用于保存黄热病病毒RNA的Whatman FTA卡的评估，用于分子诊断-杂志期刊论文发表

艾米丽·戴维斯 ，杰森?布兰迪·拉塞尔，简·巴西尔，亚伦?布劳尔特，霍莉·休斯

出版日期： 2022年06月15日

抽象

黄热病病毒（YFV）是一种黄病毒，经常在非洲和南美洲引起出血热疫情，被认为是一种重新出现的公共卫生威胁。准确诊断黄热病至关重要，因为一例确诊病例构成疫情，并可能引发大规模疫苗接种运动。已经开发出高度灵敏和特异性的分子诊断;然而，这些测定需要在标本运输过程中维持冷链，以防止在检测前病毒RNA降解。这种冷链要求在一些地区很难满足。在这项研究中，我们研究了Whatman FTA卡作为YFV RNA的替代稳定方法，用于分子诊断。使用人为的标本，线性回归分析表明，从单个6mm FTA卡孔中检测RNA的灵敏度明显低于传统的RNA提取;然而，从两个FTA冲头中提取的RNA合并显着降低了检测限，使其与传统RNA提取金标准相同。在探讨FTA卡方法在可变温度下稳定YFV RNA的能力的实验中，在25°C下储存后，可以检测到RNA超过两周。 更有希望的是，YFV RNA可以在37°C的卡片上检测到，从两天到两周以上，具体取决于病毒输入。FTA卡也被证明，如果在接种前将卡干燥，FTA卡可以在高湿度下稳定YFV RNA。这些结果支持FTA卡可能具有成本效益，并且易于用于YF的分子诊断，保存病毒RNA以允许在维持冷链不可行的情况下进行阳性诊断。

作者摘要

黄热病病毒（YFV）是黄热病（YF）的病原体，黄热病是撒哈拉以南非洲和南美洲热带地区特有的出血性疾病。由于黄热病对公共卫生构成威胁，单一病例构成疫情，因此准确诊断至关重要。YFV 感染期间的病毒血症是可变的，并且可能相当低，具体取决于疾病的严重程度和样本收集的时间。此外，病毒RNA具有高度的敏感性，特别是在伴随YFV传播季节的炎热潮湿条件下。为了减少RNA降解，临床样品通过冷链运输到诊断实验室。由于冷链并不总是可靠或可用，某些地区进行黄热病分子诊断的能力受到阻碍，导致诊断和疫情管理延迟。在这里，我们优化了将Whatman FTA卡纳入YF分子诊断的方案，目的是产生一种独立于冷链的病毒RNA稳定方法。这些卡结构紧凑，易于使用，并被证明可以在高温和高湿度下灭活YFV并稳定YFV RNA。在流行地区实施该方案有助于快速准确地诊断黄热病。

引文： Davis EH，Velez JO，Russell BJ，Basile AJ，Brault AC，Hughes HR （2022）用于保存黄热病病毒RNA的Whatman FTA卡的评估，用于分子诊断。PLoS Negl Trop Dis 16（6）：e0010487。https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0010487

编辑 器： Pedro F.C. Vasconcelos， Universidade do Estado do Para： Universidade do Estado do Para， BRAZIL

收到： 2022年1月15日;接受： 五月 10， 2022;发表： 六月 15， 2022

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数据可用性： 所有相关数据都在稿件及其支持信息文件中。

资金： 作者没有为这项工作获得任何具体资金。

竞争利益： 作者宣布不存在相互竞争的利益。-杂志期刊论文发表

介绍

黄热病病毒（YFV）是一种黄病毒，在撒哈拉以南非洲、中美洲和南美洲的47个国家流行。该病毒是黄热病（YF）病周期性暴发的原因，黄热病是一种出血性疾病，重症病例的病死率为30-60%[1]。据估计，每年有200，000例黄热病病例和30，000例黄热病相关死亡[2]。由于大多数黄热病病例是无症状的，因此黄热病的患病率被认为远高于年发病率。因此，WHO将一例黄热病确诊病例归类为疫情，需要立即接种减毒活疫苗株17D的环围疫苗接种[3]。虽然在许多黄热病流行国家，黄热病疫苗接种是常规疫苗接种计划的一部分，但在人口众多且未接种疫苗的城市地区，黄热病病毒已经出现。黄热病疫情风险增加，黄热病疫苗供应有限，凸显了对黄热病病毒准确诊断的必要性。假阴性可能导致更大的爆发，假阳性可能导致计划外的疫苗使用。

