来自沃尔巴克氏体前噬菌WO的Cif蛋白修改精子基因组完整性以建立细胞质不相容性
鲁平德·考尔 ，布列塔尼 A. 利 ，伊莎贝拉?塞思·博尔登斯坦
出版日期： 2022年05月24日-厦门杂志期刊论文发表
抽象
遗传微生物可以自私地操纵宿主繁殖以驱动种群。在黑腹果蝇中，天然沃尔巴克氏体前噬WO蛋白CifA和CifB的种系表达引起细胞质不相容（CI），其中来自受感染雄性和未感染雌性的胚胎遭受灾难性的有丝分裂缺陷和致死性;然而，在受感染的女性中，CifA表达挽救了胚胎的致死性，从而赋予母体传播的沃尔巴克氏体一种适应性优势。尽管与性别决定、进化和病媒控制具有广泛的相关性，但CI何时以及如何损害男性生殖的机制仍然未知，并且是一个有争议的话题。在这里，我们在D中使用细胞化学，显微镜和转基因测定。黑色素酶体，以证明wMel的CifA和CifB蛋白在整个精子发生过程中定位于核DNA。Cif蛋白导致延长精子中的组蛋白保留异常，以及使用Cif蛋白进入女性生殖道的成熟精子中的鱼精蛋白缺乏症。值得注意的是，鱼精蛋白基因敲除可增强野生型CI。在卵巢中，CifA定位于早期卵室的生殖细胞核和细胞质;然而，Cifs在晚期卵母细胞中不存在，随后在受精胚胎中不存在。最后，CI和救援取决于新注释的CifA二分核定位序列。总之，我们的结果强烈支持CI的宿主修饰模型，其中Cifs最初修改父系和母体配子以赋予CI定义的胚胎致死性和挽救性。
引文： Kaur R，Leigh BA，Ritchie IT，Bordenstein SR（2022）来自沃尔巴克氏体前噬菌体WO的Cif蛋白修改精子基因组完整性以建立细胞质不相容性。PLoS Biol 20（5）：e3001584。https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001584
学术编辑： Harmit S. Malik，Fred Hutchinson癌症研究中心，美国
收到： 一月 14， 2022;接受： 2022年2月25日;发表： 五月 24， 2022
版权所有： ? 2022 Kaur等人。这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，允许在任何媒体上不受限制地使用，分发和复制，前提是注明原作者和来源。
数据可用性： 所有相关数据都在论文及其支持信息文件中。
资金： 消化系统疾病研究中心奖学金S1848284，S1848300，S1883559至S.R.B.，范德比尔特 - 英格拉姆癌症中心奖学金S1871288，S1848887，S1848952至S.R.B，美国国立卫生研究院奖R01 AI132581和AI143725至S.R.B.，F32 AI140694 Ruth Kirschstein博士后奖学金为B.A.L.，范德比尔特微生物组创新中心为S.R.B。资助者在研究设计，数据收集和分析，出版决定或手稿准备方面没有任何作用。
竞争利益： 我已阅读该期刊的政策，本手稿的作者具有以下相互竞争的利益：SRB被列为与这项工作相关的临时专利的发明人。
缩写： A.U.，任意单位;bNLS，二分核定位信号;CI，细胞质不相容性;CMA3，嗜铬霉素A3;PFA，多聚甲醛;PTM，翻译后修饰;SP，精子;SR，精管插座
介绍
许多动物物种含有可遗传的微生物，以有益和有害的方式改变宿主的适应性。最常见的母体遗传细菌是沃尔巴克氏体，通常以细胞内方式存在于雄性和雌性节肢动物的生殖组织中。在这里，它们诱导具有性别特异性效应的生殖修饰，例如细胞质不相容性（CI），可以自私地将细菌驱赶到宿主种群中的高频率。CI还通过引起沃尔巴克氏体感染雄性和未感染雌性胚胎的致死性，对节肢动物物种形成[1-3]和病媒控制策略[4-9]产生了重要影响。由于CI由具有相同菌株的沃尔巴克氏体感染女性挽救[10，11]，因此表型赋予传播细菌的感染女性相对健康优势[12]。
两个基因CI因子cifA和cifB发生在沃尔巴克氏体噬细胞WO中，该基因在真核生物关联模块中，该模块富含节肢动物的功能和同源性[13-15]。我们先前证明，雄性果蝇中来自wMel Wolbachia的cifA和cifB的双重转基因表达诱导CI，而女性中单一表达的cifA可挽救CI[16，17]。这些结果构成了几种（但不是全部）沃尔巴克氏体菌株CI的二乘一遗传模型的基础[13，15，18，19]。在细胞水平上，CI定义致死性与染色质缺陷和胚胎发育最初几个小时内的有丝分裂停滞有关。通常，受精后，精子结合的“鱼精蛋白”在胚胎中被移除，并被母体提供的“组蛋白”取代，从而导致父系染色质的快速重塑[20]。然而，在CI期间，母体组蛋白沉积到父系染色质上的延迟存在，导致DNA复制改变、染色体凝聚失败以及导致胚胎死亡的各种有丝分裂缺陷[13，21-27]。
建立CI和救援的生殖组织中的初始偏爱事件仍然是神秘的，并且受到最近的争论，即（i）Cifs是否在精子发生（宿主修饰模型）或胚胎发生（毒素 - 解毒剂模型）期间修改父系基因组，以及（ii）通过CifA结合CifB在胚胎中发生或不发生抢救[28，29]].这两个关键观察结果可以最终区分CI的机制模型，尽管迄今为止尚未明确解决。值得注意的是，在任一机制模型下，蛋白质从精子到胚胎的父系传递都可能发生[11，29]。最近提出的毒素 - 解毒剂模型是使用来自wPip Wolbachia的Cif蛋白的转基因异源表达[30]。在这项研究中，CifB瓦果仁蛋白质父系转移到苍蝇胚胎上，并与胚胎中父系基因组的DNA复制应激有关。然而，如果没有能力挽救这种非天然的转基因CI，从而可视化CifA-CifB在救援胚胎中的结合，这些有趣的结果还没有解决2个模型的预测。此外，在胚胎中观察到的父系DNA复制缺陷可以在Cif蛋白受精之前建立，这与宿主修饰模型一致。
在这里，我们开发抗体以在D期间定位来自wMel Wolbachia的Cif蛋白。黑素配子发生和胚胎发生，然后跨转基因，突变体和野生型治疗组对发育中的精子进行基因组完整性测量。我们描述了以下细胞生物学和配子染色质事件，这些事件支持CI和救援的宿主修饰模型：（i）CifA和CifB蛋白从早期精子阶段到晚期伸长精子体定位于发育中的精子核;（ii）在成熟精子中，CifA与精子尾巴相关，偶尔发生在顶体中，而CifB在所有成熟精子中定位于顶体;（三） Cifs增加发育中精子的组蛋白保留，并降低成熟精子中的鱼精蛋白水平;（iv）CI和救援都依赖于CiFA中新注释的二分核定位信号（bNLS），该信号会影响核定位和精子蛋白水平;（v）在交配期间，两种Cif蛋白都与成熟精子转移，表现出鱼精蛋白水平降低;重要的是，鱼精蛋白突变蝇增强野生型CI;（vi）在卵巢中，CifA在种系干细胞中是细胞核，并在护士细胞质中与沃尔巴克氏体共定位;（vi）CifA在胚胎中不存在，因此，必须在胚胎中独立于CifA在胚胎中的存在而建立抢救。综上所述，结果表明，来自沃尔巴克氏体的噬菌体WO编码的Cif蛋白侵入配子核以修饰男性组蛋白到鱼精蛋白过渡阶段的染色质完整性。在机制水平上，结果支持CI和救援的宿主修饰模型，其中本地Cifs在施肥前发挥其影响。
