安哥拉登革热病毒2型城市疫情的分子和基因组学调查-厦门杂志期刊论文发表
佐赖马内托，佩德罗?马丁内斯，莎拉?希尔，多明戈斯·扬东多，朱利安·泰泽，马里内拉·米兰德拉，雷纳托·桑塔纳·阿吉亚尔，乔尔森·泽维尔，克鲁兹·多斯桑托斯·塞巴斯蒂安，安娜·路易莎·米科洛·坎迪多，菲利帕·瓦兹，吉塞尔·雷耶斯·卡斯特罗，乔安娜·保拉·派桑，[ ... ],乔安娜·德·莫赖斯[ 查看全部 ]
出版日期： 2022年05月18日
抽象
背景
在非洲流行的登革热病毒（DENV）的传播模式和遗传多样性仍然知之甚少。2013年在安哥拉发现了DENV血清型（DENV1）的循环，而2018年首次检测到DENV血清型2（DENV2）。在此，我们报告了安哥拉卫生部国家参比实验室（INIS）对2017年1月至2019年2月期间发现的疑似登革热病例进行的分子和基因组调查的结果。
方法
在安哥拉18个省中的13个省共采集了登革热疑似病例的401份血清样本。其中，351个样本具有用于人口和流行病学分析的完整数据，包括年龄，性别，省份，居住类型，临床症状以及症状发作和样本收集日期。从样品中提取RNA，并通过两种不同的实时RT-PCR方案测试DENV-RNA。对PCR+病例进行现场全基因组纳米孔测序。贝叶斯聚结模型用于估计爆发出现的日期和起源，以及人口增长率。
结果
分子诊断显示，在安哥拉5个省的351例（19%）疑似病例中，有66例是DENV-RNA阳性。与农村相比，DENV PCR+病例在城市站点的诊断频率更高。在DENV阳性样本中，大多数是在症状发作后6天内收集的。93%的感染通过血清型特异性RT-PCR确认为DENV2，1例（1.4%）被确认为DENV1。在研究期间还发现了6例CHIKV RT-PCR阳性病例，包括1例与DENV1合并感染。大多数病例（87%）是在4月至10月的雨季在罗安达发现的。在11名患者中观察到与严重登革热相关的症状，其中2名具有致命的结果。现场纳米孔基因组测序和遗传分析显示，可能在2015年10月或前后从印度引入DENV2世界性基因型（也称为DENV2-II基因型），至少在该国检测到之前1.5年。凝聚模型表明，在研究期间，安哥拉的流行增长率和翻倍时间相对适中，并且DENV2适度扩张。
结论
本研究描述了安哥拉DENV2主要城市传播的基因组、流行病学和人口特征。我们还发现DENV2与DENV1和CHIKV共同传播，并报告了该国几例RT-PCR确诊的严重登革热病例。提高医疗保健专业人员对登革热的认识，扩大对全国虫媒病毒流行的监测，确定城市环境中最常见的蚊子滋生地，实施创新的病媒控制干预措施和登革热疫苗接种运动，有助于减少安哥拉的病媒存在和DENV传播。
作者摘要
安哥拉在2013-2017年期间经历了登革热、黄热病和寨卡病毒疫情。为了更好地发现安哥拉虫媒病毒疫情，我们在安哥拉卫生部国家卫生研究所（INIS）建立了国家虫媒病毒监测规划实验室，该实验室于2017年初正式启动了虫媒病毒监测活动。在这项研究中，我们测试了从2017年1月至2019年2月疑似登革热病例患者身上收集的样本。我们报告了安哥拉DENV2传播的分子和基因组学发现。现场全基因组测序和随后的系统发育分析表明，从南亚单次引入DENV2世界性基因型（也称为DENV2-II基因型），可能是由于国际旅行，随后是病毒数量适度增长的结果。在安哥拉，大多数检测发生在城市地区，尽管我们在安哥拉18个省中的5个省发现了DENV2。这项工作强调了在全国维持活跃的虫媒病毒监测规划的重要性，以调查安哥拉的DENV传播模式和高度流行的风险。
引文： Neto Z，Martinez PA，Hill SC，Jandondo D，Thézé J，Mirandela M等人（2022）安哥拉登革热病毒血清型2型城市爆发的分子和基因组学调查，2017-2019。PLoS Negl Trop Dis 16（5）：e0010255。https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0010255
编辑 器： David W.C. Beasley，德克萨斯大学医学部，美国-厦门杂志期刊论文发表
收到： 四月 15， 2021;接受： 2022年2月11日;发表： 五月 18， 2022
版权所有： ? 2022 Neto 等人。这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，允许在任何媒体上不受限制地使用，分发和复制，前提是注明原作者和来源。
数据可用性： 来自安哥拉的新型DENV基因组序列可在GenBank上找到，加入号为：MW481670 - MW481694。
资金： 这项工作得到了惠康信托基金会（NRF：亨利·戴尔爵士奖学金惠康信托奖学金204311/Z/16/Z;SCH：亨利·惠康爵士博士后奖学金220414/Z/20/Z）;约翰·费尔研究基金（赠款005166）;非洲牛津赠款（NRF：AfiOx-48，SCH：AfiOx-60）;医学研究委员会和FAPESP CADDE合作奖（MR/S0195/1）;和内部GCRF（授予005073）。资助者在研究设计，数据收集和分析，出版决定或手稿准备方面没有任何作用。
竞争利益： 作者声明没有利益冲突。
介绍
世界上约有一半人口面临登革热风险，其中很大一部分生活在非洲[1，2]。登革热病是由登革热病毒（DENV）引起的，登革热病毒是一种包膜10.7kb的单链RNA病毒基因组。DENV是黄病毒属的成员，其中还包括黄热病病毒（YFV）和寨卡病毒（ZIKV）。DENV主要由嗜人性埃及伊蚊和白纹伊蚊媒介传播[3]。经过近几十年广泛的全球扩张，这些蚊子现在可以在世界各地具有热带和亚热带气候的城市和城郊地区找到[4]。虽然大多数DENV感染是无症状的，但有症状的疾病通常以发烧，关节痛，严重头痛，肌痛，呕吐和皮疹为特征。偶尔，感染会引起一种称为重症登革热的潜在致命并发症，其特征是血管通透性增加，可导致液体积聚、出血和休克[3]。
DENV可分为四个遗传上不同的病毒分支，这些分支被命名为血清型（DENV1至DENV4）。感染一种血清型可赋予对该血清型的终身免疫力和对其他血清型的暂时（0.5-2年）免疫力[5，6]。然而，杂型血清型感染会增加发生重症登革热的风险[7]。全球旅行的增加促进了DENV血清型的传播和共同循环（高流行性）的增加[8，9]。1953年在菲律宾描述了第一次严重登革热的流行。从那时起，在整个亚洲、太平洋岛屿和美洲都观察到了重症登革热[10]。
在非洲，重症登革热的报道很少见[11-13]。虽然已知4种DENV血清型在非洲传播[14]，但人们对非洲大陆登革热传播的真正负担知之甚少。这部分是由于在一些非洲地区，用于常规疾病监测的可靠血清学和分子诊断方法有限。由于缺乏来自非洲大陆的数据，高质量的流行病学和遗传信息的产生变得复杂，这些信息可以为登革热传播的模式和驱动因素提供信息[15]。因此，改善非洲登革热病例的监测和实验室诊断是评估登革热病毒血清型全球流行病学和传播动态的关键优先事项[16]。