诊断黄热病可能很困难，因为患者在鉴别诊断期间表现为非特异性流感样症状，可与钩端螺旋体病、疟疾和其他病毒性出血热相混淆。因此，需要实验室诊断来确认黄热病。血清学方法（YFV IgM或IgG检测，然后进行斑块减少中和试验）和/或YFV特异性RNA检测均包含在WHO实验室诊断YF的算法中[4]。虽然这些检测成功用于准确检测YF，但必须解决一些重要的警告。黄热病的血清学诊断因黄病毒交叉反应性抗体反应特征良好而变得复杂[5]。登革热 （1–4）、寨卡病毒和西尼罗河病毒等其他黄病毒感染必须通过额外的血清学检测排除，并在区域参比实验室进行确认。此外，针对野生型（WT）YFV感染而生成的IgM与疫苗接种后产生的IgM没有区别，包括在疫苗相关嗜内脏性疾病的罕见病例中，使得大规模疫苗接种运动期间的血清学诊断变得困难[6]。

虽然YF分子诊断检测可以区分WT和与17D疫苗接种相关的罕见不良事件[7，8]，但如果样本在一天内到达，则需要在湿冰上运输;如果样本在超过一天后到达，则需要在-20°C下运输。这种冷链是防止YFV RNA降解所必需的，但在YF流行地区，传播季节伴随着炎热潮湿的天气，这种冷链通常不现实[3]。此外，YFV感染期间的病毒血症是短暂的，并且高度依赖于收集样本的时间，导致一些YF临床样品具有非常低水平的病毒RNA。血清学或分子方法在黄热病诊断中的应用取决于标本采集的时间（即急性与非急性）和该区域的实验室能力。南美国家通常使用“YFall”引物进行分子诊断[9]，而非洲国家则更喜欢斑块减少中和试验（PRNT），CDC虫媒病毒MAC ELISA进行血清学检测。随着世卫组织最近对用于YFV分子诊断的qRT-PCR试剂盒的评估[10]，分子诊断很可能在非洲变得更加常规，这突出表明RNA稳定是在新区域实施YF分子诊断的关键因素。

Whatman FTA卡已被证明对多种病毒和细菌性疾病的分子诊断有效[11-24]。目前的WHO诊断算法要求从血清样本中对黄热病进行分子诊断，血清样本在诊所收集，诊断在区域参比实验室完成[25]。本文展示了将FTA卡纳入YFV分子诊断如何有可能改善偏远流行地区的YFV监测。

材料/方法

病毒

疫苗亚株17D-204 [滴度：7 log10斑块形成单位（pfu）/ml]和WT菌株Asibi（滴度：6 log10本研究中使用的pfu / mL）来自CDC虫媒病毒疾病分支，虫媒病毒参考集。根据生物安全2级要求进行了涉及17D-204病毒的实验，并根据生物安全3级安全要求进行了涉及Asibi病毒的实验。在PBS（美国马萨诸塞州吉布科）或黄病毒阴性人血清（EMD Millipore，美国马萨诸塞州）中进行病毒连续稀释。

FTA卡协议，RNA提取和基因组扩增

将人为的标本发现在FTA微卡（WHAWB120205，Sigma-Aldrich，美国圣路易斯）上，允许干燥并根据制造商协议从卡中打孔的圆盘中提取RNA（即，140μL样品均匀分布在样品区域）。为了尽量减少交叉污染，在接种之前，还用灭菌的6毫米打孔机对卡片进行了预打孔。用10μL人为标本接种冲头，并在室温下在生物安全柜中干燥一小时。然后将单个冲头放入1.5 mL管中并按所述储存，直到使用QIAmp病毒RNA提取试剂盒（美国加利福尼亚州Qiagen）进行RNA提取。