结果
CifA和CifB在精子发生和精子发生过程中侵入精子核
为了评估Cif蛋白的细胞定位，我们产生了单特异性多克隆抗体，用于可视化生殖组织中的蛋白质（S1图）。在D.黑素雄性，精子形态发生过程细分为2个事件：（i）精子发生，包括有丝分裂扩增和减数分裂阶段;和（ii）精子发生，一个减数分裂后阶段。在精子发生过程中，种系干细胞经历4轮同步有丝分裂，产生16个称为精子的前体细胞。然后精子生长并成为精子细胞[31]。在生长期后，精子细胞通过减数分裂分裂并分化成64个单倍体圆形洋葱精子。减数后，圆形精子核伸长以逐渐改变其形状，并在独木舟阶段伴有染色质的重组[32]。这导致个体化复合体形成纤细的针状精子核，体积减小[31，32]。精子的伸长和个体化是精子发生的最后阶段，之后成熟精子被输送到精囊[31，33]。
CifA，但不是CifB，定位于<8小时龄的cifA和cifB转基因表达（图1）和野生型wMel +雄性（S2图）中睾丸顶端的种系干细胞中。CifA和CifB均在有丝分裂精子和精子细胞核中检测到。CifA在精子阶段比CifB更丰富（S3A图和S1表）。在减数分裂后的圆形洋葱精子中，CifA和CifB的簇都与细胞核相邻。在细长的独木舟形精子中，CifA和CifB定位在精子头核的顶端，可能是顶体（图1和S2）。CifB存在于所有精子核中，而CifA平均存在于每个精子束的39%的伸长精子中（S3B图）。在独木舟伸长阶段，染色质结合的组蛋白通常被去除并用鱼精蛋白代替，以产生精子DNA的致密核包装和染色质组织[32]。核压实完成后，在晚期精子针状核（图1）和精囊成熟精子（S4图）中均未检测到Cif蛋白，这表明Cif蛋白被完全剥离，或者当染色质紧密致密时，抗体可能无法检测到Cif蛋白[34，35]].为了评估成熟精子中的Cif存在/不存在，我们从<8小时龄男性的精囊中分离后，对精子进行去缩骨，并用相应的Cif抗体染色。CifA在精子尾部以斑点模式（图1和S2）常见，很少出现在顶体区域，平均在45%或0%的成熟精子头部中，具体取决于样本的精囊（S3B图）。CifB存在于精子的所有囊体尖端中，而不是局限于精子尾巴（图1和S2）。-厦门杂志期刊论文发表
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图 1. CifA和CifB在精子发生和精子发生期间侵入精子核。
用 Biorender.com 创建的黑腹果蝇男性生殖系统的示意图显示在顶部。在精子形态发生期间，解剖并免疫染色来自表达双转基因cifAB的<8小时龄男性的睾丸（n = 20），以可视化CifA（绿色）和CifB（红色）。DAPI染色（蓝色）用于标记细胞核。CifA，但不是CifB，定位于睾丸顶端的种系干细胞中。CifA和CifB都定位于有丝分裂精子，精子细胞和圆洋葱期精子的细胞核中。在精子发生的后期阶段，细长的精子在头部的顶端具有CifA和CifB。CifB存在于所有独木舟阶段的精子核中，而CifA平均存在于每束39%的精子中。在针头阶段，紧密压实的精子中的抗体无法接触到Cifs。在从精囊中分离出的成熟精子去缩膜后（参见方法），CifA和CifB在顶体区域以不同的百分比被检测到。CifA在斑点图案（白色箭头）的精子尾部中很常见，并且平均存在于45%或0%的成熟精子头部中，具体取决于采样的精囊。CifA在顶体区域的存在表现为实心白色箭头和空白色箭头的缺失。CifB存在于所有精子的顶端（实心白色箭头）中，并且不会发生在精子尾部。CifA和CifB定位模式在野生型（wMel+）线中相似，在沃尔巴克氏体未感染（wMel?）阴性对照系中不存在信号（S2图）。一些CifA和CifB蛋白也被个体化复合物剥离到细胞质废物袋中（S5图）。该实验在2个生物重复中重复。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001584.g001
在精子发生过程中，沃尔巴克体被剥离到细胞质废料袋中，从而在精子伸长过程中消除多余的细胞质物质[23]。在这里，我们表明一些CifA和CifB蛋白也被个体化复合物剥离到细胞质废物袋中（S5图）。由于成熟精子中不存在沃尔巴克氏体[36，37]，这些数据表明，Cif蛋白在精子发生过程中退出沃尔巴克氏体细胞，可能与精子DNA相互作用并修改精子DNA（见下文）。综上所述，这些发现表明CifA和CifB蛋白在整个发育过程中访问果蝇精子核。
Cifs导致异常组蛋白潴留和鱼精蛋白缺乏
由于Cifs在精子发生期间定位于发育中的精子核，我们假设它们可能在早期与核DNA相互作用以影响精子基因组完整性 - CI的宿主修饰模型的中心预测[11，29]。在精子发生过程中组蛋白到鱼精蛋白的转变阶段[38]，组蛋白通常经过各种翻译后修饰（PTMs）以去除并用较小的鱼精蛋白替代，以实现染色质的紧密重组[38-41]。缺乏PTM可导致组蛋白结合染色质和鱼精蛋白沉积不当，从而导致父系染色质缺陷、男性不育和胚胎致死[27，42，43]。因此，睾丸中开始的初始缺陷可导致受精后灾难。
利用核心组蛋白抗体，我们研究了CI和非CI引起男性的独木舟晚期精子束内的组蛋白丰度。与阴性对照相比，我们发现<8小时龄男性的w Mel +和cifAB表达睾丸的组蛋白保留显着增加（图2A，S6和S1表）。单一转基因表达在此阶段显示出明显较少的组蛋白保留束，类似于wMel?阴性对照（S7A图和S1表）。为了检测组蛋白潴留异常是否与成熟精子中的鱼精蛋白缺乏有关，我们接下来使用了荧光色素染色霉素A3（CMA3）染色剂，该染色剂在与DNA蛋白缺乏区域结合时会发出荧光[44，45]。从年轻（高CI诱导）wMel +雄性的野生型精囊中分离出的成熟精子相对于wMel?雄性表现出增加的鱼精蛋白缺乏症（图2B和S1表）。
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图 2. Cifs导致晚期独木舟精子中的组蛋白潴留和成熟精子中的鱼精蛋白缺乏。