安哥拉共和国拥有超过3200万居民，位于非洲西南部，北部与刚果民主共和国接壤，东部与赞比亚接壤，南部与纳米比亚接壤。20世纪80年代，从安哥拉返回荷兰的感染旅行者首次间接证实了安哥拉的DENV传播[17]。2013年，安哥拉报告了首例本地获得性DENV病例[18-21]。在2013年疫情期间，安哥拉首都罗安达约10%的病例和随机聚集性受试者有近期DENV感染的证据[18]。同年，来自4大洲5个国家的返乡旅行者在安哥拉获得了由DENV1基因型V引起的DENV感染[21][20]。随后对2013年罗安达疫情的系统发育分析显示，该病毒谱系很可能是由西非流行的DENV1病毒流行谱系引起的[19]。随后，一项纳入47例从安哥拉返回葡萄牙患者的调查还发现2例DENV2病例（1例与DENV1和DENV3合并感染）和1例DENV4病例[22]。此外，2013年，在第二名从安哥拉返回葡萄牙的旅行者中发现了DENV4[23]。
近期研究表明，埃及伊蚊病媒广泛存在于安哥拉首都罗安达省的所有城市[24，25]。此外，2016年YFV最近流行，该国18个省中有13个省出现确诊病例[26]，2016年至2018年期间ZIKV的本地传播[27]以及基孔肯雅病毒的间接证据[28]进一步证实了存在有利于埃及伊蚊传播的虫媒病毒在安哥拉流行传播的合适环境条件， 包括DENV。
为了改善非洲登革热的监测和管理，必须生成关于登革热流行病学和演变的定量信息。在安哥拉，2017年1月在罗安达国家卫生研究所（INIS）开始了登革热、延年FV、基孔肯雅热和寨卡病毒的主动分子监测。INIS目前寻求使用实时逆转录PCR（RT-PCR）从安哥拉各地的医院和诊所确认登革热疑似病例，在某些情况下还通过病毒全基因组测序。对DENV基因组序列的分析可以帮助解开病毒谱系的起源及其时间动态。尽管在疫情暴发期间（特别是在低收入和中等收入国家）的病毒基因组序列数据的生成存在一些后勤挑战[29]，但我们于2018年1月对安哥拉的单个登革热病毒株进行了首次现场基因组测序[30]。
在这里，我们分析了安哥拉13个省351例疑似登革热病例的临床、人口和流行病学数据，包括安哥拉首批严重登革热报告。接下来，我们报告了安哥拉INIS产生的前25个DENV基因组的基因组分析。使用凝聚系统发育分析，我们估计关键的流行病学参数，例如引入日期和研究期间传播的主要DENV谱系的倍增时间。最后，我们根据安哥拉最近发生的虫媒病毒疫情，将我们的发现置于背景中，并讨论了当前监测系统的复杂性。
结果
临床和流行病学数据由2017年1月实施的国家虫媒病毒监测规划进行收集和分析，并由安哥拉卫生部INIS协调。在 2017 年 1 月至 2019 年 2 月期间，我们使用 RT-PCR 进行分子检测，对安哥拉共和国 13 个省（罗安达、本格拉、本戈、南宽扎、北宽扎、万博、威拉、库内内、纳米贝、卡宾达、威热、扎伊尔和莫西科）的登革热疑似病例进行了检测。采用RT-PCR检测方法，共检测了351份来自疑似登革热病例的血清样本，其中有完整的流行病学信息，检测是否存在DENV、ZIKV和CHIKV RNA[32]。
安哥拉实验室检测DENV2、DENV1和基孔肯雅病毒
我们发现总共71例RT-PCR阳性病例，无论是DENV（91.5%，n = 65/71），CHIKV（7%，n = 5/71）还是DENV和CHIKV（1.4%，n = 1/71）（S1表）。然后，我们使用单独的CDC DENV1-4实时RT-PCR测定法对DENV阳性病例（n = 66）进行输入[31]。我们发现大多数（97%，n = 64/66）DENV感染是由DENV2（RT-PCR循环阈值，平均CT = 27，范围：17至37）引起的。大多数DENV2感染是在罗安达（82.8%，n = 53/64）发现的，但我们也在北宽扎（6%，n = 4/64），库内内（4.7%，n = 3/64），威拉（3%，n = 2/64）和Uíge（3%，n = 2/64）省（图1和S1表）发现了DENV2病例。
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图 1. 安哥拉DENV2 RT-PCR确诊病例的空间分布。
上层世界地图显示了安哥拉的地缘政治位置。在下图中，DENV2 RT-PCR确诊（深红色），疑似病例（浅红色）的位置。没有从各省收到灰色样本。显示逆转录聚合酶链反应确诊病例和疑似病例的省份名称。
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安哥拉2型脑室内出血病毒感染的流行病学模式
在我们的研究中，大多数确诊的DENV感染患者居住在城市地区（92.4%，n = 61/66）。大多数DENV RT-PCR阳性病例发生在<18岁的个体中（51.5%n = 34/66）（S1表）。大多数具有性别相关信息的PCR确诊病例为男性（分别为60%，n = 36/65）。绝大多数DENV病例（69.7%，n = 46/66）是在雨季发现的，病例数在2018年4月至5月之间达到峰值（图2）。我们还在6月至10月的旱季发现了病例，这可能表明安哥拉有全年传播的可能性。与农村地区相比，DENV PCR确诊病例在城市地区的诊断频率更高（p<0.0001;比值比，OR = 7.9，95%可信区间，CI = 2.77-22.8）（S2表）。
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图 2. 安哥拉DENV2 RT-PCR确诊病例的时间序列。
Arrow表示本研究之前安哥拉最早的DENV2已知病例（分离株AO-1）的症状发作日期，之前在Hill等人中已有描述[30]。地毯图显示了样本采集地点（罗安达/罗安达以外）、居住地（城市/农村）、测序状态和季节，对应于S1表中描述的每个DENV2 RT-PCR阳性病例的症状发作日期。
https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0010255.g002
安哥拉DENV感染的临床特征分析
根据DENV RT-PCR病例的完整通报流行病学表格，DENV PCR确诊病例的主要临床症状是发热（97%，n = 64/66），肌痛（62%，n = 41/66）和头痛（57.6%，n = 38/66）和关节痛（42%，n = 28/66）（S1表）。患者还报告了眶后疼痛（14%，n = 9/66）和皮疹（4.5%，n = 3/66）（S1表）。重要的是，在9例患者中发现了与血浆渗漏相关的出血体征（14%，n = 9/66），包括来自罗安达的8例患者和来自Uíge省的1例患者。在根据WHO标准确定的重症登革热患者中，三分之二（n = 6/9）有一个解剖出血部位（消化道、泌尿生殖系统、皮肤或呼吸道），三分之一（n = 3/9）报告两个解剖部位出血。这些患者没有关于血小板计数和血细胞计数的信息。有出血体征的DENV2病例的平均CT值为26.2（范围：20.1至35.8），与非重症登革热感染相似（S1表）。等于或低于CT<37的值与存在发热（p = 0.0459）有关，但与其他症状（肌痛，眼眶后疼痛，皮疹和出血体征）无关，也与样本收集和症状发作之间的经过时间（未显示）无关。
DENV2的现场基因组测序和基因分型
接下来，我们尝试使用先前验证的纳米孔测序方法生成现场完整的病毒基因组序列[30]。在INIS进行测序，并尝试在3个测序文库中随机选择的25个样本上进行测序。平均而言，我们每个文库的中位数为2，172，258次读取（范围：1，825，088至4，358，412），基因组覆盖率的中位数为86.1%（范围：14-94%）（位于或高于20倍深度的位点）。我们从安哥拉回收了总共25个部分至接近完整的新DENV2基因组。使用系统发育亚型方法[33]，所有生成的基因组都被归类为DENV2基因型II（DENV2-II），也称为DENV2世界性基因型（图3A）。
