通过细胞周期蛋白B / CDKB1和促同期复合物控制衣原体的分裂
克雷斯蒂·佩卡尼，克里斯蒂·利伯曼，田岛夏目白崎，大西正之 ，弗雷德里克·克罗斯
出版日期： 2022年08月18日
抽象
在酵母和动物中，细胞周期蛋白B结合并激活细胞周期蛋白依赖性激酶（“CDK”）CDK1以驱动进入有丝分裂。我们表明，CYCB1是衣原体中唯一的细胞周期蛋白B，它激活了植物特异性CDKB1而不是CDK1正交基因CDKA1，从而确认并扩展了先前的结果。延时显微镜检查表明，CYCB1在多次裂变循环中各分裂前合成，然后在分裂发生前3-5分钟迅速降解。CYCB1降解依赖于促变复合物（APC）。与CYCB1一样，CDKB1直到G1后期才合成;然而，CDKB1不会随着多次裂变循环内的每个分裂而退化，而是在所有分裂停止后降解。用mNeonGreen标记的微管加末端结合蛋白EB1允许检测活细胞中的有丝分裂事件。有丝分裂中最早的可检测步骤是将极性EB1信号分裂成两个病灶，可能与未来的纺锤体极点相关，这取决于CYCB1。CYCB1-GFP 在纺锤体形成前紧邻这些病灶。纺锤体分解，裂隙沟形成和EB1在沟中积累取决于APC。在间期，快速生长的微管以EB1的“彗星”为标志;在没有APC功能的情况下，彗星不存在。因此，CYCB1 / CDKB1和APC调节微管功能和组装，同时调节有丝分裂进展。遗传结果表明APC在调节姐妹染色单体内聚方面具有独立的额外作用;这个角色很可能在真核生物中是保守的。
作者摘要
我们分析了与经过充分研究的酵母和动物系统相比，植物王国的微生物成员衣原体leinhardtii细胞分裂周期的进展和调节。我们通过野生型和突变体的单细胞延时显微镜分析了一系列在细胞周期进展中有缺陷的突变体。我们发现细胞周期控制的许多方面都得到了惊人的保护，包括促性复合物（APC）的作用和细胞周期蛋白B作为有丝分裂诱导剂的近端作用;令人惊讶的是，衣原体中的细胞周期蛋白B激活了植物特异性的细胞周期蛋白依赖性激酶CDKB，而不是酵母和动物中的CDK1。微管结构的变化密切相关，并且因果关系依赖于细胞周期蛋白B和APC活性的变化。
引文： Pecani K，Lieberman K，Tajima-Shirasaki N，Onishi M，Cross FR（2022）通过细胞周期蛋白B / CDKB1和促性复合物控制衣原体的分裂。PLoS Genet 18（8）：e1009997。https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009997
编辑 器： 曲丽佳，北京大学，中国
收到： 2021年12月21日;接受： 七月 12， 2022;发表： 八月 18， 2022
版权所有： ? 2022 Pecani et al.这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，允许在任何媒体上不受限制地使用，分发和复制，前提是注明原作者和来源。
数据可用性： 所有相关数据都在稿件及其支持信息文件中。
资金： 这项工作得到了生物科学理事会的支持：MCB 1818383到MO，以及国家普通医学科学研究所：RO1GM078153到FC。https://www.nsf.gov/ https://www.nih.gov/。我们也感谢John R. Pringle的贡献，他作为MCB 1818383的接受者支持这项工作。资助者在研究设计，数据收集和分析，出版决定或手稿准备方面没有任何作用。
竞争利益： 作者宣布不存在相互竞争的利益。
介绍
真核生物细胞周期的进展由细胞周期蛋白和细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）控制[1]。CDK通常缺乏任何蛋白激酶活性作为单体;细胞周期蛋白-CDK异源二聚体的形成导致CDK主要重折叠为激酶活性形式[2]。cyclin-CDK接口很大，结合本质上是不可逆的。除了激活CDK酶活性外，细胞周期蛋白还经常提供可以与底物结合的“对接位点”，从而为异源二聚体提供大部分底物特异性[3]。在大多数真核生物中，存在多个CDK和细胞周期蛋白，它们在每个细胞周期阶段对特定靶标的丰度和特异性可能不同。例如，在发芽酵母中，G1期功能和细胞周期的启动由G1细胞周期蛋白Cln1-3驱动，有丝分裂由B型细胞周期蛋白Clb1-4驱动[4]。B型细胞周期蛋白是每个真核生物测试进入有丝分裂所必需的。在许多系统中，细胞周期蛋白B降解对于有丝分裂退出（端粒期和细胞分裂）至关重要[5，6]。独立地，复制起源的重新许可也被许多生物体中的高CDK活性所阻断[7]。
CDK对细胞周期蛋白酶活性的依赖性以及底物靶向的依赖性意味着CDK活性可以通过控制细胞周期蛋白丰度来间接控制，并且对细胞周期蛋白水平的转录和转录后控制都是主要的细胞周期控制机制。细胞周期蛋白降解对于消除复合物是必要的，因为细胞周期蛋白- CDK结合基本上是不可逆的。细胞周期蛋白B降解发生在泛素化后由泛素化物（APC）（一种多亚基E3泛素连接酶）蛋白水解发生[8]。APC由Cdc20和Cdh1激活[9，10]。泛素化通常依赖于目标细胞周期蛋白上的破坏盒（“D盒”）共识序列[11]。在发芽酵母中，从各种B型细胞周期蛋白中对破坏盒序列进行基因组去除已被证明可以稳定其水平[12，13]。与细胞周期蛋白相反，大多数系统中的CDK1被认为是高度稳定的，并且在整个细胞周期中过量，至少在快速增殖的细胞中是这样[1]。
APC在几乎所有真核生物中都是必不可少的;一个值得注意的例外是贾第鞭毛虫，它缺乏所有APC亚基的基因[14]。细胞周期性贾第鞭毛虫B缺乏破坏盒，但未知系统在有丝分裂中仍然降解细胞周期蛋白B。在大多数真核生物中，APC是分析阶段所必需的，而与其在细胞周期蛋白B降解中的作用无关，因为它需要去除安全素，安全素是姐妹染色单体分离和相间期的抑制剂[10]。Securin阻断ESP1（分离酶）蛋白酶的激活。分离酶是内聚素复合物蛋白水解所必需的，释放姐妹染色单体内聚并允许相位。在酵母中，提出了ESP1在促进有丝分裂出口方面的单独作用[15]，包括调节有丝分裂纺锤体稳定性[16]。目前尚不清楚这些单独的角色是否是酵母特有的;分离酶失活未阻断小鼠细胞中的DNA复制周期[17]。在动物细胞中，分离酶也可能促进中心粒脱离和重复[18]。
在发芽酵母中，虽然B型细胞周期蛋白Clb2的降解对于有丝分裂出口至关重要[13]，但密切相关的B型细胞周期蛋白Clb3可以持续未分级，而不会阻断有丝分裂出口或影响生存能力[12]。此外，通过周期性抑制细胞周期蛋白B-CDK相关激酶，可以绕过对APC依赖性细胞周期蛋白B蛋白水解的需求[19]。在果蝇胚胎发生中，前8个周期的细胞周期蛋白B降解很少或没有，有丝分裂退出可能通过周期性抑制性CDK磷酸化来控制[20]。因此，观察到细胞周期蛋白B降解，并且对于许多但不是全部真核细胞分裂中的有丝分裂退出至关重要。
植物王国，包括绿藻衣原体，在进化早期从酵母和动物中分化[21]。这种早期分歧意味着在没有直接证据的情况下假设监管体系的守恒是不安全的;与酵母和动物相比，即使是高度同源的蛋白质在植物中也起着不同的作用[22，23]。拟南芥包含多个细胞周期蛋白，这些细胞周期蛋白根据细胞周期阶段聚集成具有特定功能的组[24-26]。在酵母和动物中，由细胞周期蛋白B激活以驱动有丝分裂的CDK是CDK1 [1]。植物王国的所有成员都包含一个名为CDKA的CDK1同源物。令人惊讶的是，与CDK1明显不同的植物特异性CDKB1是有丝分裂进入的必需CDK，而不是CDKA1[27，28]，并且CDKB1相关的激酶活性遗传依赖于CYCB1[29]。相反，CDKA1在很大程度上仅限于细胞周期启动时的作用[27，30，31]。
总体而言，这些数据表明，在植物谱系进化的早期，植物特异性CDKB1接管了诱导有丝分裂进展以响应细胞周期蛋白B积累的作用。在另一种单细胞绿藻中进行的实验 Ostreococcus支持这一观点[32]。同样值得注意的是，在青光植物和红豆藻的早期发散藻类中发现了清晰的CDKB1同源物[33，34]，尽管尚未确定它们的伴侣细胞周期蛋白，但在细胞分裂过程中强烈诱导青光体CDKB1转录本[33]。此外，在许多异质藻类（仅与真核树根部附近的植物共享祖先）中发现了“发散的”CDKA2基因，其中一些基因可能在细胞分裂过程中被诱导[23，35]。因此，CDK波动和/或发散的CDKB（样）基因可能起源于始祖细胞系进化的早期。
与酵母和动物一样，一些植物细胞周期蛋白受到破坏盒和蛋白酶体依赖性降解的控制[36]，这表明APC在调节植物中的CDK中起重要作用。此外，CDKB1的活性也可以通过其自身的降解直接调节[32，37]，这表明额外的植物特异性调节层。在 N.tabacum，破坏盒缺失CYCB1的表达导致细胞分裂缺陷[38]，可能是由于CDK磷酸化使细胞分裂诱导蛋白失活[39]。因此，植物中的CDK / cyclin调节可能与动物和酵母中开发的规范模型不同，并且对这种调节的阐明可能使我们能够剖析进化保守的基本核心机制，而不是在独立谱系中进化的辅助模块。然而，植物生物学的几个方面对陆地植物的遗传分析提出了挑战[40]。
绿藻衣原体莱因哈蒂为研究植物王国中的CDK / cyclin调节（和许多其他过程）提供了相当大的技术优势。其系统发育定位在Viridiplantae基部附近，这意味着其“植物样”基因组尚未经历多次基因组复制事件，这与单细胞生活方式和单倍体基因组一起，显着促进了细胞分裂周期的遗传和细胞生物学研究[40]。
衣原体表现出一种称为“多发性裂变”的细胞分裂模式[40]。小的新生儿细胞可以在10-12小时内生长，>10倍于其起始大小，而无需DNA合成或细胞分裂。然后细胞吸收纤毛并进行多次快速细胞分裂：完整的DNA复制、核分裂和细胞分裂，全部在母细胞壁内，直到后代细胞分裂到大约它们的起始大小[40]。每个周期需要约30分钟，所有新生细胞都保留在母细胞壁内，直到终末细胞分裂后孵化[40]。昼夜同步人群的转录组分析显示，在S-M-C的多个周期中，大量基因被强烈诱导[41-44]。该集群包括CDKB1和CYCB1;CDKA1的去除强烈延迟了该簇的诱导时间[30，43]，这与CDKA1 / CYCA1主要负责细胞周期启动的想法一致，而CDKB1 / CYCB1控制每个S-M-C周期中涉及的事件。
此前，我们在多个APC亚基以及细胞周期蛋白B和CDKB中分离出ts致死突变[28，29，45]。衣原体中的 APC 失活导致在用中期纺锤体进行一轮 DNA 复制后停滞，这表明拟性粒可能直接需要 APC 衣原体。这在陆地植物中也可能如此[46-49]，可能是由于需要APC依赖性降解的守护神 anaphase抑制剂，一种安全蛋白同源物[50]。缺乏APC的植物也显示出细胞周期蛋白B降解的延迟。在衣原体中，APC的突变失活阻止了CDKB1相关蛋白激酶活性的下调[29]。
微管在有丝分裂中起着重要且多样化的作用，细胞周期蛋白B依赖性激酶可调节有丝分裂微管结构的动力学和形成[51，52]。衣原体中的微管包括非常稳定的“小根”，形成以基体为中心的十字形结构，含有乙酰化微管蛋白[53，54]。此外，还有非乙酰化和高动态的微管从基体和根部附近延伸，形成以基体为基体的杯形图案[53，55]。在有丝分裂中，形成完全不同的微管结构：有丝分裂纺锤体和标记细胞动力学沟的微管，它们可能分别对染色体分离和细胞分裂至关重要[56，57]。
微管末端结合蛋白1（EB1）与主动聚合微管的加端结合[58-60]。在酵母和动物细胞中，EB1及其同系物在间期与皮质微管相关，表现为小“彗星”，并与有丝分裂细胞中的纺锤体微管相关[61-65]。EB1在拟南芥中表现出类似的定位模式，在相间期表现为皮质彗星[66]，并且在有丝分裂期间在纺锤体极附近[67]。在间期衣原体细胞中，用mNeonGreen（EB1-NG）标记的EB1位于睫状基底体或附近的一个或两个前部斑点[55，57]，并且移动的EB1-NG彗星沿着细胞皮层延伸至细胞后部[55，57]。此外，在分裂细胞时，EB1-NG与纺锤体和裂隙沟共定位[57]，使其成为监测有丝分裂事件的有用标志物。
在这里，我们开发了长期定量单细胞成像方法，以检查细胞周期蛋白B和CDKB通过完整的多个裂变周期和单细胞突变停滞的动力学积累和降解，并使用荧光标记的EB1作为微管定位的报告者，特别是快速增长的微管加末端的报告者，将这种行为与有丝分裂进展的细胞学相关联。
结果
CYCB1与CDKB1相互作用