（A）对w Mel+，wMel?和转基因cifAB系的<8小时龄男性的睾丸（n = 15）进行解剖和免疫染色，以可视化和定量精子束，并在精子发生晚期的独木舟阶段具有组蛋白保留（紫色）。 DAPI染色（蓝色）用于标记精子核。具有DAPI信号的总精子束和具有保留组蛋白的总精子束被手动计数和绘制图形。与阴性对照相比，wMel+沃尔巴克氏体和双表达cifAB转基因系在独木舟晚期表现出异常的组蛋白保留。 竖线表示平均值，误差线表示标准差。字母表示通过基于柯尔莫哥洛夫-斯米尔诺夫检验的成对比较确定的统计学显着（p <0.05）差异。（B）从21°C下饲养的<8小时龄雄性的精囊（n = 15）中分离出的成熟精子用荧光CMA3（绿色）染色，以检测每个精子核中的鱼精蛋白缺乏症。在ImageJ中量化单个精子头部强度（参见方法）并绘制图表。瓦与w Mel?对照相比，Mel+和转基因cifAB系显示出增强的鱼精蛋白缺乏水平。竖线表示平均值，误差线表示标准差。字母表示统计学上显着（p < 0.05）的差异，这是通过基于Kruskal-Wallis检验和Dunn多重检验校正的多重比较确定的。所有 p 值都在 S1 表中报告。实验在2个独立的生物重复中进行，样品在第一次运行中盲编码。此图背后的原始数据可以在 S1 数据文件中找到。CMA3，嗜铬霉素A3。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001584.g002
为了调查缺乏鱼精蛋白是否与CI有关，我们从具有鱼精蛋白A和B敲除突变系的<8小时龄的男性中分离出精子。我们表明，鱼精蛋白突变体，无论是在沃尔巴克氏体存在（ΔProt+）和不存在（ΔProt?）的情况下，相对于wMel?也表现出荧光的显着增加（图3A和S1表）。此外，在相同的实验设置下，与野生型wel+ CI相比，患有沃尔巴克氏体的ΔProt +男性鱼精蛋白缺乏症较高的一个关键结果是CI增加（图3B和S2表）。这些发现表明沃尔巴克氏体和ΔProt敲除对鱼精蛋白缺乏和CI外显率的加性效应。值得注意的是，ΔProt?雄性不会自己概括CI;因此，鱼精蛋白缺乏不是CI的唯一原因，必须与其他CI修饰一起起作用。与这些结果一致，7天大的wMel +男性几乎没有表达CI，表现出与wMel?男性相似的弱蛋白缺乏水平，如预期的那样（S8A和S8B Fig和S2表）。此外，转基因分析指出，CifA的单表达和双表达，CifB引起鱼精蛋白缺乏，其水平明显高于wMel?和非CI转基因的阴性对照（S7B图和S1表）。由于单独表达的 Cifs 不会在 D 中引起 CI。黑色素[16]（S7C图和S2表），可能需要对鱼精蛋白缺乏和/或由于异常PTM引起的组蛋白保留的加性作用来完全建立CI。
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图 3. 鱼精蛋白突变体增强野生型CI，并显示成熟精子中鱼精蛋白缺乏水平显着升高。
（A）来自沃尔巴克体感染（ΔProt+）和沃尔巴克氏体未感染（ΔProt?）鱼精蛋白突变体（w[1118]; ΔMst35B[floxed]，Sco / CyO）雄性的精子表现出显着增加的CMA3荧光，表明鱼精蛋白缺乏症与野生型wMel +和wMel?相比。竖线表示平均值，误差线表示标准差。字母表示具有统计学意义（p < 0.05）差异，这是通过基于Kruskal-Wallis检验和Dunn多重检验校正的多重比较确定的。所有 p 值都在 S1 表中报告。（B）CMA3测定中使用的雄性兄弟姐妹的CI孵化率分析（图A）验证了精子蛋白缺乏症增加的ΔProt +雄性比wMel +引起更强的（可挽救的）CI水平。ΔProt?雄性不引起CI。星号表示通过成对曼-惠特尼检验确定的统计学显著性 （p < 0.05） 差异。与CI测定相关的所有p值都在S2表中报告。此图背后的原始数据可以在 S1 数据文件中找到。CI，细胞质不相容性;CMA3，嗜铬霉素A3。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001584.g003
CI和救援都依赖于CIFA bNLS
基于用于核定位信号的cNLS图谱工具[46]，CifA氨基酸在蛋白质最保守的区域[13，47，48]中具有预测的二分核定位序列（S3表），该区域处于强纯化选择下[17]。由于核定位信号与核转运蛋白importin-α（也称为核益素-α）的延伸表面沟槽结合[49]，我们假设CifA的精子核定位以及CI和救援依赖于bNLS。为了验证这一假设，我们用丙氨酸取代物诱变了2个bNLS序列（NLS1的aa189-190（表示cifA）189） 和 aa224-225 表示 NLS2（表示 cifA224）），我们另外删除了整个 bNLS 区域 （cifAΔbNLS) (图4A）。bNLS缺失也对应于CifA中预测较弱的过氧化氢酶-相对结构域[47，48]。-厦门杂志期刊论文发表
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图 4. CIFA中的核定位信号对于CI，救援和鱼精蛋白水平是必要的。
（A）CifA注释的示意图显示了带有工程氨基酸取代和缺失的注释bNLS。（乙、中）孵化率测定评估了表达野生型、转基因和突变cIFA的果蝇的CI（B）和救援（C）。每个点代表从一对雄性和雌性孵化出来的胚胎的百分比。样本数量列在括号中。水平条表示中位数。右边的字母表示由 Kruskal-Wallis 检验和 Dunn 多重比较检验确定的显著差异。所有 p 值都在 S2 表中报告。（D）bNLS突变系（cifA）睾丸中洋葱期精子的抗体标记（绿色）和DAPI染色ΔbNLS）显示缺失消融了CifA对细胞核的定位，因此CifA保留在周围的细胞质中。成像实验与图1所示的nos;cifAB线平行进行。（E）从转基因cifA的<8小时龄男性的精囊（n = 15）中分离出的成熟精子ΔbnlsB 线显示荧光减少，表明与 cifAB 相比，鱼精蛋白缺乏较少。为了控制nos-Gal4VP16驱动器线的任何背景混杂效应，wMel?父亲事先被交叉到nos-mothers以产生具有nos;wMel?基因型的男性。从nos;wMel?雄性中分离出的精子的CMA3荧光水平与本研究中先前测定中使用的wMel?野生型系相似。竖线表示平均值，误差线表示标准差。字母表示具有统计学意义（p < 0.05）差异，这是通过基于Kruskal-Wallis检验和Dunn多重检验校正的多重比较确定的。所有 p 值都在 S1 表中报告，此图的原始数据可以在 S1 数据文件中找到。bNLS，二分核定位信号;CI，细胞质不相容。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001584.g004