为了提取RNA，将单个FTA打孔直接放入140μLPBS中，彻底涡旋，加入560μL缓冲液AVL中，并在室温下孵育10分钟。当从两个冲头中汇集RNA时，将单个冲头放入70μLPBS中并涡旋。然后将PBS中的提取物合并（即总共140μL）并加入560μLAVL中。然后按照前面描述的遵循QIAmp协议的其余步骤[23]。使用60μL缓冲液AVE进行最终洗脱，根据制造商的方案同时提取来自YFV加标血清的相同制剂的RNA（即，将样品直接放入缓冲液AVL中）。

使用定量探针RT-PCR试剂盒（美国加利福尼亚州Qiagen）和YFall引物检测病毒RNA，如前所述[9]，总反应体积为25μL。所有样品均使用10μLRNA一式三份进行测试。虽然使用高输入洗脱可能导致反应中含有更多的抑制剂，但在我们使用正常人血清的有限分析中没有观察到抑制。

自贸区接种后YFV失活

使用机构批准的方案进行病毒灭活的确认。疫苗株17D-204病毒被用作所有YFV的替代品，以减少对生物安全问题的担忧。FTA冲头接种10μl17D-204病毒（5 log10pfu / ml），使其干燥，并在100μL无菌水中再水化。将所得的FTA提取物用于两种测定以确认失活。首先，将100μLFTA提取物接种到Vero细胞上，并在室温下孵育1小时，然后加入DMEM培养基，并将烧瓶置于37°C / 5%CO2并允许孵育一周。监测细胞的细胞病变效应（CPE），这与YFV疫苗株一起发生。一周后，将一个烧瓶中一周的100μL培养基转移到新鲜的Vero细胞上。这个过程重复了三个星期。其次，FTA提取物用于病毒斑块测定。在牛白蛋白-1培养基（BA-1）中制备10倍的FTA提取物连续稀释（1：10–1：1，000，000），并用于进行斑块测定，如前所述[26]。-杂志期刊论文发表

环境条件对RNA稳定性的影响

对于稳定性实验，将17D-204稀释在PBS或人黄病毒阴性血清中，并以7 log的浓度接种到打孔器上10pfu/mL （100，000 pfu/冲头）， 6 对数10pfu/mL （10，000 pfu/冲头）， 5 对数10pfu/mL （1，000 pfu/冲头）， 4 对数10pfu/mL （100 pfu/冲头）， 3 对数10pfu/mL （10 pfu/冲孔） 和 2 对数10pfu/mL （1 pfu/punch）.通过将具有可变滴度YFV的FTA打孔机在37°C下保持两周，并比较RNA阳性以控制在室温（~25°C）下保持相同时间的打孔器，来测量FTA卡在高温下稳定YFV RNA的能力。样本一式三份进行检测，实验一式两份进行，导致所有组的n = 6。接种后，将37°C组中的冲头直接放入加热块中，以确保在实验中捕获温度对干燥过程的任何影响。在使用单冲程的实验中，每天从一拳中提取RNA，持续7天，并在接种后14天提取RNA。对于使用来自两个冲孔的混合RNA的研究，仅使用10 pfu /冲孔和1 pfu /冲头。一旦打孔不再检测出YFV RNA阳性，该稀释液中的冲头将在随后的几天内从收集中移除。

黄热病流行地区的实验室经常受到高湿度的影响。为了测定湿度对FTA卡效用的影响，使用上述一次打孔方案进行了两部分实验。第一部分试图确定卡片在接种后暴露于高湿度下是否会影响其稳定YF RNA的能力。FTA卡接种10 pfu /Punch或1 pfu /Punch的17-204病毒，并在高湿度（80-85%）下孵育。每天从一拳中提取RNA，持续七天。使用湿度和温度笔（Fisher Brand）在每个时间点获取湿度读数，以确保不会因打开和关闭培养箱门而发生湿度大的波动。第二项评估旨在确定卡片在接种前暴露于高湿度是否会影响其稳定YF RNA的能力。FTA卡在37°C和高湿度（80-85%）下孵育一天，两天和三天，然后从培养箱中取出接种卡，立即打孔，并接种10 pfu / mL或1 pfu / mL的17-204病毒。冲头立即返回到培养箱，以便在高湿度下干燥。