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图 3. 安哥拉DENV2世界性基因型的系统发育分析。
A.最大似然（ML）系统发育树，参考来自[33]的DENV2基因型菌株，表明安哥拉菌株在DENV2世界性基因型内聚类。数字表示自举支持系统发育聚类。左下角的插图显示了ML系统发育树的根尖差异与采样日期之间的强相关性，该树是从包含安哥拉菌株和最接近公开可用的DENV2世界性基因型菌株（n = 38）的比对中估计的。二.DENV2世界性基因型基因组的年代学树，其分支根据菌株采样的位置着色。在每个序列的右侧，正方形根据样品原点显示样品类型。右侧的箭头突出显示了2019年2月在库内内省收集的最新样本B09分离株。s/s = 每个站点的替换数;R = 相关系数。
https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0010255.g003
DENV2世界性基因型在安哥拉的传播史
我们对DENV2世界性基因型基因组的最大可能性系统发育分析（n = 38）表明，来自安哥拉的所有菌株都属于一个单一的强支持单系进化枝（安哥拉进化枝的自举支持= 100%），这与印度和东非的序列密切相关（图3）。使用分子钟分析和最合适的嵌套常数逻辑人口统计模型（S3表），我们在2015年10月下旬或前后确定了DENV2世界性基因型AO-分支的共同祖先（95%BCI，2015年4月至2016年5月）（图3）。这表明，在2017年7月罗安达省出现首例确诊的DENV病例之前，DENV2世界性基因型可能已经默默传播了12个月以上（另见图2）。进化率估计为5.6×10?4（95% BCI， 4.5 至 6.9 × 10?4）每年每个站点的替换次数。此外，我们最拟合的恒定逻辑模型表明，安哥拉DENV2疫情的人口增长率为2.59（95%BCI，1.57至3.62）新感染者/个体/年（图4）。鉴于倍增时间可以直接从使用对数的增长率（r）中获得2（r），我们发现DENV2安哥拉分支的倍增时间为1.37（95%BCI，0.65至1.86）年。这反映了安哥拉境内人口指数增长率和（或）地理分布速度适中。
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图 4. 安哥拉DENV2的人口动态。
A. 有效种群规模（Ne）的时间变化乘以对数尺度的生成时间（t）。B. 物流增长率（年）-1）使用嵌套聚结模型估计了爆发前的病毒谱系（主要对应于来自印度的橙色样本）和安哥拉病毒谱系（红色）[34]。
https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0010255.g004
DENV2世界性基因型的谱系地理学
为了估计安哥拉DENV2世界性基因型流行的地理起源，每个分类单元被分配到采样国（安哥拉，中国，埃塞俄比亚和印度），并使用考虑不对称位置交换迁移率的贝叶斯方法估计年代系统地理树。我们的分析表明，DENV2世界性基因型AO-clade可能起源于印度（位置后验概率= 0.95）（图3B）。来自中国的两个序列都可以在安哥拉的基因组中穿插，揭示了登革热病毒从安哥拉传播到中国的传播。2019年2月中旬在南部库内内省采集的一种样本（B09）与罗安达省采集的基因组P26紧密聚集，并具有强大的统计支持（后验概率= 1.00）。加上城市病例比例高，这表明在首都罗安达建立了DENV2世界性基因型，随后传播到安哥拉其他省份。
讨论
我们的研究报告了登革热疑似病例的分子调查和向安哥拉卫生部报告的登革热确诊病例的基因组表征。对2017年1月至2019年7月期间在安哥拉发现的所有DENV确诊病例中超过三分之一的基因组测序，确定了DENV2世界性基因型的流行性传播。在此期间还发现了一例DENV1和5例CHIKV感染。DENV的系统发育分析显示，在2015年10月下旬（2015年2月至2016年6月）左右，安哥拉引入了该谱系，至少在该国发现之前1.5年。
大多数发现的DENV病例发生在城市环境中，2018年4月至5月期间确诊病例的高峰发生在罗安达蚊子数量高的几个月。然而，全年都发现了确诊病例，这表明罗安达的气候为埃及伊蚊传播的病毒提供了全年传播的机会。大多数DENV2病例是在罗安达省以及安哥拉沿海省份发现的，这一事实让人想起2016年黄热病疫情的模式[35]，并且可能反映了易感宿主的组合，以及驱动伊蚊属病媒丰度的适宜气候条件。然而，虽然18个省中有13个在2016年报告了YFV病例，但18个省中只有5个在2017-2019年期间确认了DENV2病例（图1B），这表明与YFV相比，DENV2的传播更为有限或DENV2监测更为有限。
人类流动性在伊蚊传播病毒和其他新发病毒的传播中起着关键作用[36，37]。我们的系统地理学分析表明，DENV2世界性基因型最有可能是从印度引入的，印度是一种进口途径，也得到了旅行数据的支持[19]。重要的是要强调，其他未采样的位置可能成为虫媒病毒传播的垫脚石。基于DENV2-II谱系基因组的可用性有限（在我们考虑的分支中，只有12个基因组来自安哥拉境外，图3B），这些结果应该谨慎解释，因为最近流行的病毒可能来自未采样的位置。大多数飞往安哥拉的航空乘客都是在巴西开始旅行的。然而，尽管两国之间频繁交换蚊媒病毒（例如寨卡病毒和基孔肯雅病毒），但最近在巴西才检测到DENV2-II[38]，而最近在巴西发现的DENV2-III流行传播[39]在安哥拉尚未观察到。此外，来自中国的两个DENV2序列属于这里报道的安哥拉序列的多样性。同样，在前往安哥拉的中国旅行者中也观察到YFV感染[40，41]。所有病例均与来自安哥拉的YFV毒株具有高度同源性，提示通过返回的旅行者输入。鉴于安哥拉与南美洲和亚洲的连通性，需要继续监测以快速发现新引入的登革热谱系和其他病毒病原体的传播，包括安哥拉被认为高度脆弱的国家SARS-CoV-2[42]。
我们的系统发育分析进一步表明，单一病毒被引入该国，然后是DENV2-II安哥拉分支的指数级人口增长，估计增长率约为2.59例新感染/个体/年。这表示流行时间翻了一番，为71周（95%BCI，33.8周至1.9年），与1997-2000年间委内瑞拉抽样的DENV2-III的估计值相比，这一速度慢了近3倍[43]，与整个美洲大陆抽样的DENV2谱系的估计值相比，慢了3倍以上[44]。由于不同谱系的进化速度没有显著差异，因此，与美洲的爆炸性疫情相比，罗安达以外地区人口增长较慢和人口分布更有限，这两者都可能导致该病毒在安哥拉境内的较温和传播。与美洲相比，安哥拉伊蚊易感性和种群免疫力的差异也有可能导致人口增长率降低。
安哥拉四分之一的人口居住在首都罗安达，那里发现的DENV急性感染病例数量最多。罗安达的700万居民中有许多生活在卫生条件不足的环境中，这有利于A的繁殖。埃及蚊虫病媒。因此，罗安达DENV检出率的提高确实可以反映出该市虫媒病毒传播的发病率更高，条件更合适。此外，2014年4月至2015年3月期间进行的昆虫学调查显示存在A。罗安达省所有城市的埃及伊蚊[25]。未来的公共卫生预防和控制登革热应依靠更有效的病媒控制措施，特别是在安哥拉最大的城市中心。然而，罗安达的DENV检测可能至少部分反映了一种确定偏倚，这是由于来自远离罗安达的省份的样本运输更具挑战性和充分储存而造成的[27]。正在进行的研究正试图分析更多的病例，并评估在安哥拉各地的省级实验室中对病毒暴发进行分散监测的策略。