B型细胞周期蛋白是动物和酵母细胞周期的关键调节因子[1]。衣原体具有单一的必需细胞周期蛋白B基因CYCB1[29]。在CYCB1启动子的控制下，我们构建了一个转基因融合，GFP附加到CYCB1的C末端，并鉴定了拯救温度敏感（ts）cycb1-5（方法）致死性的转基因转化子。我们选择了一种具有单个含GFP位点的转化子，该转化子在四聚氰胺分析中有效地挽救了cycb1-5。根据目前的衣原体命名惯例（https://www.chlamycollection.org/content/uploads/2021/11/Nomenclature-Final.pdf），我们将这个位点称为CYCB1：GFP-TG（反式基因）。
抗GFP免疫印迹显示免疫沉淀（图1A）或直接免疫印迹（S1图）后融合的条带与预期大小相同。新生细胞中CYCB1-GFP的水平较低，并且随着细胞开始分裂周期而升高，类似于CDKB1和复制对照蛋白CDC6，ORC1，MCM6和CDC45的模式（[29，68];S1 图）。这种积累模式可能反映了G1晚期这些基因（以及几乎所有其他复制或分裂必需基因）的强转录诱导[43，44]。随着细胞完成多次裂变循环，CYCB1-GFP信号在时间过程的后期下降到低水平;在APC（cdc27-6，[29]）或CDKB1（cdkb1-1，[28]）失活的遗传背景中没有观察到这种下降。CDC27是APC的核心亚基;cdc27-6是CDC27中一种对温度敏感的致死性突变，可导致第一周期的严格停滞[29]。cdkb1-1是CDKB1编码序列中的一种温度敏感致死突变[28]。虽然本实验中的野生型细胞经历了多次分裂周期，但没有检测到CYCB1-GFP水平的振荡，只有一次上升和下降。正如我们将要展示的，这是由于衣原体不完全同步。据我们所知，没有同步批量培养的方法可以在多次裂变循环（例如，第三分裂的S期）的不同位置提供细胞的干净分离。这是单细胞方法在这个系统中至关重要的主要原因。
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图 1. 通过共免疫沉淀检测CYCB1-GFP结合伙伴和激酶活性。
（A） 顶行：在未标记的对照 （'wt'）、wt、cdc27-6 或 cdkb1-1 背景中，CYCB1-GFP 下拉的抗 GFP 免疫印迹。CYCB1-GFP从细胞裂解物中拉出，这些裂解物首先通过氮剥夺同步，然后在完全培养基中移动到限制性温度（33°C）并在13小时后收集。通常，在 13 小时后。在33°C下，野生型细胞经历了多次裂变，并且来自大量细胞的CYCB1-GFP水平很高（例如，参见S1图中的时间过程和S5A图中的野生型显微镜图像）。中排：负载控制是来自总裂解物免疫层的非特异性抗GFP信号，在用于顶部行所示的IP之前。底行：来自免疫沉淀物的激酶活性显示在顶行。除左侧未标记的wt对照外，所有菌株均具有CYCB1：GFP-TG转基因拯救的温度敏感cycb1-5。基于OD的等量生物量750从每个样品中提取并免疫沉淀。对每种基因型测试两种独立菌株。（B）检测CDKA1-mCherry或CDKB1-mCherry作为CYCB1-GFP的可能结合伴体。具有CYCB1-GFP和CDKA1-mCherry或CDKB1-mCherry的指示组合的菌株用来自细胞裂解物的抗GFP免疫沉淀，这些裂解物首先通过氮剥夺同步，然后在完全培养基中移至限制性温度（33°C）并在13小时后收集，这是基于先前使用该方案的实验的细胞处于中分裂期的时间。输入生物量由OD均衡750.然后用抗GFP或抗mCherry进行免疫印迹。针对每种基因型测试了两个独立的菌株，使得泳道7-12在泳道1-6中重现实验。上样对照（底行）是在免疫沉淀前从总裂解物中进行非特异性蛋白质染色。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009997.g001
细胞周期蛋白本身缺乏酶活性（见介绍）。然而，来自循环细胞的免疫沉淀细胞周期蛋白可以通过CDK在体内紧密结合和活化而具有相关的蛋白激酶活性。组蛋白H1是许多CDK酶活性的便捷体外底物[1]，包括CDKB1 [29]。我们使用与磁珠结合的抗GFP纳米体免疫沉淀CYCB1-GFP。洗涤免疫沉淀物并加入32P-ATP和组蛋白H1后，32P标记积聚在H1上，表明蛋白激酶活性与CYCB1-GFP共免疫沉淀（图1A）。该信号是特异性的，因为它在遗传上依赖于CYCB1：GFP-TG转基因。同时，我们从具有cdc27-6温度敏感突变的细胞中免疫沉淀CYCB1-GFP，以灭活APC。观察到CYCB1-GFP和共免疫沉淀激酶活性水平升高。与激酶活性相比，蛋白质印迹的近似定量表明，在cdc27-6背景中可检测到的大部分或全部酶活性增加与CYCB1-GFP水平的增加相关。我们还从具有cdkb1-1温度敏感突变的细胞中免疫沉淀CYCB1-GFP，以灭活CDKB1。在免疫沉淀物中检测到CYCB1-GFP蛋白，尽管水平有些不同。重要的是，尽管存在CYCB1-GFP蛋白（图1A），但在这些免疫沉淀物中未观察到激酶活性，这表明野生型细胞中与CYCB1-GFP共免疫沉淀的组蛋白H1激酶活性是由于活化的CDKB1。反过来，我们之前表明CDKB1相关激酶活性，但不是CDKB1蛋白水平，在cycb1-6背景中强烈降低，使CYCB1失活，并在cdc27-6中增加;CDKB1：mCherry-TG.综上所述，这些结果表明，对CYCB1丰度的调控是CDKB1激酶活性的主要控制。
我们构建了共表达CDKA1-mCherry或CDKB1-mCherry的衣原体CYCB1-GFP菌株。抗GFP免疫沉淀特异性共沉淀CDKB1-mCherry，但不是CDKA1-mCherry（图1B;显示了两组独立先天菌株的结果），表明CYCB1特异性地与CDKB1结合，而不是CDKA1在体内。
总体而言，这些结果与CYCB1结合和激活CDKB1的高特异性一致。
多裂变循环中细胞周期蛋白B的积累和降解
在没有APC功能的情况下，CYCB1-GFP的积累增加（图1A）表明，与其他系统一样，APC促进CYCB1降解的可能性。然而，我们手中细胞周期同步的不完美不足以解决单个快速分裂，从而无法确定cyclin B在整个多次裂变期间是否稳定，并且仅在所有分裂完成后才降解（如MCM4 [68]），或者在每次分裂中降解然后重新合成。
为了解决这个问题，我们开发了衣原体长期延时荧光显微镜的方法。这带来了许多技术挑战，包括需要对被成像的细胞进行高度精确的温度调节（特别是对于温度敏感的突变体至关重要），防止细胞游出视野，为图像采集之间的光合作用提供光，以及从叶绿体中计算减去自发荧光，否则会淹没CYCB1-GFP信号。我们的解决方案包括小型，单独密封的丙烯酸腔室，里面装满了TAP/琼脂糖，每个腔室都含有不同的细胞群;由小型LED提供的顶置照明，这些LED被编程为在图像采集时瞬时关闭;和计算反卷积以消除叶绿体自发荧光的贡献（材料和方法）。
据我们所知，我们解决的问题（在这里和[68]中）通过对整个衣原体多次裂变周期的延时荧光成像抑制或阻止了先前的描述。
我们还发现，衣原体对荧光成像所需的照明杀死非常敏感。因此，对于长时间的电影，我们将曝光时间和荧光强度限制在检测所需的最小值，采用3分钟的帧速率，并且仅对我们的自动对焦例程放置在细胞中线的单个焦点平面进行成像。这限制了图像强度和分辨率，但允许以基本上正常的动力学完成多个裂变周期。这里报告的这些条件的结果通常至少在具有1分钟或更短帧速率的第一分割和具有最大投影的多个z堆栈中得到证实（方法;见下文），这给出了更高质量的图像，但导致在前一次或两次分裂后细胞活力的丧失。
计算反卷积过程（方法;S2 图）需要对CYCB1-GFP信号进行合理准确的定量;然而，即使没有反卷积，基本行为也是可以检测到的（S2图）。CYCB1-GFP信号在第一次分频前约0.5-1小时首次在背景上清晰可检测（图2和S1视频）;信号稳定增加约20分钟。从信号的形状和位置，我们假设CYCB1-GFP在很大程度上是核定位的，尽管我们缺乏直接的证据。在一些细胞中（特别是那些被APC失活捕获的细胞 - 见下面讨论的图3），我们观察到额外的信号在假定的核信号之外向细胞前极延伸。我们推测，该前信号可能与含心心的基底核体连接器重叠[69]。
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图 2. CYCB1-GFP的活细胞延时显微镜检查。
（A）CYCB1-GFP细胞的延时图像。每个细胞都有一个明场图像（右），蓝色的叶绿体自发荧光和黄色的CYCB1-GFP信号（左）的复合物。每个条带顶部指示的时间是延时开始后的小时和分钟。指示的时间对应于每个条带中的顶部单元格;下面的单元格显示了3分钟的延时序列。箭头表示在明场检测到的新裂隙沟形成。成像的细胞经历了三个分裂;将显示第一个和最后一个分区周围的帧。比例尺：5微米。（B）左：定量从叶绿体自发荧光（黄线）和叶绿体自发荧光（蓝线）解卷积的CYCB1-GFP信号。箭：对应于裂隙沟形成。右图：黄色迹线：细胞上方的 CYCB1-GFP 总信号。黑色：计算出包含50%CYCB1-GFP信号的最小凸面船体，并计算出浓度（信号/面积），显示局部浓度（可能在细胞核内;见文本）和细胞总量通过分裂密切跟踪。可根据要求提供用于计算凸壳的 MATLAB 代码。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009997.g002
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图 3. CYCB1-GFP在cdc27-6背景中的活细胞延时。
（A）每个细胞都有一个明场图像（右），蓝色的叶绿体自发荧光和黄色的CYCB1-GFP信号的复合物（左）。每个条带顶部指示的时间是延时开始后的小时和分钟。指示的时间对应于每个条带中的顶部单元格。每个后续细胞下降都是每3分钟捕获一次的图像。比例尺：5微米。（B） 绿色：A所示小区中解卷积的总GFP信号;蓝色：浓度估计如图2所示。（C） 12个像元的平均值和s.e.m.的相同图。所有迹线在取平均值之前调整为最大信号 1。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009997.g003
经过一段时间的稳定积累，CYCB1-GFP信号在细胞分裂前不久下降到近背景水平（通过在并发明场图像中形成裂隙沟来评分;图2和S1视频中的箭头）。从一个3分钟分辨率的典型电影中，可以对15个单个细胞进行成像，我们获得了CYCB1-GFP蛋白半衰期的值，在3.0 + / - 1.3分钟（平均+/- 标准偏差;n = 15）的快速周转期间，以及从达到CYCB1-GFP水平的低谷到细胞分裂之间的1.2 +/- 2.4分钟的间隔。然后CYCB1-GFP重新积累，但仅限于随后经历额外分裂的细胞（图2），这表明分裂的“决定”是CYCB1积累的上游。具有多种菌株的其他电影给出了高度相似的结果。
在以后的除法周期中新累积的CYCB1-GFP有时被清楚地分成2（2第 nd除法）或 4 （3三分裂）焦点（图2），我们假设它对应于不同子核中的单独积累。这并不总是得到明确遵守;我们认为这可能是由于在单个焦平面上观察到的乘法分裂的细胞几何形状的复杂性。
细胞周期蛋白 B 蛋白水解依赖于 APC 和 CDKB1
APC依赖性泛素化和随之而来的蛋白水解通常依赖于靶蛋白中的“破坏盒”共识序列[11]。CYCB1包含一个共识破坏盒[29]。使用核心必需APC亚基中的cdc27-6温度敏感突变[29]，我们发现CYCB1-GFP蛋白水解依赖于APC（图3）：CYCB1-GFP水平在早期较低，并且在与野生型相似的时间上升，但与野生型不同，即使在许多小时后也没有观察到突然的降解。图3显示了从一部电影中评分的12个细胞的结果;在多个额外的实验中获得了类似的结果。
我们还发现，与野生型（S3图和S2视频）不同，CYCB1-GFP水平在cdkb1-1背景中没有急剧下降（参见讨论）。
细胞周期蛋白B降解是必需的吗？
APC依赖性细胞周期蛋白B降解对于许多但不是全部真核系统中的有丝分裂活力至关重要（简介）。
我们构建了一个CYCB1-db：GFP转基因，删除了销毁盒，预计这将赋予APC介导的蛋白水解不敏感[11]。我们将转基因转化为与野生型CYCB1：GFP平行的cycb1-5温度敏感菌株，在33度下选择以拯救cycb1-5。在三个独立的实验中，每个实验都有大量获救的菌落（太多而无法计数，但每次镀层转化超过100个），我们使用野生型CYCB1：GFP在电穿孔时没有获得在33度下存活的菌落，其中CYCB1和CYCB1-db 在相同的质粒环境中，并以相同的浓度平行转化（方法）。这一结果与CYCB1-db的致死性一致。我们不能排除CYCB1销毁箱是CYCB1正功能所必需的可能性;然而，这在其他系统中没有观察到，并且销毁盒远离负责CDK活化和底物靶向的细胞周期蛋白区域。无论如何，这些结果表明CYCB1中的破坏盒对于其在活细胞中的功能至关重要。