最后，测定了先前暴露于潮湿条件下的干燥卡的效果，以确定是否需要干燥的FTA卡来稳定接种后的RNA。将FTA卡置于37°C的培养箱中，在75-80%的湿度下放置三天，然后将转移到装有一个或两个二氧化硅1克凝胶干燥包的塑料袋中（干燥和干燥，美国加利福尼亚州）并密封。在每个时间点，放置在没有干燥包的袋子中的卡也作为控件包括在内。在接种前将袋子放回培养箱一天，两天或七天，当时FTA卡被打孔并接种10 pfu /拳或1 pfu /拳17D-204病毒。冲头立即返回到装有指定数量的干燥剂包的袋子中，并放入培养箱中。从冲孔中提取RNA，每天检测YFV RNA阳性，持续七天。用不同品牌的干燥包（Whatman FTA，1克包）重复实验，以比较1克干燥包的功效。

统计学

采用线性回归建模计算检测限（LOD）和负结果时间，估计当均值Ct值已达到截止阈值 37。这些回归的拟合优度是使用 R 计算的2值。对于高滴度样品，均值 Ct在时间过程结束之前，值从未达到37，因此基于线性回归模型推断了检测损失的时间。通过计算C的95%置信区间的可能性，确定LOD和负结果时间的显着差异t如前所述，两个实验的值37（95%CI）将重叠[27]。在由于数据限制而估计阴性结果的时间的情况下，没有完成95%的CI作为平均天数与C的比较t的 37 被推断出来。

结果

将YFV接种到FTA卡上会导致病毒失活

YFV的疫苗株17D-204在FTA卡上储存后被证实失活。在接种了17D-204 FTA冲孔提取物的Vero细胞中，在每次1周的三次盲传后未观察到CPE。此外，在17D-204 FTA冲孔提取物上进行斑块测定后未观察到斑块。

来自疫苗和WT YFV菌株的RNA可以在接种到FTA卡后检测到

为了确定疫苗和WT菌株的YFV接种后是否可以在接种到FTA卡上，将疫苗替代菌株17D-204，WT菌株Asibi和PBS作为阴性对照接种到FTA卡上并检测YFV RNA。以相同的滴度接种病毒（6log10pfu/mL）。这些 Ct将值与17D-204和Asibi的标准提取（直接提取的140μL样品）进行比较。虽然均值 Ct从FTA冲头中提取RNA时，两种菌株均为17D-204（均值Ct值：23.2 ±0.12）和菌株Asibi（平均值Ct值：从FTA冲头中很容易检测到23.9±0.1），而PBS对照对YFV RNA呈阴性（平均值Ct值：43.3±1.9）（S1图）。

应用于FTA卡的低容量降低了测定灵敏度

通常，当从YFV临床样品中提取病毒RNA时，使用140μL血清作为提取方案的输入。虽然该体积可以应用于整个FTA卡，但使用FTA卡的RNA提取方案要求在RNA提取之前打孔卡，从而限制了提取的样品量。测试了冲孔，预接种或接种后的时机，以确保“预冲孔方案”不会影响RNA产量。C组无显著差异t将样品应用于整个卡并在以后打孔时的值（“接种后打孔”，R2= 0.99）和当样品应用于预打孔卡（“预接种打孔”，R2= 0.98）（接种前冲头与接种后冲头95%CI：-9.3，10.97，S2图）。

为了测试输入量的减少是否显着影响了测定的灵敏度，对应用于FTA冲头的10μL病毒的检测限值进行了测定，并与从10μL病毒的直接提取和直接提取140μL病毒的“金标准”进行了比较。140 μL 病毒（0.22 pfu，R2= 0.98）被证明明显低于一个FTA冲头（3.01 pfu，R）的LOD（140μL病毒与一个FTA冲头95%置信区间CI：0.09，1.4）2= 0.97）;然而，从一个FTA打孔中提取的RNA的LOD与直接提取的10μL病毒相比（2.2 pfu，R）在从一个FTA冲头中提取的RNA的LOD中没有显着差异（一个FTA冲头与10μL 95%CI：-0.2，0.4）2= 0.97） （图 1）。为了确定从多个冲孔中提取RNA是否增加了灵敏度，从接种了在PBS中稀释的病毒的两个冲孔中合并RNA（图1）。增加使用的冲头数量，显著降低（两个FTA冲头与一个自贸区冲头95%置信区间：0.4，1.0）LOD（0.6 pfu，R2= 0.98）与从一个冲孔中提取RNA相比。当从三个和四个冲孔中提取RNA时，这种趋势仍在继续（S1表）。