非洲严重登革热的报道很少见。我们在安哥拉发现了9例表现出与严重登革热相符的体征的病例。序贯异亚型登革热感染与重症登革热相关[10]。鉴于1型DENV于2013年在罗安达的传播情况，安哥拉发现严重登革热病例并不意外。在安哥拉以往2013年DENV1疫情期间，报告了1例死亡病例和1例具有临床显著出血表现的重症登革热病例[20]。这表明不能排除其他血清型在安哥拉未被发现的传播。事实上，DENV4于2014年1月在一名从罗安达返回的旅行者中被发现[28]。我们确定了改善安哥拉虫媒病毒分子监测血清型和基因型检测的几个方面。例如，来自疑似登革热患者的32%（n = 100）样本是在症状发作后6天以上收集的，此时RT-qPCR检测效果较差，因为患者可能不再急性感染。然而，由于道路基础设施不足，一些省份在向参比实验室运送样本方面可能会遇到挑战。我们目前正在测试使用化学处理的滤纸卡来运输活RNA，以减少样品收集和测试之间的天数，并提高RNA在运输过程中的稳定性。
发现新的DENV血清型是未来重症登革热流行持续风险的重要指标[7，10]。非洲强化监测已导致非洲大陆多例严重登革热病例报告[11，12，20，45]。然而，登革出血热的确认通常需要实验室检查，例如血液学检查、血小板计数、对有出血症状的患者样本进行病毒学和血清学筛查。安哥拉尚无用于这些检测的实验室设备。及时诊断和实施登革热患者管理策略有助于提供更有效的登革热治疗。在2017年至2020年期间，INIS为全国各地的医疗保健专业人员和公共卫生人员组织了几门关于虫媒病毒的短期课程。然而，应进一步优先考虑在全国范围内提高对登革热的认识并改善医疗护理的可及性，以增加报告并帮助降低死亡率[46]。
最后，我们介绍了安哥拉卫生部加强常规监测工作的登革热流行病学、临床和遗传学发现。在全国范围内扩大和分散对虫媒病毒流行的监测，提高卫生保健人员对登革热的认识，确定城市环境中最常见的蚊子孳生地，实施新的病媒控制干预措施和登革热疫苗接种运动，可能有助于减少安哥拉的病媒存在和DENV传播。
材料和方法
道德声明
临床样本（血清和血液）和相关的人口数据在INIS根据安哥拉卫生部最近成立的安哥拉国家虫媒病毒监测实验室的指南进行了处理和分析。残留的匿名临床诊断样本对患者没有风险或风险最小，作为安哥拉国家虫媒病毒监测的一部分，在安哥拉卫生部国家伦理委员会的条款范围内，用于研究和监测目的。
上下文
安哥拉共和国，安哥拉，位于非洲西南部，面积为1，247百万公里22019年估计有30，175，553名居民（https://www.ine.gov.ao）。其百分之六十二的人口居住在城市地区。安哥拉北部与刚果民主共和国接壤，东部与赞比亚和博茨瓦纳接壤，南部与纳米比亚接壤。该国分为18个省，162个直辖市和559个公社。人口最多的省份是罗安达省，估计有700万居民（https://www.ine.gov.ao）。该国的气候沿海和南部干旱，内陆有热带和温带气候。罗安达的气候特点是9月至4月的雨季，5月初至8月底的旱季，平均气温为24.4°C（8月最低20.4°C，3月最高26.9°C），年平均降水量为439毫米（集中在9月至5月之间）。
安哥拉登革热病例定义和通报
安哥拉卫生部（MoH）国家虫媒病毒监测实验室（NAS）疑似DENV感染指南于2013年4月推出，包括未分化发热、斑丘疹、肌痛、头痛、关节痛、眶后疼痛和呕吐。根据世界卫生组织2009年指南修订后，重症病例的定义包括血浆渗漏、出血和器官受累[10]。全国各地的临床医生被告知，这种疾病可能是轻微的，或者以更具侵袭性的形式发生，可能伴有鼻衄，牙龈出血，呕血，血尿和黑便。DENV疑似病例的血清样本与手写通知表一起提交给INIS，其中包括有关性别、年龄、居住类型（城市或农村）、临床症状、症状发作日期、过去两周的旅行史以及在当地医院进行的其他临床实验室检测（疟疾厚血涂片和血图的厚血涂片和血迹图）的信息。在没有提供样本进行确认的情况下，不会向INIS报告疑似病例。
DENV疑似病例的实验室确认
根据卫生部的官方指南，2017年1月至2019年2月期间，向INIS报告了401例DENV疑似病例，其中只有351例病例具有详细的流行病学数据。本研究仅使用具有流行病学数据的样本。13个省报告了疑似病例（图1）。在罗安达的INIS对登革热疑似病例的血清样本进行了DENV RNA筛查。根据制造商的说明，使用QIAamp病毒RNA迷你试剂盒从血清样品中提取RNA。登革热的临床症状通常与ZIKV和CHIKV的症状重叠[47]。此外，血清学检测中通常与其他黄病毒（如寨卡病毒、黄热病、西尼罗河病毒和日本脑炎病毒）有很强的交叉反应性[48，49]。因此，我们使用Trioplex实时RT-PCR测定进行了分子诊断，以准确区分DENV，ZIKV和CHIKV感染[31]。对于DENV阳性样本，我们使用CDC DENV1-4 RT-PCR测定[32]来鉴定特定的DENV血清型。两种RT-PCR测定都是在应用生物系统7500 Fast系统上进行的。每个RT-PCR确诊病例的性别、年龄、临床数据、省、市采样、居住类型和周期阈值（CT）值可在S1表中找到。
便携式现场DENV纳米孔基因组测序
根据前面详细描述的方案，使用牛津纳米孔技术MinION测序仪对25个RT-PCR阳性样品进行了测序[30，50]。生成了24个DENV2完整或接近完整的病毒基因组序列。简而言之，cDNA被反向转录并接受多重PCR，旨在扩增跨越整个DENV2编码区的~1000bp重叠片段。使用适配器连接，条形码PCR扩增子制备了一个文库，并在MinION上测序。根据先前描述的方案进行共识序列的生物信息学生成[30，50]。在生成共识序列后，所有序列均使用Muscle v3.8 [51]和使用DENV2基因组（加入号LC121816）作为参考基因组进行对齐。本研究产生的所有DENV2序列都可以在GenBank加入号上找到：MW481670-MW481694。
DENV2基因组数据集的编译和管理
DENV2基因组或长度至少为1，000个核苷酸的部分基因组于2019年6月从GenBank下载[52]，使用内部python脚本（称为全球数据集）。检索检索到n = 1，584个序列，然后使用基于系统发育的在线工具将其分类为基因型[33]，并通过RaXML v8的手动系统发育亚型进行确认[53]。对于手动系统发育亚型，将来自安哥拉的全球数据集和新基因组序列附加到先前策划的DENV2参考数据集（n = 42）中，该数据集在其他地方进行了详细描述[30]。接下来，我们准备了一个单独的数据集，其中包含与安哥拉流行的DENV2基因型相同的DENV2基因型相关的所有DENV2序列。这导致总共38个完整的基因组的数据集用于后续分析，包括来自安哥拉（n = 25），中国（n = 2），印度（n = 10）和埃塞俄比亚/吉布提（n = 1）的数据。由此产生的核苷酸数据集，称为DENV2世界性数据集，然后使用Muscle 3.8对齐[51]。关于收集国家/地点、采样日期的元数据是从GenBank条目和直接报告序列数据的出版物中手动检索的。
最大似然系统发育分析