如果CYCB1-db确实具有致死性，则预计不可能恢复表达CYCB1-db的转化子，从而阻止研究隐含的CYCB1-db依赖性致死性的表型。然而，结果不仅仅是阴性的，因为我们可以使用CYCB1-db校准补充cycb1-5菌株的失败，并具有CYCB1-wt的回收效率。通过有条件地过表达细胞周期蛋白B-CDK活性的Sic1化学计量抑制剂，在发芽酵母中解决了这个问题;这维持了DB缺失的细胞周期蛋白B菌株的生存能力，当Sic1关闭时，可以研究致死表型[13]。这种资源目前在衣原体中不可用。
保护APC在衣原体中的吻合促进作用
在酵母和动物中，由于需要降解相位抑制剂安全蛋白以允许ESP1激活和内聚素复合物的裂解，因此姐妹染色单体分离和相吻合需要APC / CDC20，这与APC / CDC20在去除细胞周期蛋白B中的作用无关（参见简介）。在植物王国中，最近才鉴定出安全蛋白同源物[50]，虽然APC亚基在陆地植物中显然是必不可少的（见介绍），但APC失活的细胞学后果尚不清楚。
此前，我们分离出该系统许多组分的突变：APC亚基、CDC20、凝聚素加载剂SCC2和分离酶/ESP1[28，45]。我们表征了这组突变体中单突变体和双突变体的细胞周期停滞。CDC20失活导致一次复制的DNA（通过流式细胞术检测2C DNA，散发逃逸者进展至4C）的停滞，并且用染料Syto11对DNA进行活细胞染色显示单个DNA质量没有细胞分裂（图4A）。ESP1失活也导致单个DNA细胞核，其中DNA染色信号比CDC20失活要亮得多。一致地，对被捕的esp1突变体的流式细胞术显示，他们经历了至少三轮完整且连续的DNA复制，积累了8C DNA含量（图4B和S4A）。细胞也表现出异常的细胞分裂，单个大核分离成一个细胞体（[28];图4A）。DNA含量结果表明需要APC / CDC20，但不是ESP1或姐妹染色单体分离，以进行新一轮复制。预计SCC2失活会干扰内聚蛋白复合物的加载，对复制谱几乎没有影响。scc2细胞似乎也经历细胞学正常的多发性裂变周期，尽管由此产生的子细胞主要或完全不存活[45]。还分析了这组突变体中的双突变体。cdc20;esp1双突变体，对于某些esp1等位基因，在四元分析中不可存活，与CDC20和ESP1在同一途径中起作用一致;但是与其他等位基因一起，双突变体是可行的，并且在高温下停滞时，在形态学上与cdc20单突变体（S5A图）无法区分，特别是在缺乏可检测的细胞分裂作用的情况下。cdc20;esp1 双突变体以 2C DNA 含量被捕，如 cdc20 单突变体（S6A 图）。cdc20;scc2和esp1;scc2双突变体通过流式细胞术的DNA含量分别与cdc20和esp1单突变体相似（图4B），但值得注意的是，在cdc20和esp1中观察到的单个大DNA质量被可变数量和大小较小的质量所取代（图4A).这与双突变体中由于SCC2失活而导致的姐妹染色单体内聚力的至少部分缓解是一致的。此外，我们注意到，当与scc2-3结合时，由于一个esp1等位基因，ts-致死性得到了部分挽救（S5B图）。这些结果总体上与分支途径一致，其中CDC20 / APC位于顶部调节两个单独的分支，一个导致DNA复制和细胞分裂，另一个导致姐妹染色单体分离;ESP1，SCC2和假设的安全蛋白类似物可能仅参与调节姐妹染色单体分离的分支（图4C）。我们观察到具有5个独立esp1等位基因的高度相似的停滞表型（高倍体单核细胞），并且在ESP1编码序列的多个不同区域中发现了这些等位基因中的致病突变（S4图）。因此，我们认为这是衣原体中esp1的真正零表型，分离酶可能是姐妹分离所必需的，但有丝分裂退出不是必需的，包括细胞分裂和额外的DNA复制轮。通过这种方式，衣原体可能类似于动物细胞而不是发芽的酵母（[17];见介绍）。这意味着分离酶的姐妹分离作用，但可能不是其他作用，已经在最后一个真核共同祖先的时间附近建立[21]。
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图 4. APC（cdc20）和分离酶（esp1）突变体中的DNA定位和复制。
（A）如上所述[29]，将野生型、cdc20-1、esp1-2突变体与无scc2-3在G1中阻断，置于限制性温度（33°C）下，15 h后收集，并用Syto11活细胞绿色荧光核酸染色染色。红色信号来自叶绿体自发荧光。（B）从与（A）相同的细胞组中流式细胞术，但在13小时收集后。有关0和15h的流式细胞术数据以及相应的细胞大小数据，请参见S4A图。（C）提出CDC20/APC调控DNA复制和姊妹染色单体分离的模型。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009997.g004
CDKB1的监管
我们之前报道CDKB1-mCherry在多次裂变期间积聚在细胞核中[29];然而，使用批量培养测量，我们无法确定CDKB是否降解，然后在每个细胞周期中重新合成，正如根据拟南芥和串球菌的结果所建议的那样[32，37]。我们无法通过CDKB1：mCherry-TG细胞的延时显微镜来回答这个问题，因为mCherry和叶绿体自发荧光的光谱重叠太大，因此反卷积方法无法处理我们现有的滤波器，给定相对较低的CDKB1-mCherry信号[29]。因此，我们构建了一个CDKB1：Venus转基因，并用它来拯救cdkb1-1菌株。金星检测下的衣原体自发荧光足够低，足以可靠地检测来自CDKB1-Venus的信号（图5）。在获救细胞的延时显微镜检查中，我们观察到CDKB1-Venus仅在多次裂变周期期间积累，与先前的结果一致[29]。然而，计算反卷积后的量化（如上所述;方法）表明，与CYCB1-GFP的行为不同，在单个分裂过程中的任何时候都没有总CDKB1-Venus信号的损失（图5）。由于CYCB1-GFP和CDKB1-Venus图像被解卷积并进行了相同的处理（方法），我们得出结论，CYCB1-GFP在每个周期中都有大量的循环，但CDKB1-Venus没有。
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图 5. CDKB1的活细胞延时：金星TG细胞。
（A）明场图像（右），以及蓝色叶绿体自发荧光和黄色CDKB1-Venus信号的复合物（左）。每个条带顶部指示的时间是延时开始后的小时和分钟。指示的时间对应于每个条带中的顶部单元格。每个后续细胞下降都是每3分钟捕获一次的图像。箭：裂隙沟形成。比例尺：5微米。（B）量化（A）所示细胞中的YFP信号。绿线：总YFP信号;蓝线：最小凸面船体中的估计浓度（每个区域的YFP信号），计算为包含总信号的50%。（C） 12个像元的平均值和s.e.m.的相同图。所有迹线在取平均值之前调整为最大信号 1。在B和C中，注意在切割沟形成之前CDKB1-Venus 1-2帧的可重复浓度峰值。这种模式在连续的循环中重复;平均数据中的峰值强度降低，很可能是由于比较不同细胞的时间略有同步。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009997.g005
尽管在整个细胞上定量的CDKB1-Venus信号在多次分裂周期中保持高水平，但核信号的局部强度在整个细胞周期中变化，在分裂前约6分钟达到峰值（图5）。更强烈的CDBK1-Venus定位的时间大约对应于CYCB1-GFP积累的时间。我们推测CDKB1的有效核定位可能需要CYCB1。
来自单个电影的12个细胞的定量可重复行为如图5所示;具有多个高度背交的cdkb1-1菌株的其他电影给出了一致的结果。在完成末端细胞分裂后，CDKB1-Venus在随后的~1小时内保持弥漫并消失（图5），这表明CDKB1降解可能取决于退出多次裂变期。
EB1-mNeonGreen的活细胞成像揭示了细胞进入有丝分裂时微管结构的调节
微管末端结合蛋白EB1标记生长微管的加端，并为包括衣原体在内的许多系统中的微管依赖性有丝分裂事件提供了有用的标记（简介）。我们使用两种不同的成像方法来精确记录EB1-NG在划分野生型和突变细胞时的行为。在方法1中，我们使用3分钟的间隔和单个Z平面以避免光毒性，并使用精确的温度控制通过多个分频周期对ts致死突变体进行成像，如上所述。方法1也用于间隔20秒的短片。在方法2中，我们使用10秒的间隔和单个Z平面来检查在多次裂变循环的第一部分靠近内侧平面（前点，纺锤体和沟）的EB1标记结构[57]。
当细胞进入有丝分裂时，EB1信号的极性“点”分裂成两个;这两个点略微进入细胞内部，并在极分裂后约4分钟标记成核形成的双极纺锤体的病灶（图6和7以及表1以及S3和S4视频）。请注意，我们使用术语“极性”，“极点”和“极分裂”并不暗示它们与基底体，纺锤体极点或其他已知的基于微管的有丝分裂结构的关系。在衣原体中，基体和纺锤体杆彼此靠近，但在空间上不同[70]。确定这些关系需要多次标记，并且可能还需要超分辨率显微镜，这在技术上具有挑战性，并且与延时不兼容，至少与我们目前的方法不兼容。
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图 6. 野生型EB1：NG-TG细胞的活细胞延时，间隔10秒。
用显微镜方法2获得的活细胞延时，间隔为10秒（参见方法部分）。橙色的EB1-NG信号。PS：极点分离。Sp：纺锤体形成。SPB：主轴故障。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009997.g006
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图 7. 野生型EB1：NG-TG细胞的活细胞延时，间隔3分钟。
使用显微镜方法1获得的3分钟间隔的活细胞延时（参见方法部分）。每个细胞都有一个明场图像（右），黄色的EB1-NG信号和蓝色的叶绿体自发荧光信号（左）的复合。黄色箭头：主轴极分离。蓝色箭头：新纺锤形。白色箭头：新的裂隙沟形成。每个条带顶部指示的时间是延时开始后的小时和分钟。指示的时间对应于每个条带中的顶部单元格。每个后续细胞下降都是每3分钟捕获一次的图像。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009997.g007
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表 1. EB1可分有丝分裂事件的时间。
手动分析不同帧速率的延时短片（顶行），并显示时间间隔的平均和标准偏差（全部以分钟为单位）。“极点”：将EB1前信号分离成两个独立的病灶。“SP1、SP2、SP3”：在 1 中完全形成双极主轴圣, 2第 nd, 3三分手赛。当EB1-NG信号在细胞中线连续时，对纺锤体进行评分，并且信号的方向大致垂直于下面的切割沟。“SP1B、SP2B、SP3B”：主轴故障 1圣, 2第 nd, 3三分手赛。当EB1-NG信号不再垂直于下一个裂解沟时，对主轴击穿进行评分。纺锤体的形成和分解在单个细胞内的后代中高度同步，尽管并非所有纺锤体在每个分裂中都是焦点。为了计算主轴持续时间，或SP到SPB，从主轴击穿的开始帧数中减去第一个可见心轴的帧号，然后乘以帧频率。如果主轴在任何帧中都不可见，则其值为0帧，但前提是前面的PS清晰可见;在这些情况下，假设主轴可能丢失了，因为它在捕获图像时不存在。如果既看不到 PS，也看不到 SP，则不会记录这些值。“CF1、CF2、CF3”：1 中可检测到的裂隙沟起始圣, 2第 nd, 3三分裂的回合（对于后来的分裂，由于图像复杂性，任何后代细胞中的沟形成都被计数）。当可见的压痕与明场中的黑线相关时，CF被评分，与即将到来的细胞分离平面对齐。10秒帧率的电影在26°C;20秒和3分钟的电影在33°C。 条目以分钟为单位：平均值 +/- 标准差（单元格数）。ND：未确定，原因如下：（1）10和20秒帧速率仅适用于第一次分化，因为细胞活力因光照而下降;（2）从仅以3 min分辨率捕获的明场图像中对裂隙沟的形成进行评分。在3 min分辨率下很难有效检测极点分离，因为当可以在相邻帧之间比较移动密度时，最容易观察到。只有PS的后期阶段，一旦两极分离并且非常明亮，就很容易看到。因此，这在3分钟帧速电影中没有评分。有关说明性示例，请参见图 6 和 7 以及 S3 和 S4 视频。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009997.t001