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图 1. 从FTA冲孔中提取YFV RNA降低了基于体积而非技术的YFV qRT-PCR测定的灵敏度。

使用制造商方案从PBS中稀释的140μLYFV，从单个FTA打孔器，从PBS中稀释的10μLYFV以及从两个FTA打孔中提取来自YFV疫苗株17D-204的RNA。C 处的虚线t值 37 表示 YFV RNA 阳性的截止值，基于该领域 YFV 分子诊断中使用的截止值。在PBS中进行稀释以形成标准曲线。点表示两个实验的平均值，并使用线性回归进行拟合。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0010487.g001

由于血清是用于分子诊断的最常见样品，因此使用人黄病毒阴性血清（EMD Millipore，Burlington，MA）作为稀释剂重复实验。正如在使用PBS作为稀释剂的实验中观察到的那样，在人血清中稀释的140μL病毒的LOD（0.5 pfu，R2= 0.96）显著低于接种在人血清中稀释的10 μL病毒的FTA打孔的LOD（140 μL与FTA打孔95%CI：0.8，1.5）2= 0.95），但接种了在血清中稀释的10μL病毒的FTA打孔的LOD与接种有10μL在PBS中稀释的病毒的FTA打孔没有显着差异（10μL血清与10μL PBS 95%CI：-0.3，0.4）（图2）。

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图 2. 加标到血清中的YFV可以从FTA卡中提取，但灵敏度低于传统方法。-杂志期刊论文发表

使用制造商方案从血清中稀释的140μLYFV，从单个FTA打孔和两个FTA冲头中提取来自YFV疫苗株17D-204的RNA。C 处的虚线t值37表示YFV RNA阳性的截止值，并且基于该领域YFV分子诊断中使用的截止值。稀释使标准曲线分别在人、黄病毒阴性血清中进行。点表示两个实验的平均值，并使用线性回归进行拟合。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0010487.g002

热量降低了FTA卡YFV分子诊断的灵敏度

室温下，100，000 pfu/冲头（R2= 0.68），10，000 pfu/冲床（R2= 0.80），1，000 pfu/冲（R2= 0.64） 和 100 pfu/冲床 （R2= 0.82）可以检测到超过两周（图3A）。以10 pfu/冲压接种的YFV可检测6.2天（R2= 0.88） 和 1 pfu/冲程 3.5 天 （R2= 0.74） （图 3A）。在 37°C 时，100，000 pfu/冲头 （R2= 0.78） 和 10，000 pfu/冲头 （R2= 0.73）仍然可检测到超过14天;但是，1，000 pfu/冲头样品（R2= 0.64）可检测到13.7天（图3A）。同样，100 pfu/冲头的可探测性持续时间（10.1 天，R2= 0.70），10 pfu/冲（4.1天，R2= 0.77）和1 pfu/冲（2.2天，R2= 0.72）样品在37°C时减少（图3B）。使用95%置信区间比较qRT-PCR可检测到YFV的天数，10 pfu/冲头（RT vs 37°C 95% CI：1.52，2.77）和1 pfu/Punch（RT vs 37°C 95% CI：0.7，2.0）在37°C下比在RT下短得多的时间内变得明显短。

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图 3. FTA卡在高温下YFV RNA的稳定性降低。

将YFV的疫苗株17D-204在PBS中稀释，从FTA卡上发现并置于室温（~25°C）或37°C下两周。C 处的虚线t值 37 表示 YFV RNA 阳性的截止值，基于该领域用于 YFV 分子诊断的截止值。点表示两个实验的平均值，其中从一个冲孔中提取物并使用线性回归进行拟合。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0010487.g003

为了测试从多个FTA冲头中提取RNA是否提高了高温下YFV分子检测的灵敏度，从两个冲头中以10 pfu/冲头和1 pfu/冲头汇集RNA。结果表明，从两个冲孔中提取RNA显着增加了RNA的检测天数（表1）。