使用RaXML v8为全局和Cosmopolitan数据集生成最大似然（ML）系统发育树[53]。使用 Cosmopolitan 数据集的 1000 个引导复制获得了统计分支支持。使用TempEst通过回归收集日期（格式y-mm-dd;没有确切日期时，使用1年或1个月的精度）和根到尖端的遗传距离[54]，对该数据集的时间信号进行了分析。一个采样日期具有异常低散度的异常值序列（GenBank MH822954）从后续分析中删除。鉴于Cosmopolitan数据集的根到端散度与采样日期之间的强相关性（图2A），我们使用此数据集进行了随后的带时间戳的贝叶斯系统发育分析。
病毒种群动态
为了估计来自印度次大陆和埃塞俄比亚/吉布提的安哥拉谱系和安哥拉分支（AO）旁系谱系（以下简称前AO谱系）的人口增长率，我们使用了最近描述的嵌套贝叶斯融合方法[34]，该方法符合不包括AO谱系的家谱的恒定逻辑人口统计模型[55]。初始恒定相位适应来自前AO谱系的较长分支，如图2B所示。嵌套在此模型中，我们为 AO 谱系指定了一个单独的物流增长模型。我们将嵌套常数逻辑的拟合度与其他四个合并模型进行比较：恒定人口大小、指数人口大小、逻辑人口大小和贝叶斯天际线。在BEAST v1.10 [57]中采用路径采样和石材采样方法[56]进行模型选择结果。
贝叶斯系统地理分析
在BEAST v1.10中对严格和不相关的松弛分子钟模型进行了贝叶斯分子钟分析[57，58]。我们使用了一个严格的分子时钟，假设DENV2 Cosmopolitan基因型的所有系统发育分支的单一进化速率，在初步松弛的时钟模型分析显示变异系数接近于零（中位数0.17，95%BCI：7.6 x 10?5至 0.34）。为了估计整个DENV2世界性基因型历史中的祖先位置，我们使用了一个不对称的离散性状系统发育模型，该模型考虑了病毒基因组的共同祖先和系统发育的不确定性[59]。在BEAST v1.10中，对5000万个MCMC步长进行了严格的分子钟谱系地理学分析，并进行了最合适的聚结模型[57]。使用Tracer版本1.7.1 [60]检查MCMC链的收敛性，在移除10%的后树作为烧入后，使用TreeAnnotator v.1.7.1 [57]生成最大分支可信度树，并在FigTree v.1.4.3 [61]中可视化。
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2017 年 1 月至 2019 年 2 月期间在 INIS 分析的 DENV RT-qPCR 阳性病例和测序样本相关元数据。
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1 表 S2.2017 年 1 月至 2019 年 2 月期间在 INIS 分析的 DENV RT-qPCR 阳性病例和测序样本相关元数据。
2
3 示例标识 序列样本 性 年龄 省 城 日期发作症状 日期收集 季节 居住类型 临床数据 虫媒病毒检测到三重体 断续器值
4 A25666 P7|A25665|安哥拉|罗安达|维亚纳|维亚纳|2018-03-12 M 54 罗安达 维亚纳 29.11.2018 12.03.2018 雨 都市的 发烧 丹佛-2 21.4
5 A27500 P138|A27500|安哥拉|罗安达|维亚纳|维亚纳|2018-05-17 F 10 罗安达 维亚纳 13.05.2018 17.05.2018 干 都市的 发烧 丹佛-2 26
6 抗氧化剂 B09 DENV2_Angola_library1_20190423|NB04NB09|85|Ondjiva|库内内|2019-02-15 M 19 库内内 昂迪瓦 10.02.2019 15.02.2019 雨 都市的 发热、关节痛 丹佛-2 17.0
7 D|17|01 未排序 F 36 罗安达 K.基亚希 06.01.2017 08.01.2017 雨 都市的 发烧 奇克沃 34.6
8 D|17|02 未排序 F 17 罗安达 K.基亚希 10.02.2017 12.02.2017 雨 都市的 发烧 奇克沃 35.1
9 D|17|03 未排序 M 5 罗安达 塔拉托纳 03.03.2017 04.03.2017 雨 都市的 发热、关节痛 奇克沃 36.0
10 D|17|04 未排序 M 52 罗安达 马扬加 02.04.2017 05.04.2017 雨 都市的 发热、黄疸、呕吐、肝脾肿大 奇克沃 26.5
11 D|17|05* 未排序 M 32 罗安达 马扬加 24.05.2017 26.05.2017 干 都市的 发热和严重出血，致命后果 DENV & CHIKV 26.4;24.9
12 D|17|06 未排序 M 17 罗安达 马扬加 20.07.2017 26.07.2017 干 都市的 发烧 丹佛-2 19.5
13 D|18|01 未排序 M 22 威拉 马塔拉 23.01.2018 25.01.2018 雨 农村 发烧、肌痛、头痛 丹佛-2 20.0
14 D|18|02 未排序 F 20 威拉 马塔拉 26.01.2018 27.01.2018 雨 农村 发热、肌痛、头痛、出血体征 奇克沃 33.4
15 D|18|03 未排序 M 26 威拉 马塔拉 27.01.2018 31.01.2018 雨 农村 发热、肌痛、头痛、关节痛 丹佛-2 28.8
16 D|18|113 未排序 F 5 罗安达 贝拉斯 08.06.2018 13.06.2018 干 都市的 发热、肌痛、头痛、关节痛 丹佛-2 24.3
17 D|18|114 未排序 F 16 罗安达 塔拉托纳 10.06.2018 14.06.2018 干 都市的 发热、肌痛、头痛、关节痛 丹佛-2 36.6
18 D|18|116 未排序 M 6 罗安达 塔拉托纳 09.06.2018 14.06.2018 干 都市的 发热、肌痛、头痛、关节痛 丹佛-2 32.9
19 D|18|119 未排序 F 14 Cuanza_Norte 卡曾戈 07.04.2018 11.04.2018 雨 都市的 发烧 丹佛-2 27.4
20 D|18|130 未排序 F 25 Cuanza_Norte 卡曾戈 06.04.2018 11.04.2018 雨 都市的 发烧 丹佛-2 26.0
21 D|18|133 未排序 F 7 Cuanza_Norte 卡曾戈 02.04.2018 11.04.2018 雨 都市的 发烧 丹佛-2 22.9
22 D|18|140 未排序 F 18 Cuanza_Norte 卡曾戈 06.04.2018 11.04.2018 雨 都市的 发烧 丹佛-2 23.7
23 D|18|145 未排序 M 6 罗安达 桑巴舞 26.08.2018 27.08.18 干 都市的 发烧 丹佛-2 26.6
24 D|18|16 P22|D|18|16|安哥拉|罗安达|本菲卡|爱国|2018-03-31 F 27 罗安达 本菲卡 30.03.2018 31.03.2018 雨 都市的 发热、肌痛、头痛、眼眶后疼痛、关节痛、出血体征 丹佛-2 20.1
25 D|18|17 P23|D|18|17|安哥拉|罗安达|基兰巴基亚西|拜罗17/2018-04-04 M 48 罗安达 K.基亚希 01.04.2018 04.04.2018 雨 都市的 发热、肌痛、头痛、眼眶后疼痛、关节痛、出血体征 丹佛-2 24.2
26 D|18|18 未排序 M 11 罗安达 贝拉斯 29.03.2018 04.04.2018 雨 都市的 发热、肌痛、头痛、眼眶后疼痛、关节痛、出血体征 丹佛-2 24.6