每个bNLS突变体，单独和一起（cifA189;224），在具有转基因完整cifB的睾丸中双表达以评估CI，并在女性中单独表达以评估救援。转基因 CIFA189如前所述，表达显著降低了CI和抢救（图4B、4C和S2表）[48]。相反，转基因CIFA224在CI或救援中，表达与对照组没有显着差异，这表明该区域几乎没有影响。然而，当两个突变体都以cifA表达时189;224或者当整个bNLS被删除时，CI和救援被强烈抑制（图4B和4C和S2表）。这些结果凸显了核定位序列在诱导CI和救援方面的重要性。为了确定CI诱导的缺乏是否是由于CifA蛋白的非核定位，我们使用缺失突变的cifAΔbNLS用野生型cifB来证明与其正常的核定位相反（图1），它错位到洋葱阶段精子的细胞质而不是细胞核（图4D）。此外，为了测试bNLS的缺失是否会影响精子基因组完整性，我们进行了基于CMA3的鱼精蛋白缺乏测定（如上所述），并发现由于非CI引起cifA，成熟精子中的鱼精蛋白缺乏水平降低。ΔbNLS;B线与引起CI的cifAB（图4E和S1表）相比，提供了进一步的证据，证明鱼精蛋白缺乏与CI有关。总体而言，这些数据提供了以前未知的发现，即功能性核定位序列和CifA核定位会影响CI，救援和精子蛋白蛋白水平。
Cifs 引起父亲转移的鱼精蛋白缺乏症
为了研究Cif蛋白和/或基因组完整性修饰是否将父体转移到雌性生殖道，为CI和救援杂交建立了单个雄性：雌性成对交配。交配4小时后，我们分离出整个子宫（图5A），包括精子储存器官（精子（SP）和精囊（SR））。在精子去缩、抗体染色和显微镜检查之后，我们观察到了2个关键结果。首先，CifA和CifB蛋白分别与精子尾部和头部一起转移到无沃尔巴克氏体女性的精子储存器官（图5B）。其次，由wMel +和表达cifAB的雄性诱导的CI相关精子蛋白缺乏症转移并持续存在于从无沃尔巴克氏体，交配雌性的SP和SR分离的精子中（图5C和5D和S1表）。这些发现将父亲转移的精子修饰与沃尔巴克氏体和Cifs本身的活性联系起来。结果强烈支持CI的宿主修饰模型，因为在睾丸中建立的CIF诱导的精子修饰转移到女性生殖道。
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图 5. CifA，CifB和鱼精蛋白缺乏症与成熟精子一起转移到女性生殖道。
（A）黑腹果蝇女性生殖系统的示意图。成熟的卵母细胞离开卵子房到达UT，在那里它们可以在产卵前受精。来自雄性的精子储存在专门的器官中 - 盒子中显示的SP和SR，它们打开进入UT进行受精。使用 BioRender.com 创建逻辑示意图。（B）转基因cifAB表达和wMel?雄性杂交至wMel?雌性。受精后四小时，从雌性中分离的精子被去缩骨并免疫染色以定位CifA（绿色）和CifB（红色）。DAPI染色（蓝色）用于标记细胞核。CifA在精子头部（空箭头）中不存在，沿着精子尾巴（箭头）可以看到脓胸。CifB存在于所有精子头（实心箭头）的顶端顶端，在更去缩的精子核中具有更远的信号。从wMel?阴性对照雄性转移的精子中不存在Cifs。（C）个体精子强度定量表明，与w Mel?雄性相比，雌性转产后，来自wMel+和转基因cifAB雄性精子的精子蛋白缺乏症仍然存在。来自转基因cifAB雄性的精子蛋白缺乏症也持续存在于wMel +雌性的生殖道中。竖线表示平均值，误差线表示标准差。字母表示具有统计学意义（p < 0.05）差异，这是通过基于Kruskal-Wallis检验和Dunn多重检验校正的多重比较确定的。所有 p 值都在 S1 表中报告，此面板下的原始数据可以在 S1 数据文件中找到。（D）显示了从w Mel?，w Mel+和w Mel+女性生殖系统中从wMel?，wMel+和转基因cifAB雄性转移的CMA3染色成熟精子（箭头）的代表性图像。CMA3，嗜铬霉素A3;卵巢，卵巢;SP，精子;SR，精管插座;UT，子宫。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001584.g005
CifA存在于早期卵子发生中，在成熟卵子和抢救胚胎中不存在
CIFA在卵巢中的单独表达可挽救CI [16，17]，但CifA蛋白如何介导抢救尚不清楚，并且是进一步区分CI机制模型的核心。例如，女性的CifA可以修改生殖细胞生物学，以消除胚胎中诱导CI诱导的精子修饰（宿主修饰），或者，CifA可以直接结合胚胎中的CifB以防止其提出的CI毒性（毒素 - 抗毒素）。使用CIFA抗体，我们在wMel +和cifA转基因表达卵巢中显示CifA蛋白是细胞核的，并且特异性地定位到胚芽区域1中的囊肿DNA（图6A），表明卵巢中的核访问与睾丸相似（图1）。糙中的膀胱母细胞经历一轮有丝分裂以产生卵母细胞和护士细胞[50，51]。沿着wMel +雌性的卵室2至8期，CifA与护士细胞和卵母细胞质中的沃尔巴克氏体共定位（图6A）。虽然沃尔巴克氏体在10期卵室中很丰富，但CifA明显不存在。在转基因雌性中，CIFA也主要在早期卵室的禹和细胞质中检测到，而在晚期卵室中不存在（图6A和S9A）。建议在沃尔巴克氏体感染的卵中存在高水平的CIFA以拯救CI;重要的是，在早期有丝分裂期间，我们没有在大约30至60分钟的抢救胚胎中检测到CifA（图6B）。此外，在1至2小时大的胚胎中未检测到CifA（S9B图），而阳性对照组蛋白信号在两个胚胎发育阶段与胚胎DNA共定位。
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图 6. CIFA存在于早期卵子发生中，在晚期卵室中不存在。