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表 1. 从FTA卡中提取时，温度升高会降低YFV RNA阳性的持续时间。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0010487.t001

高湿度会对FTA卡上的RNA稳定性产生负面影响

最初的实验是在受控的气候（40-55%湿度）下进行的。为了测试这些湿度条件是否对FTA卡上的RNA稳定性有积极影响，将卡接种10 pfu /拳和1 pfu /拳的YFV并放入湿度室（80-85%）一周。将对照样品在环境湿度下留在生物安全柜中一周。在高湿度下孵育的卡在检测阳性C的时间限制上没有差异t与在低湿度下孵育的干卡相比的值（S2 表）。尽管如此，在高湿度常见的YFV特有地区，湿度对FTA卡稳定RNA的能力的负面影响已得到广泛记录[28]。为了测定报告的RNA产量损失是否是由于卡在接种前从空气中吸收了水分，则在接种YFV之前将卡在湿度室中预孵育一天，两天或三天（如S3图所示）。随着预潜伏期的增加，LOD显著下降（S3表，1 pfu/冲头低湿度vs 1 pfu/冲头高湿度3天95%置信区间：-4.78，-2.83））。一天和两天的注射前LOD差异不显着（一天与两天95%CI：-0.1，0.7）;然而，三天后LOD的差异显着不同（两天与三天95%置信区间：0.1，0.9）。在10 pfu/punch时，一天和两天的检测周期没有差异（一天对两天95%CI：-0.6，1.5），但两天和三天之间有显着差异（两天对三天95%CI：2.4，4.7）（表2）。在高湿度下，在1 pfu/Punch（一天对两天95%CI：0.2，3.0）和2天和3天（两天对三天95%CI：2.8，5.1）的预插孔下，检测时间存在显着差异。在高湿度下预培养卡三天后，YFV RNA在1 pfu /Punch下检测不到（表2）。

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表 2. 在潮湿环境中储存FTA卡会对卡随时间稳定YFV RNA的能力产生负面影响。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0010487.t002

接种前干燥FTA卡可提高YFV RNA稳定性

为了减少高湿度下RNA产量的损失，在用低滴度YFV接种之前，将预加湿卡与干燥包一起孵育一天，两天和七天（如图S3图所示）。与在不干燥的情况下孵育的相同浓度/冲头相比，添加干燥包可延长检测时间（表 3）。对于接种10 pfu/冲头的冲头，与一包相比，两个干燥包在干燥一天后显着延长了检测时间（95%CI：0.1，1.1）。对于接种1 pfu/punch的打孔器，使用一个或两个干燥剂包预孵育一两天的卡之间的检测长度没有显着变化。对于在接种前用 10 pfu/Punch（一个干燥包 vs 两个干燥包 95% CI： 0.2， 2.5）和 1 个 pfu/Punch（一个干燥包 vs 两个干燥包 95% CI： 1.4， 3.4）YFV 孵育 7 天的卡，与添加一个包相比，添加两个干燥包可显著延长 RNA 检测（表 3）。与在低湿度下孵育的FTA冲头相比（表1），接种前一到两天的干燥产生相似的RNA稳定性（表2）。对两个品牌的干燥剂包进行测试，干燥两天后，YFV测试的两个滴度的检测长度没有显着差异（S4表）。

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表 3. 接种前的FTA卡干燥可提高YFV RNA的稳定性。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0010487.t003

讨论

YFV的分子诊断可能受到病毒RNA降解速率的限制，而许多流行地区存在的炎热和潮湿条件会加速这种速率[29]。由于RNA高度不稳定，疑似YFV临床样本必须使用连续的冷链维护进行运输，出发后一天内到达的样本在湿冰上运输，运输超过一天的样品在-20°C下运输[3]。Whatman FTA卡已被用作其他RNA病毒的解决方案，因为它们可以快速灭活病毒并稳定遗传物质[11，24，30-32]。使用FTA卡优化了利用多种样本类型的实验方案，包括血液、血清、蜱虫和蚊子匀浆、死鸟印迹、咽拭子、口腔液和上皮混悬液[13，18，22-24，30-36]。事实上，WHO和CDC批准将FTA卡用于麻疹和脊髓灰质炎病毒诊断方案，表明这些卡在临床环境中是有效的[23]。在这项研究中，我们优化了Whatman FTA卡与YFV分子诊断的使用，并表明这种广泛可用的商业产品的结合可以减少对冷链的需求，冷链通常是不可用或不完整的。