27 D|18|19 未排序 M 1 罗安达 贝拉斯 28.03.2018 02.04.2018 雨 都市的 发热、肌痛、头痛、关节痛 丹佛-2 20.8
28 D|18|20 P26|D|18|20|安哥拉|罗安达|本菲卡|贝拉维斯塔|2018-03-31 M 2 罗安达 本菲卡 28.03.2018 31.03.2018 雨 都市的 发热、肌痛、头痛、 丹佛-2 26.1
29 D|18|21 P27|D|18|21|安哥拉|罗安达|贝拉斯|诺瓦维达|2018-03-31 M 34 罗安达 K.基亚希 30.03.2018 31.03.2018 雨 都市的 发热、肌痛、头痛、关节痛 丹佛-2 23.5
30 D|18|211 未排序 F 13 罗安达 卡夸科 06.10.2018 08.10.2018 雨 农村 发热、肌痛、出血体征 丹佛-2 37.0
31 D|18|22 未排序 M 23 罗安达 维亚纳 26.03.2018 30.04.2018 雨 都市的 发热、肌痛、头痛、关节痛 丹佛-2 34.6
32 D|18|23 P29|D|18|23|安哥拉|罗安达|兰格尔|兰格尔|2018-03-31 M 28 罗安达 兰格尔 03.04.2018 04.04.2018 雨 都市的 发烧，肌痛，头痛，皮疹， 丹佛-2 23.6
33 D|18|24 未排序 M 28 罗安达 维亚纳 03.04.2018 04.04.2018 雨 都市的 发烧，肌痛，头痛，皮疹， 丹佛-2 21.3
34 D|18|242* 未排序 F 8 罗安达 维亚纳 08.10.2018 15.10.2018 雨 都市的 发烧、肌痛、头痛 丹佛-2 35.0
35 D|18|25 未排序 F 56 罗安达 贝拉斯 02.04.2018 07.04.2018 雨 都市的 发烧、肌痛、头痛、皮疹、出血体征 丹佛-2 24.0
36 D|18|257 未排序 M 8 罗安达 维亚纳 10.10.2018 14.10.2018 雨 都市的 发烧 丹佛-2 36.8
37 D|18|258 未排序 M 5 罗安达 桑巴舞 01.10.2018 04.10.2018 雨 都市的 发热、肌痛、头痛、眼眶后疼痛 丹佛-2 32.8
38 D|18|260 未排序 M 29 库内内 川滨 08.10.2018 10.10.2018 雨 农村 关节痛 丹佛-2 33.6
39 D|18|265 未排序 F 3 库内内 川滨 01.10.2018 10.10.2018 雨 都市的 肌痛、头痛 丹佛-2 35.4
40 D|18|266 未排序 M 43 威热 否定 02.08.2018 16.10.2018 干 农村 发热、肌痛 丹佛-2 34.5
41 D|18|27 未排序 M 25 罗安达 贝拉斯 04.04.2018 07.04.2018 雨 都市的 发热、肌痛、头痛、眼眶后疼痛、关节痛、出血体征 丹佛-2 23.0
42 D|18|270 未排序 F 19 威热 否定 15.10.2018 15.10.2018 雨 都市的 发烧，肌痛，头痛，出血性体征 丹佛-2 35.8
43 D|18|271 未排序 F 58 罗安达 维亚纳 14.10.2018 19.10.2018 雨 都市的 发烧、肌痛、头痛 丹佛-2 33.2
44 D|18|272 未排序 F 25 罗安达 维亚纳 14.10.2018 19.10.2018 雨 都市的 发烧、肌痛、头痛、关节痛 丹佛-2 36.0
45 D|18|273 未排序 F 8 罗安达 维亚纳 14.10.2018 19.10.2018 雨 都市的 发烧、肌痛、头痛 丹佛-2 35.3
46 D|18|274 未排序 M 14 罗安达 维亚纳 14.10.2018 19.10.2018 雨 都市的 发热、肌痛、头痛、关节痛 丹佛-2 36.7
47 D|18|276 未排序 F 3 罗安达 贝拉斯 20.10.2018 26.10.2018 雨 都市的 发热、肌痛 丹佛-2 34.3
48 D|18|28 P32|D|18|28|安哥拉|罗安达||卡波罗|2018-04-07 F 36 罗安达 维亚纳 07.04.2018 07.04.2018 雨 都市的 发热、肌痛、头痛、眼眶后疼痛、关节痛、出血体征 丹佛-2 19.9
49 D|18|29 P33|D|18|29|安哥拉|罗安达|维亚纳|维亚纳|2018-04-07 M 21 罗安达 维亚纳 06.04.2018 06.04.2018 雨 都市的 发热、肌痛、头痛、眼眶后疼痛、关节痛、出血体征 丹佛-2 27.0
50 D|18|299 未排序 F 11 罗安达 贝拉斯 22.10.2018 26.10.2018 雨 都市的 发烧、肌痛、头痛 丹佛-2 33.1
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S1 表。 2017 年 1 月至 2019 年 2 月期间在 INIS 分析的 DENV RT-qPCR 阳性病例和测序样本相关元数据。
https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0010255.s001
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S2 表。 2017年1月至2月报告发生的登革热病例的流行病学描述。2019年在安哥拉。
https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0010255.s002
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S3 表。 合并树先前模型选择分析的结果。
https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0010255.s003
（XLSX）
确认
我们感谢中国广州市疾病预防控制中心病毒学与免疫学系的苏文哲允许使用在发布前存放在GenBank的两个中国登革热病毒基因组序列。我们感谢CDC虫媒病毒分会和Biomanguinhos提供的登革热分子诊断试剂，以及巴西FioCruz的Luiz Alcantara在物流方面的帮助。
引用
1.Bhatt S， Gething PW， Brady OJ， Messina JP， Farlow AW， Moyes CL， et al.登革热的全球分布和负担。自然界。2013;496(7446):504–7.Epub 格式 2013/04/09.pmid：23563266.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
2.Brady OJ， Gething PW， Bhatt S， Messina JP， Brownstein JS， Hoen AG， et al.通过循证共识完善登革热病毒传播的全球空间限制。PLoS Negl Trop Dis. 2012;6（8）：e1760.Epub 格式 2012/08/11.pmid：22880140.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
3.谁。登革热和重症登革热。世界卫生组织 [互联网].2019.