CifA和CifB在CI和抢救胚胎中均不存在。（A）顶部的黑腹果蝇卵巢示意图从左到右说明了卵子发生的阶段。映像是使用 BioRender.com 创建的。免疫染色测定表明CifA（绿色）定位到沃尔巴克氏体未感染转基因cIFA系胚芽1区域1中的囊肿DNA（用DAPI标记的蓝色）。在wMel +系中，CifA与沃尔巴克氏体（红色）在禹，护士细胞和卵母细胞质中沿着卵室的2-8个阶段共定位。CifA在第10期卵室中不存在，而沃尔巴克氏体信号持续存在。在转基因CIFA系中，我们注意到在绿色通道中观察到的自发荧光勾勒出组织形态并不表示CIFA信号。在Affinity设计软件中手动调整了Ovariole图像，以将卵室阶段对齐在同一平面上。（B）从抢救中获得的大约30至60分钟龄胚胎（cifAB雄性×wMel +雌性）和CI杂交（nos;cifAB雄性×wMel?雌性）中获得的CifA（绿色）和CifB（红色）的免疫荧光。组蛋白抗体标记核心组蛋白（洋红色）被用作阳性对照。组蛋白信号与用DAPI（蓝色）标记的宿主DNA共定位，而未检测到CifA和CifB信号。在胚胎形状周围绘制点状的白色胚胎外围。白色箭头表示受精后的分裂细胞核，箭头表示极体。CI，细胞质不相容。-厦门杂志期刊论文发表
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001584.g006
最近发现，来自wPip的CifB被父系转移到CI胚胎上[30]。我们评估了wMel CifB是否在受精后与有丝分裂胚胎DNA共定位。CifB在胚胎细胞核和CI胚胎的细胞质中不存在（图6B），这表明CifB不与胚胎的父系DNA遗传。根据CI的宿主修饰模型的预测，晚期野生型和转基因卵子和胚胎中CifA和CifB的缺失表明，宿主配子的变化为胚胎在受精前的CI和救援做好了准备。这一推论也与以往的研究一致，其中卵巢而非胚胎转基因cifA表达拯救CI[13，15–17，52]。
讨论
在遗传水平上，cifA和cifB的双重表达或CIFB的单一表达可以概括CI，cifA挽救CI[13，15–19，52]。然而，CI和救援的细胞和机制基础仍未解决，并且有几个问题的主题：Cif蛋白何时何地定位于睾丸中以增强CI？Cifs是否被转移到已经针对CI定义缺陷进行修改的胚胎上？CIFA和CifB是否在胚胎中结合以挽救杀伤力？在这里，我们确定CifA和CifB蛋白都侵入发育中的精子的细胞核，并通过改变组蛋白 - 鱼精蛋白转化过程来修改父系基因组的完整性。具体而言，CifA和CifB的双重表达诱导CI诱导CI诱导CI的异常组蛋白保留和鱼精蛋白缺乏。此外，敲除鱼精蛋白可增强野生型 CI，CIFA 中的核定位序列对于 CI、救援和鱼精蛋白缺乏至关重要。最后，CIFA和CifB在胚胎中的结合并不明显。
精子基因组压缩通常在精子发生的减数分裂后独木舟阶段实现，此时组蛋白被鱼精蛋白取代[53]。这种压实过程从苍蝇到人类都是高度保守的[54-56]，在成功的受精和胚胎发育中起着至关重要的作用[57，58]。组蛋白标记是跨代表观遗传信息的载体[59]，精子表观基因组的变化可导致有害后果，包括早期胚胎致死性和出生缺陷[59，60]。组蛋白在降解和从精子染色质中去除之前，会经历各种PTM，例如泛素化，甲基化，磷酸化和乙酰化[38]。因此，异常保留的组蛋白可能是由表达Cif的苍蝇中的异常PTM引起的。在蛋白质相互作用组筛选中，泛素和组蛋白H2B均被确定为与CifB结合的候选宿主[52]。因此，组蛋白泛素化过程的抑制可能介导异常组蛋白潴留。此外，在精子发生的独木舟阶段，果蝇组蛋白驱逐需要组蛋白乙酰化[61]。事实上，乙酰化水平降低会导致组蛋白潴留和鱼精蛋白缺乏异常，从而导致苍蝇胚胎存活[61]和哺乳动物[40，62，63]。未来的研究调查在组蛋白 - 鱼精蛋白过渡阶段改变的特异性PTM将有助于阐明导致CI的分子途径。
父系来源的Cif蛋白与精子一起传播到女性生殖道，其中CifB存在于腹股沟区域，CifA沿着尾巴发生。值得注意的是，两种Cifs在胚胎中都不明显。虽然父系转移的Cifs的存在与CI的机制模型[11，29]不明确，并且最近在另一项转基因研究[30]中证实了这一点，但拯救胚胎中CifA-CifB结合的存在将支持毒素 - 抗毒素模型。然而，迄今为止，没有证据表明胚胎中存在这种结合现象。因此，我们得出结论，Cifs在受精之前起作用，以启动精子染色质并初步启动CI。父系效应蛋白可以修饰各种系统中的精子以赋予胚胎缺陷，即使蛋白质本身不会转移到胚胎上[60，64，65]。
在果蝇中，精子以完整的膜进入卵子[66]。因此，胚胎中缺乏Cifs提出了一个问题，即在精子进入卵子之前，沿着尾巴的CifA和顶体中的CifB在什么点丢失。一种可能的解释是，Cif蛋白在顶体胞吐时从精子中释放出来。顶体，最广为人知的是分泌囊泡，发生胞吐作用并释放其内容物以促进哺乳动物精子-卵子结合[67，68]。尽管在昆虫中的特征尚不清楚，但家蝇麝香的研究显示，精子质膜在进入卵子之前丢失，随后在精子通过卵子微叶的过程中，囊体内容物的胞吐[69]。
CifA在沃尔巴克氏体感染和转基因胚胎中不存在，这表明在宿主修饰模型下的卵子发生过程中建立了抢救，因此CifA不会结合并抵消胚胎中wMel Wolbachia的CifB。事实上，新注释的核定位序列中的CifA突变体会消融救援，这表明获得卵巢核对于救援很重要。有趣的是，CifA和CifB的结构支持2种蛋白质的结合[70]，但鉴于这些结果，CifA-CifB结合可能是CI诱导的核心，而不是救援。此外，CifA蛋白长度上的突变氨基酸位点（包括结合和非结合残基）通常会消融CI和挽救[48，70]。因此，消融抢救的CifA突变体可能通过改变卵巢靶标的蛋白质结构，功能和/或位置来修饰，而不是CifA在体内与CifB的胚胎结合。未来的工作对于解决CifA如何利用卵子发生来改变支撑救援的特定细胞生物和生化事件非常重要。
一旦受精发生，必须去除父系染色质中的鱼精蛋白并用母体组蛋白代替，以解除麻醉并激活发育中胚胎的染色质[71]。有趣的是，CI胚胎中母体H3.3组蛋白沉积的受精后延迟发生[21]。延迟可能部分是由于预加载的父系组蛋白或父系表观基因组信息改变导致母体组蛋白沉积的错误，从而导致CI。因此，我们提出，涉及配子中组蛋白，鱼精蛋白和可能的其他因素的基因组完整性网络可能是支撑CI和救援发作的共同和定义特征。
总而言之，在雄性和雌性配子中发现的核靶向Cif蛋白为早期细胞生物学和生化步骤建立了新的见解，这些步骤与节肢动物的形成和害虫控制相关，支撑CI驱动系统[11]。除了解开控制配子发生和胚胎发生的Cif蛋白的生殖事件外，证据还表明Cif蛋白修改精子基因组完整性并父亲转移，但它们本身不会在胚胎中进入并相互结合以实现救援。这些发现与wMel Wolbachia的CI的宿主修饰模型一致。更一般地说，由于以前没有关于前噬细胞蛋白入侵动物配子核以损害精子发生过程中组蛋白 - 鱼精蛋白过渡的报道，因此这些发现对于将前噬细胞 - 细菌 - 真核生物相互作用的欣赏扩展到动物繁殖领域具有重要意义。
方法
CIF蛋白抗体开发