S3视频显示了在第一个分裂周期中以10秒的时间分辨率标记的极点分裂，纺锤体形成，相位和细胞分裂过程均由EB1-NG标记。S4 视频在 3 分钟分辨率下，显示相同的序列在三个顺序分割中重复。如方法中所述，10秒的分辨率导致细胞的充分照射，在第一次分裂后，很少观察到额外的分裂。每3分钟成像一次，允许多次快速分割（图6和7以及S3和S4视频）。
EB1信号检测到的主轴结构具有约4分钟的使用寿命，然后消失;信号保持在大约主轴中区的位置，并且该信号迅速垂直于主轴线伸长（图6和7以及S3和S4视频）。检测到的EB1信号线与垂直于前纺锤轴的裂隙沟（可在成对的明场图像中检测到）重合。EB1信号和裂隙沟在空间和时间上基本上一起延伸（图7）。
由于在明场中可检测到的裂隙沟的形成几乎总是发生在主轴检测后的3分钟框架中（表1），并且CYCB1-GFP降解与裂解沟的形成密切相关（图2;见上文），这些综合结果表明几乎同时纺锤体击穿和CYCB1降解，然后是裂解沟形成。
在多发性裂变中，额外的细胞分裂周期发生在同一母细胞壁内[40]。这些循环是快速且有规律的（表1）。S4视频显示了给定母细胞后代内连续分裂的高度同步性，以及在纺锤体分解后立即以直角显示细胞动力学沟胯的可靠外观。
我们几乎总是观察到两个双极主轴的第二部分同时出现，它们在下一帧中消失，取而代之的是垂直于主轴长轴的两条EB1信号线。在大多数细胞中，在同一帧中可以检测到裂隙沟（图7和S4视频）。有利 3三-分裂细胞，类似的观察可以由四个双极纺锤体组成（图7和S4视频）。我们预计这反映了在后来的分裂中与第一个部分观察到的相似的微管和EB1行为。然而，3 min帧分辨率接近于极分和主轴形成之间以及主轴形成和击穿之间的间隔;因此，在相当大一部分细胞中，我们观察到极点分裂或纺锤体形成，但不是两者兼而有之。
我们在上面提出，在衣原体中，ESP1在调节姐妹染色单体内聚方面具有特异性功能，并且在其他生物体中缺乏为其提出的其他作用（见上文和介绍）。为了进一步测试这一点，我们执行了 esp1 的延时摄影;EB1：非容许温度下的NG-TG应变（S5视频）。在第一个细胞周期中，这些细胞呈现出通常类似于野生型的EB1-NG行为：极分裂，纺锤体形成和分解以及细胞动力学沟的形成。（后来的周期是异常的，难以解释，与经过几次尝试分裂后已经证明的esp1突变细胞的高度异常形态一致[图4A和S5A]）。但是，在第一部分，完全的极到纺锤到沟EB1循环的明显正常执行表明，这些事件中的任何一个都不需要ESP1，这与它在姐妹内聚中的具体参与一致，但在纺锤体控制的其他方面则不然，类似于小鼠细胞的结果[17]。
上述结果为我们提供了野生型EB1标记有丝分裂事件的事件的清晰图片。与CYCB1-GFP积累时间的比较表明，CYCB1的存在与“极点分裂”和纺锤体形成之间存在相关性，CYCB1-GFP消失与纺锤体分解和细胞分裂之间存在相关性。为了确定这些相关性是否反映了因果关系，我们确定了突变体的EB1-NG表型，要么阻断CYCB1-CDKB1功能（cycb1-5或cdkb1-1）要么阻断CYCB1-CDKB1失活（cdc27-6，cdc20-1）。突变体的所有结果均通过多株背交菌株的多株分离株得到证实。
在表达EB1-NG的cycb1-5细胞中（图8和S6视频），我们只观察到EB1-NG信号的前部斑点，就像野生型G1细胞一样，即使在长时间的孵育期（当野生型细胞几乎全部分裂时）。没有观察到极性分裂事件以及随后的纺锤体形成。这与极性分裂和纺锤体形成跟随CYCB1积累的相关结果一致。先前通过抗微管蛋白免疫荧光检测到的纺锤体形成在cdkb1-1和cycb1-5细胞中存在缺陷[28，29]。目前的结果表明，即使在纺锤体形态发生的早期步骤也不会在这些突变背景中发生。这与在没有CDKB1功能的情况下有丝分裂基因簇转录的基本上正常的诱导形成鲜明对比[43]，其中包括许多可能参与纺锤体形态发生的基因。该对比表明，CYCB1-CDKB1依赖性磷酸化对纺锤体形成有特定要求，例如酵母和动物中驱动蛋白马达Eg5的CDK磷酸化[71]。
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图 8. cycb1-5的活细胞延时;EB1：NG-TG细胞。
用显微镜方法1获取的活细胞延时（参见方法部分）。每个细胞都有一个明场图像（右），黄色的EB1-NG信号和蓝色的叶绿体自发荧光信号（左）的复合。每个条带顶部指示的时间是延时开始后的几个小时。指示的时间对应于每个条带中的顶部单元格。每个后续细胞下降都是每30分钟捕获一次的图像。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009997.g008
反过来，我们在上面注意到CYCB1退化的时序非常接近主轴击穿的时序（比较图2和表1）。为了询问这种相关性是否可能反映因果关系，我们通过使用cdc27-6突变（使必需的APC核心亚基失活）灭活APC来阻断CYCB1的去除。我们还用cdc20-1突变测试了APC / CDC20失活。
在两种突变背景中，在限制性温度下表达EB1-NG的细胞经历了极性分裂反应，然后有效地形成双极纺锤体（图9和10，以及S7和S8视频）。一旦形成，纺锤体稳定，持续数小时（与野生型约4分钟相反），与先前使用抗微管蛋白免疫荧光的观察结果一致[29]。没有形成细胞动力学裂解沟;与此相关的是，没有垂直于主轴长轴对齐的EB1-NG信号。
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图 9. cdc27-6的活细胞延时;EB1：NG-TG细胞。
用显微镜方法1获取的活细胞延时（参见方法部分）。每个细胞都有一个明场图像（右），黄色的EB1-NG信号和蓝色的叶绿体自发荧光信号（左）的复合。黄色箭头：主轴极分离。蓝色箭头：新纺锤形。每个条带顶部指示的时间是延时开始后的小时和分钟。指示的时间对应于每个条带中的顶部单元格。每个后续细胞下降都是每3分钟捕获一次的图像。
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图 10. cdc20-1的活细胞延时;EB1：NG-TG细胞。
用显微镜方法1获取的活细胞延时（参见方法部分）。每个细胞都有一个明场图像（右），黄色的EB1-NG信号和蓝色的叶绿体自发荧光信号（左）的复合。每个条带顶部指示的时间是延时开始后的小时和分钟。指示的时间对应于每个条带中的顶部单元格。每个后续细胞下降都是每3分钟捕获一次的图像。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009997.g010
虽然APC-CDC20是姊妹染色单体分离所必需的，因为需要安全蛋白分解导致内聚蛋白裂解，但纺锤体分解不需要酵母和动物中的这些事件[10];因此，我们建议在没有APC的情况下，最有可能负责主轴维护的目标是CYCB1。
在相间期，EB1-NG与从前皮层向后叶移动的“彗星”有关[55]，可能标志着微管的快速生长。这些彗星消失的时间间隔非常短，恰好与纺锤体的存在相吻合（图11A，11C和S7）。在cdc20-1细胞中，纺锤体是稳定的，彗星抑制是永久性的（图11B和11D）。这表明APC-Cdc20依赖于彗星形成抑制剂的降解。
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图 11. 有丝分裂期间细胞质EB1-NG彗星的抑制。
（一、二）表达EB1-NG的野生型（A）和cdc20-1（B）细胞的代表性例子。延时显微镜使用方法3完成（参见材料和方法）。棒材，5微米。（C、 D）代表极点，纺锤体和沟（A，B中的绿色）和细胞质（A，B中的洋红色）的区域被掩盖，如材料和方法中所述。被屏蔽区域中的总信号表示为SEM的平均±（N = 7），单个单元格的值叠加为点。时间零（完全纺锤体的首次出现）是根据经验为每个细胞确定的。有关单个迹线，请参见 S7 图。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009997.g011
有趣的是，当细胞进入有丝分裂时，EB1从彗星到纺锤体极附近的再分布也在拟南芥[66，67]中进行了表征，这表明这种再分布可能通过Viridiplantae（藻类和陆地植物）保存。cyclin-Cdk在拟南芥这种再分布中的具体参与尚不清楚，但12成员cyclin B家族的缺失被证明会干扰准确和及时的有丝分裂纺锤体形成[51]。γ-微管蛋白环复合物结合蛋白GIP1被推荐为CDKB磷酸化靶标，可以解释这一要求[51]。衣原体具有明确的GIP1同源物（Cre14.g610000），但这种蛋白质缺乏拟南芥蛋白中发现的CDK磷酸化位点。
CYCB1和EB1的同步延时显微镜检查
为了研究CYCB1和EB1之间的空间和时间相关性，我们构建了CYCB1：GFP EB1：mScarlet菌株，并用活细胞显微镜观察了第一次分裂（显微镜方法#3与z-stacks）。EB1-mScarlet的定位类似于上面用EB1-NG观察到的：当细胞进入有丝分裂时，极性信号分裂成两个，并且从这两个点形成双极纺锤体;然后纺锤体消失，EB1沿着裂隙沟收集（图6和12;[57]）。
CYCB1-GFP随着假定的核内定位而稳定积累（图12，S9视频）。就在纺锤体形成之前，CYCB1-GFP信号短暂地集中在EB1病灶处或附近（图12，时间点18-20分钟;S9 视频）。这意味着 CYCB1-GFP 定位在未来的主轴极点或附近。当主轴发生故障时，CYCB1-GFP在前主轴中区的大致位置显示瞬态定位到波段;然后CYCB1-GFP完全降解。因此，CYCB1退化和主轴击穿几乎是同时发生的，这与我们比较单独的CYCB1-GFP和EB1-NG薄膜的结论一致（见上文）。
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图 12. CYCB1：GFP的活细胞延时;EB1：mScarlet-TG细胞，间隔1分钟。
使用方法3完成活细胞延时成像（参见方法部分）。成像在27°C下完成。 所选时间范围显示在左侧（分钟）指示的时间。对于DIC和AF（叶绿素自发荧光），显示中段图像;对于EB1-mSc，显示了Z轴的最大投影;对于 CYCB1-GFP，显示了沿 Z 轴的高斯模糊后 Z 堆栈的最大投影。棒材，5微米。请参阅 S9 视频，了解在整个时间序列中包括此单元格在内的更大视野。在这个实验中，我们使用CYCB1：GFP的等位基因，其中内源性CYCB1位点用GFP标记;内源性标记的CYCB1的结果通常与本文其他地方使用的转基因的结果非常相当。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009997.g012
CYCB1对主轴形成的遗传要求，以及CYCB1在主轴形成前对主轴极的定位，表明了通过杆定位CYCB1直接调节主轴装配的推测。
讨论
CYCB1与CDKB1相互作用
先前[29]，我们推断CYCB1是CDKB1酶活性最可能的激活剂，因为CDKB1相关的组蛋白H1激酶活性在cycb1-5细胞的免疫沉淀物中大大降低。在这里，我们确认并扩展了这一发现：CYCB1在来自双标记细胞的免疫沉淀物中结合CDKB1但不结合CDKA1，并且在来自cdkb1-1细胞的免疫沉淀物中不存在CYCB1相关的组蛋白H1激酶活性。
拟南芥中细胞周期蛋白和 CDK 之间相互作用的特异性尚无定论。具有标记蛋白的综合蛋白质组学表明，细胞周期蛋白B特异性地结合CDKB而不是CDKA [72];然而，Boruc等人[73]通过二元相互作用测定表明，CDKB和CDKA都具有结合CYCB和CYCA的能力。Motta等人[51]显示出拟南芥CYCB和CDKBs的优先相互作用，以产生活性组蛋白H1激酶。这一发现与Opisthokont cyclin B与CDKA1直系CDK1结合的特异性形成鲜明对比[1]。正如引言中所讨论的，细胞周期蛋白B对CDKB的调节可能在始祖细胞进化的早期进化。
细胞周期调节和 APC 依赖性 CYCB1 蛋白水解
APC失活大大增加了CDKB1相关的激酶活性，而没有改变CDKB1水平[29]，我们推断这可能是由于阻断APC依赖性CYCB1蛋白水解。在这里，我们表明CYCB1丰度确实受到细胞周期的急剧调节。在细胞分裂周围的一段时间内，CYCB1-GFP蛋白的估计半衰期减少到约3-5分钟，并且降解取决于功能性APC。CYCB1-GFP降解在经历多次裂变的单个母细胞的子后代中急剧同步。这种同步性的基础（无论是由于独立后代细胞中的相同时间，还是细胞之间的通讯）都是未知的。