在YFV暴发期间，分子诊断非常重要，因为针对WT YFV感染和疫苗接种产生的IgM无法通过血清学区分。在这项研究中，使用YFall qRT-PCR测定[9]表明，在接种到FTA卡上后，WT和YFV疫苗株具有相同的可检测性（S1图）。该分子检测法在该领域常用，已被证明对WT和YFV疫苗株具有敏感性和特异性[8，9]。我们之前设计了一种qRT-PCR测定法，使用锁定核酸（LNA）技术区分两种菌株，并认为在爆发期间使用FTA卡运输临床样品可以增加两种分子测定的成功使用。

WT YFV感染期间血清中的病毒血症/RNA是短暂的，特别是在轻度或亚临床病例中，通常在感染后3-6日开始减弱[1]。在重度黄热病病例中，病毒血症可持续感染持续时间，但变化很大[37，38]。在一项对2016-2018年巴西YFV疫情死亡时病毒血症的研究中，死亡时的病毒血症范围从10以上5pfu/mL 至小于 1 pfu/mL [39]。在许多情况下，使用FTA卡可降低分子检测的敏感性[23，28，31]。据推测，这是由于许多因素造成的，包括接种物的使用量、流行地区的湿度以及用样本接种后FTA卡的不完全干燥[23，28，40]。尽管在PBS和黄病毒阴性人类血清中，FTA冲头上的YFV 17D RNA的LOD均小于10 pfu/mL，但FTA卡的LOD与直接RNA提取的金标准显着不同。虽然在提取中实现100%的RNA回收率的可能性不大，但RNA产量的损失可能是由于用于提取RNA的样品体积，因为FTA冲头仅可容纳10μL，而直接提取涉及140μL临床标本。通过从两个或多个冲孔中提取RNA，LOD得到了显着改善。FTA Micro卡最多可以制造9个6毫米的打孔器，这意味着可以汇集来自多个打孔器的RNA，从而留下足够的卡来轻松实现验证性重复。与直接RNA提取相比，使用FTA卡时灵敏度的降低可以通过使用多个冲孔来克服，以允许检测小于1 pfu / mL。这将允许检测YF临床样本中看到的全部病毒载量。

用于黄热病分子诊断的最常见样本类型是血清。使用17D-204病毒加刺到黄病毒阴性人血清中，与在PBS中稀释的17D-204病毒相比，我们在RNA保存方面没有显着差异。许多研究表明，黄病毒RNA在全血中可能更容易被检测出来，并且检测时间更长，因为病毒与红细胞结合较强[41-43]。虽然本文未测试全血对YFV分子诊断的影响，但已通过FTA卡上的全血对无形体和立克次体进行分子诊断[15，16，44]。综上所述，从疑似YF患者身上采集的血液样本很可能是FTA卡中另一种可接受的YF分子诊断样本类型。在无法进行冷运的偏远地区，进行手指点刺抽血的能力可以增加YFV监测的便利性。

YFV传播季节与南美和非洲地区的雨季相吻合，这也对应于一年中最热的时间。FTA卡已被证明可以在高温下稳定RNA，尽管稳定持续时间确实随着温度的升高而减少[22]。在这里，在37°C下，高滴度YFV RNA在FTA卡上保存了两周以上，低滴度RNA在37°C下保存了两天。 尽管与室温相比，在高温下检测YFV RNA的时间有所缩短，但两天的时间在世卫组织目前测试YFV样品的时间表内。这表明在正常条件下运输后会检测到低滴度样品;但是，在病毒发作设置期间，传输可能超过两天。从两个冲孔中提取RNA将RNA可检测的时间缩短至3.7天，进一步说明了双冲头方法的实用性。这里没有测试流行地区的极端环境条件（即较高温度），这是本研究的局限性。然而，将在不同国家进行田间试验，以分析它们对FTA卡上YF RNA稳定性的影响。