4.Kraemer MU， Sinka ME， Duda KA， Mylne AQ， Shearer FM， Barker CM， et al.虫媒病毒载体埃及伊蚊和埃及伊蚊的全球分布。白纹。电子生活。2015;4：e08347.Epub 格式 2015/07/01.pmid：26126267.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
5.Gibbons RV， Kalanarooj S， Jarman RG， Nisalak A， Vaughn DW， Endy TP， et al.分析登革热的重复住院情况，以估计导致入院和登革出血热的第三次或第四次登革热感染的频率，以及血清型序列。美国热带医学和卫生杂志。2007;77(5):910–3.Epub 格式 2007/11/07.pmid：17984352.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
6.Reich NG， Shrestha S， King AA， Rohani P， Lessler J， Kalayanarooj S， et al.登革热血清型之间的相互作用凸显了交叉免疫的流行病学影响。皇家学会杂志，界面/皇家学会。2013;10(86):20130414.Epub 格式 2013/07/05.pmid：23825116.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
7.咕噜咕噜DJ.登革热和登革出血热。临床微生物学评论。1998;11(3):480–96.Epub 格式 1998/07/17.pmid：9665979.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
8.Nunes MR， Palacios G， Faria NR， Sousa EC Jr.， Pantoja JA， Rodrigues SG， et al.航空旅行与巴西登革热病毒血清型1-3的大陆传播有关。PLoS Negl Trop Dis. 2014;8（4）：e2769.Epub 格式 2014/04/20.pmid：24743730.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
9.Tian H， Sun Z.， Faria N. R.， Yang J.， Cazelles B.， Huang S.， Xu B.， Yang Q.， Pybus O. G.， Xu B. 增加航空旅行可能促进亚洲多种登革热病毒血清型的共同传播。PLoS被忽视的热带病。2017;11（8）：e0005694.pmid：28771468
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
10.谁。2009年登革热诊断、治疗、预防和控制指南。
11.Gubler DJ，Sather GE，Kuno G，Cabral JR.登革热3病毒在非洲传播。美国热带医学和卫生杂志。1986;35(6):1280–4.Epub 格式 1986/11/01.pmid：3789276.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
12.咕噜咕噜DJ.登革热/登革出血热的全球大流行：现状和未来前景。Ann Acad Med Singapore.1998;27(2):227–34.Epub 格式 1998/07/15.pmid：9663316.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
13.Malik A， Earhart K， Mohareb E， Saad M， Saeed M， Ageep A， et al.苏丹港儿童登革出血热疫情。感染与公共卫生杂志。2011;4(1):1–6.Epub 格式 2011/02/23.pmid：21338953.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
14.Messina JP， Brady OJ， Scott TW， Zou C， Pigott DM， Duda KA， et al.登革热病毒类型的全球传播：绘制70年历史图。微生物学趋势。2014;22(3):138–46.Epub 格式 2014/01/29.pmid：24468533.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
15.Jaenisch T， Junghanss T， Wills B， Brady OJ， Eckerle I， Farlow A， et al.非洲登革热的扩张-不被承认或没有发生？新发传染病。2014;20(10).Epub 格式 2014/10/02.pmid：25271370.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
16.Amarasinghe A， Kuritsk JN， Letson GW， Margolis HS.非洲登革热病毒感染。新发传染病。2011;17(8):1349–54.Epub 格式 2011/08/02.pmid：21801609.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
17.Bakker RC， Veenstra J， Dingemans-Dumas AM， Wetsteyn J， Kager PA.荷兰输入登革热。J Travel Med. 1996;3（4）：204–8.Epub 格式 1996/12/01.pmid：9815457.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索-厦门杂志期刊论文发表
18.夏普TM，莫雷拉R，苏亚雷斯MJ，米格尔达科斯塔L，曼恩J，德洛雷M等人。2013年安哥拉罗安达流行期间登革热的认知不足。新发传染病。2015;21(8):1311–6.Epub 格式 2015/07/22.pmid：26196224.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
19.Sessions OM， Khan K， Hou Y， Meltzer E， Quam M， Schwartz E， et al.探索2013年安哥拉罗安达登革热疫情的起源和传播潜力。全球健康行动. 2013;6：21822.Epub 格式 2013/08/06.pmid：23911088.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
20.疾病中心C，预防。持续的登革热流行——安哥拉，2013年6月。MMWR发病率和死亡率周报。2013;62(24):504–7.Epub 格式 2013/06/21.pmid：23784016.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
21.Schwartz E， Meltzer E， Mendelson M， Tooke A， Steiner F， Gautret P， et al.2013年3月至5月，在四大洲发现与安哥拉罗安达持续疫情有关的登革热病例。欧洲监测：欧洲传染病通报=欧洲传染病通报。2013;18(21).Epub 格式 2013/06/04.pmid：23725977.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
22.Abreu C，Silva-Pinto A，Lazzara D，Sobrinho-Simoes J，Guimaraes JT，Sarmento A.2013年安哥拉疫情的输入性登革热：不仅检测到血清1型。临床病毒学杂志：泛美临床病毒学学会的官方出版物。2016;79:77–9.Epub 格式 2016/04/24.pmid：27107210.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
23.Neumayr A， Munoz J， Schunk M， Bottieau E， Cramer J， Calleri G， et al.哨点监测通过欧洲旅行者到欧洲的输入性登革热2012年至2014年：来自登革热工具研究计划的TropNet数据。欧洲监测：欧洲传染病通报=欧洲传染病通报。2017;22(1).Epub 格式 2017/01/13.pmid：28080959.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
24.里贝罗·1971年安哥拉罗安达黄热病流行期间埃及伊蚊的防治情况。《世界卫生组织简报》。1973;48(4):504–5.Epub 格式 1973/01/01.pmid：4543554.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
25.Fernandez MC M.， Flores Y. H.， Nuviola D. L. 安哥拉罗安达埃及伊蚊（Diptera： Culicidae）的空间分布和主要繁殖地。社区医学和实践年鉴。2016;3(1):1017.
查看文章谷歌学术搜索
26.Grobbelaar AA，Weyer J，Moolla N，Jansen van Vuren P，Moises F，Paweska JT.安哥拉黄热病的复苏，2015-2016。新发传染病。2016;22(10):1854–5.Epub 格式 2016/08/19.pmid：27536787.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
27.Hill SC， Vasconcelos J， Neto Z， Jandondo D， Ze-Ze L， Aguiar RS， et al.安哥拉寨卡病毒亚洲谱系的出现：疫情调查。柳叶刀传染病。2019;19(10):1138–47.Epub 格式 2019/09/29.pmid：31559967.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
28.Parreira R，Centeno-Lima S，Lopes A，Portugal-Calisto D，Constantino A，Nina J. Dengue病毒血清型4型和基孔肯雅病毒合并感染，一名从安哥拉罗安达返回的旅行者，2014年1月。欧洲监测：欧洲传染病通报=欧洲传染病通报。2014;19(10).Epub 格式 2014/03/22.pmid：24650864.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
29.Gardy JL， Loman NJ.建立基因组学知情、实时、全球病原体监测系统。《自然》杂志评论遗传学。2018;19(1):9–20.Epub 格式 2017/11/14.pmid：29129921.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
30.Hill SC， Neto de Vasconcelos J， Granja BG， Theze J， Jandondo D， Neto Z， et al.登革热病毒2型世界性基因型的早期基因组检测，安哥拉，2018年。新发传染病。2019;25(4):784–7.Epub 格式 2019/03/19.pmid：30882320.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
31.Santiago GA， Vazquez J， Courtney S， Matias KY， Andersen LE， Colon C， et al.Trioplex实时RT-PCR检测法在检测寨卡病毒、登革热和基孔肯雅病毒方面的性能。自然通讯。2018;9(1):1391.Epub 格式 2018/04/13.pmid：29643334.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
32.Santiago GA， Vergne E， Quiles Y， Cosme J， Vazquez J， Medina JF， et al.CDC实时RT-PCR测定的分析和临床性能，用于登革热病毒的检测和分型。PLoS Negl Trop Dis. 2013;7（7）：e2311.Epub 格式 2013/07/23.pmid：23875046.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
33.Fonseca V， Libin PJK， Theys K， Faria NR， Nunes MRT， Restovic MI， et al.一种鉴定登革热、寨卡病毒和基孔肯雅病毒种类和基因型的计算方法。PLoS Negl Trop Dis. 2019;13（5）：e0007231.Epub 格式 2019/05/09.pmid：31067235.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
34.Worobey M，Watts TD，McKay RA，Suchard MA，Granade T，Teuwen DE等人1970年代和“患者0”HIV-1基因组阐明了北美的早期HIV /AIDS历史。自然界。2016;539(7627):98–101.pmid：27783600.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
35.Kraemer MUG， Faria NR， Reiner RC Jr.， Golding N， Nikolay B， Stasse S， et al.2015-16年安哥拉和刚果民主共和国黄热病病毒疫情的传播：一项建模研究。柳叶刀传染病。2017;17(3):330–8.Epub 格式 2016/12/27.pmid：28017559.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
36.Bogoch II， Brady OJ， Kraemer MUG， German M， Creatore MI， Brent S， et al.寨卡病毒在非洲和亚太地区资源有限国家引入和传播的可能性：一项建模研究。柳叶刀传染病。2016;16(11):1237–45.Epub 格式 2016/10/30.pmid：27593584.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
37.Bogoch II， Brady OJ， Kraemer MUG， German M， Creatore MI， Kulkarni MA， et al.预测寨卡病毒从巴西的国际传播。柳叶 刀。2016;387(10016):335–6.Epub 格式 2016/01/19.pmid：26777915.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
38.乔瓦内蒂M，佩雷拉洛杉矶，圣地亚哥GA，丰塞卡五世，加西亚门多萨议员，德奥利维拉C，.登革热-2世界性基因型检测和在南美洲的出现。medRxiv.2022:2022.03.29.22273028.