细胞周期蛋白B积累是所有检查的真核生物中有丝分裂进入所必需的;并且细胞周期蛋白B降解对于有丝分裂退出和进入大多数但不是所有系统中的新细胞周期至关重要，这意味着细胞周期蛋白B强制循环丰富（[1];见介绍）。我们在衣原体中的结果，包括无法通过与CYCB1-db：GFP-TG（删除了保守破坏盒）的转化来补充cycb1-5 ts致死性，这与APC介导的CYCB1降解在衣原体中也是必不可少的一致。我们之前推测CYCB1可能抑制细胞分裂的完成，因为APC失活使CYCB1水平升高与没有裂隙沟有关，而apc;cycb1-5双突变体形成异常部分沟，类似于cycb1-5单突变体产生的异常部分沟[29]。
CYCB1-GFP降解在遗传上依赖于CDKB1以及APC的观察结果可以用两种方式来解释：（1）降解可能仅限于CDKB1复合物中的CYCB1;（2） 激活 APC 可能需要 CYCB1-CDKB1。前者可能不太可能，因为在其他生物体中，APC依赖性降解通常与销毁盒一起转移，即使附加到报告器上[8]。后一种机制可能与动物细胞的结果一致，其中APC-Cdc20的活化依赖于APC亚基的细胞周期蛋白B-Cdk1磷酸化[74]。其机制很复杂：将Cks1-CDK-cyclin招募到APC3的无序区域，促进APC1片段的磷酸化，该片段阻塞Cdc20结合位点;磷酸化APC1不会阻塞该部位，Cdc20被招募[74]。人类APC3和APC1中对这种机制至关重要的区域和磷酸化位点与衣原体同源物对齐不良或根本不对齐，因此任何类似的机制都必须与发散的序列一起运行。在cdc20-1和cks1-1之间杂交的四联分析中[45]，我们观察到双突变体在允许温度下的完全致死性，这表明CDC20和CKS1之间存在一些合作，但我们没有信息将其与CDK激活的CDC20联系起来。
CDKB1水平通过进入“分裂阶段”来调节，但不受细胞周期位置的调节
在蓝藻、蛇夫球菌、肉体和拟南芥（红藻和绿藻、苔藓和陆地植物）的有丝分裂细胞中，CDKB转录和蛋白质积累升高[27，32]。这导致有丝分裂后其降解可能是细胞周期-期特异性的，可能与细胞周期蛋白B降解具有相同的功能，以允许有丝分裂退出[32，37]。我们的结果表明，在衣原体中，情况并非如此。与细胞周期蛋白B不同，CDKB1（唯一的CDKB家族成员）在每次有丝分裂结束时不会被移除。相反，CDKB1仅限于我们所说的“分裂阶段”：一种致力于细胞分裂（无论是一种还是多种）的条件[30，31]。经历多次分裂的细胞在第一次分裂之前使CDKB1保持高水平，直到所有分裂完成（细胞退出“分裂阶段”）;然后迅速降解。由于多次裂变生物学，有丝分裂特异性积累和分裂期特异性积累在衣原体中更容易区分。
我们最近提出，经典对分裂的“承诺”与包括CDKB1在内的大量分裂必需基因转录的激活之间存在等价性[30]。我们推测，这些基因的转录可能在整个多次裂变期间是连续的;分裂之间CDKB1蛋白水平缺乏任何下降与这一观点是一致的。最近我们发现，复制对照蛋白MCM4是有丝分裂转录调节子和CDKB1的成员，随着细胞进入分裂期而积累，保持在较高水平，直到终末分裂，然后降解[68]，因此表现出与CDKB1相似的行为。这与“分裂期”作为离散细胞状态的想法一致，允许细胞周期进展，但独立于特定的细胞周期阶段[30，31]。CDKB1 在 cdc27-6 背景中不会降级（图 3）。CDKB1降解的这种APC依赖性可能是间接的，因为CDKB1缺乏APC依赖性降解的可识别目标（D-box或KEN盒）。APC是退出分部阶段所必需的，因此CDKB1可以稳定地积累在高水平。
通过CYCB1-CDKB1和APC-CDC20调节微管结构
EB1-NG定位反映了生长活跃的MT加末端的位置，被证明是衣原体有丝分裂进展的信息性单细胞标志物[57]。当细胞进入有丝分裂时，EB1-NG定位发生巨大变化[57]：EB1-NG的单极焦点分裂成两部分并分离;然后有丝分裂纺锤体在这两个病灶之间形成，并在分析期前持续约4分钟。特别是在这一时期，间期细胞的皮质彗星特征[55]被完全抑制（图11）。主轴击穿后，EB1-NG信号立即移动到垂直于前主轴轴的“线”上，标志着不断增加的裂隙沟。（请注意，由于这条“线”可以在单个焦点平面上检测到（图7和S4视频），因此它可能反映了垂直于前主轴轴的EB1-NG表面，例如由裂隙沟[75]产生的。衣原体的裂解强烈依赖于微管[56]，并且可以在完全没有F-肌动蛋白[57]的情况下发生，因此EB1-NG的沟槽定位可能反映了细胞分裂过程中必需的微管生长。我们推测，这一线EB1-NG反映了称为“phycoplast”的微管阵列的生长，该阵列标志着（并且可能是）裂隙沟发育所必需的[56，57]。四元小根微管在该阵列中与细胞质微管相邻运行[53]，并可能决定其位置[53，56]。
CYCB1 / CDKB1是此过程的第一步所必需的;停滞的cycb1细胞保持单个前焦点，不会分裂（图8）。由于这些细胞中没有纺锤体形成，因此野生型的极性分裂可能会产生纺锤体产生所需的极点。突变细胞形成初始细胞压痕（“缺口”;[28]）（图9），在EB1-NG前焦点的位置，但没有EB1-NG线延伸到细胞中（如在全细胞分裂中观察到的那样;[57];图 7）被观察到。
在纺锤体形成前1-2分钟将CYCB1定位到纺锤体杆的区域与纺锤极微管组织活性的直接调节一致，尽管我们目前不能排除间接机制。在动物细胞和裂变酵母中，细胞周期蛋白B通过细胞周期蛋白B“疏水贴片”对接基序（[76]及其参考文献）定位于中心体;衣原体CYCB1保留了构成疏水性斑块的所有关键残留物。然而，与衣原体相反，细胞周期蛋白 B 定位到酵母和动物中的纺锤体极可能在实际纺锤体形成之前很久就发生。同样重要的是要注意，在衣原体中，纺锤体极在空间上与基体不同（相当于中心体）[70]。我们不知道CYCB1定位是否特定于基体或纺锤体的一个或另一个。
APC或CDC20的失活对EB1极性分裂或纺锤体形成没有影响，但完全阻断了前期，裂解和细胞分裂;始终如一地，在这些阻塞的细胞中没有观察到垂直于纺锤轴轴的EB1-NG信号的“线”（图9和10）。
这些结果意味着CYCB1 / CDKB1与APC-CDC20对微管结构的形成和分解具有强烈和相反的影响。这些事件发生在刻板的时间间隔内，协调（并且可能由）CYCB1水平和APC-CDC20活性的紧密顺序变化引起。
衣原体具有与CDC20同源物CDH1同源的基因，在其他生物体中也可以激活APC。EB1比较cdc20-1和cdc27-6突变体的结果基本一致，表明这些表型是由于APC的丧失疾控中心20复杂，并且CDH1衣原体不能完全替代CDC20。酵母和动物也是如此，至少部分原因是CDK依赖性抑制CDH1-APC[10]。衣原体CDH1同源物具有多个潜在的N端CDK磷酸化位点[77]，这表明存在类似的调节机制的可能性。
衣原体中的APC很可能在调节姐妹染色单体内聚方面具有关键作用，而与它在调节细胞周期蛋白B水平中的作用无关;这种调节结构是高度保守的[10]。导致DNA复制的APC活性的独立分支在很大程度上是由于在萌芽酵母中，细胞周期蛋白B-CDK依赖性抑制复制起源再加载。这反过来又导致APC失活的要求，因为这些加载的来源的发射需要细胞周期蛋白B-CDK;因此，每轮复制都需要一个完整的周期周期的细胞周期蛋白B/APC活性[1]。在动物中，APC负责双子蛋白的降解，双子蛋白是一种原产地重载抑制剂[1]。在酵母中没有发现双子素，在植物王国中也没有明确的同源物[78]。DNA复制如何局限于每细胞周期一次，以及APC和/或细胞周期蛋白-CDK活性如何参与，在整个植物王国中尚不清楚，尽管与原产地负荷似乎有联系[68]。
通过细胞周期蛋白B-CDK调节微管动力学和纺锤体形态发生可能在整个真核生物中保持保守[76，79]，包括早期分化植物王国（[51];我们的结果）。总体而言，我们观察到衣原体和酵母以及动物之间对细胞周期蛋白B / CDK和APC的作用的强烈保守性，这些作用涉及它们的相互调节及其对细胞周期生物学（包括纺锤体形态发生）的整体影响。这种保护强烈暗示这些监管系统在最后一个真核共同祖先时期已经存在[21]。然而，虽然细胞周期蛋白B在有丝分裂中具有高度保守的作用，但其相关的激酶亚基是CDKB1，而不是像酵母和动物那样的CDK1 / CDKA1;这种替代在植物王国中可能是普遍的[27-29，32，51]。在植物王国中，CDKA1可能特异性于细胞大小控制和G1/S转变[27，30]。因此，衣原体提供了一个独特的机会，可以在高空间和时间分辨率下研究单细胞系统中植物特异性有丝分裂诱导剂CYCB / CDKB的分子调控和有丝分裂功能。
材料和方法
免疫沉淀、免疫印迹和激酶测定
收集用于免疫印迹CYCB1-GFP时间过程的细胞培养物，以wt，cdc27-6或cdkb1-1背景（S1图）为单位，并使用分光光度计中用750nm光测量的光密度（OD）进行平衡。通过氮剥夺同步细胞，如下所示。将平衡的细胞悬浮液置于含有正常量氯化铵的1/10的TAP板上，并孵育24小时。在21°C的光照下。然后将细胞转移到具有正常量氯化铵的TAP板上，并在光照下移动到33°C。当转移到33°C时，将来自每个菌株的细胞悬浮液平均分成单独的TAP板（每个250mL）。在每个收集时间点，收集其中一个复制板的整个细胞内容物用于免疫印迹。使用标准方法进行蛋白质印迹。抗GFP抗体（GF28R，赛默飞世尔科技）在1：2000稀释下使用。信号由ImageQuant LAS 4000成像仪（GE Healthcare）中的化学发光（SuperSignal West Femto，Thermo Scientific）检测。
如上所述，通过氮剥夺同步进行用于CYCB1-GFP免疫沉淀蛋白质印迹和激酶测定的细胞（图1A），然后置于33°C，并在13小时后收集。在33°C时。 为每个基因型收集两个重复。从所有培养物中收集相同的生物量，根据OD进行均衡。收集的培养物具有以下OD值：未标记的WT #1，0.70;未标记的 WT #2， 0.45;WT #1， 0.55;WT #2， 0.70;cdc27-6 #1， 0.52;cdc27-6 #2， 0.62;cdkb1-1 #1， 0.59;cdkb1-1 #2， 0.45.从所有培养物中分离出相同的体积（5mL），然后将它们重悬在等于上述OD值的毫升数中。最后，从所有重悬培养物中收集0.2 mL。
免疫沉淀如[29]所述进行，除了CYCB1-GFP被拉下抗GFP纳米体LaG41，这是Peter Fridy和Michael P. Rout的礼物[80]。将总细胞裂解物的一小部分样品用于CYCB1-GFP检测的蛋白质印迹，然后在剩余的总细胞裂解物上用抗GFP纳米体进行免疫沉淀。所有蛋白质印迹均使用标准方法在1：2000稀释时使用抗GFP抗体GF28R（赛默飞世尔科学） 完成。激酶测定如前所述进行[29]。
在通过CYCB1-GFP免疫沉淀检测CDKA1-mCherry或CDKB1-mCherry的实验中（图1B），通过氮剥夺同步并收集13小时后收集细胞。在33°C时，如上所述。收集的培养物具有以下OD值：WT #1，0.44;WT #2， 0.49;CYCB1-GFP #1， 0.33;CYCB1-GFP #2， 0.51;CDKA1-m樱桃 #1， 0.50;CDKA1-m樱桃 #2， 0.63;CYCB1-GFP CDKA1-m樱桃 #1， 0.59;CYCB1-GFP CDKA1-m樱桃 #2， 0.78;CDKB1-m樱桃 #1， 0.62;CDKB1-m樱桃 #2， 0.88;CYCB1-GFP CDKB1-mCherry #1， 0.52;CYCB1-GFP CDKB1-mCherry #2， 0.88.收集的生物质以与上面描述的图1A中的实验相同的方式进行均衡。
在该实验（图1B）中，CYCB1-GFP的免疫沉淀是使用上述相同的方法和相同的抗GFP纳米体（LaG41）完成的。共免疫沉淀的CYCB1-GFP和CDKA1-mCherry或CDKB1-mCherry的蛋白质印迹是用如上所述的标准方法完成的。抗GFP抗体（GF28R，赛默飞世尔科技）在1：2000稀释下使用。抗mCherry抗体（16D7，赛默飞世尔科技）也用于1：2000稀释。
菌株构建和生长
在用转基因进行初始转化后，所有应变结构均通过交配和四联分析。cdkb1-1和cdc27-6（称为div23）在[28]中被分离出来，并在[28，29]中表征。cycb1-5的特征见[29]。cdc20-1的分离和表征见[45]。scc2-3 （chr6：C4382319T;G600E;按照[45]中的程序被分离出来。
在分析之前，将温度敏感突变和反式基因繁殖回交至野生型（在大多数情况下为4-5次），并测试多个独立的菌株，以确保结果是由于指示的基因型而不是未知的背景突变。菌株在TAP介质中的连续光下保持。
荧光报告基因结构
CYCB1：GFP-TG.