还建议通过FTA卡来限制传播季节的高湿度RNA稳定性[28]。一项研究表明，FTA卡的不完全干燥导致RNA产量损失最显著[23]。我们的数据证实了这一发现，即在高湿度下存储卡片三天，受影响的RNA保存超过三天的高温。为了辨别如何最好地减轻RNA中的这种损失，测试了接种前后湿度的影响。将卡接种干燥，然后置于高湿度下，产量没有显着损失;然而，在接种前几天暴露于高度潮湿环境的卡片（表2）显示RNA检测存在显着损失。这表明，当FTA卡从环境中吸收水分时，高湿度会降低FTA卡吸收接种物的能力，从而限制了样品容量，正如其他人所指出的那样[22，23，28，32]。为了抵消环境湿度的吸收，在接种前和接种后对“预加湿”FTA卡进行了干燥。这里提供的数据表明，两天的预干燥显着改善了RNA的稳定性。长时间干燥FTA卡被证明是不太有效的，这可能是由于干燥包变得完全饱和。如果干燥包被换成新的包，RNA可能更稳定。然而，接种在预干燥卡上的YFV可以比在潮湿条件下储存的卡多几天。这表明，如果将样品涂覆并储存在带有干燥包的密封容器中时卡片是干燥的，则可以成功稳定和检测RNA。

FTA卡已成功纳入许多RNA病毒的分子诊断方案中。在这里，我们展示了FTA卡在平均环境条件下稳定和灭活YFV。FTA卡的实施可以通过简化和确保成功将诊断上可行的样本运输到实验室，帮助偏远地区的YFV监测。在许多情况下，使用FTA卡可以区分可检测RNA的完全损失和成功检测。早期发现黄热病病例是控制黄热病暴发的EYE策略的组成部分[3]。可靠地检测YFV RNA的能力将减轻血清学检测的负担，这在流行地区和疫情期间通常很复杂。随着YFV的分子诊断在YF流行地区变得更加常规，FTA卡提供的RNA稳定可能成为确保准确诊断不可或缺的一部分。

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增加RNA提取中使用的冲头数量，可提高检测效果。-杂志期刊论文发表

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S1 表：增加 RNA 提取中使用的冲头数量，提高检测能力10 pfu/冲床1 pfu/冲床均值 Ct标准开发均值 Ct标准开发40 微升30.60.332.40.24拳30.90.0834.60.330 微升310.234.40.33拳31.10.134.60.320 微升31.50.334.20.22拳31.70.535.10.210 微升32.10.235.30.21 冲床32.50.335.50.1

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S1 表。 增加RNA提取中使用的冲头数量，可提高检测效果。

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S2 表。 预干燥的FTA卡在低湿度和高湿度下的性能相似。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0010487.s002

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S3 表。 在接种之前在高湿度下孵育FTA卡可降低从卡中提取的YFV RNA的LOD。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0010487.s003

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S4 表。 品牌100g干燥包不影响YFVRNA检测的长度。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0010487.s004

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S1 图 WT和YFV疫苗株可以使用FTA卡检测。

WT YFV毒株Asibi和YFV疫苗株17D-204被发现在FTA卡上并使其干燥一小时。从卡中提取RNA并使用YFall qRT-PCR引物进行测定。还使用140μL样品直接从Asibi和17D-204分离物中提取RNA直接进入裂解缓冲液。PBS被发现在FTA卡上作为阴性对照。C 处的虚线t值 37 表示 YFV RNA 阳性的临界值，并基于该领域用于 YFV 分子诊断的临界值。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0010487.s005

（断续器）

S2 图 在样品接种前或接种后打孔FTA卡不会影响RNA产量。

将YFV 17D-204病毒接种到FTA卡（整个卡上130μL样品）或FTA卡打孔器（10μL/打孔）上并使其完全干燥。然后从整个FTA卡或预打孔样品制成的冲孔中提取RNA。C 处的虚线t值 37 表示 YFV RNA 阳性的临界值，并基于该领域用于 YFV 分子诊断的临界值。稀释在PBS中进行。点和误差线表示两个实验的平均值，并使用线性回归对数据进行拟合。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0010487.s006

（断续器）

S3 图例 FTA卡湿度YFV RNA产率影响的实验设计.

使用BioRender制成。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0010487.s007

（巴新）

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