查看文章谷歌学术搜索
39.De Jesus JG， Dutra K. R.， Salles F.C. S.， Claro I.M.， Terzian A.C.， Candido D. S.， Hill S.C.， Thézé J.， D'agostini T. L.， Felix A.C.， Reis A. F. N.， Alcantara L.C. J.， Abreu A. L.， Croda A.， de Oliveira W. K.， de Filipis A.M.B.， dos Santos M.C. R.， 罗马诺C.M.，洛曼N.J.，皮布斯O.G.，萨比诺E.C.，诺盖拉M.L.，法里亚N.R.在巴西，使用便携式基因组监测及早鉴定登革热病毒谱系替代物。生物Rxiv.2019.
查看文章谷歌学术搜索
40.施拉根豪夫 P， 陈 LH.黄热病输入中国——旅行前和旅行后控制系统的失败？国际传染病杂志：IJID：国际传染病学会的官方出版物。2017;60:91–2.Epub 格式 2017/06/11.pmid：28600148.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
41.宋R， 关淑， 李世生， 陈志， 陈春， 韩磊， 徐勇， 李爱， 曾海， 叶海， 张F. 晚期或缺乏与从安哥拉输入中国黄热病有关的疫苗接种。新发传染病。2018;24(7):1383–6.
查看文章谷歌学术搜索
42.Gilbert MP， G.， Pinotti F.， Valdano E.， Poletto C.， Bo?lle P-Y.， D'Ortenzio E.， Yazdanpanah Y.， Eholie S.P.， Altmann M.， Gutierrez B.， Kraemer M. U.G.， Colizza V. 非洲国家对引入2019-nCoV的准备和脆弱性。medRxiv.2020;
查看文章谷歌学术搜索
43.Twiddy SS，Pybus OG，Holmes EC.蚊媒黄病毒的比较种群动态。感染，遗传学和进化：传染病中的分子流行病学和进化遗传学杂志。2003;3(2):87–95.Epub 格式 2003/06/18.pmid：12809802.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
44.Carrington CV，Foster JE，Pybus OG，Bennett SN，Holmes EC.登革热病毒在美洲的2型和4型的入侵和维持。病毒学杂志。2005;79(23):14680–7.Epub 格式 2005/11/12.pmid：16282468.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
45.Faye O， Ba Y， Faye O， Talla C， Diallo D， Chen R， et al.2009年登革热病毒3型感染的城市流行，塞内加尔。新发传染病。2014;20(3):456–9.Epub 格式 2014/02/28.pmid：24572297.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
46.Moraes GH，de Fatima Duarte E，Duarte EC.巴西重症登革热死亡率的决定因素：基于人群的病例对照研究。美国热带医学和卫生杂志。2013;88(4):670–6.Epub 格式 2013/02/13.pmid：23400577.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
47.Grubaugh ND， Faria NR， Andersen KG， Pybus OG.对寨卡病毒出现和传播的基因组见解。细胞。2018;172(6):1160–2.Epub 格式 2018/03/10.pmid：29522736.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
48.Hunsperger EA， Yoksan S， Buchy P， Nguyen VC， Sekaran SD， Enria DA， et al.市售抗登革热病毒免疫球蛋白 M 试验的评估。新发传染病。2009;15(3):436–40.Epub 格式 2009/02/26.pmid：19239758.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
49.Bosch I， de Puig H， Hiley M， Carre-Camps M， Perdomo-Celis F， Narvaez CF， et al.对患者血清中的登革热病毒血清型和寨卡病毒进行快速抗原检测。科学译本 2017;9（409）.Epub 格式 2017/09/29.pmid：28954927.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
50.Quick J， Grubaugh ND， Pullan ST， Claro IM， Smith AD， Gangavarapu K， et al.多重PCR方法，用于直接从临床样品中对寨卡病毒和其他病毒基因组进行MinION和Illumina测序。Nat Protoc.2017;12(6):1261–76.Epub 格式 2017/05/26.pmid：28538739.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
51.埃德加·MUSCLE：具有高精度和高通量的多序列比对。核酸研究。2004;32(5):1792–7.Epub 格式 2004/03/23.pmid：15034147.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
52.Sayers EW， Cavanaugh M， Clark K， Ostell J， Pruitt KD， Karsch-Mizrachi I. GenBank.核酸研究。2019;47（D1）:D 94–D9.Epub 格式 2018/10/27.pmid：30365038。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
53.Stamatakis A. RAxML版本8：用于系统发育分析和大型系统发育后分析的工具。生物信息学。2014;30(9):1312–3.Epub 格式 2014/01/24.pmid：24451623.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
54.Rambaut A， Lam TT， Max Carvalho L， Pybus OG.使用TempEst（以前称为Path-O-Gen）探索异时序列的时间结构。病毒卷2016;2（1）：vew007.Epub 格式 2016/10/25.pmid：27774300.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
55.Faria NR， Rambaut A， Suchard MA， Baele G， Bedford T， Ward MJ， et al. HIV流行病学.HIV-1在人群中的早期传播和流行病点燃。科学。2014;346(6205):56–61.Epub 格式 2014/10/04.pmid：25278604.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
56.Baele G，Li WL，Drummond AJ，Suchard MA，Lemey P.贝叶斯系统发育中松弛分子钟的精确模型选择。分子生物学和进化论。2013;30(2):239–43.Epub 格式 2012/10/24.pmid：23090976。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
57.Suchard MA，Lemey P，Baele G，Ayres DL，Drummond AJ，Rambaut A. Bayesian系统发育和系统动力学数据集成使用BEAST 1.10。病毒卷2018;4（1）：vey016.Epub 格式 2018/06/27.pmid：29942656.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
58.Ho SY，Phillips MJ，Drummond AJ，Cooper A.使用松弛时钟模型进行速率估计的准确性，重点是早期的后生动物辐射。分子生物学和进化论。2005;22(5):1355–63.Epub 格式 2005/03/11.pmid：15758207.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索-厦门杂志期刊论文发表
59.Lemey P， Rambaut A， Drummond AJ， Suchard MA.贝叶斯系统地理学找到了它的根源。PLoS计算生物学。2009;5（9）：e1000520.pmid：19779555.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
60.Rambaut A， Drummond AJ， Xie D， Baele G， Suchard MA.使用示踪剂1.7的贝叶斯系统发育中的后验总结。系统生物学。2018;67(5):901–4.Epub 格式 2018/05/03.pmid：29718447.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术搜索
61.Rambaut A. FigTree v1.4.2.2015.