我们构建了一个质粒，其中包含CYCB1上游的1.3 kb基因组DNA，然后是带有内含子的CYCB1编码序列;终止密码子被3个拷贝的GlyGlyGlyGlySer连接序列替换，后跟GFP。在GFP终止密码子之后，质粒含有来自CDKB1的3'UT区域的1.1 kb，然后是含有巴龙霉素抗性盒的1 kb片段。
我们线性化了该质粒，并通过电穿孔转化了cycb1-5菌株，如上所述[29]。我们以两种方式回收转化子：要么通过在21度（cycb1-5的允许温度）下选择巴龙霉素，要么在33度（非允许温度）下选择不含巴龙霉素。由于未知的原因，可能与衣原体中转化DNA的已知片段化有关，所有测试的耐巴龙霉素菌落都是对温度敏感的，并且没有一个耐温菌落对巴龙霉素耐药。我们选取了一种耐温转化子，通过PCR在含有GFP的单个位点之间的四元分析中发现了连锁反应，并挽救了cycb1-5的温度敏感性。在三个实验中，具有相同质粒的平行转化与CYCB1破坏盒的缺失[29]未能产生任何耐温转化子，而具有完整破坏盒的CYCB1-GFP产生的菌落比可靠计数的要多，但每个实验中至少有100个。通常，巴龙霉素对CYCB1-GFP的抗性联系较低（可能是由于衣原体中转化DNA的频繁降解）排除了使用该标记物进一步分析CYCB1-db-GFP缺乏救援的情况。
衣原体转基因经常受到随机沉默[81]。我们通过在转基因菌株背景中保持cycb1-5，并在延时显微镜检查之前在非宽松温度下选择培养物，在很大程度上消除了CYCB1：GFP-TG的这个问题（见下文）。即使采取这种预防措施，我们也观察到延时散发细胞未能表达CYCB1：GFP-TG，而是以cycb1-5的特征形态阻止[29]。
EB1.
为了构建pMO699（EB1-mSC），pCrEB1-NG [55]中的mNeonGreen序列被XhoI位点切除，并用mScarlet-I[从mScarlet-I-mTurquoise2（Addgene，质粒#98839）[82]通过Gibson组装进行线性化。
在一个实验（图12和S9视频）中，我们使用CYCB1：GFP的等位基因，其中CYCB1的内源性拷贝用GFP标记。内源性标记的CYCB1-GFP的行为类似于本文报道的所有其他实验中使用的转基因表达的CYCB1-GFP。所有表达内源性标记的EB1-mNG或CYCB1-GFP的菌株都是通过CRISPR介导的标记制成的单亲菌株的后代。CRISPR程序在很大程度上如前所述[83]使用来自Integrated DNA Technologies的Alt-R sgRNA和S.p.Cas9核酸酶V3完成。用于EB1标记的sgRNA序列：GAAACACAAGTGGAGTTCGCGGG。用于CYCB1标记的sgRNA序列：ACAGGGAAAGCACAGCTCATGGG。
延时显微镜。
使用了多种成像方法。方法#1用于3 min间隔的单Z平面成像和低荧光曝光时间，以避免细胞光毒性并通过多个分裂周期对细胞进行成像。方法#2用于单个Z平面上的10或20秒间隔电影。方法#3用于具有高荧光曝光时间的1分钟间隔电影。这些方法是相辅相成的。频繁的曝光，高曝光时间和多个Z平面允许对单个细胞分裂中的事件进行高分辨率检测，但成像细胞通常在不久之后失去活力;虽然方法#1的整体照明要低得多，但降低了时间和空间分辨率，但允许对整个多次裂变周期进行可靠的成像（在该过程结束时，活细胞经常从母体中孵化并游走，证明完全成功的多次裂变循环）。
方法#1。
将细胞从TAP板上的2天培养物中取出，转移到液体TAP中4小时。为了使细胞变得运动，然后将游泳细胞与分裂和其他非运动细胞和碎片分开。这种分离是通过移液500μL液体细胞培养物，从移液器中取出移液器尖端，然后将移液器尖端放入含有500μLTAP + 2%Ficoll的另一个吸头中来实现的，使得含有细胞的移液器尖端的末端与Ficoll接触。然后将白色LED（Evan Designs）放置在移液器尖端对的宽端上。然后将这个完整的设备放入一个黑暗的外壳中。由于LED是外壳内唯一的光源，细胞游离光线，进入Ficoll，并收集在移液器尖端的末端。一旦足够数量的运动细胞穿过Ficoll并积聚在移液器尖端上，移液器尖端被移除，并且通过轻轻按压移液器尖端的宽端将细胞推出。这种“游泳选择”的群体主要由小到中等的运动细胞组成（由于Ficoll的高密度），很少有大细胞或分裂细胞被较小细胞的流动所携带。
为了固定游泳选择的细胞进行长期延时显微镜检查，它们在收集后立即放置在琼脂糖培养基上，类似于Di Talia等人使用的细胞。[84]用于发芽酵母显微镜检查。但是，Di Talia等人采用的设置。[84]涉及将大型琼脂糖板紧密地放在玻璃盖玻片上，并用透明的塑料片覆盖，然后用石蜡沿着边缘密封。由于以下原因，该设置不能用于衣原体的长期显微镜检查。首先，与发芽酵母不同，衣原体细胞是运动的，因此将琼脂糖板紧密地放在盖玻片上允许细胞从一个板跳到另一个板块的可能性（如果在板之间形成连接层液体）。其次，为了制作长期电影（20小时），必须尽量减少琼脂糖的干燥。在琼脂糖板上放置一个大塑料盖，导致在电影过程中有足够的干燥，细胞经常完全漂移出场外。干燥也会导致细胞沿着z轴移动，因此需要非常大的自动对焦范围。一个大塑料盖还通过冷凝收集其内表面的水，这在我们打算制作电影的温度（33.3°C）下非常重要。
为了避免这些问题，我们设计了一个具有一个开口侧的小圆柱形腔室（内径：5mm;内高：3.5 mm;壁径：1 mm）。该腔室由洛克菲勒大学精密仪器技术设施的激光切割机由透明丙烯酸板制成。腔室的桶部分是通过在3.5毫米厚的丙烯酸板上切割两个同心圆制成的。内圆的直径比外圆小2毫米，因此枪管的侧面宽1毫米。通过将透明的1毫米厚的丙烯酸板切割成直径等于桶外径的圆圈来制作盖子。然后将盖子用丙烯酸水泥（Scigrip）连接到桶上。
将含有1.5%SeaKem NuSieve GTG琼脂糖（龙沙）的熔融TAP倒入腔室中至顶部以上3毫米的水平，并将载玻片放置在盒子上边缘上方1.5毫米处，使琼脂糖变平。将琼脂糖在室温下固化10分钟，然后取出载玻片。将细胞移液（0.5μL）到琼脂糖表面上，并在室温下保持15分钟，以使表面干燥。琼脂糖边缘被修剪，使暴露的琼脂糖表面始终是平坦的。将盒子的细胞侧放置在24 x 50毫米的玻璃盖玻片（Fisherbrand）上，并用VALAP（等质量的凡士林，石蜡，羊毛脂）密封暴露的琼脂糖部分。当使用多个细胞室时，它们被放置在相距1厘米处（中心到中心）。与玻璃相比，塑料盖玻片（Rinzle和ACLAR，均来自电子显微镜科学）偶尔会产生更好的细胞活力和分裂数（主要是3个分裂，而玻璃上有2个分裂），但这种差异在批次之间是不规则的。我们目前供应商的玻璃盖玻片（Fisher Scientific 'Fisherbrand' Cat. No. 12-545-F）在维持细胞活力方面一直优于Rinzle或ACLAR塑料，大多数细胞分裂3-4次。与塑料相比，玻璃还具有自发荧光更低、弯曲更小的额外好处，从而减少沿 z 轴的漂移，使自动对焦更容易。
在徕卡DMI6000B倒置显微镜上使用63X物镜进行延时显微镜检查，物镜和载物台加热至33.3°C。 图像是使用定制软件获取的，如前所述，用于发芽酵母显微镜[85]，但进行了修改以改善衣原体的自动聚焦。我们获得了明场图像而不是相差，因为明场允许更可靠的自动对焦。使用徕卡EL6000汞弧灯和30%中性密度滤光片获取荧光图像。GFP图像是使用色度（Cat. No. 49020）的窄带eGFP滤光片集在0.4 s曝光下拍摄的，以尽量减少自发荧光。Venus和mNeonGreen（NG）图像是使用Chroma（Cat. No. 49003）的eYFP滤镜以0.3秒的曝光率拍摄的。对于叶绿体背景，我们使用Chroma的Cy5滤光片集（Cat. No. 49006）采集了0.003秒曝光的图像。
在衣原体中，叶绿体荧光在大多数波长下都是可检测到的，这严重干扰了相当暗淡的CYCB1-GFP信号的检测。我们开发了一个简单的反卷积程序，从GFP中减去叶绿体背景（见下文）。
为了为细胞在帧之间提供光合作用的照明，我们将白色LED（Evan Designs）放置在细胞室上方10 mm，距离成像轴7 mm，因此细胞位置的辐照度为150μmol光子m-2s-1.LED安装在覆盖牢房的3D打印塑料外壳上。从上面透射的光路没有受到阻碍，因为使用透明的塑料ACLAR薄膜（电子显微镜科学）作为顶部。该外壳还通过部分隔离环境温度波动来帮助保持电池室的温度稳定性。LED 连接到计算机控制的开/关定时器 （PowerUSB）。LED灯在透射光/荧光图像采集期间关闭，然后在剩余大部分时间内亮起，直到下一帧。由于延时图像采集计划和外部LED灯开/关定时器之间的不完全同步，因此在LED关闭时间上增加了10-20秒，允许在3分钟帧之间至少90秒的LED照明。
延时短片过程中的温度稳定性和准确性非常重要。我们发现，在上述显微镜设置中，野生型细胞在34°C及以上是不可存活的。许多对温度敏感的突变体在33°C以下不会紧紧停滞。 因此，我们的电影是在33.3°C（±0.3°C）下完成的。为了精确测量细胞位置的温度，我们在琼脂糖显微镜室中嵌入了一个直径为0.1毫米的热电偶（PerfectPrime TL0201）。为了保持这个小温度范围，我们使用由烤箱工业5C7-195控制器运行的帕尔贴模块加热物镜（使用铝制环）和载物台（使用铝嵌件）。为了最大限度地减少舞台上方和下方气流的影响，我们用铝箔覆盖了舞台下方的开口，并在舞台上方使用了3D打印的塑料外壳。外壳在洛克菲勒大学的精密仪器技术设施中打印。
方法#2。
如前所述[57]。
方法#3。
使用26°C下的12L：12D光循环同步电池。 在?11小时，通过离心收集细胞并点在一小块TAP + 1.5%低熔点琼脂糖（Bio-Rad）上，然后将其置于玻璃底18孔室（Ibidi）中并用额外的TAP +低熔点琼脂糖密封。使用配备HC PL APO 63X / 1.40 N.A.油浸物镜的徕卡Thunder倒置显微镜和保持在27°C的OkoLab培养箱进行成像。 使用以下LED激励和发射滤光片组合捕获信号：CYCB1-GFP和EB1-NG的510 nm和535/15 nm;EB1-mSc 为 550 nm 和 595/40 nm;640 nm 和 705/72 nm 用于叶绿素自发荧光 （AF）。以2分钟的间隔捕获延时图像，Z间距为0.6μm，覆盖9μm;用0.21μm Z间距捕获静止图像，覆盖10-15μm。获取的荧光图像通过Thunder大体积计算清除和解卷积（Leica）进行处理。从GFP图像中除去背景叶绿体信号基本上如下所述。图12和S9视频使用了15张CYCB1-GFP和EB1-mSC z堆叠图像的最大投影。CYCB1-GFP的最大投影是颗粒状的，因为信号接近背景;在计算最大投影之前，GFP堆栈的高斯模糊减少了这个问题（0.5 * 图像（n-1）+ image（n） + 0.5 * image（n））。
EB1-NG信号的定量
代表极点、有丝分裂纺锤体和沟槽的“峰值”蒙版是通过在 ImageJ 中应用高斯模糊滤波（1.5 像素）和默认阈值滤镜，从 MAX 投影的 EB1-NG 图像创建的。通过应用高斯模糊滤波（2像素）和三角形阈值滤镜，从MAX投影的AF图像中生成代表整个细胞体的蒙版。从该掩模中减去“峰值”区域产生一个基本上覆盖细胞质的掩模。与图中所示的中段图像不同，该MAX投影使用适当的阈值覆盖二值化后的大部分细胞体，除了薄皮质层未被覆盖。应用强烈的2像素模糊来扩展信号，以便生成的掩模覆盖皮层。在相间细胞中，该细胞质面罩下的EB1信号主要是由于EB1的离散“彗星”沿着皮层行进到细胞后部[55]。EB1-NG的信号在均匀减去与非细胞区域强度相对应的背景后，在每个掩模中定量。
延时图像分析的反卷积
叶绿体的自发荧光占CYCB1-GFP或CDKB1-Venus检测总信号的绝大多数。我们开发了一个简单的计算反卷积过程，在很大程度上纠正了这个问题。关键观察结果是，由于光合色素的广泛激发和发射光谱，叶绿体可以用GFP，YFP或RFP特异性过滤器检测;相比之下，GFP和YFP在RFP检测下没有信号。最亮的RFP信号总是在已知叶绿体所在的细胞后部区域检测到。因此，假设叶绿体色素在细胞中的所有点都具有相同的GFP：RFP检测比例，那么给定用于GFP和RFP检测的成对图像，从高RFP像素（可能纯粹来自叶绿体）确定该比率是很简单的（S2图）).这种反卷积是使用对每个图像使用相同的算法自动执行的。为了考虑电影中灯泡强度或曝光时间的可能变化，为系列中的每个图像分别计算反卷积比。假设F是具有最高红色信号（纯叶绿体）的像素中红色与绿色信号的平均比率。考虑另一个可能同时包含叶绿体和CYCB1-GFP信号的像素。如果CYC是来自该像素的CYCB1-GFP的信号量，并且来自该像素的绿色和红色信号总数分别为G和R，则
G = FR + k*CYC，其中 k 是反映给定量 CYCB1-GFP 的绿色排放的常数。因此，该像素中的CYCB1量（以任意单位）为：
CYC = （G-FR）/k
假设在电影中的灯泡强度和曝光相似，k是一个常数，以CYCB1-GFP的任意单位埋藏。鉴于上述假设，这导致CYCB1-GFP的线性测量值在图像之间和序列图像之间具有可比性，并去除了叶绿体对绿色信号的贡献。
这种方法确实依赖于足够的真实GFP信号来克服叶绿体强度的微小波动，暴露之间的叶绿体运动等。我们认为S2 Fig在本例中证明了系统的合理性;显然，反卷积的主要影响是丢弃不是由于GFP引起的背景，并且该过程不会引入初始未卷积数据中不存在的人工峰或谷值。
同样的程序也适用于YFP。
可根据要求提供执行反卷积的 MATLAB 代码。
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通过免疫印迹检测野生型、cdc27-6 或 cdkb1-1 背景中的 CYCB1-GFP。
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S1 图 通过免疫印迹检测野生型、cdc27-6 或 cdkb1-1 背景中的 CYCB1-GFP。
野生型、cdc27-6 或 cdkb1-1 背景中 CYCB1-GFP 的抗 GFP 免疫印迹。如上所述[29]，通过氮剥夺在G1中阻断细胞，然后在完全培养基中置于限制性温度（33°C）下，并在指示的小时数后收集。所有菌株均具有由CYCB1：GFP-TG转基因拯救的温度敏感的cycb1-5。负载控制来自免疫布洛特的非特异性抗GFP信号。CYCB1-GFP检测来自WT和突变体的相同暴露量，并行检测;负荷对照（与抗GFP抗体反应的非特异性条带）来自不同的暴露，但菌株之间具有类似的可比性。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009997.s001
（断续器）
S2 图 显微镜图像中叶绿体自发荧光的减法图示。
使用单个CYCB1：GFP-TG细胞的自发荧光减影方法。第一列：RFP检测（蓝色）（仅叶绿体信号）。第二列：仅GFP检测通道（CYCB1-GFP信号+叶绿体信号）。第三列：前两列的组合。第四列：反卷积后残留的GFP信号（去除叶绿体信号对GFP通道的贡献，仅留下CYCB1-GFP信号）。第五列：RFP通道（仅叶绿体）和解卷积绿色通道（仅CYCB1-GFP信号）的复合。底部：量化总RFP和GFP信号（左图）以及反卷积前后的GFP信号浓度（黑线）。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009997.s002
（断续器）
S3 图例 CYCB1-GFP在cdkb1-1背景中的活细胞延时。
用显微镜方法1获取的活细胞延时（参见方法部分）。每个细胞都有一个明场图像（右），黄色的CYCB1-GFP信号和蓝色的叶绿体自发荧光信号（左）的复合物。每个条带顶部指示的时间是延时开始后的小时和分钟。指示的时间对应于每个条带中的顶部单元格。每个后续细胞下降都是每3分钟捕获一次的图像。我们假设在11：21的一帧中没有任何CYCB1-GFP信号是由于激励或快门打开失败而无法采集该单个帧;这是所用延时设置的一个罕见的间歇性问题。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009997.s003
（断续器）
S4 图 野生型流式细胞术，cdc20-1，esp1-2，有或没有scc2-3。
（A）如上所述[29]所述，将野生型，cdc20-1，esp1-2突变体与不带scc2-3的G1通过氮剥夺阻断，然后在完全培养基中置于限制性温度（33°C）下，13和15小时后收集，并通过流式细胞术进行分析。对于每个时间点和基因型，DNA含量直方图（计数与荧光信号）显示DNA补体数，正向散射与荧光信号图反映细胞大小。参见Tulin & Cross 2014 [28]， Cross 2020 [30]，了解本程序中DNA和细胞大小信号的解释。esp1-2的致病突变为W2316R[28]。在单独的实验中，我们将esp1-2的停滞表型与其他等位基因进行了比较：esp1-1（W2211L），esp1-4（F2185L），esp1-6（L1284P）和esp1-7（W179R）。所有通过FACS产生高倍体细胞（延伸至8C）;FACS样品的显微镜检查显示，几乎所有的DNA染色都在单个大核中，如图4所示。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009997.s004