先前已鉴定出来自wMel Wolbachia的CifA和CifB蛋白的保守氨基酸区域[47]。利用这些区域，太平洋免疫学（加利福尼亚州雷蒙纳）通过向兔注射3种合成并保存的每种蛋白质的短（20 aa）肽，在商业上产生单特异性多克隆抗体。肽序列是CyfA的Cys-EYFYNQLEEKDKEKKLTE和CifB的Cys-DENPPENLLSDQTRENFRR。使用酶联免疫吸附测定法评估所得的α-CifA和α-CifB抗体，并确定每种抗体的滴度高于1：500，000。使用Invitrogen WesternDot试剂盒（#W10142，加利福尼亚州卡尔斯巴德）的标准方案，使用蛋白质印迹（1：1，000倍抗体稀释）验证wMel+样品的抗体特异性，这些蛋白质是从wMel+（阳性），wMel?（阴性对照）和cifAB转基因（阳性）苍蝇的50个睾丸对（0至8小时龄男性）和10个卵巢对（6天龄女性）的匀浆中分离出来的蛋白质。仅从wMel +和cifAB生殖组织中检测到正确尺寸的条带（S1图）。由于抗体是在同一动物中产生的，因此所有后续标记都是用单个抗体完成的。
NLS 识别
来自已知沃尔巴克氏体和近亲的CifA氨基酸序列被输入到cNLS Mapper软件[72]中，以鉴定每种蛋白质中推定的NLS序列（S3表）。cNLS Mapper识别特定于导入α/β途径的序列。对所有序列应用截止评分4。分数越高，表示 NLS 活动越强。评分 >8 表示细胞核的排他性定位，7 至 8 分表示对细胞核的部分定位，3 至 5 分表示对细胞核和细胞质的定位，1 至 2 分表示仅定位到细胞质。预测的 NLS 序列分为单部分类和二分类。单方NLS包含单个碱性残基区域，二分NLS包含2个由连接子区域分隔的碱性残基区域。-厦门杂志期刊论文发表
转基因品系的开发
在GenScript上从头开始合成cifA变体，并如前所述克隆成pUC57质粒[48]。GenScript执行了针对站点的诱变，以产生图5中概述的突变体。CIFA189变异首先在什罗普郡及其同事[48]中被描述为cifA2.然后使用先前建立的方案生成UAS转基因cifA突变果蝇[13]。简而言之，GenScript将每个基因亚克隆到pTIGER质粒中，pTIGER质粒是一种基于pUASp的载体，专为种系特异性表达而设计。然后将转基因整合到y中1M{vas-int.Dm}ZH-2A w*;P{CaryP}attP40 附加站点进入 D.使用PhiC31整合酶的黑色素基因组通过BestGene的胚胎注射。每个转基因构建体至少注射200个胚胎，并根据含有转基因的pTIGER质粒上包含的红眼色基因鉴定出成功的转化子。所有序列都在 S4 表中报告。
苍蝇饲养和应变
D. 黑腹股 y1w*（BDSC 1495），nos-GAL4：VP16（BDSC 4937），用于cifA，cifB，cifAB，CD0508 [13]和鱼精蛋白突变体（w[1118]; ΔMst35B[floxed]，Sco / CyO）的UAS转基因系纯合子在50 mL标准培养基上在25°C和70%相对湿度下维持12小时的光照/黑暗循环。如先前研究[13]所述，通过3代四环素处理（在50ml苍蝇培养基中为20μg/ ml）产生未感染的鱼精蛋白突变系，然后在实验中使用前在标准食品培养基上进行2轮饲养。使用Wolb_F和Wolb_R3引物通过PCR定期确认所有品系的感染状况[74]。
出雏率
亲蝇要么是野生型未感染（wMel?），要么是感染（wMel+）的沃尔巴克氏体或表达转基因的，没有沃尔巴克氏体感染。未感染的转基因苍蝇是先前产生的[13，17]。将祖母年龄控制在9-11日内，以表达wMel CI的自然高外显率[75]。亲本转基因雄性通过杂交nos-Gal4：VP16处女（9-11日龄）与UAS-cif转基因未感染雄性而产生[75]。母亲在杂交前年龄为6-9 d，而父亲雄性首次出现时间为0-8小时，用于孵化率和组织收集，以控制与CI外显率降低相关的弟弟效应[13，76]。
如前所述设置出雏率[13，17]。简而言之，将一对男性和女性放在一个8盎司的圆底聚丙烯果蝇汤瓶中，用含有少量酵母的葡萄汁琼脂板放在底部并用胶带固定。然后将这些瓶子放在25°C的培养箱中过夜，以便求偶和交配。第二天，这些盘子被丢弃，取而代之的是带有新鲜酵母的新葡萄汁琼脂盘子。另外24小时后，取出板，并计数胚胎。然后将胚胎板在25°C下孵育36小时，然后计数未孵化胚胎的总数。任何产下胚胎少于25个的杂交都从分析中被丢弃。显着差异（p <0.05）是通过成对的Mann Whitney U测试或GraphPad Prism 7中的Kruskal-Wallis测试和Dunn多重测试校正确定的。所有 p 值都列在 S2 表中。
免疫荧光：睾丸和精囊
从孵化率（雄性0至8小时）收集兄弟姐妹在冰冷的1×PBS溶液中进行睾丸解剖。将组织固定在4%甲醛中，在室温下用1×PBS稀释30分钟，并在1×PBS-T（1×PBS + 0.3%Triton X-100）中洗涤3次，每次5分钟。然后在室温下在PBS-T中在1%BSA中阻断组织1小时。然后将它们与1°抗体（α-CifA 1：500或α-CifB 1：500）一起在4°C旋转下孵育过夜。在室温下洗涤1×PBS-T 3次，每次5分钟后，在室温下与1：1，000稀释的山羊抗兔Alexa Fluor 594二抗（Fisher Scientific，Cat#A11037，CA，USA）一起在室温下孵育4小时。然后将组织在1×PBS-T中洗涤3次，每次5分钟，并安装在载玻片上。为了染色核DNA，在将盖玻片轻轻放在组织上并擦去多余的液体之前，将0.2mg / mL DAPI添加到安装培养基中。载玻片在黑暗中干燥过夜，然后在蔡司LSM 880共聚焦显微镜上观察。所有图像都是使用每行的相同参数采集的，并在ImageJ中进行处理，如[77]中所述。
成熟精子核的去缩合
从雄性苍蝇（0-8小时）收集的压扁精囊囊在PBS中用10mM DTT、0.2%Triton X-100和400 U肝素治疗×，持续30分钟[34]。然后将载玻片在免疫荧光染色之前在1×PBS中快速洗涤（见上文）。
免疫荧光和定量：组蛋白
来自雄性苍蝇（0至8小时）的睾丸被固定并染色，如上所述用于睾丸。用核心组蛋白抗体（MilliporeSigma，Cat#MABE71，USA）（1：1，000）染色组织，并在Keyence BZ-800显微镜上成像。在每个睾丸中量化独木舟晚期精子束的总数量，并确定保留组蛋白的精子束。在GraphPad Prism 7中绘制了包含组蛋白的晚期独木舟阶段束与每个睾丸总束的比率。统计学显著性（p < 0.05）通过基于Kolmogorov-Smirnov检验的成对比较和基于GraphPad Prism 7中Kruskal-Wallis检验和Dunn多重检验校正的多重比较来确定。
