子以黄色突出显示。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1010969.s001
（三十）
确认
我们感谢Fred Homa博士（匹兹堡大学），Joel Baines（康奈尔大学），John Wills博士（宾夕法尼亚州立大学）提供抗血清，Wade Bresnahan博士（明尼苏达大学）提供T12细胞，Greg Smith博士（西北大学）提供VP26-mRFP1 HSV-1菌株。我们感谢Landon Montag（女王大学）对我们的数据进行统计分析的帮助。我们感谢Renée Finnen博士，Jie Gao博士和Xiahou Yan博士（女王大学）在电子显微镜方面的帮助，以及Laurent Brechenmacher博士（南艾伯塔省质谱中心）在质谱方面的帮助。我们感谢我们的同事Renée Finnen和Safara Holder对手稿进行的有益讨论和评论。
引用
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