（断续器）
S5 图例 cdc20;esp1和scc2;esp1双突变体的分析。
（A）将来自cdc20 x esp1杂交的一个四联的固定相细胞在限制性温度（33°C）下接种在新鲜完全培养基上，并在13，14，15小时通过显微镜观察。cdc20;ESP1 和 cdc20;esp1 segregants 在形态上是无法区分的。（B）在允许温度（21°C），部分限制性温度（30°C）和完全限制性温度（33°C）下，在TAP琼脂上修补的scc2 x esp1交叉修补的隔离剂的比较。在我们的筛选中分离出的scc2突变[45]似乎有些泄漏，允许在非允许温度下有限增殖;在此温度下产生的细胞在很大程度上是不可存活的[45]。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009997.s005
（断续器）
S6 图 野生型、cdc20-1、esp1-2 和 cdc20-1;esp1-2 的流式细胞术。
（A）野生型、cdc20-1、esp1-2和cdc20-1;如上所述，通过氮剥夺在G1中阻断esp1-2细胞，然后在限制性温度（33°C）下置于完全培养基中，13和15小时后收集，并用流式细胞术进行分析。对于每个时间点和基因型，DNA含量直方图（计数与荧光信号）显示DNA补体数，正向散射与荧光信号图反映细胞大小。与细胞分裂一样，cdc20 完全上位于 esp1。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009997.s006
（断续器）
S7 图 图12中用于定量的单个细胞的痕量。
上行和下行分别显示了图12中绿色和洋红色掩码下的总信号。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009997.s007
（断续器）
S1 视频。 CYCB1-GFP通过3个部门。
左上角：蓝线：RFP（叶绿体）信号。黄线：解卷积的 CYCB1-GFP 信号。前 2 名第 nd图：黄色：总GFP信号;黑色：计算出一个最小凸起的船体，其中包含总细胞GFP信号的50%并计算出浓度;3三：凸起船体中强度的直方图;4千：GFP强度的表面图。下图：明场（左）和荧光（右）。黑线：手动选择的单元格轮廓。白线：计算凸起的船体。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009997.s008
（MP4）
S2 视频。 CDKB1-1 背景中的 CYCB1-GFP。
图表和图像，如S1视频中所示。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009997.s009
（MP4）
S3 视频。 野生型EB1：NG-TG细胞中第一次分裂的活细胞延时，间隔10秒。
用显微镜方法2获得的活细胞延时，间隔为10秒（参见方法部分）。蓝色的EB1-NG信号。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009997.s010
（MP4）
S4 视频。 野生型EB1：NG-TG细胞的活细胞延时，进行3轮多次裂变，间隔3分钟。
使用显微镜方法1获得的3分钟间隔的活细胞延时（参见方法部分）。左边的图像是明场，右边的图像是黄色的EB1-NG信号和蓝色的叶绿体自发荧光信号。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009997.s011
（MP4）
S5 视频。 esp1的活细胞延时;EB1：NG-TG细胞。
用显微镜方法1（参见方法部分）获取的活细胞延时，间隔3分钟。左图为明场，右图为绿色EB1-NG信号，叶绿体自发荧光信号为红色。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009997.s012
（MP4）
S6 视频. cycb1-5的活细胞延时;EB1：NG细胞。
用显微镜方法1（参见方法部分）获取的活细胞延时，间隔3分钟。左边的图像是明场，右边的图像是黄色的EB1-NG信号和蓝色的叶绿体自发荧光信号。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009997.s013
（MP4）
S7 视频. cdc27-6的活细胞延时;EB1：NG-TG细胞。
用显微镜方法1（参见方法部分）获取的活细胞延时，间隔3分钟。左边的图像是明场，右边的图像是黄色的EB1-NG信号和蓝色的叶绿体自发荧光信号。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009997.s014
（MP4）
S8 视频. cdc20-1的活细胞延时;EB1：NG-TG细胞。
用显微镜方法1（参见方法部分）获取的活细胞延时，间隔3分钟。左边的图像是明场，右边的图像是黄色的EB1-NG信号和蓝色的叶绿体自发荧光信号。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009997.s015
（MP4）
S9 视频. CYCB1：GFP的延时显微镜;EB1-mScarlet细胞。
CYCB1：GFP的活细胞延时;EB1：mScarlet细胞，通过显微镜方法3获得1分钟间隔，具有15个z-堆栈（参见方法部分）。从左到右：DIC（以分钟为单位的时间：秒表示）;EB1-mSC;CYCB1-GFP;叶绿体自发荧光;CYCB1-GFP（绿色）和EB1-mSC（洋红色）重叠。GFP图像被解卷积以去除叶绿体的贡献（方法）。过滤GFP z图像（0.5 *图像（n-1）+图像（n）+ 0.5*（n-2），然后计算最大投影。该程序旨在最大限度地提高细节，同时最大限度地减少颗粒度。EB1-mSC图像是最大投影。缺乏GFP的EB1-mSC细胞显示从mSC到GFP通道没有出血。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009997.s016
（MP4）
确认
我们感谢Karl Lechtreck分享EB1：NG-TG和抗EB1抗体。我们还感谢衣原体资源中心提供必需的菌株和试剂。
引用
1.摩根 DO.细胞周期，控制原理。综合和比较生物学。2007.
查看文章谷歌学术搜索
2.Jeffrey PD， Russo AA， Polyak K， Gibbs E， Hurwitz J， Massagué J， et al.CDK激活的机制由细胞周期蛋白A-CDK2复合物的结构揭示。自然界。1995;376.pmid：7630397
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
3.Loog M，Morgan DO.细胞周期蛋白在细胞周期蛋白依赖性激酶底物磷酸化的特异性。自然界。2005;434: 104–108.pmid：15744308
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
4.Bloom J，Cross FR.细胞周期控制中多层次的细胞周期蛋白特异性。2007;8： 149–160.pmid：17245415
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
5.Murray AW， Kirschner MW.多米诺骨牌和时钟：细胞周期的两个视图的并集。科学。1989;246: 614–621.pmid：2683077
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
6.Murray AW， Solomon MJ， Kirschner MW.细胞周期蛋白合成和降解在控制成熟促进因子活性中的作用。自然界。1989;339: 280–286.pmid：2566918
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
7.Kearsey SE，Cotterill S.神秘变异：调节真核DNA复制的不同模式。分子细胞。2003. pmid：14636567
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
8.Glotzer M， Murray AW， Kirschner MW.细胞周期蛋白通过泛素途径降解。自然界。1991;349: 132–138.pmid：1846030
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
9.Visintin R，Prinz S，Amon A. CDC20和CDH1：APC依赖性蛋白水解的底物特异性激活剂家族。科学（1979年）。1997;278.pmid：9334304
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
10.Zachariae W， Nasmyth K. 誰的終點是破壞：細胞分裂和促性相複合物。基因和发育。1999. 第2039–2058页.pmid：10465783
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
11.何J，Chao WCH，Zhang Z，Yang J，Cronin N，Barford D.APC / C共激活剂从Acm1-Cdh1复合物的结构中对degron识别的见解。分子细胞。2013. pmid：23707760
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
12.有丝分裂细胞周期蛋白clb3的降解不是有丝分裂出口所必需的，但对于G1细胞周期蛋白控制后续细胞周期是必要的。遗传学。2016. pmid：27794027
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
13.有丝分裂细胞周期蛋白 Clb2 的 APC 依赖性蛋白水解对于有丝分裂退出至关重要。自然界。2002;418: 556–562.pmid：12152084
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
14.古尔格雄 S， 霍尔特 LJ， 坎德 WZ.贾第鞭毛虫细胞周期独立于促缺相复合物进行。细胞科学杂志。2013;126.pmid：23525017
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
15.沙利文 M， 乌尔曼 F.分离酶的非蛋白水解功能将分析期的发作与有丝分裂出口联系起来。国家细胞生物学. 2003;5： 249–254.pmid：12598903
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
16.Sullivan M，Lehane C，Uhlmann F.编排分析期和有丝分裂出口：Slk19的分离酶裂解和定位。2001;3.pmid：11533655
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
17.Wirth KG，Wutz G，Kudo NR，Desdouets C，Zetterberg A，Taghybeeglu S等人。 Separase：姐妹染色单体分离的通用触发因素，但不是染色体周期进展。细胞生物学杂志。2006;172.pmid：16533945
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
18.Tsou MFB，Wang WJ，George KA，Uryu K，Stearns T，Jallepalli P v. Polo Kinase和Separase调节人体细胞中Centriole重复的有丝分裂许可。发育细胞。2009;17.pmid：19758559
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
19.桑顿 BR， 托奇斯基 DP.Securin和B-cyclin / CDK是APC的唯一基本目标。自然细胞生物学。2003. pmid：14634663
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
20.Edgar BA，Sprenger F，Duronio RJ，Leopold P，O'Farrell PH.独特的分子机制在果蝇胚胎发生的连续阶段调节细胞周期时间。基因和发育。1994;8.pmid：7510257
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
21.罗戈津 IB， 巴苏 MK， Csür?s M， 库宁 E v.对罕见基因组变化的分析不支持Unikint-Bikont系统发育，并建议蓝藻共生作为真核生物的主要辐射点。基因组生物学与进化。2009. pmid：20333181
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
22.迪斯迈尔N，韦默AK，德维尔德L，诺瓦克B，施尼特格A.与酵母或后生动物相比，植物细胞周期进展的调节网络根本不同。植物信号和行为。2010;5.pmid：21139435
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
23.Harashima H，Dissmeyer N，Schnittger A.整个真核王国的细胞周期控制。细胞生物学趋势。2013. pmid：23566594
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
24.de Veylder L， Beeckman T， Inzé D.植物细胞周期的来龙去脉。自然评论分子细胞生物学。2007. pmid：17643126
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
25.Inzé D， de Veylder L. 植物发育中的细胞周期调节。遗传学年度回顾。2006. pmid：17094738
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
26.Vandepoele K，Raes J，de Veylder L，Rouzé P，Rombauts S，Inzé D.拟南芥中核心细胞周期基因的全基因组分析。植物细胞。2002;14.pmid：11971144
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
27.Nowack MK， Harashima H， Dissmeyer N， Zhao X， Bouyer D， Weimer AK， et al. 拟南芥中细胞周期蛋白依赖性激酶功能的遗传框架.发育细胞。2012. pmid：22595674
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
28.图林F，十字FR。在植物超级王国中控制细胞周期的微生物途径。植物细胞。2014. pmid：25336509
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
29.ATkins KC，Cross FR.CDKA / CDK1和植物特异性细胞周期蛋白依赖性激酶CDKB的间调控衣原体细胞周期。植物细胞。2018. pmid：29367304
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
30.通过CDKA1和衣原体Rb-E2F途径调控多元裂变和细胞周期依赖性基因表达。当前生物学。2020. pmid：32243861
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
31.Heldt FS， Tyson JJ， Cross FR， Novák B.单个光响应式定径器可以控制衣原体的多次裂变周期。当前生物学。2020. pmid：31928875
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
32.Corellou F， Camasses A， Ligat L， Peaucellier G， Bouget FY.绿色谱系特异性 B 型细胞周期蛋白依赖性激酶的非典型调控。植物生理学。2005. pmid：15965018
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
33.Sumiya N， Fujiwara T， Era A， Miyagishima SY.真核藻类中的叶绿体分裂检查点。美国国家科学进展 2016;113.