精子分离和CMA3染色/定量
从雄性苍蝇（1日龄苍蝇为0至8小时，老年苍蝇为7天）中收集精囊，并将其置于冰冷的1×PBS的显微镜载玻片上。使用镊子在载玻片上提取精子，并在4°C下以3：1体积/体积甲醇：乙酸固定20分钟。然后除去多余的溶液，并将载玻片风干。每张载玻片在黑暗中用0.25mg / mL的CMA3在McIlvain的缓冲液中处理20分钟，pH 7.0，用10mM MgCl2.然后将精子在1×PBS中洗涤，安装，并使用Keyence BZ-X700荧光显微镜成像。所有图像都是以每条线的相同参数获取的，并且没有发生重大变化。根据[77]中描述的细节，通过使用ImageJ在单个精子头内以任意单位（A.U.）对荧光像素进行荧光定量，并绘制每个精子头的计算荧光强度。统计学意义（p < 0.05）由GraphPad Prism 7中的Kruskal-Wallis检验和Dunn多重检验校正确定。所有涉及CMA3染色的实验均在21°C而不是25°C下进行，CI孵化速率测定并行进行，以确保CI和救援表型不会因温度条件变化而受到影响。
免疫荧光：卵巢
在1×PBS中解剖来自女性（6日龄）的卵巢，并如前所述进行处理[76，78]。在室温下在PBS-T中用1%BSA封闭组织1小时，并首先与α-CifA（1：500）一抗一起在4°C下孵育过夜。在室温下用1×PBS-T洗涤3次，每次5分钟后，在室温下用1：1，000稀释的Alexa Fluor 488二抗（赛默飞世尔科技，Cat#A11034，USA）在室温下孵育4小时。然后适当冲洗样品并再次阻断，然后与α-ftsZ（1：150）一抗（Irene Newton博士的礼物）一起孵育，以在4°C下染色沃尔巴克氏体过夜。在1×PBS-T洗涤3次后，将样品与第二二抗（Alexa Fluor 594）一起在黑暗中孵育4小时。由于CifA和ftsZ抗体都是在同一动物中产生的，因此我们使用偶联到2个远处荧光团的二抗来区分特异性信号。然后将组织在1×PBS中洗涤3次，每次5分钟，用DAPI染色以标记核DNA并安装在载玻片上。将载玻片在黑暗中干燥过夜，然后在蔡司LSM 880（美国）共聚焦显微镜上观察。
免疫荧光：胚胎
交配24小时后，更换平板，每30分钟收集一次胚胎。将胚胎收集在胚胎洗涤溶液中的100μm网篮中。为了去除绒毛膜，将篮子置于50%漂白剂中3分钟，然后用1×PBS冲洗。然后将胚胎在微量离心管中转移到50：50 4%多聚甲醛（PFA）和庚烷中，并在室温下旋转20分钟。然后将管从旋转器中取出，并在小心地去除底部PFA相之前允许庚烷和PFA分离。将甲醇加入到剩余的庚烷中，并用力摇动管子20秒，然后将胚胎沉降到底部并除去溶液。向胚胎中加入新体积的甲醇，并允许它们沉降到管的底部。去除甲醇，对上面的睾丸和卵巢组织进行所有阻断，染色和成像步骤。
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S1 图 使用CIF抗体的蛋白质印迹显示适当大小的蛋白质。
蛋白质印迹在从卵巢中提取的蛋白质（n = 10）上进行，这些蛋白质具有野生型感染的wMel +，未感染的wMel?，cifA转基因（cifA）和双cifA;B表示转基因品系。CifA 的预期大小约为 54 kD。使用抗CifB抗体对野生型感染（+），未感染（?）和CIFA的睾丸（n = 15）进行蛋白质印迹;B 转基因（A;B） 行。预期的 CifB 大小约为 133kD。Cifs在wMel?控制中不存在，并且在wMel+和cif表达线中以精确的大小存在。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001584.s001
（断续器）
S2 图 Cifs侵入野生型wMel +睾丸中的精子核。
对来自<8小时龄野生型wMel+和wMel?系的男性的睾丸（n = 20）进行解剖和免疫染色，以在精子形态发生期间可视化CifA（绿色）和CifB（红色）。DAPI染色（蓝色）用于标记细胞核。野生型系中的CifA和CifB定位模式与转基因cifAB相似（图1），wMel?未感染的对照系中不存在信号。该实验与图1所示的实验并行进行。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001584.s002-厦门杂志期刊论文发表
（断续器）
S3 图例 CifA和CifB在精子和成熟精子中的丰度水平各不相同。
（A）基于ImageJ的信号强度定量表明，在精子发生的精子阶段，CifA（绿色）比CifB（红色）表达更丰富。具有标准偏差的单个数据点的平均值绘制在图形上。字母表示通过基于曼恩-惠特尼检验的成对比较确定的统计学显着性（p <0.05）差异。p 值在 S1 表中报告。（B）在从精囊中分离出来的去缩骨成熟精子中，CifB存在于独木舟形精子和成熟精子头部的顶端，而CifA分别存在于其中的40%和20%中。对图1中获得的图像数据进行定量。每个点代表每个测试的精子或成熟精子中存在的Cifs的百分比。此图背后的原始数据可以在 S1 数据文件中找到。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001584.s003
（断续器）
S4 图 由于技术限制，CifA和CifB在精囊中的浓缩成熟精子中无法检测到。
对来自<8小时龄的转基因cifAB，野生型wMel +和wMel?系的雄性精囊（n = 20）进行解剖和免疫染色，以可视化成熟浓缩精子中的CifA（绿色）和CifB（红色）（由白色箭头表示）。DAPI染色（蓝色）用于标记细胞核。没有CifA和CifB表明，当精子染色质凝结并紧密堆积时，抗体无法获得蛋白质。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001584.s004
（断续器）
S5 图例 CifA和CifB也在细胞质WB中被去除。
对来自<8小时龄转基因cifAB雄性的睾丸（n = 20）和野生型wMel?系进行解剖和免疫染色，以可视化细胞质中的CifA（绿色）和CifB（红色）（存在于精子尾束基底端附近的WB）。一些CIF蛋白在cifAB系的WB中剥离，在wMel?对照睾丸中不存在。Brightfield被证明可以突出精子尾束和WB的形态，否则使用CIF抗体和DAPI染色是看不见的。该实验与图1和S2所示的实验并行运行。WB，废液袋。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001584.s005
（断续器）
S6 图 显示与图2A相关的完全未裁剪的荧光图像。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001584.s006
（断续器）
S7 图 个别 CifA 和 CifB 表达谱系不显示组蛋白保留异常，但蛋白缺乏。
（A）从单转基因表达谱系cifA，cifB和非CI引起对照基因WD0508的<8小时龄男性中解剖睾丸（n = 15），以定量精子束与精子发生晚期的组蛋白保留（紫色）。DAPI染色（蓝色）用于标记精子核。具有DAPI信号的总精子束和具有保留组蛋白的总精子束被手动计数和绘制图形。在独木舟晚期，单个转基因表达系显示出明显较少的组蛋白，类似于阴性对照wMel?。竖线表示平均值，误差线表示标准差。字母表示具有统计学意义（p < 0.05）差异，这是通过基于Kruskal-Wallis检验和Dunn多重检验校正的多重比较确定的。（B）从21°C下饲养的<8小时龄雄性的精囊（n = 15）中分离出的成熟精子用荧光CMA3（绿色）染色，以检测每个精子核中的鱼精蛋白缺乏症。在ImageJ中量化单个精子头部强度（参见方法）并绘制图表。与wMel?和WD0508对照系相比，cifA和cifB表达品系的荧光明显更高，表明鱼精蛋白水平降低。竖线表示平均值，误差线表示标准差。字母表示具有统计学意义（p < 0.05）差异，这是通过基于Kruskal-Wallis检验和Dunn多重检验校正的多重比较确定的。所有 p 值都在 S1 表中报告。这些实验与图2所示的实验并行进行。（C）CMA3测定中使用的转基因雄性兄弟姐妹的CI孵化率分析（图2B和S6）证实，在21°C下饲养时，与非CI诱导的胚胎相比，CI交叉（黑圆圈）产生的胚胎孵化明显较少。 右边的字母表示统计学上显着（p < 0.05）的差异，这些差异是通过基于Kruskal-Wallis检验和Dunn多重检验校正的多重比较确定的。所有 p 值都在 S2 表中报告。此图背后的原始数据可以在 S1 数据文件中找到。CI，细胞质不相容性;CMA3，嗜铬霉素A3。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001584.s007
（断续器）
S8 图 七日龄男性不引起CI，也没有鱼精蛋白缺乏。
（A）来自7天龄野生型沃尔巴克氏体感染（wMel+）雄性的精子显示出与wMel?相似的鱼精蛋白水平。竖线表示平均值，误差线表示标准差。字母表示通过成对曼-惠特尼检验确定的统计学显着性（p <0.05）差异。所有 p 值都在 S1 表中报告。（B）CMA3测定中使用的雄性兄弟姐妹的CI孵化率分析（图A）验证7d老wMel +不会诱导与其正常水平的精子蛋白水平相关的CI。右边的字母表示统计显著性（p < 0.05）差异，这些差异是通过使用Kruskal-Wallis检验和Dunn多重检验校正计算的多重比较来确定的。所有 p 值都在 S2 表中报告。此图背后的原始数据可以在 S1 数据文件中找到。CI，细胞质不相容性;CMA3，嗜铬霉素A3。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001584.s008
（断续器）
S9 图. CifA在卵母细胞晚期和来自抢救杂交的发育胚胎中不存在。
（A）在转基因cifA系中，CIFA（绿色）在卵母细胞晚期不存在。在20×放大倍率下获取图像，以显示一个平面中的中后期卵母细胞。我们注意到，在绿色通道中增露时的自发荧光勾勒出 15 期卵室的组织形态并不表示 CifA 信号。（B）从抢救杂交（cifAB雄性×wMel +雌性）获得的1至2小时龄胚胎（n = 50）中CifA（绿色）和组蛋白（洋红色）的免疫荧光。组蛋白信号在与宿主DNA共定位的发育胚胎中检测到，用DAPI（蓝色）标记，而CifA信号不存在。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001584.s009
（断续器）
S1 表。 与定量数据进行的所有统计比较相关的 p 值。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001584.s010
（XLSX）
S2 表。 与所有 CI 测定相关的 p 值。CI，细胞质不相容。-厦门杂志期刊论文发表
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001584.s011
（XLSX）
S3 表。 跨 CIFA 类型鉴定的 NLS 序列。NLS，二分核定位信号。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001584.s012
（XLSX）
S4 表。 本研究中使用的核苷酸和蛋白质序列。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001584.s013
（XLSX）
S1 数据。 基础数据的原始数据。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001584.s014
（XLSX）
S1 原始图像。 与S1图相对应的原始蛋白质印迹图像。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001584.s015
（DOCX）
确认
作者感谢Jennifer Battle在苍蝇收集和精子完整性测定染色方面的帮助;亚历克斯·曼苏埃托（Alex Mansueto）在孵化率方面的帮助;Sarah Bordenstein、Dylan Shropshire 和 Luis Mendez 对手稿提供了有用的反馈。我们感谢Janna McLean博士发送鱼精蛋白突变飞线进行实验。我们感谢Irene Newton博士分享沃尔巴克氏体抗体，并就本手稿的预印本版本提供有用的反馈。我们还感谢范德比尔特的细胞成像共享资源（CISR）提供的成像帮助。
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