查看文章谷歌学术搜索
34.Brawley SH， Blouin NA， Ficko-Blean E， Wheeler GL， Lohr M， Goodson H v.， et al.深入了解红藻和真核进化从斑卟（Bangiophyceae，Rhodophyta）的基因组。美国国家科学进展 2017;114.pmid：28716924
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
35.Huysman MJJ，Tanaka A，Bowler C，Vyverman W，de Veylder L.硅藻细胞周期蛋白依赖性激酶A2作为有丝分裂调节剂的功能表征揭示了非绿色谱系中的植物样特性。BMC 植物生物学.2015;15.
查看文章谷歌学术搜索
36.Genschik P，Criqui MC，Parmentier Y，Derevier A，Fleck J.植物中的细胞周期依赖性蛋白水解：鉴定蛋白酶体抑制剂MG132产生的破坏盒途径和中期停滞。植物细胞。1998;10.pmid：9836745
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
37.Adachi S，Uchimiya H，Umeda M.B2型细胞周期蛋白依赖性激酶的表达由拟南芥中的蛋白质降解控制。植物和细胞生理学。2006. pmid：17099223
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
38.Weingartner M， Criqui MC， Mészáros T， Binarova P， Schmit AC， Helfer A， et al.不可降解的细胞周期蛋白B1的表达影响植物发育，并通过抑制膈肌母细胞的形成导致内斜视。植物细胞。2004. pmid：15004270
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
39.Sasabe M，町田Y.控制植物细胞分裂的信号通路。酶。2014. pmid：25740718
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
40.克罗斯FR，乌门JG。衣原体细胞周期。植物学报.2015.
查看文章谷歌学术搜索
41.[2] 潘奇N， 吴国， 牛顿L， 蔡春， 陈军， 本宁 C， 等.莱因哈蒂衣原体中双链体转录的患病率、进化和顺式调控。G3：基因，基因组，遗传学。2014;4.pmid：25354782
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
42.Strenkert D， Schmollinger S， Gallaher SD， Salomé PA， Purvine SO， Nicora CD， et al.衣原体生命中一天分子事件的多组学分辨率。美国国家学院学报 2019;116.
查看文章谷歌学术搜索
43.Tulin F，Cross FR.周期蛋白依赖性激酶调节衣原体中昼夜转录。植物细胞。2015;27.pmid：26475866
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
44.区域JM，Blaby IK，Merchant SS，Umen JG。对来自莱因哈蒂衣原体的同步昼夜转录组进行高分辨率分析可显示连续的细胞和代谢分化。植物细胞。2015;27.pmid：26432862
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
45.Breker M，Lieberman K，Cross FR.全面发现衣原体莱因哈蒂衣原体中的细胞周期必需途径。植物细胞。2018. pmid：29743196
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
46.Saleme M de LS， Andrade IR， Eloy NB.促性相复合物/环状体（APC / C）在植物繁殖中的作用。植物科学前沿.2021. pmid：33719322
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
47.Capron A， Serralbo O， Fül?p K， Frugier F， Parmentier Y， Dong A， et al.拟南芥促性复合物或环状体：APC2亚基的分子和遗传表征。植物细胞。2003;15.pmid：14508008
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
48.Pérez-Pérez JM， Serralbo O， Vanstraelen M， González C， Criqui MC， Genschik P， et al.CDC27在拟南芥促进复合物（APC / C）中的功能的特化。植物学报.2008;53.pmid：17944809
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
49.郭磊， 蒋磊， 张勇， 卢思豪， 谢强， 维杰斯D， 等.促进全相的复合物通过细胞周期蛋白B1的降解在拟南芥中启动合子分裂。植物学报.2016;86.pmid：26952278
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
50.Cromer L， Jolivet S， Singh DK， Berthier F， de Winne N， de Jaeger G， et al.守护神是难以捉摸的植物安全蛋白，通过拮抗分离酶来防止染色体分离。美国国家学院学报 2019;116.
查看文章谷歌学术搜索
51.Motta M， Zhao X， Pastuglia M， Belcram K， Roodbarkelari F， Komaki M， et al.B1型细胞周期蛋白控制拟南芥细胞分裂过程中的微管组织。EMBO Rep. 2022;23.pmid：34882930
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
52.Serpico AF，Febbraro F，Pisauro C，Grieco D.Cdk1的分区控制驱动有丝分裂主轴组装。单元格报告。2022;38.pmid：35081344
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
53.Ehler LL， Holmes JA， Dutcher SK. 在缺乏基底体的衣原体 reinhardtii 突变株中，有丝分裂纺锤体装置的空间控制丧失。遗传学。1995.
查看文章谷歌学术搜索
54.Janke C，Montagnac G.微管乙酰化的原因和后果。当前生物学。2017. pmid：29207274
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
55.哈里斯·贾， 刘 Y， 杨 P， 克纳 P， 莱希特雷克 KF.单颗粒成像显示鞭毛衣原体中 EB1 的鞭毛转运与转运无关性转运和积累。细胞的分子生物学。2016. pmid：26631555
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
56.Ehler LL，Dutcher SK.根和藻母微管在衣原体莱因哈蒂衣原体中裂隙沟的定位和组装中的作用的药理学和遗传学证据。细胞运动和细胞骨架。1998. pmid：9634216
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
57.Onishi M，Umen JG，Cross FR，Pringle JR.在衣原体中没有F-肌动蛋白的裂隙沟形成。Proc Natl Acad Sci U S A. 2020.pmid：32690698
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
58.Akhmanova A，Steinmetz MO.跟踪末端：动态蛋白质网络控制微管尖端的命运。自然评论分子细胞生物学。2008. pmid：18322465
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
59.Mitchison T，Kirschner M.微管生长的动态不稳定性。自然界。1984. pmid：6504138
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
60.Nehlig A，Molina A，Rodrigues-Ferreira S，Honoré S，Nahmias C.在微管动力学控制中调节末端结合蛋白EB1。细胞和分子生命科学。2017. pmid：28204846
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
61.Berrueta L， Kraeft SK， Tirnauer JS， Schuyler SC， Chen LB， Hill DE， et al.腺瘤性息肉病大肠杆菌结合蛋白EB1与细胞质和梭形微管有关。Proc Natl Acad Sci U S A. 1998.pmid：9724749
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
62.Morrison EE，Wardleworth BN，Askham JM，Markham AF，Meredith DM.EB1是一种与APC肿瘤抑制因子相互作用的蛋白质，在整个细胞周期中与微管细胞骨架相关。基因。1998. pmid：10030671
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
63.Schwartz K，Richards K，Botstein D.BIM1在酵母中编码微管结合蛋白。细胞的分子生物学。1997. pmid：9398684
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
64.Tirnauer JS O'Toole E， Berrueta L， Bierer BE， Pellman D. Yeast Bim1p 促进微管的 G1 特异性动力学。细胞生物学杂志。1999. pmid：10352017
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
65.Tirnauer JS， Canman JC， Salmon ED， Mitchison TJ.EB1靶向具有附着的聚合微管的运动管。细胞的分子生物学。2002. pmid：12475954
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
66.Chan J，Calder GM，Doonan JH，Lloyd CW.EB1揭示了拟南芥中的移动微管成核位点。自然细胞生物学。2003;5.pmid：14557818
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
67.Chan J，Calder G，Fox S，Lloyd C.微管末端结合蛋白EB1的定位揭示了拟南芥悬浮细胞中纺锤体发育的替代途径。植物细胞。2005;17.pmid：15879559
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
68.Ikui AE，Ueki N，Pecani K，Cross FR.在衣原体莱因哈蒂衣原体分裂周期内对前复制复合物的控制。PLoS Genetics.2021;17.pmid：33909603
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
69.索尔兹伯里JL，男爵AT，桑德斯MA。基于中心蛋白的衣原体细胞骨架：分布在相间细胞和有丝分裂细胞中。细胞生物学杂志。1988;107.pmid：3047144
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
70.O'Toole ET，Dutcher SK.衣原体中特定部位的基体复制。细胞骨架。2014;71.pmid：24166861
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
71.Waitzman JS，Rice SE.驱动蛋白-5的机制和调节，驱动蛋白-5是有丝分裂纺锤体的基本运动。细胞生物学。2014. pmid：24125467
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
72.van Leene J， Hollunder J， Eeckhout D， Persiau G， van de Slijke E， Stals H， et al.靶向相互作用组学揭示了拟南芥中复杂的核心细胞周期机制。分子系统生物学。2010. pmid：20706207
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
73.Boruc J， van den Daele H， Hollunder J， Rombauts S， Mylle E， Hilson P， et al.拟南芥核心细胞循环中的功能模块二元蛋白质 - 蛋白质相互作用网络。植物细胞。2010. pmid：20407024
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
74.张S， 常磊， 阿尔菲力C， 张志， 杨俊， 马斯伦S， 等.有丝分裂磷酸化激活APC/C的分子机制.自然界。2016. pmid：27120157
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
75.Johnson UG，Porter KR.莱因哈迪衣原体细胞分裂的精细结构。基底体和微管。细胞生物学杂志. 1968;38.pmid：5664210
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
76.Basu S， Roberts EL， Jones AW， Swaffer MP， Snijders AP， Nurse P.疏水贴片将细胞周期蛋白B引导至中心体，以促进有丝分裂时的全球CDK磷酸化。当前生物学。2020;30.pmid：32084401
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
77.交叉FR.将衣原体基因组中的松散末端捆绑在一起：丰富的上游开放阅读框架的功能意义。G3：基因，基因组，遗传学。2016;6.pmid：26701783
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
78.卡罗E，卡斯特拉诺MM，古铁雷斯C.一种染色质链接，将细胞分裂与拟南芥中的根表皮图案耦合。自然界。2007;447.pmid：17450124
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
79.Verde F，Dogterom M，Stelzer E，Karsenti E，Leibler S.通过非洲爪蟾卵提取物中的细胞周期蛋白A和细胞周期蛋白B依赖性激酶控制微管动力学和长度。细胞生物学杂志。1992;118.pmid：1387400
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
80.Fridy PC， Li Y， Keegan S， Thompson MK， Nudelman I， Scheid JF， et al.用于快速生产多功能纳米管库的强大管道。自然方法。2014;11.
查看文章谷歌学术搜索
81.Schroda M.衣原体中核转基因表达的好消息。细胞。2019. pmid：31795196
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
82.Mastop M，Bindels DS，Shaner NC，Postma M，Gadella TWJ，Goedhart J.表征一组光谱多样化的荧光蛋白作为mTurquoise的FRET受体2。科学报告。2017;7.
查看文章谷歌学术搜索
83.Picariello T， Hou Y， Kubo T， McNeill NA， Yanagisawa HA， Oda T， et al. TIM，一种利用CRISPR/Cas9在衣原体reinhardtii中的靶向插入诱变方法。PLoS ONE.2020;15.pmid：32401787
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
84.di Talia S， Skotheim JM， Bean JM， Siggia ED， Cross FR.分子噪声和大小控制对发芽酵母细胞周期变异性的影响.自然界。2007;448: 947–951.pmid：17713537
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
85.Charvin G， Cross FR， Siggia ED.一种微流体装置，用于在未扰动的分裂酵母细胞中进行时间控制的基因表达和长期荧光成像。PLoS ONE.2008. pmid：18213377
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索